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一种鱼类表面处理液

阅读：1013发布：2021-02-26

IPRDB可以提供一种鱼类表面处理液专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种鱼类浸泡免疫方法，包括如下步骤：将待免疫鱼移入鱼类表面处理液中，浸泡2～10min；将处理后的待免疫鱼捞起，用水清洗表面后移入浸泡疫苗中浸泡5～40min。本方法中所使用的鱼类表面处理液每1000mL中含有：38～40%的甲醛溶液0.05～2mL，苯扎氯胺0.0010~0.0035g，乙醇酸0.04～0.08g，甘油10～20mL。用该鱼类表面处理液处理后可提高鱼体表面的通透性，增加鱼体对疫苗的吸收效率，显著提高免疫效果；而且成本低、安全无毒、对鱼的存活和生长没有影响，适于推广应用。，下面是一种鱼类表面处理液专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种鱼类表面处理液，其特征在于，每1000mL处理液中含有：38～40%的甲醛溶液

0.05～2mL，苯扎氯铵0.0010～0.0035g，乙醇酸0.04～0.08g，甘油10～20mL。

2.根据权利要求1所述的鱼类表面处理液，其特征在于，每1000mL处理液中含有：

38～40%的甲醛溶液0.05mL，苯扎氯铵0.0035g，乙醇酸0.04g，甘油10mL。

3.根据权利要求1或2所述的鱼类表面处理液，其特征在于，所述处理液的溶剂为水。

说明书全文

一种鱼类表面处理液

技术领域

[0001] 本发明属于水生生物疾病免疫防治领域，具体涉及一种鱼类浸泡免疫方法。

背景技术

[0002] 病害给水产业带来的经济损失是不可估量的。疫苗是传统而有效的防治方法，传统注射疫苗的优点是免疫效果好，缺点是费时费力，难以大规模应用。浸泡和口服的疫苗的优点是应用简单，可以大规模使用，但其缺点是疫苗在浸泡过程中，与疫苗鱼体注射方法相比，仅有很少量的疫苗可通过皮肤表面或口、腮粘膜进入鱼体内，另外疫苗抗原口服后，进入消化道很容易被破坏，所以传统的浸泡和口服疫苗方法，产生的疫苗免疫效果差。目前国内国外所开发的浸泡和口服疫苗产品不多。因此改善鱼类疫苗浸泡方式，提供新型疫苗佐剂，提高鱼类疫苗免疫效果，是水产养殖快速发展所必须的。

[0003] 本发明的优点在于通过表面处理液处理后增加鱼表皮的通透性，促进浸泡疫苗的吸收，同时浸泡疫苗中加入佐剂，可提高疫苗的免疫效果。本使用方法简单安全，成本低，不需要额外的设施和工序，适合于种苗场和基层的养殖户使用。

发明内容

[0004] 本发明的一个目的在于提供一种鱼类表面处理液。

[0005] 本发明的另一个目的在于提供一种鱼类浸泡免疫方法。

[0006] 本发明所采用的技术方案是：

[0007] 一种鱼类表面处理液，每1000mL中含有：38～40%的甲醛溶液0.05～2mL，苯扎氯胺0.0010～0.0035g，乙醇酸0.04～0.08g，甘油10～20mL。

[0008] 优选的，所述鱼类表面处理液每1000mL中含有：38～40%的甲醛溶液0.05mL，苯扎氯胺0.0035g，乙醇酸0.04g，甘油10mL。

[0009] 所述处理液的溶剂为水。

[0010] 一种浸泡疫苗佐剂，每1000mL中含有：肽聚糖0.5～2.5 g，棕榈油1.0～6.0mL，卡波姆0.1～3.5g，甘油1.0～6.5mL，二乙醇胺0.5～2.0mL，溶剂为水。

[0011] 优选的，所述浸泡疫苗佐剂每1000mL中含有：肽聚糖0.5～2.5 g，棕榈油1.4～5.9mL，卡波姆0.1～3.5g，甘油1.3～ 6.3mL，二乙醇胺0.5～2.0mL，溶剂为水。

[0012] 优选的，所述浸泡疫苗佐剂每1000mL中含有：肽聚糖1.5 g，棕榈油3.0mL，卡波姆1.5g，甘油3.0mL，二乙醇胺1.0mL，溶剂为水。

[0013] 一种鱼类浸泡免疫方法，包括如下步骤：

[0014] （1）将待免疫鱼移入上述的鱼类表面处理液中，浸泡2～10min；

[0015] （2）将处理后的待免疫鱼捞起，放入清水中清洗1～2min；

[0016] （3）将清洗后的待免疫鱼移入浸泡疫苗中浸泡5～40min。

[0017] 所述待免疫鱼的体重3～100g。

[0018] 所述浸泡疫苗由抗原与佐剂混合而成；所述佐剂为上述的浸泡疫苗佐剂。

[0019] 所述浸泡疫苗的抗原为细菌、病毒、细菌多糖或细菌病毒蛋白抗原。

[0020] 本发明的有益效果在于：用本发明的鱼类表面处理液处理后可提高鱼体表面的通透性，增加鱼体对疫苗的吸收效率，显著提高免疫效果。该表面处理液的成本低、安全无毒、对鱼的存活和生长没有影响。本发明的免疫方法操作简单，适于推广应用。

[0021] 另外，本发明的浸泡免疫方法中所使用的佐剂配方可提高疫苗的免疫效果，使用简便，成本低，安全无毒，适于种苗场和基层养殖户使用。

具体实施方式

[0022] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

[0023] 实施例1

[0024] 一、鱼类表面处理液的制备

[0025] 配方1：

[0026] 38～40%甲醛溶液0.05mL，苯扎氯胺0.0035g，乙醇酸0.04g，甘油10mL，加水定容至1000mL。

[0027] 配方2：

[0028] 38～40%甲醛2mL，苯扎氯胺0.001g，乙醇酸0.08g，甘油20mL，加水定容至1000mL。

[0029] 配方3：

[0030] 38～40%甲醛1mL，苯扎氯胺0.002g，乙醇酸0.06g，甘油15mL，加水定容至1000mL。

[0031] 二、表面处理液对罗非鱼的毒性试验

[0032] 1.试验鱼：3g～10g罗非鱼480尾/组。

[0033] 2.对照鱼：不做表面处理液浸泡，3g～10g罗非鱼30尾/组，设2个平行组。

[0034] 3.处理方法：将每组30尾鱼分别在配方1、配方2 和配方3中浸泡1min、3min、5min、10min、15min、20min、25min、2h，观察记录鱼的状态及死亡情况。

[0035] 4.结果：

[0036] 表1 表面处理液对罗非鱼的毒性试验

[0037]

[0038] 试验过程中未见鱼出现不正常状态，结果表明该鱼类表面处理液对鱼没有造成伤害，不会造成鱼的死亡。

[0039] 实施例2

[0040] 一、鱼类表面处理液的制备

[0041] 鱼类表面处理液配方：38～40%甲醛1mL，苯扎氯胺0.002g，乙醇酸0.06g，甘油15ml ，加水定容至1000ml。

[0042] 二、浸泡疫苗的制备

[0043] 1、疫苗佐剂配方：肽聚糖0.5g，棕榈油1.4g，卡波姆0.1g，甘油1.3g，二乙醇胺0.5mL，加水定容至1000mL。

[0044] 2、抗原制备

[0045] 用TSB液体培养基对无乳链球菌（S.agalactiae）进行扩大培养，置于30℃恒温振荡培养箱振荡培养（120rpm/min）24h，然后采用平板计数的方法对培养的菌液进行活菌计数。在计完数的无乳链球菌中加入终浓度为0.4%的甲醛在37℃下灭活36h后，将灭活的菌体接种于TSA固体平板，置温箱恒温培养48h，确定无菌落生长后，将菌液于常温下6000rpm离心10min，收集菌体；将收集的菌体用灭菌的PBS（pH7.4）清洗3遍，用PBS制成
9
1.0×10cells/mL的菌悬液。

[0046] 实施例2～4所用无乳链球菌（S.agalactiae）由中国兽医药品监察所提供，保藏机构为国家兽医微生物菌种保藏管理中心，编号为CVCC 1887。

[0047] 3、复合疫苗制备

[0048] 将上述菌悬液用超声波破碎处理后与疫苗佐剂按9:1的体积比混合，制成无乳链球菌亚单位复合疫苗，充分混匀后4℃备用。

[0049] 对照：将菌悬液用超声波破碎处理后与水按9:1的体积比混合，得到不加佐剂的无乳链球菌亚单位悬液。

[0050] 三、免疫方法与结果

[0051] 1）试验鱼：3～10g罗非鱼300尾。

[0052] 2）试验分组

[0053] 对照组：试验鱼不经免疫处理直接攻毒；

[0054] 试验1组：经表面处理液浸泡处理后，用本实施例的复合疫苗浸泡免疫；

[0055] 试验2组：不经表面处理液浸泡处理，直接使用本实施例的复合疫苗浸泡免疫；

[0056] 试验3组：经表面处理液浸泡处理后，直接用不加佐剂的无乳链球菌亚单位悬液进行免疫；

[0057] 试验4组：不经表面处理液浸泡处理后，直接用不加佐剂的无乳链球菌亚单位悬液进行免疫。

[0058] 每组设三个平行，每个平行20尾鱼。

[0059] 3）免疫方法：试验鱼暂养1周后，将试验1、3组的鱼在稀释后的表面处理液中浸泡5min；将鱼捞起用干净的水清洗2遍后，试验1组用复合疫苗浸泡30min，试验3组直接用不加佐剂的无乳链球菌亚单位悬液浸泡30min；试验2组直接用复合疫苗浸泡30min，试验4组直接用不加佐剂的无乳链球菌亚单位悬液浸泡30min。

[0060] 4）免疫后攻毒：免疫后15天各组用无乳链球菌攻毒，攻毒采用注射感染，剂量为7
2×10cells/尾。

[0061] 5）试验结果

[0062] 攻毒后15天，统计各组存活率，见表2。

[0063] 表2 用无乳链球菌浸泡疫苗浸泡免疫罗非鱼的免疫相对保护率

[0064]

[0065] 相对保护率计算方法：（对照组死亡率－试验组死亡率）/对照组死亡率%[0066] 试验结果表明试验1组和试验2组的保护率都高于对照组，而试验1组的相对保护率为70%明显高于试验2组的53.33%。试验3组的相对保护率56.67%高于试验4组的46.67%。试验结果表明，利用本实施例的鱼体表面处理液处理后，能有效提高浸泡疫苗对鱼体的免疫保护作用。

[0067] 另外，试验1组的相对保护率高于试验3组，试验2组的相对保护率高于试验4组，结果表明，本发明的疫苗佐剂能够有效提高浸泡疫苗对鱼体的免疫保护作用。

[0068] 实施例3

[0069] 一、鱼类表面处理液的制备

[0070] 鱼类表面处理液配方：38～40%甲醛0.05mL，苯扎氯胺0.0035g，乙醇酸0.04g，甘油10mL ，加水定容至1000mL。

[0071] 二、浸泡疫苗的制备

[0072] 1、疫苗佐剂配方：肽聚糖2.5g，棕榈油5.9g，卡波姆3.5g，甘油6.3g，二乙醇胺2.0mL，加水定容至1000mL。

[0073] 2、抗原制备

[0074] 用TSB液体培养基对无乳链球菌（S.agalactiae）进行扩大培养，置于30℃恒温振荡培养箱振荡培养（120rpm/min）24h，然后采用平板计数的方法对培养的菌液进行活菌计数。在计完数的无乳链球菌中加入终浓度为0.4%的甲醛在37℃下灭活36h后，将灭活的菌体接种于TSA固体平板，置温箱恒温培养48h，确定无菌落生长后，将菌液于常温下6000rpm离心10min，收集菌体；将收集的菌体用灭菌的PBS（pH7.4）清洗3遍，用PBS制成
9
1.0×10cells/mL的菌悬液。

[0075] 3、复合疫苗制备

[0076] 将上述菌悬液经超声波破碎处理后与疫苗佐剂按9:1的体积比混合，制成无乳链球菌亚单位复合疫苗，充分混匀后4℃备用。

[0077] 对照：将菌悬液用超声波破碎处理后与水按9:1的体积比混合，得到不加佐剂的无乳链球菌亚单位悬液。

[0078] 三、免疫方法与结果

[0079] 1）试验鱼：3～10g罗非鱼160尾。

[0080] 2）试验分组

[0081] 对照组：试验鱼不经免疫处理直接攻毒；

[0082] 试验1组：经表面处理液浸泡处理后，用本实施例的复合疫苗浸泡免疫；

[0083] 试验2组：不经表面处理液浸泡处理，直接使用本实施例的复合疫苗浸泡免疫；

[0084] 试验3组：经表面处理液浸泡处理后，直接用不加佐剂的无乳链球菌亚单位悬液进行免疫；

[0085] 试验4组：不经表面处理液浸泡处理后，直接用不加佐剂的无乳链球菌亚单位悬液进行免疫。

[0086] 每组设三个平行，每个平行20尾鱼。

[0087] 3）免疫方法：试验鱼暂养1周后，将试验1组、试验3组的鱼在稀释后的表面处理液中浸泡5min；将鱼捞起用干净的水清洗2遍后，试验1组用复合疫苗浸泡30min，试验3组直接用不加佐剂的无乳链球菌亚单位悬液浸泡30min；试验2组直接用复合疫苗浸泡
30min，试验4组直接用不加佐剂的无乳链球菌亚单位悬液浸泡30min。

[0088] 4）免疫后攻毒：免疫后15天各组用无乳链球菌攻毒，攻毒采用注射感染，剂量为7
2×10cells/尾。

[0089] 5）试验结果

[0090] 攻毒后15天，统计各组存活率，见表3。

[0091] 表3 用无乳链球菌浸泡疫苗浸泡免疫罗非鱼的免疫相对保护率

[0092]

[0093] 试验结果表明试验1组和试验2组的保护率都高于对照组，而试验1组的相对保护率为74.20%明显高于试验2组的51.62%，试验3组的相对保护率58.07%高于试验4组的38.71%。试验结果表明，利用本实施例的鱼体表面处理液处理后，能有效提高浸泡疫苗对鱼体的免疫保护作用。

[0094] 另外，试验1组的相对保护率高于试验3组，试验2组的相对保护率高于试验4组，结果表明，本实施例的疫苗佐剂能够有效提高浸泡疫苗对鱼体的免疫保护作用。

[0095] 实施例4

[0096] 一、鱼类表面处理液的制备

[0097] 鱼类表面处理液配方：38～40%甲醛2.0mL，苯扎氯胺0.001g，乙醇酸0.08g，甘油20mL ，加水定容至1000mL。

[0098] 二、浸泡疫苗的制备

[0099] 1、疫苗佐剂配方：肽聚糖1.5g，棕榈油3.0g，卡波姆1.5g，甘油3.0g，二乙醇胺1.0mL，加水定容至1000mL。

[0100] 2、抗原制备

[0101] 用TSB液体培养基对无乳链球菌（S.agalactiae）进行扩大培养，置于30℃恒温振荡培养箱振荡培养（120rpm/min）24h，然后采用平板计数的方法对培养的菌液进行活菌计数。在计完数的无乳链球菌中加入终浓度为0.4%的甲醛在37℃下灭活36h后，将灭活的菌体接种于TSA固体平板，置温箱恒温培养48h，确定无菌落生长后，将菌液于常温下6000rpm离心10min，收集菌体；将收集的菌体用灭菌的PBS（pH7.4）清洗3遍，用PBS制成
9
1.0×10cells/mL的菌悬液。

[0102] 3、复合疫苗制备

[0103] 将上述菌悬液经超声波破碎处理后与疫苗佐剂按9:1的体积比混合，制成无乳链球菌亚单位复合疫苗，充分混匀后4℃备用。

[0104] 对照：将菌悬液用超声波破碎处理后与水按9:1的体积比混合，得到不加佐剂的无乳链球菌亚单位悬液。

[0105] 三、免疫方法与结果

[0106] 1）试验鱼：3～10g罗非鱼160尾。

[0107] 2）试验分组

[0108] 对照组：试验鱼不经免疫处理直接攻毒；

[0109] 试验1组：经表面处理液浸泡处理后，用本实施例的复合疫苗浸泡免疫；

[0110] 试验2组：不经表面处理液浸泡处理，直接使用本实施例的复合疫苗浸泡免疫；

[0111] 试验3组：经表面处理液浸泡处理后，直接用不加佐剂的无乳链球菌亚单位悬液进行免疫；

[0112] 试验4组：不经表面处理液浸泡处理后，直接用不加佐剂的无乳链球菌亚单位悬液进行免疫。

[0113] 每组设三个平行，每个平行20尾鱼。

[0114] 3）免疫方法：试验鱼暂养1周后，将试验1组、试验3组的鱼在稀释后的表面处理液中浸泡5min；将鱼捞起用干净的水清洗2遍后，试验1组用复合疫苗浸泡30min，试验3组直接用不加佐剂的无乳链球菌亚单位悬液浸泡30min；试验2组直接用复合疫苗浸泡
30min，试验4组直接用不加佐剂的无乳链球菌亚单位悬液浸泡30min。

[0115] 4）免疫后攻毒：免疫后15天各组用无乳链球菌攻毒，攻毒采用注射感染，剂量为7
2×10cells/尾。

[0116] 5）试验结果

[0117] 攻毒后15天，统计各组存活率，见表4。

[0118] 表4 用无乳链球菌浸泡疫苗浸泡免疫罗非鱼的免疫相对保护率

[0119]

[0120] 试验结果表明试验1组和试验2组的保护率都高于对照组，而试验1组的相对保

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