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一种检测VEGF靶向治疗药物生物学活性的方法

阅读：197发布：2021-02-22

IPRDB可以提供一种检测VEGF靶向治疗药物生物学活性的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了一种检测VEGF靶向治疗药物生物学活性的方法，其包括以下步骤：构建编码KDR-NGFR融合蛋白的核苷酸序列，将其进行全长克隆到空白载体中，转染第一细胞，用杀稻瘟菌素杀死未稳定转染的细胞，在杀稻瘟菌素下正常生长的细胞为第二细胞；构建转录因子NF-kB重组结合序列，然后将其克隆到荧光素酶报告基因载体中，转染第二细胞，用杀稻瘟菌素和嘌呤霉素杀死未稳定转染的细胞，在杀稻瘟菌素和嘌呤霉素下正常生长的细胞为第三细胞；接种第三细胞，加入VEGF靶向治疗药物和VEGF，培养细胞；裂解细胞，加入荧光素酶的底物，检测荧光强度，以确定所述VEGF靶向治疗药物阻断VEGF的生物学活性。本发明的方法能准确、简单易行、快速检测VEGF靶向药物的生物学活性。，下面是一种检测VEGF靶向治疗药物生物学活性的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种检测VEGF靶向治疗药物生物学活性的方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一：构建编码KDR-NGFR融合蛋白的核苷酸序列，所述KDR-NGFR融合蛋白由KDR蛋白胞外段和NGFR胞内段形成，其中所述KDR蛋白胞外段包括KDR基因的信号肽以及蛋白暴露在细胞外的区域，所述NGFR胞内段包括KDR基因的跨膜区和细胞内序列，然后将所述编码KDR-NGFR融合蛋白的核苷酸序列进行全长克隆到空白载体中，并将构建后的质粒转染第一细胞，用杀稻瘟菌素杀死未稳定转染的细胞，在杀稻瘟菌素下正常生长的细胞为第二细胞；

步骤二：构建转录因子NF-kB重组结合序列，然后将所述NF-kB重组结合序列克隆到荧光素酶报告基因载体中，将所述NF-kB重组结合序列作为启动子的组成部分，用以引导荧光素酶报告基因的转录，并将构建后的质粒转染所述第二细胞，用杀稻瘟菌素和嘌呤霉素杀死未稳定转染的细胞，在杀稻瘟菌素和嘌呤霉素下正常生长的细胞为第三细胞。

步骤三：接种所述第三细胞，然后加入所述VEGF靶向治疗药物和VEGF，然后培养细胞；

步骤四：裂解细胞，加入荧光素酶的底物，检测荧光强度，以确定所述VEGF靶向治疗药物阻断VEGF的生物学活性。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，如果同时加入VEGF和所述VEGF靶向治疗药物后测得的荧光强度低于仅加入VEGF后测得的荧光强度，则所述VEGF靶向治疗药物具备生物学活性。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光素酶报告基因载体为pLVX-Luc2P载体。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤三中，培养细胞的时间为4-8小时。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤四中，加入所述荧光素酶的底物之后，静置不超过5分钟即进行检测。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述KDR-NGFR融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述NF-kB重组结合序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤一中，所述空白载体为pLVX-BSD空白载体。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤一中，所述第一细胞为HEK293细胞。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述VEGF靶向治疗药物为阿柏西普、阿帕替尼、阿西替尼、帕唑帕尼、舒尼替尼、索拉非尼、安罗替尼、瑞戈非尼、布立尼布、西地尼布、贝伐珠单抗、雷莫卢单抗、凡德他尼、乐伐替尼、普纳替尼、卡博替尼、呋喹替尼中的任意一种或多种。

说明书全文

一种检测VEGF靶向治疗药物生物学活性的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物检测领域，具体涉及一种检测VEGF靶向治疗药物生物学活性的方法。

背景技术

[0002] 血管内皮生成因子(VEGF)是高度保守的同源二聚体糖蛋白，两条分子量各为约24kDa的单链以二硫键组成二聚体。由于vegf基因的mRNA不同的剪切方式，分别产生出VEGF-A121和VEGF-A165等至少5种蛋白形式，其中VEGF121、VEGF165是分泌型可溶性蛋白，能直接作用于血管内皮细胞表面的VEGF受体(VEGFR，或称为KDR)促进血管内皮细胞增殖，促进血管生成，增加血管通透性。KDR膜蛋白一般只表达在血管内皮细胞表面。当VEGF与KDR结合后，激活一系列与血管生成相关的转录因子活化和诱导基因转录，这些被诱导转录的基因参与血管生成的细胞学过程，并最终导致新生血管的生产。

[0003] 转录因子NF-kB是被广泛研究的蛋白，其介导的信号转导已经被证明是参与细胞生理、病理过程的重要的信号转导通路。一系列的细胞外信号，例如生长因子，白介素和细菌毒素等激活的上游通路都可以经过NF-kB信号进行转导，活化的NF-kB转录因子转移入细胞核内介导一系列基因的转录。

[0004] 治疗有新生血管(湿)年龄相关黄斑变性(AMD)的药物阿柏西普(Aflibercept)为一种靶向VEGF的融合蛋白药物，是由人VEGF受体1和VEGF受体2的胞外区与人体免疫球蛋白G1的可结晶片段(Fc段)融合而成。阿柏西普可以结合VEGF家族各成员(包括VEGF-A121、EGF-A165)及胎盘生长因子(PIGF)从而阻断后者的生物学作用，抑制异常的血管生成及渗漏。

发明内容

[0005] 为解决上述问题，本发明的目的是提供一种能够准确、简单易行、快速检测VEGF靶向治疗药物生物学活性的方法。

[0006] 为此，本发明提供了以下技术方案：

[0007] 一种检测VEGF靶向治疗药物生物学活性的方法，其包括以下步骤：

[0008] 步骤一：构建编码KDR-NGFR融合蛋白的核苷酸序列，所述KDR-NGFR融合蛋白由KDR蛋白胞外段和NGFR胞内段形成，其中所述KDR蛋白胞外段包括KDR基因的信号肽以及蛋白暴露在细胞外的区域，所述NGFR胞内段包括KDR基因的跨膜区和细胞内序列，然后将所述编码KDR-NGFR融合蛋白的核苷酸序列进行全长克隆到空白载体中，并将构建后的质粒转染第一细胞，用杀稻瘟菌素(Blasticidin，BSD)杀死未稳定转染的细胞，在杀稻瘟菌素下正常生长的细胞为第二细胞(可命名为HEK293KDR)；

[0009] 步骤二：构建转录因子NF-kB重组结合序列，然后将所述NF-kB重组结合序列克隆到荧光素酶报告基因载体中，将所述NF-kB重组结合序列作为启动子的组成部分，用以引导荧光素酶报告基因的转录，并将构建后的质粒转染所述第二细胞，用杀稻瘟菌素和嘌呤霉素杀死未稳定转染的细胞，在杀稻瘟菌素和嘌呤霉素(Puromycin，Puro)下正常生长的细胞为第三细胞(可命名为HEK293KDR-NF-kB-Luc2P)。

[0010] 步骤三：接种所述第三细胞，然后加入所述VEGF靶向治疗药物和VEGF，然后培养细胞；

[0011] 步骤四：裂解细胞，加入荧光素酶的底物，检测荧光强度，以确定所述VEGF靶向治疗药物阻断VEGF的生物学活性。

[0012] 如果加入VEGF靶向治疗药物和VEGF后测得的荧光强度低于仅加入VEGF后测得的荧光强度，则说明VEGF靶向治疗药物具备阻断VEGF生物学活性的效果。

[0013] 荧光强度(或相对荧光强度)的越低代表了VEGF靶向治疗药物阻断VEGF的生物学活性越强，荧光强度(或相对荧光强度)越高，则说明检测的VEGF靶向治疗药物的生物学活性越弱。

[0014] 本文所称的“VEGF靶向治疗药物”是指以对VEGF具有靶向阻断作用的药物，包括但不限于融合蛋白、单克隆抗体、含有单克隆抗体作为活性成分的药物制剂、反义核苷酸、激酶抑制剂、化合物、中药提取物、中药复方提取物、或其组合。优选地，所述VEGF靶向治疗药物包括但不限于阿柏西普、阿帕替尼、阿西替尼、帕唑帕尼、舒尼替尼、索拉非尼、安罗替尼、瑞戈非尼、布立尼布、西地尼布、贝伐珠单抗、雷莫卢单抗、凡德他尼、乐伐替尼、普纳替尼、卡博替尼、呋喹替尼中的任意一种或多种。更优选地，所述VEGF靶向治疗药物为阿柏西普。

[0015] 优选地，所述荧光素酶报告基因载体包括但不限于pLVX-Luc2P载体。

[0016] 优选地，所述步骤三中，培养细胞的时间为4-8小时，更优选为6小时。

[0017] 优选地，所述步骤四中，加入所述荧光素酶的底物之后，静置不超过5分钟即进行检测。

[0018] 优选地，所述KDR-NGFR融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0019] 优选地，所述NF-kB重组结合序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0020] 优选地，所述步骤一中，所述空白载体为pLVX-BSD空白载体。

[0021] 优选地，所述步骤一中，所述第一细胞可以是不表达KDR的人永生化活细胞，包括但不限于HEK293细胞。

[0022] 优选地，所述VEGF的加入量为50ng/ml

[0023] 优选地，所述VEGF靶向治疗药物的加入量为1μg/ml。

[0024] 与现有的检测方法相比，本发明的方法采用能稳定表达KDR蛋白和报告基因(reporter gene)的HEK293细胞检测VEGF的生物学活性、以及VEGF靶向治疗药物(如阿柏西普)阻断VEGF的生物学活性，简单易行，没有繁琐的中间操作过程，可在24小时内简便、准确、快速地检测VEGF靶向治疗药物(特别是阿柏西普)的生物学活性，特别适用于生物制品的质量检测和质量控制。

附图说明

[0025] 图1是构建HEK293KDR-NF-kB-Luc2P细胞和方法建立示意图。

[0026] 图2是质粒pLVX-KDR-NGFR-BSD构建示意图。

[0027] 图3是质粒pLVX-NF-kB-Luc2P构建示意图。

[0028] 图4是HEK293KDR-NF-kB-Luc2P细胞(克隆号1B5)细胞表达KDR融合蛋白流式细胞仪检测结果和基因组插入NF-kB结合的重组序列测序图。

[0029] 图5是HEK293KDR-NF-kB-Luc2P细胞(克隆号1B5)在VEGF刺激后荧光素酶转录和荧光强度的检测信号。

[0030] 图6HEK293KDR-NF-kB-Luc2P细胞(克隆号1B5)对不同浓度阿柏西普拮抗VEGF的生物学活性结果。结果表明，阿柏西普对50ng/ml VEGF的阻断效果呈现浓度依赖性，IC50在5ng/ml左右，1μg/ml可以达到完全抑制效果。

具体实施方式

[0031] 下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不对本发明的保护范围构成限制。如未特别指出，以下实施例中所使用的试剂和仪器均可通过商业渠道获得。为简便起见，以下实施例中的部分常规技术操作的细节并未予以描述，但可以理解的是，其属于本领域技术人员可知晓并实施的范围内。基于本发明的检测原理，尽管以下具体实施例中仅使用了阿柏西普为例进行活性检测，但本发明的检测方法仍适用于其他VEGF靶向治疗药物的生物学活性检测。本文所称的“VEGF靶向治疗药物”是指以对VEGF具有靶向阻断作用的药物，包括但不限于融合蛋白、单克隆抗体、含有单克隆抗体作为活性成分的药物制剂、反义核苷酸、激酶抑制剂、化合物、中药提取物、中药复方提取物、或其组合。优选地，所述VEGF靶向治疗药物包括但不限于阿柏西普、阿帕替尼、阿西替尼、帕唑帕尼、舒尼替尼、索拉非尼、安罗替尼、瑞戈非尼、布立尼布、西地尼布、贝伐珠单抗、雷莫卢单抗、凡德他尼、乐伐替尼、普纳替尼、卡博替尼、呋喹替尼中的任意一种或多种。

[0032] 构建KDR-NGFR融合蛋白，并合成该基因序列

[0033] 构建HEK293KDR-NF-kB-Luc2P细胞和方法如图1所示。

[0034] 将KDR胞外段和NGFR胞内段核苷酸序列首尾连接成KDR-NGFR融合蛋白核苷酸序列，KDR-NGFR融合蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO.1(2826bp)所示。

[0035] 合成该序列(由通用生物系统有限公司合成)并克隆到pLVX-BSD空白载体中，该载体为Clontech公司产品(载体示意图如图2所示)。构建后的质粒命名为pLVX-KDR-NGFR-BSD。

[0036] 构建NF-kB结合序列作为荧光素酶基因的启动子

[0037] 设计NF-kB重组结合序列的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所示：

[0038] GGGAATTTCCGGGAATTTCCGGGAATTTCCGGGAATTTCCGCGCGTAGACACTAGAGGGTATATAATG(SEQ ID NO.2)。

[0039] 值得注意的是，此处增加至6个结合位点是为了增加NF-kB蛋白的结合域，允许蛋白结合。

[0040] 合成该序列(由金斯瑞生物科技公司合成)并克隆到荧光素酶报告基因载体pLVX-Luc2P载体中，该载体为Clontech公司产品(载体示意图如图3所示)。通过常规操作将NF-kB结合序列构建到该载体中，序列测序结果如图3所示。得到含有NF-kB结合序列和荧光素酶报告基因的质粒pLVX-NF-κB-Luc2P。

[0041] 筛选HEK293KDR阳性细胞和HEK293KDR-NF-kB-Luc2P细胞及细胞单克隆化[0042] 对转染了pLVX-KDR-NGFR-BSD治疗的HEK293细胞加入2.5ug/ml杀稻瘟菌素进行毒性筛选，待细胞在该霉素中能正常生长后，可以认为该HEK293细胞已经具备抗药性，命名为HEK293KDR阳性细胞。可以用于后续细胞实验。

[0043] 对转染了pLVX-NF-κB-Luc2P质粒的HEK293KDR细胞进行双药物筛选，同时加入2.5μg/ml杀稻瘟菌素和2.5μg/ml Puro，知道细胞可以在两种抗生素中正常生长，命名为HEK293KDR-NF-kB-Luc2P细胞。

[0044] 对HEK293KDR-NF-kB-Luc2P细胞进行单可克隆化和功能筛选。首先，对挑选的单克隆细胞进行KDR蛋白表达的检测。用流式细胞技术的方法，对各单克隆细胞加入特异性鼠抗人KDR抗体，再加入荧光素FITC标记的养抗鼠二抗，然后用流式细胞仪检测KDR蛋白的表达。然后提取细胞基因组DNA，设计插入的NF-κB RE序列上下游序列的引物。

[0045] 上述序列特异性引物如下：

[0046] 上游引物核苷酸序列如下：ACAGGGACAGCAGAGATCCA(SEQ ID NO.3)；

[0047] 下游引物核苷酸序列如下：TTCCAGGAACCAGGGCGTAT(SEQ ID NO.4)。

[0048] PCR反应条件：95℃15s，58℃30s，72℃30s，30个循环反应。

[0049] 反应体系如以下表1所示：

[0050] 表1

[0051] 物质体积(μl)，总体积20μlH2O 12.5
10×反应缓冲液 2
10μM上游引物 2
10μM下向引物 2
Taq酶 0.5
DNA模板 1μg(1μl)

[0052] 将PCR反应产物进行测序分析。筛选到克隆号1B5细胞株的KDR表达水平与NF-κB测序结果如图4所示。

[0053] 筛选VEGF刺激诱导荧光素酶报告基因阳性细胞株

[0054] 对单克隆筛选到的细胞株进行荧光素酶报告基因检测。将HEK293KDR-NF-kB-Luc2P细胞的各单克隆细胞按照空白对照组和VEGF刺激组分成两组，将细胞按照5×104/孔分别种植到各组中。空白对照组加入PBS，VEGF组加入50ng/ml VEGF蛋白，与细胞共孵育6小时，37℃。孵育完成后，分别加入等体积细胞裂解液和荧光素酶底物，室温孵育不超过5分钟。然后将白色细胞培养板置于酶标仪进行化学发光模块检测读数。克隆号1B5荧光读数结果如图5所示。

[0055] 阿柏西普生物学活性的检测

[0056] 在进行检测阿柏西普融合蛋白的生物学活性时，将HEK293KDR-NF-kB-Luc2P细胞(克隆号1B5)接种于白色96孔板中，5×104/孔，75μl/孔，每个剂量2个复孔。按实验要求设计阴性对照组、阳性对照组和阿柏西普组。同时按照实验设计加入各处理因素，阴性对照为非特异性IgG抗体(Santa cruz公司，货号：sc-2025)，浓度1μg/ml；阳性对照组为50ng/ml的VEGF(R&D Systems，货号：293-VE-010)；实验组加入50ng/ml的VEGF和阿柏西普(Eylea，批号572A)个浓度梯度(浓度为0.46、1.37、4.12、12.35、37.04、111.11、333.33和1000.00ng/ml，共8个浓度点)。

[0057] 将细胞与个药物培养板置于37℃、5％CO2、100％湿度细胞培养箱中培养6小时。6小时后，加入等体积细胞裂解液与荧光素酶底物混合物。室温孵育不超过5分钟，然后进行信号检测(BioTek H1仪器)，读数时间为100ms，中间间隔50ms。检测结果如图6所示。

标题	发布/更新时间	阅读量
具转染力的分子-专利编号CN1163896A	2020-05-13	698
细胞转染-专利编号CN1158898A	2020-05-11	577
聚肽型转染试剂-专利编号CN100434520C	2020-05-12	289
聚肽型转染试剂-专利编号CN1821399A	2020-05-13	927
转染颗粒-专利编号CN1290178A	2020-05-11	918
细胞转染方法-专利编号CN104619848A	2020-05-12	832
转染具有基因沉默活性的寡核苷酸的组合物-专利编号CN101631553B	2020-05-12	415
具转染力的分子-专利编号CN1281620C	2020-05-13	76
转染剂-专利编号CN1845932A	2020-05-11	828
转染剂-专利编号CN102131926A	2020-05-11	743

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