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ETS2和MESP1由成纤维细胞生成心脏祖细胞

阅读：367发布：2020-05-11

IPRDB可以提供ETS2和MESP1由成纤维细胞生成心脏祖细胞专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且利用异源基因表达来调节细胞分化能力的方法。本发明的一些实施方案涉及通过将重编程因子递送至细胞从而诱导出心脏祖细胞的方法，其中所述重编程因子包含ETS2或者ETS2与Mesp1的组合。，下面是ETS2和MESP1由成纤维细胞生成心脏祖细胞专利的具体信息内容。

权利要求

1.制备诱导出的心脏祖细胞的方法，该方法包括

(a)用ETS2转导体细胞形成经ETS2处理的细胞，其中所述经ETS2处理的细胞产生在所述体细胞中不存在的多能干细胞标志物蛋白；以及(b)用Mesp1转导经ETS2处理的细胞形成心脏祖细胞，其中所述心脏祖细胞产生在所述体细胞和所述经ETS2处理之细胞中均不表达的心脏细胞标志物蛋白，其中所述体细胞是正常人皮肤成纤维细胞。

2.权利要求1的方法，其中所述ETS2基因由SEQ ID NO:9的DNA序列组成。

3.权利要求1的方法，其中所述Mesp1基因由SEQ ID NO:6的DNA序列组成。

说明书全文

ETS2和MESP1由成纤维细胞生成心脏祖细胞

技术领域

[0001] 本申请要求享有2010年3月5日提交的、名称为“ETS2 AND MESP1GENERATE CARDIAC PROGENITORS FROM FIBROBLASTS”的美国临时专利申请系列号61/339,509的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

[0002] 本发明的一个方面一般地涉及细胞分化领域，更特别地涉及通过成纤维细胞的分离、更新以及定向分化为特定的成熟的心脏细胞类型、起搏细胞类型、平滑肌细胞类型和内皮细胞类型从而使心血管组织再生的策略。

背景技术

[0003] 哺乳动物心脏组织的损伤常常导致大量心脏细胞(包括成熟的心脏细胞、起搏细胞、平滑肌细胞和内皮细胞)损失。尽管有迹象表明，心脏细胞能够在人中再生(Bergmann等，2009)，但是其机制并不清楚，并且该过程对于修复常见类型的心脏损伤(例如缺血、梗塞、创伤或者由于毒素或病毒感染引起的伤害)来说似乎进行得不够快。因此，实验性心脏药物的中心目标是研发使由于心脏损伤而损失的心脏细胞再生的方法。已进行了对胚胎心脏发生机制的研究，其目标是在体外或体内复制心脏发生过程，以达到使受损组织再生的目的。

[0004] 最近的研究已鉴定出多能(Isl1+)心血管祖细胞(multipotent(Isl1+)cardiovascular progenitor，MICP)细胞，其能够分化形成成熟的心脏组织。已分离了来源于胚胎干细胞(embryonic stem(ES)cell)的MICP细胞，其能够产生内皮细胞、心脏细胞和平滑肌细胞(Moretti等，2006)。基因研究已表明，这些MICP细胞表达Isl1、Nkx2.5和Flk1。

[0005] 研究心脏发生的模型系统包括海鞘类玻璃海鞘(Ciona intestinalis)(Beh等，2007)。谱系研究已显示，成年玻璃海鞘的心脏来源于两种表达Ci-Mesp(碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子)以及Ci-Est1/2的起始细胞(founder cell)(Imai等，2004；Satou等，2004)。此外，还表达保守的心脏特化基因NK4(tinman nkx2.5)、GATAa(pannier/GATA4/5/6)、Hand和Hand样的海鞘类直系同源物(Imai等，2003；Davidson，2007；
Davidson和Levine，2003；Satou等，2004)。Ci-Mesp敲低的胚胎不发育出心脏原基(primordia)，并且对Ets1/2活性的靶向抑制还阻断了心脏特化和心脏区的扩展。类似地，Ci-Mesp、Mesp1、Mesp2的鼠同源物表达于定向为颅骨-心脏中胚层的早期中胚层中(Saga等，2000)。只有Mesp1/Mesp2双敲除的小鼠缺乏心脏中胚层(Saga等，1999；Kitajima等，
2000)，这表明这些基因在指导高等脊椎动物中出现心脏祖细胞中发挥作用。Mesp基因的冗余使得胚胎中的进一步研究成为艰难的任务。

[0006] 本领域中所需的是诱导心脏发生的方法，以实现心脏细胞再生从而用于治疗受损心脏组织的目的。Yamanaka、Thomson和Daley小组已报道了利用有限数目的、对于保持自我更新和多能性来说重要的转录因子使人的体细胞重编程为多能细胞(Takahashi等，2007；Yu等，2007；Park等，2008)。本发明的一个方面提供了使体细胞重编程以及定向分化为心脏祖细胞的方法。因此，本申请的一个实施方案提供了测试如下独特的调节模式的方法，在所述调节模式中，ETS2和Mesp1是转化性的(transformative)(这与NKX2.5和ISL1不同)，其将非胚胎的正常人皮肤成纤维细胞(normal human dermal fibroblast，NHDF)转变为初级心脏祖细胞。本申请的另一个方面是阐述Mesp1在指导心脏祖细胞出现的调节层次中的作用。

[0007] 概述

[0008] 本发明的一个实施方案涉及使用异源基因表达来调节细胞分化能力。本发明的一些实施方案涉及通过将重编程因子(reprogramming factor)递送至细胞从而诱导出心脏祖细胞的方法，其中所述重编程因子包含ETS2或者ETS2与Mesp1的组合。

[0009] 本发明的另一个实施方案提供了通过使体细胞重编程而诱导出的心脏祖细胞，其中所述重编程包括将包含ETS2基因的重编程因子递送至体细胞。所述体细胞可以是正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)，所述重编程因子可以是ETS2或Mesp1或者其组合。

[0010] 本发明的又一个实施方案提供了使体细胞重编程以产生心脏祖细胞的方法，其中所述重编程包括将包含ETS2基因的重编程因子递送至体细胞。所述体细胞可以是NHDF，所述重编程因子可以是ETS2或Mesp1或者其组合。

附图说明

[0011] 以下附图构成本说明书的一部分，其进一步表明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一幅或多幅并结合本文中对特定实施方案的详细描述，可更好地理解本发明。

[0012] 图1显示插入了ETS2和ELK4全长DNA编码序列的慢病毒示意图。功能性元件和缩写：组成型Ef-1α启动子、多克隆位点(multiple cloning site，MCS)、来自人脊髓灰质炎病毒的内部核糖体进入位点(independent ribosome entry site，IRES)、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的编码序列、旱獭肝炎病毒转录后调节元件(Woodchuck Hepatitis Posttranscriptional Regulatory Element，WPRE)、活化结构域(activation domain，AD)、DNA结合ETS结构域。这些质粒通过标准的重组DNA克隆技术得到，随后用于制备慢病毒，以感染正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)；

[0013] 图2显示( 上图) 经空慢病毒(pWPI-GFP)、pWPI-ELK4-GFP慢病毒或pWPI-ETS2-GFP慢病毒处理的NHDF，以及(下图)经空病毒、携带ETS2的病毒、携带ELK4的病毒感染的细胞或者未感染的第3代NHDF(NHDF-P3)中GAPDH、NANOG、OCT3/4、SOX2的表达水平；

[0014] 图3显示使用针对干细胞标志物NANOG的抗体在经携带ETS2(而非ELK4或空载体)之慢病毒感染的NHDF-P3细胞中的免疫荧光染色(上图)。使用抗ETS2抗体进行的蛋白质印迹显示，经携带ETS2之慢病毒感染4周的NHDF中表达ETS2，而经空慢病毒感染的NHDF显示无表达(左下图)。利用抗ETS2抗体进行的免疫荧光染色证实了经ETS2慢病毒感染之细胞中的诱导表达(右下图)；

[0015] 图4显示培养4周后干细胞样集落中干细胞标志物NANOG、OCT3/4，SOX2、REX1和c-MYC的诱导。荧光颜色(图中未显示颜色)如下：DAPI(蓝色)、GFP(绿色)、NANOG和OCT3/4(红色)，所有这三种颜色的混合见于“合并”图中。依要求可以提供彩色荧光图像。

[0016] 图5显示表明H9人胚胎干细胞(A)、未感染的NHDF(B)或经ETS-2感染的细胞(C)的百分比的流式细胞图，其中对干细胞表面标志物SSEA-3进行染色。阴性对照，黑线；SSEA-3染色，灰线；

[0017] 图6显示表明H9人胚胎干细胞(A)、未感染的NHDF(B)或经ETS-2感染的细胞(C)的百分比的流式细胞图，其中对干细胞表面标志物Tra-1-81进行染色。阴性对照，黑线；Tra-1-81染色，灰线；

[0018] 图7显示用Mesp1慢病毒感染后的EPS细胞图像。用DAPI对细胞进行染色以使细胞核可见(左图)，用特异性针对ISL1、NKX2.5、GATA4、MEF2C、TNT和MHC3的抗体对细胞染色以使所示心脏祖细胞蛋白可见(右图)。中间的图显示细胞的相差图像。荧光颜色如下：DAPI(蓝色)，蛋白特异性染色(红色)。依要求可以提供彩色荧光图像；

[0019] 图8显示仅通过ETS2和Mesp1之组合诱导的NKX2.5、ISL1、GATA4、MEF2C、TBX5、MHC3、TNT、MLC2、CX43和CX45的表达(使用RT-PCR检测)。单独使用ETS2或Mesp1均不能在NHDF中诱导这些心脏发生基因。

[0020] 图9显示心脏祖细胞程序的顺序性的从头(de novo)诱导。用ETS2慢病毒感染NHDF，培养4周，用Mesp1慢病毒感染并培养7天，然后通过悬滴(hang-drop)法使其聚集，并铺板于经明胶包被的培养皿上；

[0021] 图10显示心脏祖细胞程序基因表达的活化，其通过报告蛋白Red-Tomato的荧光进行测定，所述报告蛋白仅当心脏祖细胞因子NKX2.5表达时表达。荧光颜色(图中未显示颜色)如下：GFP(绿色)、Red(红色)，这两种颜色的混合见于“合并”图中；

[0022] 图11显示从经ETS2和Mesp1慢病毒感染的NHDF获得、并针对GFP或者GFP与报告蛋白Red-Tomato进行分选的心脏祖细胞的流式细胞图；

[0023] 图12显示培养9天后心脏祖细胞中内皮和心脏细胞表面标志物CD31、CD34和CD144的展示；以及

[0024] 图13显示重编程的心脏祖细胞中节律性搏动的数据。用Mesp1慢病毒以及携带肌球蛋白重链启动子(其驱动嘌呤霉素抗性基因)的病毒感染EPS细胞。为了选择对抗生素具有抗性的心脏祖细胞，用50μg/ml的嘌呤霉素处理细胞。9天后，观察到细胞培养物中的节律性搏动，并通过视频显微镜拍摄并转换为MPEG视频。对每个培养皿中的每个培养聚集体的搏动进行20秒计数，然后乘以3，得到每分钟的搏动。对组织培养皿或孔中的每个聚集体进行3次单独测定。

[0025] 优选实施方案的详述

[0026] 本发明的一个实施方案涉及利用异源基因表达来调节细胞分化。本发明的一些实施方案涉及通过将重编程因子递送至细胞从而诱导出心脏祖细胞的方法，其中所述重编程因子包含ETS2或者ETS2与Mesp1的组合。

[0027] 本发明的一个实施方案提供了通过对体细胞重编程而诱导出心脏祖细胞的方法，其中重编程包括将包含单一异源基因的重编程因子递送至体细胞。所述体细胞可以是成纤维细胞，优选为正常人皮肤成纤维细胞。所述异源基因可以是ETS2。所述异源基因可包含人ETS2编码序列(SEQ IDNO：9)或ETS2基因(SEQ ID NO：7)，或者所述异源基因可编码人ETS2蛋白质序列(SEQ ID NO：8)。由编程引起的经诱导的干细胞样细胞可表现出心脏发生或者心脏祖细胞之其它特征，包括表达心脏祖细胞因子(例如NKX2.5、ISL1、MEF2C、dHAND和GATA4)或者节律性搏动。

[0028] 本发明的另一个实施方案提供了通过使体细胞重编程而诱导出心脏祖细胞的方法，其中重编程包括将包含两种异源基因的重编程因子递送至体细胞。所述体细胞可以是成纤维细胞，优选为正常人皮肤成纤维细胞。所述异源基因可以是ETS2和Mesp1。所述异源基因可包含人ETS2编码序列(SEQ ID NO：9)、ETS2基因(SEQ ID NO：7)或编码人ETS2蛋白质序列(SEQ ID NO：8)的DNA序列以及小鼠Mesp1编码序列(SEQID NO：6)、小鼠Mesp1基因(SEQ ID NO：4)或编码小鼠Mesp1蛋白质序列(SEQ ID NO：5)的DNA序列。由编程引起的经诱导的干细胞样细胞可表现出心脏发生或者心脏祖细胞之其它特征，包括表达心脏祖细胞因子(例如NKX2.5、ISL1、MEF2C、dHAND和GATA4)或者节律性搏动。

[0029] 在本发明的另一个实施方案中，可通过使用重组载体将重编程因子递送至体细胞来实现对体细胞重编程。还可以使用慢病毒转导系统递送重编程因子，从而在体细胞中表达重编程因子。在这些实施方案中，所述重编程因子可以是ETS2和Mesp1。

[0030] 本发明的又一个实施方案提供了经重编程的体细胞，其中重编程包括将包含单一异源基因或多个异源基因的重编程因子递送至体细胞。所述体细胞可以是成纤维细胞，优选为正常人皮肤成纤维细胞。所述异源基因可以是ETS2，或者所述多个异源基因可以是ETS2和Mesp1。由编程引起的经诱导的干细胞样细胞可表现出心脏发生或者心脏祖细胞之其它特征，包括表达心脏祖细胞因子(例如NKX2.5、ISL1、MEF2C、dHAND和GATA4)或者节律性搏动。

[0031] 实施例1

[0032] 重编程因子的选择

[0033] 已注意到高度保守的DNA结合结构域ETS结构域(图1)能够与在很多干细胞标志物基因之启动子上发现的5’-GGA(A/T)-3’DNA核心基序结合。ETS2的表达与细胞永生、肿瘤形成的介导以及端粒酶活性的增强有关。

[0034] 利用慢病毒载体将ETS2和ELK4(其DNA结合区域与ETS2同源的ETS家族基因)转导入NHDF-P3中。一周内，用含有ETS2的慢病毒载体转导的成纤维细胞代之以高度增殖性的小圆形细胞。在用空慢病毒转导的对照中或者用含有ELK4的慢病毒载体转导的成纤维细胞中未观察到这些高度增殖性的细胞(图2-3)。

[0035] 实施例2

[0036] 慢病毒转导系统

[0037] 图1显示插入了ETS2(SEQ ID NO：9)和ELK4(SEQ ID NO：3)DNA编码序列的慢病毒示意图。注意到，仅ETS2具有pointed结构域。用这些质粒制备慢病毒，以感染NHDF。ETS2全长序列(SEQ ID NO：7)包含编码ETS2蛋白序列(SEQ ID NO：8)的ETS2编码序列(SEQ ID NO：9)。ELK4全长序列(SEQ ID NO：1)包含编码蛋白序列(SEQ ID NO：2)的ELK4编码序列(SEQ ID NO：3)。

[0038] 空慢病毒载体pWPI-eGFP由D.Trono博士(Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne，Switzerland)惠赠。用于克隆人ETS2和ELK4基因的cDNA(克隆ID：3852274和4364006)获自Open Biosystems，而Mesp1 cDNA由Y.Saga博士(National Institute of Genetics，Mishima，Japan)惠赠。通过PCR克隆将起始蛋白质翻译的共有Kozak序列和表位HA-标签分别加至ETS2、ELK4和Mesp1编码序列的5’和3’端。

[0039] 慢病毒的包装和感染如下进行：用pWPI-eGFP、或pWPI-ELK4-eGFP(人ELK4编码序列，SEQ ID NO：3)、或pWPI-ETS2-eGFP(人ETS2编码序列，SEQ ID NO：9)、或pWPI-Mesp1-eGFP( 小鼠 MesP1 序列，SEQ ID NO：6)、或 SMPU-alphaMHC/puro-Rex1/Blast(由M.Mercola博士惠赠，Burnham Institute for Medical Research，La Jolla，CA)转染6cm皿中接种的293FT细胞。将4.5μg的各构建体于室温下在458μl的无血清Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)以及27.5μl Fugene(Roche)、2.8μg包装载体psPAX2和1.9μg包膜载体pMD2.G的溶液中混合25分钟。随后，将该混合物加至无酚红DMEM(Invitrogen)培养的293FT细胞，所述DMEM中还添加有10％FBS(热灭活)、0.1mM MEM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠和6mM L-谷氨酸盐。培养24～26小时后，收集含有病毒颗粒的培养基3天，用于感染。

[0040] 用所收集的培养基感染培养于Fibroblast Basal Medium(FBM，Lonza)中的NHDF，6
直至80％汇合。转染前，将细胞以2.5×10个细胞/皿的密度重新接种于6cm Petri皿中，将培养基更换为StemPro，然后加入病毒颗粒和聚凝胺(终浓度为8μg/ml)。为了提高感染效率，在48小时内重复该步骤。所有细胞均培养于37℃和5％CO2下。

[0041] 实施例3

[0042] 重编程细胞中的基因表达

[0043] 图2显示，在培养7天内，ETS2慢病毒诱导干细胞出现以及诱导干细胞标志物蛋白NANOG、OCT3/4和SOX2，而ELK4慢病毒则不然。图2的上图显示在病毒感染前在添加有hFGF-β、胰岛素、庆大霉素/两性霉素和2％FBS(添加物由Lonza提供)的FBM中生长至约80％汇合度的NHDF(Lonza，USA，cc-2509)。用空pWPI-eGFP和pWI-ELK4-eGFP和pWPI-ETS2-eGFP慢病毒分别感染NHDF-P3。在经胶原蛋白包被的Petri皿上，在人诱导型多能培养基StemPro hES SFM(Invitrogen)中培养经感染和未经感染的NHDF-P3细胞7天。如绿色荧光显微镜所示，克隆进慢病毒载体中的绿色荧光蛋白在经感染细胞中表达。在该培养期间，观察到形态学变化，其中经ETS2感染之NHDF的外形由细长的多形性成纤维细胞形状变为圆形的“干细胞样细胞”。相比而言，经空慢病毒载体或ELK4慢病毒载体感染的NHDF未改变细胞形状。

[0044] 图2的下图显示对重编程细胞的逆转录PCR(RT-PCR)分析。用冰冷的PBS清洗细胞，并用Qiagen RNeasy Kit分离RNA。利用MMLV逆转录酶(Invitrogen)使RNA转录，并使用LA16聚合酶混合物针对GAPDH、NANOG、OCT3/4、SOX2进行PCR扩增(30个循环)(参考表1的引物组)。所述酶混合物利用15μl KlenTaq1(25单位/μl，AbPeptides，St Louis，MO)和1μl Pfu(2.5单位/μl，Stratagene，La Jolla，CA)制备。然后，利用2％琼脂糖凝胶对经扩增的DNA样品进行电泳，溴化乙锭染色显示经ETS2感染的细胞中诱导表达出干细胞标志物基因NANOG、OCT3/4和SOX2，而NHDF-P3或者经ELK4或空慢病毒感染的细胞中则没有。

[0045] 表1.用于心脏祖细胞研究的引物

[0046]

[0047]

[0048] 实施例4

[0049] 重编程细胞中的干细胞标志物蛋白

[0050] 图3显示使用针对干细胞标志物NANOG的抗体对经感染的NHDF-P3进行免疫荧光染色。在经ETS2感染的细胞中显示诱导的NANOG染色，而经ELK4或空载体感染的细胞则不然。而且，利用ETS2特异性抗体进行的蛋白质印迹显示其在经ETS2慢病毒感染的细胞(而非经空慢病毒感染的NHDF)中表达。

[0051] 图4显示培养4周后经ETS2慢病毒诱导的干细胞样集落以及干细胞标志物蛋白NANOG、OCT3/4、SOX2、REX1和c-MYC的诱导。左上图显示经ETS2病毒感染的NHDF转变为小圆形细胞的集落，其与培养的鼠和人胚胎干细胞高度相似。注意集落通过ETS2慢病毒感染被GFP标记。未感染的成纤维细胞不能变圆，并且无GFP染色或形成细胞集落。

[0052] 图4的右上图显示通过RT-PCR分析的、经ETS2诱导的细胞集落中干细胞标志物基因NANOG、OCT3/4、SOX2、REX1、KLF4和c-MYC的表达。下方是经ETS2感染的细胞中NANOG、OCT3/4、SOX2和c-MYC的定量RT-PCR图示。

[0053] 图4的下图通过用特异性抗体进行免疫荧光染色证实了经ETS2诱导的细胞集落中存在NANOG和OCT3/4蛋白。

[0054] 实施例5

[0055] 用ETS2转导的细胞的特征

[0056] 图5显示约97％的H9人胚胎干细胞呈现干细胞表面标志物SSEA-3染色(A图)。与经空慢病毒感染的NHDF少于2％染色相比(B图)，超过60％的经ETS2感染的细胞也展示出表面标志物SSEA-3(C图)。因此，ETS2有效地将NHDF转变为具有SSEA-3表面标志物、与人胚胎干细胞相似的细胞。

[0057] 利用BD Biosciences LSR II分析仪进行流式细胞分析。用胰蛋白酶使汇合的形6
成集落之细胞离散，用PBS清洗并稀释成浓度为5×10个细胞/ml PBS的8份样品(每份
100μl)。其后，用10μl正常人血清封闭5分钟。依照生产商的说明书对SSEA-3-PE抗体(Becton Dickinson)进行稀释以及添加，于4℃孵育1小时。然后，加入400μl PBS，使混合物旋转沉淀，弃去一半上清液，加入200μl PBS并通过流式细胞术进行测定。

[0058] 图6显示如针对SSEA-3进行地、针对干细胞表面标志物Tra-1-81染色之细胞的流式细胞分析。约45％的H9人胚胎干细胞呈现Tra-1-81染色(A图)。经空慢病毒(不携带异源基因)感染的NHDF未检测到Tra-1-81染色(B图)。ETS2病毒感染使得约39％的细胞展示出胚胎干细胞标志物Tra-1-81(C图)。这表明ETS2有效地将NHDF转变为具有Tra-1-81表面标志物、与人胚胎干细胞相似的细胞。

[0059] 仅在用含有ETS2的慢病毒载体转导NHDF-P3后观察到OCT3/4、NANOG和SOX2基因转录物，而用空慢病毒载体或者含有ELK4的载体转导后则不然。可见OCT3/4、NANOG和SOX2转录物(图2)，利用免疫荧光可见诱导的NANOG(图3)。

[0060] 通过蛋白质印迹可见，用ETS2对NHDF-P3细胞进行慢病毒转导使得4周内所有细胞群均显示强烈的ETS2表达(图3)。这些经ETS2转导的细胞形成大的绿色荧光集落，其与多能ES和/或经诱导的多能干(induced pluripotent stem，iPS)细胞类似。

[0061] 通过RT-PCR和定量PCR以及免疫染色测定地，用ETS2使成纤维细胞重编程导致多能标志物基因NANOG、OCT3/4、SOX2和c-MYC的强表达。此外，流式细胞分析显示ETS2有效地将NHDF转变为具有表面标志物SSEA-3和Tra-1-81、与人胚胎干细胞相似的细胞。因此，这些经ETS2处理的人成纤维细胞在表达多能干细胞标志物蛋白的能力方面与iPS细胞相似。因而将这些细胞命名为“EPS”细胞。

[0062] 实施例6

[0063] ETS2和Mesp1的组合在成纤维细胞中从头诱导心脏祖细胞程序

[0064] 接下来，用小鼠Mesp1对EPS细胞进行慢病毒转导。可以利用由ES细胞形成拟胚体(embryoid body)的方案对所得的表达Mesp1之EPS细胞进行诱导，以形成拟胚体。进一步用活化素和BMP4处理经铺板的细胞聚集体4天，然后在第10天进行检测。即使在用Mesp1转导并加入生长因子成形素(morphogen)后，干细胞标志物仍组成型表达。

[0065] 通过免疫染色观察到，心脏祖细胞因子ISL1、NKX2.5、GATA4、MEF2C、TNT和MHC仅在经表达Mesp1之慢病毒感染的EPS细胞中强烈诱导。图7显示用DAPI染色以使核可见的细胞(左图)、相差图像(中图)以及用特异性抗体染色以使所示蛋白可见的细胞(右图)。

[0066] 图8显示MesP1感染EPS细胞诱导最初为NHDF之细胞的从头的心脏祖细胞程序。聚集后的心脏祖细胞铺板一周，然后进行RNA分离。利用MMLV逆转录酶使RNA转录，并利用LA-16聚合酶混合物针对GAPDH、NKX2.5、ISL1、GATA4、MEF2C、TBX5、MHC3、TNT、MLC2、CX43和CX45进行30个循环的PCR扩增(参考表1的引物组)。

[0067] 图8显示在培养4周、聚集和铺板7天的EPS细胞中，通过RT-PCR未观察到早期心脏发育之标志物的转录物。类似地，用Mesp1单独感染NHDF后未检测到早期心脏发育标志物的明显表达。然而，将Mesp1加至EPS细胞中则诱导了心脏中胚层祖细胞标志物(包括NKX2.5、ISL1、GATA4、MEF2C、TBX5)的强烈表达，以及心脏收缩蛋白(包括αMHC和肌钙蛋白T)基因表达。

[0068] 图9显示，如通过RT-PCR测定地，MesP1感染EPS细胞诱导顺序性的从头的心脏祖细胞程序。用ETS2慢病毒感染NHDF-P3细胞，培养4周，然后用Mesp1慢病毒感染、聚集以及铺板7天。每天分离RNA，并通过RT-PCR分析心脏发生基因的表达。

[0069] 图10显示，如通过由报告构建体NKX2.5-Red Tomato呈现RedTomato荧光染色所显示地，MesP1感染EPS细胞诱导从头的心脏程序基因表达。将在心脏祖细胞中活化的NKX2.5/Smad/GATA增强子连接至与嘌呤霉素抗性基因、IRES序列和强效报告基因td-Tomato(cDNA由R.Tsien博士惠赠，University of California，San Diego)相邻的最小HSP68启动子。如上所示，GFP染色是由于ETS2和Mesp1慢病毒感染NHDF所致。Red Tomato荧光与ETS2/Mesp1通过诱导NKX2.5基因表达从而驱动转变为心脏祖细胞相一致。注意到，出现了很多三角形和矩形的细胞，其形状与心肌细胞高度相似。

[0070] 图11，A图显示心脏祖细胞的FACS分选的总结，所述心脏祖细胞由顺序地用ETS2慢病毒处理NHDF、然后用Mesp1慢病毒处理所得EPS细胞而获得。利用BD Biosciences LSR II分析仪进行流式细胞分析。用胰蛋白酶使汇合的形成集落之细胞离散，用PBS清洗并稀释成浓度为5×106个细胞/ml PBS的8份样品。图A显示GFP染色细胞表明总的慢病毒感染，因为每个病毒均带有GFP标签。B图显示约19％的经ETS2和Mesp1感染的细胞均具有GFP和Red-Tomato染色(阴影区)。如通过关键性心脏发生报告基因NKX2.5 Red-Tomato的活化所证实地，ETS2和Mesp1有效地将NHDF转变为具有与心脏祖细胞相似之特征的细胞。

[0071] 图12显示，培养9天后，约10～40％的经ETS2和Mesp1感染的NHDF细胞展示出内皮和心脏细胞表面标志物CD31、CD34和CD144。这同样也证明了ETS2和Mesp1有效地将NHDF转变为具有与胚胎内皮细胞和心肌细胞相似之特征的细胞。

[0072] 实施例7

[0073] 重编程细胞的心脏特性

[0074] 利用与嘌呤霉素抗性基因相连的慢病毒心脏特异性α-肌球蛋白重链(α-MHC)启动子和增强子进行嘌呤霉素选择系统的慢病毒转导导致心脏祖细胞富集，并且随后观察到经转导细胞的节律性搏动，这与心肌细胞中观察到的类似。

[0075] 将驱动嘌呤霉素选择基因构建体的肌球蛋白重链启动子转导入NHDF中，然后用ETS2和Mesp1依次进行转导。随后，用50μg/ml的嘌呤霉素对在悬滴拟胚体形成过程中获得的细胞聚集体进行处理，以选择具有嘌呤霉素抗性并因而具有心脏特异性α-MHC活性启动子的细胞。

[0076] 9天后，利用视频显微镜观察细胞培养物中的搏动并拍摄，将其转换为MPEG视频。对每个培养皿中每个培养聚集体的搏动进行20秒计数，然后乘以3，得到每分钟的搏动次数(图13)。对组织培养皿或孔中的每个聚集体进行3次单独测定。

[0077] 如通过RT-PCR和免疫染色所测定地，用Mesp1使EPS细胞重编程导致心脏祖细胞基因的强表达。此外，流式细胞分析显示Mesp1有效地将EPS细胞转变为具有表面标志物CD31、CD34和CD144的细胞，其与人心脏细胞相似。最后，在细胞培养物中观察到了节律性搏动。这完成了由皮肤成纤维细胞向终末分化之心脏发生细胞的转变。

[0078] 所引用的参考文献

[0079] 以下参考文献以其提供对本文进行补充的示例性方法或其它细节的程度通过引用具体并入本文。

[0080] 美国专利文件

[0081] 美国专利公开No.2009/0227032，S.Yamanaka

[0082] 非专利参考文献

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永生化鸡胚成纤维细胞-专利编号CN107002044A	2020-05-12	894
ETS2和MESP1由成纤维细胞生成心脏祖细胞-专利编号CN102844428A	2020-05-11	890
成纤维细胞生长因子11-专利编号CN1414101A	2020-05-13	875
ETS2和MESP1由成纤维细胞生成心脏祖细胞-专利编号CN102844428B	2020-05-11	367
防止成纤维细胞皱缩-专利编号CN104582683A	2020-05-12	966
成纤维细胞增殖剂-专利编号CN101795668B	2020-05-12	500
一种成纤维细胞培养液-专利编号CN102690782A	2020-05-13	506
成纤维细胞生长因子11-专利编号CN1181110A	2020-05-13	114
诱导成纤维细胞形成软骨细胞的方法-专利编号CN100482784C	2020-05-11	565
诱导成纤维细胞形成软骨细胞的方法-专利编号CN1661010A	2020-05-11	855

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