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永生化鸡胚成纤维细胞

阅读：895发布：2020-05-12

IPRDB可以提供永生化鸡胚成纤维细胞专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及永生化鸡胚成纤维细胞，包含此类永生化细胞的细胞培养物，包含此类细胞的疫苗，用于在此类细胞上繁殖禽类病毒的方法，以及制备此类细胞和此类疫苗的方法。，下面是永生化鸡胚成纤维细胞专利的具体信息内容。

权利要求

1.稳定转染的永生化鸡胚成纤维细胞(CEF)，其特征在于所述永生化CEF表达SV40 T抗原、表达在异源启动子控制下的鸡端粒酶(cTERT)且不包含外源性逆转录病毒长末端重复DNA。

2.细胞培养物，其包含根据权利要求1的永生化CEF。

3.根据权利要求2的细胞培养物，其特征在于所述细胞培养物是禽类病毒或禽类病毒载体感染的。

4.根据权利要求3的细胞培养物，其特征在于所述禽类病毒或禽类病毒载体选自马立克氏病病毒(MDV)、MDV相关的火鸡疱疹病毒(HVT)、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、减蛋综合征病毒(EDSV)、火鸡鼻气管炎病毒(TRT)、呼肠孤病毒(RV)和包含IBDV VP2-基因、IBV-刺突蛋白基因、禽流感HA基因、ILT gD/gI蛋白基因或NDV F-基因的HVT载体。

5.用于制备根据权利要求1的永生化CEF的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：a) 获得原代CEF细胞，

b) 用以下转染所述原代CEF：1) 不含LTR序列的DNA分子，其包含转座子反向重复且包含在合适启动子控制下的编码SV40 T抗原的基因，2) 不含LTR序列的DNA分子，其包含转座子反向重复且包含在合适启动子控制下的编码鸡端粒酶cTERT的基因，和3) 包含在合适启动子控制下的编码转座酶的基因的DNA分子，c) 选择已经培养至少45个细胞周期的CEF细胞。

6.用于制备根据权利要求1的永生化CEF的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：a) 获得原代CEF细胞，

b) 用不含LTR序列的单一DNA分子转染所述原代CEF细胞，所述单一DNA分子包含转座子反向重复且包含在合适启动子控制下的编码SV40 T抗原的基因和在合适启动子控制下的编码鸡端粒酶的基因两者且包含在合适启动子控制下的编码转座酶的基因，c) 选择已经培养至少45个细胞周期的CEF细胞。

7.用于制备根据权利要求1的永生化CEF的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：a) 获得原代CEF细胞，

b) 用以下转染所述原代CEF细胞：1) 不含LTR序列的DNA分子，其包含转座子反向重复，包含在合适启动子控制下的编码SV40 T抗原的基因和在合适启动子控制下的编码鸡端粒酶的基因两者，以及2) 包含在合适启动子控制下的编码转座酶的基因的DNA分子，c) 选择已经培养至少45个细胞周期的CEF细胞。

8.根据权利要求5-7中任一项的方法，其特征在于在步骤c)中选择已经培养至少100个细胞周期的细胞。

9.禽类病毒或禽类病毒载体的复制方法，所述方法包括以下步骤：a) 培养根据权利要求1的永生化CEF，

b) 将永生化CEF与所述禽类病毒或禽类病毒载体接触，

c) 允许所述禽类病毒或禽类病毒载体复制，和

d) 分离后代病毒。

10.根据权利要求9的方法，其特征在于所述禽类病毒或禽类病毒载体选自由马立克氏病病毒(MDV)、MDV相关的火鸡疱疹病毒(HVT)、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、减蛋综合征病毒(EDSV)、火鸡鼻气管炎病毒(TRT)、呼肠孤病毒(RV)和包含IBDV VP2-基因、IBV-刺突蛋白基因、禽流感HA基因、ILT gD/gI蛋白基因或NDV F-基因的HVT载体组成的禽类病毒组。

11.根据权利要求9的方法，其特征在于所述禽类病毒或禽类病毒载体选自由MDV和MDV载体病毒组成的禽类病毒组。

12.用于制备包含禽类病毒或禽类病毒载体的疫苗的方法，其特征在于所述方法包括将根据权利要求3或4的细胞培养物与药学上可接受的载体混合的步骤。

13.根据权利要求12的方法，其特征在于所述禽类病毒或禽类病毒载体是MDV。

14.根据权利要求12的方法，其特征在于所述疫苗中的MDV或MDV病毒载体是活减毒形式。

15.疫苗，其包含权利要求3或4的细胞培养物和药学上可接受的载体。

16.用于制备包含禽类病毒或禽类病毒载体的疫苗的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：a) 用禽类病毒或禽类病毒载体感染根据权利要求2的细胞培养物b) 复制所述禽类病毒或禽类病毒载体

c) 分离后代病毒

d) 将所述后代病毒与药学上可接受的载体混合。

说明书全文

永生化鸡胚成纤维细胞

[0001] 本发明涉及永生化鸡胚成纤维细胞，包含此类永生化细胞的细胞培养物，包含此类细胞的疫苗，用于在此类细胞上复制禽类病毒的方法，以及制备此类细胞和此类疫苗的方法。

[0002] 出于疫苗生产目的的病毒繁殖需要易感宿主细胞的可用性。通常，根据所使用的病毒种类和宿主细胞的类型，这些宿主细胞将在细胞培养物中生长。对于许多禽类病毒种类的繁殖，存在在含胚卵中繁殖的额外可能性。然而在实践中，许多禽类病毒种类生长在原代鸡胚成纤维细胞(CEF)细胞上。(直接从动物培养的细胞被称为原代细胞)。此类原代CEF细胞对许多不同的病毒种类是易感的，并且此类病毒通常可以在这些细胞中生长至高滴度。经常在CEF细胞上生长的病毒的实例是火鸡疱疹病毒(HVT)、马立克氏病病毒、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、减蛋综合征病毒(EDSV)、呼肠孤病毒(RV)和火鸡鼻气管炎病毒(TRT)。

[0003] 然而，使用CEF细胞有几个缺点。它们具有相对较短的体外寿命，并且它们获得自含胚的特定无病原体的卵，所以对于连续需求，其生产既非常费力又非常昂贵。因此，期望建立禽类来源的细胞系来代替原代CEF细胞的使用。

[0004] 对于本发明的目的，永生化的细胞系是源自多细胞生物体的细胞群体(在本情况下为CEF)，其通常不会无限增殖，但由于突变，已逃避正常细胞衰老并反而可以保持进行细胞分裂。此类细胞已逃避持续只有有限数量的分裂周期的正常生长限制。

[0005] CEF细胞(CEF细胞系)的永生化形式原则上可以解决上面鉴定的问题，但此类细胞几乎不可得。获得此类细胞的一种方式是分离和生长原代CEF细胞并等待自发永生化事件发生。然而，对于禽类细胞，自发永生化是非常罕见的。因此，仅已报道过三种自发永生化的鸡细胞系；DF-1 (美国专利US 5672485)，SC-1和SC-2 (Christman, S.A.等人, Dissertation Abstracts Int.65:4414 (2004) (ISBN 0-496-06882-2)。除了发现和分离自发永生化的CEF细胞会非常耗时的事实，还证明，此类永生化的CEF细胞可显示非常不同的特征，诸如随着时间推移可变的生长速率和p53水平，这取决于它们已具有的传代次数(Christman, S.A.等人, FEBS letters 579:6705-6715 (2005))。然而，特别是对于疫苗生产目的，需要这样的细胞系，其特征随着时间推移保持相同，而无论传代次数。FDA已经表明，不鼓励在已通过未知机制转化的赘生性细胞中的最小纯化的活的减毒病毒疫苗的开发(FDA; CBER Discussion on cell substrates；2000年5月12日)。因此，自发永生化的CEF细胞作为用于疫苗目的的病毒繁殖的细胞来源是不太期望的。

[0006] 还有本领域已知用于细胞有意永生化的方法。此类方法的优点是消除了一致性因素(coincidence factor)，已知其为目的在于自发永生化细胞时的严重障碍。对于非禽类细胞，特别是哺乳动物细胞，常用的获得永生化细胞的方法依赖于用逆转录病毒或逆转录病毒载体感染原代细胞，或用包含逆转录病毒或至少逆转录病毒长末端重复(LTR)序列和编码DNA肿瘤病毒癌蛋白(诸如猿猴病毒SV40 T和t)的序列的DNA分子转染原代细胞。

[0007] SV40 T和t在视网膜母细胞瘤(Rb)和p53蛋白的失活中起作用。Deepika Ahuja等人关于编码大T和t的SV40 T的综述论文提供了这些蛋白的作用机制的见解(Oncogene 24:7729-7745 (2005))。基本上，SV40 T基因产物T和t抑制肿瘤抑制因子的p53和Rb家族。

[0008] LTR是包含逆转录病毒基因表达所需的以下所有信号的逆转录病毒元件：增强子、启动子、转录起始、转录终止和多聚腺苷酸化信号。

[0009] 然而，这些LTR被怀疑具有致癌作用。这是由于已知它们顺式激活其他细胞基因的事实和它们可与其他逆转录病毒序列重组于细胞基因组中的事实(Mosier, D.E., Applied Biosafety 9: 68-75 (2004))。因此，使用包含LTR或至少长逆转录病毒序列的逆转录病毒DNA用于转染细胞的严重缺点在于在此类情况下，LTR序列将被引入永生化细胞的DNA中。

[0010] 对于禽类细胞，用包含LTR和表达SV40 T抗原的DNA分子的成功永生化的唯一一个实例是已知的：此类永生化CEF细胞描述于PCT申请WO 97/44443中。

[0011] 此类方法显然不是非常成功。Soo-Hyun Kim描述了用编码SV40 T抗原的逆转录病毒转染CEF细胞，试图通过灭活视网膜母细胞瘤(Rb)和p53肿瘤抑制因子来永生化CEF细胞。(J. Cell Science 119: 2435-2443 (2006))。然而，这仅导致CEF细胞寿命的轻微延长，而不是永生化。

[0012] Kim在当时提出，对有限的寿命延长的可能解释可能是端粒的持续侵蚀。然而，鸡细胞含有具有不同大小类型的端粒重复的大和微染色体(其中一些是间质性的)，使该情况复杂化。因此，在这个时刻，端粒侵蚀和修复的动力学及其对鸡细胞永生化的影响仍不清楚。

[0013] 如果CEF永生化中的关键作用涉及p53和Rb的丧失或端粒酶的活化，则这触及基础和未解决的问题(Campisi, J., Exp. Gerontol. 36: 607-618 (2001)以及Sherr, J.C.和DePinho, R.A., Cell 102: 407-410 (2000))。

[0014] 可以从最近的实验中得出，与Kim的提议相反，端粒酶在CEF细胞永生化中的作用似乎不是关键的。首先，引人注目的是，在自发永生化的CEF细胞系SC-1 (参见上文)中，没有可检测到的端粒酶表达(Christman, S.A.等人, FEBS letters 579: 6705-6715 (2005))。

[0015] 其次，在用cTR、cTERT或cTR和cTERT两者转导或转染鸡细胞的几个直接的实验中，没有获得永生化的鸡细胞(Swanberg, S.E.等人, Exp. Gerontol. 45: 647-654 (2010))。

[0016] 与所有期望相反，现在已经发现，稳定转染的CEF细胞系可以不使用LTR序列，而通过使用DNA分子转染CEF细胞而获得，其中所述DNA分子包含用于将DNA分子整合至细胞基因组中的转座子反向重复，以及在合适启动子控制下的编码SV40 T和t抗原或至少T的基因，和在合适启动子控制下的编码鸡端粒酶(cTERT)的基因二者的组合。转座子反向重复在编码SV40 T和t抗原或至少T的基因和编码(cTERT)的基因稳定整合至CEF基因组中起作用，这是获得根据本发明的稳定转染的永生化CEF的先决条件。

[0017] 因此，本发明的第一个实施方案涉及稳定转染的永生化鸡胚成纤维细胞(CEF)，其特征在于所述稳定转染的永生化CEF表达SV40 T抗原、表达鸡端粒酶(cTERT)且不包含外源性逆转录病毒长末端重复DNA。

[0018] 外源性逆转录病毒LTR DNA被认为是在如上所述的永生化过程期间被引入鸡胚成纤维细胞的DNA。

[0019] 此永生化CEF的细节和特征以及制备此CEF的方法广泛描述于下文中。

[0020] 本发明的第二个实施方案涉及制备此类永生化CEF细胞系的方法。

[0021] 用于制备根据本发明的永生化的CEF细胞系的方法基本上包括下列步骤：a) 获得原代CEF细胞的步骤。该步骤在本领域中是众所周知的，并且已经特别地由Hernandez, R和Brown, D.T.描述于Current protocols in Microbiology 17:A.4i.1 – A.4i.8 (2010)还有其他描述。其仍然是获得CEF的优选方式。
b) 用以下转染所述CEF的步骤：1)不含LTR序列的DNA分子，其包含转座子反向重复且包含在合适启动子控制下的编码SV40 T抗原的基因，2)不含LTR序列的DNA分子，其包含转座子反向重复且包含在合适启动子控制下的编码鸡端粒酶cTERT的基因，和3)包含在合适启动子控制下的编码转座酶的基因的DNA分子。

[0022] 包含在合适启动子控制下的编码转座酶的基因的DNA分子不必一定不含LTR序列，因为该DNA分子本身不包含转座子序列，并且因此不可能整合至宿主的基因组中。然而，为了避免无意的意外整合，优选地，包含在合适启动子控制下的编码转座酶的基因的DNA分子不含LTR序列。

[0023] 出于效率的原因，实际上，优选用不含LTR序列的单一DNA分子进行转染，所述DNA分子包含转座子反向重复、包含在合适启动子控制下的编码SV40 T抗原的基因和在合适启动子控制下的编码鸡端粒酶的基因两者，且包含在合适启动子控制下的编码转座酶的基因。

[0024] 只有在DNA整合在CEF基因组中的永生化过程的第一步期间才需要转座酶活性。一旦整合DNA，就不再需要转座酶。之后其甚至可能对细胞的稳定性有害。

[0025] 因此，甚至更优选地，转染所述CEF的步骤可用以下进行：1) 不含LTR序列的单一DNA分子，其包含转座子反向重复且包含在合适启动子控制下的编码SV40 T抗原的基因和在合适启动子控制下的编码鸡端粒酶的基因以及2) DNA分子，其优选不含LTR序列，仅包含在合适启动子控制下的转座酶基因，且没有转座子序列。

[0026] 转染可以通过本领域中已知的许多方式进行。用于转染的商业试剂盒目前可通过尤其是 Bio-Rad (Life Science (Research, Education, Process Separations, Food Science), Life Science Research, 2000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547, USA)和Invitrogen (Life Technology, 3175 Staley Road, Grand Island, NY 14072, USA)得到。常用的基于试剂的转染方法包括使用脂质、磷酸钙、阳离子聚合物、DEAE-葡聚糖、活化的树枝状聚合物和磁珠。基于仪器的方法包括电穿孔、核转染和显微注射。

[0027] 包含转座子反向重复，包含在合适启动子控制下的编码SV40 T抗原的基因和转座子反向重复和/或在合适启动子控制下的编码鸡端粒酶的基因的不含LTR序列的DNA分子可以例如是质粒。所述质粒，当其用于转染步骤时，可以是环状或线性形式。

[0028] 转座子的这样的用途是本领域中公知的。Ivics, Z.和Izsvak Z.的论文广泛综述了转座子及其用途，并且提供了转座子的作用机制的见解(Mobile DNA 1:25-39 (2010))。转座子可以被视为天然的DNA转移媒介物，其与整合性病毒类似，能够进行有效的基因组插入，其由转座酶介导。

[0029] 原则上，转座子在整合于基因组中之后保持稳定存在于细胞基因组中。因此，优选根据本发明的永生化CEF包含转座子序列，诸如转座子反向重复。

[0030] 用于表达SV40 T抗原和cTERT的大量合适的启动子是本领域中已知的，因其有效水平的表达而得到认可。已知在哺乳动物细胞中有转录活性的启动子在禽类细胞中也良好地发挥作用。此类启动子包括经典启动子，如(人)巨细胞病毒立即早期启动子(Sun-Young Lee等人, Journal of Biomedical Science 6: 8-17 (1999), Seed, B.等人, Nature 329, 840-842, 1987; Fynan, E.F.等人, PNAS 90, 11478-11482,1993; Ulmer, J.B.等人, Science 259, 1745-1748, 1993)、人巨细胞病毒增强子-启动子(Donofrio G.,等人, Clinical and Vaccine Immunology 13: 1246-1254, (2006))、小鼠巨细胞病毒立即早期(MCMVie1)启动子、小鼠巨细胞病毒早期(MCMVe1)启动子、SV40立即早期启动子(Sprague J.等人, J. Virology 45, 773 ,1983)、SV-40启动子(Berman, P.W.等人, Science,
222, 524-527, 1983)、金属硫蛋白启动子(Brinster, R.L.等人, Nature 296, 39-42,
1982)、热休克启动子(Voellmy等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4949-53,
1985)、Ad2的主要晚期启动子和β-肌动蛋白启动子(Tang等人, Nature 356, 152-154,
1992)。

[0031] 优选的启动子是CAG启动子。(Miyazaki, J; Takaki, S; Araki, K; Tashiro, F; Tominaga, A; Takatsu, K; Yamamura, K., Gene 79 (2): 269–277 (1989),和Niwa, H; Yamamura, K; Miyazaki, J,. Gene 108 (2): 193–199 (1991))。

[0032] c) 选择能够持续增殖的细胞的步骤。

[0033] 能够持续增殖的CEF细胞是保持增殖至少45次群体倍增的细胞。细胞周期，或细胞分裂周期，是细胞中发生的导致其分裂和复制(细胞复制)的一系列事件。由于以下原因，能够持续增殖的细胞的选择是非常简单的过程：甚至在最佳情况下，原代CEF也不能在其自然环境(禽类胚胎)之外分裂超过45次。在增殖的初始阶段后，分离后的活原代CEF细胞的增殖速率随时间推移而降低，并且最终所有原代CEF细胞进入非增殖阶段。因此，它们将在最多约45次群体倍增后死亡。

[0034] 这意味着，如果有细胞数量增加，特别是在45次群体倍增后，这一定是由于这样的事实，即一个或多个细胞已被成功转染，并且编码SV40 T抗原的基因和编码cTERT的基因插入细胞基因组。所以，基本上该过程是自我选择：CEF (其中一些是成功转化的)在合适的细胞生长培养基中的保持，将自动导致这些转化的细胞的复制，而非永生化的细胞将停止分裂并死去。合适的细胞生长培养基是本领域中已知的(参见上文Kim, 2006和Hernandez, 2010)，并且特别描述于实施例部分。

[0035] 关于细胞培养条件的进一步指导可见于实施例中。

[0036] 通常，选择已经培养至少45个细胞周期的细胞。对于此类细胞，可以合理地假设，它们是成功永生化的CEF，因为原代CEF在从鸡胚分离之后，通常不在体外复制多于约45次。

[0037] 因此，本发明的一个实施方案涉及用于制备根据本发明的永生化的CEF的方法，其中所述方法包括以下步骤：a) 获得原代CEF细胞，
b) 用以下转染所述CEF：1) 不含LTR序列的DNA分子，其包含转座子反向重复且包含在合适启动子控制下的编码SV40 T抗原的基因，2) 不含LTR序列的DNA分子，其包含转座子反向重复且包含在合适启动子控制下的编码鸡端粒酶cTERT的基因，和3) 不含LTR序列的DNA分子，其包含在合适启动子控制下的编码转座酶的基因。
c) 选择已经培养至少45个细胞周期的CEF细胞。

[0038] 该实施方案的优选形式涉及制备根据本发明的永生化CEF的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤a)获得原代CEF细胞，
b)用不含LTR序列的单一DNA分子转染所述原代CEF细胞，所述单一DNA分子包含转座子反向重复、包含在合适启动子控制下的编码SV40 T抗原的基因和在合适启动子控制下的编码鸡端粒酶的基因两者，且包含在合适启动子控制下的编码转座酶的基因，
c)选择已经培养至少45个细胞周期的CEF细胞。

[0039] 该实施方案的更优选形式涉及制备根据本发明的永生化CEF的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：a) 获得原代CEF细胞，
b) 用以下转染所述原代CEF细胞：1) 不含LTR序列的DNA分子，其包含转座子反向重复，包含在合适启动子控制下的编码SV40 T抗原的基因和在合适启动子控制下的编码鸡端粒酶的基因两者，以及2) 不含LTR序列的DNA分子，其包含在合适启动子控制下的编码转座酶的基因，
c) 选择已经培养至少45个细胞周期的CEF细胞。

[0040] 在特殊情况下，经过约45个细胞周期的细胞仍然可以显示不稳定的行为，例如由于该转座子已经在非常关键的位点整合于细胞基因组中的事实，或由于编码SV40 T抗原或编码cTERT的基因的不稳定整合。因此，在实践中，优选选择已经培养至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150或甚至160个细胞周期(以该优先顺序)的细胞。任何不稳定性变得明显的机会的确随着选择的永生化的CEF的细胞周期的量而减少。

[0041] 因此，优选地，选择已经培养至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150或甚至160个细胞周期(以该优先顺序)的细胞。

[0042] 本发明的第三个实施方案涉及禽类病毒或禽类病毒载体的复制方法，所述方法包括以下步骤：a) 培养根据本发明的永生化CEF，
b) 将永生化CEF与所述禽类病毒或禽类病毒载体接触，
c) 允许所述禽类病毒或禽类病毒载体复制，和
d) 分离后代病毒。

[0043] 特别感兴趣的禽类病毒是以下禽类病毒：火鸡疱疹病毒(HVT)、马立克氏病病毒、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、减蛋综合征病毒(EDSV)、呼肠孤病毒(RV)和火鸡鼻气管炎病毒(TRT)。对于所有这些病毒，疫苗都是本领域已知的，其基于活减毒病毒、灭活病毒或重组病毒；表达任何这些病毒的免疫原性组分的病毒载体。

[0044] 病毒载体是携带不存在于野生型形式的病毒中的额外基因的病毒。病毒载体是本领域非常熟知的。病毒载体可用于携带例如外来细菌基因或外来病毒基因。通常，将额外基因置于合适启动子的控制下。此类病毒载体的实例是例如包含IBDV VP2-基因、IBV-刺突蛋白基因、禽流感HA基因、ILT gD/gI蛋白基因或NDV F-基因的HVT载体。

[0045] 因此，该实施方案的优选形式涉及复制禽类病毒或禽类病毒载体的方法，根据本发明，其中所述禽类病毒或禽类病毒载体选自由马立克氏病病毒(MDV)、MDV相关的火鸡疱疹病毒(HVT)、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、减蛋综合征病毒(EDSV)、呼肠孤病毒(RV)、火鸡鼻气管炎病毒(TRT)和包含IBDV VP2-基因、IBV-刺突蛋白基因、禽流感HA基因、ILT gD/gI蛋白基因或NDV F基因的HVT载体组成的禽类病毒组。

[0046] 马立克氏病病毒(MDV)是已知以三种血清型存在的疱疹病毒：高度毒力血清型1、中度毒力血清型2和血清型3，对鸡没有毒性的火鸡病毒；马立克氏病相关病毒火鸡疱疹病毒(HVT)。

[0047] 根据本发明的永生化CEF细胞非常适合于所述三种MDV-血清型的繁殖。

[0048] 因此，该实施方案的更优选形式涉及根据本发明的禽类病毒的复制方法，其中所述禽类病毒选自由MDV和MDV载体病毒组成的禽类病毒组。

[0049] 本发明的第四个实施方案涉及包含根据本发明的永生化的CEF的细胞培养物。

[0050] 该实施方案的优选形式涉及这样的细胞培养物，其是用禽类病毒或禽类病毒载体感染的。

[0051] 该实施方案的更优选形式涉及这样的细胞培养物，其是用选自以下的禽类病毒或禽类病毒载体感染的：马立克氏病病毒(MDV)、MDV相关的火鸡疱疹病毒(HVT)、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、减蛋综合征病毒(EDSV)、火鸡鼻气管炎病毒(TRT)、呼肠孤病毒(RV)和包含IBDV VP2-基因、IBV-刺突蛋白基因、禽流感HA基因、ILT gD/gI蛋白基因或NDV F-基因的HVT载体。

[0052] 该实施方案的甚至更优选形式涉及这样的细胞培养物，其中所述细胞培养物是MDV或MDV病毒载体感染的。

[0053] 本发明的第五个实施方案涉及制备包含禽类病毒或禽类病毒载体的疫苗的方法，其中所述方法包括将根据本发明的细胞培养物与药学上可接受的载体混合的步骤，其中所述细胞培养物是禽类病毒或禽类病毒载体感染的。

[0054] 在该实施方案的优选形式中，所述禽类病毒或禽类病毒载体选自马立克氏病病毒(MDV)、MDV相关的火鸡疱疹病毒(HVT)、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、减蛋综合征病毒(EDSV)、呼肠孤病毒(RV)、火鸡鼻气管炎病毒(TRT)和包含IBDV VP2-基因和/或NDV F-基因的HVT载体。

[0055] 一些MDV相关病毒只有在它们与它们在其中生长的细胞结合的情况下才能存活。血清型1能够在不与细胞结合的情况下存活。血清型2不太可能在不与细胞结合的情况下存活。血清型3 (HVT)在与其所生长的细胞分离时无法存活。根据本发明的永生化CEF非常适合于使这些MDV血清型生长。因此，对于MDV，特别是对于MDV血清型2和3，被这些MDV血清型感染的根据本发明的永生化CEF非常适合用于包含细胞结合的MDV的疫苗中。可以根据本领域已知用于制备细胞结合的MDV疫苗的标准技术，通过将此类MDV感染的永生化CEF和药学上可接受的载体混合，来制备此类疫苗。

[0056] 因此，在该实施方案的更优选形式中，所述禽类病毒或禽类病毒载体是MDV。

[0057] 在该实施方案的甚至更优选形式中，所述MDV或MDV病毒载体是活的减毒形式。

[0058] 本发明的第六个实施方案涉及制备包含禽类病毒或禽类病毒载体的疫苗的方法，其中所述方法包括以下步骤：a) 用禽类病毒或禽类病毒载体感染根据本发明的CEF的细胞培养物
b) 复制所述禽类病毒或禽类病毒载体
c) 分离后代病毒
d) 将所述后代病毒与药学上可接受的载体混合。

[0059] 该实施方案的优选形式涉及这样的疫苗，其中所述禽类病毒或禽类病毒载体选自马立克氏病病毒(MDV)、MDV相关的火鸡疱疹病毒(HVT)、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、减蛋综合征病毒(EDSV)、呼肠孤病毒(RV)、火鸡鼻气管炎病毒(TRT)和包含IBDV VP2-基因和/或NDV F-基因的HVT载体。

[0060] 该实施方案的更优选形式涉及这样的疫苗，其中所述禽类病毒或禽类病毒载体是MDV或MDV载体。

[0061] 如上所述，一些MDV相关病毒只有在它们与它们在其中生长的细胞结合的情况下才能存活。因此，对于MDV，特别是对于MDV血清型2和3，被这些MDV血清型感染的根据本发明的永生化CEF非常适合用于包含细胞结合的MDV的疫苗中。可以根据本领域已知用于制备细胞结合的MDV疫苗的标准技术，通过将此类MDV感染的永生化CEF和药学上可接受的载体混合，来制备此类疫苗。

[0062] 因此，本发明的第七个实施方案涉及包含根据本发明的永生化CEF细胞培养物和药学上可接受的载体的疫苗，其中所述细胞培养物是MDV感染的。

[0063] 附图说明：图1：pPB-CAG-SV40 T Ag (A)和pPB-CAG-cTERT (B)的载体图。

[0064] 图2：cTERT氨基酸序列。*指示终止密码子。

[0065] 图3：CEF ST-1细胞系的生长曲线。将用pPB-EV(十字形)、pPB-SV(菱形)或pPB-SV和pPB-cTERT (CEF ST-1)(正方形)转染的细胞传代。在每次传代测定细胞数，以计算每次传代的群体倍增。

[0066] 图4：CEF ST-1形态在传代期间保持恒定。在第25次传代(100x)(A)和第44次传代(100x)(B)拍摄CEF ST-1细胞。

[0067] 图5：CEF ST-2细胞系的生长曲线。将用pPB-SV(菱形)或pPB-SV和pPB-cTERT (CEF ST-2)(正方形)转染的细胞传代。在每次传代测定细胞数，以计算每次传代的群体倍增。

[0068] 图6：CEF ST-2形态在传代期间保持恒定。在第19次传代(100x)(A)和第26次传代(40x)(B)拍摄CEF ST-2细胞。

[0069] 图7：CEF ST-2细胞中的HVT复制。在T = 0时，以0.05的MOI用HVT感染CEF ST-2细胞。在指定时间点收获细胞，且通过滴定测定HVT滴度。

[0070] 图8：在T = 0时，以0.05的MOI用HVT感染CEF ST-2细胞。在96小时后，用胰蛋白酶消化并收获细胞，并在新鲜CEF ST-2单层上重新接种。将该程序重复4次。在每次传代，收获样品以测定HVT滴度。

[0071] 图9：在T = 0时，以0.05的MOI用HVT或重组HVT病毒感染CEF ST-2细胞。在96小时后，用胰蛋白酶消化并收获细胞。通过滴定测定HVT滴度。实施例

[0072] 实施例1：小鸡胚胎成纤维细胞的永生化质粒。

[0073] 为了构建pPB-CAG-SV40 T Ag，使用引物SV40标签5'-BII (5'-GGCGAGATCTACCATGGATAAAGTTTTAAACAG-3')和SV40标签3'-XI (5'-
GGCGCTCGAGTTATGTTTCAGGTTCAGGGG-3')，通过PCR将XhoI和BglII位点加入SV40 T Ag。根据制造商的方案，将Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs)用于PCR。将片段克隆入pCR-Blunt (Life Technologies)并通过测序验证。接着，将SV40 T Ag从pCR-Blunt切出，并使用BglII-XhoI 位点克隆入pPB-CAG-EBNXN (Yusa等人, 2009)以生成pPB-CAG-SV40 T Ag (图1A)。通过测序验证最终构建体。

[0074] 通过合成生成其后为猫疱疹病毒polyA信号序列的编码cTERT的序列(CAATAAACATAGCATACGTTATGACATGGTCTACCGCGTCTTATATGGGGACGAC) (Willemse等人，
1995)，将其测序并使用XhoI-ClaI位点克隆至pPB-CAG-EBNXN (Yusa等人, 2009)中以生成pPB-CAG-cTERT (图1B和图2)。使用Qiagen EndoFree质粒maxi试剂盒(Qiagen)分离用于转染入CEF的质粒DNA。

[0075] CEF的分离和生长。

[0076] 将10个SPF卵在37℃孵育10天，并用于分离原代胚胎成纤维细胞。在无菌条件下从卵中收获胚胎。移去头部、腿部和翅膀后，将胚胎在无菌PBS中洗涤三次，并使用胰蛋白酶/EDTA溶液解离。解离后，添加胎牛血清以使胰蛋白酶失活。将分离的细胞以400xg离心15分钟。将沉淀的细胞重悬浮于含有5％胎牛血清(Moregate)、1％鸡血清(Sigma)、2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和抗生素的DMEM中，针对活力染色并计数。在培养瓶中铺板2.10^5个细胞/cm2，并在40℃和5% CO2下孵育。

[0077] 转染培养3天之后，收获CEF并计数活细胞，然后转染。每次转染，使用Nucleofector 4D装置(Lonza Cologne AG)的程序CA-137，在100µl原代细胞缓冲液P3 +补充剂(Lonza Cologne AG)中转染1.10^6个活细胞。用1,6µg pPB-CAG-SV40 T Ag和0,4µg pPB-CMV-hyPBase (Yusa等人, 2011)，或作为对照，用1,6µg pPB-CAG-EBNXN和0,4µg pPB-CMV-hyPBase转染细胞。施用脉冲之后，将细胞在室温放置5分钟。接着，将400µl RPMI 1640 (37℃)缓慢添加至细胞，并在37℃孵育5分钟。然后将细胞小心地重悬浮，接种在T25烧瓶中的生长培养基中，并在40℃和5% CO2下孵育。使用相同的方案进行用pPB-CAG-cTERT对CEF + pPB-CAG-SV40 T Ag细胞的转染。此处，用1,6µg pPB-CAG-cTERT和0,4µg pPB-CMV-hyPBase (Yusa等人，2011)，或作为对照，用1,6µg pPB-CAG-EBNXN和0,4µg pPB-CMV-hyPBase或2µg标准GFP表达载体(pmaxGFP, Lonza)转染用pPB-CAG-SV40 T Ag稳定转染的CEF。

[0078] 组织培养转染后，使培养物生长于生长培养基(含有5％胎牛血清(Moregate)、1％鸡血清(Sigma)、2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠的DMEM)中，并在80-90％汇合后常规地传代。除去培养基后，将细胞用PBS洗涤两次，并使用胰蛋白酶/EDTA溶液进行胰蛋白酶消化。将细胞重悬浮于生长培养基中并沉淀。将沉淀的细胞重悬浮于生长培养基中，并使用Bürker-Türk计数室计数。将细胞铺板在Cellbind组织培养瓶(Corning)中的新鲜培养基中，并在40℃和5% CO2下孵育。在不同的传代次数，将CEF + pPB-CAG-SV40细胞冷冻，用于液氮储存于含有42.5％ FCS和10％ DMSO的标准培养基中。将用p-PB-CAG-cTERT或对照质粒转染的CEF + pPB-CAG-SV40 T Ag细胞铺板在正常生长培养基或无动物组分的培养基+ 1％新生牛血清(Hyclone, ThermoFisher)中的胶原I包被的表面(Biocoat, Corning)上。使用以下方程计算群体倍增数：
群体倍增
其中Nt是生长期结束时的活细胞数，而N是铺板细胞数(Venkatesan和Price，1998)。使用与Olympus CKX41显微镜偶联的Olympus DP21相机拍摄细胞。

[0079] 感染在感染前24小时，将细胞以1.10^5个细胞/cm2的密度接种于具有或没有0.25％新生牛血清的无动物组分的培养基中，并在40℃和5% CO2下孵育。以0.05噬斑形成单位(PFU)的MOI感染细胞。使用的病毒是HVT (FC126)、表达NDV F和IBDV VP2抗原二者的重组HVT (HVT-NDV-IBDV)和表达ILT gD/gI抗原的重组HVT (HVT-ILT)。感染后，将细胞在38.5℃和
5% CO2下孵育。在将细胞孵育超过72小时的情况下，72小时后完全替换培养基。根据实验，感染后72、96、120或144小时收获用于滴定的样品，并将其冷冻用于液氮储存：除去培养基后，将细胞用PBS洗涤两次，并使用胰蛋白酶/EDTA溶液进行胰蛋白酶消化。将细胞重悬浮于生长培养基中并沉淀。除去上清液后，将细胞重新悬浮于新鲜生长培养基中并计数。接下来，将1.10^7/ml细胞冷冻于含有终浓度为10％的DMSO和20％的胎牛血清的生长培养基中并储存在液氮中。

[0080] 滴定将冷冻的HVT感染的细胞的安瓿解冻，并通过滴定CEF上的HVT感染的细胞来测定PFU/ml的数量。使用识别HVT的单克隆抗体或多克隆鸡血清，用免疫荧光测定显现噬斑。山羊抗鸡Alexa 488抗体或山羊抗小鼠Alexa 488抗体分别用作二抗。所有滴定进行一式两份。

[0081] 结果SV40 T抗原的表达延长原代CEF的寿命。

[0082] 在第1次传代时，用pPB-CAG-SV40 T Ag (pPB-SV)和piggyBac转座酶表达载体转染原代CEF，以获得SV40 T Ag的基因组整合和稳定表达。作为对照，还用空pPB-CAG-EBNXN (pPB-EV)载体转染CEF。转染后，细胞在80-90％汇合度常规传代，并计数以测定活细胞数。传代时活细胞的数量用于计算接种后群体倍增数(群体倍增(PDs))。尽管SV40 T Ag表达细胞相比于对照显示延长的寿命(分别为35次群体倍增相比于26次群体倍增)，但所有培养物最终在约第17次传代停止生长(图3)。第17次传代后，培养物中仍然存在正在增殖的细胞。
然而，由于培养物中的许多细胞死亡，没有发现总细胞数的增加，并且最终所有细胞都死亡。

[0083] 在不同的传代次数，使用对SV40 T Ag特异性的单克隆抗体，用免疫荧光测定检查CEF + pPB-SV细胞的SV40 T Ag表达。在第2次传代，即转染后传代一次，少量细胞为SV40 T Ag阳性的。在第7次传代后，几乎所有细胞都表达SV40 T Ag(数据未显示)。

[0084] cTERT在SV40 T Ag表达细胞中的表达诱导永生化。

[0085] CEF ST-1细胞系为了获得永生化的CEF，我们用pPB-CAG-cTERT (pPB-cTERT)表达载体转染CEF + pPB-SV细胞。将第13次传代的CEF + pPB-SV的安瓿解冻，取出细胞进行培养，传代并在第18次传代时，用pPB-cTERT和转座酶表达载体转染。在第18次传代的CEF + pPB-SV细胞的总数低。
因此，我们使用了用标准GFP表达载体(EV)转染的CEF + pPB-SV细胞以测定转染效率，也作为传代期间的空载体对照。转染后，接种细胞，并每天检查集落的增殖和生长。在CEF + pPB-SV + EV培养物中未观察到增殖，且所有细胞最终都死亡(数据未显示)。然而，在CEF + pPB-SV + pPB-cTERT培养物中，10天后，快速增殖的集落清晰可见。将这些集落进行胰蛋白酶消化，将细胞计数并接种在组织培养瓶中。我们发现这些细胞在无动物组分(ACF)的培养基中比在我们的标准生长培养基中增殖更好(数据未显示)，因此我们继续在ACF培养基中使这些细胞生长。这些CEF + pPB-SV + pPB-cTERT细胞继续剧烈生长，并被传代，直到它们已进行超过100次群体倍增(PD)(图3)。

[0086] 在此时，细胞仍然是健康的，并急剧增殖。因此，我们得出结论，我们已建立了永生化的CEF细胞系，并将其命名为CEF ST-1 (对于CEF + SV40 T Ag + cTERT-nr.1)。细胞具有在传代期间保持恒定的成纤维细胞形态(图4)。

[0087] 不同传代次数的CEF ST-1细胞已经在安瓿中冷冻下来用于液氮储存。这些细胞在液氮储存后可以容易地再生长。

[0088] CEF ST-2细胞系通过用cTERT表达载体转染第18次传代的CEF + pPB-SV细胞来生成CEF ST-1。在此时，有限数量的细胞仍然正在增殖，并且培养物中的许多细胞已经死亡。由于在cTERT转染后，只有少量永生化的集落生长出来并产生CEF ST-1细胞系，所以我们得出结论：CEF ST-1是一种寡克隆细胞系。

[0089] 为了建立多克隆细胞系，即源自许多不同永生化CEF细胞的细胞系，我们还用cTERT转染早期传代的CEF + pPB-SV细胞。将在第9次传代储存于液氮中的CEF + pPB-SV细胞取出进行培养，在ACF培养基中传代，并在第11次传代，用pPB-cTERT或pPB-EV与转座酶表达载体的组合转染细胞。转染后，将细胞接种并传代。CEF + pPB-SV + pPB-EV细胞停止增殖并在第16次传代后死亡(数据未显示)。用pPB-SV和pPB-cTERT转染的细胞继续剧烈增殖，并被传代，直到它们已经进行超过70 PD (第33次传代，图5)。

[0090] 在此时，细胞仍然是健康的，并良好增殖。因此，我们得出结论：我们已经建立了另一个永生化的CEF细胞系。该细胞系被命名为CEF ST-2 (对于CEF + SV40 T Ag + cTERT-nr.2)。CEF ST-2细胞具有在传代期间保持恒定的成纤维细胞形态(图6)。不同传代次数的CEF ST-2细胞已经在安瓿中冷冻下来用于液氮储存。这些细胞在液氮储存后可以容易地再生长。

[0091] HVT在CEF ST-1和CEF ST-2上的复制。

[0092] 我们测试了CEF ST-1和CEF ST-2细胞系的支持火鸡疱疹病毒(HVT)复制的能力。首先，使用免疫荧光测定(IF)，我们证明CEF ST-1可被HVT感染并支持HVT的复制。CEF ST-1细胞用HVT感染并在72、96和120小时后固定用于IF。可以在所有时间点在HVT感染的CEF ST-1细胞中看到HVT阳性病灶，表明CEF ST-1细胞可被HVT感染并支持HVT的细胞间扩散(数据未显示)。

[0093] 在第二实验中，我们比较了CEF ST-1和CEF ST-2细胞之间HVT感染和细胞间扩散的效率。CEF ST-1和CEF ST-2两者都用HVT感染并在不同时间点固定，以研究这些细胞系中HVT复制的动力学。在24、48和72小时后，两个细胞系中都存在HVT阳性病灶，并且病灶的数量和大小随时间增加(数据未显示)。从这些实验明显的是，与CEF ST-1相比，在CEF ST-2中看到更高数量的HVT病灶以及更大的病灶。因此，我们得出结论，CEF ST-2细胞是比CEF ST-1更好的HVT复制的基质。

[0094] 接下来，我们更详细地检查了CEF ST-2系中的HVT复制动力学。CEF ST-2细胞用HVT感染，并且在感染后72、96、120和144小时取样，以测定每毫升噬斑形成单位数(PFU)(图7)。这些结果表明，HVT在CEF ST-2细胞上复制，并且尽管在不同收获时间之间的滴度差异很小，但感染后约96小时的病毒滴度似乎达到峰值(图7)。

[0095] HVT可以在CEF ST-2细胞上传代。

[0096] 在我们已经确立CEF ST-2是HVT感染和复制的基质后，我们检查了HVT感染的CEF ST-2细胞是否可以感染CEF ST-2细胞的新鲜单层。用HVT感染CEF ST-2细胞，96小时后收获，并接种至新鲜CEF ST-2细胞单层上。将该程序重复4次，并在每次传代，将细胞固定用于IF染色，并取样用于测定PFU/ml数。IF染色证明每次传代后都存在HVT阳性病灶，并且在第四次传代后看到大量清晰的HVT病灶(数据未显示)。滴定显示，与第1次传代滴度相比，第2次传代的HVT滴度略低(图8)。然而，随后在CEF ST-2细胞上的传代导致HVT滴度随着每次传5.7
代增加，并且在第5次传代HVT滴度为10 PFU/ml。这清楚地显示，CEF ST-2细胞系是HVT复制的合适基质。

[0097] CEF ST-2是重组HVT构建体的复制的基质。

[0098] HVT也可以用作抗原表达的病毒载体，例如，其他禽类病毒诸如新城疫病毒(NDV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)或传染性喉气管炎病毒(ILT)的抗原表达的病毒载体(Iqbal，2012)。为了测试CEF ST-2细胞是否也允许复制重组HVT构建体，CEF ST-2细胞用野生型HVT、表达NDV F和IBDV VP2抗原二者的重组HVT (HVT-NDV-IBDV)或表达ILT gD/gI抗原的重组HVT (HVT-ILT)感染。在感染后96小时，固定细胞用于IF染色，或者收获细胞以制备样品用于滴定。IF染色清楚地显示CEF ST-2细胞中野生型HVT和重组HVT构建体的病灶(数据未显示)。样品的滴定也证明CEF ST-2细胞支持HVT重组体的复制(图9)，尽管重组HVT的复制在所用条件下比野生型HVT复制效率更低。

[0099] 参考文献列表Iqbal,M. (2012). Progress toward the development of polyvalent
vaccination strategies against multiple viral infections in chickens using herpesvirus of turkeys as vector. Bioengineered. 3, 222-226.
Venkatesan,R.N.和Price,C. (1998). Telomerase expression in chickens: constitutive activity in somatic tissues and down-regulation in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 95, 14763-14768.
Willemse,M.J., Strijdveen,I.G., van Schooneveld,S.H., van den Berg,M.C.,和Sondermeijer,P.J. (1995). Transcriptional analysis of the short segment of the feline herpesvirus type 1 genome and insertional mutagenesis of a unique reading frame. Virology 208, 704-711.
Yusa,K., Rad,R., Takeda,J.,和Bradley,A. (2009). Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon. Nat. Methods 6, 363-369.
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标题	发布/更新时间	阅读量
永生化鸡胚成纤维细胞-专利编号CN107002044A	2020-05-12	895
ETS2和MESP1由成纤维细胞生成心脏祖细胞-专利编号CN102844428A	2020-05-11	890
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ETS2和MESP1由成纤维细胞生成心脏祖细胞-专利编号CN102844428B	2020-05-11	367
防止成纤维细胞皱缩-专利编号CN104582683A	2020-05-12	966
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一种成纤维细胞培养液-专利编号CN102690782A	2020-05-13	506
成纤维细胞生长因子11-专利编号CN1181110A	2020-05-13	114
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诱导成纤维细胞形成软骨细胞的方法-专利编号CN1661010A	2020-05-11	855

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