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在室温稳定全血

阅读：65发布：2020-05-13

IPRDB可以提供在室温稳定全血专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本公开涉及稳定离体全血样品中的有核细胞，其通过作为用于稳定离体全血样品的完整有核细胞中的分析物的液体组合物的添加剂而实现，所述组合物是水溶液，所述溶液包含抗凝剂、磷酸盐、细胞可代谢的糖、腺嘌呤和抗氧化剂，其中所述抗氧化剂包含线粒体靶向的抗氧化剂，优选选自SkQ1、MitoQ、SS‑31及其混合物的线粒体靶向的抗氧化剂。在一个具体实施方案中，所述液体组合物进一步包含蛋白酶抑制剂。进一步提供了用于稳定离体全血样品的完整有核细胞中的选自DNA、RNA和蛋白的分析物的组合物的有利用途以及用于实施所述用途的包括所述组合物的试剂盒。此外，提供了用于稳定离体全血样品的完整有核细胞的具体方法。，下面是在室温稳定全血专利的具体信息内容。

1.用于稳定离体全血样品的完整有核细胞中的分析物的液体组合物，所述组合物是水溶液，所述溶液包含抗凝剂、磷酸盐、细胞可代谢的糖、腺嘌呤和抗氧化剂，其中所述抗氧化剂包含线粒体靶向的抗氧化剂，优选选自SkQ1、MitoQ、SS-31及其混合物的线粒体靶向的抗氧化剂。

2.根据权利要求1的方法，其中所述组合物进一步包含蛋白酶抑制剂，优选选自西维来司他、4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐(AEBSF)及其混合物的蛋白酶抑制剂。

3.根据权利要求1和2中任一项的组合物，其中所述抗氧化剂是第一和第二抗氧化剂的混合物，其中所述第一抗氧化剂是线粒体靶向的抗氧化剂，并且所述第二抗氧化剂是除了线粒体靶向的抗氧化剂以外的抗氧化剂。

4.根据权利要求3中任一项的组合物，其中所述第二抗氧化剂选自谷胱甘肽、乙酰基水杨酸、N-乙酰基-5-氨基水杨酸、N-乙酰基半胱氨酸、6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸(Trolox)及其混合物。

5.根据权利要求3的组合物，其中所述第一线粒体靶向的抗氧化剂选自SkQ1、MitoQ、SS-31及其混合物。

6.根据权利要求1至5中任一项的组合物，其中所述细胞可代谢的糖选自葡萄糖和果糖。

7.根据权利要求1至6中任一项的组合物，所述组合物被封闭于采血容器中。

8.根据权利要求1至7中任一项的组合物，其进一步包含全血的量。

9.根据权利要求8的组合物，其中所述组合物包含集合浓度为10 nM至200 µM、优选100 nM至100 µM、更优选200 nM至50 µM的一种或多种线粒体靶向的抗氧化剂。

10.根据权利要求9的组合物，其中所述组合物包含选自50 nM - 250 nM、优选100 nM SkQ1；250 nM -200 µM、优选100 µM SkQ1；50 nM - 250 nM、优选100 nM MitoQ；和500 nM – 10 µM、优选1 µM SS-31的测量的量的线粒体靶向的抗氧化剂。

11.根据权利要求10的方法，其中所述组合物包含11.1 mM - 12.3 mM柠檬酸三钠(约

11.7 mM) / 2 mM - 2.2 mM柠檬酸(约2.1 mM)，2 mM - 2.2 mM NaH2PO4 (约2.1 mM)，19.1 mM – 21.1 mM葡萄糖(约20.1 mM)，0.23 mM – 0.25 mM腺嘌呤(约0.24 mM)，0.24 mM – 

0.26 mM AEBSF (约0.25 mM)，990 nM – 1.1 µM SS-31 (约1 µM)和乙酰基水杨酸990 µM – 1.1 mM (约1 mM)。

12.根据权利要求1至7中任一项的组合物用于稳定离体全血样品的完整有核细胞中的选自DNA、RNA和蛋白的分析物的用途。

13.包含根据权利要求7的组合物的部件试剂盒，所述试剂盒进一步包含包装材料、标记和用户说明书。

14.用于稳定离体全血样品的完整有核细胞的方法，所述方法包括以下步骤：(a) 提供所述离体全血样品；

(b) 使步骤(a)的样品与根据权利要求1至6中任一项的组合物接触和混合；

(c) 孵育步骤(b)中获得的混合物，

由此稳定所述离体全血样品的完整有核细胞。

15.根据权利要求14的方法，其中步骤(b)中获得的混合物是根据权利要求9至11中任一项的组合物。

16.根据权利要求14和5中任一项的方法，其中步骤(c)在室温进行选自0小时-12小时、

0小时-24小时、0小时-36小时、0小时-48小时、0小时-60小时和0小时-72小时的时间间隔。

17.根据权利要求14至16中任一项的方法，所述方法进一步包括以下步骤：(d) 从步骤(c)中获得的孵育混合物中分离完整有核细胞；

(e) 裂解分离的有核细胞并检测裂解物中的有核细胞的分析物，其中所述分析物选自DNA、RNA和蛋白。

18.根据权利要求17的方法，其中在步骤(b)的混合物中，所述线粒体靶向的抗氧化剂是浓度为500 nM – 10 µM、优选约1 µM的SS-31。

19.根据权利要求18的方法，其中步骤(b)的混合物进一步包含浓度为200 nM – 10 mM、优选1 mM的乙酰基水杨酸和浓度为50 nM - 1 mM、优选250 nM的AEBSF。

20.根据权利要求17的方法，其中在步骤(b)的混合物中，所述线粒体靶向的抗氧化剂是浓度为250 nM – 200 µM、优选100 µM的SkQ1。

21.根据权利要求20的方法，其中步骤(b)的混合物进一步包含浓度为100 mM - 600 mM、优选325 mM的谷胱甘肽和浓度为10 mM - 300 mM、优选100 mM的AEBSF。

22.根据权利要求17的方法，其中在步骤(b)的混合物中，所述线粒体靶向的抗氧化剂是浓度为50 nM - 250 nM、优选100 nM的SkQ1。

23.根据权利要求14至16中任一项的方法，所述方法进一步包括以下步骤：(d) 从步骤(c)中获得的孵育混合物中分离完整有核细胞；

(e) 使步骤(d)的分离的有核细胞与培养基接触，并培养活细胞。

24.根据权利要求23的方法，其中步骤(e)的活细胞在所述培养基中经历一次或多次细胞分裂。

说明书全文

在室温稳定全血

[0001] 本公开涉及可用于稳定全血样品中存在的完整活细胞、特别是有核细胞的组合物、用途、试剂盒和方法。本公开涉及稳定离体全血样品中的有核细胞，其通过作为用于稳定离体全血样品的完整有核细胞中的分析物的液体组合物的添加剂而实现，所述组合物是水溶液，所述溶液包含抗凝剂、磷酸盐、细胞可代谢的糖、腺嘌呤和抗氧化剂，其中所述抗氧化剂包含线粒体靶向的抗氧化剂，优选选自SkQ1、MitoQ、SS-31及其混合物的线粒体靶向的抗氧化剂。在一个具体实施方案中，所述液体组合物进一步包含蛋白酶抑制剂。进一步提供了用于稳定离体全血样品的完整有核细胞中的选自DNA、RNA和蛋白的分析物的组合物的有利用途以及用于实施所述用途的包括所述组合物的试剂盒。此外，提供了用于稳定离体全血样品的完整有核细胞的具体方法。
[0002] 背景全血是用于医学中的诊断分析的最经常收集的样品材料之一。然而，全血的取样和分析通常是独立事件。取样步骤之后，存在涉及完整细胞、特别是完整有核细胞稳定一段时间的主要技术挑战。本领域中特定期望保持全血样品中的有核细胞的生物状态，以便连接取样和分析之间的时间间隔，参见Olson WC等人. (Journal of Translational Medicine 9 (2011) 26), Tanner等人. (Clin. Lab. Haem. 24 (2002) 337-341), Baechler等人. (Genes and Immunity 5 (2004) 347-353),和Elliott等人. (International Journal of Epidemiology 37 (2008) 234-244)。“保持生物状态”或“稳定”被理解为提供这样的条件，在所述条件下，关于取样时活细胞中存在的生物分子的组成和水平的变化尽可能降低，同时保持细胞完整和存活。在这方面，感兴趣的具体生物分子是DNA、RNA和蛋白。
[0003] US 2010-0003748和WO 2004/106494公开了保存活细胞的方法。细胞DNA的稳定先前已经在US 2008-0268514中得到解决。US 2011-0111410公开了稳定血液样品内的完整细胞中的RNA。Macfarlane DE & Dahle CE (Journal of Clinical Laboratory Analysis 11 (1997) 132-139)报道了从在室温储存两周时段的血液分离RNA。Rainen L等人.(Clinical Chemistry 48 (2001) 1883-1890)公开了稳定全血样品中的mRNA表达。在蛋白水平稳定细胞，特别是出于免疫表征的目的，公开于WO 2003/018757和US 5,459,073。
[0004] Baker CJ等人(J.of Surgical Res.86 (1999) 145-149)报道了在其下水溶性α-生育酚类似物改善在4℃储存的细胞的活性。US 7,645,425和US 7,309,468报道了某些蛋白酶抑制剂用于稳定全血的用途。在这方面，值得注意的是，许多蛋白酶抑制剂是有毒的且降低细胞活性。
[0005] Marthandan S.等人.Free Radical Research 45 (2011) 351-358报道了化合物MitoQ对从健康个体分离的人外周血单核细胞的影响。WO 1997/016967公开了某些抗氧化剂减少氧化应激诱导的血液组分损伤的用途。
[0006] 尽管一些细胞保存性添加剂是本领域已知的，但使具有有核细胞的全血样品在室温稳定2至3天的时段仍然是一个技术挑战。特别需要能够在该时间间隔之后分离完整有核细胞(其中所述细胞是优选存活的)的方式。更具体地，期望尽可能减小细胞中的生物分子的组成和水平的任何变化，使得该时间间隔之后的细胞的分析密切反映取样全血时的时间点时细胞的生物状态。
[0007] 概述本文报道的第一方面是用于稳定离体全血样品的完整有核细胞中的分析物的液体组合物，所述组合物是水溶液，所述溶液包含抗凝剂、磷酸盐、细胞可代谢的糖、腺嘌呤和抗氧化剂，其中所述抗氧化剂包含线粒体靶向的抗氧化剂，优选选自SkQ1、MitoQ、SS-31及其混合物的线粒体靶向的抗氧化剂。
[0008] 本文报道的第二方面是如本文公开的组合物用于稳定离体全血样品的完整有核细胞中的选自DNA、RNA和蛋白的分析物的用途。
[0009] 本文报道的第三方面是包含包封根据本文公开内容的液体组合物的采血容器的部件试剂盒(a kit of parts)，所述试剂盒进一步包含包装材料、标记和用户说明书。
[0010] 本文报道的第四方面是用于稳定离体全血样品的完整有核细胞的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供离体全血样品；(b)使步骤(a)的样品与本文公开内容的组合物接触并混合；(c)孵育步骤(b)中获得的混合物，由此稳定离体全血样品的完整有核细胞。

附图说明

[0011] 图1掺入血液样品的MDA-MB-468细胞在室温储存48小时之后的检测。描绘了通过用抗-CK5/8抗原免疫染色检测到的MDA-MB-468细胞的百分数。“盒须图”表明通过如实施例1中所述的测定的靶细胞回收的平均百分比。第1图解盒 – EDTA：在作为抗凝剂的EDTA中储存的血液样品中检测到的MDA-MB-468细胞。第2盒 – EDTA+ 西维来司他：在作为抗凝剂的EDTA和作为稳定剂的西维来司他中储存的血液样品中检测到的MDA-MB-468细胞。第3盒 - EDTA + Pefabloc® SC：在作为抗凝剂的EDTA和作为稳定剂的Pefabloc® SC中储存的血液样品中检测到的MDA-MB-468细胞。第4盒 - EDTA + SKQ1：在作为抗凝剂的EDTA和作为稳定剂的SKQ1中储存的血液样品中检测到的MDA-MB-468细胞。第5盒 - EDTA + MitoQ：在作为抗凝剂的EDTA和作为稳定剂的MitoQ中储存的血液样品中检测到的MDA-MB-468细胞。第6盒 - EDTA + 谷胱甘肽：在作为抗凝剂的EDTA和作为稳定剂的谷胱甘肽中储存的血液样品中检测到的MDA-MB-468细胞。
[0012] 图2掺入血液样品的MDA-MB-468细胞在室温储存48小时之后的检测。描绘了通过用荧光抗- CK5/8抗体免疫检测检测到的MDA-MB-468细胞的百分数。“盒形图”表明借助实施例2中所述的测定的靶细胞回收的平均百分比。第1图解盒 – EDTA：在作为抗凝剂的EDTA中储存的血液样品中检测到的MDA-MB-468细胞。第2盒 - CPDA：在柠檬酸盐/柠檬酸、磷酸盐、右旋糖和腺嘌呤中储存的血液样品中检测到的MDA-MB-468细胞。第3盒 - CPDA+SS-31：在柠檬酸盐、磷酸盐、右旋糖、腺嘌呤和SS+31中储存的血液样品中检测到的MDA-MB-468细胞。第4盒 - CPDA + 谷胱甘肽：在柠檬酸盐、磷酸盐、右旋糖、腺嘌呤和谷胱甘肽中储存的血液样品中检测到的MDA-MB-468细胞。
[0013] 图3储存对DNA产率的影响。样品储存于EDTA或补充有谷胱甘肽、SkQ1和Pefabloc® SC(“稳定剂3”)的EDTA中，如实施例3中所示。
[0014] 图4来自两个血液供体的血液收集于EDTA中或如实施例5中所述的稳定剂中。用MDA-MB-468细胞掺入样品。立即和在室温72小时长孵育之后，分离MDA-MB-468细胞并提取核酸。图中描绘的核酸参数的集合通过RT-PCR或PCR(取决于模板)进行扩增；使用GCK DNA作为内部参考计算各自核酸水平的变化。“稳定剂72小时”是指与稳定剂5孵育72小时的样品，如实施例5中所述。
[0015] 图5来自2个不同供体的血液用EDTA或用稳定剂稳定。将MDA-MB-468细胞掺入血液样品。将样品在室温储存48小时。通过红细胞裂解和使用CD326 (EpCAM)微粒免疫磁性分离而富集MDA-MB-468细胞(参见实施例7)。将细胞培养超过100小时。
[0016] 空心菱形：样本1，EDTA-稳定的，实心菱形：具有稳定剂5的样本1。
[0017] 空心正方形：样本2，EDTA-稳定的，实心正方形：具有稳定剂5的样本2。
[0018] 空心圆形：样本1，EDTA-稳定的，实心圆形：具有稳定剂5的样本1。
[0019] 空心三角形：样本2，EDTA-稳定的，实心三角形：具有稳定剂5的样本2。
[0020] 详述对于本公开的目的，某些术语在本文中如下定义。在本公开中的定义和引用的参考文献中的定义冲突的情况下，以本公开为准。
[0021] 如本文所使用，术语“包含”意指可以利用不影响最终结果的其他步骤和其他组分。术语“包含”涵盖表述“由...组成”和“基本上由...组成”。单数标识符诸如“该(the)”、“一个/种(a)”或“一个/种(an)”的使用不旨在单独限于使用单组分，但可以包括多种组分。例如，除非另有说明，否则表述“一种化合物”具有“一种或多种化合物”的含义。如本文所使用，“多个/种”被理解为意指多于一个/种。例如，多个/种是指至少两个/种、三个/种、四个/种、五个/种或更多个/种。除非特别说明或从上下文显而易见，否则如本文所使用，术语“或”被理解为是包括性的。术语“和/或”意指所列要素中的一种或所有或所列要素的任何两种或更多种的组合。范围在本文中用作描述在该范围内的各个和每一值的简写(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。该范围内的任何值可被选作该范围的终点。除非特别说明或从上下文显而易见，如本文所使用，术语“约”被理解为在本领域中的正常公差的范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。如果没有不同指明，“约”可以被理解为在所示值的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%或0.01%内。除非从上下文另外清楚，否则本文提供的所有数值可以通过术语“约”进行修饰。
[0022] 如本文所使用，术语“室温”，除非另有说明，意指通常的实验室的环境温度，其通常为约18℃至25℃。在一个具体实施方案中，室温是选自18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃和25℃的温度。如本文所使用，“纯化的”或“分离的”化合物意指该化合物已经从形成其的混合物分离。就细胞而言，“纯化的”或“分离的”细胞表示从细胞的混合物富集或分离的一种或多种细胞或一组细胞。通过非限制性实例的方式，可以通过裂解样品中存在的红细胞和通过离心分离完整有核细胞、弃去上清液且将沉淀的细胞重新悬浮于生理缓冲液中或细胞培养基中而从全血离体样品中的细胞混合物分离有核细胞。
[0023] 本文公开了“组合物”，该术语应当被理解为表示组合和混合多种成分的产物。“液体”组合物是以聚集的液态存在的组合物。具体地，如本文公开的液体组合物是水性组合物，具有作为溶剂的水和溶解于其中的多种水溶性化合物的溶液。“分析物”通常是物质，特别是细胞组分，其为分析方法、诸如但不限于该物质的定性或定量检测方法的靶标。用于本公开的目的的具体分析物选自DNA、RNA和蛋白，后者包含寡肽、多肽及其翻译后修饰的衍生物。
[0024] 大量用于纯化和分析核酸的方法是已知的。在分析领域中，特别聚焦于特定DNA或RNA序列的定性和/或定量检测。使用聚合酶链式反应(PCR)和与目的DNA序列的侧翼杂交的特异性引物，可以扩增所述序列，并且可以检测扩增的序列。通常作为用标记的探针的杂交反应进行这样的检测。所谓的实时PCR允许该检测步骤发生，同时扩增靶序列。对于RNA序列的特异性检测，RNA需要被反向翻译形成cDNA；然后可以使用基于PCR的DNA扩增技术扩增和检测反映靶RNA序列的cDNA。
[0025] 通常利用能够结合至靶标的特异性结合剂实现靶蛋白的特异性检测。因此，免疫测定检测方法是该方法的一种非限制性实例。
[0026] 本公开特别涉及使离体全血样品的完整有核细胞中的选自DNA、RNA和蛋白的分析物稳定长达72小时(0至72小时)、特别是48至72小时的时段，所述时段从取样全血并且使所述全血与如本文公开的稳定组合物接触的时间点计时。有利地，血样取样和使所述血液与稳定组合物接触之间的时间少于30秒。
[0027] 术语“稳定”包括使血液样品的有核细胞的细胞膜保持完整、以及在有核细胞中保存和维持细胞蛋白和细胞DNA以及细胞RNA、特别是反映取样时的基因表达状态的细胞mRNA的组成的具体含义；此外，“稳定”涵盖提供这样的环境：其中有核细胞具有实质上降低的经历坏死或凋亡的趋势，并且其中表达的蛋白的模式在很大程度上保持不变。术语“稳定”进一步包括支持重要细胞功能，避免细胞的中毒和细胞死亡，使有核细胞维持在静止、但活的状态。
[0028] 除非另有明确地提及，表达“柠檬酸盐/柠檬酸”是指柠檬酸三钠和柠檬酸的混合物。提及具有EDTA作为唯一抗凝剂的血液意指具有约1.8 mg/ml血液的EDTA浓度的全血。
[0029] 如本文公开的第一方面是用于稳定离体全血样品的完整有核细胞中的分析物的液体组合物，所述组合物是水溶液，所述溶液包含抗凝剂、磷酸盐、细胞可代谢的糖、腺嘌呤和抗氧化剂，其中所述抗氧化剂包含线粒体靶向的抗氧化剂，优选选自SkQ1、MitoQ、SS-31及其混合物的线粒体靶向的抗氧化剂。具体地，所述分析物选自全血样品的完整有核细胞的DNA、RNA和蛋白。
[0030] 在本文公开的所有方面和实施方案中，术语“全血”表示直接收集自脊椎动物，特别地收集自哺乳动物，更特别地收集自灵长类动物，甚至更特别地收集自人，的血液，其除了采血过程以外无需任何进一步处理。应当理解，采血过程本身不是根据本公开的任何程序、用途和/或方法的部分。相反，本公开涉及基于提供“离体”全血(也就是说，采集全血的生物体之外或与采集全血的生物体分离的全血)的样品的程序、用途和方法。离体全血作为“样品”提供，其被理解为测量的量的全血。
[0031] 抑制血液和/或血浆凝固的添加剂对于确保在分析过程之前待分析的细胞不受凝血负面影响是重要的。抗凝血通过结合钙离子(EDTA，柠檬酸盐)或通过抑制凝血酶活性(肝素，水蛭素)而发生。因此，为了防止离体全血样品的凝血，如本文中的所有方面和实施方案中公开的组合物包含抗凝剂，特别是选自EDTA、柠檬酸盐、肝素、水蛭素、华法林及其混合物的抗凝剂。同时允许有核细胞的完整性(即不裂解)和活性的抗凝剂添加剂是本领域中已知的。在如本文公开的所有方面中的一个具体实施方案中，向全血样品中添加柠檬酸钠/柠檬酸至分别11.7 mM和2.1 mM的最终浓度。
[0032] 如本文公开的组合物中的磷酸盐，或单独或与EDTA和/或柠檬酸盐组合，如果存在的话，在生理pH实现全血样品的缓冲。在如本文公开的所有方面的一个具体实施方案中，所述磷酸盐是NaH2PO4，在一个甚至更具体的实施方案中，将其向全血样品中添加至2.1 mM的最终浓度。进一步添加剂是腺嘌呤和细胞可代谢的糖，以支持细胞完整性和活性。在如本文公开的所有方面的一个进一步具体实施方案中，向全血样品中添加腺嘌呤至0.24 mM的最终浓度。
[0033] 值得注意的是，本公开的作者发现，有效量的抗氧化剂的存在，对于稳定离体全血样品的有核细胞是必要的。观察到的抗氧化剂的有益效果将反应性氧种类指向为样品中的细胞不稳定性的一个可能原因。反应性氧种类通常由NADPH氧化酶、黄嘌呤氧化酶、线粒体电子-转运链和功能异常的内皮一氧化氮合酶生成。当细胞抗氧化防御系统(例如，超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、血红素加氧酶、对氧磷酶)的能力过度时，这导致氧化应激，其可以促进细胞死亡。因此，防止氧化应激的方式是主要感兴趣的。
[0034] 具体地，线粒体在线粒体电子-转运链复合物I和III处产生大量O2−。复合物I将O2−−释放入线粒体基质，并且被认为是由于在低ADP条件下从复合物II的反向电子流导致的O2的主要产生者。基质-定位的线粒体超氧化物歧化酶2(SOD2)将O2−歧化成H2O2，其进而被谷胱甘肽过氧化物酶或过氧化氢酶还原成水。SOD2的重要性因此在于解毒O2−以防止ONOO−(过氧亚硝酸盐)的生成和/或线粒体电子-转运链蛋白和线粒体DNA的氧化损伤，其可以以其它− −
方式损害线粒体功能。复合物III也将O2释放至线粒体膜内间隙，所述O2 在其中SOD1(超氧化物歧化酶的另一种同工酶)歧化。已知线粒体本身对反应性氧种类是敏感的。氧化损伤降低它们的活性，并且可以甚至增加它们的活性氧种类的产生。已知其提高水平损伤线粒体DNA，并且刺激线粒体凋亡因子的释放。
[0035] 重要的是，如本文公开的所有方面和实施方案中的组合物包含线粒体靶向的抗氧化剂。在一般意义上的“抗氧化剂”是能够抑制由氧、反应性氧种类和过氧化物促进的氧化或反应的分子。这包括能够抑制和/或终止自由基的反应的特性。抗氧化剂通常是能够作为电子供体参与氧化反应、因此变得本身被氧化的还原剂。根据如本文公开的理解的抗氧剂充当与细胞组分竞争的替代氧化靶标，其在抗氧化剂不存在的情况下被氧化，由此被氧化损伤所损害。
[0036] “线粒体靶向的”抗氧化剂是这样的抗氧化剂，其通常在细胞外应用，其能够穿过细胞膜且能够与线粒体膜相互作用，以抑制在细胞的线粒体隔室中发生的某些氧化过程。这样的细胞可渗透的抗氧化剂的具体实例是SkQ1、MitoQ、SS-31等等。SkQ1，也被称为包含
10-(6'-质体醌基)癸基三苯基鏻的盐，由于其神经保护特性等等而已知。当细胞外应用于靶细胞时，已经显示SkQ1抑制线粒体中由活性氧引起的氧化应激。MitoQ是mitoquinol(还原形式)和mitoquinone(氧化形式)的混合物，也被称为(10-(2,5-二羟基-3,4-二甲氧基-
6-甲基苯基)癸基)三苯基鏻和(10-(4,5-二甲氧基-2-甲基-3,6-二氧代环己-1,4-二烯基)癸基)三苯基鏻。MitoQ包含通过脂族碳链共价连接至亲脂性三苯基鏻阳离子的泛醇部分。
细胞外施加的MitoQ的抗氧化反应主要发生在磷脂双层内。SS-31 (d-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2; Dmt = 2′,6′-二甲基酪氨酸)是还原细胞内游离自由基的几种细胞-渗透性抗氧化肽的家族的成员。如该家族中的其它成员，已知SS-31肽靶向线粒体且保护线粒体免于线粒体通透性转换、溶胀和细胞色素c释放，并防止叔丁基过氧化氢诱导的细胞凋亡。
[0037] 许多其它线粒体靶向的抗氧化剂是本领域已知的，特别是在心血管和神经变性疾病的领域中的临床应用中。原则上，这些也有资格作为可以有利地用作替代稳定化合物以实施本公开的教导的化合物。
[0038] 在如本文公开的所有方面的一个具体实施方案中，所述线粒体靶向抗氧化剂是SkQ1。在一个甚至更具体实施方案中，向全血样品中添加SkQ1至5 – 500 nM的最终浓度，有利地50 – 250 nM、特别是约100nM的最终浓度。在如本文公开的所有方面的又一个进一步具体实施方案中，所述线粒体靶向抗氧化剂是SS-31。在一个甚至更具体实施方案中，向全血样品中添加SS-31至0.1 – 50 µM的最终浓度，有利地0.5 – 10 µM、特别是约1 µM的最终浓度。
[0039] 由于本文公开的抗氧化剂在水溶液中提供，所以选择以实施本公开的所有方面和实施方案的抗氧化剂有利地是水溶性的或在水中溶解，例如使用辅助物质，包括但不限于表面活性剂、去垢剂和乳化剂。
[0040] 在如本文公开的所有方面的一个具体实施方案中，所述抗氧化剂是第一和第二抗氧化剂的混合物，其中所述第一抗氧化剂是线粒体靶向的抗氧化剂，并且所述第二抗氧化剂是除了线粒体靶向的抗氧化剂以外的抗氧化剂。该组涵盖具有还原活性的水溶性分子，其中所述分子能够在线粒体隔室以外经历氧化。在一个进一步具体实施方案中，所述第二抗氧化剂是除了SkQ1、MitoQ和SS-31以外的抗氧化剂。有利地，在如本文公开的所有方面的一个甚至更具体实施方案中，所述第二抗氧化剂选自谷胱甘肽、乙酰基水杨酸、N-乙酰基-5-氨基水杨酸、N-乙酰基半胱氨酸、6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸(Trolox)及其混合物。
[0041] 如本文公开的所有方面和实施方案中的液体组合物中蛋白酶抑制剂的存在提供全血样品的有核细胞的进一步稳定。在这方面，一个具体实施方案包括丝氨酸蛋白酶的抑制剂。在这方面，一个更具体实施方案包括人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的抑制剂。特别有利的是由用于稳定离体全血样品的完整有核细胞中的分析物的液体组合物的具体实施方案提供，所述液体组合物包括选自西维来司他、AEBSF及其混合物的蛋白酶抑制剂。作为“西维来司他”或“ONO-5046”销售的化合物，也称为N-{2-[({4-[(2,2-二甲基丙酰基)氧基]苯基}磺酰基)氨基]苯甲酰基}甘氨酸，是一种选择性的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂。AEBSF是4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟的缩写，其为水溶性的，并且是不可逆的丝氨酸蛋白酶抑制剂。盐酸盐作为Pefabloc® SC商业可得。在如本文公开的所有方面的一个具体实施方案中，且具有特别优点，将Pefabloc® SC添加至全血样品，导致产生0.05 – 1 mM、更具体地0.1 – 
0.5 mM、且甚至更具体地0.2 – 0.3 mM、具体地约0.25 mM的最终浓度。
[0042] Pefabloc® SC是具有239.5道尔顿的分子量的水溶性丝氨酸蛋白酶抑制剂，本领域也已知为4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐(AEBSF)。所述化合物能够抑制蛋白酶如胰凝乳蛋白酶、激肽释放酶、纤溶酶、凝血酶和胰蛋白酶。
[0043] 为了稳定全血样品的有核细胞，还发现用细胞可代谢的糖补充样品是有利的。在如本文公开的所有方面的一个具体实施方案中，所述糖选自葡萄糖和果糖。在一个甚至更具体实施方案中，向全血样品中添加葡萄糖至15 – 25 mM的最终浓度，有利地19 – 21 mM、特别是约20 mM的最终浓度。
[0044] 如本文公开的一个进一步方面是包含如本文公开的用于稳定离体全血样品的完整有核细胞中的分析物的液体组合物的部件试剂盒(a kit of parts)，所述组合物是水溶液，所述溶液包含抗凝剂、磷酸盐、细胞可代谢的糖、腺嘌呤和抗氧化剂，其中所述抗氧化剂包含线粒体靶向的抗氧化剂，所述液体组合物被封闭于采血容器中，所述试剂盒进一步包含包装材料、标记和用户说明书。
[0045] 采血容器中有利地含有如本文公开的所有方面和实施方案中的用于稳定离体全血样品的完整有核细胞中的分析物的液体组合物。其实例本领域已知为“真空容器(vacutainer)”。真空容器是提供为无菌玻璃或塑料管的血液收集管，其在管内具有封闭空间(closure)和真空，便于从受试者的静脉采集预定体积的液体诸如全血样品。根据本公开的真空容器管含有用于稳定离体全血样品的完整有核细胞中的分析物的液体组合物，以便在分析测试前稳定和保存全血样品。管可以有或没有安全工程改造的封闭空间，具有多种标签选项和封闭空间颜色以及一定范围的采集体积。
[0046] 在血液收集过程中，首先用半透明塑料保持器中携带的皮下针刺穿静脉。所述针具有双端，第二较短针由于安全而被保持器笼罩。当将真空容器试管向下推入保持器时，其橡胶帽被第二针刺穿，且血液体积和管中的真空之间的压力差迫使血液通过针并进入管。然后移除填充管，并且可以插入另一个管并以相同方式填充。在抽出针之前移除管是重要的，因为可能仍然留下一些吸力，在抽出后引起疼痛。一旦从针移除收集管，则管内的全血样品与受试者的身体分离，因此，是离体全血样品。因此，如本文公开的所有方面的另一个具体实施方案包括(a)如本文公开的用于稳定离体全血样品的完整有核细胞中的分析物的液体组合物和(b)一定量的全血(即所述样品是测量和/或预定量的离体全血)的混合物。
[0047] 本文公开的另一个方面是使用如本文公开的用于稳定离体全血样品的完整有核细胞中的分析物的液体组合物，所述组合物是水溶液，所述溶液包含抗凝剂、磷酸盐、细胞可代谢的糖、腺嘌呤和抗氧化剂，其中所述抗氧化剂包含线粒体靶向的抗氧化剂，所述使用为了稳定离体全血样品的完整有核细胞中的选自DNA、RNA和蛋白的分析物的目的。
[0048] 因此，本文公开的另一个方面是用于稳定离体全血样品的完整有核细胞的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供离体全血样品；(b)使步骤(a)的样品与如本文公开的用于稳定离体全血样品的完整有核细胞中的分析物的液体组合物接触并混合，所述组合物是水溶液，所述溶液包含抗凝剂、磷酸盐、细胞可代谢的糖、腺嘌呤和抗氧化剂，其中所述抗氧化剂包含线粒体靶向的抗氧化剂；(c)孵育步骤(b)中获得的混合物，由此稳定离体全血样品的完整有核细胞。在如本文公开的所有方面的一个具体实施方案中，与如本文公开的液体组合物接触并混合的全血样品可以在室温孵育延长时间间隔，由此稳定全血样品中存在的有核细胞，以及细胞中的分析物，特别是DNA、RNA和蛋白。在一个具体实施方案中，孵育步骤(b)中获得的混合物的步骤可以在室温进行选自0小时-12小时、0小时-24小时、0小时-36小时、0小时-48小时、0小时-60小时和0小时-72小时或者甚至更长的时间间隔，这取决于其后待检测的分析物。
[0049] 在如本文公开的所有方面的实施方案中，用于稳定的靶细胞是全血的离体样品中存在的有核细胞。具体地，所述有核细胞是造血谱系的有核细胞或非造血谱系的有核细胞。具体地，造血谱系的有核细胞选自由巨核细胞、血小板、有核红细胞、肥大细胞、成髓细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、大颗粒淋巴细胞、小淋巴细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、浆细胞和树突状细胞组成的细胞类型，或任何所述细胞类型的前体。在另一个具体实施方案中，所述有核细胞是造血谱系的有核癌细胞。
[0050] 在如本文公开的所有方面的一个进一步实施方案中，用于稳定的靶细胞是全血的离体样品中存在的有核细胞，所述有核细胞能够经历两次或更多次细胞分裂，由此形成子细胞。在一个具体实施方案中，所述有核细胞能够不仅在体内、而且在培养基中离体经历细胞分裂。因此，在本公开中，其方面和实施方案提供用于支持和/或维持离体全血样品的完整有核靶细胞的活性的液体组合物，所述组合物是水溶液，所述溶液包含抗凝剂、磷酸盐、细胞可代谢的糖、腺嘌呤和抗氧化剂，其中所述抗氧化剂包含线粒体靶向的抗氧化剂，优选选自SkQ1、MitoQ、SS-31及其混合物的线粒体靶向的抗氧化剂，其中所述完整有核靶细胞能够经历一次或多次细胞分裂。更具体地，所述有核靶细胞能够在培养基中经历一次或多次细胞分裂。
[0051] 在这方面，技术人员完全知道支持哺乳动物细胞、具体地人细胞、更具体地人来源的癌细胞的活性和细胞分裂的不同培养基。在一个具体实施方案中，在如本文公开的用于支持和/或维持离体全血中的完整有核靶细胞的活性的组合物不存在的情况下，所述培养基支持细胞活性和细胞分裂。
[0052] 一方面，尽管在静息状态，但与如公开的稳定液体组合物混合的离体全血样品中的有核靶细胞的活性得到维持。另一方面且显著地，在静息状态的有核靶细胞可以分离自稳定的血液样品并投入培养，由此一旦从稳定剂移除，所述有核细胞再次变得有生理活性。换言之，从具有稳定组合物的全血样品移取有核靶细胞后，静息状态被逆转，甚至包括对于细胞分裂必需的生物学功能。因此，技术人员现在具备从全血样品分离有核靶细胞的改进方式，其中在一个具体实施方案中，所述靶细胞能够离体经历细胞分裂，并且更具体地，其中所述靶细胞是癌细胞，例如但不限于，循环肿瘤细胞。
[0053] 在如本文公开的所有方面的又一个进一步实施方案中，提供了分离并培养离体全血样品中存在的有核靶细胞的方法，其包括以下步骤：(a)提供离体全血样品；(b)使步骤(a)的样品与液体组合物接触并混合，所述组合物是水溶液，所述溶液包含抗凝剂、磷酸盐、细胞可代谢的糖、腺嘌呤和抗氧化剂，其中所述抗氧化剂包含线粒体靶向的抗氧化剂，优选选自SkQ1、MitoQ、SS-31及其混合物的线粒体靶向的抗氧化剂；(c)孵育步骤(b)中获得的混合物，由此稳定离体全血样品的完整有核细胞；从步骤(c)的孵育混合物分离有核细胞并将分离的有核细胞与培养基接触；和(d)在培养基中孵育所述有核细胞。在具体实施方案中，所述液体组合物选自如本文公开的所有方面和实施方案中的用于稳定离体全血样品的完整有核细胞中的分析物的液体组合物。
[0054] 具有在人体扩散的转移性肿瘤的癌症比具有原发性肿瘤的癌症更难以移除或治疗。在具有转移性疾病的患者中，可以在静脉血液中发现循环肿瘤细胞(CTC)。这些循环肿瘤细胞是转移性癌生长的潜在原因。检测这些细胞在癌症治疗中是特别期望的。因此，本文公开的教导、方面和实施方案提供用于该目的的额外方式。
[0055] 因此，在如本文公开的所有方面的又进一步实施方案中，用于稳定的靶细胞是全血的离体样品中存在的有核癌细胞。具体地，用于稳定的靶细胞是离体全血样品中存在的有核细胞，其中在稳定(和检测)前获得全血样品的个体患有癌症。在一个具体实施方案中，所述靶细胞是非造血谱系的有核细胞，特别是非造血谱系的癌细胞。具体地，所述癌细胞是循环肿瘤细胞，特别是从实体瘤脱落进入循环(包括淋巴和血液的循环)的细胞。
[0056] 在如本文公开的所有方面的一个具体实施方案中，所述循环肿瘤细胞选自实体瘤的细胞，所述实体瘤选自上皮、结缔组织、骨、软骨、肌肉和神经细胞的实体瘤。循环肿瘤细胞是如此处呈现的本公开的目的在于通过使全血中的癌细胞优选在室温稳定一段时间而使得在全血中可检测的特定有核细胞。
[0057] 提供以下实施例、附图和序列表以帮助理解本发明，其真正范围在所附权利要求中记载。应当理解的是，在不偏离如本文提供的公开和教导的精神的情况下可以对所述程序进行修改。
[0058] 实施例1细胞蛋白的保存
将MDA-MB-468(人乳腺癌细胞系)的悬浮细胞掺入获得自健康个体的血液样品，导致产生每ml血液100,000个掺入细胞。将样品立即处理或在室温储存48小时之后处理。样品1仅含有EDTA作为抗凝剂而无添加剂，样品2至6分别补充有西维来司他(10 µg/ml)、Pefabloc® SC (1 mM)、SkQ1 (100 nM)、Mito Q (100 nM)和谷胱甘肽(3 mM)。
[0059] 通过红细胞裂解富集有核细胞。将各样品的50 µl等分试样与200 µl裂解缓冲液(100 mM NH4Cl, 5 mM Hepes, 0.5 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA)混合并在室温孵育10分钟。以200 x g离心15分钟之后，除去上清液并将沉淀重新悬浮于250 µl裂解缓冲液中。以200 x g离心15分钟之后，除去上清液并将沉淀重新悬浮于1,000 µl PBS, 0.3 mM EDTA中。通过以200 x g离心15分钟而沉淀细胞。将沉淀重新悬浮于PBS, 0.3 mM EDTA中，并将样品的体积调整至500 µl。
[0060] 对于每种样品，将50 µl体积的细胞悬浮液点样于载玻片上并风干。将载片在冰冷的丙酮中固定10分钟，用PBS洗涤两次，并浸入含有1:50稀释于PBS中的抗细胞角蛋白K5/K8 – FITC标记的抗体的标记混合物(细胞角蛋白= CK)中。在黑暗中孵育30分钟之后，除去上清液。添加含有DAPI的封固介质，用盖玻片覆盖斑点，并且在进一步孵育20分钟之后，在Zeiss Axio Observer 显微镜上进行分析。用来自Zeiss的Assay Builder软件分析有核细胞和CK 5/8阳性细胞的总数。结果显示于图1中。含有蛋白酶抑制剂如西维来司他(嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的抑制剂)和Pefabloc SC(丝氨酸蛋白酶抑制剂)的样品显示比不含添加剂的对照样品更高的信号。用SkQ1和MitoQ(靶向至线粒体的抗氧化剂)观察到特别阳性的效果。用抗氧化剂谷胱甘肽观察到进一步阳性的效果。
[0061] 图1说明掺入血液样品的MDA-MB-468细胞在室温储存48小时之后的检测。描绘了通过用抗- CK 5/8抗原免疫染色检测到的MDA-MB-468细胞的百分数。
[0062] 实施例2细胞蛋白的保存
将MDA-MB-468细胞掺入获得自健康个体的血液样品，导致产生100,000个掺入细胞/ ml血液的浓度。将样品立即处理或在室温储存48小时之后处理。样品1含有EDTA作为唯一抗凝剂且无进一步添加剂，样品2至4含有柠檬酸盐(11.7 mM) / 柠檬酸(2.1 mM)、NaH2PO4 (2.1 mM)、右旋糖(20.1 mM; 右旋糖 = D-葡萄糖)、腺嘌呤(0.24 mM)作为稳定剂。样品3额外补充有线粒体靶向的抗氧化剂SS-31 (1 µM)，样品4额外补充有谷胱甘肽(0.75 mM)。通过红细胞裂解富集有核细胞并进行处理，如实施例1中所述。
[0063] 结果显示于图2中。除了实施例1的结果以外，抗氧化剂还显示它们在柠檬酸盐抗凝化的血液中的阳性效果。图2说明掺入血液样品的MDA-MB-468细胞在室温储存48小时之后的检测。描绘了通过用荧光抗- CK5/8抗体免疫检测检测到的MDA-MB-468细胞的百分数。
[0064] 实施例3DNA的保存
以200,000个掺入细胞/ml血液的最终浓度将Karpas 422细胞掺入EDTA或与谷胱甘肽(325 mM)、SKQ1 (100 µM)和Pefabloc ®SC (100 mM)(也称为“稳定剂3”)混合的EDTA中的来自3个健康个体的血液样品。将样品储存在环境温度。Karpas细胞是具有t(14;18)和t(4;
11)染色体易位的B-细胞非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)细胞系。选择t(14;18)易位作为区分源自Karpas细胞的DNA与源自正常细胞(即，无t(14;18)易位的血液细胞)的DNA的标志物。
[0065] 样品设置之后立即和在室温孵育48小时之后，通过红细胞裂解富集有核细胞。将350 µl样品的等分试样与1,000 µl裂解缓冲液(80 mM NH4Cl, 10 mM Hepes缓冲液, 0.1 mM EDTA)混合并在室温孵育10分钟。以300 x g离心15分钟之后，除去上清液并将沉淀重新悬浮于1,000 µl裂解缓冲液中。以300 x g离心15分钟之后，除去上清液并将沉淀重新悬浮于1,000 µl PBS中。通过以300 x g离心15分钟而沉淀细胞。将沉淀重新悬浮于PBS中，并用高纯度模板制备试剂盒(Roche Applied Science, 目录号11 796 828 001)根据制造商推荐的方案分离DNA。用100 µl洗脱缓冲液从HighPure柱洗脱DNA。
[0066] 将来自各样品的5 µl DNA的等分试样用于20 µl PCR反应中，一式三份。在LightCycler 480仪器中用Lightcycler 480 Probes Master (Roche Applied Science 目录号04707494001)进行扩增，在95℃初始变性10分钟，50个循环的95℃持续10秒、60℃持续60秒。使用的引物和探针序列是：t(14/18)正向引物acctgaggagacggtgac (SEQ ID NO:1)；t(14/18)反向引物tggggttttgacctttagaga (SEQ ID NO:2)；t(14/18) – FAM检测探针
6FAM-ctctgggtgggtctgtgttgaaaca--BHQ2 (序列是SEQ ID NO:3)。
[0067] 由样品在室温储存48小时引起的交叉点(术语定义参见实施例4)的差异显示于图3中。在测试的两种条件下没有DNA的显著降解。然而，在稳定剂3存在的情况下，观察到样品间变异减少，并且还有测定内变异的减少。
[0068] 实施例4RNA的保存
将来自乳腺癌患者的含有循环肿瘤细胞的血液样品收集于柠檬酸盐(11.7 mM) /柠檬酸(2.1 mM)、NaH2PO4 (2.1 mM)、右旋糖(20.1 mM)、腺嘌呤(0.24 mM)和SkQ1 (100 nM)(被称为“稳定剂4”)或CellSave (Veridex Cell Save Preservative管，目录号7900005)中。
将样品#59、# 60、# 62、# 63、# 58在室温储存48小时，将样品# 55、# 56和# 57在室温储存
72小时。通过红细胞裂解富集有核细胞。将350 µl血液样品的等分试样与1,000 µl裂解缓冲液(80 mM NH4Cl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EDTA)混合，在室温孵育10分钟，以300 x g离心15分钟，用1,000 µl裂解缓冲液洗涤，以300 x g离心15分钟。将沉淀溶解于200 µl PBS中，并用来自Roche Applied Science的高纯度RNA分离试剂盒(目录号11828665001)从这些细胞分离RNA。用56 µl洗脱缓冲液洗脱柱。在20 µl的反应体积中使用Transcriptor第一链cDNA合成试剂盒(Roche Applied Science, 目录号04897030001)对2 µl来自分离的RNA的等分试样进行逆转录。在LightCycler 480仪器中用LightCycler 480 Probes Master扩增5 µl cDNA的等分试样。使用的引物和探针描述于表1中。
[0069] 表 1：§包括5´ FAM标记，和3´-BHQ2标记
$包括5´ FAM标记，和3´-TAMRA标记。
[0070] 实时PCR，包括RT(=逆转录)-PCR，使用DNA扩增的线性，以确样品中的已知序列的绝对或相对量。通过在反应中使用荧光报道分子，在PCR的每个循环监测DNA的生成。当DNA在扩增的对数线性阶段中时，荧光的量增加高于背景。在其过程中荧光变得针对背景可测量的扩增循环被称为循环阈值或“交叉点”。
[0071] 结果显示于表2a-2d中。在每个部分(2a-2d)，第一行表明样品数和分别在室温的储存时间。第二行指明稳定剂的类型。一式两份进行RT-PCR，表示为“测试A”和“测试B”。表中的数字是实时RT-PCR之后获得的交叉点。“neg”表明阴性结果。
[0072] 表2a
[0073] 表2b
[0074] 表2c
[0075] 表2d
[0076] 上面指明的RNA分子已知对于某些类型的循环肿瘤细胞是特异性的。因此，在用稳定剂4保存的样品中，编码E-钙黏着蛋白、EpCam、Muc 1、细胞周期蛋白、CAV和CK18的RNA令人惊讶地仍然是可检测的。用稳定剂CellSave，在白细胞中也表达的cMyc RNA同样是可检测的，但交叉点强烈偏移。这表明对应RNA水平降低几个数量级。
[0077] 用作对照的持家基因RNA PPIA、TBP、beta2m和GAPDH在所有样品中都是可检测的。然而，用CellSave稳定的样品显示非常高的交叉点，因此显示非常低的RNA水平。
[0078] 本实施例显示，储存48小时或72小时的血液样品中的RNA可以保存于稳定剂4试剂中。
[0079] 实施例5来自72小时样品储存之后分离的细胞的RNA的定量
以14.4 x 106个细胞/ ml将MDA-MB-468细胞掺入获得自两个健康个体的血液样品。从每个供体制备四个样品。样品1和2仅含有EDTA作为抗凝剂且没有添加剂，样品3和4用柠檬酸盐(11.7 mM)、柠檬酸(2.1 mM)、NaH2PO4 (2.1 mM)、右旋糖(20.1 mM)、腺嘌呤(0.24mM)、Pefabloc® SC (0.25 mM)、SS-31 (1 µM)和乙酰基水杨酸(1 mM)作为稳定剂(“稳定剂5”)进行稳定。设置之后立即处理来自这些样品的等分试样，在室温储存72小时之后处理其它等分试样。通过根据制造商推荐的方案用来自Adnagen目录号:T1-508的
BreastSelectBeads与1,000 µl样品材料的等分试样捕获而从血液分离MDA-MB-468细胞。
[0080] 将珠捕获纯化的细胞重新悬浮于1,000 µl PBS中。用200 µl等分试样，使用MagNA Pure LC DNA分离试剂盒 – 大体积目录号03310515001使用程序“DNA LV Blood_20_200”和100 µl的洗脱体积分离RNA。
[0081] 在70 µl体积的反应(各反应含有12.5 µl分离的核酸)中，使用Transcriptor第一链cDNA合成试剂盒目录号:04897030001将RNA转录成cDNA。在LightCycler 480仪器中，用LightCycler 480 Probes Master，在含有5 µl cDNA的20 µl反应中，进行PCR。在95℃初始变性10分钟，50个循环的在95℃变性10秒和在58℃退火/延伸1分钟。检测形式：双色水解探针UPL (Universal Probe Library, Roche Diagnostics GmbH Mannheim, Germany)探针，如下所示。表3描述分析的RNA/DNA靶标的引物/探针。
[0082] 为了定量测试的RNA靶标的表达水平的变化，使用Livak和Schmittgen的相对定量方法(Livak K.J.和Schmittgen T.D., Methods 2001, 25(4) 402-408)。为了提供参考用于获得的RNA值的归一化，从总核酸制备物中存在的DNA扩增GCK靶标。
[0083] 图4显示来自从储存于EDTA中的血液分离的细胞的RNA水平的强烈下降。当从储存于稳定剂5中的血液分离细胞时，观察到对RNA的影响非常小。表达模式在储存过程中仅受到轻微影响。
[0084] 表 3：§ 包括5´ FAM标记，和3´-BHQ2标记
$ 包括5´ FAM标记，和3´-TAMRA标记。
[0085] 实施例6样品储存48小时之后活细胞的分离
将MDA-MB-468细胞掺入获得自健康个体的血液样品，导致产生300,000个掺入细胞/ ml血液的最终浓度。将样品立即处理或在室温储存48小时之后处理。样品1仅含有EDTA作为抗凝剂且没有进一步添加剂，样品2含有柠檬酸盐(11.7 mM)/柠檬酸(2.1 mM)、NaH2PO4 (2.1 mM)、右旋糖(20.1 mM)、腺嘌呤(0.24mM)、Pefabloc® SC (0.25 mM)、SS-31 (1 µM)和乙酰基水杨酸(1 mM)作为稳定剂(“稳定剂5”，参见实施例5)。
[0086] 样品设置之后立即和48小时之后，通过红细胞裂解富集有核细胞。将1 ml血液的等分试样与4 ml裂解缓冲液(80 mM NH4Cl, 10 mM Hepes缓冲液, 0.1 mM EDTA)混合并在室温孵育10分钟。以200 x g离心15分钟之后，除去上清液并将沉淀重新悬浮于2 ml PBS/3 mM EDTA中。通过以200 x g离心15分钟而沉淀细胞。除去上清液，并将细胞沉淀重新悬浮于300 µl补充有2 mM EDTA和0.5% BSA的PBS中。
[0087] 使用来自Miltenyi的CD326 (EpCAM)微粒(目录号130-061-101)、MS柱和MACS分离系统(Milteny目录号130-042-201, 130-042-102)，利用制造商推荐的方案，从这些样品分离MDA-MB-468细胞。
[0088] 将富集的细胞悬浮于300 µl RPMI培养基中。
[0089] 用台盼蓝排除法测试细胞的活性。将10 µl各样品与10 µl台盼蓝(Sigma-Aldrich T8154)混合。在Neubauer室中计数排除染料的MDA-MB-468细胞的数目。使用掺入血液样品的细胞数作为100％来计算活细胞的得率。
[0090] 表4显示用来自两个供体的血液样品获得的结果。稳定剂5可以保存显著数目的细胞。当仅EDTA用作稳定剂时，细胞活性受到负面影响，至令人惊讶地显著的程度。
[0091] 表 4：供体 抗凝剂/稳定剂 储存48小时、红细胞裂解和免疫磁性富集之后分离的活细胞的百分数#1 EDTA 16
#1 稳定剂5 44
#2 EDTA 9
#2 稳定剂5 46
[0092] 实施例7从稳定的血液分离的细胞是可培养的
将如实施例6中所述处理和分离的MDA-MB-468细胞接种入用于实时细胞分析仪 
(RTCA) MP (xCELLigence系统)的E-板96-孔装置(Roche Applied Science, 目录号
06472451001, Roche Diagnostics GmbH Mannheim, Germany)的各孔中。将50 µl细胞的等分试样接种入含有50 µl RPMI培养基的各孔中。使用一式两份用于分析。将E-板在孵育器中在37℃孵育过夜，以允许MDA-MB-468细胞粘附至E-板的底部。为了除去污染的血液来源的细胞，除去培养基，并将粘附至培养板的细胞用PBS洗涤3次。每孔添加150 µl新鲜RPMI培养基，并将E-板转移至实时细胞分析仪。细胞指数每小时测量一次，持续101小时。
[0093] 结果显示于图5中。用从本发明中所述的稳定剂中储存48小时的血液分离的细胞可以观察到细胞生长。
[0094] 与仅用EDTA稳定的细胞进行比较。如所表明，从仅用EDTA储存48小时的血液分离的细胞不再是可培养的。
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