发明背景

本申请要求于2007年3月9日提交的美国临时申请60/894,096和 2007年4月30日提交的美国临时申请60/915,066的优先权，本文完整 引入其公开内容作为参考。

1.发明领域

本发明主要涉及制备和转化植物分生组织及转基因植物的选择 和随后的再生的方法。

2.相关技术描述

可以通过直接处理植物胚的分生组织获得转化的植物。分生组 织包含形成性植物细胞，形成性植物细胞分化产生多种植物结构， 包括茎、根、叶、种系组织和种子。可以从种子切下如大豆组织的 分生组织。已知直接对大豆胚的分生细胞使用细菌介导的基因转移 来遗传转化大豆(Glycine max)的方法。已经转化了分离的棉花分 生组织和苗端(shoot apex)组织。已报道了细胞分裂素在组织培养 中诱导苗发育的用途。

已知许多用于遗传转化植物细胞的选择剂。氨基糖苷-3’-腺苷酰转 移酶已被用作转化植物细胞中的选择性标记。已经报道了aadA与编码 叶绿体转运肽的序列的融合，以允许将核产生的AadA引向叶绿体。

发明概述

一方面，本发明提供了产生包含至少两种异源核酸序列的转基 因植物的方法，包括：(a)提供包含赋予除草剂抗性的第一异源核酸 序列的外植体；(b)转化该外植体以包括含有赋予壮观霉素抗性的可 选择标记基因的第二异源核酸序列；和(c)再生显示壮观霉素抗性的外 植体成为包含至少两种异源核酸序列的转基因植物。在一个实施方案 中，外植体包含胚分生组织。在另一个实施方案中，第一异源核酸 序列赋予对草甘膦、双丙氨膦(bialaphos)、草胺膦(phosphinothricin)、 Basta、草丁膦、2，4-D、卡那霉素和相关的氨基糖苷类、潮霉素 (hygromycin)、乙酰辅酶A羧化酶抑制剂、产氧自由基物质或麦草畏 的抗性。在另一个实施方案中，外植体是大豆、玉米、棉花或油菜 (canola)外植体。在一个特定的实施方案中，外植体是大豆或棉花 外植体，如大豆植物。

另一方面，本发明提供了产生转基因植物的方法，包括：(a)用 包含赋予壮观霉素耐受性的可选择标记的异源核酸序列转化至少第 一种子外植体；和(b)从转化的细胞再生转基因植物，其中在步骤(a) 或步骤(b)之前、同时和/或之后，将外植体与包含壮观霉素的至少第 一培养基接触，以选择包含所述可选择标记的转化细胞。在一个实 施方案中，转基因植物由导致种系组织转化的分生组织的转化产生。 在某些实施方案中，产生的植物是非嵌合的。在另外其它的实施方案 中，产生的植物是嵌合的。在一个特定的实施方案中，产生的植物的 至少一个苗(shoot)是转基因且非嵌合的。在另一个特定的实施方 案中，产生的植物的至少一个苗是转基因且非嵌合的，而至少一个 其它苗或一个其它根不包含在异源核酸上所含的序列。在某些实施 方案中，第一种子外植体包括转基因。在其它实施方案中，外植体包 含胚分生组织。在另外其它的实施方案中，在步骤(a)的过程中或之后， 在35℃-40℃下，在选择剂的存在下培育外植体，和/或在允许正常质 体发育的光照条件下培育外植体。在另外其它的实施方案中，在 35℃-40℃下，培育进行1-7天，或者光照条件包括至少5微爱因斯坦 (μEinsteins)、大约16小时光照/8小时黑暗的光周期。

在某些实施方案中，在步骤(a)之前，在0-15℃的温度下存储外 植体1小时至7天。在其它实施方案中，培养基包含大约15mg/L- 大约1500mg/L的壮观霉素。本发明进一步涉及一种方法，其中外植体 的细胞包含赋予对草甘膦、双丙氨膦、草胺膦、Basta、草丁膦、2，4-D、 卡那霉素和相关的氨基糖苷类、潮霉素、链霉素、氨苄青霉素或麦草 畏的耐受性的编码序列。在某些实施方案中，步骤(a)包括在包含壮观 霉素的共培养基上培育外植体。在其它实施方案中，在从共培养基中 转移出后，外植体不与包含壮观霉素的培养基接触。或者，在其它实 施方案中，在从共培养基中转移出后，外植体与包含壮观霉素的培养 基接触。在某些实施方案中，无需在无菌培养基中预生根，将再生成 为植物的外植体转移到土壤或土壤替代物中生根。在其它实施方案 中，异源核酸进一步包括赋予农艺学上的目标性状或具有改善的最 终用途的性状的编码序列。

在其它实施方案中，本发明提供了产生转基因植物的方法，包括： (a)用包含赋予壮观霉素耐受性的可选择标记的异源核酸序列转化至 少第一种子外植体，和(b)从转化的细胞再生转基因植物，其中在步 骤(a)或步骤(b)之前、同时和/或之后，将外植体与包含壮观霉素的至 少第一培养基接触，以选择包含所述可选择标记的转化细胞，其中， 步骤(a)包括用至少第二异源核酸转化外植体的细胞。在特定的实施方 案中，第二异源核酸序列包含赋予除草剂耐受性的编码序列。在某些 实施方案中，第一和第二异源核酸整合在细胞基因组中的不同的基因 座处。本发明的某些实施方案包括，在步骤(a)之前的引发(priming) 种子的步骤，其中，引发包括将种子与细胞分裂素接触。在其它实施 方案中，涉及一种方法，进一步包括在步骤(b)之前、同时和/或之后， 将外植体与细胞分裂素接触。在特定的实施方案中，细胞分裂素选自 噻苯隆(thidiazuron)、BAP(6-苄氨基嘌呤)、激动素、CPPU(N-(2- 氯-4-吡啶基)-N’-苯脲)、2iP(6-(y，y-二甲基烯丙基氨基)嘌呤)、玉米 素、玉米素-核苷、腺嘌呤和TIBA(2，3，5-三碘苯甲酸)。

在某些实施方案中，步骤(a)包括将外植体与包含所述异源核酸 的重组根瘤菌科细菌(Rhizobiaceae)接触，其中，在外植体接触重组 根瘤菌科细菌之前或同时，根瘤菌科细菌已经暴露于噻苯隆。在某些 实施方案中，在外植体接触重组根瘤菌科细菌之前，根瘤菌科细菌暴 露于噻苯隆大约1-5天。在其它实施方案中，在外植体接触根瘤菌科 细菌之前，在对未转化的外植体具有活性的选择剂的存在下，悬浮根瘤 菌科细菌。在某些实施方案中，根瘤菌科细菌选自土壤杆菌 (Agrobacteria)、中华根瘤菌(Sinorhizobia)、中慢生根瘤菌 (Mesorhizobia)和根瘤菌(Rhizobia)。在另外其它的实施方案中， 在用包含赋予壮观霉素耐受性的可选择标记的异源核酸序列转化至 少第一种子外植体的步骤之前、过程中或之后，在杀真菌剂的存在 下培育外植体。在某些实施方案中，在杀真菌剂和DMSO的存在下 培育外植体。在特定的实施方案中，在制霉菌素(nystatin)、噻菌灵 (thiabendazole)和DMSO的存在下培育外植体。

在某些实施方案中，外植体是大豆、玉米、棉花或油菜外植体。 在特定的实施方案中，外植体是大豆外植体或棉花外植体。

在某些实施方案中，产生转基因植物的方法包括：(a)用包含赋 予壮观霉素耐受性的可选择标记的异源核酸序列转化至少第一种子 外植体，和(b)从转化的细胞再生转基因植物，其中在步骤(a)或步骤 (b)之前、同时和/或之后，将外植体与包含壮观霉素的至少第一培养 基接触，以选择包含所述可选择标记的转化细胞，进一步包括步骤 (c)：获得包含赋予目标性状的基因且缺乏可选择标记的任一代转基因 植物的后代植物。在某些实施方案中，异源核酸包括包含位于赋予目 标性状的基因侧翼的左和右T-DNA边界的第一DNA区段；和包含第 二套位于所述赋予壮观霉素耐受性的可选择标记侧翼的左和右 T-DNA边界的第二DNA区段。在其它实施方案中，该方法进一步包 括步骤(c)：获得包含赋予目标性状的基因且缺乏可选择标记的任一代 转基因植物的后代植物。

在某些实施方案中，异源核酸包括右和左T-DNA边界及第一和 第二DNA区段，其中，第一DNA区段包括位于右边界之后的目标基 因，而且其中，第二DNA区段包括位于左边界之后的可选择标记。在 某些实施方案中，异源核酸包括第一和第二右T-DNA边界，其中， 包含目标基因的第一DNA区段位于第一右边界之后，且包含可选择标 记的第二DNA区段位于第二右边界之后。

在某些实施方案中，该方法包括在步骤(b)的过程中，在缺乏壮观 霉素的培养基上培养所述外植体大约1天至大约7天。在其它实施方案 中，该方法包括将外植体与包含壮观霉素的至少第一培养基接触大约 15分钟至大约7天。在特定的实施方案中，可选择标记由aadA编码。 在更加特定的实施方案中，aadA包括SEQ ID NO：1。在某些实施方案 中，aadA基因与叶绿体转运肽融合。在特定的实施方案中，aadA包括 SEQ ID NO：2。

在某些实施方案中，进一步限定外植体在步骤(b)前、在以下条件 下维持：其中，外植体不发芽，并且保持存活且能够进行遗传转化。在 某些实施方案中，所述条件包括使外植体或包含外植体的种子脱水。 在某些实施方案中，进一步限定该方法为包括在步骤(b)之前或同时增 加外植体的含水量。在特定的实施方案中，所述条件包括大约3％- 大约25％的外植体的内部含水量。在更加特定的实施方案中，所述 条件包括大约3％-大约16％的外植体的内部含水量。在某些实施方 案中，所述条件包括在大约-80℃-大约60℃的温度下维持外植体。

在某些实施方案中，该方法包括在步骤(b)之前引发外植体。在特 定的实施方案中，引发种子包括将外植体或包含外植体的种子与包含 水、植物生长调节剂、选择剂或细胞膜调节剂的水溶液接触。

在某些实施方案中，包括产生转基因植物的方法，包括：(a)用 包含赋予壮观霉素耐受性的可选择标记的异源核酸序列转化至少第 一种子外植体；和(b)从转化的细胞再生转基因植物，其中在步骤(a) 或步骤(b)之前、同时和/或之后，将外植体与包含壮观霉素的至少第 一培养基接触，以选择包含所述可选择标记的转化细胞，该方法进 一步包括通过细菌介导的转化或微粒轰击，用异源核酸转化外植体 的至少第一细胞。

在某些实施方案中，进一步限定外植体为从包含3％-25％的内部 含水量的种子、或包含26％-80％的内部含水量的水化的或发芽的种 子上切下的，或者外植体包含以下组织：分生组织、不成熟的胚、 胚、胚轴、子叶、下胚轴(hypocotyl)、中胚轴(mesocotyl)、叶、 初生叶原茎(primary leaf base)、叶盘(leaf disc)、茎尖(shoot tip) 和胚芽(plumule)。在某些实施方案中，进一步限定外植体为从发芽 或吸胀的种子上切下的。在其它实施方案中，在步骤(a)之后，外植 体不与包含壮观霉素的培养基接触。在特定的实施方案中，第一培养 基是液体。在其它实施方案中，步骤(a)-(b)中的一个或多个是自动化 的。

另一方面，本提供了包含赋予壮观霉素或链霉素耐受性的两种序列 的核酸构建体，其中，第一序列可操作地连接到在植物细胞中具有活性 的启动子上，且第二序列可操作地连接到在原核细胞中具有活性的启动 子上。在一个特定的实施方案中，赋予壮观霉素或链霉素耐受性的序 列编码具有氨基糖苷-3’-腺苷酰转移酶(aadA)活性的多肽。在一个更 特定的实施方案中，至少一个序列包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2。

附图简述

下面的附图是本说明书的一部分，而且包括在说明书中以进一 步证明本发明的某些方面。通过参考附图结合本文提出的具体实施 方案的详细描述，可以更好地理解本发明。

图1：用添加到接种物/共培养培养基中的不同水平的TDZ处理 后，4种大豆外植体的放大的细节。每种外植体发育出新生的芽/苗 (下图)，而一些是GFP阳性的(上图)。上排的图片是在显微镜 下用通过荧光检测表达GFP的组织的改变的蓝光源采集的。用标准 白光源采集同样的图片，以显示所有的发育的芽/苗(下排)。

图2：pMON96999的质粒图。

图3：壮观霉素选择方案“A”的略图。在液体或半固体培养基上的 选择、苗诱导和延长；使分离的苗在半固体培养基上生根。

图4：壮观霉素选择方案“B”的略图。在液体或半固体培养基上的 选择、苗诱导和延长；无需选择，使分离的苗在具有液体培养基的OASIS 塞(plug)中生根。

图5：壮观霉素选择方案“C”和“D”(下图)的略图，以及与使用草 甘膦选择的方案的比较(上图)。对于方案“C”，在共培养之后，保持 外植体在原始的PLANTCONs中，并加入12ml液体选择培养基。4天 后，将它们转移到用于选择和苗诱导的半固体选择培养基上。对于方案 “D”，在共培养之后，将外植体直接转移到用于选择和苗诱导的半固体 培养基上。在方案“C”和“D”中，无需对于苗延长和根诱导进行选择，将 产生绿苗的外植体移到具有液体培养基的塞中。对于使用草甘膦 选择的方案(上图)，其中，苗诱导和苗延长在半固体培养基上进行并 进行选择，分离的苗的生根也在半固体培养基上进行并进行选择。

图6：包含2个T-DNA、OriRi和aadA的pMON107379的质粒图。

发明详述

下面是本发明的详述，用以帮助本领域的技术人员实践本发明。 本领域的技术人员可以在不背离本发明的精神或范围的情况下，对 本文所述的实施方案进行修改和改变。

本发明提供了使用壮观霉素作为选择剂从大豆、玉米、棉花、或 油菜植物等制备、筛选、转化和再生外植体，以获得转化的植物组织 和植物的方法和组合物。在某些方面，所述方法的各个部分可以是 自动化、高通量的程序。例如，从种子获得如成熟的或不成熟的胚 的外植体，并可通过例如细菌介导的方法或微粒轰击方法转化该外 植体。在某些实施方案中，在异源DNA接触外植体的时候或随后， 外植体接触选自噻苯隆、BAP(6-苄氧基嘌呤)、激动素、CPPU(N-(2- 氯-4-吡啶基)-N’-苯脲)、2iP(6-(y，y-二甲基烯丙基氨基)嘌呤)、玉米 素、玉米素-核苷、腺嘌呤和TIBA(2，3，5-三碘苯甲酸)的细胞分裂素 或其它类似敌草克(dikegulac)的试剂。为了有助于外植体与细胞分 裂素的接触，可以在外植体接触接种物之前向用于转化的细菌接种 物中加入细胞分裂素。在某些实施方案中，所用的细胞分裂素是大约 0-3mg/L或大约0.25-3mg/L的浓度的BAP或TDZ(大约0-3mg/l或大 约0.25-3mg/L)。在某些实施方案中，也可以在种子吸胀过程中加入 细胞分裂素或其它试剂，以在切下外植体之前处理它们。

涉及在用或不用细胞分裂素处理的情况下，以15-1500mg/L的浓度 使用壮观霉素，例如，大约25、50、100、150、250、300、500、1000 或1500mg/L。如果使用细菌介导的转化的方法，可以在其接触外植体 之前向细菌接种物中加入壮观霉素。或者，如果使用细菌介导的转化 方法或微粒轰击转化方法，可以在转化大豆、玉米、棉花或油菜细胞 的步骤之前、同时或之后加入壮观霉素，以选择被异源核酸转化的细 胞。也可以采用壮观霉素作为所述组织培养生长步骤的时间段中的一部 分的“脉冲”，如预培养步骤、共培养步骤、延迟步骤或选择步骤，且任 选地以大约1000mg/L的较高浓度使用。

在现有技术中，使用本文所述的方法和组合物没有实现获得的转化 率(“TF”)。因此，相比例如使用草甘膦或麦草畏作为大豆或棉花转化 的选择剂时发现的TF，已经实现了2-10或5-10倍的TF增加(在某些 情况下甚至更高)。另外，提高的转化效率允许开发使用大观霉素选择 的有效的2T-DNA转化系统，因此允许通过转化叠加转基因性状，并 且使已经包含一种转基因性状的植物与编码另外的目标性状的核酸杂 交，然后筛选也包含编码该另外的性状的核酸的植物。

与TF的提高相结合，所述方法在简化并减少产生转化的植物必需 的劳动力的同时，也允许更快速地再生候选的转化植物组织，提高鉴定 和培育转化的苗和植物的效率，和减少成本和人类工程学(ergonomic) 负担。例如，在具有绿色的(即，大观霉素抗性的)芽或叶的大观霉素 抗性苗已经伸长并且可以筛选或评分为大观霉素抗性之后，在存在或不 存在选择剂的情况下，可以将它们置于土壤中或如生根培养基的土壤 替代物上。从这种外植体伸长的苗常规地证明为转基因的，并产生 R1和转基因的后代，而从这样的外植体发育的根可以是转基因或非 转基因的。因此，也涉及包含转基因苗和部分或完全非转基因的根 系统的植物。也涉及这样一种方法：通过在缺乏选择剂的培养基上 培养转化的组织，从来自转化的分生组织的转基因苗再生完整的植 物，尽管根是非转基因的。因此，所述方法使得在选择条件下和使 用选择剂的情况下的耗时明显减少，因而也减少了可能的费用。

为了提供对于说明书和权利要求书的清楚和一致的理解，包括这些 术语的范围，提供了下面的定义。

“胚”是种子的部分，由叶、茎和根的前体组织(分生组织)组 成。一旦胚开始生长(发芽)，则变成幼苗植物。

分生组织(“Meristem”或“meristematic tissue”)由未分化细胞、分 生组织细胞组成，其分化产生多种植物结构，包括茎、根、叶、种 系组织和种子。分生组织细胞是为了获得转基因植物的转化的靶标。

“外植体”是用于表示转化的靶标材料的术语，包括分生组织。它 可以指植物组织，包括但不限于一个或多个胚、子叶、下胚轴、叶 基、中胚轴、胚芽、原生质体和胚轴。

“嵌合植物”是由遗传学上不同的组织组成的植物，即，该植 物只有一部分组织是转化的，而其余的组织不是遗传转化的。

当目标基因转化到产生花粉或胚珠的细胞中进而转化到种子中时， 发生了“种系转化”。

为了获得转基因后代植物，可以用选择的异源DNA序列转化外植 体，且可以由此再生转基因植物，而无需从转化的外植体产生愈伤组织 细胞培养物。例如，选择的异源DNA序列可以编码可筛选或可选择的 标记，和/或包含提供由异源核酸表达而产生的植物或细胞所显示的性 状的农艺学目标基因。性状可以是农艺学上有用的，例如，导致提高的 产量、除草剂耐受性、害虫或病原体抗性或环境适应性等表型。性状也 可以确定需要的终产物的产生。

这样的转化和再生方法允许用于产生转化植物的快速有效的高通 量程序。机械化明显减少产生10,000个外植体预计的需要的工时，例如 在棉花的例子中，从大约40小时减少到只有2.4小时，明显节约了劳动 力成本。由于预期只有非常少量的转化事件显示最理想的适于商业开发 的表达谱，因此这种技术允许测试大量的转基因并选择较高质量的事件 用于进一步的分析。由于在外植体递送方面的灵活性增加，机械切除方 法也允许对转化步骤进行更好的时间安排和调度。外植体切除使用机械 化方法可以提供明显的经济、安全和灵活性方面的益处。但是，也可以 手工进行外植体制备。

在吸胀、发芽和/或外植体切除之前，可以对种子进行灭菌步骤以 及挑选步骤，以避免微生物污染，除去具有高度细菌或真菌污染的种子， 以及除去由于任何原因不可能产生用于本发明的活外植体组织的种子。 例如，可以根据如种子的大小、颜色或密度等参数或包括化学组成特征 的其它特征，进行挑选。挑选方法的例子可以包括在大小分选后使用自 动称。适于此目的的光学分选器是Sortex 3000 Series Color Sorter (Buhler-Sortex KK，Yokohama，Japan)。也可以采用其它挑选技术，包括 根据含水量挑选。切除后，在用异源核酸转化之前，外植体也可以进行 再水化或预培养步骤。

在特定的实施方案中，使用可以反向旋转的、碾压施加到其表面 的种子的轧辊(roller)进行机械切除。可以根据施加的种子的大小 调整轧辊之间的间隙。轧辊材料可以是例如弹性体或金属。在某些实 施方案中，已经发现甚至在反复和持续使用后，不锈钢轧辊保持有效 的工作质量。发现当用于棉花种子时，具有次级凹槽的轧辊有效地 夹紧和碾压种子，而对分生组织外植体种子部分具有最小的损伤。 已知机械切除植物外植体的方法，例如，参见，美国临时专利申请 60/894,096和60/915,066与美国专利申请公开US2005/0005321，本文完 整引入作为参考。

在一个实施方案中，可以限定根据本发明制备的外植体具有大 约4-25％的内部含水量，包括大约4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、16、17、18、19、20、21、22、23、24和25％的内部含水 量，而且特别包括在任意两个这样的数值之间的可推导出的所有范 围。在特定的实施方案中，可以以预定的适合由此分离可转化的材 料的内部含水量，收获将要从其制备外植体的种子。在某些非限制 性的实施方案中，从其获得外植体的种子可以限定为具有大约3-25 ％的内部含水量，包括大约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、16、17、18、19、20、21、22、23、24和25％的内部含水量， 而且特别包括在任意两个这样的数值之间的可推导出的所有范围， 例如大约4％-16％。在某些实施方案中，可以通过控制含水量改变 种子的脆性，以允许种子的有效分裂和外植体的制备。例如，如 3％-7％的内部含水量可能是有利的。种子可以在使用前保持有这样 的含水量或任何其它可产生稳定的存储条件(和可转化的外植体) 的含水量。在某些实施方案中，种子可以是大豆、玉米、棉花或油 菜种子。

可以使用具有不同的年龄的干外植体(在低含水量条件下从种 子上切下的外植体)或干燥的湿外植体(在水化/吸胀之后从种子上 切下，随后脱水并存储的外植体)。在一个实施方案中，外植体相 对“年轻”，因为它们在使用前从种子上切下不到一天，如大约1-24 小时，例如大约2、3、5、7、10、12、15、20或23小时。在其它 实施方案中，外植体可以存储较长时间，包括几天、几周、几个月 或甚至几年，这取决于用来维持外植体生命力的存储条件。本领域 的技术人员尤其会理解：可以优化存储时间使得转化体的质量和/或 产率以及转化过程的效率最大化。这可以为了任何特定的转化方案 而进行，例如，如土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化、微粒轰 击转化以及其它转化方法。

在某些实施方案中，干燥的种子或外植体可以首先例如通过吸 收如水或灭菌液的液体来引发，再干燥，随后用于转化和再生。在 其它实施方案中，可以通过以下步骤引发种子或者外植体：提高种 子的内部含水量到超过30％，在一时间点保持种子或者外植体，然 后在稍后的时间点重新开始吸胀。在一个替代实施方案中，可以通 过以下步骤引发种子或者外植体：提高内部含水量到超过30％，存 储种子或外植体一段预定时期，干燥种子或外植体到内部含水量低 于20％，然后重新开始吸胀。

可以收获可再生、可转化的外植体，其不包含、包含一些或部 分仍然附于胚组织上的每个子叶，例如多达1/4的子叶。这些外植体被 认为是基本相似的，因为它们均可产生稳定的转化的植物。然而， 外植体应该包含胚的分生组织区中的至少一部分，使得外植体一般 可在组织培养生长条件开始后的12周内产生苗。

外植体可以从水化的种子、干燥存储的种子、干燥水化的外植 体的部分再水化来回收，其中，“水化”和“再水化”定义为种子的内部 含水百分比的可测量的变化，或从“引发的”种子回收；即，已经 开始发芽，但已适当地处于停滞状态，等待有利条件以完成发芽过 程的种子。本领域的技术人员能够使用不同的水化方法并在转化前 优化孵育时间长度。产生的新的外植体是可存储的，并且在提供适 当的条件时可以发芽和/或被转化。因此，新的、干燥的、可存储的 分生组织外植体可称为人工种子。

切下后，本领域的技术人员可以根据公开的方法在随后的使用 前存储外植体。干燥、存储和使种子发芽的方法和参数是本领域中 已知的(例如，Senaratna等人，1983；Vertucci和Roos，1990；Chai等 人，1998)。需要时可以使用这些存储条件的修改条件存储本发明的 切下的分生组织。可以按所需使用任何这样的条件，例如，包括例 如大约-80℃-大约60℃的温度。尤其发现大约-20℃到室温的温度 运行良好，但本发明并不限于这些温度。

实施例中所述的数据表明，例如，存储的包含分生组织的种子 外植体可以保持存活，并且可用于在从种子切下后的几周或几个月 的时间里进行随后的遗传转化和再生(例如，实施例12)。切除、 灭菌、存储、水化、再脱水和转化参数的操作允许开发有效的自动 化高通量植物转化方案。也提出了再水化、引发和水化的条件。机 器切除的典型方案，可以包括将种子置于200ppm活性氯的漂白溶 液中15分钟，然后是不接触液体的2小时，随后在豆类发芽培养基 (BGM)或50ppm活性氯的漂白溶液中水化过夜。

获取和处理外植体的许多参数可以变化。在一个实施方案中， 切除方法可以是手工的；在一个替代实施方案中，通过自动化方法 进行切除。在其它实施方案中，可以通过将种子或外植体与液体灭 菌剂接触进行灭菌。将溶解在DMSO中的制霉菌素(50ppm)和噻 菌灵(10ppm)加入到共培养基(如INO)中(1.0ml DMSO/升INO) 可以改善外植体的健康，这可能是通过控制通常在种子之中和之上 发现的酵母和真菌而实现的，在进行大量和/或自动化组织培养时是 有用的手段。在一个替代的实施方案中，种子或外植体可以与气体 灭菌剂接触。在一个替代的实施方案中，种子或外植体可以与如紫 外线的照射灭菌剂接触。在一个替代的实施方案中，可以通过将种 子或外植体进行短时间高温处理来对种子或外植体灭菌，从而降低 种子或外植体表面上如外来细菌和真菌的生物污染物的活力，而不 降低种子或外植体的活力。这可以在高于40℃的温度下实现；优选 温度是40℃-90℃。例如，可以通过压力加热空气或蒸汽提高温度。 这样的温度可以由Bry-Air Inc.(Sunbury，Ohio，USA)生产的干燥机 提供。在另外一个实施方案中，切除时种子的含水量可以变化。在 另一个实施方案中，切除时种子的温度可以变化。在其它实施方案 中，切除后的存储参数可以变化。例如，在一个实施方案中，外植 体存储的相对湿度可以变化。在另一个实施方案中，外植体存储的 温度可以变化。在其它的实施方案中，外植体存储的时间长度可以 变化。在其它的实施方案中，存储外植体的培养基的组成可以变化。 可以控制的其它参数包括水化和再水化介质的组成、孵育温度、时 间长度和转化方法等。

切除后，本发明也提供了用于从非转化的损伤的外植体、子叶、种 皮和其它碎片中筛选可转化的分生组织外植体材料的方法和装置。本方 法可以手动进行，或可以是部分或完全机械化的。在某些实施方案中， 筛选过程基本上是机械化的。例如，可以根据待碾压的种子和待分 离的外植体的大小使用合适大小的筛子，进行一个或多个筛分步骤。 可以使已经通过轧辊的大量的碾压过的种子通过一系列分离筛，使 得通过大小排除法将不需要的大和小的碎片与需要的外植体分离。 这可以有效实现，例如，使用棉籽材料，使用美国标准筛子，如#8 (2.36mm孔)、#10(2.0mm孔)、#16(1.18mm孔)和合适的其它 筛子(例如，如1/16″x3/4″、1/18″x3/4″、1/19″x1/2″或1/20″x1/2″的伸长 的窗口筛)。如需要，对于给定的种子大小，可以根据待施加的材料的 大小制造具有其它孔大小的筛子。也可以调节筛选过程的时间长度和筛 选的强度，以提高该过程的通量和/或产量。

也可以使用其它筛选方法，如通过测量外植体材料相对于碎片在溶 液中不同的浮力。已发现漂浮在水溶液中的一部分材料富集完整的可转 化外植体。可以使用干切的外植体。也可以使用这些筛选方法的结合。 具有可转化外植体的材料部分可以包括分生组织和其它组织，如子叶的 部分。但是，外植体应该包含至少一些分生组织区域，使得在合适的生 长条件开始的12周之内外植体典型地能够产生芽或苗。

在某些实施方案中，可以用目标异源基因转化切下和筛选的组织。 已开发了各种将基因转移到植物组织中的方法，包括高速显微投影 (microprojection)、显微注射、电穿孔、直接DNA摄取和细菌介导的 转化。已知可介导植物细胞转化的细菌包括根瘤菌科的许多种，包括但 不限于：土壤杆菌属的种、中华根瘤菌属的种(Sinorhizobium sp.)、 中慢生根瘤菌属的种(Mesorhizobium sp.)和慢生根瘤菌属的种 (Bradyrhizobium sp.)(例如，Broothaerts等人，2005；美国专利申请公 开2007/0271627)。尽管分化的组织也已被用于短暂和稳定的植物转化， 并且在该例子中也可以使用，但是用于这种转化的靶标通常是未分化的 愈伤组织。可以在黑暗条件下或例如光照的Percival培养器的光照条件 下(例如，16小时光照/8小时黑暗的光周期，具有≥5μE的光强度，如 大约5-200μE，或其它允许正常质体发育的光照条件)，在大约23-25℃ 的温度下，且可以在高达大约35℃或40℃的温度下，进行共培养和 随后的步骤，例如2-5天。

在设计用于转化过程的载体时，选择一个或多个引入植物细胞或组 织中的遗传成分。遗传成分可以包括使用本发明的方法引入植物细胞或 组织中的任何核酸。在一个实施方案中，将遗传成分掺入如重组双链质 粒或载体分子的DNA组成中，所述重组双链质粒或载体分子包含至少 一种或多种以下类型的遗传成分：(a)在植物细胞中发挥功能导致RNA 序列产生的启动子，(b)导致编码农艺学上有用的产物的RNA序列产生 的结构DNA序列，和(c)在植物细胞中发挥功能导致多腺苷酸化的核苷 酸被添加到RNA序列的3′端的3′非翻译DNA序列。

载体可以包含许多有助于植物细胞或组织转化的遗传成分，并调节 结构核酸序列的表达。在一个优选的实施方案中，定向遗传成分以表达 mRNA，mRNA在任选的实施方案中可以翻译为蛋白质。以双链形式存 在的植物结构编码序列(基因、cDNA、合成的DNA或其它DNA)的 表达包括信使RNA(mRNA)通过RNA聚合酶从DNA的一条链转录 和随后mRNA初始转录物在核中的加工。该加工涉及将多腺苷酸化的 核苷酸添加到mRNA的3′端的3′非翻译区。制备包含需要的遗传成分的 质粒或载体的方法是本领域所熟知的。

当DNA构建体包含超过一个T-DNA时，包含在其中的这些T-DNA 和转基因可以整合到植物基因组中分别的基因座处。这称为“共转化” (美国专利5,731,179、WO 00/18939)。其中两个T-DNA位于植物基 因组中的不同的基因座因而在后代中独立地分离的共转化过程，可以通 过用携带分离的T-DNA的质粒转化的土壤杆菌的混合物递送T-DNA来 实现。共培养也可以通过用两个分别包含一个T-DNA的双运DNA构建 体转化一个土壤杆菌菌株来实现(例如，Daley等人，1998)。也可以在 一个DNA载体上设计两个T-DNA，接着将载体转化到植物细胞中，然 后鉴定已在不同的基因座处整合有T-DNA的转基因细胞或植物(美国 专利5,731,179；WO 00/18939；Komari等人，1996；美国专利7,288,694)。

双T-DNA系统是一种有用的方法，用于将转基因植物中农艺学上 重要的目标基因(GOI)与标记基因分离。在已用来对转化的植物细胞 进行选择或评分之后，标记基因一般没有进一步的用处。携带双T-DNA 的单一DNA载体是一种构建双T-DNA转化系统的方法。但是，由于两 个T-DNA在一个DNA构建体上出现，可以将二者转移到植物基因组中 相同的基因座处。当在整合过程中没有识别第一T-DNA的一个边界 DNA分子时，发生这种情况。这种降低的效率增加了产生事件和选择 在独立的基因座处整合有T-DNA的个体的成本。因此也需要DNA构建 体和一种方法，其中可以化学选择在同一基因座处已掺入两个T-DNA 的个体，同时根据每个T-DNA的存在与否和连接状况进行筛选。

通过通常称为“启动子”的DNA区域调节DNA向mRNA的转录。 启动子区域包含一种碱基序列，该碱基序列对RNA聚合酶发出信号以 结合DNA并使用一条DNA链作为模板形成RNA的相应互补链，开始 向mRNA的转录。在文献中已描述了许多在植物细胞中具有活性的启 动子。这样的启动子包括但不限于：在根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti质粒上携带的胭脂氨酸合酶(NOS)和章鱼氨酸合酶 (OCS)启动子、花椰菜花叶病毒启动子例如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S 和35S启动子、玄参花叶病毒(FMV)35S启动子和增强的CaMV 35S 启动子(e35S)。多种响应环境、激素、化学和/或发育信号而调节的 其它植物基因启动子，也可以用于植物细胞中的异源基因的表达，包括， 例如，受以下调节的启动子：(1)热(Callis等人，1988)，(2)光(例 如，豌豆RbcS-3A启动子，Kuhlemeier等人，(1989)；玉米RbcS启动子， Schaffner等人，(1991))；(3)激素，如脱落酸(Marcotte等人，1989)； (4)创伤(例如，Wuni，Siebertz等人，1989)；或其它信号或化学物质。 也已知组织特异性的表达。如下文所述，选择的特定启动子优选地应该 能够导致充分的表达，以导致有效量的目标基因产物的产生。描述这样 的启动子的例子包括但不限于：美国专利6,437,217(玉米RS81启动 子)、美国专利5,641,876(水稻肌动蛋白启动子)、美国专利6,426,446(玉 米RS324启动子)、美国专利6,429,362(玉米PR-1启动子)、美国专利 6,232,526(玉米A3启动子)、美国专利6,177,611(组成型玉米启动子)、 美国专利5,322,938、5,352,605、5,359,142和5,530,196(35S启动子)、 美国专利6,433,252(玉米L3油质蛋白启动子)、美国专利6,429,357(水 稻肌动蛋白2启动子以及水稻肌动蛋白2内含子)、美国专利5,837,848 (根特异性启动子)、美国专利6,294,714(光诱导型启动子)、美国专利 6,140,078(盐诱导型启动子)、美国专利6,252,138(病原体诱导型启动 子)、美国专利6,175,060(磷缺乏诱导型启动子)、美国专利6,635,806(γ- 薏苡醇溶蛋白(coixin)启动子)和美国专利申请09/757,089(玉米叶绿体 醛缩酶启动子)。可以使用的其它启动子有胭脂氨酸合酶(NOS)启动子 (Ebert等人，1987)、章鱼氨酸合酶(OCS)启动子(其在根癌土壤杆菌的肿 瘤诱导的质粒上携带)、花椰菜花叶病毒启动子例如花椰菜花叶病毒 (CaMV)19S启动子(Lawton等人，1987)、CaMV 35S启动子(Odell等 人，1985)、玄参花叶病毒35S-启动子(Walker等人，1987；美国专利 6,051,753、5,378,619)、蔗糖合酶启动子(Yang等人，1990)、R基因复合 体启动子(Chandler等人，1989)和叶绿素a/b结合蛋白基因启动子、PClSV (美国专利5,850,019)和AGRtu.nos(GenBank登记号V00087；Depicker 等人，1982；Bevan等人，1983)启动子。

也可以构建启动子杂交体，以增强转录活性(美国专利5,106,739)， 或结合需要的转录活性、可诱导性和组织特异性或发育特异性。在植物 中发挥功能的启动子包括但不限于：所述的可诱导的、病毒的、合成的 以及时间调节的、空间调节的和时空(spatio-temporally)调节的启动子。 组织增强的、组织特异性或发育调节的其它启动子也是本领域已知的， 并且预期可用于实践本发明。

如果需要，可以修饰本发明的DNA构建体中使用的启动子(即， 嵌合/重组植物基因)，以影响其控制特征。可以通过与操纵子区域连 接、随机或控制的诱变等获得启动子。而且，可以改变启动子以包含多 个“增强子序列”，以有助于提高基因表达。

由本发明的DNA构建体产生的mRNA也可以包含5′非翻译的前导 序列。该序列可以源自为表达基因而选择的启动子，并且可以特异性地 修饰以增加或减少mRNA的翻译。5′非翻译区也可以从病毒RNA、合 适的真核基因或合成的基因序列获得。这样的“增强子”序列可能是增 加或改变产生的mRNA的翻译效率所需要的。本发明并不限于其中非 翻译区源自伴随启动子序列的5′非翻译序列的构建体。更确切地说，非 翻译的前导序列可以源自不相关的启动子或基因(参见，例如，美国专 利5,362,865)。非翻译前导序列的例子包括玉米和矮牵牛花热休克蛋白 前导序列(美国专利5,362,865)、植物病毒外壳蛋白前导序列、植物核酮 糖二磷酸羧化酶-加氧酶前导序列、GmHsp(美国专利5,659,122)、 PhDnaK(美国专利5,362,865)、AtAnt1、TEV(Carrington和Freed，1990) 和AGRtu.nos(GenBank登记号V00087；Bevan等人，1983)。也设想其它 增强表达或影响基因的转录或翻译的遗传成分作为遗传元件。

嵌合构建体的3’非翻译区可以包含转录终止子，或具有相当功能的 元件，和在植物中发挥功能以导致向RNA的3’端增加多腺苷酸化核苷 酸的多腺苷酸化信号。该DNA序列在此被称为转录终止区。该区域是 转录的信使RNA(mRNA)的有效多腺苷酸化所需的。RNA聚合酶通过 发生多腺苷酸化的位点转录编码DNA序列。合适的3’区的例子是：(1) 包含土壤杆菌肿瘤诱导的(Ti)质粒基因如胭脂氨酸合酶(NOS；Fraley 等人，1983)基因的多腺苷酸化信号的3′转录、非翻译区，和(2)如大豆 储存蛋白基因和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基(ssRUBISCO)基因的 植物基因。优选的3′区的一个例子是来自豌豆的ssRUBISCO E9基因的 3′区(欧洲专利申请0385 962)。

在一个实施方案中，载体包含可选择的、可筛选的或可评分的标记 基因。这些遗传成分在本文也被称为功能性遗传成分，因为它们产生在 鉴定转化的植物中发挥功能的产物，或农艺学上有用的产物。作为选择 或筛选工具的DNA可以在再生的植物组织中发挥功能，以产生赋予植 物组织对另外的毒性化合物的抗性的化合物。许多可筛选或可选择的标 记基因是本领域内已知的，且可以用于本发明。用作标记的目标基因包 括但不限于：GUS、绿色荧光蛋白(GFP)、萤光素酶(LUX)等。在 某些实施方案中，载体包含编码植物细胞中壮观霉素抗性的具有结合的 调节元件的aadA基因。在一个特定的实施方案中，aadA基因包含叶绿 体转运肽(CTP)序列，其指引AadA基因产物向转化的植物细胞的叶 绿体的转运。在其它实施方案中，载体包含具有设计为在如土壤杆菌细 胞的细菌细胞中表达的合适的调节元件的壮观霉素抗性基因，使得选择 剂可以添加到共培养基中，并允许获得转基因植物，在共培养时期后， 例如，不需要进一步使用选择剂。

本发明可以使用任何合适的包含所述的可选择或可筛选的标记和 相关的调节元件以及一种或多种以足够赋予需要的特定性状的方式表 达的核酸的植物转化质粒或载体。本发明涉及的农艺学上有意义的合适 的结构基因的例子包括但不限于：耐受病虫害的基因、耐受除草剂的基 因、如下方面的质量提高的基因：如产量、营养增强、环境或应激耐受 或任何在植物生理学、生长、发育、形态学或植物产物方面希望的改变： 包括淀粉产生(美国专利6,538,181；6,538,179；6,538,178；5,750,876； 6,476,295)、改变的油的产生(美国专利6,444,876；6,426,447；6,380,462)、 高油产生(美国专利6,495,739；5,608,149；6,483,008；6,476,295)、改变的 脂肪酸含量(美国专利6,828,475；6,822,141；6,770,465；6,706,950； 6,660,849；6,596,538；6,589,767；6,537,750；6,489,461；6,459,018)、高蛋白 质产生(美国专利6,380,466)、果实成熟(美国专利5,512,466)、加强的动 物和人的营养(美国专利6,723,837；6,653,530；6,541,259；5,985,605； 6,171,640)、生物聚合物(美国专利RE37,543；6,228,623；5,958,745和美 国专利公开US20030028917)。还有环境应激耐受性(美国专利 6,072,103)、药物肽和可分泌的肽(美国专利6,812,379；6,774,283； 6,140,075；6,080,560)、改进的加工性状(美国专利6,476,295)、提高的可 消化性(美国专利6,531,648)、低水平的棉子糖(美国专利6,166,292)、工 业酶生产(美国专利5,543,576)、改进的香味(美国专利6,011,199)、固氮 (美国专利5,229,114)、杂种种子生产(美国专利5,689,041)、纤维生产(美 国专利6,576,818；6,271,443；5,981,834；5,869,720)和生物燃料生产(美国 专利5,998,700)。这些或者其它的遗传元件、方法和转基因中的任一种 可以用于本发明，本领域的技术人员基于本公开内容可以理解。

或者，通过编码经过如反义-、共抑制-介导的机制的基因沉默技术、 包括miRNA的RNAi技术导致内源基因表达的靶向抑制的RNA分子， 目标DNA序列可以影响这些表型(例如，美国专利申请公开 2006/0200878)。

可以通过本发明包括的方法引入的示例性的核酸包括，例如，来自 另一物种的DNA序列或基因，或来源于或存在于同一物种中、但通过 遗传工程方法而非传统的生殖或育种技术掺接受细胞中的序列或基因。 但是，术语“外源的”也指正常情况下不存在于所转化的细胞中的基因， 或也许只是不以在转化DNA区段或基因中发现的形式、结构等存在的 基因，或通常存在，但是人们希望例如过度表达的基因。因此，术语“外 源的”基因或DNA指任何引入接受细胞中的基因或DNA片段，无论 类似的基因是否已经存在于这种细胞中。外源DNA包括的DNA的类 型可包括：已在植物细胞中存在的DNA、来自另一种植物的DNA、来 自不同的生物体的DNA或外部产生的DNA，如含有基因的反义信息的 DNA序列、或编码合成或修饰形式的基因的DNA序列。

在一个实施方案中，通过细菌介导的方法，如土壤杆菌或其它根瘤 菌介导的方法，进行植物组织的转化，且目标DNA序列存在于一个或 多个T-DNA上(美国专利6,265,638，5,731,179；美国专利中请公开 US2005/0183170；2003110532)或存在于转移到植物细胞中的其它序列 (例如，载体骨架)上。T-DNA可以通过RB和/或LB序列结合，或可 以没有边界序列。可以转移到植物细胞中的序列可以存在于在用于转化 的细菌菌株中的一个转化载体上。在另一个实施方案中，序列可以存在 于在细菌菌株中的不同的转化载体上。在另外的一个实施方案中，序列 可以存在于一起用于转化的不同的细菌细胞或菌株上。

在本发明方法中用于转化的DNA构建体也可以包含在细菌细胞中 提供复制功能和抗生素选择的质粒骨架DNA区段，例如，如ori322的 大肠杆菌复制起点、如oriV或oriRi的宽宿主范围复制起点和如 Spec/Strp的编码赋予壮观霉素和链霉素抗性的氨基糖苷腺苷酰转移 酶(aadA)的可选择标记的编码区(例如，美国专利5,217,902；或 Sandvang，1999)。对于植物转化，宿主细菌菌株通常是携带具有转移 表达单位的功能的质粒的根癌土壤杆菌ABI、C58、LBA4404、EHA101 或EHA105。植物转化领域的技术人员已知的其它菌株可以在本发明中 发挥功能。

细菌介导的基因递送(例如，土壤杆菌介导的；美国专利 5,563,055、5,591,616、5,693,512、5,824,877、5,981,840)可以向从 种子上切下的胚的活分生组织中的细胞内进行(例如，美国专利 6,384,301)，且可以在如壮观霉素的选择剂的存在下培养该分生组织 区域。这一步骤的结果是尚未导入外源遗传结构的大部分细胞的生 长终止或至少生长延迟，同时由单一的转化的分生细胞或包含转化 的分生细胞在内的一小簇细胞形成了苗。在特定的实施方案中，分生 组织也可以在壮观霉素、链霉素或其它选择剂的存在下培养，由aadA 基因编码对于上述选择剂的耐受性。Miki和McHugh，2004中公开了 各种选择性标记和提供对它们的抗性的基因的例子。

根据本公开内容，许多其它可能的调节元件和其它目标序列对 于本领域的技术人员是显而易见的。因此，上述讨论是示例性的而 非穷举的。

可以采用可筛选或可评分的标记，以鉴定转基因部分和/或植物。 示例性的标记是已知的，且包括编码各种发色底物的酶的β-葡糖醛酸糖 苷酶(GUS)(Jefferson等人，1987a；Jefferson等人，1987b)；R-基因座 基因，其编码调节在植物组织中产生花青素色素(红色)的产物 (Dellaporta等人，1988)；β-内酰胺酶基因(Sutcliffe等人，1978)；编 码已知其各种发色底物的酶的基因(例如，PADAC，一种发色头孢菌 素)；萤光素酶基因(Ow等人，1986)；xylE基因(Zukowsky等人，1983)， 其编码可以转化发色儿茶酚的儿茶酚双加氧酶；α-淀粉酶基因(Ikatu 等人，1990)；酪氨酸酶基因(Katz等人，1983)，其编码能够将酪氨酸 氧化为多巴和多巴醌、其然后缩合为黑色素的酶；绿色荧光蛋白(Elliot 等人，1999)和α-半乳糖苷酶。本领域的技术人员熟知，可以使用其它 的植物转化方法，例如，Miki等人，(1993)所述，包括使用微粒轰击法 (例如，美国专利5,914,451；McCabe等人，1991；美国专利5,015,580、 5,550,318、5,538,880)。

已知多种组织培养基，当适当补充时，它们支持植物组织的生 长和发育，包括从切下的分生组织形成成熟植物。这些组织培养基 可以作为商业制剂购买，或者可以由本领域的技术人员定制和修改。 这样的培养基的例子包括但不限于下面文献中所述的那些： Murashige和Skoog，(1962)；Chu等人，(1975)；Linsmaier和Skoog， (1965)；Uchimiya和Murashige，(1962)；Gamborg等人，(1968)；Duncan 等人，(1985)；McCown和Lloyd，(1981)；Nitsch和Nitsch，(1969)；以及 Schenk和Hildebrandt，(1972)，或者相应补充的这些培养基的衍生产 品。本领域的技术人员知道，培养基和培养基补充物，如用于转化 和再生的营养物和生长调节剂，通常为了特定的目标农作物或感兴 趣的品种而进行优化。可以用例如但不限于葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、 甘露糖、果糖、乳糖、半乳糖和/或右旋糖的碳水化合物或一定比例 的多种碳水化合物补充组织培养基。试剂可以商业获得，且可以从 多个供应商购买(参见，例如，Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo和 Phytotechnology Laboratories，Shawnee Mission，KS)。

可以通过本文公开的方法和组合物从转化的植物细胞再生转基因 植物，例如但不限于，壮观霉素方案“A”至“D”，如同对大豆、玉米、棉 花或油菜进行的方案。使用土壤杆菌转化方法形成的转基因植物典型地 (尽管不总是)包含一个插入一个染色体中的简单的重组DNA序列， 且被称为转基因事件。这样的转基因植物由于插入的外源性序列而可以 被称为是杂合的。通过包含单一外源性基因序列的独立的分离的转基因 植物与其本身(例如R0植物)有性繁殖(自交)，以产生R1种子， 可以获得对于转基因而言为纯合的转基因植物。1/4的产生的R1种子对 于转基因而言是纯合的。R1种子发芽产生植物，可以测试该植物的接合 性，典型地使用允许区分杂合子和纯合子的SNP试验或热扩增试验 (即，接合性测试)。

为了证实外源DNA或者“转基因”在转基因植物中的存在，可以 进行多种试验。这些试验包括，例如，“分子生物学”试验，如DNA 印迹法和RNA印迹法和PCRTM、INVADER试验；“生物化学”试验， 如检测蛋白质产物的存在，例如，通过免疫学方法(ELISA和蛋白质印 迹法)或者通过酶功能；植物部分试验，如叶或者根试验；以及，通过 分析整个再生植物的表型。

一旦转基因被导入植物中，就可以通过杂交将该基因导入到任何与 该第一植物性相容的植物中，而根本不需要直接转化第二植物。因此， 本文中使用的术语“后代”指的是按照本发明制备的亲本植株的任何一 代后代，其中，该后代包含选择的DNA构建体。因此，“转基因植物” 可以是任何一代。“杂交”一种植物以提供相对于初始植物系具有一个 或者多个添加的转基因或等位基因的植物系，被定义为通过将初始系与 包含转基因或等位基因的供体植物系杂交从而导致特定的序列被导入 植物系中的技术。为了实现这一点，例如，可以进行如下步骤：(a)种 植第一(初始系)和第二(包含需要的转基因或等位基因的供体植物系) 亲本植株的种子；(b)将第一和第二亲本植株的种子培育成有花的植物； (c)用第二亲本植物的花粉对第一亲本植物的花授粉；和(d)收获 具有已受精的花的亲本植物上产生的种子。

本发明也提供了通过本发明的方法产生的植物部分或植物。植物部 分包括但不限于：果实、种子、胚乳、胚珠、花粉、叶、茎和根。在一 个优选的实施方案中，植物部分是种子。

另一方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含编码包括叶 绿体转运肽(CTP)-aadA翻译融合的多肽的序列。在某些实施方案中， 该核酸包含SEQ ID NO：2。

实施例

本领域的技术人员可以理解本发明提供的方法和组合物的许多 优点。本文包括下面的实施例来证明本发明的优选的实施方案。本 领域的技术人员应该理解，下面的实施例中公开的技术代表了本发 明人发现的在实践本发明中运用良好的技术，因此可以被认为构成 实践本发明的优选方式。然而，本领域的技术人员根据本公开内容 应该理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对公开的 具体实施方案进行许多改变，而仍然获得相同或类似的结果。本文 引入在此引用的全部参考文献作为参考，以补充、解释、提供背景 或教导在此使用的方法、技术或组合物。

实施例1

外植体和接种材料的制备

A.大豆

为了获得分生组织外植体材料，处理大豆种子(例如，cv.A3525； Asgrow Seed Company)以从包括种皮和子叶的其它组织中分离出包含 分生组织的胚。外植体的手工制备提供了适于大豆分生组织的土壤杆菌 介导的转化的组织(美国专利6,384,301)，且微粒介导的转化方法 是已知的(美国专利5,914,451)。在美国专利申请公开20050005321 和美国专利申请公开20060059589中也描述了提取外植体的机械方法。 所有这些方法都产生可以通过所述方法充分转化的分生组织外植体。

B.棉花

机械处理棉花种子以切除并分离其分生组织。或者，可以通过从种 子、子叶和下胚轴上切除胚轴制备棉花外植体(例如，McCabe和 Martinell，1993)。为了获得可转化的分生组织外植体材料，如下处理棉 花种子(例如，来自基因型STN474(Stoneville Pedigreed Seed Co.， Stoneville，MS)、Delta Pearl(Delta and Pine Land Co.，Scott，MS)、 DP5415、DP393、00S04(Delta and Pine Land Co.)、SureGrow501或 SureGrow747(Sure Grow Cotton Seed Company，Maricopa，AZ))，以从 种皮和子叶中分离出包含分生组织的胚。从4℃或-20℃的存储中取出 棉花种子，并使其达到室温。称重种子，置于无菌的发芽单元中，并在 50％Clorox(次氯化钠)中表面消毒5分钟。然后用无菌蒸馏水清洗种 子3次，并在液体水化培养基(CSM)中在28℃下、在黑暗中水化大 约18小时(范围是14-42小时)。或者，发芽温度可以更低，例如是 大约23℃。CSM培养基含有200mg/L羧苄青霉素(PhyoTechnology Laboratories，Shawnee Mission，KS)、125mg/L头孢噻肟(Midwest Scientific，St.Louis，MO)、30mg/L BRAVO 75(Carlin，Milwaukee，WI) 和30mg/L克菌丹50(Carlin)。其它溶液也已经成功地用于水化棉花 种子，包括无菌的去离子水或含有低浓度的漂白剂、典型地含有50-1000 ppm的次氯化钠的水。水化后，种子可以立即使用，或者在进一步处理 之前在冷藏温度下存储长达一周。也可以机械切除棉花外植体 (WO92/15675；Keller等人，1997；McCabe和Martinell，1993；美国专利 公开2005/0005321)。

C.用于接种和共培养的土壤杆菌的制备

将含有具有一个或两个上述植物表达盒的双运载体的土壤杆菌菌 株C58从甘油储备液接种到含有75mg/mL的壮观霉素和50mg/mL的 卡那霉素的液体LB培养基(10g/L氯化钠、5g/L酵母提取物和10g/L 细菌用胰蛋白胨)中。允许液体培养物在28℃、以200rpm的转速在 旋转振动器中过夜生长。在过夜培养物的光密度(OD660)达到0.4-1.2 的目标范围之后，以3500rpm的速度离心细菌培养物大约20-25分钟， 以沉淀细胞。

在除去上清液之后，在10mL的接种培养基(INO，表1)中再悬 浮沉淀物。测量OD660(细菌浓度的间接测量)并稀释、调整至OD660 为大约0.28-0.32。一旦制备好土壤杆菌培养物，将植物外植体暴露于 接种物，短暂暴露于来自如L&R Ultrasonics QS140(L&R Manufacturing Co.，Kearny，NJ)或Honda W113超声仪(Honda，Denshi Japan)的标 准实验室水浴清洗超声仪的超声波能量，根据外植体的类型，进行 20秒到2分钟。短暂超声处理步骤之后，排出外植体的初始接种物， 并将外植体转移到各含有5ml的INO培养基和一张滤纸的新鲜的 PLANTCONs中，通常在转染开始后的数小时之内。然后在大约23-28℃ 下在光照室内(一般是≥5uE的光照16小时)培养外植体1-5天。一系 列的短暂GUS表达研究表明0.3-0.8的接种OD660产生相对较高比例的 分生组织转化和转基因表达。尽管更低和更高的OD660测量值也产生成 功的实验结果。

表1.接种培养基的组成。

 成分   量/升  硫酸镁(Fisher M63)   0.1g  硫酸铵(Fisher A702)   53.6mg  一水合磷酸钠(Fisher S369-500)   60mg  氯化钙(Sigma C-3881)   60mg  硼酸(Fisher A73-3)   0.3mg  硫酸锰(Sigma I-2550)   1mg  七水合硫酸锌(Sigma Z-1001)   0.2mg  碘化钾(Sigma P-8166)   0.075mg

  二水合钼酸钠(Sigma S-6646)   0.025mg   硫酸铜(Fisher C493-500)   2.5μg   六水合氯化钴(Sigma C-2911)   2.5μg   维尔烯(Sequestrene)(Ciba 964603)   2.8mg   硝酸钾(Sigma P-8291)   1g   葡萄糖(Phytotech G386)   30g   MES(Sigma M8250)   3.9g   用去离子蒸馏水使体积为1L   用KOH调节pH至   5.4   高压灭菌   加入含有以下成分的灭菌维生素储备液   肌醇(Sigma I-3011)   10mg   烟酸(Sigma N-0765)   0.1mg   盐酸吡哆醇(Sigma P-8666)   0.1mg   盐酸硫胺素(Sigma T-3902)   1mg

实施例2

大豆外植体的转化-细胞分裂素处理

对于大豆的土壤杆菌介导的转化，制备具有双运载体的菌株ABI (C58)的接种物，该载体如含有gus标记基因和赋予壮观霉素抗性的 aadA基因的pMON96999，含有CP4 EPSPS和GUS基因的 pMON101343，或含有gfp标记基因和赋予草甘膦耐受性的编码CP4 EPSPS的基因的pMON77404，或含有gfp标记基因和赋予麦草畏耐受 性的DMO基因的pMON73737。

pMON96999(图2)含有受增强的CaMV35S启动子(美国专利 5,322,938；5,352,605；5,359,142和5,530,1960)、35S前导序列和来自根 癌土壤杆菌的胭脂氨酸合酶基因3’非翻译区(Genbank登记号E01312) 控制的uidA基因，和赋予壮观霉素抗性的靶向核的aadA基因(美国专 利5,217,902；(SEQ ID NO：1))。aadA腺苷酰转移酶基因产物通过拟南 芥EPSPS的叶绿体转运肽靶向叶绿体(ShkG-CTP2Klee等人，1987.)， 且受拟南芥延伸因子EF-1α的启动子(Tsf1；美国专利申请20050022261) 与豌豆rbcS2的FMV-35S增强子、Tsf1前导序列(外显子1)、Tsf1 内含子和3’非翻译区的控制。

在接种/共培养过程中以及之后，测试以几种浓度加入的细胞分裂 素、噻苯隆(TDZ)或BAP。接种后，在大约23℃、在Percival孵化 器中以16小时光照/8小时黑暗的光周期(光强度≥5μE)进行共培养大 约2-5天(例如，3天)。这样，测试外植体对于细胞分裂素的响应， 并评估不同处理对于多种苗诱导和转基因事件产生的效应。

A.使用草甘膦或麦草畏作为选择剂的细胞分裂素处理的效应

对于接种和共培养过程中的TDZ处理，用具有pMON77404(含有 编码CP4EPSPS和GFP的基因)或pMON101343(含有CP4EPSPS和 GUS)的土壤杆菌菌株ABI接种大豆外植体，并与补充有不同水平的 细胞分裂素的接种物共培养3天。共培养后，将外植体转移到选择培养 基(WPM；表2)中，该培养基含有各为200mg/L的羧苄青霉素和头 孢噻肟，含有100mg/L的特美汀(Timentin)以抑制土壤杆菌和其它污 染物的生长，和用于选择的75μM草甘膦或0.01mg/L麦草畏。大约 23-30天之后，合适的话，在装配有检测表达GFP的组织的滤光器套件 的显微镜下检查外植体，或检查GUS表达。如表3所示，相比未处理 的外植体，更多的用TDZ处理的外植体已发育出表达GFP的芽或幼苗。 这种效应是浓度相关的。在这种情况下，所用的可选择标记赋予对草甘 膦的耐受性。

表2.用于使用草甘膦选择的大豆转化的WPM的组成；对于麦草畏选 择，用0.01mg/L的麦草畏代替草甘膦。

  成分   量/升   具有维生素的LM WPM(Phytotech L449)   2.41g   蔗糖(Phytotech S391)   20g   葡萄糖酸钙(Sigma G-4625)   1.29g   具有或不具有Clearys 3336WP(Carlin 10-032)   0.03g   琼脂凝胶(AGARGEL)(Sigma A-3301)   4g   加水到   1L   pH   5.6   高压灭菌

  羧苄青霉素(Phytotech C346)(40mg/mL)   5mL   头孢噻肟(Midwest NDC0039-0019-10)(50mg/mL)   4mL   特美汀(100mg/ml)(Duchefa T0190)   1ml   草甘膦(0.5M)   3mL

表3.在大豆转化中使用草甘膦选择，在接种和共培养过程中的TDZ 处理对转基因(GFP阳性)芽/苗发育的效应。

  实验-   处理   接种和共培养培   养基中的TDZ水   平(mg/L)   检查的   外植体   数   具有GFP+   芽/苗1的外   植体数   频率   1033-1   1033-2   1033-3   1033-4   1033-5   1033-6   0   0.5   1.0   1.5   2.0   3.0   200   200   200   200   200   200   27   36   48   50   60   64   13.5％   18％   24％   25％   30％   32％

在接种和共培养后，例如，在组织培养的“延迟”或选择期，当使用 TDZ处理大豆外植体时，观察到类似的结果。

但是，如表4所示，另外的实验表明相对于在缺乏TDZ的情况下 获得的数量，用草甘膦作为选择剂，TDZ的使用(例如，在接种/共培 养的过程中)导致转化的生根的大豆苗的数量减少。

表4.比较接种/共培养培养基中的不同TDZ水平的草甘膦选择实验的 转化结果。

也使用编码对于另一种选择剂麦草畏的耐受性的DNA构建体，评 估细胞分裂素处理对于转化率的效应。使用编码GFP和DMO基因的 pMON73737。在共培养后，如表5所示，使用或不使用BAP或TDZ， 在含有0.01mg/L麦草畏的培养基上培养外植体4天。在早期，如接种 后的24天(“DAI”，表5)，用BAP或TDZ的处理导致显示GFP阳性 的芽的外植体数量增加。

表5.在使用麦草畏选择的大豆转化中，共培养后用BAP和TDZ处理 4天对转基因(GFP阳性)芽发育的效应。

  实验-处理   用BAP或TDZ预   处理(4天)   检查的外植体数   (24DAI)   具有GFP+芽的   外植体数(％)   906-1   906-2   906-3   906-4   906-5   没有预处理   1mg/L BAP   2mg/L BAP   1mg/L TDZ   2mg/L TDZ   284   325   336   387   383   6(2.1％)   12(3.7％)   11(3.3％)   71(18.3％)   53(13.8％)

如在各种实验中所观察到的，用TDZ处理的外植体没有显示强的 顶端优势，且产生较多的苗(重新的多个苗)。相反地，未处理的外植 体显示更多的初始苗的生长(顶端优势的结果)，且产生较少的苗。那 些苗也同样地从腋芽发育。因此，得到的转化率低于TDZ处理的外植 体。但是，由经受了在含有草甘膦或麦草畏的培养基上选择的大豆外植 体的转化而产生的苗的生长(例如，伸长)延迟。使用草甘膦选择，从 接种到随后的转化R1种子收获的时间是大约7个月，而转化的生根的 苗的发育时间是大约10-12周。加入细胞分裂素(BAP或TDZ)，用麦 草畏选择，对于获得的最终转化率(TF)没有明显的影响，尽管如表5 所示，它导致在早期产生更多的GFP阳性的芽。

B.使用壮观霉素作为选择剂，细胞分裂素处理的效应

在接种培养基(表1)中，通过超声处理20秒，用土壤杆菌接种外 植体，接着如实施例1所述，在与接种培养基相同的共培养基上培养。 用2mg/L的TDZ补充接种和共培养培养基。在大约23℃下，以16小 时光照/8小时黑暗的光周期共培养外植体4天。共培养后，将除了不是 用琼脂凝胶固化且缺乏选择剂(草甘膦、麦草畏或壮观霉素)之外与表 2所示的WPM培养基相同的12ml液体延迟培养基，加到含有外植体 的各个PLANTCONTM(MP Biomedicals，Solon，OH)中。外植体在延迟培 养基中培养4天(28℃，16小时光照/8小时黑暗的光周期)。为了选 择和苗诱导，转移外植体到同样的液体培养基，但其中加入了不同水平 的壮观霉素(25-250mg/L的壮观霉素)。将外植体单个地移植到 PLANTCON容器中的泡沫海绵的裂缝中。每个容器含有60ml培养基 和一片承载大约25个外植体的泡沫海绵。

在所有处理中，外植体发育出多个芽和苗。在不同的阶段，收集外 植体的样品和产生的组织，并分析其GUS活性。当在壮观霉素的存在 下选择用aadA基因和GUS(在pMON96999上；图2)转化的外植体 组织时，在接种后大约3周，在大量TDZ处理的外植体上，观察明显 绿色的(壮观霉素耐受的)和漂白的(壮观霉素敏感的)芽和苗，以及 GUS阳性的组织(表8)。在2周内，在选择培养基上，最多达80％ 的外植体发育出GUS阳性的芽和苗(接种后大约3周，即，大约22DAI； 表8-9)。

表6.每升土壤杆菌共培养培养基1595的组成。

也进行了一项研究，以评估通过促进多苗发育，用细胞分裂素BAP 的处理是否也提高使用壮观霉素选择的大豆转化的转化率。接种大豆外 植体，并与携带pMON96999的土壤杆菌共培养(图2)。用0、1、2、 3、4或5mg/L BAP补充接种和共培养培养基。共培养3天后，在延迟 培养基(缺乏选择的接种培养基)中培养外植体4天。如表7所示，对 于每种处理，也用同样水平的BAP补充延迟培养基。然后转移外植体 到用于苗的诱导和选择的选择培养基(与延迟培养基相同，但含有150 mg/L的壮观霉素)上。在没有BAP的处理中的外植体显示更强的顶端 优势，具有更伸长的初生苗。

为了确定在没有BAP处理的情况下，多少外植体可以发育为转化 的苗，在接种后42天，分析外植体组织的GUS活性。大约18％的外 植体具有GUS+芽或小苗(表7)。它们中的大部分是腋生的，且其中 一些显然是嵌生的。用BAP处理的外植体具有少得多的或没有伸长的 初生苗和更多的新生苗。许多苗在选择培养基上伸长，收获它们，如方 案“A”所述，在也含有150mg/L壮观霉素的接种培养基上诱导根。根据 生根的苗的数量确定转化率(TF)，在表7中示出。由于在没有用BAP 处理的外植体中只有18％的外植体显示GUS+芽或苗，如果外植体没有 为了GUS分析而损失，预期TF比18％低得多，因为并非全部的GUS+ 芽/苗持续地发育最终成为植物。因此，该数据强烈地提示BAP处理通 过抑制顶端优势并促进多苗发育而提高TF。

表7.在共培养过程中和共培养后延迟阶段的BAP处理的效应。

  实验-处   理编号  共培养和共  培养后4天的  延迟培养基  中的BAP  (mg/L)   剩余的   外植体   数   产生GUS+腋   生芽/苗的外   植体数   (42DAI)   生根的   植物2数   ％TF   1118-11   0   352   65(18.5％)   n/a   n/a   1118-2   1   395   n/a   103   26.1   1118-3   2   347   n/a   94   27.1   1118-4   3   350   n/a   87   24.9   1118-5   4   435   n/a   132   30.3   1118-6   5   436   n/a   116   26.6

1.在接种后42天，分析该处理中的全部外植体的GUS活性。

2.在含有150mg/L的壮观霉素的培养基中生根。

表8.在接种和共培养过程中用不同水平的TDZ处理对GUS阳性芽的 发育的效应。

  用于接种和共   培养的TDZ水   平   分析GUS   的外植体   数   具有GUS+芽的   外植体数   (13DAI)   具有GUS+芽   的外植体％   (13DAI)   0.5mg/L   1.0mg/L   2.0mg/L   96   96   96   18   34   48   18.8   35.4   50.0

表9.在含有不同水平的壮观霉素的培养基上培养的、发育出表达GUS 的芽和苗的外植体的百分比。

  实验-处   理   所用的壮观   霉素水平   分析的外植   体数  具有GUS+苗/芽  的外植体数   ％   1102-1   1102-2   1102-3   1102-4   1102-5   1102-6   25   50   100   150   200   250   25   25   25   25   25   25   13   18   19   18   20   20   52   72   76   72   80   80

也发现各种水平的TDZ可以有效地促进GUS阳性芽的发育。与使 用草甘膦或麦草畏作为选择剂进行的研究相反，绿色的耐受壮观霉素的 苗良好地伸长，且在接种后6周可以进行苗的收获。尽管有一些产生多 于一个的苗，但是大部分培养的外植体材料一次产生一个伸长的苗。从 每个转化的外植体收获一个伸长的苗。在接种后大约9周停止苗收获， 尽管其它的外植体产生甚至更多的伸长的苗。苗在根诱导培养基(BRM) 中生根。该培养基包含1/2强度的MS盐、MS维生素、100mg/l的肌醇、 100mg/l的半胱氨酸、30mg/l的蔗糖和100mg/l的替卡西林(ticarcillin)， 且用8g/l的洗过的琼脂固化，也补充150mg/L的壮观霉素和0.1mg/L 的IAA或0.25mg/L IBA作为生根激素。使用0-250ppm的壮观霉素， 在某些研究中高达1000ppm。如表10所示，在第一项研究中，平均转 化率是18.6％，范围是12.6-26.1％，相对于在利用草甘膦作为选择剂的 比较实验中可见的大约2％的转化率，具有明显增加。后一研究证实了 该结果(表10)。使用宽范围的壮观霉素浓度(25-250mg/L，最高达 1000mg/L)发现了这样高的转化率，在后面的研究中典型地使用150 mg/L的壮观霉素。另外，在待证实转化的测试的前32个植物中，后来 证明有31个植物被转化，只有一个“漏掉”。

表10.使用壮观霉素选择的转化率。

1尽管一些外植体产生多个苗，但从每个外植体只收获一个苗。由于苗 伸长不是均匀的，在接种后9周停止苗收获，尽管后来可以收获更多的苗。

“SF”＝出苗率；“TF”＝转化率

使用壮观霉素选择，从接种到转化的生根的苗发育的时间是大约8 周，到随后的转化的R1种子收获的时间典型地＜6个月。

实施例3

使用壮观霉素选择的快速有效的大豆转化和培养方案的开发和比较

为了提高使用壮观霉素选择、包括用细胞分裂素处理的大豆转化的 速度和效率，将几种应用壮观霉素选择的方案彼此进行比较，并且与以 前采用的使用草甘膦作为选择剂的方法进行比较。表11和图3-5概述 了所用的方案和获得的结果。如指出的，与草甘膦选择方案相比，壮观 霉素选择方案证明有高转化率和较短的完成每种方案所需的时间(从接 种到下一代种子)。另外的益处包括简单、减少人类工程学影响和植物 处理流水线化，导致较低的成本。

提高的获得转基因植物的频率(相比草甘膦或麦草畏选择，有效性 约＞10X)，通过转化例如ROUNDUP种质，接着选择第二目 标基因的不含标记的分离子，能够实现有效的2T-DNA转化系统和叠 加性状的方法。因为许多大豆繁殖系本身是草甘膦耐受性的，将另外的 性状递送到这样的遗传背景中为性状整合提供了明显的优势。

表12-13表明使用方案C或D获得的转化率。

表12.使用壮观霉素选择方案“C”的大豆转化率。

  实验-处   理   构建体   (pMON)   外植体   数   移至塞子   的外植体   数   移至塞子   的外植体   的百分比   移出的植   物数   ％TF   1207-2   96999(1T)   227   144   63.4   70   30.8   1207-4   96999(1T)   129   89   69.0   47   36.4   1208-3   96999(1T)   127   83   65.4   30   23.6   1208-6   96999(1T)   192   137   71.4   46   24.0   1216-1   96999(1T)   273   166   60.8   83   30.4   1216-2   96999(1T)   97   70   72.2   54   55.7   总计   1045   689   65.9   330   31.6   1223-1   107379(2T；   OriRi)   293   188   64.2   82   28.0   1223-2   107379(2T；   OriRi)   292   167   57.2   65   22.3   1223-3   107379(2T；   OriRi)   254   165   65.0   71   28.0   1223-4   107379(2T；   OriRi)   275   191   69.5   72   26.2   总计   1114   711   63.8   290   26.0

表13.使用壮观霉素选择方案“D”的大豆转化率。

  实验-   处理  构建体  (pMON)   外植体数   移至塞子的   外植体数   移至塞子   的外植体   的百分比   移至出的植   物数   ％TF   1224-1  107379(2T；  OriRi)   338   208   61.5   74   21.9   1224-2  107379(2T；  OriRi)   234   140   59.8   50   21.4   1225-1  107379(2T；  OriRi)   235   173   73.6   60   25.5   1225-2  107379(2T；  OriRi)   253   178   70.4   65   25.7   1226-1  107379(2T；   205   139   67.8   49   23.9

 OriRi)   1226-2  107379(2T；  OriRi)   201   131   65.2   45   22.4   总计   1466   969   66.1   343   23.4   1244-1  107380(2T；  OriV)   264   154   58.3   61   23.1   1244-2  107380(2T；  OriV)   205   124   60.5   50   24.4   1254-1  107380(2T；  OriV)   283   232   82.0   111   39.2   1254-2  107380(2T；  OriV)   267   213   79.8   88   33.0   1255-1  107380(2T；  OriV)   202   136   67.3   47   23.3   1255-2  107380(2T；  OriV)   295   198   67.1   94   31.9   总计   1516   1057   69.7   451   29.7

实施例4

转化率和事件质量的比较

如表14所示，针对大豆转化质量，将几种上述的壮观霉素转化方 案互相进行比较，并与草甘膦选择方案进行比较。在下面的表中，“TF” 指每批数量的外植体产生的事件的数量；“qTF”指每批数量的外植体的 质量事件的数量，其中，质量事件定义为包含一个拷贝的目标基因并缺 乏骨架(载体序列)的事件；且“MF TF”指每批数量的受到转化的外植 体中，不与标记连锁、且缺乏载体骨架序列、具有一个拷贝的目标基因 的事件的数量。

表14.转化质量的评估。

  方案和载   体类型   测试的   外植体   数   产生的   事件数   TF   (％)   +/-s.e   分析的   事件数   质量   事件   ％   qTF   ％   评估   的   MF   TF％   壮观霉素   方案A-1T；   41786   8154   19.5-   (0.89)   828   19.1   3.7   (0.67)   n/a

  OriV   壮观霉素   方案C-1T；   OriV   1045   330   31.6   (4.85)   393*   20.9   6.6   (1.09)   n/a   壮观霉素   方案C-2T；   OriRi   1114   290   26   (1.34)   286   23.8   6.2   (0.37)   1.8   壮观霉素   方案D-2T；   OriV   1516   451   29.7   (2.69)   433   20.3   6.0   (0.96)   1.4   壮观霉素   方案D-2T；   OriRi   1466   343   23.4   (0.76)   326   24.2   5.7   (0.29)   1.7   CP4方案-   2T；OriV   21351   589   2.76   (0.23)   529   29.9   0.74   (0.08)   0.18   CP4方案-   2T；OriRi   21651   360   1.66   (0.19)   299   38.8   0.54   (0.08)   0.24

*并非所有的事件都包括在计算TF中。

表14中用于评估MF TF值的非连锁率(non-linkage rate)基于通 过表15中的数据评估的非连锁率。可以发现：相比草甘膦选择方案， 在获得的“质量事件”的数量方面，某些壮观霉素转化方案(“C”、“D”) 产生高达10倍的增加，而方案“A”也在TF和qTF方面显示明显的增加。 当使用方案“A”、“C”或“D”中的任一种时，根据R1未成熟大豆胚中的 GUS表达，证实超过92％的事件为种系-转化的。这种“漏掉”率与草 甘膦选择方案中观察到的相当。也发现R0植物正常生长且良好地结出 种子(R1代)，使用方案A-D中的任一种，来自转化的大豆植物的每 个植物平均产生几乎200粒种子。

表15.非连锁率的评估。

  选择和骨架类型   分析的植物数   获得的非连锁率   壮观霉素OriV   122   ～23％   壮观霉素OriRi   157   ～29％   CP4OriV   55   ～24％   CP4OriRi   62   ～44％

实施例5

用于干切的大豆外植体的壮观霉素转化系统的开发

使用壮观霉素选择方法转化如下制备的干切的大豆外植体：

1)干的活种子(适当存储的高质量大豆种子包含大约10-12％ 的内部含水量)用无菌水或次氯酸钠溶液(从0ppm到～30,000ppm 的活性氯，包括50ppm-200ppm的活性氯)冲洗3-20分钟。然后排 出液体。这个过程提高内部含水量到大约16％。在此简短的表面清 洗步骤之后，在商业种子干燥器中用除湿空气流(温度控制到大约 60-90°F)降低种子的内部含水量到低于8％(一般优选4-6％)。 这一干燥步骤维持种子活力，但为了便于加工，松弛纸质种皮(种 子外层)。这种降低了含水量的种子也明显更脆。利用这种脆性在 脱壳机中适当地分裂种子，从而最大化回收具有活性完整的分生组 织的高质量外植体。这样制备的种子可以存储相当长的时期(在合 适的条件下为2年或更长)，或者直接用于进一步的处理。

2)可以分裂适当制备的干燥大豆种子，且使用多种机器回收活分 生组织外植体。一种成功使用的机器是Grainman Rice Sheller(64型)。 然后可以进一步处理在该机器中分裂的种子，以在用合适大小的筛子改 进的Clipper-Cleaner中回收需要的具有分生组织的外植体。在这种快速 且柔和的过程中回收的外植体可以直接用于转化，或存储直至需要。在 存储过程中典型的温度条件范围是从室温到-80℃。

3)在需要的存储之后，再水化外植体用于转化。用于这一步骤的 培养基的类型可以变化，且包括“豆类发芽培养基”(BGM；培养基 表16)、大豆接种培养基(INO；表1)和制备的对数期土壤杆菌生长 培养物(AGRO)。在Lysogeny Broth(LB，通常也称为Luria-Bertani Broth) 中过夜培育土壤杆菌生长培养物至对数期，然后离心并再悬浮至660nm 处的最终光密度为0.25-0.6。用于稀释的培养基与大豆接种培养基相同。 再水化温度和持续时间也可以不同，某些实验中将外植体在4℃下 浸泡于这些溶液中的一种中过夜。在接触相应水化培养基的持续时 间、接触过程中的温度和相应培养基的饱和程度方面进行其它变化。 测试的接触时间为0-24小时。较长的接触时间(超过4小时)中的 温度为室温(～26℃)、23℃或4℃。4小时或少于4小时的接触 时间都在室温下测试。作为在水化过程中用液体培养基完全浸没或 基本上饱和外植体的替代，一些处理使用湿润的滤纸(有足够的液 体湿润，但没有饱和)。这用以BGM或者土壤杆菌培养基润湿的滤 纸来完成。再水化在多种容器中进行，包括但不限于锥形离心管、 刻度玻璃瓶或者PLANTCON组织培养容器(MP Biomedicals，Irvine， CA)。

再水化后，在如其它实施例所述的合适的土壤杆菌培养物的存 在下，对外植体进行简短的超声处理。共培养在光照Percival中、在 大约23-25℃的温度下一般进行2-5天(16小时光照，8小时黑暗， 光强度为≥5μE)。在再水化、共培养步骤过程中和/或共培养后，以 15毫克/升-1000毫克/升的浓度应用作为选择剂的壮观霉素。常规回 收表型阳性的苗(植物)(参见表17所示)。

表16.用于大豆发芽的培养基。

如表17所示，根据所用的方案，在几个实验中获得20-25％的转化 率，且常规获得超过10％的转化率。

表17.干切的大豆外植体的转化率(TF)。

  实验-处理编号   外植体数   事件数   TF％   1095   138   5   3.6   1109   455   23   5.1   1141-1   543   136   25   1141-2   541   67   12.4   1169-1   192   37   19.3   1260   281   57   20.3   1261   770   154   20   1263-1   235   14   6   1262-2   59   11   18.6   1263-2   159   21   13.2   1264-1   55   9   16.4   1265-1   636   151   23.7   1264-2   102   4   3.9   1265-2   101   13   12.9

实施例6

使用aadA作为可选择标记和壮观霉素作为选择剂的棉花转化

A.土壤杆菌接种物的制备

使用具有携带含有aadA和其它GOI或可筛选标记的1个或2个 T-DNA的双运载体的土壤杆菌菌株C58。如实施例1所述，制备接种 物。

B.棉花外植体，用土壤杆菌接种和共培养

从吸胀的成熟的种子上机械切下棉花胚轴，并用制备的土壤杆菌进 行接种和共培养。机械处理棉花种子，以切下并分离其分生组织。为了 获得可转化的分生组织外植体材料，如下处理棉花种子(例如，来自基 因型STN474(Stoneville Pedigreed Seed Co.，Stoneville，MS))、Delta Pearl (Delta and Pine Land Co.，Scott，MS)、DP5415(Delta and Pine Land Co.)、SureGrow501或SureGrow747(Sure Grow Cotton Seed Company， Maricopa，AZ)，以从种皮和子叶中分离包含分生组织的胚。从4℃或 -20℃的储存中取出棉花种子，并恢复到室温。称重种子，置于无菌发 芽器单元中，并在50％ Clorox(次氯酸钠)中表面消毒5分钟。然后 用无菌蒸馏水清洗种子3次，并在液体水化培养基(CSM)中在28℃、 在黑暗中水化大约18小时(范围是14-42小时)。或者，发芽温度可 以较低，例如大约23℃。CSM培养基含有200mg/L羧苄青霉素 (PhyoTechnology Laboratories，Shawnee Mission，KS)、125mg/L头孢 噻肟(Midwest Scientific，St.Louis，MO)、30mg/L BRAVO 75(Carlin， Milwaukee，WI)和30mg/L克菌丹50(Carlin)。其它溶液也已经成功 地用于水化棉花种子，包括无菌去离子水或含有低浓度的漂白剂(典型 地为50-1000ppm的次氯化钠)的水。水化之后，种子可以立即使用， 或者在进一步处理前在冷藏温度下存储长达一周。

用无菌水洗涤外植体。将大约1-60g、例如30g的外植体置于 PlantconTM容器(MP Biomedicals，Solon，OH)的顶端部分(倒置)，接 着加入足够覆盖外植体的大约50mL的制备的土壤杆菌悬浮液。在关闭 PlantconTM之后，将它插入适当大小的固定器中，将其置于超声仪中(例 如，L&R Ultrasonics QS140；L&R Manufacturing Co.，Kearny，NJ；或 Honda W113超声仪，Honda，Denshi Japan)。用大约2L的0.1％ (例如，Sigma 526-36-23；Sigma Chemical Co，St.Louis，MO)填充超声 仪。在超声处理最多5分钟后，将PlantconTM牢固地置于大约80-100rpm 的振动器之上，温育10分钟。接种后，从PlantconTM除去土壤杆菌接 种物。将大约2g接种的外植体组织转移到新鲜的含有无菌滤纸和5mL 的INO的PlantconTM(表1)，并在培养基表面分散外植体以避免聚集。 也可以用如赤霉素(GA3)、植物生长素(NAA、IBA、IAA、2，4-D、 麦草畏等)、细胞分裂素(BAP、噻苯隆、敌草克、激动素等)的植物 生长调节剂和抗微生物化合物50ppm制霉菌素(50mg/L)、TBZ(10 mg/L)与选择剂壮观霉素(100mg/L)补充INO培养基。将包含接种 的外植体的PlantconTM置于Percival培养器中，在大约23-28℃下、以 16小时光照的光周期(光强度为≥5μE)共培养2-5天。

C.使用壮观霉素作为选择剂对转基因事件的选择和鉴定

在共培养后，通过单独植入培养基中而将外植体转移到PlantconTM 容器中的半固体选择培养基上，或者将它们放于培养基的表面上。基础 培养基是改良的Lloyd & McCown木本植物培养基(WPM，Lloyd and McCown，1981)，并补充了200mg/L头孢噻肟、200mg/L羧苄青霉素 和100-200mg/L壮观霉素(表18)，具有或不具有植物生长调节剂或 其它添加剂，以促进多苗形成和生长。

表18.棉花转化中使用的选择和苗发育培养基的成分-补充了抗生素 的改良的Lloyd & McCown木本植物培养基。

  成分   量/升   含有维生素的LM WPM(Phytotech L449)   2.41g   葡萄糖(Fisher D16-3)   20g   葡萄糖酸钙(Sigma G-4625)   1.29g   含有或不含有Clearys 3336 WP(Carlin 10-032)   0.03g   琼脂凝胶(Sigma A-3301)   4g   加水至   1L   pH   5.6   高压灭菌   羧苄青霉素(Phytotech C346)(40mg/mL储备液)   5mL(200mg)   头孢噻肟(Midwest NDC0039-0019-10)(50mg/mL   储备液)   4mL(200mg)   壮观霉素(50mg/mL的储备液)   3mL(150mg)

在每个容器中培养25-50个外植体。立即将外植体移入温度设定为 大约28℃的光培养室(16小时光照/8小时黑暗的光周期，光强度≥5 μE)，或者首先移入温度设定为大约35℃、最高达40℃的光照室一 段短的时间(例如3-5天)，然后移至28℃。进行实验比较这两种培养 计划，结果表明在35℃的处理时是益的(表19)。

表19.对于使用壮观霉素选择的棉花转化，接种和共培养方法的比较。

  实验-处   理  接种/共  培养方  法   培养温度   含有分生   组织的外   植体数   GUS+苗数   (分析的苗   的总数)   产生GUS+   苗的外植体   的百分比   1021-1   A   35℃，3天   到28℃   127   6(7)   4.7   1021-2   B   28℃   183   0(2)   0   1021-3   B   35℃，3天   到28℃   141   0(2)   0   1021-4   A   28℃   324   2(2)   0.6   1021-5   A   35℃，3天   到28℃   225   7(9)   3.1   1023-1   A   35℃，3天   到28℃   81   5(7)   6.2   1023-2   B   28℃   95   0(0)   0   1023-3   B   35℃，3天   到28℃   81   11(13)   13.6   1023-4   A   28℃   101   0(0)   0   1023-5   A   35℃，3天   到28℃   88   1(3)   1.1

在方法A中，将每种处理中的所有外植体置于一个PLANTCON中， 并添加土壤杆菌接种物以覆盖外植体。超声处理(大量超声处理)接种 物中的外植体2分钟，以产生用于土壤杆菌进入的伤口，接着在振动器 (80rpm)上10分钟。然后除去接种物，并将外植体分散到各含有一 张滤纸和5ml接种培养基的PLANTCON中。在方法B中，分散外植 体以覆盖每个PLANTCON(每个PLANTCON大约100个外植体)的 部分。加入5ml土壤杆菌接种物，然后超声处理外植体20秒，并立即 连同接种物一起转移到具有一张滤纸的PLANTCON的底部。

在选择培养基上大约3-4周之后，绿色的抗性苗在一些外植体上开 始变得明显，而在其它外植体上清楚可见变白的幼苗或原基 (primordia)。在选择培养基上大致又一个2周之后，将长出绿苗的那 些外植体转移到塞，用于在温室中从最初的状态进行苗生长和根 诱导。将Oasis塞置于没有孔的标准平面中，并置于包含0.5g/L的WPM 盐和维生素(Phytotechnology Laboratories，Lenexa KS；编号L449)和 0.25mg/L IBA的简单液体培养基中，并用塑料圆顶覆盖。也可以将外 植体转移到具有相同或更高浓度的壮观霉素或除去壮观霉素的新鲜的 选择培养基上，用于在移到塞子之前进行进一步的选择和/或生长。在 某些实验中，棉花外植体接受基本上如上文的方案“D”的大豆转化、选 择和植物再生所述的组织培养和生长条件。棉花生根培养基(CRM；表 20)也可以用来诱导根的形成。

表20.棉花生根培养基(CRM)的成分。

  成分   量/升   MS基础盐(Phytotech M524)   2.15g   肌醇(Sigma I-3011)   0.1g   右旋糖(Fisher D16-3)   30g   SBRM维生素储备液：   甘氨酸(Sigma G-6143)：1g/L   烟酸(Sigma N-0765)：0.25g/L   盐酸吡哆醇(Sigma P-8666)：0.25g/L   盐酸硫胺素(Sigma T-3902)：0.5g/L   2mL   半胱氨酸(10mg/mL)   10mL   用去离子的蒸馏水补足体积   用KOH调节pH   5.8   细菌培养用琼脂(BD 214030)   8g   高压灭菌   IAA(Sigma I-2886)(0.02mg/mL)   5mL   特美汀(Duchefa T0190)(100mg/mL)   1mL   头孢噻肟(Midwest NDC0039-0019-10)(50   mg/mL)   4mL

在大约3-4周之后，塞中的大部分苗已经明显生长，并且根 也良好地发育。通过例如试验(Third WaveTM Technologies， Madison，WI)、PCR或Southern杂交的一种或多种分子试验方法，分 析组织的分子特征。如果使用包含uidA基因的构建体，当仍然在选择 培养基上和/或处于后期时，也可以从每个绿苗收集叶样品，并分析GUS 活性。壮观霉素用作早期鉴定转化的有用的可见标记。未转化的组织通 常看起来变白，且在壮观霉素选择下通常是畸形的，而转化的组织是绿 色的，且适当地发育。在使用uidA标记基因的实验中，可以在选择培 养基上大约4-8周之后，通过GUS表达证实绿色组织的转化性质。因 此，使用壮观霉素作为选择剂优于在分生组织转化系统中常用的劳动力 密集和耗时的GUS分析，并提供了明显减少与产生转基因植物有关的 劳动的优势。

实施例7

使用aadA作为可选择标记基因的玉米转化

A.玉米外植体

在授粉后大约10天，收获含有不成熟的胚(例如，FBLL或LH244) 的穗，并在4℃保持冷藏直至使用(收获后多达5天)。用于该转化 方法的优选的胚的大小是～1.0-2.0mm。使用87°F平均温度、由GE 1000 瓦高压钠灯提供补充照明的14小时白日长度的培育条件，在温室中， 通常在授粉后大约10天获得这种大小。该方法是不依赖于基因型的。

B.土壤杆菌接种物的制备

使用具有携带含有aadA和其它GOI或可筛选标记的1个或2个 T-DNA双运载体的土壤杆菌菌株C58。如美国专利申请公开 20040244075所述，制备接种物。

C.接种和共培养

从表面消毒的穗上分离不成熟的胚，并将不成熟的胚直接滴入1.5 mL微量离心管中的制备的土壤杆菌细胞悬浮液中。持续分离15分钟。 离心管然后静置5分钟，这使得各种胚的接种时间范围是5-20分钟。 在使用无菌细尖移液管除去土壤杆菌细胞悬浮液后，将不成熟的胚转移 到共培养基上(表21)。将胚置于培养基上，盾片(scutellum)侧朝上。 在黑暗的培养器中(23℃)培养胚大约24小时。

D.转化体在含有壮观霉素的培养基上的选择、再生和生长

在共培养后，将胚转移到皮氏培养皿(100mmx25mm)中的补充 有500mg/L羧苄青霉素和50、100、150、200或500mg/L壮观霉素的 改良的MS培养基(诱导MS，表21)上，每板20-25个胚。存在植物 生长素和细胞分裂素以启动来自盾片组织(scutellar tissue)的胚发生培 养应答。27℃下将板保持在黑暗的培养室中大约2周。将具有发育的 愈伤组织的不成熟的胚各自转移到第一再生培养基上，除了用3.5mg/L BAP(MS/BAP，表21)代替2，4-D和毒莠定并且羧苄青霉素水平降低 到250mg/L以外，该培养基与上述培养基相同。将培养物移到具有16 小时光照/8小时黑暗的光周期和27℃的培养室中。5-7天后，也可以 将愈伤组织片转移到皮氏培养皿(100mmx25mm)中的第二再生培养 基上-一种不含激素的基于MS的培养基(MSOD，表21)。再过大约 2周后，将具有再生的绿苗或仍然存活的愈伤组织片转移到Phytatrays 中的相同的不含激素的培养基上，用于进一步的选择和生长。所有上述 的培养基中补充有50、100、150或200mg/L的壮观霉素。当它们到达 Phytatray的顶部且具有一个或多个健康的根时，将再生的绿色植物(R0) 移到生长室中的泥炭罐中的土壤中。在另外7-10天后，将它们移植到 12英寸的罐中，并移到具有正常玉米生长条件的温室中。植物进行自花 授粉或与野生型植物杂交。

进行分子试验(例如，如以上对于玉米植物的描述)，以表征植物。

表21.用于转化和再生玉米的培养基。

1.培养基1/2 MSVI和1/2 MSPL作为液体使用。用5.5mg/l的低EEO 琼脂糖固化共培养基。对于草甘膦选择，用7g/l植物琼脂(Phytagar) 或3g/l植物凝胶(phytagel)固化所有的其它培养基。

实施例8

来自土壤杆菌和CTP-aadA融合基因的增强的16S RNA启动子的制备

一种具有OriRi复制起点的2T-DNA载体pMON107379，具有位于 骨架中(即，T-DNA之外)的启动子，用于在大肠杆菌或土壤杆菌宿 主细胞中选择壮观霉素抗性。为了制备pMON107379，用NotI消化从 pMON96999(图2)上切下的植物壮观霉素选择表达盒，并插入用 PspOMI打开的pMON107341中。亲本pMON107341是具有通过P-rrn 启动子驱动的增强的壮观霉素抗性表达盒的基于oriRi的载体。与包含 OriRi的载体相同，当载体的拷贝数低时，来自土壤杆菌的增强的16S RNA启动子(SEQ ID NO：3)尤其有用。P-rrn启动子通过PCR从土壤 杆菌菌株C58 16S rDNA分离，并与virE操纵子核糖体结合位点(RBS) 融合，以使其能够在大肠杆菌和土壤杆菌中有效翻译。pMON107379也 包含编码赋予壮观霉素抗性的氨基糖苷-3’-腺苷酰转移酶(SEQ ID NO：1)的aadA基因，该编码氨基糖苷-3’-腺苷酰转移酶的基因也与叶 绿体转运肽(SEQ ID NO：2)融合，用于将核编码的氨基糖苷-3’-腺苷 酰转移酶转运到质体中。

实施例9

大豆和棉花中的优良ROUNDUP READYTM种质的直接再转化

利用本文所述的方法，优良的转基因Round-Up ReadyTM种质可以用 2个T-DNA转化，该T-DNA编码用于壮观霉素选择的aadA基因，同 时在第二T-DNA(或质粒，如果使用两种质粒)上使用新的基因(通 常称为“目标基因”)，以允许与所述的aadA分离。

比较棉花种子品种(07W610F)和种质对照的非转基因品 种(00S04)。种子在24℃吸胀～18小时，机器切除并机器筛分(两步) 接着浮选富集外植体。在OD660 0.3的INO中，用土壤杆菌悬浮液接种 外植体，超声处理2分钟，并温育10分钟。然后除去土壤杆菌悬浮液， 并以大约2g/容器将外植体分散于共培养容器中。将外植体置于用5ml 的共培养基(添加有50ppm的制霉菌素、10ppm的TBZ和100ppm的 壮观霉素的INO)湿润的滤纸上，并在大约23-25℃下、在光照的(16 小时光照/8小时黑暗，光强度≥5μE)Percival培养器中共培养3天。接 着将外植体转移到具有150ppm的壮观霉素的WPM培养基上，在35℃ 的光照室(16小时光照/8小时黑暗)中培养3天，然后移到28℃的光 照室中(16小时光照/8小时黑暗)。接种后6周，收获表型阳性的绿 色小植物，置于用0.5g/L WPM盐(任选包含0.25mg/L的IBA，以改 善生根)湿润的塞(Smithers-Oasis USA；Kent，OH)中，并移到 温室条件下。一旦植物适应并开始生长，分析它们的CP4、GUS和脉管 GUS表达(种系转化的预测指标)。预期再转化的转基因植物是CP4+ GUS+，而转化的对照植物预计为CP4-GUS+。在下面的表22中列出转 化植物的产量的分析。由于此时分析不是完全的，预期总转化率增加。 所述程序可用于再转化转基因棉花植物，其效率类似于常规的非转基因 棉花品种的转化。

表22：再转化的种质的转化率。

  棉花种质   接种   的质   量外   植体   壮观霉素表   型阳性的   (绿色)小   植物   绿色小   植物％   为GUS   采样的   植物数   在所有叶   中表达   GUS的植   物(种系)   ％TF，   表达   GUS的   种系   00S04   928   18   1.90％   11   2   0.22％   07W610F   3665   87   2.40％   64   9   0.25％

实施例10

种子和/或外植体材料的灭菌

测试了许多在切除前对种子灭菌以及在从种子切下后对外植体灭 菌的技术。以15分钟至16小时的时间间隔，检测了在真空干燥室中使 用氯气对干燥外植体的切除后灭菌。尽管真菌污染在对氯气的暴露已经 超过了外植体的生存极限的处理中生长，但是污染控制随着对氯气的更 长时间的暴露而提高。

也测试了臭氧气体处理。在PLEXIGLAS室(OSR-8臭氧发生器； Ozone Solutions，Sioux Center，IA)中，以1-24小时的各种时间间隔将完 整的种子(切除前)和干燥的外植体(切除后)暴露于O3气体。使用 467ppm的浓度的O3。在将种子暴露于臭氧后，切下胚材料，并测量外 植体的生命力。大豆种子臭氧处理12小时或更短时间不会影响随后分 离的外植体的生命力，但在外植体中发现急剧降低的生物负荷 (bioburden)。对干切的外植体的短至1-4小时的臭氧处理降低了外植 体的健康(即，活胚的数量)。

使用200ppm活性氯的漂白溶液对完整种子的切除前灭菌进行另外 的测试，接着是在50ppm活性氯溶液中的过夜水化期(～9小时)。然 后在机械切除之前，将这些种子在层流柜中干燥(典型地为12-48小时)。 也测试了对50％漂白液浸泡方案的改进，其中，首先用70％的乙醇溶 液清洗种子。立即排干乙醇(对乙醇的总暴露时间少于5秒)，然后通 过在50％漂白液中处理种子3-15分钟进行50％漂白液浸泡，接着用水 清洗3遍并过夜干燥种子，使得含水量低于8％。也采用紫外线来对植 物材料灭菌。

实施例11

种子和外植体材料的水化

测试了采用新的预培养水化/发芽策略的研究。用于此步骤的培养 基的类型包括“豆类发芽培养基”(BGM；表16)、大豆接种培养基 (INO；表1)和制备好的土壤杆菌对数期生长培养物(AGRO)。 土壤杆菌生长培养物在Lysogeny Broth(LB，通常也称为Luria-Bertani Broth)中过夜生长至对数期，然后离心并再悬浮至660nm处的最终 光密度为0.25-0.6。用于稀释的培养基与大豆接种培养基相同。在4 ℃下，将外植体浸泡在该溶液中过夜。在与相应的水化培养基接触 过程中，进行其它改变：此接触期间的各种温度和相应的培养基中 的饱和程度。测试的接触时间为0-24小时。较长的接触时间(超过 4小时)中的温度为室温(～26℃)、23℃或4℃。4小时或更短 的接触时间全都在室温下测试。作为在水化过程中用液体培养基完 全浸没或基本上饱和外植体的替代方案，一些处理使用湿润的滤纸 (有足够的液体湿润，但没有饱和)。这使用以BGM或者土壤杆菌 培养基润湿的滤纸来完成。再水化在多种容器中进行，包括但不限 于圆锥形离心管、刻度玻璃瓶或者PLANTCON组织培养容器(MP Biomedicals，Irvine，CA)。

本实施例也证明了水化可以在包含如葡萄糖(INO)和蔗糖 (BGM)等各种类型的碳水化合物的多种培养基中进行。其它碳水 化合物如半乳糖也可以用于水化培养基中。

实施例12

延长时间存储的干切大豆外植体的转化

干切的外植体在-20℃至4℃下存储最长达20个月，然后测试 其存活力、可转化性和活力。无论相比对照处理(处理1)的存储条 件或者温度如何，外植体的存活力和总活力似乎在所有处理组中均 相似。这证明能够存储干切外植体几乎2年而没有损害。在接种4 天后测试每种处理的外植体的瞬时GUS表达。表23显示各种处理 之间分生组织特异性gus表达的比较，以0-9级评分，0表示没有可 见的表达，9表示在胚的所有3个分生组织中都大量表达。这证明了 干切的外植体不仅可以在各种条件的长期存储后存活而没有明显的 活力丧失，而且保持了对于转化的适应力。因此现在可以在非高峰 时间切下大量的外植体以备后用，这代表了在计划和实施转化研究 中显著的、可能的费用节约和灵活性。

表23：存储时间和温度对外植体转化的影响。

  处理   种子消毒技术   切除技术   存储时间   存储温度   瞬时gus表达   (0-9级)   1和2   50％漂白液清洗   使用Grainman   水稻脱壳机的   自动干切   无   NA   0.90、1.60   3   50％漂白液清洗   使用Grainman   水稻脱壳机的   自动干切   17个月   4℃   0.20   4   50％漂白液清洗   使用Grainman   水稻脱壳机的   自动干切   17个月   -20℃   0.10   5   50％漂白液清洗   手动干切   20个月   4℃   0.70   6   50％漂白液清洗   手动干切   20个月   -20℃   1.50

实施例13

合适的预接种培养(“预培养”)组合物和条件的确定

当用土壤杆菌接种用于转化时，干切的外植体可能仍处于半休 眠状态。因此，开发了一种在土壤杆菌接种前刺激干切外植体的代 谢活性的方法，用于增强它们的转化能力。即，通过操纵干外植体 的生物学，可以使每个外植体中的种系阳性事件的百分比增加2-10 倍。

在23℃和/或28℃温度下，以及在1-5天的不同光照/黑暗条 件下，测试几种培养基组合物-BGM(表16)、INO(表1)或OR(表 24)增强转化能力的能力。预培养步骤后，将外植体集中在一起，然 后根据实施例1中所述的方法用土壤杆菌培养物接种。在外植体上 进行的瞬时GUS表达试验表明在共培养2天和4天后预培养处理中 的GUS活性增强。

在某些预培养实验中，由于真菌感染导致植物损失，但是与未 预培养的干切的外植体相比，在BGM润湿的滤纸上、23℃、黑暗 中预培养5天的干切的外植体的总转化率似乎是最高的。由于真菌 污染导致的损失可以通过在预培养和/或共培养步骤中使用诸如各为 大约1％的BRAVO 75和克菌丹50的抗真菌剂来减轻。用CP4探针 对本实施例中产生的植物进行的Southern印迹和INVADER分析证 实了这些植物的转基因性质。

表24：大豆器官生成(OR)培养基

化合物：                    每4升：

MS盐                        17.2g

3X次要MS盐                  40ml

烟酸(1毫克/毫升)            4ml

盐酸吡哆醇(1毫克/毫升)      4ml

盐酸硫胺素(1毫克/毫升)      46.8ml

蔗糖(超纯)                  120g

肌醇(细胞培养级)            40g

pH                          5.8

洗过的琼脂                  32g

高压灭菌后添加：

脯氨酸(2.5m储备液)          19.2ml

TSG/OR激素储备液            40.0ml

表25：干外植体预培养的影响；使用pMON10343的转化率

重复研究来比较两个构建体：pMON101343，其包含1个含有提 供草甘膦抗性的CP4基因和OriV复制起点的T-DNA；和 pMON107350，其包含1个在载体骨架上含有提供草甘膦抗性的CP4 基因和OriR复制起点(US20070074314)的T-DNA。如表26所示， 与未预培养的干外植体的转化率相比，干外植体的预培养再次提高 了转化率。

表26：对干切外植体的预培养的另外的研究。

如表27所示，当在使用机器人系统自动除去和添加的液体再生 培养基(除琼脂凝胶外，表12的培养基)中培养外植体时，预培养 的干切外植体也产生了较高的转化率。具有预培养步骤使用液体再 生培养基的TF似乎甚至更高。液体培养基中的湿切的外植体似乎由 于污染而具有低TF。

预培养令人惊奇地增加了转化能力并且提高了转化一致性。这 样的提高对于减少工业规模生产转基因大豆植株的生产过程中的变 异性是关键的。

表27：干切的外植体的预培养；固体和液体培养基的比较。

实施例14

使用干大豆外植体和壮观霉素选择产生转基因大豆植物

干的活种子(适当存储的高质量大豆种子具有大约10-12％的内 部含水量)用无菌水或次氯酸钠溶液(0ppm至～30,000ppm的活性 氯，包括50ppm-200ppm的活性氯)冲洗3-20分钟。然后排出液体。 这个过程提高内部含水量到大约16％。在此简短的表面清洗步骤后， 在商业种子干燥器中用除湿空气流(温度控制到大约60-90°F)降低 种子的内部含水量到低于8％。

在需要的存储后，将外植体再水化用于转化。这一步骤中所用 的培养基类型可以不同，包括“豆类发芽培养基”(BGM；表16)、 大豆接种培养基(INO；表1)和制备的对数期土壤杆菌生长培养物 (AGRO)。土壤杆菌生长培养物在Lysogeny Broth(LB，通常也称 为Luria-Bertani Broth)中生长过夜达到对数期，然后离心并再悬浮 至在660nm处的最终光密度为0.25-0.6。用于稀释的培养基与大豆 接种培养基一样。再水化温度和持续时间也可以不同，某些实验中 将外植体在4℃浸泡于这些溶液中的一种中过夜。在接触相应水化 培养基的持续时间、接触过程中的各种温度和相应培养基的饱和程 度方面进行其它变化。测试的接触时间为0-24小时。较长接触时间 (超过4小时)的温度是室温(～26℃)、23℃或4℃。4小时或 少于4小时的接触时间都在室温下测试。作为在水化过程中用液体 培养基完全浸没或基本上饱和外植体的替代，一些处理使用湿润的 滤纸(有足够的液体湿润，但没有饱和)。这用以BGM或者土壤杆 菌培养基润湿的滤纸来完成。再水化在多种容器中进行，包括但不 限于锥形离心管、刻度玻璃瓶或者PLANTCON组织培养容器(MP Biomedicals，Irvine，CA)。

再水化后，在适合的土壤杆菌培养物的存在下，对外植体进行 简短的超声处理。共培养和后续步骤在大约23-25℃的温度下、在 光照Percival培养箱中进行2-5天(16小时光照，8小时黑暗，光强 度为大约5μE-200μE)，且可以在最高大约35℃下进行。已知光 促进基因从土壤杆菌转移到植物细胞。在再水化、共培养步骤过程 中和/或共培养后，以15毫克/升-1000毫克/升的浓度应用作为选择 剂的壮观霉素。

如表28所示，使用以下构建体常规回收表型阳性的苗(植物)： pMON96999，其包含1个含有addA基因和OriV复制起点的T-DNA； 或构建体pMON101343，其包含1个含有CP4基因和OriV复制起点 的T-DNA。在存在壮观霉素的情况下，“表型阳性”的意思是苗为绿 色且坚实，而表型阴性的苗如果伸长，则较弱且变白(白色)。壮 观霉素或草甘膦以表28所示的浓度在再生培养基(固体或者液体) 中使用。

表28：使用草甘膦或壮观霉素作为选择剂的干大豆外植体的转化率。

壮观霉素也作为用于干切大豆胚转化的选择剂，使用以下条件： 在INO培养基中水化1小时，在INO、150ppm壮观霉素中共培养4天， 在固体或液体WPM(表2，加入或不加琼脂)上培养。可以使用23-25 或28℃、最高大约35℃的温度。在土壤杆菌接种8-10周后，收获表 型阳性的苗，并在含有150ppm壮观霉素的固体BRM(参见实施例2) 上诱导生根。在两个不同的研究中，获得25.05％和19.27％的非常高 的转化率。

实施例15

用干大豆胚、壮观霉素和液体培养基产生转基因大豆植物

在这些研究中，外植体在开始时水化并最终在上述具有液体覆 盖层的WPM固体培养基或WPM液体培养基上再生。在接种6周后 将所有外植体转移到含有Wedge System(Smithers-Oasis USA； Kent，OH)和简化液体培养基(含有0.25毫克/升IBA的0.5克/升 WPM)的浅盘上。2-4周后，获得生根和发芽的R0植物。在所有的 研究和处理中，在如表29所示的相应培养基中进行外植体的初始水 化1小时。除了草甘膦被150ppm的壮观霉素代替外，液体培养基 与表2中相同。在液体覆盖处理中，使用固体和液体培养基；当它 们在组织培养过程中在如表30所示的特定时间置于固体培养基上 时，将液体培养基分配在外植体的顶部。这作为一种类型的培养基 更新来进行，并且不需要将外植体从旧培养基转移到新培养基。在 对照处理中，将外植体表面接种于固体WPM培养基上(表2)。除 了草甘膦被150ppm的壮观霉素代替外，苗在如上所述的固体BRM 培养基上收获并生根。

表29：给定水化条件下的转化率。

表30：液体覆盖时间安排

实施例16

使用干大豆胚、壮观霉素、通过预培养步骤和转移整个再生外植体 来产生转基因大豆植物

在这些研究中，如实施例13，使用预培养步骤(5天，23℃， 黑暗，在BGM中)。在预培养步骤前，干切的外植体也在INO培 养基上进行水化1小时。在共培养期之后，将大约12毫升包含150 ppm壮观霉素的液体WPM直接分配到共培养PLANTCON中，4天 后将外植体表面接种于包含150ppm壮观霉素的固体WPM上。在本 实施例中，在再生的大约第4周鉴别表型阳性的绿苗，并从WPM再 生培养基转移到包含Wedge System(Smithers-Oasis USA； Kent，OH)和简化液体培养基(含有0.25毫克/升IBA的0.5毫克/ 升WPM)的浅盘中。2-4周后，获得生根和发芽的R0植物。总之， 这些研究中的预培养也提高了TF％(表31)。下面(表31)显示的 质量事件百分比是指通过InvaderTM试验证明存在1-2个拷贝的目标 基因(GUS)和标记基因(aadA)的转基因事件的比例。评估的无 标记TF(mTF)是指没有标记基因的事件的百分比。

表31：从整个再生的外植体观察到的转化率和质量。

  方案和载体   类型   外植   体数   产生   的事   件数   TF％   分析   的事   件数   质量   事件   ％   qTF％ 评估的 mTF％＊＊   干切-   2T/OriV   260   34   13.1+/-0.17   32   21.9   2.7+/-0.23   0.62   干切-   2T/OriRi   161   15   9.32+/-7.38   14   28.6   2.5   0.45   预培养的干-   2T/OriV   1641   319   19.4+/-5.42   311   24.4   4.6+/-1.35   1.1   预培养的干-   2T/OriRi   336   66   19.64+/-1.97   64   20.3   3.9+/-1.22   0.7

实施例17

使用存储的干大豆胚、壮观霉素、通过预培养步骤和整个再生外植 体的转移产生转基因大豆植物

在本实施例中，使用存储3个月的干外植体，且对干切的外植 体在INO中进行1小时的水化步骤。预培养在23℃黑暗条件下、 在含有50ppm的制霉菌素和10ppm的TBZ杀真菌剂的BGM中进 行5天。将TDZ和硫辛酸都加到接种物和共培养基(INO)中。构 建体pMON107379是包含oriRi和aadA基因的传统2T载体，并进 行共培养5天。在共培养后，将外植体表面接种于固体WPM上，然 后转移到具有简化液体培养基(含有0.25毫克/升IBA的0.5克/升 WPM)的Wedge System(Smithers-Oasis USA；Kent，OH)中。 如表32所示，预培养干外植体提高了TF。因此，存储3个月的干 外植体的表现类似于新切下的干外植体。进一步，将溶解在DMSO 中的制霉菌素(50ppm)和噻菌灵(10ppm)加入到INO共培养基 中(1.0ml DMSO/升INO)改善了外植体的健康，这可能是通过控 制通常在种子之中和之上发现的酵母和真菌而实现的，因此在进行 大量和/或自动化组织培养时是有用的手段。

表32：预培养对存储的干外植体的TF(％)的影响。

  外植体类型   预培养步骤   外植体数   R0植物   TF   湿切的   无   263   75   28.52％   存储的干外植体   无   678   71   10.47％   新鲜的干外植体   无   375   24   6.40％   存储的干外植体   有   901   129   14.32％   新鲜的干外植体   有   1008   112   11.11％

************

根据本发明的公开内容，可以在不进行过多实验的情况下，制 备和实施本文公开的和要求保护的全部组合物和方法。尽管本发明 的组合物和方法已经在上面示例性的实施方案中详述，但是本领域 的技术人员应当明白，在不背离本发明的真正概念、精神和范围的 情况下，可以对本文所述的组合物、方法和方法的步骤或步骤的次 序进行变化、改变、修改和改造。更加特别的是，应当明白，在化 学和生理学上相关的某些试剂可以代替本文所述的试剂，而仍可获 得相同或相似的结果。对于本领域的技术人员来说显而易见的所有 这些类似的替代物和修改都被认为落入由所附权利要求书所限定的 本发明的精神、范围和概念之内。

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本文特别引入以下文献作为参考，其提供补充本文所述信息的 示例性的程序上的或其它方面的细节。

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序列表

<110>Martinell，Brian

     Petersen，Michael

     Somers，David

     Wan，Yuechun

     Williams，Edward

     Ye，Xudong

<120>使用壮观霉素选择的植物转化方法

<130>MONS：194WO

<140>PCTUS0856427

<141>2008-03-10

<150>US 60/894,096

<151>2007-03-09

<150>US 60/915,066

<151>2007-04-30

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>792

<212>DNA

<213>志贺氏菌属的种

<400>1

atgggggaag cggtgatcgc cgaagtatcg actcaactat cagaggtagt tggcgtcatc   60

gagcgccatc tcgaaccgac gttgctggcc gtacatttgt acggctccgc agtggatggc  120

ggcctgaagc cacacagtga tattgatttg ctggttacgg tgaccgtaag gcttgatgaa  180

acaacgcggc gagctttgat caacgacctt ttggaaactt cggcttcccc tggagagagc  240

gagattctcc gcgctgtaga agtcaccatt gttgtgcacg acgacatcat tccgtggcgt  300

tatccagcta agcgcgaact gcaatttgga gaatggcagc gcaatgacat tcttgcaggt  360

atcttcgagc cagccacgat cgacattgat ctggctatct tgctgacaaa agcaagagaa  420

catagcgttg ccttggtagg tccagcggcg gaggaactct ttgatccggt tcctgaacag  480

gatctatttg aggcgctaaa tgaaacctta acgctatgga actcgccgcc cgactgggct  540

ggcgatgagc gaaatgtagt gcttacgttg tcccgcattt ggtacagcgc agtaaccggc  600

aaaatcgcgc cgaaggatgt cgctgccgac tgggcaatgg agcgcctgcc ggcccagtat  660

cagcccgtca tacttgaagc tagacaggct tatcttggac aagaagaaga tcgcttggcc  720

tcgcgcgcag atcagttgga agaatttgtc cactacgtga aaggcgagat caccaaggta  780

gtcggcaaat aa                                                      792

<210>2

<211>1020

<212>DNA

<213>人工序列

<220>合成的引物

<400>2

atggcgcaag ttagcagaat ctgcaatggt gtgcagaacc catctcttat ctccaatctc   60

tcgaaatcca gtcaacgcaa atctccctta tcggtttctc tgaagacgca gcagcatcca  120

cgagcttatc cgatttcgtc gtcgtgggga ttgaagaaga gtgggatgac gttaattggc  180

tctgagcttc gtcctcttaa ggtcatgtct tctgtttcca cggcgtgcat gggggaagcg    240

gtgatcgccg aagtatcgac tcaactatca gaggtagttg gcgtcatcga gcgccatctc    300

gaaccgacgt tgctggccgt acatttgtac ggctccgcag tggatggcgg cctgaagcca    360

cacagtgata ttgatttgct ggttacggtg accgtaaggc ttgatgaaac aacgcggcga    420

gctttgatca acgacctttt ggaaacttcg gcttcccctg gagagagcga gattctccgc    480

gctgtagaag tcaccattgt tgtgcacgac gacatcattc cgtggcgtta tccagctaag    540

cgcgaactgc aatttggaga atggcagcgc aatgacattc ttgcaggtat cttcgagcca    600

gccacgatcg acattgatct ggctatcttg ctgacaaaag caagagaaca tagcgttgcc    660

ttggtaggtc cagcggcgga ggaactcttt gatccggttc ctgaacagga tctatttgag    720

gcgctaaatg aaaccttaac gctatggaac tcgccgcccg actgggctgg cgatgagcga    780

aatgtagtgc ttacgttgtc ccgcatttgg tacagcgcag taaccggcaa aatcgcgccg    840

aaggatgtcg ctgccgactg ggcaatggag cgcctgccgg cccagtatca gcccgtcata    900

cttgaagcta gacaggctta tcttggacaa gaagaagatc gcttggcctc gcgcgcagat    960

cagttggaag aatttgtcca ctacgtgaaa ggcgagatca ccaaggtagt cggcaaataa   1020

<210>3

<211>227

<212>DNA

<213>人工序列

<220>合成的引物

<400>3

gtctgttttt tgacaattga atatgagaag aaagagaaac gtgggcggcg aagctagctt     60

gcgggacctg gagagatttg ggtcctagtg aatagacttt gacggtcacg ttttaatgag    120

acaacaccaa tttcgcgagc agagatgctt gttgagattg atgtgagttc tcgtcgattc    180

agaataacgt gacaatagtc aatgattgaa ggagaaacaa agccatg                  227