本发明专利为中国专利申请03142114.8《浊点系统在生物转化中 的应用》的发展。
在中国专利申请03142114.8中，本发明人公开了一种浊点系统 在生物转化中的新应用，即采用一种或一种以上非离子表面活性剂形 成浊点低于微生物转化培养温度的水溶液系统即浊点系统，作为微生 物转化的介质。该系统特别适用于疏水性化合物的微生物转化，能解 除底、产物抑制，排除产物降解。该浊点系统形成了油包水和水包油 的微观乳浊液，表面活性剂液滴具有增溶能力，充当着底物的储藏库 和产物的萃取剂，强化了底物的生物利用度，排除了产物的抑制。连 续的表面活性剂中存在水泡，相当于一个微反应器，能使微生物免受 表面活性剂的毒害作用，从而提高了生物相容性。
但在这种浊点系统的生物转化方法中，使用的微生物均为生长细 胞，存在着整个转化过程需在无菌状态下进行，且微生物细胞转化过 程受底物、产物的浓度影响较大(这在本发明人另一篇中国专利申请 03142115.6中有详细的描述)；产物分离纯化过程难度较大，以及转 化过程的优化不能独立进行等问题。

本发明所要解决的技术问题在于提供一种采用静息细胞在浊点 系统中进行生物转化的方法，使浊点系统条件下的生物转化更为简 便。
本发明采用静息细胞在浊点系统中进行生物转化的方法是采用 一种或一种以上非离子表面活性剂溶液在低于微生物转化培养温度 下形成浊点系统，作为静息细胞转化的介质进行生物转化。
本发明所述的非离子表面活性剂选自聚氧乙烯醇类、聚氧乙烯醚 类或辛基酚聚氧乙烯类表面活性剂。
其中所述的聚氧乙烯醇类包括Brij30，Brij35，Brij56或C12E7； 聚氧乙烯醚类包括Tween20、Tween40、Tween60、Tween80、Span20、 Span40、Span60或Span80；辛基酚聚氧乙烯类包括Triton X-100或 Triton X-114。
其中所述的静息细胞为将在生长培养基上培养至一定时间后的 微生物细胞，用适当方法收集并用缓冲液进行洗涤，去除了营养成分 的微生物细胞，然后用于浊点系统中。
在本发明静息细胞培养基中也可加入以非离子表面活性剂溶解 的诱导物，以诱导产生生物转化所需的酶。该诱导物一般为转化底物， 浓度为0.1～2.0％(w/v)之间。
本发明静息细胞培养的具体步骤包括(除非特别指明，本发明所 述的浓度均指w/v)：
(1)将斜面接种物接种在含有碳源为甘油或葡萄糖，浓度为 0.5～2.0％；氮源为0.5g酵母浸出膏或蛋白胨等，浓度为0.5～2.0％； 无机盐为K2HPO4、(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、Na2HPO4和KH2PO4 等，浓度为0.05～0.5％组成的生长培养基中；在25～35℃下培养2～9 天；
或在上述培养基中加入0.1～2.0％的转化底物，以及0.1- 2.0％的非离子表面活性剂，在生长培养基上培养2～9天；
(2)微生物细胞经离心收集，用磷酸缓冲液(100ml溶液中含 0.45g Na2HPO4，0.34g KH2PO4)洗涤3次以去除转化液中的营养成分， 在-20℃的冰箱中保藏备用。
以上述方法获得的静息细胞即可用于浊点系统中进行生物转化。
本发明采用的静息细胞在浊点系统中进行生物转化特别适用于：
1.疏水性化合物的微生物转化；
2.对微生物生长具有底物和产物抑制作用的微生物转化；
3.产物易被微生物降解的微生物转化；
4.可使用微生物细胞进行循环的生物转化；
本发明方法特别适用于胆固醇边链的切除、甾体化合物转化、有 机污染沉淀物的降解等。
利用静息细胞在浊点系统中进行生物转化除了保持浊点系统所 具有的优点外，还体现在：
1.可以人为地控制和调节微生物细胞的浓度，实现高细胞浓度 下的生物转化：即在生长细胞转化时的细胞浓度由于受到生长抑制不 能达到高浓度转化，而利用静息细胞转化由于细胞可以在转化前培养 收集，因此，在转化系统中的细胞浓度可以人为地控制和调节；从而 在工业规模可以达到在较小的转化体积下，获得较高的转化能力，以 能够大大地节约能源和其他生产成本。
2.微生物细胞的生长与转化是独立的过程，细胞生长和生物转 化的过程可独立优化：即在细胞培养过程中进行细胞活性和细胞生长 条件的优化，以得到大量的转化活力高的微生物细胞，来制备用于生 物转化的静息细胞；而一旦静息细胞收集制备后，就可以进行转化条 件的优化，如底物加入量和加入方式、细胞加入量和加入方式，以及 转化周期和循环转化批次等，而无需考虑细胞的培养条件和培养方式 等，达到最佳的生物转化效果。
3.由于微生物细胞的生长与转化是独立的过程，因此，在生物 转化系统中的静息细胞已经合成好了用于转化的酶，所以，底物和产 物对细胞生长的抑制可以有效地被排除。
4.可使整个转化过程在非无菌状态下进行，使操作简化，成本 降低。
5.能够比较简单地实现循环转化，大大提高转化效率，因为经 过一次培养的微生物细胞可以作为生物催化剂反复使用；另外，整个 循环系统无需其他复杂的配套系统，即在常规的操作条件下就能够实 现。
6.产物的分离纯化，以及底物和转化系统中表面活性剂的回收 套用工艺可以简化，因为在转化系统中所用的静息细胞不像生长细胞 那样，伴随大量的发酵培养基成分，以及在细胞生长和转化过程中产 生的大量其他代谢产物，从而有效地提高了下游处理的效率，降低了 制备成本。
本发明以胆固醇的静息细胞边链切除为模型，进一步说明静息细 胞在浊点系统中进行生物转化的方法。
胆固醇经静息细胞边链切除生成甾体药物的重要中间体ADD是 生物转化疏水性化合物的典型例子。首先，胆固醇是典型的疏水性化 合物，其在水中的溶解度常在1μM以下，而一般的甾体在0.01～ 0.1mM之间。其次，这一转化的底物和产物对微生物都有毒害作用， 这种毒害作用可能是对微生物生长必需的某种酶合成的阻遏作用，也 可能是对已经合成的酶的抑制作用。利用静息细胞在浊点系统中进行 疏水性化合物的生物转化，可以较好地解决这些问题，而使转化效率 得到较好的提高。下面通过具体的实验过程对本发明以胆固醇为原料 生产ADD和4AD的方法作进一步的描述。
1.微生物培养
微生物菌种Mycobacterium sp.NRRL B 3683。它能实现胆固醇的 边链切除，生成产物ADD和4-AD，其比例大概为10∶1。
培养基：
斜面培养基(100ml)：0.5g酵母浸出膏，1.2g琼脂粉，1g甘油， 0.05g K2HPO4，0.1g(NH4)2SO4，0.05g MgSO4·7H2O或1.0g酵母浸出 膏，1.5g琼脂粉，1.0g葡萄糖，1.0g蛋白胨。
种子培养基(100ml)：
0.5g(NH4)2SO4，0.45g Na2HPO4，0.34g KH2PO4，0.05g MgSO4·7H2O， 1.0g甘油，0.2g胆固醇，0.2g Triton X-100。
生长培养基(100ml)：
1.0g(NH4)2SO4，0.45gNa2HPO4 0.34gKH2PO4，0.2gMgSO4·7H2O，0.5g胆固醇，2.0g非离子表面活 性剂。
2.分析方法
取1ml样品用4ml甲醇浸泡2hr。离心后取0.8ml上清进行HPLC 分析。用Hypersil C18柱，流动相为甲醇∶水(4∶1)，流速为0.7ml/min，检 测波长为254nm。ADD和AD的停留时间分别为4.8，6.2min。
3.细胞收获和静息细胞的制备
将在生长培养基上培养一定时间后的微生物细胞经离心后收集。 用磷酸缓冲液(100ml溶液中含0.45g Na2HPO4，0.34g KH2PO4)洗涤 3次以去除转化液中的营养成分，作为静息细胞保藏在-20℃的冰箱 中备用。
4.静息细胞生物转化
根据实验要求收集静息细胞菌体，每克菌体根据平板计数法测定 约含3×1013个细胞。每100ml磷酸缓冲液中，可以加入1～15克的静 息细胞菌体进行生物转化。
5.底物和表面活性剂
在100ml磷酸缓冲液中，可以加入0.5～5.0克的胆固醇底物，以 及可以加入4～12克左右的表面活性剂，表面活性剂为Triton X-100： Triton X-114＝1∶1。
6.生物转化条件
生物转化温度为25～35℃；生物转化时间为1～9天；摇床转速为 200～300rpm。
5.结果与讨论
采用生长细胞生物转化法进行甾醇边链切除生产ADD和4-AD 的报道很多，本发明人在中国专利申请03142114.8中描述了利用生 长细胞在浊点系统中生物转化ADD和4-AD。本发明将描述利用静 息细胞在浊点系统中生物转化生产ADD和4-AD。静息细胞生物转 化的前提条件是生物转化和微生物生长过程具有独立性，可以在高细 胞浓度的条件下和在非无菌的条件下实现生物转化。为了考察这些因 素，进行了下列实验。
1)生物转化反应和细胞生长的独立性，以及非无菌操作的可能 性微生物生长和生物转化反应的独立性是决定能否采用静息细胞生 物转化的关键因素。考虑到微生物生长完全可能引起生物转化过程中 产物的积累，为了排除生物转化过程中微生物的生长，静息细胞生物 转化在磷酸缓冲液系统中进行。图1所示为不同条件下静息细胞生物 转化的结果。在这一细胞浓度下，ADD的产量与转化时间成正比例 间接地表明了细胞不生长，即生物转化和细胞生长的独立性。另外， 实验结果表明该系统可以在非无菌条件下操作。
2)不同生长周期的细胞在静息细胞浊点系统中生物转化ADD的 影响
收集不同生长周期的50ml微生物细胞，按静息细胞浊点系统进 行生物转化ADD，其结果如图2所示。结果表明：收集培养至第7 天的生长细胞制备成静息细胞，并在浊点系统中进行生物转化比较合 适。这可能是，细胞生长周期中不同时期其有关酶的催化活性不同， 一方面，可能是由于微生物的生长，使酶量增加；另一方面，可能是 由于酶的比活力随细胞的生长周期发生变化。一般地，酶活性是酶的 表达和降解、抑制或阻遏与激活消长的结果。希望得到的酶可能只在 某一特定的时间，如对数生长的后期、停滞期等最为有效。
3)细胞生长条件的选择
静息细胞生物转化的优势之一是细胞生长和生物转化的条件可 独立优化。在确定了最佳细胞收集时间为对数生长的后期的基础上， 分别用斜面培养基(去掉琼脂粉)、种子培养基、生长培养基在摇瓶 装量为50/500ml的条件下分别培养细胞3、5、7天后收集细胞。在 表面活性剂浓度为4g/100ml，底物浓度为3g/100ml，摇瓶装量为 20/250ml的条件下静息细胞生物转化培养1天。结果如表1所示。虽 然斜面培养基的细胞量大，但比酶活不高，微生物生长过程中生成生 物转化所需的酶系可能需要底物诱导。以总酶活为标准选择转化培养 基作为细胞生长和收集的培养基。
表1培养基的选择
      培养基   细胞量(g)  ADD浓度(mg/L)
      斜面培养基     1.5    110
      种子培养基     0.5    50
      转化培养基     0.7    310
4)温度对细胞活性的影响
温度对酶活性的影响常常比较显著。细胞浓度为1.4g细胞泥 /100ml，不同温度下静息细胞转化的结果如图3所示。在实验的温度 范围内，虽然温度升高，酶催化活性有一定的提高，但温度对酶活的 影响并不敏感。
5)浊点系统中表面活性剂浓度对静息细胞降解产物的影响
静息细胞在浊点系统中生物转化底物时同时伴随有转化产物 ADD的降解，其降解能力与构成浊点系统的表面活性剂浓度有关。 图4所示为浊点系统中表面活性剂浓度对静息细胞降解产物的影响。 这证实细胞不但能催化底物的生物转化，而且能催化产物的降解。细 胞的降解能力随表面活性剂浓度的增加而降低。在CPS萃取转化中， 产物原位萃取到凝聚层相，使反应相中的产物维持在较低水平而保护 了产物的降解。产物在两相中的分配由产物浓度和CPS的组成控制。 故细胞的降解能力随表面活性剂浓度的增加而降低。
6)底物浓度对细胞活性的影响
定义细胞活性为1g静息细胞生物转化底物1天时产生ADD的 量。文献报道甾醇的微生物转化在底物浓度高于12mM(约 0.5g/100ml)时存在底物抑制。但本实验结果表明(图5所示)，即使 底物浓度为1g/100ml时，细胞活性仍没受到影响。底物抑制作用的 消除可归因CPS中凝聚层相中表面活性剂的增溶作用。两相分配系 统常用于有毒底物的控制释放。底物增溶于凝聚层相并和稀相建立动 态平衡。微生物转化反应发生在两相界面或稀相，这样可保证微生物 反应所在相的底物浓度维持在一定水平，但低于其抑制浓度。
7)细胞浓度对细胞活性的影响
测定细胞浓度对细胞活性的影响是确定生物转化反应是传递控 制还是生物催化反应控制的关键。不同细胞浓度下静息细胞生物转化 的结果如图6所示。尽管文献报道这一转化过程是传递控制，但在实 验的细胞浓度范围内细胞活性不变，表明转化反应是由生物催化反应 控制。说明CPS提高了底物的生物利用度。
8)静息细胞在浊点系统中的生物转化活性随转化时间的变化
如图7所示(数据为图6中5种细胞浓度的平均值)，细胞活性 随转化反应的进行降低。细胞活性的降低可能是细胞失活、产物抑制、 降解等引起。由细胞的稳定性实验推测细胞失活的可能性不大。尽管 文献报道ADD抑制微生物呼吸过程，类似于底物在CPS中的增溶而 实现在两相的不均匀分配，ADD在细胞反应相的浓度高于产物抑制 浓度的可能性也不大。微生物进一步降解产物能较好地说明细胞活度 降低，随着转化反应时间的延长，产物浓度增加导致产物降解加剧， 细胞活度降低。活性可能不降低，而是产物浓度增加而导致降解速率 的增加。
9)表面活性剂浓度对细胞活性的影响
为了进一步确证CPS保护产物的降解，实验测定了表面活性剂 浓度对细胞活性的影响，结果如图8所示。生物转化过程中ADD的 积累是底物转化和产物降解两个过程相互消长的结果。细胞活性随表 面活性剂浓度的增加而上升和CPS保护产物降解一致。
10)生物催化剂的循环利用
为了考察静息细胞生物转化时酶的操作稳定性或批式操作间酶 的复活能力，在底物浓度为2.5g/100ml，细胞浓度为2g/100ml，表面 活性剂浓度为8g/100ml，转化时间为4天的条件下循环利用细胞的结 果如图9所示，虽然由于产物的抑制/降解，批式操作中细胞的催化 活性随时间延长而降低，但4次重复利用细胞其催化活性基本保持不 变。说明在排除产物的抑制/降解的条件下，细胞作为催化剂在循环 过程中的活力具有稳定性。

图1不同条件下生物转化ADD
转化系统的条件：1.4g微生物菌体，6g表面活性剂，每100ml 缓冲液含1.5g胆固醇。
图2不同生长周期的细胞在静息细胞浊点系统中生物转化 ADD的结果
转化系统的条件：由50ml微生物培养液收集的静息细胞，6g表 面活性剂，每100ml缓冲液含1.5g胆固醇。
图3不同温度下静息细胞生物转化ADD的结果
转化系统的条件：1.4g微生物菌体，6g表面活性剂，每100ml 缓冲液含1.5g胆固醇。
图4浊点系统中表面活性剂浓度对静息细胞降解产物的影响
转化系统的条件：1.4g微生物菌体，每100ml缓冲液含1.5g胆 固醇。
图5底物浓度对细胞活性的影响
转化系统的条件：1.4g微生物菌体，6g表面活性剂，每100ml 缓冲液含0.1～1.5g胆固醇。
图6细胞活性随细胞浓度的变化
转化系统的条件：每100ml缓冲液中含有4g表面活性剂和1.5g 胆固醇。
图7细胞活性随转化时间的变化
转化系统的条件：细胞浓度为图6中5种浓度的平均值，每100ml 缓冲液中含有4g表面活性剂和1.5g胆固醇。
图8细胞活性随表面活性剂浓度的变化
转化系统的条件：每100ml缓冲液中含有4.2g静息细胞和1.5g 胆固醇。
图9细胞的循环利用
转化系统的条件：每100ml缓冲液中含有2g静息细胞，2.5g胆 固醇和8g表面活性剂；转化时间为4天。

实施例1  静息细胞的制备
微生物菌种
微生物菌种Mycobaterium sp.NRRL B 3683。它能实现胆固醇的 边链切除，生成产物ADD和4-AD，其比例大概为10∶1。
培养基
斜面培养基(100ml)：
0.5g酵母浸出膏，1.2g琼脂粉，1g甘油，0.05g K2HPO4，0.1g (NH4)2SO4，0.05g MgSO4·7H2O或1.0g酵母浸出膏，1.5g琼脂粉，1.0g 葡萄糖，1.0g蛋白胨。培养温度25～35C，培养时间2～9天。
种子培养基(100ml)：
0.5g(NH4)2SO4，0.45g Na2HPO4，0.34g KH2PO4，0.05g  MgSO4·7H2O，1.0g甘油，0.2g胆固醇，0.2g非离子表面活性剂 Triton X-100。培养温度25～35C，培养时间2～9天。
生长培养基(100ml)： 1.0g(NH4)2SO4，0.45g Na2HPO4，0.34g KH2PO4，0.2g MgSO4.7H2O， 0.5g胆固醇，2.0g非离子表面活性剂Triton X-100。培养温度25～35C， 培养时间2～9天。
细胞收获和静息细胞的制备：
将接种在上述培养基上的微生物菌种培养至2～9天后，经离心分 离加以收集微生物细胞；然后用磷酸缓冲液(100ml溶液中含 0.45gNa2HPO4，0.34gKH2PO4)洗涤3次，以去除粘附在微生物细胞 上的营养成分和其他成分，减少所获得的静息细胞在浊点系统中进行 生物转化时的干扰。由此获得的静息细胞保藏在-20C的冰箱中备用。
实施例2  静息细胞在浊点系统中的生物转化
以胆固醇作为底物，浓度为3g/100ml；以表面活性剂Triton X-100 和Triton X-114，浓度为4g/100ml(Triton X-100：Triton X-114＝1∶1)； 取实施例1方法制得的静息细胞细胞浓度为48g/L条件下转化5天； ADD浓度达5000mg/L。
实施例3
以胆固醇作为底物，浓度为3g/100ml；以表面活性剂Triton X-100 和Triton X-114，浓度为4g/100ml(Triton X-100：Triton X-114＝1∶1)； 取实施例1方法制得的静息细胞细胞浓度为225g/L条件下转化1天； ADD浓度达3800mg/L。
实施例4
以胆固醇作为底物，浓度为2.5g/100ml；以表面活性剂 Triton X-100和Triton X-114，浓度为10g/100ml(Triton X-100： Triton X-114＝1∶1)；取实施例1方法制得的静息细胞浓度为200g/L 条件下转化4～5天；ADD浓度达12000mg/L。
实施例5
以胆固醇作为底物，浓度为2.5g/100ml；以表面活性剂 Triton X-100和Triton X-114，浓度为8g/100ml(Triton X-100： Triton X-114＝1∶1)；取实施例1方法制得的静息细胞浓度为200g/L 条件下转化时间4天；循环利用细胞4次；ADD浓度分别可以达到 12000、12000、11500和11400mg/L左右。
实施例6    静息细胞系统与生长细胞系统的比较。
以胆固醇作为底物，度为2.5g/100ml；以表面活性剂Triton X-100 和Triton X-114，浓度为8g/100ml(Triton X-100：Triton X-114＝1∶1) 组成生物转化的浊点系统。用生长细胞转化7天，ADD浓度可以达 到9000mg/L左右，而用取实施例1方法制得的静息细胞浓度为 200g/L，转化时间4天；循环利用细胞4次的条件；ADD浓度分别 可以达到12000、12000、11500和11400mg/L左右。由此比较：利 用静息细胞浊点生物转化系统具有明显的优越性。
实施例7
在实施例1静息细胞制备过程中，去除种子培养基和生长培养基 中的胆固醇和表面活性剂后，进行静息细胞的培养和收集。然后同实 施例2的方法进行生物转化，ADD浓度达3500mg/L。