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一种microRNA-150纳米粒子的制备方法

阅读：956发布：2021-02-25

IPRDB可以提供一种microRNA-150纳米粒子的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种microRNA-150纳米粒子的制备方法，包括制备包载miR-150的PEI-PLGA纳米粒子以及建立小鼠呼吸道过敏模型，通过运用miR-150纳米粒子治疗呼吸道过敏小鼠，并观察其疗效；通过构建PLGA高分子纳米粒子，构建出以PLGA为核心包裹miR-150的纳米粒子，表面通过连接PEI支链修饰，从而增加其对miR-150的保护作用，提高细胞摄取率，以及其进入细胞后miR-150释放效率，且通过滴鼻给药途径中使其更易通过鼻纤维粘液毯的屏障作用，充分发挥局部黏膜免疫作用既可诱导调控血清中抗原特异性抗体的产生，直接在黏膜系统表面形成防护网，在动物实验中发现其可有效治疗和缓解模型小鼠的呼吸道过敏症状，使得呼吸道过敏症状明显好转，血清TH2细胞因子明显下降。，下面是一种microRNA-150纳米粒子的制备方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种microRNA-150纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括制备包载miR-150的PEI-PLGA纳米粒子以及建立小鼠呼吸道过敏模型，通过运用miR-150纳米粒子治疗呼吸道过敏小鼠，并观察其疗效；具体分为以下步骤：S1：取PLGA(分子量为：40kDa)32mg和PEI(分子量：25kDa)100ug溶于1ml二氯甲烷(DCM)中；

S2：将miR-150(283.5uG)与4mg的乙酰胎牛血清预先溶解于0.2ml 1X的Tris-EDTA缓冲液中；

S3：将S2中配置好的缓冲液加入S1的有机相中(PEI和miR-150的摩尔比为1∶8)，然后冰浴中进行超声处理(3W)1min，形成油包水乳液；

S4：向S3中加入6ml 2％的聚乙烯醇溶液(PVA溶液)，再次冰浴超声3min(9W)，形成复乳；

S5：向S4中加入ddH2O至20ml，室温条件下搅拌18h，使有机溶剂完全挥发，10000×g离心10min，用双蒸水洗3次，离心，收集沉淀，置于低温冷冻干燥机中24h，收集干燥的粉末，4℃保存；

S6：常规实验室OVA致敏法制备小鼠呼吸道过敏模型，将4-6周龄、雄性BALB/c小鼠分别在第1、7天接受腹腔注射；

S7：过敏模型组小鼠每只腹腔注射200μl致敏液(小鼠卵清蛋白OVA50ug、氢氧化铝AL(OH)50ug、溶于PBS，pH7.2)；对照组以PBS代替致敏液注射，注射部位及注射剂量与其他组相同，在第14天给予鼻腔激发，每天一次，观察激发后，小鼠喷嚏次数、抓鼻次数、分泌物量、状态；

S8：免疫治疗变应性鼻炎小鼠；在第28天根据分组情况治疗组给予S5中制备好的miR-

150纳米粒子治疗，另设正常小鼠为空白对照组，小鼠每天接受一次滴鼻治疗，共7次；

S9：通过HE染色观察小鼠鼻腔和肺组织病理改变以及采用real-timePCR检测小鼠肺组织中miR-150的表达，以及ELISA分析小鼠血清特异性IgE的变化情况。

2.根据权利要求1所述的一种microRNA-150纳米粒子的制备方法，其特征在于，通过real-time PCR检测，miR-150明显减少，采用miR-150纳米粒子治疗后，可上调miR-150的表达。

3.根据权利要求1所述的一种microRNA-150纳米粒子的制备方法，其特征在于，通过ELISA检测，miR-150纳米粒子治疗能有效减少呼吸道过敏小鼠血清中特异性IgE的含量。

4.根据权利要求1所述的一种microRNA-150纳米粒子的制备方法，其特征在于，通过HE染色观察到呼吸道过敏小鼠鼻粘膜上皮细胞水肿、坏死、排列紊乱、炎性细胞浸润病理改变，其支气管腔内上皮细胞脱落，分泌物增多，周围炎性细胞侵润，气管壁增厚及气道重塑；

经miR-150纳米粒子治疗后，能有效治疗小鼠呼吸道过敏性疾病造成的呼吸道病理改变，缓解呼吸道过敏症状。

5.根据权利要求1所述的一种microRNA-150纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述PLGA纳米粒子为一种制备高效、靶向的基因治疗载体系统的良好介质，其采用有机溶剂挥发法制备PLGA纳米粒子包载药物，具备生物兼容性、可生物降解性、无毒性、无免疫原性以及体内可以代谢降解诸多良好的生物学优点。

说明书全文

一种microRNA-150纳米粒子的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及污泥处理技术领域，具体为一种microRNA-150纳米粒子的制备方法。

背景技术

[0002] MicroRNA：MicroRNA(miR)是一类非编码单链小分子RNA，能够与特定的mRNA结合，通过与靶基因mRNA3`非翻译区(3`UTR)的完全或不完全配对，降解靶基因mRNA或抑制其翻译，从而对蛋白的编码基因进行转录后调控，参与个体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生命活动。

[0003] microRNA-150(miR-150)是一个长度为22个核苷酸的单链小分子RNA，定位于人类染色体19q13.33，通过特异性结合下游靶基因参与多种信号通路的调控，包括MYB，FLT3，CBL，EGR2，DKC1，AKT2和Notch3等；参与免疫细胞的分化和成熟，并通过转录后调控多种免疫应答的发生，在肿瘤、炎症、免疫系统疾病、心血管疾病等各种疾病的发挥重要作用。目前miR-150呼吸道过敏性疾病的研究仍较为缺乏，前期研究发现miR-150在呼吸道过敏性疾病的动物体内表达降低，与其发病机制Th1/Th2平衡密切相关，并通过过表达miR-150能有效治疗并缓解模型动物呼吸道过敏症状。

[0004] 纳米粒子是指粒度在1-100nm之间的粒子(纳米粒子又称超细微粒)。由于材料及制备工艺的不同，也可形成纳米微球(nanospheres)和纳米微囊(nanocapsules)。药物可以吸附在其表面或封包于其内部，保护其携带的有效成分或基因信息，不被体内、外环境破坏，实现对携带药物的靶向性运输。

[0005] PLGA是通过认证的聚乳酸-羟基乙酸共聚化合物，被广泛应用于制药、医用工程材料和现代化工业领域。目前常采用有机溶剂挥发法制备PLGA纳米粒子包载药物，其具备生物兼容性、可生物降解、基本无毒性、无免疫原性以及体内可以代谢降解等诸多良好的生物学优点而成为制备高效、靶向的基因治疗载体系统的良好介质。

[0006] 目前，miR-150在肿瘤诊断和治疗领域已有大量研究报道，miR-150抑制剂作为抗肿瘤药物抑制肿瘤细胞的生长和增殖，以及增加其耐药性等多方面作用。中山大学专利《miR-150抑制剂在制备结直肠癌耐药逆转剂》(申请公布号：CN 103721268)提供了miR-150抑制剂在制备结直肠癌耐药逆转剂上的应用，尤其是miR-150抑制剂在制备HCT-116系和/或HT-29系结直肠癌细胞耐药逆转剂上的应用。以及苏州吉玛基因药物科技有限公司申请的专利《人miR-150反义核酸及其应用》(CN 102031254A)公开了一种用于抑制miR-150表达的反义寡核苷酸及其有效抑制人脑胶质瘤细胞U87中miR-150的表达，同时抑制上述细胞生长和增殖。但目前尚未见miR-150用于呼吸道过敏性疾病的治疗报道。

[0007] 呼吸道过敏性疾病(Allergic airway disease，AAD)：是一种由多种炎性细胞共同参与的呼吸道免疫调节异常性疾病，主要包括过敏性鼻炎(AR)与过敏性哮喘(AS)。上、下气道在组织结构上是连续的，AR、AS有着相似的流行病学、病因、发病机制、临床表现及治疗原则和措施。世界卫生组织(WHO)也提出了“同一气道，一种疾病”的观点，并将其列为“21世纪重点研究和防治的三大疾病之一”。据统计，过去十年AAD发病率在世界范围内增加了3倍，其中AR总患病率已高达20％-30％，近年来随着空气环境污染的加剧，其发病率仍呈逐年上升趋势，其发病机制尚不完全清楚，目前临床上常使用抗组胺或激素等对症治疗来缓解病情，特异性免疫疗法(SIT)虽是WHO公认的唯一对因治疗过敏性疾病的方法，但其治疗效果不理想，治疗周期长，病人依从性低，且有诱发加重哮喘甚至引起过敏性休克等多种缺陷。因此，积极开展过敏性疾病发病机制的研究寻找新的治疗手段显得刻不容缓。

发明内容

[0008] 本发明的目的在于提供一种microRNA-150纳米粒子的制备方法，制备包载miR-150的PEI-PLGA纳米粒子，通过滴鼻疗法治疗呼吸道过敏小鼠，评价miR-150纳米粒子治疗呼吸道过敏性疾病的疗效，可有效缓解并治疗呼吸道过敏症状，以解决上述背景技术中提出的其治疗效果不理想，治疗周期长，病人依从性低，且有诱发加重哮喘甚至引起过敏性休克等多种缺陷问题。

[0009] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种microRNA-150纳米粒子的制备方法，包括制备包载miR-150的PEI-PLGA纳米粒子以及建立小鼠呼吸道过敏模型，通过运用miR-150纳米粒子治疗呼吸道过敏小鼠，并观察其疗效；具体分为以下步骤：

[0010] S1：取PLGA(分子量为：40kDa)32mg和PEI(分子量：25kDa)100ug溶于1ml二氯甲烷(DCM)中；

[0011] S2：将miR-150(283.5uG)与4mg的乙酰胎牛血清预先溶解于0.2ml 1X的Tris-EDTA缓冲液中；

[0012] S3：将S2中配置好的缓冲液加入S1的有机相中(PEI和miR-150的摩尔比为1∶8)，然后冰浴中进行超声处理(3W)1min，形成油包水乳液；

[0013] S4：向S3中加入6ml 2％的聚乙烯醇溶液(PVA溶液)，再次冰浴超声3min(9W)，形成复乳；

[0014] S5：向S4中加入ddH2O至20ml，室温条件下搅拌18h，使有机溶剂完全挥发，10000×g离心10min，用双蒸水洗3次，离心，收集沉淀，置于低温冷冻干燥机中24h，收集干燥的粉末，4℃保存；

[0015] S6：常规实验室OVA致敏法制备小鼠呼吸道过敏模型，将4-6周龄、雄性BALB/c小鼠分别在第1、7天接受腹腔注射；

[0016] S7：过敏模型组小鼠每只腹腔注射200μl致敏液(小鼠卵清蛋白OVA50ug、氢氧化铝AL(OH)50ug、溶于PBS，pH7.2)；对照组以PBS代替致敏液注射，注射部位及注射剂量与其他组相同，在第14天给予鼻腔激发，每天一次，观察激发后，小鼠喷嚏次数、抓鼻次数、分泌物量、状态；

[0017] S8：免疫治疗变应性鼻炎小鼠：在第28天根据分组情况治疗组给予S5中制备好的miR-150纳米粒子治疗，另设正常小鼠为空白对照组，小鼠每天接受一次滴鼻治疗，共7次；

[0018] S9：通过HE染色观察小鼠鼻腔和肺组织病理改变以及采用real-timePCR检测小鼠肺组织中miR-150的表达，以及ELISA分析小鼠血清特异性IgE的变化情况。

[0019] 优选的，通过real-time PCR检测，miR-150明显减少，采用miR-150纳米粒子治疗后，可上调miR-150的表达。

[0020] 优选的，通过ELISA检测，miR-150纳米粒子治疗能有效减少呼吸道过敏小鼠血清中特异性IgE的含量。

[0021] 优选的，通过HE染色观察到呼吸道过敏小鼠鼻粘膜上皮细胞水肿、坏死、排列紊乱、炎性细胞浸润病理改变，其支气管腔内上皮细胞脱落，分泌物增多，周围炎性细胞侵润，气管壁增厚及气道重塑；经miR-150纳米粒子治疗后，能有效治疗小鼠呼吸道过敏性疾病造成的呼吸道病理改变，缓解呼吸道过敏症状。

[0022] 优选的，所述PLGA纳米粒子为一种制备高效、靶向的基因治疗载体系统的良好介质，其采用有机溶剂挥发法制备PLGA纳米粒子包载药物，具备生物兼容性、可生物降解性、无毒性、无免疫原性以及体内可以代谢降解诸多良好的生物学优点。

[0023] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：

[0024] 1、本microRNA-150纳米粒子的制备方法，与现有技术相比扩大了miR-150的运用领域，现有技术是通过使用miR-150反义核酸或者miR-150抑制剂，降低miR-150在肿瘤的表达，从而达到抑制肿瘤生长或制备肿瘤耐药逆转剂；本发明通过纳米粒子包载miR-150，提高机体miR-150的含量，从而缓解了呼吸道过敏反应的症状，扩大了miR-150在疾病诊疗过程中的应用领域。

[0025] 2、本microRNA-150纳米粒子的制备方法，通过纳米粒子包裹，保护miR-150在机体内外不被RNA酶降解，到达靶向细胞发挥其免疫活性作用；PLGA是通过美国FDA认证的聚乳酸-羟基乙酸共聚化合物，被广泛应用于制药、医用工程材料和现代化工业领域，目前常采用有机溶剂挥发法制备PLGA纳米粒子包载药物，其具备生物兼容性、可生物降解、基本无毒性、无免疫原性以及体内可以代谢降解等诸多良好的生物学优点而成为制备高效、靶向的基因治疗载体系统的良好介质。

附图说明

[0026] 图1为本发明中所制备的microRNA-150纳米粒子透射电镜图；

[0027] 图2为本发明免疫治疗变应性鼻炎小鼠方案图；

[0028] 图3为本发明为小鼠鼻中隔和肺组织病理切片HE染色图；

[0029] 图4为本发明real-time PCR检测结果图；

[0030] 图5为本发明ELISA检测结果图。

具体实施方式

[0031] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0032] 一种microRNA-150纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

[0033] 实施例一：制备包载miR-150的PEI-PLGA纳米粒子；

[0034] 步骤一：取PLGA(分子量为：40kDa)32mg和PEI(分子量：25kDa)100ug溶于1ml二氯甲烷(DCM)中；

[0035] 步骤二：将miR-150(283.5uG)与4mg的乙酰胎牛血清预先溶解于0.2ml 1X的Tris-EDTA缓冲液中；

[0036] 步骤三：将步骤二加入步骤一的有机相中(PEI和miR-150的摩尔比为1∶8)，然后冰浴中进行超声处理(3W)1min，形成油包水乳液；

[0037] 步骤四：向步骤三中加入6ml 2％的聚乙烯醇溶液(PVA溶液)，再次冰浴超声3min(9W)，形成复乳；

[0038] 步骤五：向步骤四中加入ddH2O至20ml，室温条件下搅拌18h，使有机溶剂完全挥发，10000×g离心10min，用双蒸水洗3次，离心，收集沉淀，置于低温冷冻干燥机中24h，收集干燥的粉末，4℃保存，得microRNA-150纳米粒子。

[0039] 请参阅图1，透射电镜显示经过上述步骤制备而成的microRNA-150纳米粒子，表面光滑成球形，直径约180-230nm。

[0040] 实施例二：建立小鼠呼吸道过敏模型，通过运用miR-150纳米粒子治疗呼吸道过敏小鼠，并观察其疗效；

[0041] 步骤六：常规实验室OVA致敏法制备小鼠呼吸道过敏模型，将4-6周龄、雄性BALB/c小鼠分别在第1、7天接受腹腔注射(方案见图1)；

[0042] 步骤七：其中过敏模型组小鼠每只腹腔注射200μl致敏液(小鼠卵清蛋白OVA50ug、氢氧化铝AL(OH)50ug、溶于PBS，pH7.2)；对照组以PBS代替致敏液注射，部位及注射剂量与其他组相同，在第14天给予鼻腔激发，每天一次，观察激发后，小鼠喷嚏次数、抓鼻次数、分泌物量、状态；

[0043] 步骤八：免疫治疗变应性鼻炎小鼠：在第28天根据分组情况治疗组给予miR-150纳米粒子治疗，另设正常小鼠为空白对照组，小鼠每天接受一次滴鼻治疗，共7次(治疗方案见图1)；

[0044] 步骤九：通过HE染色观察小鼠鼻腔和肺组织病理改变(如图2)；采用real-timePCR检测小鼠肺组织中miR-150的表达(见图3)；通过ELISA分析小鼠血清特异性IgE的变化情况(见图4)。

[0045] 请参阅图2-5，检测结果：图3中，A-健康PBS致敏小鼠鼻中隔，B-呼吸道过敏小鼠鼻中隔，C-miR-150纳米粒子治疗后小鼠鼻中隔；D-健康PBS致敏小鼠肺内细支气管，E-呼吸道过敏小鼠肺内细支气管，F-miR-150纳米粒子治疗后小鼠肺内细支气管。

[0046] 由图3可见：呼吸道过敏小鼠鼻粘膜上皮细胞水肿、坏死、排列紊乱、炎性细胞浸润等病理改变，支气管腔内上皮细胞脱落，分泌物增多，周围炎性细胞侵润，气管壁增厚及气道重塑；经miR-150纳米粒子治疗后，上述情况明显好转；说明miR-150纳米粒子能有效治疗小鼠呼吸道过敏性疾病造成的呼吸道病理改变，缓解呼吸道过敏症状。

[0047] 由图4可见：与正常小鼠相比呼吸道过敏性疾病小鼠肺组织中，通过real-time PCR检测，miR-150明显减少，通过miR-150纳米粒子治疗后，可上调miR-150的表达。

[0048] 由图5可见：通过ELISA检测，miR-150纳米粒子治疗能有效减少呼吸道过敏小鼠血清中特异性IgE的含量。

[0049] 综上所述：本microRNA-150纳米粒子的制备方法，首先确定了在呼吸道过敏性疾病中miR-150低表达，并通过过表达miR-150缓解并治疗呼吸道过敏症状；通过分枝PEI修饰PLGA纳米粒包裹miR-150，通过滴鼻治疗过敏性鼻炎小鼠，小鼠鼻粘膜和肺组织是miR-150表达增高，呼吸道过敏症状明显好转，血清TH2细胞因子下降；通过构建PLGA高分子纳米粒子，构建出以PLGA为核心包裹miR-150的纳米粒子，表面通过连接PEI支链修饰，从而增加其对miR-150的保护作用，提高细胞摄取率，以及其进入细胞后miR-150释放效率，且通过滴鼻给药途径中使其更易通过鼻纤维粘液毯的屏障作用，充分发挥局部黏膜免疫作用既可诱导调控血清中抗原特异性抗体的产生，直接在黏膜系统表面形成防护网，在动物实验中发现其可有效治疗和缓解模型小鼠的呼吸道过敏症状，有望开发成为一种靶向性免疫治疗呼吸道过敏性疾病的新型药物。

[0050] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

标题	发布/更新时间	阅读量
纳米粒子-专利编号CN102292411B	2020-05-12	377
纳米粒子-专利编号CN102741297A	2020-05-12	357
纳米粒子-专利编号CN101611084B9	2020-05-11	498
纳米粒子-专利编号CN104371704A	2020-05-11	404
纳米粒子-专利编号CN101765649A	2020-05-12	912
纳米粒子-专利编号CN101495558A	2020-05-13	341
Cu2ZnSnS4纳米粒子-专利编号CN105164047A	2020-05-13	217
纳米粒子-专利编号CN102741297B	2020-05-11	360
纳米粒子-专利编号CN102292411A	2020-05-11	691
Cu2XSnY4纳米粒子-专利编号CN108383090A	2020-05-13	1031

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