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一种鉴定中药材骨碎补的SCAR分子标记及其应用

阅读：274发布：2021-01-14

IPRDB可以提供一种鉴定中药材骨碎补的SCAR分子标记及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明属于物种鉴定领域，具体涉及一种鉴定中药材骨碎补的SCAR分子标记、分子标记的构建方法、特征性扩增引物及其应用。本发明公布了鉴定中药材骨碎补正伪品的SCAR分子标记的构建方法，三个SCAR分子标记，以及对应的特征性扩增引物，鉴定方法及应用。本发明SCAR分子标记更加经济方便，不用经历PCR产物纯化、测序等步骤，能大大节约鉴定成本；更加准确和稳定；不需要分类学背景的专家、不需要经历次级代谢产物提取与检测分析等步骤，就能对中药村进行更加快捷高效的鉴定。本发明可以实现骨碎补药材的准确鉴定，突破了传统药材识别的局限，解决了骨碎补药材混伪品滥用的问题，有利于提高用药的安全性和有效性，有较高的应用价值。，下面是一种鉴定中药材骨碎补的SCAR分子标记及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种高效鉴定中药材骨碎补的SCAR分子标记，其特征在于：该分子标记为trnS-psb30，其序列如SEQ ID No.1所示，或ndhB-trnR，其序列如SEQ ID No.2所示，或rbcL-accD，其序列如SEQ ID No.3所示，鉴定的范围包括中药材骨碎补槲蕨(Drynaria roosi)及

6种混伪品团叶槲蕨(D.boni),石莲姜槲蕨(D.propinqua)；崖姜(Pseudodrynaria coronans)，中华槲蕨(D.sinica)；栎叶槲蕨(D.quercifolia)；川滇槲蕨(D.delavayi)；大叶骨碎补(Davalia formosana)。

2.如权利要求1所述的高效鉴定中药材骨碎补的SCAR分子标记的构建方法，包括以下步骤：

1)对包含中药材骨碎补在内的7个物种的DNA提取后进行DNA文库构建，

2)通过二代测序获得原始reads，经组装、拼接得到21个叶绿体全基因组，对叶绿体基因进行注释后，对骨碎补和6个混伪品的叶绿体基因组进行比对，分析高变异的DNA片段，进一步比对高变异的DNA序列，筛选出3个片段作为SCAR分子标记，

3)针对筛选出的片段设计特征性扩增引物，用相对应的引物进行PCR鉴定，结果成功构建出能准确鉴定骨碎补的三个SCAR分子标记，它们分别是trnS-psb30，ndhB-trnR和rbcL-accD。

3.如权利要求1所述的高效鉴定中药材骨碎补的SCAR分子标记的特征性扩增引物，其特征在于：第一引物序列为：正向引物S30F:TCCGACGCTTTAAACCCCT

反向引物S30R:TTGCGCAATTGTTTCTAAATTCATT；

或第二引物序列：

正向引物BRF:ATCCCATCCTTCCTTTGT

反向引物BRR:TTAGGAATATCTAACCAGAAC；

或者第三引物序列为：

正向引物LDF:GAGTATCGGTAAGGAGTTCACC

反向引物LDR:GTCTTGCTGCTCTCTATCTTTCTTC，

其中所述第一引物对为在SEQ ID No.1所示的分子标记trnS-psb30上设计的SCAR标记引物，其序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示；所述第二引物为在SEQ ID No.2所示的分子标记ndhB-trnR上设计的SCAR标记引物，其序列如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示；所述第三引物对为在SEQ ID No.3所示的分子标记rbcL-accD上设计的SCAR标记引物，其序列如SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示。

4.如权利要求1所述的高效鉴定中药材骨碎补的SCAR分子标记的应用，其特征在于-，包括以下步骤：

1)待检测样品槲蕨和其他常混用做骨碎补蕨类的根茎DNA提取，并对所得DNA进行电泳检测样本DNA的完整性；

2)用步骤1中得到的样品DNA为模板，构建专用PCR反应体系，利用权利要求2所述的三对引物其中之一进行PCR扩增；

3)利用琼脂糖凝胶电泳对步骤2得到的PCR扩增产物进行检测，由所述第一引物对扩增得到的第一PCR产物的长度在骨碎补中的为388bp,混伪品中的长度为596-623bp；由所述第二引物对扩增得到的第二PCR产物的长度在骨碎补中的为104bp，在混伪品中没有扩增产物；由所述第三引物对扩增得到的第三PCR产物的长度在骨碎补中的为1733bp，在混伪品中没有扩增产物。

5.根据权利要求4所述的高效鉴定中药材骨碎补的方法，其特征在于，所述的步骤2)中当用第一引物对和第二引物对进行PCR扩增时，专用PCR反应程序为：1)94℃预变性4分钟，

2)94℃变性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸50秒，该程序循环35次，3)72℃延伸6分钟；当用第三引物对进行扩增时，专用PCR反应程序为：1)94℃预变性4分钟，2)94℃变性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸2分钟，该程序循环35次，3)72℃延伸6分钟。

6.根据权利要求4或5所述的高效鉴定中药材骨碎补的方法，其特征在于：步骤2)中所述的PCR扩增所使用的专用PCR反应体系为：2X Master Mix为10μL；正向引物1μL，反向引物

1μL，DNA为0.5μg，加水至总体积为20μL。

说明书全文

一种鉴定中药材骨碎补的SCAR分子标记及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于物种鉴定领域，具体涉及用于鉴定中药材骨碎补的SCAR分子标记，分子标记的构建方法，特征性扩增引物及其应用。

背景技术

[0002] 中药材的准确鉴定是中医药事业运行和发展的基本环节。中药材质量不稳定仍是中药发展面临的一个重大问题，造成这个问题的一个主要原因是同种药材来源复杂，特别是中药材在传承过程中存在同物异名、同名异物等现象药导致同一种药材的使用植物种类繁多、来源复杂。很多情况下，多种同属植物作为一种药材使用，而其鉴定与质量控制都尚难尽如人意。由于药材之间形态、结构极近似，性状、显微(组织构造和粉末)等传统鉴定方法有比较大的难度，即使是有丰富经验的专业人员或药师，也费时费力，并且不能保证精确无误。因而，有必要建立更加准确、快速、可靠的多来源药材鉴定和质量评价体系。

[0003] 槲蕨(Drynaria roosi)为槲蕨科(Drynariaceae)植物。其干燥根状茎为我国的传统中药材骨碎补；柚皮苷为主要药效成分，《中华人民共和国药典》规定干燥品中不得低于0.5％。市场上出现的骨碎补混伪品药材只含有微量甚至不含柚皮苷，主要包括团叶槲蕨(D.boni),石莲姜槲蕨(D.propinqua)；崖姜蕨(Pseudodrynaria coronans)，中华槲蕨(D.sinica)；栎叶槲蕨(D.quercifolia)；川滇槲蕨(D.delavayi)；大叶骨碎补(Davalia formosana)。它们在形态上非常相似，很难区分，经常会被当作中药材骨碎补使用。错误的使用可能降低用药的有效性并存在用药安全的隐患。同一科属的蕨类植物具有相似的形态学特征，需要经验丰富的分类专家才能准确鉴定，且鉴定过程极为繁琐。

[0004] 随着分子生物学技术的发展，基于DNA序列变异的分子生物学手段是中药材鉴定的重要方法，在中药材的鉴定中广泛应用。近年来，随着DNA条形码技术的发展，DNA条形码已经发展成为物种鉴定的重要工具，在中药材的鉴定中应用广泛。然而，传统DNA条形码存在以下问题：1、这些传统DNA条形码在不同植物类群中的鉴定能力存在较大差异，没有一个DNA条形码能适用于所有植物类群，针对某一特定类群，需要进行重新筛选，而已有可作为DNA条形码筛选的基因较少，2、单一DNA条形码所包含的变异位点较少，且变异位点多为单核苷酸突变位点，所合成引物往往表现扩增效率和测序成功率低，其物种鉴定能力有限，3、传统DNA条形码需经过DNA测序和序列比对实现物种鉴定，成本较高。通过比较不同物种的叶绿体全基因组序列，可以发掘叶绿体基因组在不同物种间的特征性区域，从而可以开发出特定物种的序列特征性扩增区域(SCAR)标记，用于特定物种的鉴定。相对于RAPD、SSR等传统的分子标记，本发明开发的SCAR分子标记具有所用引物较长且引物序列与模板DNA完全互补，可在严谨条件下进行扩增，扩增产物特异性强，检测结果稳定性好、可重复性强。由于上述优点，SCAR分子标记成为目前中药材分子鉴定的重要工具。

发明内容

[0005] 针对以上技术问题，本发明旨在提供一种鉴定中药材骨碎补的SCAR分子标记，分子标记的构建方法，特征性扩增引物及其应用。

[0006] 本发明的技术方案如下：

[0007] 一种高效鉴定中药材骨碎补的SCAR分子标记，该分子标记是序列列为SEQ ID No.1所示的trnS-psb30，或序列为SEQ ID No.2所示的ndhB-trnR，或序列为SEQ ID No.3所示的rbcL-accD，所鉴定的的中药材包括骨碎补及其常用混伪品：槲蕨(Drynaria roosii)，团叶槲蕨(D.bonii),石莲姜槲蕨(D.propinqua)；崖姜槲(Pseudodrynaria coronans)，中华槲蕨(D.sinica)；栎叶槲蕨(D.quercifolia)；川滇槲蕨(D.delavayi)；大叶骨碎补(Davallia formosana)。

[0008] 所述的高效鉴定中药材骨碎补的SCAR分子标记的构建方法，包括以下步骤：

[0009] 1)对包含中药材骨碎补及其混伪品在内的7个物种的DNA提取后进行DNA文库构建，

[0010] 2)通过二代测序获得原始reads，经组装、拼接得到21个叶绿体全基因组，对叶绿体基因进行注释后，对骨碎补和6个混伪品的叶绿体基因组进行比对，分析高变异的DNA片段，进一步比对高变异的DNA序列，筛选出3个片段作为SCAR分子标记，

[0011] 3)针对筛选出的片段设计骨碎补特征性扩增引物，用相对应的引物进行PCR鉴定，结果成功构建出能准确鉴定骨碎补的三个SCAR分子标记，它们分别是trnS-psb30，ndhB-trnR和rbcL-accD。

[0012] 所述的高效鉴定中药材骨碎补正伪的SCAR分子标记的特征性扩增引物，其特征在于：第一引物序列为：

[0013] 正向引物S30F:TCCGACGCTTTAAACCCCT

[0014] 反向引物S30R:TTGCGCAATTGTTTCTAAATTCATT；

[0015] 或第二引物序列：

[0016] 正向引物BRF:ATCCCATCCTTCCTTTGT

[0017] 反向引物BRR:TTAGGAATATCTAACCAGAAC；

[0018] 或者第三引物序列为：

[0019] 正向引物LDF:GAGTATCGGTAAGGAGTTCACC

[0020] 反向引物LDR:GTCTTGCTGCTCTCTATCTTTCTTC，

[0021] 其中所述第一引物对为在SEQ ID No.1所示的分子标记trnS-psb30上设计的SCAR标记引物，其序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示；所述第二引物对为在SEQ ID No.2所示的分子标记ndhB-trnR上设计的SCAR标记引物，其序列如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示；所述第三引物对为在SEQ ID No.3所示的分子标记rbcL-accD上设计的SCAR标记引物，其序列如SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示。

[0022] 利用上述分子标记高效鉴定中药材骨碎补的方法，包括以下步骤：

[0023] 1)待检测样品槲蕨和其他骨碎补混伪品蕨类根茎DNA提取，并对所得DNA进行电泳检测样本DNA的完整性；

[0024] 2)用步骤1中得到的样品DNA为模板，构建专用PCR反应体系，利用上述所述的三对引物其中之一进行PCR扩增；

[0025] 3)利用琼脂糖凝胶电泳对步骤2得到的PCR扩增产物进行检测，由所述第一引物对扩增得到的第一PCR产物的长度在骨碎补中的为388bp,混伪品中的长度为596-612bp；由所述第二引物对扩增得到的第二PCR产物的长度在骨碎补中的为104bp，在混伪品中没有扩增产物；由所述第三引物对扩增得到的第三PCR产物的长度在骨碎补中的为1733bp，在混伪品中没有扩增产物。

[0026] 进一步地，所述的步骤2)中当用第一引物对和第二引物对进行PCR扩增时，专用PCR反应程序为：1)94℃预变性4分钟，2)94℃变性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸50秒，该程序循环35次，3)72℃延伸6分钟；当用第三引物对进行扩增时，专用PCR反应程序为：1)94℃预变性4分钟，2)94℃变性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸2分钟，该程序循环35次，3)72℃延伸6分钟。

[0027] 进一步地，步骤2)中所述的PCR扩增所使用的专用PCR反应体系为：2X Master Mix为10μL；前引物1μL，后引物1μL，DNA为0.5μg，加水至总体积为20μL。

[0028] 工作原理：

[0029] 本发明在完成不同物种总共21个个体叶绿体完整基因组测序的基础上，通过基因组序列比较，发掘存在插入或缺失等序列分化较大的DNA区域，设计出能在骨碎补中扩增到特异DNA片段的引物，共筛选到三个DNA片段在骨碎补中存在特异性的缺失/插入。针对这些插入/缺失已设计出的特征性扩增引物，从而开发SCAR标记作为骨碎补分子鉴定的DNA分子标记。通过PCR反应检测产物片段的有无或根据片段大小进行骨碎补鉴定，即利用前述三对引物，以待检测骨碎补样本DNA为模板，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若用第一引物对扩增得到的PCR产物的长度为388bp,检测为骨碎补，若长度为596-612bp，则检测为混伪品；若用第二引物对扩增得到的PCR产物的长度为104bp,检测为骨碎补，若没有扩增产物而为混伪品；若用第三引物对扩增得到的PCR产物的长度为1733bp,检测为骨碎补，若没有扩增产物而为混伪品。

[0030] 与现有技术相比，本发明的有益效果：

[0031] 1)本发明开发的这种特异性片段的DNA分子标记相对于传统DNA条形码，更加经济方便，不用经历PCR产物纯化、测序等步骤，能大大节约鉴定成本；

[0032] 2)相对于传统DNA分子标记技术，SCAR标记技术更加准确和稳定；相对传统的形态学和化学鉴定方法，DNA标记鉴定不需要分类学背景的专家、不需要经历次级代谢产物提取与检测分析等步骤，能对中药村进行更加快捷高效的鉴定。

[0033] 3)本发明可以实现骨碎补药材的准确鉴定，突破了传统药材识别的局限，解决了骨碎补药材滥用的问题，有利于提高用药的安全性和有效性，有较高的应用价值。

[0034] 附图及附图说明

[0035] 图1为分子标记trnS-psb30上第一特征性引物对所处位置及PCR扩增电泳图，其中1-6泳道为骨碎补槲蕨扩增；第7-8泳道为团叶槲蕨扩增；第9-11泳道为石莲姜槲蕨扩增后；
第12-14泳道为崖姜槲扩增；第15-17泳道为中华槲蕨扩增；第18-19泳道为栎叶槲蕨扩增；
第20-22泳道为川滇槲蕨扩增；第23泳道为大叶骨碎补的扩增结果。

[0036] 图2为分子标记ndhB-trnR上第二特征性引物对所处位置及PCR扩增电泳图，其中第1-6泳道为骨碎补槲蕨扩增的产物，其长度为104bp,第7-8泳道为团叶槲蕨、第9-11泳道为石莲姜槲蕨、第12-14泳道为崖姜槲、第15-17泳道为崖姜槲、第18-19泳道为栎叶槲蕨、第20-22泳道为川滇槲蕨、第23泳道为大叶骨碎的扩增结果。

[0037] 图3为分子标记rbcL-accD上第三特征性引物对所处位置及PCR扩增电泳图，其中第1-6泳道为骨碎补槲蕨扩增的产物，其长度为1733bp,第7-8泳道为团叶槲蕨、第9-11泳道为石莲姜槲蕨、第12-14泳道为崖姜槲、第15-17泳道为崖姜槲、第18-19泳道为栎叶槲蕨、第20-22泳道为川滇槲蕨、第23泳道为大叶骨碎的扩增结果。

具体实施方式

[0038] 实施例1.中药骨碎补SCAR分子标记的构建方法

[0039] 1.1试验材料

[0040] 叶绿体基因组测序使用的样本：槲蕨科7个种，共21个样本。其中团叶槲蕨(D.bonii)3个样，川滇槲蕨(D.delavayi)2个样，石莲姜槲蕨(D.propinqua)2个样，栎叶槲蕨(D.quercifolia)2个样，秦岭槲蕨(D.sinica)2个样，崖姜(P.coronans)3个样，槲蕨(D.roosii)7个样。

[0041] SCAR分子标记验证材料：一共8个物种。槲蕨科7个种、骨碎补科1个种，共23个样。

[0042] 槲蕨科7个种，共22个样。其中团叶槲蕨(D.bonii)3个样，川滇槲蕨(D.delavayi)3个样，石莲姜槲蕨(D.propinqua)2个样，栎叶槲蕨(D.quercifolia)2个样，秦岭槲蕨(D.sinica)3个样，崖姜(P.coronans)3个样，槲蕨(D.roosii)6个样。骨碎补科大叶骨碎补(Davallia formossana)1个样。

[0043] 1.2.试验仪器及试剂

[0044] 艾本德5418R小型高速离心机(Eppendorf，德国)。Qubit 3.0荧光定量仪(Life Invitrogen,美国)；Covaris M220超声波破碎仪(基因有限公司，中国)；On-Chip Electrophoresis芯片；Highly-sensitive Electrophoresis芯片、DYY-6C电泳仪(北京六一仪器厂，中国)、Agilent 2100Bioanalyzer生物芯片分析系统(Agilent，美国)、-20℃冰箱(海尔，中国)。

[0045] Qubit dsDNA HS Assay Kit双链DNA高灵敏度荧光定量试剂盒(Life Invitrogen,美国)。植物DNA提取试剂盒(天根，中国)。建库试剂盒(包括磁珠)(New ENGLAND Biolabs，美国)；DynaMag-2Magnet 12321D invitrogen磁力架(thermofisher，英国)；DNA 1000Assay Protocol芯片筑胶试剂盒、灌胶注射器(Agilent，美国)。BiofLux纯化试剂盒(BiofLux，日本)、Master mix、RNA酶(TsingKE，北京)、TAE、琼脂(BIOFROXX，德国)。

[0046] 1.3.试验方法

[0047] 1.3.1DNA提取

[0048] 新鲜叶片清理后硅胶干燥备用，CTAB法提取DNA(Allen et al.2006)。

[0049] (1)称取20mg干燥材料至2ml试管中，加入钢珠后的试管放入球磨仪研磨5min。

[0050] (2)取出钢珠，在试管中加入1.2ml的65℃预热的CTAB溶液，充分混匀后65℃水浴30min，每隔5-10min上下翻转摇匀一次。

[0051] (3)取出试管，冷却至室温后置离心机13500g离心10min，上清液置于新的离心管中。

[0052] (4)加入800μl苯酚：氯仿：异戊醇，旋转试管混匀后室温静置20min。

[0053] (5)13500g离心10min。小心地将上层转移到含有800毫升预冷异丙醇(储存于-20℃)的2ml试管中，混匀后室温静置10min。

[0054] (6)13500g×离心10min后去除上清液，加入无DNA酶的RNA酶37℃静置30min。

[0055] (7)加入25μl 3M醋酸钠溶液后混合。加入600μl预冷乙醇(-20℃)，混匀后在-20℃静置20min，使DNA沉淀。

[0056] (8)3500g离心10min后去除上清液。

[0057] (9)加入500μl-20℃预冷70％乙醇，快速涡旋1-2s。13500g×离心10min。

[0058] (10)重复(9)步骤一次，吸干剩余液体，置通风橱干燥10min。

[0059] (11)加入50μl TE缓冲液混匀后静置30min。

[0060] (12)1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA。

[0061] (13)将所获得的DNA保存-20℃冰箱，待用。

[0062] 1.3.2DNA浓度测定

[0063] 在DNA文库构建前，Qubit 3.0测定样品DNA的浓度。试剂使用Qubit dsDNA HS Assay Kit双链DNA高灵敏度荧光定量试剂盒(Life Invitrogen,美国)。测定浓度后的样品稀释，准备DNA打断。将测定浓度后的样品DNA在打断管中稀释至浓度5ng/μL，65μL。

[0064] 1.3.3DNA样品打碎

[0065] 打断管放入Covaris超声波破碎仪中，将DNA打碎至500bp左右的长度。碎样后DNA片段长度检测:琼脂糖电泳检测，如果样品DNA片段偏大，需重新打碎DNA样品。

[0066] 1.3.4DNA文库构建

[0067] 1.3.4.1末端修饰和接头连接

[0068] 使用 UltraTM II试剂盒构建DNA文库。首先对样品DNA进行末端修饰和接头连接(adaptor ligation)。

[0069] 1.3.4.2DNA片段筛选

[0070] 接下来，磁珠接头筛选，筛选合适大小的DNA双链片段(400-500bp)，修饰后的DNA(加上插入部分，接头，底物等)双链片段按650bp算，第一次筛选加20μl的磁珠，第二次加10μl的磁珠。第一次筛选去掉大片段的DNA双链片段，第二次去掉过小的DNA双链片段。

[0071] 筛选后的DNA片段取15μl至PCR管中，写上对应的编号。

[0072] 1.3.4.3文库PCR

[0073] PCR管中加入筛选后的DNA样品、Q5、index、Master mix。每个index对应一个样品，测序时通过index编号区分DNA样品。

[0074] 1.3.4.4DNA文库PCR产物纯化

[0075] 将PCR产物移至1.5mL试管中，加45μL磁珠。混匀，静置5min，瞬离，上磁力架孵育5min；弃上清液，加300μl的80％酒精清洗，180度转动试管两次，静置，弃上清液；重复酒精清洗一次；吸干酒精，磁珠自然干燥；加33μl水，从磁力架上取出试管，在桌面上敲打，使磁珠在水中混匀；瞬离，混匀，静置5min，瞬离后上磁力架孵育5min。取30μl上清液至PCR管中，写上对应的编号。

[0076] 1.3.4.5DNA片段浓度和大小测定

[0077] DNA文库片段大小和浓度测定。Qubit 3.0测定样品浓度A，测定浓度后样品稀释至30ng/μL左右，DNA浓度>30ng/μL的样品，使用On-Chip Electrophoresis芯片；DNA浓度≦
30ng/μL的样品，使用Highly-sensitive Electrophoresis芯片。

[0078] 配胶，将染料与胶混匀后过滤；准备DNA文库样品；在芯片注胶平台往芯片孔内加入胶、marker、ladder、DNA文库样品；将芯片置生物芯片系统上跑胶后读取DNA片段大小数据B。

[0079] 样品混匀后送公司测序。将前面所得DNA大小和浓度代入公式(1.515×1000×A)/B(bp)，将文库稀释到3n mol。稀释后将所有的样品混匀后送去测序。

[0080] 1.4.数据处理

[0081] 1.4.1叶绿体基因组组装

[0082] 在Illumina HiSeq X-Ten测序平台完成叶绿体基因组测序(华大基因，北京)。每个物种，大约生成1.6GB的原始数据，双端150bp的读取长度。对原始序列读取进行筛选，去除低质量的序列。叶绿体基因组使用Spades 3.9.0(Bankevich et al.,2012)组装，从高质量数据中组装Contigs。

[0083] 1.4.2叶绿体拼接

[0084] 从NCBI下载已公布的49个种蕨类植物的叶绿体基因组进行本地建库。各样本数据的与本地数据库blast分析显示网眼瓦韦(Lepisorus clathratus,Genbank序列号：NC_035739)和川滇槲蕨(D.delavayi)叶绿体基因组序列相似度最高，因此将网眼瓦韦的叶绿体基因组作为川滇槲蕨的参照序列。通过blast确定川滇槲蕨Contigs的排列顺序，在Geneious 8.1.3(Kearse et al.,2012)手动拼接成环；槲蕨叶绿体基因组参照Drynaria roosii(Sun et al.,2017)(Genbank序列号：KY075853)拼接，确定槲蕨的Contigs中各序列排列顺序后Geneious手动拼接成环；其他种以槲蕨和川滇槲蕨叶绿体基因组为参拼接。

[0085] 拼接好的序列中gaps和不确定的序列。通过设计引物、PCR扩增、测序，进一步确定核苷酸序列和gaps(Dong et al.,2013)。最后，将过滤的reads重新map到拼接好的叶绿体基因组上进行检测，然后获得叶绿体基因组序列。

[0086] 1.4.3叶绿体基因组注释

[0087] Dual Organellar GenoMe Annotator(DOGMA)在线初步注释叶绿体基因组基因(Wyman,Jansen and Boore,2004)，使用默认参数值。系统通过自动搜索与待注释序列相似的序列进行同源注释，包括tRNA基因、rRNA基因、编码蛋白基因(CDS)。反向重复区使用CpGAVA(Liu et al.,2012)在线注释。tRNAscan-SE(Lowe and Chan,2016)预测tRNA。基于DOGMA同源注释的基因，Geneious 8.1.3手动调整基因起始密码子、内含子、终止密码等位置。OGDRAW GeSeq进行叶绿体基因组绘图(Lohse et al.,2013)。以槲蕨(D.roosii)为参考基因组，mVISTA在线程序(http://genome.lbl.gov/vista/mvista/submit.shtml)的Shuffle-LAGAN模型对槲蕨科7个种蕨类进行多基因组比对(Frazer et al.,2004)。调整后的叶绿体基因组序列提交Genbank，获取叶绿体基因组收录编号。

[0088] 1.4.4引物设计

[0089] 通过比对全叶绿体基因组、分析各DNA片段的核苷酸多态性后筛选出合适的特异性片段，其在骨碎补中的序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示。比对各物种的序列确定设计特征性扩增引物的位置，Primer5软件设计引物并合成引物。设计出三条引物，其序列分别如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6，SEQ ID No.7，SEQ ID No.8，SEQ ID No.9所示，见表1。

[0090] 表1三个特异性引物及所对应的分子标记

[0091]

[0092] 实施例2：鉴定中药材骨碎补的方法

[0093] 2.1样本DNA的提取

[0094] 使用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒(DP305)[0095] 提取，详细步骤如下，

[0096] 1)取待检测干燥根茎0.1克，(包含骨碎补及混伪品总共23个样本，见检测结果图注)加入液氮充分研磨，

[0097] 2)将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μL 65℃预热缓冲液GP1的离心管中(实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1％)，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。

[0098] 3)加入700μL氯仿，充分混匀，12,000rpm离心5min。

[0099] 4)小心地将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700μL缓冲液GP2，充分混匀。

[0100] 5)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12,000rpm离心30sec，弃掉废液。

[0101] 6)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

[0102] 7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

[0103] 8)重复操作步骤7.

[0104] 9)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。

[0105] 10)对所得DNA进行电泳检测，检查DNA完整性。

[0106] 2.2PCR扩增

[0107] 2.2.1利用第一引物进行PCR扩增

[0108] 使用北京擎科新业生物技术有限公司的2×TSINGKE Master Mix进行扩增。实验步骤如下：

[0109] 1)专用的反应体系

[0110] 所述的专用PCR反应体系为：2X Master Mix为10μL；前引物1μL，后引物1μL，DNA为0.5μg，加水至总体积为20μL。

[0111] 2)PCR反应程序为：1)94℃预变性4分钟，2)94℃变性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸50秒，该程序循环35次，3)72℃延伸6分钟。

[0112] 2.2.2利用第二引物进行PCR扩增

[0113] 与上述2.2.1不同之处在于将第一引物替换为第二引物，

[0114] 2.2.3利用第三引物进行PCR扩增

[0115] 与上述2.2.1不同之处在于将第一引物替换为第三引物。

[0116] PCR反应程序为：1)94℃预变性4分钟，2)94℃变性30秒，54℃退火30[0117] 秒，72℃延伸2分钟，该程序循环35次，3)72℃延伸6分钟。

[0118] 2.3电泳检测

[0119] 扩增结束后，将各PCR产物进行电泳检测

[0120] 1)称取0.2g琼脂放入锥形瓶，再加入20ml的1×TAE；微波炉中低火煮1-2min至琼脂完全融化。

[0121] 2)冷却至合适温度后加入2μl核苷酸染液，混匀后倒至模板内冷却，凝固的琼脂置于电泳槽内(电泳液1×TAE)，使电泳液没过点样孔。

[0122] 3)点样，取3μl样品与1μl的5×Loading buffer混匀后放入琼脂孔内，留1-2个样品孔点2μl的marker；电泳后的琼脂置透射仪上观察。

[0123] 2.4结果判定

[0124] 由所述第一引物对扩增得到的第一PCR产物的长度在骨碎补中的为388bp,混伪品中的长度为596-612bp，如图1所示，第1-6泳道为骨碎补槲蕨扩增的产物，其长度为388bp,第7-8泳道为团叶槲蕨扩增的产物，其长度为610bp,第9-11泳道为石莲姜槲蕨扩增后的产物，其长度为612bp；第12-14泳道为崖姜槲扩增的产物，其长度为611bp；第15-17泳道为中华槲蕨扩增的产物，其长度为596bp；第18-19泳道为栎叶槲蕨扩增的产物，其长度为609bp；第20-22泳道为川滇槲蕨扩增的产物，其长度为596bp；第23泳道为大叶骨碎补扩增的产物，其长度为623bp；即第1-6泳道所测产品为骨碎补，其它为混伪品；

[0125] 由所述第二引物对扩增得到的第二PCR产物的长度在骨碎补中的为104bp，在混伪品中没有扩增产物；如图2所示，第1-6泳道为骨碎补槲蕨扩增的产物，其长度为104bp,第7-8泳道为团叶槲蕨、第9-11泳道为石莲姜槲蕨、第12-14泳道为崖姜槲、第15-17泳道为崖姜槲、第18-19泳道为栎叶槲蕨、第20-22泳道为川滇槲蕨、第23泳道为大叶骨碎没有扩增产物；即第1-6泳道所测产品为骨碎补，其它为混伪品；

[0126] 由所述第三引物对扩增得到的第三PCR产物的长度在骨碎补中的为1733bp，在混伪品中没有扩增产物。如图3所示，第1-6泳道为骨碎补槲蕨扩增的产物，其长度为1733bp,第7-8泳道为团叶槲蕨、第9-11泳道为石莲姜槲蕨、第12-14泳道为崖姜槲、第15-17泳道为崖姜槲、第18-19泳道为栎叶槲蕨、第20-22泳道为川滇槲蕨、第23泳道为大叶骨碎没有扩增产物；即第1-6泳道所测产品为骨碎补，其它为混伪品。

[0127] 以上可以看出，本发明开发的这种特异性片段的DNA分子标记相对于传统DNA条形码，更加经济方便，不用经历PCR产物纯化、测序等步骤，能大大节约鉴定成本；相对于传统DNA分子标记技术，SCAR分子标记技术更加准确和稳定；相对传统的形态学和化学鉴定方法，DNA标记鉴定不需要分类学背景的专家、不需要经历次级代谢产物提取与检测分析等步骤，能对中药村进行更加快捷高效的鉴定；本发明可以实现骨碎补药材的准确鉴定，突破了传统药材识别的局限，解决了骨碎补药材鉴定的问题，有利于提高用药的安全性和有效性，有较高的应用价值。

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一种鉴定中药材骨碎补的SCAR分子标记及其应用

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