技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种用于培育肉苁蓉愈伤组织的细胞悬 浮培养系的构建方法。

                              背景技术

肉苁蓉(Cistanche deserticola Y.C.Ma)是列当科肉苁蓉属多年生高等寄生 植物，寄生在梭梭等植物的根上。肉苁蓉具有补肾益精、润肠通便和延缓衰老之 功能，常被选用于补肾壮阳药物中。肉苁蓉中主要的活性成分物质是苯乙醇糖甙 类化合物(phenylethanoid glycosides，PeG)、肉苁蓉多糖和甜菜碱。其中PeG具 有清除自由基和抗衰老作用；肉苁蓉多糖可以增强机体的免疫功能；甜菜碱具有 抗脂肪肝和抗肿瘤以及扩张外周血管和降压的作用(李琳琳等，中国中药杂志， 1997，22：364-367；薛德钧等，中国中药杂志，1995，20：687-689)。长期以来， 由于滥采乱挖，肉苁蓉寄主梭梭等毁坏严重，破坏了自然生态环境，加速了土地 沙漠化。而肉苁蓉的人工栽培虽已试验成功，但受寄主植物的数量、分布和根系 发育等条件的影响，脱离寄主进行人工种植尚有一定困难。因此迫切需要开发肉 苁蓉的组织和细胞培养技术，通过肉苁蓉细胞工业化大规模培养繁殖，生产其含 有的药物成分，以满足国内外日益增长的需要，并杜绝无节制的滥采乱挖现象。 我们已经研究了诱导肉苁蓉种子产生愈伤组织并分化出芽的方法(欧阳杰， CN02117657.4)，但是要达到肉苁蓉细胞大规模培养的目的，必须首先在摇瓶中 建立肉苁蓉细胞的悬浮培养系，然后才能在生物反应器中进行工业化生产。通过 查新，目前尚未见有建立肉苁蓉悬浮细胞培养系的报道。

和固体培养相比，液体悬浮培养有良好的混合、流动性能及更高的传质效率， 但溶氧有限，可能对植物细胞的生长有一定的限制作用。愈伤组织由固体培养基 转至液体培养时，愈伤组织逐渐分散成单个细胞或多个细胞的聚集体。在悬浮培 养过程中，随着细胞的生长和增殖，细胞的聚集度又慢慢提高，细胞聚集体不断 增大，聚集体的大小与液体悬浮过程中产生的剪切力有关，并与次级代谢产物含 量之间也存在着一定关系。

植物组织和细胞培养已经经过了近百年的发展历程，有许多植物细胞如紫草 (Noguchi et al.，Plant tissue culture and its biotechnological application，1977，pp. 85)、人参根(B.Hwang et al.，KR9500443)、长春花细胞(Scragg&Altan， Biotechnology in agriculture and forestry，1993，pp.249-268)、草莓细胞(周春江等， 植物生理学通讯，2002，38(1)：22-24)、青蒿、毛地黄等建立了悬浮细胞系并达 到中试或工业化规模。在建立悬浮细胞培养系的过程中，固体培养基上愈伤组织 的生理状态直接影响液体培养基中悬浮细胞培养系的质量。应该挑选那些松软易 碎、颗粒较小的愈伤组织转接到液体培养基中，并通过反复继代来达到建立稳定 的悬浮细胞培养系的目的。

                              发明内容

本发明的目的是提供一种用于培育肉苁蓉愈伤组织的细胞悬浮培养系的构 建方法，通过将愈伤组织转接至液体培养基并反复继代，从而建立用于培育肉苁 蓉愈伤组织的细胞悬浮培养系，实现人工培养，达到规模化生产的目的。

本发明的实施方案如下：

本发明提供的用于培育肉苁蓉组织的细胞悬浮培养系的构建方法，其步骤如 下：

1)将固体培养基上生长的由肉苁蓉种子诱导得到的愈伤组织转移到添加了 0.5-10mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸的B5固体培养基上进行继代培养，形成浅黄色、 半透明、松软易碎的肉苁蓉愈伤组织；

2)将步骤1)中得到的肉苁蓉愈伤组织转接到与步骤1)中所使用的B5固 体培养基相同组分和含量的液体培养基中，使聚集成块的愈伤组织分散为单个细 胞或细胞聚集体进行摇瓶培养；培养时摇床转速为60-120r/min，温度为20-30 ℃，光照强度为1000-3000lux，光照时间8-20小时/天；

3)每5-15天进行一次继代培养，将颜色为白色至淡黄色，生命力旺盛的处 对数生长期的肉苁蓉单细胞或小细胞团用无菌吸管转入新鲜液体培养基中，继代 培养5-15次后，得到本发明稳定的用于培育肉苁蓉愈伤组织的悬浮细胞培养系； 所述的新鲜液体培养基的组分和含量同步骤2)中使用的液体培养基。

所述步骤2)中使用的B5固体培养基中2，4-二氯苯氧乙酸的含量为1.0-5.0 mg/L为较佳；所述摇床转速为80-110r/min为较佳；所述培养温度为23-27℃为 较佳；所述光照强度为1500-2500lux为较佳。

所述步骤3)中的继代培养每8-12天继代一次为较佳；所述继代培养的继代 次数为8-12次为较佳。

不同生长形态以及处于不同生长时期的愈伤组织，其生理状况不同，细胞内 代谢活动情况有较大的差别。松散的愈伤组织是进行悬浮培养最适合的材料，稍 经机械振荡，即可使愈伤组织分散成单细胞或由几个细胞组成的小细胞团，在培 养中细胞迅速增殖；而坚实愈伤组织中的细胞间被果胶质紧紧地粘着，因而往往 不能形成良好的悬浮系统。坚实的愈伤组织由于密度较大，转接到液体培养基后 会沉在摇瓶底部，由于得不到充分的氧气和营养供应，很快就会褐化死亡；肉苁 蓉愈伤组织的种龄对悬浮细胞的培养也有较大的影响，将处于对数生长期的愈伤 组织转接到液体培养基较好，这样可以缩短悬浮细胞生长的延滞期，而很快进入 对数生长期，细胞生长迅速。

本发明提供的用于培育肉苁蓉愈伤组织的细胞悬浮培养系的构建方法，通过 将愈伤组织转接至液体培养基并反复继代，从而建立用于培育肉苁蓉愈伤组织的 细胞悬浮培养系，可实现人工培养，达到规模化生产的目的。

                                 具体实施方式

实施例1：构建一种用于培育肉苁蓉愈伤组织的细胞悬浮培养系，其步骤如下：

1.将固体培养基上生长的由肉苁蓉种子诱导得到的愈伤组织转移到添加 0.5mg/L的2，4-D的B5固体培养基进行继代培养，培养20天，形成浅黄色，半 透明，松软易碎的肉苁蓉愈伤组织；

2.将步骤1中得到的肉苁蓉愈伤组织转接到与步骤1中所使用B5固体培养 基相同组分和含量的液体培养基中，使聚集成块的愈伤组织分散为单个细胞或细 胞聚集体进行摇瓶培养；培养时摇床转速为60r/min，温度为20℃，光照强度为 1000lux，光照时间16小时/天；

3.每5天进行一次继代，将变褐的细胞弃去，将颜色为白色至淡黄色、生 命力旺盛的处对数生长期的肉苁蓉单细胞或小细胞团用无菌吸管转入新鲜液体 培养基中，继代培养5次后，可得到生长良好，苯乙醇糖甙类化合物含量为6.9 ％的悬浮细胞培养系；所使用的新鲜液体培养基的组分和含量同步骤2的液体培 养基。

实施例2：构建一种用于培育肉苁蓉愈伤组织的细胞悬浮培养系，其步骤如下：

1.将固体培养基上生长的由肉苁蓉种子诱导得到的愈伤组织转移到添加 10mg/L的2，4-D的B5固体培养基进行继代培养，培养20天，形成浅黄色，半 透明，松软易碎的肉苁蓉愈伤组织；

2.将步骤1中得到的肉苁蓉愈伤组织转接到与步骤1中所使用B5固体培养 基相同组分和含量的液体培养基中，使聚集成块的愈伤组织分散为单个细胞或细 胞聚集体进行摇瓶培养；培养时摇床转速为120r/min，温度为30℃，光照强度 为3000lux，光照时间20小时/天；

3.每15天进行一次继代，将变褐的细胞弃去，将颜色为白色至淡黄色、生 命力旺盛的处对数生长期的肉苁蓉单细胞或小细胞团用无菌吸管转入新鲜液体 培养基中，继代培养15次后，可得到生长良好，苯乙醇糖甙类化合物含量为9.3 ％的悬浮细胞培养系；所使用的新鲜液体培养基的组分和含量同步骤2的液体培 养基。

实施例3：构建一种用于培育肉苁蓉愈伤组织的细胞悬浮培养系，其步骤如下：

1.将固体培养基上生长的由肉苁蓉种子诱导得到的愈伤组织转移到添加 2mg/L的2，4-D的B5固体培养基进行继代培养，培养20天，形成浅黄色，半透 明，松软易碎的肉苁蓉愈伤组织；

2.将步骤1中得到的肉苁蓉愈伤组织转接到与步骤1中所使用B5固体培养 基相同组分和含量的液体培养基中，使聚集成块的愈伤组织分散为单个细胞或细 胞聚集体进行摇瓶培养；培养时摇床转速为90r/min，温度为23℃，光照强度为 2000lux，光照时间8小时/天；

3.每10天进行一次继代，将变褐的细胞弃去，将颜色为白色至淡黄色、生 命力旺盛的处对数生长期的肉苁蓉单细胞或小细胞团用无菌吸管转入新鲜液体 培养基中，继代培养8次后，可得到生长良好，苯乙醇糖甙类化合物含量为10.3 ％的悬浮细胞培养系；所使用的新鲜液体培养基的组分和含量同步骤2的液体培 养基。

实施例4：构建一种用于培育肉苁蓉愈伤组织的细胞悬浮培养系，其步骤如下：

1.将固体培养基上生长的由肉苁蓉种子诱导得到的愈伤组织转移到添加 5mg/L的2，4-D的B5固体培养基进行继代培养，培养20天，形成浅黄色，半透 明，松软易碎的肉苁蓉愈伤组织；

2.将步骤1中得到的肉苁蓉愈伤组织转接到与步骤1中所使用B5固体培养 基相同组分和含量的液体培养基中，使聚集成块的愈伤组织分散为单个细胞或细 胞聚集体进行摇瓶培养；培养时摇床转速为110r/min，温度为27℃，光照强度为 2500lux，光照时间16小时/天；

3.每12天进行一次继代，将变褐的细胞弃去，将颜色为白色至淡黄色、生 命力旺盛的处对数生长期的肉苁蓉单细胞或小细胞团用无菌吸管转入新鲜液体 培养基中，继代培养8次后，可得到生长良好，苯乙醇糖甙类化合物含量为9.5 ％的悬浮细胞培养系；所使用的新鲜液体培养基的组分和含量同步骤2的液体培 养基。

实施例5：构建一种用于培育肉苁蓉愈伤组织的细胞悬浮培养系，其步骤如下：

1.将固体培养基上生长的由肉苁蓉种子诱导得到的愈伤组织转移到添加 3mg/L的2，4-D的B5固体培养基进行继代培养，培养20天，形成浅黄色，半透 明，松软易碎的肉苁蓉愈伤组织；

2.将步骤1中得到的肉苁蓉愈伤组织转接到与步骤1中所使用B5固体培养 基相同组分和含量的液体培养基中，使聚集成块的愈伤组织分散为单个细胞或细 胞聚集体进行摇瓶培养；培养时摇床转速为100r/min，温度为25℃，光照强度 为1800lux，光照时间16小时/天；

3.每10天进行一次继代，将变褐的细胞弃去，将颜色为白色至淡黄色、生 命力旺盛的处对数生长期的肉苁蓉单细胞或小细胞团用无菌吸管转入新鲜液体 培养基中，继代培养12次后，可得到生长良好，苯乙醇糖甙类化合物含量为11.1 ％的悬浮细胞培养系；所使用的新鲜液体培养基的组分和含量同步骤2的液体培 养基。

实施例6：构建一种用于培育肉苁蓉愈伤组织的细胞悬浮培养系，其步骤如下：

1.将固体培养基上生长的由肉苁蓉种子诱导得到的愈伤组织转移到添加 1.0mg/L的2，4-D的B5固体培养基进行继代培养，培养20天，形成浅黄色，半 透明，松软易碎的肉苁蓉愈伤组织；

2.将步骤1中得到的肉苁蓉愈伤组织转接到与步骤1中所使用B5固体培养 基相同组分和含量的液体培养基中，使聚集成块的愈伤组织分散为单个细胞或细 胞聚集体进行摇瓶培养；培养时摇床转速为80r/min，温度为23℃，光照强度为 1500lux，光照时间16小时/天；

3.每10天进行一次继代，将变褐的细胞弃去，将颜色为白色至淡黄色、生 命力旺盛的处对数生长期的肉苁蓉单细胞或小细胞团用无菌吸管转入新鲜液体 培养基中，继代培养10次后，可得到生长良好，苯乙醇糖甙类化合物含量为10.5 ％的悬浮细胞培养系；所使用的新鲜液体培养基的组分和含量同步骤2的液体培 养基。

实施例7：构建一种用于培育肉苁蓉愈伤组织的细胞悬浮培养系，其步骤如下：

1.将固体培养基上生长的由肉苁蓉种子诱导得到的愈伤组织转移到添加 10mg/L的2，4-D的B5固体培养基进行继代培养，培养20天，形成浅黄色，半 透明，松软易碎的肉苁蓉愈伤组织；

2.将步骤1中得到的肉苁蓉愈伤组织转接到与步骤1中所使用B5固体培养 基相同组分和含量的液体培养基中，使聚集成块的愈伤组织分散为单个细胞或细 胞聚集体进行摇瓶培养；培养时摇床转速为70r/min，温度为27℃，光照强度为 1500lux，光照时间16小时/天；

3.每5天进行一次继代，将变褐的细胞弃去，将颜色为白色至淡黄色、生 命力旺盛的处对数生长期的肉苁蓉单细胞或小细胞团用无菌吸管转入新鲜液体 培养基中，继代培养14次后，可得到生长良好，苯乙醇糖甙类化合物含量为11.1 ％的悬浮细胞培养系；所使用的新鲜液体培养基的组分和含量同步骤2的液体培 养基。

实施例8：构建一种用于培育肉苁蓉愈伤组织的细胞悬浮培养系，其步骤如下：

1.将固体培养基上生长的由肉苁蓉种子诱导得到的愈伤组织转移到添加 1.0mg/L的2，4-D的B5固体培养基进行继代培养，培养20天，形成浅黄色，半 透明，松软易碎的肉苁蓉愈伤组织；

2.将步骤1中得到的肉苁蓉愈伤组织转接到与步骤1中所使用B5固体培养 基相同组分和含量的液体培养基中，使聚集成块的愈伤组织分散为单个细胞或细 胞聚集体进行摇瓶培养；培养时摇床转速为95r/min，温度为28℃，光照强度为 1500lux，光照时间16小时/天；

3.每13天进行一次继代，将变褐的细胞弃去，将颜色为白色至淡黄色、生 命力旺盛的处对数生长期的肉苁蓉单细胞或小细胞团用无菌吸管转入新鲜液体 培养基中，继代培养7次后，可得到生长良好，苯乙醇糖甙类化合物含量为11.6 ％的悬浮细胞培养系；所使用的新鲜液体培养基的组分和含量同步骤2的液体培 养基。

实施例9：构建一种用于培育肉苁蓉愈伤组织的细胞悬浮培养系，其步骤如下：

1.将固体培养基上生长的由肉苁蓉种子诱导得到的愈伤组织转移到添加 3.0mg/L的2，4-D的B5固体培养基进行继代培养，培养20天，形成浅黄色，半 透明，松软易碎的肉苁蓉愈伤组织；

2.将步骤1中得到的肉苁蓉愈伤组织转接到与步骤1中所使用B5固体培养 基相同组分和含量的液体培养基中，使聚集成块的愈伤组织分散为单个细胞或细 胞聚集体进行摇瓶培养；培养时摇床转速为105r/min，温度为27℃，光照强度 为2700lux，光照时间16小时/天；

3.每12天进行一次继代，将变褐的细胞弃去，将颜色为白色至淡黄色、生 命力旺盛的处对数生长期的肉苁蓉单细胞或小细胞团用无菌吸管转入新鲜液体 培养基中，继代培养8次后，可得到生长良好，苯乙醇糖甙类化合物含量为11.8 ％的悬浮细胞培养系；所使用的新鲜液体培养基的组分和含量同步骤2的液体培 养基。