1.技术领域
本发明一般性地涉及与烟碱脱甲基酶(nicotine demethylase)活性降低的 烟草植物相关的组合物和方法。
2.背景信息
已知烟草植物对烟碱进行N-脱甲基化以形成次级生物碱，即去甲烟碱， 已知去甲烟碱是调制过的烟叶中由微生物介导形成N-亚硝基去甲烟碱(下 文称之为“NNN ”)所用的前体。N-脱甲基化反应由烟碱脱甲基酶(NDM)催 化。使烟草中由底物烟碱至产物去甲烟碱的转变降低的最新方法利用筛选 来清除用于商业种子生产的原种生长地中的转变者植物。然而，由筛选得 到的种子直接产生的种子仍含有转变者。
发明简述
本文提供了与烟碱脱甲基酶基因中具有突变或表达含有烟碱脱甲基酶 基因序列的双链RNA的烟草植物、杂种、品种和品系的生产相关的组合物 和方法。
本文提供了烟草杂种、品种和品系。烟草杂种、品种或品系可包含烟 碱脱甲基酶基因中具有突变的植物。烟碱脱甲基酶基因中具有突变的植物 可具有非-转变者表型，与包含含野生型烟碱脱甲基酶基因的植物的相应烟 草杂种、品种或品系的回复突变率相比，该植物的后代可具有至少降低2 倍(例如10倍至1000倍或2倍至100倍)的回复突变率。烟草杂种、品种或 品系可以是白肋型、深色型、烘烤型或东方型烟草。烟草杂种、品种或品 系可以是普通烟草(Nicotiana tabacum)杂种、品种或品系。品种实质上源自 BU 64，CC 101，CC 200，CC 27，CC 301，CC 400，CC 500，CC 600，CC 700，CC 800，CC 900，Coker 176，Coker 319，Coker 371 Gold，Coker 48，CU 263，DF911， Galpao烟草，GL 26H，GL 350，GL 600，GL 737，GL 939，GL 973，HB 04P，K 149，K 326，K 346，K 358，K394，K 399，K 730，KDH 959，KT 200，KT204LC， KY 10，KY 14，KY 160，KY 17，KY 171，KY 907，KY907LC，KTY14x L8LC， Little Crittenden，McNair 373，McNair 944，msKY 14xL8，Narrow LeafMadole， NC 100，NC 102，NC 2000，NC 291，NC 297，NC 299，NC 3，NC 4，NC 5，NC 6， NC7，NC 606，NC 71，NC 72，NC 810，NC BH 129，NC 2002，Neal Smith Madole，OXFORD 207，‘Perique’烟草，PVH03，PVH09，PVH19，PVH50， PVH51，R 610，R 630，R 7-11，R 7-12，RG 17，RG 81，RG H51，RGH 4，RGH 51， RS 1410，Speight 168，Speight 172，Speight 179，Speight 210，Speight 220， Speight 225，Speight 227，Speight 234，Speight G-28，Speight G-70，Speight H-6， Speight H20，Speight NF3，TI 1406，TI 1269，TN 86，TN86LC，TN 90，TN 97， TN97LC，TN D94，TN D950，TR(Tom Rosson)Madole，VA 309或VA359。
本文还提供了包含在烟碱脱甲基酶基因座上具有突变等位基因的植物 的烟草杂种、品种和品系。在某些实施方案中，烟碱脱甲基酶基因座上的 突变等位基因编码选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO：2，其中氨基酸329 位的色氨酸被终止密码子取代；SEQ ID NO：2，其中氨基酸107位的脯氨酸 被选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨 酰胺、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨 酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸的氨基酸取代；SEQ ID NO：2，其中 氨基酸163位的异亮氨酸被甲硫氨酸取代，氨基酸309位的赖氨酸被谷氨 酸取代，氨基酸353位的甘氨酸被半胱氨酸取代，氨基酸452位的丝氨酸 被脯氨酸取代；SEQ ID NO：2，其中氨基酸416位的谷氨酰胺被亮氨酸取代， 氨基酸423位的丝氨酸被脯氨酸取代；SEQ ID NO：2，其中氨基酸163位的 异亮氨酸被甲硫氨酸取代，氨基酸309位的赖氨酸被谷氨酸取代，氨基酸 353位的甘氨酸被半胱氨酸取代，氨基酸416位的谷氨酰胺被亮氨酸取代， 氨基酸423位的丝氨酸被脯氨酸取代，氨基酸452位的丝氨酸被脯氨酸取 代；SEQ ID NO：2，其中氨基酸序列含有三个选自I163M，L309E，G353C， Q416L，S423P和S452P的取代；SEQ ID NO：2，其中氨基酸P107缺失；SEQ ID NO：2，其中至少三个选自I163，L309，G353，Q416，S423和S452的氨基酸 缺失；SEQ ID NO：2，其中在选自P107，I163，L309，G353，Q416，S423和S452 的氨基酸的邻近处插入一个或两个氨基酸；SEQ ID NO：2，其中第1至328 位中任意位置处的氨基酸被终止密码子取代；SEQ ID NO：2，其中第330至 457位中任意位置处的氨基酸被终止密码子取代。在一个具体实施方案中， 突变等位基因编码的氨基酸序列含有SEQ ID NO：2所示序列，其中氨基酸 107位的脯氨酸被亮氨酸取代。
在其它实施方案中，突变等位基因含有选自下述的核酸序列：SEQ ID NO：1，其中核酸+2021位的鸟嘌呤被腺嘌呤取代；SEQ ID NO：1，其中核酸 +2291位的鸟嘌呤被腺嘌呤取代；SEQ ID NO：1，其中内含子中插入剪接供 体；SEQ ID NO：1，其中内含子中插入剪接受体。在一个具体实施方案中， 杂种、品种或品系是普通烟草(Nicotiana tabacum)杂种、品种或品系。在另 一个实施方案中，品种实质上源自BU 64，CC 101，CC 200，CC 27，CC 301， CC 400，CC 500，CC 600，CC 700，CC 800，CC 900，Coker 176，Coker 319， Coker 371 Gold，Coker 48，CU 263，DF911，Galpao烟草，GL 26H，GL 350，GL 600，GL 737，GL 939，GL 973，HB 04P，K 149，K 326，K 346，K 358，K394，K 399，K 730，KDH 959，KT 200，KT204LC，KY 10，KY 14，KY 160，KY 17，KY 171，KY 907，KY907LC，KTY14x L8LC，Little Crittenden，McNair 373， McNair 944，msKY 14xL8，Narrow Leaf Madole，NC 100，NC 102，NC 2000， NC 291，NC 297，NC 299，NC 3，NC 4，NC 5，NC 6，NC7，NC 606，NC 71，NC 72，NC 810，NC BH 129，NC 2002，Neal Smith Madole，OXFORD 207， ‘Perique’烟草，PVH03，PVH09，PVH19，PVH50，PVH51，R 610，R 630，R 7-11， R 7-12，RG 17，RG 81，RG H51，RGH 4，RGH 51，RS 1410，Speight 168， Speight 172，Speight 179，Speight 210，Speight 220，Speight 225，Speight 227， Speight 234，Speight G-28，Speight G-70，Speight H-6，Speight H20，Speight NF3，TI 1406，TI 1269，TN 86，TN86LC，TN 90，TN 97，TN97LC，TN D94，TN D950，TR(Tom Rosson)Madole，VA 309或VA359。
在某些其它实施方案中，本发明涉及产生烟草植物的方法。在具体实 施方案中，产生烟草植物的方法包括：在Nicotiana属物种的细胞中诱导突 变，由所述细胞获得一种或多种植物，鉴定出至少一种烟碱脱甲基酶基因 中具有至少一个突变的所述植物。在其它实施方案中，该方法还包括：使 烟碱脱甲基酶基因中具有所述的至少一个突变的植物与第二种Nicotiana属 植物杂交；选择具有烟碱脱甲基酶基因突变的杂种后代。在某些实施方案 中，突变包括：编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的烟碱脱甲基酶基因， 其中氨基酸329位的色氨酸被终止密码子取代；编码SEQ ID NO：2所示氨 基酸序列的烟碱脱甲基酶基因，其中氨基酸107位的脯氨酸被选自丙氨酸、 精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、 异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色 氨酸、酪氨酸和缬氨酸的氨基酸取代；编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列 的烟碱脱甲基酶基因，其中氨基酸163位的异亮氨酸被甲硫氨酸取代，氨 基酸309位的赖氨酸被谷氨酸取代，氨基酸353位的甘氨酸被半胱氨酸取 代，氨基酸452位的丝氨酸被脯氨酸取代；编码SEQ ID NO：2所示氨基酸 序列的烟碱脱甲基酶基因，其中氨基酸416位的谷氨酰胺被亮氨酸取代， 氨基酸423位的丝氨酸被脯氨酸取代；编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列 的烟碱脱甲基酶基因，其中氨基酸163位的异亮氨酸被甲硫氨酸取代，氨 基酸309位的赖氨酸被谷氨酸取代，氨基酸353位的甘氨酸被半胱氨酸取 代，氨基酸416位的谷氨酰胺被亮氨酸取代，氨基酸423位的丝氨酸被脯 氨酸取代，氨基酸452位的丝氨酸被脯氨酸取代；编码SEQ ID NO：2所示 氨基酸序列的烟碱脱甲基酶基因，其中氨基酸序列含有三个选自I163M， L309E，G353C，Q416L，S423P和S452P的取代；编码SEQ ID NO：2所示氨基 酸序列的烟碱脱甲基酶基因，其中氨基酸P107缺失；编码SEQ ID NO：2所 示氨基酸序列的烟碱脱甲基酶基因，其中至少三个选自I163，L309，G353， Q416，S423和S452的氨基酸缺失；编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的烟 碱脱甲基酶基因，其中在选自P107，I163，L309，G353，Q416，S423和S452 的氨基酸的邻近处插入一个或两个氨基酸；编码SEQ ID NO：2所示氨基酸 序列的烟碱脱甲基酶基因，其中第1至328位中任意位置处的氨基酸被终 止密码子取代；编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的烟碱脱甲基酶基因， 其中第330至457位中任意位置处的氨基酸被终止密码子取代；含有SEQ ID NO：1所示序列的烟碱脱甲基酶基因，其中核酸+2021位的鸟嘌呤被腺嘌呤 取代；含有SEQ ID NO：1所示序列的烟碱脱甲基酶基因，其中核酸+2291 位的鸟嘌呤被腺嘌呤取代；含有SEQ ID NO：1所示序列的烟碱脱甲基酶基 因，其中内含子中插入剪接供体；含有SEQ ID NO：1所示序列的烟碱脱甲 基酶基因，其中内含子中插入剪接受体。在具体实施方案中，对Nicotiana 属种植物种子的细胞进行诱变。
在一些实施方案中，第二种烟草植物表现出表型性状，例如疾病抗性、 高产量、高等级指标、调制特性、调制质量、机器可采收性、固定能力、 烟叶品质、高度、植物成熟度(例如早熟、早熟至中熟、中熟、中熟至晚熟、 或晚熟)、叶柄大小(例如小、中或大叶柄)、或每株植物长出的叶的数目(例 如叶的数目少(如5-10片叶)、中等(如11-15片叶)或多(如16-21片叶))。在 其它实施方案中，方法还包括用能用于生产杂种或雄性不育杂种的花粉供 体对雄性不育花粉受体进行自花传粉或传粉。雄性不育花粉受体植物或花 粉供体植物的烟碱脱甲基酶基因座具有突变等位基因。在一些实施方案中， 这两种植物的烟碱脱甲基酶基因座的等位基因都是突变等位基因。
本文还提供了经调制的烟草材料(curing tobacco material)。在某些实施 方案中，经调制的烟草从包含具有烟碱脱甲基酶基因突变之植物的杂种、 品种或品系制得。在其它实施方案中，烟碱脱甲基酶基因中存在突变的烟 草植物具有非-转变者表型。在其它实施方案中，与包含含野生型烟碱脱甲 基酶基因的植物的相应杂种、品种或品系相比，该植物的后代具有降低的 回复突变率。在其它实施方案中，经调制的烟草从含有被RNAi构建体转化 之植物的杂种、品种或品系制得，所述构建体含有烟碱脱甲基酶基因或其 片段。在其它实施方案中，经调制的烟草从含有被RNAi构建体转化之植物 的杂种、品种或品系制得，所述构建体含有选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、 SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的核酸序列。在某些实施方案中，通过选自 热风管处理法(flue curing)、晾制法(air curing)、明火烘烤处理法(fire curing) 和晒制法(sun curing)的处理方法来制备经调制的烟草材料。
本文还提供了烟草制品。在一个具体实施方案中，烟草制品含有经调 制的烟草材料，所述材料得自包含在烟碱脱甲基酶基因座具有突变等位基 因之植物的杂种、品种或品系。在其它实施方案中，经调制的烟草制备自 含有被RNAi构建体转化之植物的杂种、品种或品系，所述构建体含有烟碱 脱甲基酶基因或其片段。在其它实施方案中，经调制的烟草制备自含有被 RNAi构建体转化之植物的杂种、品种或品系，所述构建体含有选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的核酸序列。在某些实 施方案中，烟草制品是卷烟制品(cigarette product)、雪茄烟制品(cigar product)、烟丝制品(pipe tobacco product)、无烟烟草制品(smokeless tobacco product)、薄层(film)、薄片(tab)、凝胶(gel)、成型部分(shpaed part)、烟杆(rod) 或泡沫(foam)。
本文提供了M1烟草植物及其后代。M1烟草植物的烟碱脱甲基酶基因 座上的突变等位基因可以是杂合的，并且能产生后代，其中所述植物的第 一代自花传粉后代中的至少一部分表现出非-转变者表型。所述M1烟草植 物的后代可回复突变成转变者表型，其回复突变率在统计学上显著低于在 所述烟碱脱甲基酶基因座上含有野生型等位基因的相应烟草植物的后代的 回复突变率。M1烟草植物可表现出非-转变者表型，并且能产生后代，所述 后代可回复突变成转变者表型，其回复突变率在统计学上显著低于在所述 烟碱脱甲基酶基因座上含有野生型等位基因的相应烟草植物的后代的回复 突变率。在一个具体实施方案中，植物或后代实质上源自BU 64，CC 101，CC 200，CC 27，CC 301，CC 400，CC 500，CC 600，CC 700，CC 800，CC 900，Coker 176，Coker 319，Coker 371 Gold，Coker 48，CU 263，DF911，Galpao烟草，GL 26H，GL 350，GL 600，GL 737，GL 939，GL 973，HB 04P，K 149，K 326，K 346， K 358，K394，K 399，K 730，KDH 959，KT 200，KT204LC，KY 10，KY 14，KY 160，KY 17，KY 171，KY 907，KY907LC，KTY14x L8LC，Little Crittenden， McNair 373，McNair 944，msKY 14xL8，Narrow Leaf Madole，NC 100，NC 102， NC 2000，NC 291，NC 297，NC 299，NC 3，NC 4，NC 5，NC 6，NC7，NC 606， NC 71，NC 72，NC 810，NC BH 129，NC 2002，Neal Smith Madole，OXFORD 207，‘Perique’烟草，PVH03，PVH09，PVH19，PVH50，PVH51，R 610，R 630，R 7-11，R 7-12，RG 17，RG 81，RG H51，RGH 4，RGH 51，RS 1410，Speight 168， Speight 172，Speight 179，Speight 210，Speight 220，Speight 225，Speight 227， Speight 234，Speight G-28，Speight G-70，Speight H-6，Speight H20，Speight NF3，TI 1406，TN 86，TN86LC，TN 90，TN 97，TN97LC，TN D94，TN D950，TR (Tom Rosson)Madole，VA309或VA359。
本文还提供了烟草杂种、品种或品系，其中杂种、品种或品系的植物 被RNAi构建体转化，所述构建体含有烟碱脱甲基酶基因或其片段，其中与 缺乏RNAi构建体的对照烟草杂种、品种或品系的植物相比，所述植物表现 出降低的烟碱脱甲基酶基因表达。烟碱脱甲基酶基因或其片段的长度可以 是25至500或100至300个核苷酸。烟草杂种、品种或品系可以是白肋型、 深色型、烘烤型或东方型烟草。烟草杂种、品种或品系可以是普通烟草 (Nicotiana tabacum)杂种、品种或品系。品种实质上源自BU 64，CC 101，CC 200，CC 27，CC 301，CC 400，CC 500，CC 600，CC 700，CC 800，CC 900，Coker 176，Coker 319，Coker 371 Gold，Coker 48，CU 263，DF911，Galpao烟草，GL 26H，GL 350，GL 600，GL 737，GL 939，GL 973，HB 04P，K 149，K 326，K 346， K 358，K394，K 399，K 730，KDH 959，KT 200，KT204LC，KY 10，KY 14，KY 160，KY 17，KY 171，KY 907，KY907LC，KTY14x L8LC，Little Crittenden， McNair 373，McNair 944，msKY 14xL8，Narrow Leaf Madole，NC 100，NC 102， NC 2000，NC 291，NC 297，NC 299，NC 3，NC 4，NC 5，NC 6，NC7，NC 606， NC 71，NC 72，NC 810，NC BH 129，NC 2002，Neal Smith Madole，OXFORD 207，‘Perique’烟草，PVH03，PVH09，PVH19，PVH50，PVH51，R 610，R 630，R 7-11，R 7-12，RG 17，RG 81，RG H51，RGH 4，RGH 51，RS 1410，Speight 168， Speight 172，Speight 179，Speight 210，Speight 220，Speight 225，Speight 227， Speight 234，Speight G-28，Speight G-70，Speight H-6，Speight H20，Speight NF3，TI 1406，TI 1269，TN 86，TN86LC，TN 90，TN 97，TN97LC，TN D94，TN D950，TR(Tom Rosson)Madole，VA 309或VA359。杂种、品种或品系可以是 普通烟草(Nicotiana tabacum)杂种、品种或品系。
本文还提供了烟草杂种、品种或品系，其中所述杂种、品种或品系的 植物被RNAi构建体转化，所述构建体含有选自SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6， SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的核酸序列，其中与缺乏RNAi构建体的对照 烟草杂种、品种或品系的植物相比，所述植物表现出降低的烟碱脱甲基酶 基因表达。品种实质上源自BU 64，CC 101，CC 200，CC 27，CC 301，CC 400， CC 500，CC 600，CC 700，CC 800，CC 900，Coker 176，Coker 319，Coker 371 Gold，Coker 48，CU 263，DF911，Galpao烟草，GL 26H，GL 350，GL 600，GL 737，GL 939，GL 973，HB 04P，K 149，K 326，K 346，K 358，K394，K 399，K 730，KDH 959，KT 200，KT204LC，KY 10，KY 14，KY 160，KY 17，KY 171， KY 907，KY907LC，KTY14x L8LC，Little Crittenden，McNair 373，McNair 944，msKY 14xL8，Narrow Leaf Madole，NC 100，NC 102，NC 2000，NC 291， NC 297，NC 299，NC 3，NC 4，NC 5，NC 6，NC7，NC 606，NC 71，NC 72，NC 810，NC BH 129，NC 2002，Neal Smith Madole，OXFORD 207，‘Perique’烟草， PVH03，PVH09，PVH19，PVH50，PVH51，R 610，R 630，R 7-11，R 7-12，RG 17， RG 81，RG H51，RGH 4，RGH 51，RS 1410，Speight 168，Speight 172，Speight 179，Speight 210，Speight 220，Speight 225，Speight 227，Speight 234，Speight G-28，Speight G-70，Speight H-6，Speight H20，Speight NF3，TI 1406，TI 1269， TN 86，TN86LC，TN 90，TN 97，TN97LC，TN D94，TN D950，TR(Tom Rosson) Madole，VA 309或VA359。
本文提供了产生烟草植物的方法。所述方法包括：在Nicotiana属植物 的细胞中导入RNAi构建体，所述构建体含有烟碱脱甲基酶基因或其片段， 由所述细胞获得一种或多种植物，鉴定出至少一种植物，与缺乏RNAi构建 体的相应烟草植物相比，该植物表现出降低的烟碱脱甲基酶基因表达。该 方法还包括：使含有RNAi构建体的植物与第二种Nicotiana属植物杂交， 选择与缺乏RNAi构建体的相应烟草植物相比，表现出降低的烟碱脱甲基酶 基因表达的杂种后代。
在某些其它实施方案中，本发明涉及产生烟草植物的方法。在具体实 施方案中，产生烟草植物的方法包括使得被含有烟碱脱甲基酶基因或其片 段的RNAi构建体转化的植物与第二种Nicotiana属植物杂交，并选择具有 RNAi构建体的杂种后代。
在一些实施方案中，第二种烟草植物表现出表型性状，例如疾病抗性、 高产量、高等级指标、调制特性、调制质量、机器可采收性、固定能力、 烟叶品质、高度、植物成熟度(例如早熟、早熟至中熟、中熟、中熟至晚熟、 或晚熟)、叶柄大小(例如小、中或大叶柄)、或每株植物长出的叶的数目(例 如叶的数目少(如5-10片叶)、中等(如11-15片叶)或多(如16-21片叶))。在 其它实施方案中，方法还包括用能用于生产杂种或雄性不育杂种的花粉供 体对雄性不育花粉受体进行自花传粉或传粉。雄性不育花粉受体植物或花 粉供体植物被含有烟碱脱甲基酶基因或其片段的RNAi构建体转化。
除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语的含义都与本发明所 属技术领域的技术人员通常所理解的含义相同。尽管与本文所述类似或等 同的方法和材料可用于本发明的实践中，但是，下文描述了适当的方法和 材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献皆全文列 入本文作为参考。当出现抵触时，以本说明书，包括定义为准。此外，本 文所述的材料、方法和实施例仅是为了阐明而不是限制本发明。
下文中的附图和详细描述部分描述了本发明的一个或多个技术方案的 细节。从描述部分和附图以及权利要求书中可明显看出本发明的其它特征、 目的和优点。
附图描述
图1显示了相对于突变状态而言，TN90烟草品系经乙烯处理的烟叶中 由气相层析测定的烟碱至去甲烟碱的转变百分比。A：品系4246，B：品系 1849，C：品系4278，D：品系4215，E：品系3320和F：品系1394。“杂 合(hetero)”表示植物中突变的烟碱脱甲基酶等位基因是杂合的。“纯合 (homo)”表示植物中突变的烟碱脱甲基酶等位基因是纯合的。“野生型(wild)” 表示植物中野生型烟碱脱甲基酶是纯合的。
图2显示了烟碱脱甲基酶核酸序列(SEQ ID NO：1)和氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。左侧是对应于核苷酸序列的编号，右侧是对应于氨基酸序列的编 号。使用Web Signal Scan程序和序列比对工具鉴定下述内容：底物识别位 点(框内)，N-末端疏水性跨膜结构域(下划线)，富含脯氨酸的区域(斜体下划 线)，含苏氨酸的氧-结合袋(点状下划线)，K-螺旋和PERF共有序列(破折号 下划线)和含半胱氨酸的血红素结合区域(黑体双下划线)。
图3图解显示了烟碱脱甲基酶RNAi构建体。CsVMV-木薯脉花叶病毒 启动子；NDMas-反义烟碱脱甲基酶序列；NDMs-有义烟碱脱甲基酶序列； Ter-Nos终止子；Act2-拟南芥肌动蛋白2启动子；NPTII-新霉素磷酸转移酶 II基因。
发明详述
本发明涉及与烟碱脱甲基酶活性降低的烟草植物相关的组合物和方 法。例如，本发明提供了烟碱脱甲基酶基因中含有一个或多个突变的烟草 植物。本发明还提供了含有双链RNA的烟草植物，所述RNA含有烟碱脱 甲基酶基因的核酸序列。其基因组中含有突变的烟碱脱甲基酶序列的烟草 植物或含有双链RNA，其中RNA含有烟碱脱甲基酶基因的核酸序列的烟草 植物一般具有降低的去甲烟碱含量。所述植物可用于烟草育种程序、制备 经调制的烟草以及制备多种烟草制品和/或烟草衍生制品。
烟碱脱甲基酶基因中的突变
一般通过在Nicotiana属种的细胞中诱导突变来产生本文所述的烟草植 物。术语“诱变”指的是使用诱变剂在个体群中诱导基因突变。被诱变的 群体可含有植物、植物部分或种子。对于被诱变的群体而言，针对每种植 物组织类型需通过实验来确定诱变化合物或辐射的剂量，以使获得的突变 率低于特征在于致死率或生殖不育性的阈值。基于预期的突变率来估计由 诱变处理导致的M1代种子的数目或M1植物群体的大小。
然后在经诱变的群体或该群体的后代中筛选出由突变导致的合乎需要 的性状(例如非-转变者表型)。或者，在经诱变的群体或该群体的后代中筛 选出感兴趣的基因，如烟碱脱甲基酶基因中发生的突变。例如，可评价M1 植物后代M2代的烟碱脱甲基酶基因中是否存在突变。“群体”是共享同一 个基因库的任何个体组合。本文所用的“M0”指的是暴露于诱变剂的植物 细胞(和由其培养出的植物)，而“M1”指的是由自花传粉的M0植物产生的 种子以及由该种子培养出的植物。“M2”是自花传粉的M1植物的后代(种子 和植物)，“M3”是自花传粉的M2植物的后代，“M4”是自花传粉的M3植 物的后代，“M5”是自花传粉的M4植物的后代，“M6”、“M7”等各是自花 传粉的上一代植物的后代。本文所用术语“selfed”指的是自花传粉。
适当的诱变剂包括例如：化学诱变剂和电离辐射。适于诱导突变的化 学诱变剂包括亚硝酸、叠氮钠、丫啶橙、溴化乙锭和甲基磺酸乙酯。适于 诱导突变的电离辐射包括X-射线、γ射线、快速中子辐射和UV辐射。其它 方法包括使用转座子(Fedoroff et al.，1984；美国专利号4,732,856和美国专 利号5,013,658)以及T-DNA插入方法学(Hoekema et al.，1983；美国专利号 5,149,645)。可在烟草基因中诱导的突变类型包括例如点突变、缺失、插入、 重复和倒位。
在一些实施方案中，通过在导致体细胞克隆变体产生的组织培养中培 养植物细胞来诱导突变。或者，利用被开发用于生产杂种植物的使用原生 质体融合的标准原生质体培养方法学来生产具有变体基因表达(例如变体烟 碱脱甲基酶基因表达)的植物。相应地，由具有变体基因表达的第一和第二 种烟草植物产生原生质体。由成功的原生质体融合培养出愈伤组织，然后 产生植物。根据本文所述的方法鉴定所得的后代杂种植物并选择变体基因 表达，将所述植物用于本文所述的育种方法。
本文所用术语“烟碱脱甲基酶基因”指的是编码烟碱脱甲基酶多肽的 基因组核酸序列。烟碱脱甲基酶基因包括烟碱脱甲基酶基因座上的编码序 列，还包括非编码序列，如调节区、内含子和其它非翻译序列。野生型烟 碱脱甲基酶基因可含有SEQ ID NO：1所示的核酸序列。本文所用术语“烟 碱脱甲基酶多肽”指的是具有烟碱脱甲基酶活性的细胞色素P450 CYP82E4 多肽。“烟碱脱甲基酶活性”是对烟碱进行N’-脱甲基化以产生去甲烟碱的 能力。野生型烟碱脱甲基酶多肽可含有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
如本文(如图2和实施例5)所提供，烟碱脱甲基酶多肽可含有与其它细 胞色素P450多肽中的保守结构域具有同源性的区域。例如，经TFSEARCH 和Web Signal Scan程序鉴定，具有SEQ ID NO：2所示序列的多肽含有6个 底物识别位点(SRS)，一个N-末端疏水性跨膜结构域，一个富含脯氨酸的区 域，一个含苏氨酸的氧-结合袋，一个K-螺旋共有序列，一个PERF共有序 列和一个含半胱氨酸的血红素结合区域。参见图2。据认为K-螺旋和PERF 共有序列可使细胞色素P450多肽的核心结构稳定化。血红素结合区域含有 半胱氨酸，该氨基酸在依赖于电子供体的细胞色素P450多肽中绝对是保守 的。据认为富含脯氨酸的区域在多肽的跨膜区域和球状部分之间形成铰链。 参见例如Werck-Reichhart and Feyereisen(2000)Genome Biology 1：3003。
优选烟碱脱甲基酶基因中的突变导致含有突变的植物中的烟碱脱甲基 酶活性降低，或甚至完全消失。烟碱脱甲基酶基因中的适当突变类型包括 但不限于在野生型烟碱脱甲基酶基因序列中插入核苷酸、缺失核苷酸或进 行转换或颠换。编码序列中的突变可导致相应基因产物中一个或多个氨基 酸的插入、一个或多个氨基酸的缺失和/或非-保守性氨基酸的取代。在一些 情况下，烟碱脱甲基酶基因序列中含有一个以上的突变或一种以上的突变 类型。
例如，编码序列中插入或缺失氨基酸可以破坏所得基因产物的底物结 合袋的构象。氨基酸插入或缺失也可破坏对基因产物活性而言至关重要的 催化位点(例如血红素结合位点)。本领域已知：与插入或缺失较小数目的氨 基酸相比，插入或缺失较大数目邻接的氨基酸更可能使得基因产物无功能。 所述突变的例子是编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的烟碱脱甲基酶基因 中的突变，所述突变导致氨基酸329位的色氨酸被终止密码子取代。
非-保守性氨基酸取代可用不同类氨基酸取代一类氨基酸。非-保守性取 代可使基因产物的电荷或疏水性发生实质性变化。非-保守性氨基酸取代也 可使残基侧链的体积发生实质性变化，例如用丙氨酸取代异亮氨酸。非-保 守性取代的例子包括用碱性氨基酸取代非-极性氨基酸，或用极性氨基酸取 代酸性氨基酸。所述突变的例子是：编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的 烟碱脱甲基酶基因中的突变，所述突变导致氨基酸107位的脯氨酸被亮氨 酸取代。
在一些实施方案中，烟碱脱甲基酶基因中的突变未导致氨基酸改变(例 如沉默突变)。沉默突变是不会影响编码多肽的氨基酸序列的核苷酸序列中 的突变。能有效降低烟碱脱甲基酶活性的沉默突变包括SEQ ID NO：1所示 烟碱脱甲基酶基因中的突变，其中核酸+2021位的鸟嘌呤被腺嘌呤取代，或 核酸+2291位的鸟嘌呤被腺嘌呤取代。其它不会导致氨基酸变化的突变可以 位于5’非编码区(如启动子或5’非翻译区)、内含子或3’非编码区。所述突变 尽管不影响所编码烟碱脱甲基酶的氨基酸序列，但可改变转录水平(例如增 加或降低转录)、降低翻译水平、改变DNA或mRNA的二级结构、改变转 录或翻译机的结合位点或降低tRNA结合效率。降低或消除烟碱脱甲基酶活 性的适当突变包括在烟碱脱甲基酶基因的内含子中插入剪接供体、在内含 子中插入剪接受体或缺失内含子的剪接位点所致的突变。
在某些实施方案中，通过鉴定烟碱脱甲基酶基因中具有突变的植物并 测定烟碱脱甲基酶活性来确定能有效降低烟碱脱甲基酶活性的烟碱脱甲基 酶基因突变。在其它实施方案中，基于本文所述突变的效果，例如表1和 表3所示的TN90品系4246，1849，4278和4215中所含的那些突变的效果 来预测适于降低烟碱脱甲基酶活性的烟碱脱甲基酶基因突变。例如，编码 SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的烟碱脱甲基酶基因中的突变可包括用终止 密码子取代氨基酸1-328中任一个的突变。
在另一个实施方案中，基于相关序列，如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4 的功能来鉴定能有效降低烟碱脱甲基酶活性的烟碱脱甲基酶基因突变。例 如，可以突变烟碱脱甲基酶基因，以使其编码在SEQ ID NO：2中具有突变 组合的烟碱脱甲基酶多肽，所述突变组合如I163M，K309E，G353C和S452P 的组合，或Q416L和S423P的组合。
在某些其它实施方案中，基于烟碱脱甲基酶多肽结构的分子模型或序 列分析来鉴定能有效降低烟碱脱甲基酶活性的烟碱脱甲基酶基因突变。所 述分子模型或序列分析可用于鉴定发生突变时哪些氨基酸会改变多肽的结 构或功能。例如，分子模型可用于鉴定底物结合袋中的哪些氨基酸可被缺 失或被非保守性的氨基酸取代以降低烟碱至去甲烟碱的转变水平。在另一 个例子中，序列分析可确定哪些氨基酸可被终止密码子取代以破坏保守的 结构域。例如，编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的烟碱脱甲基酶基因中 的突变可包括用终止密码子取代氨基酸330-457中的任一个，从而破坏烟碱 脱甲基酶的血红素-结合位点的突变。
具有突变的烟碱脱甲基酶等位基因的烟草植物
由经诱变个体的细胞获得一株或多株M1烟草植物，至少一株植物被鉴 定为含有烟碱脱甲基酶基因突变。M1烟草植物烟碱脱甲基酶基因座处突变 的等位基因可以是杂合的，由于野生型等位基因的存在，该植物表现出转 变者表型，即能将烟碱转变为去甲烟碱。在这种情况下，所述植物第一代 自花传粉后代中的至少一部分表现出非-转变者表型。或者，M1烟草植物的 烟碱脱甲基酶基因座处可具有突变的等位基因，并表现出非-转变者表型。 所述植物可以是杂合的，尽管存在野生型等位基因，但由于显性失活阻抑 现象的存在，该植物可表现出非-转变者表型，或者所述植物也可以是纯合 的，因为烟碱脱甲基酶基因座处的两个等位基因都有独立诱导的突变。然 而，两种类型M1植物的后代可回复突变成转变者表型，但其回复突变率在 统计学上显著低于在烟碱脱甲基酶基因座处为野生型的相应烟草植物后代 的回复突变率，这一点将在下文中讨论。
携有突变的烟碱脱甲基酶等位基因的M1烟草植物可源自Nicotiana属 的种，例如普通烟草(Nicotiana tabacum)，Nicotiana otophora，Nicotiana thrysiflora，绒毛烟草(Nicotiana tomentosa)，茸毛烟草(Nicotiana tomentosiformis)，Nicotiana africana，Nicotiana amplexicaulis，Nicotiana arentsii，Nicotiana benthamiana，印度烟草(Nicotiana bigelovii)，Nicotiana corymbosa，Nicotiana debneyi，Nicotiana excelsior，Nicotiana exigua，粘毛烟 草(Nicotiana glutinosa)，Nicotiana goodspeedii，野生烟草(Nicotiana gossei)， Nicotiana hesperis，Nicotiana ingulba，Nicotiana knightiana，Nicotiana maritima，Nicotiana megalosiphon，Nicotiana miersii，Nicotiana nesophila， Nicotiana noctiflora，Nicotiana nudicaulis，Nicotiana otophora，Nicotiana palmeri，Nicotiana paniculata，Nicotiana petunioides，Nicotiana plumbaginifolia， Nicotiana repanda，Nicotiana rosulata，Nicotiana rotundifolia，黄花烟草 (Nicotiana rustica)，Nicotiana setchelli，Nicotiana stocktonii，Nicotiana eastii， Nicotiana suaveolens或沙漠烟草(Nicotiana trigonophylla)。
特别有用的普通烟草(Nicotiana tabacum)品种包括白肋型、深色型、烘 烤型和东方型烟草，如烟草品种BU 64，CC 101，CC 200，CC 27，CC 301，CC 400，CC 500，CC 600，CC 700，CC 800，CC 900，Coker 176，Coker 319，Coker 371 Gold，Coker 48，CU 263，DF911，Galpao烟草，GL 26H，GL 350，GL 600， GL 737，GL 939，GL 973，HB 04P，K 149，K 326，K 346，K 358，K394，K 399，K 730，KDH 959，KT 200，KT204LC，KY 10，KY 14，KY 160，KY 17，KY 171， KY 907，KY907LC，KTY14x L8LC，Little Crittenden，McNair 373，McNair 944，msKY 14xL8，Narrow Leaf Madole，NC 100，NC 102，NC 2000，NC 291， NC 297，NC 299，NC 3，NC 4，NC 5，NC 6，NC7，NC 606，NC 71，NC 72，NC 810，NC BH 129，NC 2002，Neal Smith Madole，OXFORD 207，‘Perique’烟草， PVH03，PVH09，PVH19，PVH50，PVH51，R 610，R 630，R 7-11，R 7-12，RG 17， RG 81，RG H51，RGH 4，RGH 51，RS 1410，Speight 168，Speight 172，Speight 179，Speight 210，Speight 220，Speight 225，Speight 227，Speight 234，Speight G-28，Speight G-70，Speight H-6，Speight H20，Speight NF3，TI 1406，TI 1269， TN 86，TN86LC，TN 90，TN 97，TN97LC，TN D94，TN D950，TR(Tom Rosson) Madole，VA 309或VA359。
携有突变的烟碱脱甲基酶等位基因的烟草植物可用于植物育种程序以 产生新的和有用的品系、品种和杂种。因此，在一些实施方案中，将含有 至少一个烟碱脱甲基酶基因突变的M1、M2、M3或再下一代的烟草植物与 第二种Nicotiana植物杂交，鉴定出存在烟碱脱甲基酶基因突变的杂交后代。 应理解第二种Nicotiana植物可以是本文所述的种和品种之一。也应理解第 二种Nicotiana植物可含有与其欲杂交的植物相同的烟碱脱甲基酶突变，也 可含有不同的烟碱脱甲基酶突变，或者其烟碱脱甲基酶基因座处可以是野 生型的。
通过已知方法进行育种。DNA指纹分析、SNP或类似的技术可用于标 记-辅助的选择(MAS)育种程序，以按本文所述将烟碱脱甲基酶基因的突变 等位基因转移或培育至其它烟草中。例如，育种者可使含有突变等位基因 的基因型与农学上合乎需要的基因型进行杂交，以产生分离的群体。使用 本文所列的一种技术，使用由烟碱脱甲基酶序列或其片段开发出的标记筛 选出F2或回交代植物。将被鉴定为含有突变等位基因的植物回交或自花传 粉以产生待筛选的第二个群体。根据预期的遗传性状模式或所用的MAS技 术，或许有必要在每个回交周期之前对选定的植物进行自花传粉，这样有 助于鉴定合乎需要的个体植物。可以重复进行回交或其它育种程序，直至 发现回归亲本合乎需要的表型。
表现出与普通烟草(Nicotiana tabacum)的育种相容性的Nicotiana属种 包括：Nicotiana amplexicaulis，PI 271989；Nicotiana benthamiana PI 555478； Nicotiana bigelovii PI 555485；Nicotiana debneyi；Nicotiana excelsior PI 224063；Nicotiana glutinosa PI 555507；Nicotiana goodspeedii PI 241012； Nicotiana gossei PI 230953；Nicotiana hesperis PI 271991；Nicotiana knightiana PI 555527；Nicotiana maritima PI 555535；Nicotiana megalosiphon PI 555536；Nicotiana nudicaulis PI 555540；Nicotiana paniculata PI 555545； Nicotiana plumbaginifolia PI 555548；Nicotiana repanda PI 555552；Nicotiana rustica；Nicotiana suaveolens PI 230960；野烟草(Nicotiana sylvestris)PI 555569；Nicotiana tomentosa PI 266379；Nicotiana tomentosiformis；and Nicotiana trigonophylla PI 555572。也可参见American Phytopathology Society 出版的Compendium of Tobacco Diseases或Japan Tobacco Inc出版的The Genus Nicotiana Illustrated。
成功的杂交产生能育的F1植物，必要时，该植物能与亲本之一回交。 在一些实施方案中，筛选F2代植物群体中的变体烟碱脱甲基酶基因表达， 例如，根据标准方法，如通过使用PCR法，鉴定出因缺乏烟碱脱甲基酶基 因而不能表达烟碱脱甲基酶的植物，所述PCR法所用引物可基于本文所述 的烟碱脱甲基酶核苷酸序列信息。然后使选定植物与亲本之一杂交，使第 一代回交(BC1)植物自花传粉以产生BC1F2群体，再次筛选其变体烟碱脱甲 基酶基因表达(如烟碱脱甲基酶基因的无效形式)。将回交、自花传粉和筛选 的过程重复例如至少4次，直至最终的筛选产生能育的、适当类似于回归 亲本的植物。必要时将该植物自花传粉，随后再次筛选后代以进一步证实 植物表现出变体烟碱脱甲基酶基因表达(例如显示出烟碱脱甲基酶无效状态 的植物)，或表现出NDM核酸序列或其片段的变体表达。任选对选定植物 进行细胞遗传学分析以进一步证实染色体组和染色体配对关系。使用标准 方法产生选定植物的原原种，所述方法包括例如田间试验、证实烟碱脱甲 基酶无效状态、对经调制的烟叶进行化学分析以确定生物碱的水平和/或对 经调制的烟叶进行化学分析以确定去甲烟碱与烟碱+去甲烟碱的比率。
在将由第一种突变的烟草亲本(如TN90)和第二种野生型烟草亲本(如 N.rustica)之间杂交所得的原始F1杂种与突变的烟草亲本杂交或回交的情形 下，回交的后代可自花传粉以产生BC1F2代，BC1F2代可用于筛选突变的烟 碱脱甲基酶等位基因。
使用本文所述的突变烟草植物进行植物育种程序的结果是产生新的、 有用的品系、杂种和品种。本文所用术语“品种”指的是都具有能将其与 相同种(species)的其它植物区分开的恒定特征的植物群体。品种尽管不总 是，但是经常能商业购买。在具有一个或多个与众不同的性状的同时，品 种的特征还在于品种内部的个体之间存在很小的整体差异。通过几代自花 传粉和选择，或使用组织或细胞培养技术由单个亲本进行营养繁殖，即可 产生“纯品系”品种。品种实质上可源自另一品系或品种。如国际植物新 品种保护条约(1961年12月2日制订，1972年11月10日、1978年10月 23日和1991年3月19日修订)所定义，如果满足下述条件，可以说品种“基 本上源自”原始品种：a)其主要源自原始品种，或源自主要源自原始品种的 品种，同时保留了因原始品种的基因型或基因型组合所致的重要特征的表 达；b)其明显不同于原始品种；和c)除了因衍生行为导致的差异外，其在因 原始品种的基因型或基因型组合所致的重要特征的表达方面与原始品种一 致。通过例如从原始品种植物中选择天然或诱导的突变体、体细胞克隆变 体、变体个体，回交或转化，即可获得实质上源自原始品种的品种。与品 种有所不同的“品系”最经常地表示非商业化使用，例如用于植物研究的 一组植物。品系的个体之间在一个或多个感兴趣的性状上一般不会显示出 太大的整体差异，但个体之间在其它性状上可能会有一些差异。
通过防止第一个品种的雌性亲本植物(即种子亲本)自花传粉，允许第二 个品种的雄性亲本植物的花粉与雌性亲本植物受精，并在雌性植物上形成 F1杂种种子，即可产生杂种烟草品种。通过在花发育的早期对花进行去雄 即可防止雌性植物的自花传粉。或者，使用雄性不育形式防止雌性亲本植 物上形成花粉。例如，通过胞质雄性不育(CMS)、核雄性不育、遗传雄性不 育、分子雄性不育(其中转基因抑制了小孢子发生和/或花粉形成)或自交-不 亲和性来产生雄性不育性。含有CMS的雌性亲本植物特别有用。在雌性亲 本植物是CMS的实施方案中，雄性亲本植物一般含有育性恢复基因以确保 F1杂种是可育的。在雌性亲本是CMS的其它实施方案中，可使用不含育性 恢复基因的雄性亲本。由这种亲本产生的F1杂种是雄性不育的。雄性不育 杂种的种子可与雄性可育的种子间种以在所得雄性不育植物上提供下种用 的花粉。
本文所述的品种和品系可用于形成单交烟草F1杂种。在这种实施方案 中，可将亲本品种的植物培养成基本上为纯系的邻接群体，以便于雄性亲 本植物天然异花传粉至雌性亲本植物。通过常规方法选择性收集雌性亲本 植物上形成的F1种子。也可以大批量培养两个亲本植物品种，并收集雌性 亲本上形成的F1杂种种子和因自花传粉而在雄性亲本上形成的种子的混合 物。或者，可进行三源杂交，其中将单交F1杂种用作雌性亲本，并与不同 的雄性亲本杂交。或者，可产生双杂交种，其中两个不同单交的F1后代自 身进行杂交。当形成双杂交种时，自交-不亲和性对于防止雌性亲本的自花 传粉特别有用。
本文所用的具有转变者表型的烟草植物是从高至膝盖或更后阶段的烟 草植物上收集中间位置的烟叶，经乙烯处理后测得烟碱脱甲基化百分比至 少为5％(如4.9％，4.5％，4.2％，4％，3.8％，3.5％，3％，2％，1％，0.8％，0.6％，0.5％， 0.05％，0.02％，0.01％或不可测)的烟草植物。术语“具有转变者表型的植物” 和“转变者植物”在本文中可互换使用。类似地，具有非-转变者表型的烟 草植物是从高至膝盖或更后阶段的烟草植物上收集中间位置的烟叶，经乙 烯处理后测得烟碱脱甲基化百分比低于5％(如4.9％，4.5％，4.2％，4％，3.8％， 3.5％，3％，2％，1％，0.8％，0.6％，0.5％，0.05％，0.02％，0.01％或不可测)的烟草 植物。术语“具有非-转变者表型的植物”和“非-转变者植物”在本文中可 互换使用。
使用本领域已知的方法(如气相层析)可测定经乙烯处理的烟叶中的烟 碱和去甲烟碱。通过用在样品中测得的去甲烟碱的水平除以烟碱和去甲烟 碱水平之和再乘以100，即可计算出样品中的烟碱脱甲基化百分比。
通过选择或筛选经诱变的植物材料或其后代，即可鉴定出含有烟碱脱 甲基酶基因突变的植物。本领域技术人员已知所述筛选和选择方法学。筛 选和选择方法学的例子包括但不限于Southern分析，或用于检测多核苷酸 的PCR扩增；Northern印迹、S1 Rnase保护、引物-延伸或用于检测RNA 转录物的RT-PCR扩增；用于检测多肽和多核苷酸的酶或核酶活性的酶解测 定法；以及蛋白质凝胶电泳、Western印迹、免疫沉淀和用于检测多肽的酶 联免疫测定法。也可使用其它技术，如原位杂交、酶染色和免疫染色来检 测多肽和/或多核苷酸的存在或表达。实施上述所有技术的方法都是已知的。
可从植物群体中筛选和/或选择出具有因烟碱脱甲基酶基因突变而赋予 的合乎需要的性状或表型，如非-转变者表型的群体成员。可在一代或多代 中进行选择和/或筛选，这可用于鉴定出具有所需性状的植物。在一些实施 方案中，可在M1代中鉴定出具有非-转变者表型的植物。也可在一个以上 的地理位置进行选择和/或筛选。另外，可在植物表现出表型的特定发育阶 段进行选择和/或筛选。
可使用具有非-转变者表型的植物群体来选择和/或筛选具有降低的回 复突变率(即转变者表型植物在非-转变者植物的下一代中的百分比)的植 物。通过在自花传粉之后收集非-转变者植物产生的种子，种植300至500 颗种子，并测定所得的具有转变者表型的植物的数目，即可测定回复突变 率。将回复突变率表示为具有转变者表型的后代植物的百分比。
对烟碱脱甲基酶基因中具有突变且表现出降低的回复突变率的非-转变 者植物进行育种以产生一个或多个烟草杂种、品种或品系，其回复突变率 在统计学上显著低于具有相同或类似的遗传背景，但携有野生型烟碱脱甲 基酶基因的对照烟草杂种、品种或品系的回复突变率。一般说来，当用适 当的参数或非-参数统计学，如Chi-square试验、Student′s t-试验、 Mann-Whitney试验或F-试验测得p≤0.05时，即可认为相对于对照杂种、 品种或品系，回复突变率的降低在统计学上是显著的。在一些实施方案中， 当p＜0.01，p＜0.005或p＜0.001时，回复突变率的降低在统计学上是显著 的。
回复突变率降低的程度一般取决于烟草类型。例如，相对于具有相同 或类似的遗传背景，但携有野生型烟碱脱甲基酶基因的白肋型烟草品种而 言，烟碱脱甲基酶基因中具有突变的非-转变者白肋型烟草的回复突变率一 般降低10X或更高(如10X至1000X，10X至100X，50X至250X，50X至100X， 150X至300X，100X至1000X，500X至1000X，800X至5000X，或1500X至 10000X)。在另一个实施例中，相对于具有相同或类似的遗传背景，但携有 野生型烟碱脱甲基酶基因的深色型烟草品种而言，烟碱脱甲基酶基因中具 有突变的非-转变者深色型烟草的回复突变率一般降低2X或更高(如2X至 100X，2X至5X，2X至10X，5X至30X，10X至50X，5X至100X，10X至100X， 50X至300X，250X至500X，300X至3000X，或3000X至5000X)。在另一 个实施例中，相对于具有相同或类似的遗传背景，但携有野生型烟碱脱甲 基酶基因的烘烤型烟草品种而言，烟碱脱甲基酶基因中具有突变的非-转变 者烘烤型烟草的回复突变率一般降低2X或更高(如2X至10X，5X至30X， 10X至50X，10X至100X，50X至150X，100X至500X，200X至800X，400X 至1000X，500X至3000X，或1000X至5000X)。在一些情况下，含有烟碱 脱甲基酶基因中具有突变的植物的烟草杂种、品种或品系的回复突变率可 以很低以至于检测不到。
筛选降低的回复突变率的方法可取决于经诱变植物材料的来源。例如， 如果经诱变的植物材料是具有转变者表型的植物的种子，适当的筛选方法 包括鉴定具有烟碱脱甲基酶基因突变的后代和/或鉴定具有非-转变者表型 的后代。一旦鉴定出这种后代，即从中筛选出其后代能表现出降低的回复 突变率的植物。在另一个实施例中，如果经诱变的植物材料是具有非-转变 者表型的植物的种子，适当的筛选方法包括鉴定具有烟碱脱甲基酶基因突 变的后代和/或确定后代是否具有降低的回复突变率。
在本文所述方法的一些实施方案中，使用标准的田间方法在田间评价 由育种和筛选变体烟碱脱甲基酶基因所得的品系。包括原始的未经诱变的 亲本的对照基因型被包括在内，以随机的完全分块设计或其它适当的田间 设计来安排各项目。使用标准的烟草农学操作，例如收获烟草、称重、在 调制处理之前和过程中取样以进行化学和其它常规检测。对数据进行统计 学分析以进一步证实选定品系与亲本品系的相似性。
烟碱脱甲基酶RNA干扰
适于RNA干扰(RNAi)的转化载体包括那些可产生能形成双螺旋的 RNA的载体(如烟碱脱甲基酶RNAi构建体)，两个核酸序列中的一个位于有 义方向，另一个位于反义方向，它们之间可操作地连接，并处于启动子的 控制之下，所述启动子如CaMV 35S、分离自木薯棕色条纹病病毒(CBSV) 的启动子或分离自木薯脉花叶病毒(CsVMV)的启动子。使用内源性启动子， 如烟碱脱甲基酶启动子或其能驱动转录的片段也是合适的。另外，该核酸 可与转录终止序列，如胭脂碱合成酶(nos)基因的终止子可操作相连。
该构建体中包含的烟草烟碱脱甲基酶核酸序列的长度需至少为22个核 苷酸，如至少为22，23，24，25，26，27，30，35，40，50，80，100，200，300，400， 500，700，1000，2000或更多个核苷酸，但可包含包括长至全长烟草烟碱脱甲 基酶基因的序列。该构建体中包含的烟草烟碱脱甲基酶核酸序列的长度可 以为22个核苷酸至2552个核苷酸，如22至100个核苷酸，25至250个核 苷酸，25至500个核苷酸，50至100个核苷酸，50至500个核苷酸，100 至300个核苷酸，100至500个核苷酸，300至600个核苷酸，500至1000 个核苷酸，700至1500个核苷酸，或1000至2000个核苷酸。一般说来， 可使用较高的同源性来补偿较短序列的使用。编码双链RNA的核酸构建体 所用的适当核酸包括SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8及其互补物，其中所述双链RNA与烟碱脱甲基酶基因类似或相同。
能形成双螺旋的RNA可含有环部分。双链RNA的环部分可以是3个 核苷酸至5,000个核苷酸，如3个核苷酸至25个核苷酸，15个核苷酸至1,000 个核苷酸，20个核苷酸至500个核苷酸，或25个核苷酸至200个核苷酸。 RNA的环部分可包括内含子或其片段。适当的环部分包括SEQ ID NO：9、 SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11。
实用性
本文提供的突变和转基因烟草植物对农业特别有用。所述植物可用于 本文所述的育种程序，以产生含有具有非-转变者表型的植物的烟草品系、 品种或杂种，其中与烟碱脱甲基酶基因为野生型或缺乏烟碱脱甲基酶RNAi 构建体的相应烟草品系、品种或杂种相比，所述品系、品种或杂种具有降 低的回复突变率。在一些情况下，本文提供的突变或转基因烟草植物可与 具有另一个所需性状的植物杂交，以产生既具有降低的回复突变率又具有 另一个所需性状的烟草品种。其它所需性状的例子包括耐旱性、疾病抗性、 烟碱含量、糖含量、烟叶大小、烟叶宽度、烟叶长度、烟叶颜色、烟叶变 红、节间距、开花时间、倒伏抗性、叶柄厚度、烟叶产量、疾病抗性；高 产量；高等级指标；调制特性；调制质量；机器可采收性；固定能力；烟 叶品质；高度；成熟度；叶柄大小；和每株植物长出的叶的数目。可根据 本领域的标准方法对烟草品系、品种或杂种进行育种。
在其它情况下，人们可根据已公开的烟碱脱甲基酶突变对具有所述突 变的植物表型的影响，寻找并鉴定出在其基因组中的烟碱脱甲基酶基因座 上携有天然突变等位基因的烟草植物。所述植物可用于育种程序，以产生 含有具有烟碱脱甲基酶基因突变的植物的烟草品系、品种或杂种，其中与 具有野生型烟碱脱甲基酶基因的相应烟草品系、品种或杂种相比，所述品 系、品种或杂种具有降低的回复突变率。
在某些实施方案中，含有具有烟碱脱甲基酶基因突变的植物或含有本 文提供的烟碱脱甲基酶RNAi构建体的烟草品系、品种或杂种可用于产生烟 草材料以用于制备烟草制品。适当的烟草材料包括完整的烟叶、烟草精制 品、烟草粉末、按尺寸制造的烟草薄片、经切割或辊压的烟梗、体积膨胀 的烟草和切碎的烟草。可使用本领域已知的调制方法，如晾制法、明火烘 烤处理法、热风管处理法(如大批量调制)和晒制法来调制得自已公开的突变 烟草植物的烟草材料。在一些实施方案中，烟草材料是陈化和/或经发酵的。 参见例如美国专利公开号20050178398。
在其它实施方案中，含有具有烟碱脱甲基酶基因突变的植物或含有本 文提供的烟碱脱甲基酶RNAi构建体的烟草品系、品种或杂种可用于制备烟 草制品，与由得自含有具有野生型烟碱脱甲基酶基因的植物的相应烟草品 系、品种或杂种的烟草制得的相应制品相比，所述烟草制品具有降低的去 甲烟碱含量。使用本文所述的烟草植物材料可生产亚硝胺含量降低的烟草 制品。烟草制品中去甲烟碱的量一般降低至低于约5mg/g。例如，所述制品 中的去甲烟碱含量或NNN含量可以为：4.5mg/g，4.0mg/g，3.5mg/g，3.0 mg/g，2.5mg/g，2.0mg/g，1.5mg/g，1.0mg/g，750μg/g，500μg/g，250μg/g，100 μg/g，75μg/g，50μg/g，25μg/g，10μg/g，7.0μg/g，5.0μg/g，4.0μg/g，2.0μg/g， 1.0μg/g，0.5μg/g，0.4μg/g，0.2μg/g，0.1μg/g，0.05μg/g或0.01μg/g。相对于 其中所含总生物碱含量而言，次级生物碱的百分比低于90％，如低于70％， 50％，30％，10％，5％，4％，3％，2％，1.5％，1％，0.75％，0.5％，0.25％或0.1％。
与去甲烟碱或NNN有关的术语“降低量”指的是：按照相同的方法加 工，烟草植物或植物组分或烟草制品中去甲烟碱或NNN或这两者的量低于 相同烟草品种的野生型烟草植物或植物组分或烟草制品中的相应量，其中 后者未为了降低去甲烟碱或NNN而进行转基因，或不具有烟碱脱甲基酶基 因突变。在一个实施例中，将按照相同方法加工过的相同品种的野生型烟 草植物用作对照，以测定通过本文所述的方法是否已使去甲烟碱或NNN或 这两者的量降低。在另一个实施例中，使用标准方法评价亚硝胺含量降低 的植物，所述方法包括例如监测基因或基因产物，如烟碱脱甲基酶、转基 因或基因中特定突变的存在或缺乏。在另一个实施例中，将由育种程序所 得植物的亚硝胺含量与具有降低量亚硝胺的植物育种所用的亲本品系之一 的亚硝胺含量进行比较。根据烟草领域众所周知的方法测定去甲烟碱和 NNN或这两者的水平。
在某些实施方案中，将得自本文所提供的烟草品系、品种或杂种的烟 草材料用于制备烟草制品，包括但不限于卷烟制品(如卷烟和比迪卷烟)、雪 茄烟制品(如雪茄包裹烟草和小雪茄)、烟斗烟草制品、无烟卷烟制品、无烟 烟草制品(如湿鼻烟、干鼻烟和嚼烟)、薄层、嚼烟、薄片、成型部分、凝胶、 可消耗单位、不溶性型片、中空模型等。参见例如美国专利公开号 2006/0191548。
下述实施例将进一步描述本发明，所述实施例不会限制权利要求书所 描述的本发明的范围。
实施例
实施例1-产生突变的Nicotiana植物
将1克烟草TN90(Tennessee 90)转变者种子(约10,000颗种子)置于0.1％ 吐温中洗涤15分钟，然后浸入30ml ddH2O中2小时。将150μl(0.5％)EMS (Sigma目录号M-0880)与种子/ddH2O溶液混合，于室温(RT，约20℃)在罩 下保温8-12小时(30rpm下旋转)。然后从种子中取出液体，使液体与1M NaOH混合过夜以进行净化和处理。用100ml ddH2O将种子洗涤两次达2-4 小时。然后将经洗涤的种子悬浮于0.1％琼脂：水溶液。
将琼脂溶液中经EMS处理过的种子均匀地铺在浅苗床中用水浸泡过的 Carolina’s Choice Tobacco MixTM(Carolina Soil Company，Kinston，NC)上，每 个苗床铺约2000颗种子。然后用SaranTM包裹物覆盖苗床，将苗床置于培 养室中。一旦幼苗从土壤中长出，将SaranTM包裹物刺破，使得湿度逐渐降 低。两周后完全除去SaranTM包裹物。将苗床移至温室，用NPK肥料为其 施肥。将幼苗插入浮盘培养直至达到可移植的尺寸。将植物移植到田间。 在培养过程中，使植物自花传粉以形成M1种子。在成熟阶段，从周围7000 株植物的每一株中采集5个蒴果，对每株植物种子的籽苗给出各自的命名， 这形成了M1群体。
实施例2-鉴定突变
培养实施例1中每株M0植物的M1多系种子，收集4至5株M1植物的 叶，从混合组织样品中提取DNA。从每个M1品系中取两个混合样品。根 据厂商提供的操作手册，使用Dneasy植物微型试剂盒(QIAGEN，目录号 69104)提取DNA。
设计经IRDyeTM 700标记的正向引物和经IRDyeTM 800标记的反向引物 以扩增烟碱脱甲基酶基因(SEQ ID NO：1)。选择两对覆盖了两个独立外显子 的序列特异性引物，通过PCR扩增烟碱脱甲基酶(ND)基因。引物F6(5’-GG AATTATGCCCATCCTACAG)和R1(5’-CCAGCATTGCAGGGTTCGGGAAG A)覆盖了ND基因的-82至+1139位核苷酸，并产生1,220个核苷酸长的片 段。引物F3(5’-CAGGTAAGGTCTAAAACGTGTGTTTGCTT)和R2(5’-AATA AAGCTCAGGTGCCAGGCGAGGCGCTAT)覆盖了ND基因的+1720至 +2549位，并产生830个核苷酸长的片段。
通过混合(1∶4)经IRDyeTM 700标记的引物与未经标记的引物来制备浓 度为5μM的正向引物。通过混合(3∶2)经IRDyeTM 800标记的引物与未经标 记的引物来制备浓度为5μM的反向引物。以正向引物：反向引物为2∶1的比 例来制备贮存引物(总引物浓度为5μM)。使用50-100ng得自混合植物组织 DNA样品的基因组DNA和Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen，目录号 10966-034)，对靶区域进行PCR扩增(10μl反应中用2μl引物)。PCR条件 如下：94℃2分钟1个循环；94℃1分钟，67℃1分钟，72℃1.5分钟， 共40个循环；72℃10分钟1个循环，然后维持于4℃。扩增之后，使样品 热变性和重新退火(95℃10分钟，每秒降2℃从95℃降至85℃，每秒降 0.1℃从85℃降至25℃，1个循环)，从而在突变的扩增子与其野生型配对 物之间形成异源双链体。
根据试剂盒中推荐的方法，使用SurveyorTM核酶(目录 号706025)消化异源双链体。核酶保温条件是42℃20分钟，通过添加终止 溶液(试剂盒)来终止反应。通过95℃加热2分钟，用测序加 样染料(98％去离子甲酰胺，10mM EDTA(pH 8.0)，0.025％溴酚蓝)使异源双 链体变性。使变性样品在冰上冷却，并上样于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳系 统。用6.5％KBPlus凝胶进行电泳，在LI-DNA分析仪(LI- Biosciences)上，在装配有0.25mm成层胶的18cm板中跑电泳，电泳条件为： 1500-2000V，30mA，50W和45℃3.5小时。
在混合样品中具有突变的聚丙烯酰胺凝胶泳道中，在IRDyeTM 700红外 线染料图像上的野生型条带下方可以看见一条带。在IRDyeTM 800红外线染 料图像上的相同泳道中可看见配对物条带。该条带是经IRDyeTM 800红外线 染料标记的从互补DNA链上裂解下来的产物。两个配对物条带的长度和等 于扩增子的大小。对图像进行分析之后，鉴定出突变的混合样品(具有迟出 条带)。
对从其混合样品中检测到突变的各个植物进行第二轮筛选。从阳性品 系中提取各个植物DNA，与野生型DNA样品混合以进行第二轮筛选。这 有助于分离相同M1库中的野生型和突变植物(包括纯合和杂合突变体)。具 有裂解条带的样品含有突变的ND基因序列，而缺乏裂解条带的样品含有野 生型ND基因序列。
仅使用突变的植物DNA为模板进行第三轮筛选以区分杂合和纯合植 物。没有裂解条带的样品是纯合的。使用CEQ 8000测序仪(Beckman， Fullerton，California)分析序列痕量信息以进一步证实突变。使用提取的DNA 为模板进行PCR扩增以产生ND基因片段用于测序。在1％琼脂糖凝胶上分 离PCR产物，纯化并进行测序。
测序步骤如下：95℃加热2分钟使DNA变性，随后置于冰上。在冰上 使用0.5至10μl变性DNA模板，2μl1.6pmole正向引物，8μl DTCS Quick Start Master Mix(用水将总体积调节为20μl)进行测序反应。热循环程序由 30轮下述循环组成：96℃20秒，50℃20秒，60℃4分钟，然后维持于4℃。 通过加入5μl终止缓冲液(等体积的3M NaOAc和100mM EDTA以及1μl 20 mg/ml糖原)以终止序列。用60μl冷的95％乙醇沉淀样品，6000g离心6分 钟。弃去乙醇，用200μl冷的70％乙醇将沉淀物洗涤两次。干燥沉淀物， 然后加入40μl SLS溶液，重新悬浮沉淀物并用矿物油层覆盖。然后将样品 置于测序仪(CEQ 8000自动测序仪)中测序。将序列与野生型序列进行比对。 另外，对几个选定品系的基因组烟碱脱甲基酶DNA进行测序，以进一步证 实每个品系中仅存在烟碱脱甲基酶基因单突变。
筛选出700个独立的M1库之后，鉴定出19个突变的品系。表1中列 出了每个品系中的突变。
表1
EMS突变烟草(TN90)中的烟碱脱甲基酶基因突变
  烟草品系   位置变化1   内容变化   说明   TN90-4246   自ATG起+1985位核苷酸   自M起+329位氨基酸   G变为A   w329终止密码子   产生329个氨基酸的   无义突变   TN90-1849   自ATG起+320位核苷酸   自M起+107位氨基酸   C变为T   P107L   SRS-1结构域中的错   义突变   TN90-1394   自ATG起+412位核苷酸   自M起+138位氨基酸   G变为A   V138I   错义突变   TN90-1761A   自ATG起+934位核苷酸   自ATG起+312位氨基酸   G变为A   V312M   SRS-4中紧接内含子   之前的错义突变   TN90-4281   自ATG起+2191位核苷酸   自M起+398位氨基酸   G变为A   S 398N   错义突变   TN90-1516   自ATG起+2307位核苷酸   自M起+437位氨基酸   G变为A   D437N   错义突变   TN90-1514   自ATG起+2307位核苷酸   自M起+437位氨基酸   G变为A   D437N   错义突变   TN90-3320   自ATG起+437位核苷酸   自M起+146位氨基酸   G变为A   S146N   错义突变   TN90-3341   自ATG起+704位核苷酸   自M起+235位氨基酸   C变为T   P235L   错义突变   TN90-3387   自ATG起+668位核苷酸   自M起+230位氨基酸   G变为A   D230N   错义突变   TN90-1804   自ATG起+244位核苷酸   自M起+82位氨基酸   C变为T   L82F   错义突变   TN90-1777   自ATG起+114位核苷酸   氨基酸无变化   C变为T   P38P   沉默突变   TN90-1803   自ATG起+342位核苷酸   氨基酸无变化   C变为T   Y114Y   沉默突变   TN90-4264   自ATG起+486位核苷酸   自M起+163位氨基酸   C变为T   S162S   沉默突变   TN90-1921   自ATG起+2024位核苷酸   自M起+343位氨基酸   G变为A   K343K   沉默突变   TN90-3147   自ATG起+429位核苷酸   氨基酸无变化   C变为T   L142L   沉默突变   TN90-4278   自ATG起+2021位核苷酸   +342位氨基酸无变化   G变为A   T342T   沉默突变   TN90-4215   自ATG起+2291位核苷酸   +431位氨基酸无变化   G变为A   E431E   沉默突变   TN90-1431   自ATG起+2397位核苷酸   自M起+467位氨基酸   G变为A   E467K   错义突变
1nt＝SEQ ID NO：1中的核苷酸数目，aa＝SEQ ID NO：2中的氨基酸残基数目。
这些突变的品系包括1个具有截短蛋白质的品系(TN90-4246)，11个具有 单个氨基酸变化的品系(TN90-1849，TN90-1394，TN90-1761，TN90-4281， TN90-1516，TN90-1514，TN90-3320，TN90-3341，TN90-3387，TN90-1804和 TN90-1431)和7个具有沉默突变的品系(TN90-1777，TN90-1803，TN90-4264， TN90-1921，TN90-3147，TN90-4278和TN90-4215)。将这些品系移植到田间以 进一步对其进行鉴定。将表1所列相同品系的多余M1种子播种至土壤，在温 室中培养以筛选出更多的纯合植物并分析生物碱含量。
实施例3-测定烟碱脱甲基化
植物材料和诱导处理
测试田间生长的实施例2中选定的M1突变品系将烟碱转变为去甲烟碱 的能力。用0.3％乙烯溶液(Prep brand Ethephon(Rhone-Poulenc))喷洒采自每 个处于高至膝盖或更后阶段的M1植物中间位置的烟叶，从而诱导去甲烟碱 的形成。将每片喷洒过的烟叶悬挂在装配有加湿器并覆盖有塑料制品的处 理架中。在整个处理阶段，用乙烯溶液周期性地喷洒取样的烟叶。乙烯处 理约3天之后，收集烟叶并在50℃的炉中干燥，以对生物碱进行气相层析(GC) 分析。
气相层析生物碱分析
按下文所述进行GC生物碱分析：将样品(0.1g)与0.5ml 2N NaOH和5ml 提取溶液一起以150rpm的转速振荡，所述提取溶液含有喹啉(作为内部标准) 以及甲基叔丁基醚。在装配有FID检测器的HP 6890GC(Hewlett Packard， Wilmington，DE，USA)上分析样品。检测器和注射器的使用温度为250℃。在 每分钟10℃的110-185℃温度梯度下使用GC柱(30m-0.32nm-1m)，所述柱由 与5％苯酚和95％甲基硅交联的融合硅组成。在100℃下，使用氦气为载气， 以2μl的注射量、1.7cm3/分钟的流速和40∶1的分传比对柱进行操作。用烟碱 的量除以烟碱和去甲烟碱的总量再乘以100，即可计算出烟碱脱甲基化百分 比。
表2显示了8个突变品系中具有非-转变者表型的植物的百分比以及烟碱 脱甲基化的平均百分比，所述百分比与所述品系中各个植物的基因突变状 况有关，包括纯合突变、杂合突变和纯合野生型。M1代中4个突变品系的烟 碱脱甲基化百分比低于5％，将其归类为表现出非-转变者表型，它们是突变 品系4246，1849，4215和4278。M1代中的其它4个突变品系的烟碱脱甲基化百 分比为5％或更高，将其归类为具有转变者表型，它们是突变品系1394，3320， 4264和1924。
表2
烟碱脱甲基酶突变品系中的烟碱脱甲基化水平

图1A-1D显示出突变品系4246，1849，4215和4278的杂合突变体、纯合突 变体和纯合野生型M1植物中转变者和非-转变者表型的频率。图1E和1F显示 出M1植物中烟碱脱甲基化无差异的突变品系的代表性结果。
实施例4-烟碱脱甲基酶突变品系中的RNA表达分析
使用半-定量RT-PCR分析两个品系的RNA以测定其mRNA表达。按实施 例3所述用乙烯处理各个品系中约20个单独的M1植物，处理3天后提取总 RNA。根据厂商的方法使用RNeasy Plant Mini(Qiagen，Inc.，Valencia， California)分离总RNA。在液氮下使用经DEPC处理过的研体和研杵将组织 样品研磨成细粉末。将约100mg磨碎的组织转移至无菌的1.5ml Eppendorf 将管置于液氮中直至收集到全部样品。然后，在每个单独的管中加 入试剂盒中提供的450μl Buffer RLT(添加了β-巯基乙醇)。将样品剧烈涡旋并 在56℃保温3分钟。然后将裂解物上样于位于2-ml收集管中的QIAshredderTM 自旋柱，以最大速度离心2分钟。
收集流出液，在澄清的裂解液中加入0.5倍体积的乙醇。将样品充分混 合，转移至位于2-ml收集管中的微型自旋柱。以10,000rpm将样品 离心1分钟。接着，将700μl缓冲液RW1移液至柱，以10,000rpm离 心1分钟。将缓冲液RPE移液至新收集管内的柱，以10,000rpm离心 1分钟。将缓冲液RPE再次加入自旋柱，以最大转速离心2分钟以干 燥膜。
为了消除任何乙醇残留，将膜置于独立的收集管中，再以最大转速离 心1分钟。将柱转移至新的1.5ml收集管中，使40μl无RNase的水直 接移液至膜。以10,000rpm将最终的洗脱管离心1分钟。通过变性甲 醛凝胶和分光光度计分析总RNA的质和量。
根据厂商说明(Invitrogen，Carlsbad，California)，使用SuperScriptTM逆转 录酶生产第一链cDNA。将约100ng总RNA用于第一链cDNA生产。
用各为100pmole的正向和反向引物进行RT-PCR。反应条件为：94℃2 分钟，然后94℃1分钟、67℃1分钟、72℃3分钟共40个PCR循环，接着72℃ 单次延伸10分钟。通过1％琼脂糖凝胶电泳来分析50微升经扩增的样品。
用溴化乙锭染色琼脂糖凝胶，基于条带的强度将存在的ND RNA的量分 类为少量或大量。切下选定的样品，并从琼脂糖凝胶中纯化出该样品。按 上文所述通过CEQ 8000对纯化的DNA进行测序。
实施例5-烟碱脱甲基酶序列分析
使用TFSEARCH程序(cbrc.jp/htbin/nph-tfsearch)和Web Signal Scan程序 (dna.affrc.go.jp/sigscan)对SEQ ID NO：2所示氨基酸序列进行分析，以鉴定出 调节区元件(如TATA和CAAT盒)、器官-特异性元件和WRKY元件。如图2所 示，分析表明：SEQ ID NO：2在氨基酸108-129，212-220，249-256，312-326， 380-390和491-497处含有6个底物识别位点(SRS)，在氨基酸9-20处含有N-末 端疏水性跨膜结构域，在氨基酸34-38处含有富含脯氨酸的区域，在氨基酸 346-351处含有含苏氨酸的氧-结合袋，在氨基酸353-356处含有K-螺旋共有 序列，在氨基酸430-433处含有PERF共有序列，在氨基酸450-459处含有含 半胱氨酸的血红素-结合区域。
实施例6-烟碱脱甲基酶突变品系的烟碱转变稳定性
使用筛选出的低转变者(LC)经认证的商业品种(TN90-LC)，以其高转变 者对应品种(TN90-C)为对照，对选定的M2突变品系4246-8和1859-8B进行大 规模田间试验。筛选出的LC认证品种可商购自F.W.Rickard Seeds (Winchester，Kentucky)。筛选出的LC认证种子采集自由筛选出的LC原种培 养出的植物。筛选出的LC原种采集自预先从中除去了烟碱转变水平高于3％ 的植物，并除去了其在除去烟碱转变水平高于3％的植物之前产生的任何花 或蒴果的烟草植物群体。
通过M1纯合突变植物的自花传粉产生了两个M2突变品系4246-8和 859-8B。在3个田间试验中培养这些品系，总的株数为每个品系约200株植 物。检测田间生长的植物将烟碱转变为去甲烟碱的能力。如实施例3所述， 用乙烯处理每个M2植物中间位置的烟叶。如实施例3所述，用乙烯处理约3 天后，收集烟叶，并在50℃的炉中干燥，以对生物碱进行气相层析(GC)分 析。
表3显示了相对于商业LC品系和转变者对照而言，M2突变品系中的烟 碱转变稳定性。突变品系4246-8的烟碱转变百分比平均为1.9％，其中没有植 物被归类为高转变者。突变品系1849-8B的烟碱转变百分比平均为2.1％，其 中总共214株植物中有3株植物被归类为高转变者。LC和转变者品系的烟碱 转变平均百分比分别为6.6％和80.6％，其中分别有24％和100％的植物被归类 为高转变者。
M3代具有类似的低转变频率，这表明突变品系中的低-转变者表型具有 稳定性。
表3
烟碱脱甲基酶突变M2品系、筛选出的低转变者和
转变者对照中的烟碱脱甲基化水平
  品系   植物数目   转变者数目   转变者占总群体   的百分比   平均转变率(％)   4246-8   184   0   0   1.9   1849-8B   212   3   1.4   2.1   TN90-LC   218   53   24.3   6.6   TN90-C   95   95   100   80.6
实施例7-检测烟碱脱甲基酶突变品系中烟草特异性亚硝胺的形成
按实施例6所述，使用筛选出的低转变者(LC)经认证的商业品种 (TN90-LC)，以其高转变者对应品种(TN90-C)为对照，对选定的M2突变品系 4246-8和1859-8B进行大规模田间试验。
将实施例6中经田间培养的植物培养至成熟，收集这些植物，使用标准 的烟草生产实践对其进行晾制。通过气相-层析-TAE分析来分析烟草化学。 表4显示了相对于LC和转变者对照而言突变品系中的烟草特异性亚硝胺 (TSNA)含量。突变品系中直接衍生自去甲烟碱的N-亚硝基去甲烟碱(NNN) 含量以及总TSNA含量低于TN90-LC和TN90-转变者品系中的相应含量。
表4
晾制的白肋烟草突变品系中
N-亚硝基去甲烟碱(NNN)和总烟草特异性亚硝胺(TSNA)水平
  品系   NNN(ppm)   总TSNA(ppm)   4246-8   0.7   0.9   1849-8B   0.8   0.9   TN 90空白载体   1.6   1.9   TN 90-LC   1.6   1.6   TN 90-C(高转变者)   5.5   5.6
实施例8-烟碱脱甲基酶RNA干扰
使用烟碱脱甲基酶核酸序列(SEQ ID NO：1)的片段构建Ti烟碱脱甲基酶 RNA干扰(RNAi)构建体，以使每个烟碱脱甲基酶RNAi构建体含有木薯脉花 叶病毒启动子(CsVMV)，如图3所示，所述启动子与相对于该启动子而言位 于反义方向上的烟碱脱甲基酶核酸片段(SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8)可操作相连，接着是环序列，各个片段的互补序列 和Nos终止子。每个烟碱脱甲基酶RNAi构建体含有与拟南芥肌动蛋白2启动 子和Nos终止子可操作相连的新霉素磷酸转移酶II基因，参见图3。表5中显 示了烟碱脱甲基酶RNAi构建体中存在的序列。
表5
用于构建烟碱脱甲基酶RNAi构建体的核酸序列
  烟碱脱甲基酶RNAi   构建体   茎区序列   环序列   pGen-RNAi1-IN   SEQ ID NO：5   NDM内含子(SEQ ID NO：9)   pGen-RNAi1-gus   SEQ ID NO：5   反义方向上gus片段(SEQ ID NO：10)   pGEN-RNAi2-AT   SEQ ID NO：6   拟南芥肌动蛋白II内含子2(SEQ ID NO：11)   pGEN-RNAi3-IN   SEQ ID NO：7   NDM内含子(SEQ ID NO：9)   pGEN-RNAi4-AT   SEQ ID NO：8   拟南芥肌动蛋白II内含子2(SEQ ID NO：11)
使用标准的农杆菌转化将每个烟碱脱甲基酶RNAi构建体导入Narrow Leaf Madole深色型烟草和TN 90白肋烟草。简单地说，将4周龄无菌生长植 物的叶组织切成碎片，在含有根瘤农杆菌(菌株LB4404)的液体培养基中与所 需构建体一起保温。在不含抗生素的基础培养基上使组织生长2天以增强组 织感染。第3天，将组织铺于含有可用于选择转化体的卡那霉素(300mg/L) 和可杀死残余根瘤农杆菌的Cetofexin(500mg/L)的培养基上。每周更换一次 培养基直至长出愈伤组织。将得自愈伤组织的小苗转移至生根培养基进行 生根，随后，将生根的小植株移植至含有商购土壤混合物的4英寸坛中。在 温室内将植物培养至成熟并进行自花传粉。
本文所用的“R0”指的是用外源核酸转化的植物细胞(和由其长出的植 物)，而“R1”指的是由自花传粉的R0植物产生的种子以及由该种子培养出的 植物。“R2”是自花传粉的R1植物的后代(种子和植物)，“R3”是自花传粉的R2 植物的后代，“R4”是自花传粉的R3植物的后代。“R5”是自花传粉的R4植物的 后代。“R6”，“R7”等各是上一代自花传粉植物的后代。
筛选和再生转基因品系
使原始转化体自交产生的R1种子萌发，并在含有300mg/L卡那霉素的 培养基中培养。萌发后2-3周，当敏感的小苗萎黄并且不能长出真叶时， 测定卡那霉素抗性和敏感小苗的数目。使用这些数据来鉴定分离模式。在 温室内将卡那霉素抗性植物培养至成熟并进行自花传粉。从每个植物中收 集种子，播种于含有卡那霉素的培养基以确定哪个R1植物的转基因是纯合 的。
将每个转基因RNAi品系的种子种植于田间，测定其烟碱至去甲烟碱的 转变，针对每个烟草品种与三个对照进行比较：1.含有空白载体(即缺乏烟 碱脱甲基酶核酸片段、环序列和烟碱脱甲基酶片段互补序列的载体)的烟草 植物；2.可商购的LC品系植物(即针对Narrow Leaf Madole转基因植物的 Narrow Leaf Madole LC认证种子(F.W.Rickard Seeds，Winchester，Kentucky) 和针对TN 90转基因植物的TN 90-LC认证种子)；和3.高转变者品系的植物 (即针对Narrow Leaf Madole转基因植物的181CK和针对TN 90转基因植物的 TN 90-C)。如果深色型烟草植物的转变率为3％或更高，则将其鉴定为转变 者。如果白肋型烟草植物的转变率为5％或更高，则将其鉴定为转变者。结 果示于表6和7。
表6
转基因Narrow Leaf Madole深色型烟草中烟碱至去甲烟碱的转变
  烟草品系   载体   转变平均百分比   群体中转变者的百分   比   NLM-IN5-44   pGen-RNAi1-IN   0.1   0   NLM-IN5-52   pGEN-RNAi1-IN   0.2   --   NLM-2IN-22   pGen-RNAi3-IN   0.2   --   NLM-2IN-38   pGEN-RNAi3-IN   0.3   0   NLM-2AT-33   pGen-RNAi2-AT   0.4   0   NLM-2AT-32   pGEN-RNAi2-AT   0.4   0   NLM-3AT-11   pGEN-RNAi4-AT   0.5   --   NLM-G2-2   pGEN-RNAil-gus   0.5   --   NLM-载体   空白载体   1.7   --   NL Madole LC   --   1.5   5   181CK   --   95.1   100
表7
转基因TN 90白肋型烟草中烟碱至去甲烟碱的转变
  烟草品系   载体   转变平均百   分比   群体中转变者   的百分比   TN90-IN5-14   pGen-RNAi1-IN   0.6   0   TN90-IN5-22   pGEN-RNAi1-IN   1.1   --   TN90-2IN-12   pGen-RNAi3-IN   1.2   --   TN90-2AT-4   pGEN-RNAi2-AT   2.7   --   TN90-2AT-5   pGen-RNAi2-AT   2.8   --   TN90-G2-7   pGEN-RNAil-gus   4.6   --   TN90-载体   空白载体   4.2   --   TN90LC   --   6.5   24   TN90C   --   63.7   100
使用定量RT-PCR测定相对于TN 90-LC中的烟碱脱甲基酶RNA表达 而言的烟碱脱甲基酶RNA表达。结果示于表8。
表8
相对的NDM mRNA表达
  烟草品系   相对于TN 90-LC的NDM mRNA表达   Narrow Leaf Madole IN5   0.1   Narrow Leaf Madole 2IN   0.1   Narrow Leaf Madole 2IN-1   不可测   TN 902AT   0.1   TN 90G2   不可测   TN 90-LC   1.0   TN 90-C(高转变者)   3.1   181CK(高转变者)   6.6
实施例9-在烟碱脱甲基酶RNAi品系中检测烟草特异性亚硝胺形成
使用各个被空白载体转化的品种、各个筛选出的低转变者(LC)认证商 业品种(即Narrow Leaf Madole LC和TN 90-LC)以及各个高转变者相应品种 (即181和TN90-C)作为对照，用选定的NDM RNAi品系NLM-IN5-44， NLM-IN5-52，NLM-2IN-22，NLM-2IN-38，NLM-2AT-33，NLM-2AT-32， NLM-3AT-11，TN90-IN5-14，TN90-IN5-22，TN90-2IN-12，TN90-2AT-4， TN90-2AT-5和TN90-G2-7进行大规模田间试验。按实施例7所述产生LC种 子。使用由R1纯合转基因植物自花传粉而产生的6个RNAi TN 90品系和8个 RNAi Narrow Leaf Madole品系来测定烟草特异性亚硝胺(TSNA)水平。
在3次田间试验中将每个品系约200株植物培养至成熟。收集这些植物， 使用标准技术，按表9-11所示对其进行加工处理。通过气相-层析-TAE分析 来分析烟草化学。表9-11显示出与空白载体、LC和转变者对照相比较的RNAi 品系的N-亚硝基去甲烟碱水平和总烟草特异性亚硝胺(TSNA)水平。该数据 表明：NDM RNAi品系中的N-亚硝基去甲烟碱(NNN)水平和总TSNA水平低 于对照品系中的相应水平。
表9
明火烘烤的深色型烟草RNAi品系中的NNN和总TSNA水平
  品系   载体   NNN(ppm)   总TSNA(ppm)   NLM-IN5-44   pGen-RNAi1-IN   0.196   1.003   NLM-IN5-52   pGEN-RNAi1-IN   0.19   1.069   NLM-2IN-22   pGen-RNAi3-IN   0.337   1.22   NLM-2IN-38   pGEN-RNAi3-IN   0.338   1.414   NLM-2AT-33   pGen-RNAi2-AT   0.288   1.113   NLM-2AT-32   pGEN-RNAi2-AT   0.254   1.321   NLM-3AT-11   pGEN-RNAi4-AT   0.323   1.428   NLM-G2-2   pGEN-RNAi1-gus   0.318   1.456   NLM-载体   空白载体   0.791   1.606   NL Madole LC   --   0.952   2.041   181 CK   --   18.696   20.488
表10
晾制的深色型烟草RNAi品系中的NNN和总TSNA水平
  品系   载体   NNN(ppm)   总TSNA(ppm)   NLM-IN5-44   pGen-RNAi1-IN   0.093   0.254   NLM-IN5-52   pGEN-RNAi1-IN   0.186   0.567   NLM-2IN-22   pGen-RNAi3-IN   0.195   0.595   NLM-2IN-38   pGEN-RNAi3-IN   0.166   0.394   NLM-2AT-33   pGen-RNAi2-AT   0.205   0.762   NLM-2AT-32   pGEN-RNAi2-AT   0.112   0.439   NLM-3AT-11   pGEN-RNAi4-AT   0.142   0.373   NLM-G2-2   pGEN-RNAi1-gus   0.165   0.681   NLM-载体   空白载体   3.673   5.597   NL Madole LC   --   0.617   1.167   181 CK   --   8.756   10.909
表11
晾制的白肋型烟草RNAi品系中的NNN和总TSNA水平
  品系   载体   NNN(ppm)   总TSNA(ppm)   TN90-IN5-14   pGen-RNAi1-IN   0.239   0.365   TN90-IN5-22   pGEN-RNAi1-IN   0.573   1.689   TN90-2IN-12   pGen-RNAi3-IN   0.708   0.785   TN90-2AT-4   pGEN-RNAi2-AT   0.335   0.472   TN90-2AT-5   pGen-RNAi2-AT   0.435   0.763   TN90-G2-7   pGEN-RNAi1-gus   0.892   1.091   TN90-载体   空白载体   1.635   1.869   TN90LC   --   1.552   1.606   TN90C   --   5.523   5.572
实施例10-烟碱脱甲基酶突变和RNAi品系的表型特征
按实施例7和9所述，在大规模田间试验中将烟碱脱甲基酶突变和RNAi 品系培养至成熟。测定植物高度、烟叶长度、烟叶宽度和产量。结果示于 表12-14。
表12
深色型烟草RNAi品系的表型特征
  品系   载体   打尖过   的植物   高度   (cm)   未打尖   的植物   高度   (cm)   第10片   叶的长   度(cm)   第10片   叶的宽   度(cm)   产量(磅/   英亩)(明   火烘烤)   产量(磅/   英亩)(晾   制)   NLM-IN5-44   pGen-RNAi1-IN   108   130   79   40   3583   3508   NLM-IN5-52   pGEN-RNAil-IN   110   129   80   39   3436   3340   NLM-2IN-22   pGen-RNAi3-IN   106   115   77   37   3476   3495   NLM-21N-38   pGEN-RNAi3-IN   109   128   79   38   3330   3301   NLM-2AT-33   pGen-RNAi2-AT   112   130   78   39   3634   3480   NLM-2AT-32   pGEN-RNAi2-AT   110   130   79   39   3089   3416   NLM-3AT-11   pGEN-RNAi4-AT   106   128   77   33   3426   3381   NLM-G2-2   pGEN-RNAi1-gu   s   109   130   80   39   3450   3256   NLM-载体   空白载体   108   129   76   35   3445   3587   NL Madole   LC   --   111   132   80   39   3567   3474   181 CK   --   114   132   77   44   3616   3233
表13
白肋烟草RNAi品系的表型特征
  品系   载体   打尖过的植   物高度(cm)   未打尖植物   高度(cm)   第10片叶的   长度(cm)   第10片叶的   宽度(cm)   产量(磅/   英亩)   TN90-IN5-14   pGen-RNAi1-IN   139   179   68   36   3316   TN90-IN5-22   pGEN-RNAi1-IN   138   178   68   40   3200   TN90-2IN-12   pGen-RNAi3-IN   139   177   69   39   3125   TN90-2AT-4   pGEN-RNAi2-AT   140   179   70   40   3207   TN90-2AT-5   pGen-RNAi2-AT   141   180   70   42   3237   TN90-G2-7   pGEN-RNAi1-gus   132   174   70   40   3088   TN90-载体   空白载体   139   179   70   39   3269   TN90LC   --   138   179   70   39   3361   TN90C   --   141   182   69   40   3175
表14
白肋烟草突变品系的表型特征
  品系   载体   打尖过的植物高   度(cm)   未打尖的植物   高度(cm)   第10片叶的   长度(cm)   第10片叶的宽   度(cm)   4246-8   118   146   62   32   2904   1849-8B   112   138   60   34   2944   TN90LC   138   179   70   39   3361   TN90C   141   182   69   40   3175
其它实施方案
应理解尽管结合其详细描述部分已描述了本发明，但前述的内容只是 为了阐明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范 围来限定。其它方面、优点和改动都包含在权利要求书的范围之内。
序列表
<110>美国无烟烟草制品公司(U.S.Smokeless Tobacco Company)
<120>烟碱脱甲基酶活性降低的烟草植物
<130>20210-075WO1
<150>US11/611,782
<151>2006-12-15
<160>11
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>2552
<212>DNA
<213>普通烟草(Nicotiana tabacum)
<400>1
atgctttctc ccatagaagc cattgtagga ctagtaacct tcacatttct cttcttcttc 60
ctatggacaa aaaaatctca aaaaccttca aaacccttac caccgaaaat ccccggagga 120
tggccggtaa tcggccatct tttccacttc aatgacgacg gcgacgaccg tccattagct 180
cgaaaactcg gagacttagc tgacaaatac ggccccgttt tcacttttcg gctaggcctt 240
ccccttgtct tagttgtaag cagttacgaa gctgtaaaag actgtttctc tacaaatgac 300
gccatttttt ccaatcgtcc agcttttctt tacggcgatt accttggcta caataatgcc 360
atgctatttt tggccaatta cggaccttac tggcgaaaaa atcgaaaatt agttattcag 420
gaagttctct ccgctagtcg tctcgaaaaa ttcaaacacg tgagatttgc aagaattcaa 480
gcgagcatta agaatttata tactcgaatt gatggaaatt cgagtacgat aaatttaact 540
gattggttag aagaattgaa ttttggtctg atcgtgaaga tgatcgctgg aaaaaattat 600
gaatccggta aaggagatga acaagtggag agatttaaga aagcgtttaa ggattttatg 660
attttatcaa tggagtttgt gttatgggat gcatttccaa ttccattatt taaatgggtg 720
gattttcaag ggcatgttaa ggctatgaaa aggactttta aagatataga ttctgttttt 780
cagaattggt tagaggaaca tattaataaa agagaaaaaa tggaggttaa tgcagaaggg 840
aatgaacaag atttcattga tgtggtgctt tcaaaaatga gtaatgaata tcttggtgaa 900
ggttactctc gtgatactgt cattaaagca acggtgtttg taagttcatc tgtcattttt 960
catttattca cttttatttt gaggagcaga catgttaata ataatttgga gcaactgtaa 1020
agttatctat gtgtacaggt tcgagcctca ggtgcaacca ctaatgcttg tattagatta 1080
tgttgtctgc atcatacccc taattggagt gtggctcttc ccgaaccctg caatgctgga 1140
tgctggatgc tttatgtatc agactgacct ttttgttaaa ctatctaaat actaaggatg 1200
atttaataaa aatatagaat ggtaaacaga aaaagatgag attatttttg gggctatatg 1260
gattcgcccg ggctttggga ggtaaaacgg tatctaccag ttgagacttt actccagaac 1320
tttatctcga gagctctgaa taaaaatgaa atagtattta ccactccaaa atctttgatg 1380
gtaaaaagat gagatataac ctcttataat tgattgaacc acgttgatag aataaaactt 1440
ctttactccc attcagcata agaaaaatga aaccaaacgg aattcttctc ttttttaggg 1500
ggaaattcct taattgcttg ttgaatatag attcatgtcg ttattctatt tttaataatg 1560
atgaaaatca atatagtcaa agttaatact tatgtcattt ggtttgcgga caagttatat 1620
tggaactata taatacgtct attatagaat agtgattatt tagaggatat acattttttt 1680
tggataaata tttgatttat tggattaaaa atagaatata caggtaaggt ctaaaacgtg 1740
tgtttgcttt tacactaaat aaacttgacc tcgtacaatt ctaagaaaat atttgaaata 1800
aatgaattat tttattgtta atcaattaaa aaaatcatag tatagatgag atgtgtgcat 1860
acttgacaat aactatacta actaaaacaa ggtatgtgaa taattgatat tcctttttta 1920
attattcttt tttccagagt ttggtcttgg atgcagcaga cacagttgct cttcacataa 1980
attggggaat ggcattattg ataaacaatc aaaaggcctt gacgaaagca caagaagaga 2040
tagacacaaa agttggtaag gacagatggg tagaagagag tgatattaag gatttggtat 2100
acctccaagc tattgttaaa gaagtgttac gattatatcc accaggacct ttgttagtac 2160
cacacgaaaa tgtagaagat tgtgttgtta gtggatatca cattcctaaa gggacaagat 2220
tattcgcaaa cgtcatgaaa ctgcaacgtg atcctaaact ctggtctgat cctgatactt 2280
tcgatccaga gagattcatt gctactgata ttgactttcg tggtcagtac tataagtata 2340
tcccgtttgg ttctggaaga cgatcttgtc cagggatgac ttatgcattg caagtggaac 2400
acttaacaat ggcacatttg atccaaggtt tcaattacag aactccaaat gacgagccct 2460
tggatatgaa ggaaggtgca ggcataacta tacgtaaggt aaatcctgtg gaactgataa 2520
tagcgcctcg cctggcacct gagctttatt aa                               2552
<210>2
<211>517
<212>PRT
<213>普通烟草(Nicotiana tabacum)
<400>2
Met Leu Ser Pro Ile Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Phe Thr Phe
1                5                  10                  15
Leu Phe Phe Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gln Lys Pro Ser Lys Pro
            20                  25                  30
Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
        35                  40                  45
His Phe Asn Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
    50                  55                  60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
65                  70                  75                  80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe
                85                  90                  95
Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
            100                 105                 110
Asp Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly
        115                 120                 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys His Val Arg Phe Ala Arg Ile Gln
145                 150                 155                 160
Ala Ser Ile Lys Asn Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Gly Asn Ser Ser Thr
                165                 170                 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
            180                 185                 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
        195                 200                 205
Val Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met Ile Leu Ser Met
    210                 215                 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225                 230                 235                 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
                245                 250                 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Ile Asn Lys Arg Glu
            260                 265                 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
        275                 280                 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
    290                 295                 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305                 310                 315                 320
Asp Thr Val Ala Leu His Ile Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
                325                 330                 335
Asn Gln Lys Ala Leu Thr Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Thr Lys Val
            340                 345                 350
Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
        355                 360                 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
    370                 375                 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385                 390                 395                 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
                405                 410                 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asp Pro Asp Thr Phe Asp Pro Glu Arg
            420                 425                 430
Phe Ile Ala Thr Asp Ile Asp Phe Arg Gly Gln Tyr Tyr Lys Tyr Ile
        435                 440                 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
    450                 455                 460
Gln Val Glu His Leu Thr Met Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465                 470                 475                 480
Arg Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Ile
                485                 490                 495
Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Val Glu Leu Ile Ile Ala Pro Arg Leu
            500                 505                 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
        515
<210>3
<211>517
<212>PRT
<213>普通烟草(Nicotiana tabacum)
<400>3
Met Leu Ser Pro Ile Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Phe Thr Phe
 1               5                  10                  15
Leu Phe Phe Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gln Lys Pro Ser Lys Pro
            20                  25                  30
Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
        35                  40                  45
His Phe Asn Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
    50                  55                  60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
65                  70                  75                  80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe
                85                  90                  95
Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
            100                 105                 110
Asp Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly
        115                 120                 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys His Val Arg Phe Ala Arg Ile Gln
145                 150                 155                 160
Ala Ser Met Lys Asn Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Gly Asn Ser Ser Thr
                165                 170                 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
            180                 185                 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
        195                 200                 205
Val Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met Ile Leu Ser Met
    210                 215                 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225                 230                 235                 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
                245                 250                 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Ile Asn Lys Arg Glu
            260                 265                 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
        275                 280                 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
    290                 295                 300
Asp Thr Val Ile Glu Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305                 310                 315                 320
Asp Thr Val Ala Leu His Ile Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
                325                 330                 335
Asn Gln Lys Ala Leu Thr Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Thr Lys Val
            340                 345                 350
Cys Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
        355                 360                 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
    370                 375                 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385                 390                 395                 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
                405                 410                 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asp Pro Asp Thr Phe Asp Pro Glu Arg
            420                 425                 430
Phe Ile Ala Thr Asp Ile Asp Phe Arg Gly Gln Tyr Tyr Lys Tyr Ile
        435                 440                 445
Pro Phe Gly Pro Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
    450                 455                 460
Gln Val Glu His Leu Thr Met Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465                 470                 475                 480
Arg Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Ile
                485                 490                 495
Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Val Glu Leu Ile Ile Ala Pro Arg Leu
            500                 505                 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
        515
<210>4
<211>517
<212>PRT
<213>普通烟草(Nicotiana tabacum)
<400>4
Met Leu Ser Pro Ile Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Phe Thr Phe
 1               5                  10                  15
Leu Phe Phe Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gln Lys Pro Ser Lys Pro
            20                  25                  30
Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
        35                  40                  45
His Phe Asn Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
    50                  55                  60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
65                  70                  75                  80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe
                85                  90                  95
Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
            100                 105                 110
Asp Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly
        115                 120                 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys His Val Arg Phe Ala Arg Ile Gln
145                 150                 155                 160
Ala Ser Ile Lys Asn Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Gly Asn Ser Ser Thr
                165                 170                 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
            180                 185                 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
        195                 200                 205
Val Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met Ile Leu Ser Met
    210                 215                 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225                 230                 235                 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
                245                 250                 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Ile Asn Lys Arg Glu
            260                 265                 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
        275                 280                 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
    290                 295                 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305                 310                 315                 320
Asp Thr Val Ala Leu His Ile Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
                325                 330                 335
Asn Gln Lys Ala Leu Thr Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Thr Lys Val
            340                 345                 350
Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
        355                 360                 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
    370                 375                 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385                 390                 395                 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Leu
                405                 410                 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Pro Asp Pro Asp Thr Phe Asp Pro Glu Arg
            420                 425                 430
Phe Ile Ala Thr Asp Ile Asp Phe Arg Gly Gln Tyr Tyr Lys Tyr Ile
        435                 440                 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
    450                 455                 460
Gln Val Glu His Leu Thr Met Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465                 470                 475                 480
Arg Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Ile
                485                 490                 495
Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Val Glu Leu Ile Ile Ala Pro Arg Leu
            500                 505                 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
        515
<210>5
<211>316
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的片段
<400>5
ctgcaacgtg atcctaaact ctggtctgat cctgatactt tcgatccaga gagattcatt 60
gctactgata ttgactttcg tggtcagtac tataagtata tcccgtttgg ttctggaaga 120
cgatcttgtc cagggatgac ttatgcattg caagtggaac acttaacaat ggcacatttg 180
atccaaggtt tcaattacag aactccaaat gacgagccct tggatatgaa ggaaggtgca 240
ggcataacta tacgtaaggt aaatcctgtg gaactgataa tagcgcctcg cctggcacct 300
gagctttatt aaaacc                                                 316
<210>6
<211>179
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的片段
<400>6
ggtctgatcg tgaagatgat cgctggaaaa aattatgaat ccggtaaagg agatgaacaa 60
gtggagagat ttaagaaagc gtttaaggat tttatgattt tatcaatgga gtttgtgtta 120
tgggatgcat ttccaattcc attatttaaa tgggtggatt ttcaagggca tgttaaggc  179
<210>7
<211>254
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的片段
<400>7
gggatgcatt tccaattcca ttatttaaat gggtggattt tcaagggcat gttaaggcta 60
tgaaaaggac ttttaaagat atagattctg tttttcagaa ttggttagag gaacatatta 120
ataaaagaga aaaaatggag gttaatgcag aagggaatga acaagatttc attgatgtgg 180
tgctttcaaa aatgagtaat gaatatcttg gtgaaggtta ctctcgtgat actgtcatta 240
aagcaacggt gttt                                                   254
<210>8
<211>120
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的片段
<400>8
ttggatatga aggaaggtgc aggcataact atacgtaagg taaatcctgt ggaactgata 60
atagcgcctc gcctggcacc tgagctttat taaaacctaa gatctttcat cttggttgat 120
<210>9
<211>998
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的片段
<400>9
gtaagttcat ctgtcatttt tcatttattc acttttattt tgaggagcag acatgttaat 60
aataatttgg agcaactgta aagttatcta tgtgtacagg ttcgagcctc aggtgcaacc 120
actaatgctt gtattagatt atgttgtctg catcataccc ctaattggag tgtggctctt 180
cccgaaccct gcaatgctgg atgctggatg ctttatgtat cagactgacc tttttgttaa 240
actatctaaa tactaaggat gatttaataa aaatatagaa tggtaaacag aaaaagatga 300
gattattttt ggggctatat ggattcgccc gggctttggg aggtaaaacg gtatctacca 360
gttgagactt tactccagaa ctttatctcg agagctctga ataaaaatga aatagtattt 420
accactccaa aatctttgat ggtaaaaaga tgagatataa cctcttataa ttgattgaac 480
cacgttgata gaataaaact tctttactcc cattcagcat aagaaaaatg aaaccaaacg 540
gaattcttct cttttttagg gggaaattcc ttaattgctt gttgaatata gattcatgtc 600
gttattctat ttttaataat gatgaaaatc aatatagtca aagttaatac ttatgtcatt 660
tggtttgcgg acaagttata ttggaactat ataatacgtc tattatagaa tagtgattat 720
ttagaggata tacatttttt ttggataaat atttgattta ttggattaaa aatagaatat 780
acaggtaagg tctaaaacgt gtgtttgctt ttacactaaa taaacttgac ctcgtacaat 840
tctaagaaaa tatttgaaat aaatgaatta ttttattgtt aatcaattaa aaaaatcata 900
gtatagatga gatgtgtgca tacttgacaa taactatact aactaaaaca aggtatgtga 960
ataattgata ttcctttttt aattattctt ttttccag                         998
<210>10
<211>431
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的片段
<400>10
gtctgccagt tcagttcgtt gttcacacaa acggtgatac gtacactttt cccggcaata 60
acatacggcg tgacatcggc ttcaaatggc gtatagccgc cctgatgctc catcacttcc 120
tgattattga cccacacttt gccgtaatga gtgaccgcat cgaaacgcag cacgatacgc 180
tggcctgccc aacctttcgg tataaagact tcgcgctgat accagacgtt gcccgcataa 240
ttacgaatat ctgcatcggc gaactgatcg ttaaaactgc ctggcacagc aattgcccgg 300
ctttcttgta acgcgctttc ccaccaacgc tgatcaattc cacagttttc gcgatccaga 360
ctgaatgccc acaggccgtc gagttttttg atttcacggg ttggggtttc tacaggacgt 420
aaactagtca g                                                      431
<210>11
<211>155
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的片段
<400>11
gtaataagat cttcaacacc tacaccattt ttttaatcac tactacccat tgcattgaac 60
aaacttccaa gttcttctta gcttcagatt aagaaagtac cctttcttgg ctttgttgat 120
gtggtaccat tgtccattgt cttgtgtgtt tccag                            155