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有机溶剂辅助PEG修饰蛋白质药物的方法

阅读：694发布：2021-02-25

IPRDB可以提供有机溶剂辅助PEG修饰蛋白质药物的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种有机溶剂辅助PEG修饰蛋白质药物的方法，主要步骤为：将在含有机溶剂的溶液中稳定的蛋白质分子加入缓冲液进行溶解，调节pH值，加入聚乙二醇修饰剂，恒温状态下，4℃-37℃进行修饰；通过凝胶过滤纯化得到单修饰产物。纯化后的单修饰蛋白具有活性。本发明的优点在于：增加蛋白药物稳定性，提高单修饰率，减少修饰剂量，降低成本且操作简单。，下面是有机溶剂辅助PEG修饰蛋白质药物的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种有机溶剂辅助PEG修饰蛋白质药物的方法，主要步骤为：

非特异氨基修饰：将在含有机溶剂的溶液中稳定的蛋白质分子加入缓冲液I进行溶解，调节pH至7-9，加入聚乙二醇修饰剂，蛋白和聚乙二醇修饰剂摩尔比为1∶1-1∶10；

所述缓冲液I为0.02-0.2mol/L Tris-Cl或磷酸盐缓冲液，10-30％有机溶剂，pH7-9，恒温状态下，4℃-37℃进行修饰；或 N端氨基修饰：将在含有机溶剂的溶液中稳定的蛋白质分子加入缓冲液II进行溶解，调节pH至4-6，加入聚乙二醇修饰剂，蛋白和修饰剂摩尔比为1∶1-1∶10；所述缓冲液II为0.02-0.2mol/L NaAc-HAc或磷酸盐缓冲液，10-30％有机溶剂，pH4-6，恒温状态下，

4℃-37℃进行修饰；

蛋白质分子为重组人干扰素β1b或重组人复合干扰素或重组人干扰素α2b；有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、丙酮或四氢呋喃；非特异氨基修饰所用的聚乙二醇修饰剂为mPEG-SC5000、mPEG-SC10000、mPEG-SC20000、mPEG-SC30000、mPEG-SC40000或Y-shape mPEG-NHS40000； N端氨基修饰所用聚乙二醇修饰剂为mPEG-ALD20000、mPEG-ALD30000、mPEG-ALD40000或Y-shape mPEG-ALD40000。

2.根据权利要求1所述有机溶剂辅助PEG修饰蛋白质药物的方法，其中，修饰时间为

3-24小时。

3.根据权利要求1所述有机溶剂辅助PEG修饰蛋白质药物的方法，其中，修饰后的蛋白采用凝胶过滤层析法进行单修饰产物纯化，层析柱为Hiload superdex 200 16/60 prep grade层析柱，流动相为0.05-0.2mol/L Tris-HCl或磷酸盐缓冲液，0-20％有机溶剂，pH6-8。

说明书全文

有机溶剂辅助PEG修饰蛋白质药物的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物制药领域，特别是涉及有机溶剂辅助聚乙二醇修饰蛋白质药物的方法。

背景技术

[0002] 聚乙二醇(PEG)修饰蛋白质药物是利用聚乙二醇衍生物修饰剂共价修饰蛋白质或多肽等生物分子的过程，使制备长效生物药物的有效手段。聚乙二醇具有良好的生物相容性、无毒性和无抗原性等优点，修饰后的蛋白和多肽类药物的药代动力学和药效学性质能够得到改善，获得许多更有利于临床应用的性质，包括更好的物理和热稳定性、更强的抗蛋白水解酶降解能力、更好的溶解性、更低的清除率以及更好的药效等。

[0003] PEG修饰的蛋白常常是通过蛋白和适宜的PEG修饰剂进行反应得到的，根据蛋白氨基侧链上不同的化学基团进行反应，如-NH2、-NH-、-COOH、-OH、-SH。选择修饰剂还需要考虑蛋白活性，结构以及修饰剂性质等几个方面。大部分蛋白药物修饰反应主要是在氨基上进行，氨基修饰又分为随机修饰和定点修饰。

[0004] 随机修饰一般是在蛋白质赖氨酸的ε氨基上进行。由于蛋白链上通常存在多个赖氨酸残基且通常位于蛋白表面，因此易与PEG修饰剂发生反应，反应迅速并且容易产生复杂的多修饰混合物。同时随机修饰还容易发生在蛋白N端氨基和组氨酸的咪唑基上。这些随机的PEG修饰剂通常包括SS-PEG、SC-PEG等，其中最为常用是SC-PEG。

[0005] 定点修饰目前主要包括N末端修饰和半胱氨酸残基修饰。半胱氨酸修饰是利用修饰剂与蛋白分子的游离巯基发生反应进行，如MAL-PEG，因此半胱氨酸残基定点修饰要求蛋白质分子有游离巯基。而N末端修饰是现在最为常见的另一定点修饰方式。N末端修饰通常是通过PEG-醛类修饰剂与一定量的还原剂如氰基硼氢化钠进行的还原烷化过程。

[0006] 蛋白分子水溶液添加适当浓度的有机溶剂后结构性质往往会发生变化，因此有机溶剂有时可作为蛋白分子变性剂。但有机溶剂也可能增加一些蛋白分子的稳定性，Richard K等(Enzyme and MicrobialTechnology，1989，11(9)：568-574)指出在一种有机相-水相中10种微生物蛋白和中性蛋白酶的热稳定性高于水相，John F.等(Genet.mol.Res.，2006，5(2)：350-372)研究蛋白热稳定时发现在水-乙醇混合体系中，乙醇在低温下所起的作用是一种天然核糖核酸酶的稳定剂。虽然有机溶剂可能造成蛋白分子沉淀失活，但有时也会对蛋白分子的化学反应产生有利影响，Mirtha M.等(Biotechnology and Bioengineering，1991，37(10)：967-972)证明在水溶液中加入15％左右的二甲基甲酰胺有机溶剂木瓜酶的催化活性达到最大，KAZUHIKO HAYASHIDA等(Journal of Fermentation andBioengineering，1992，73(3)：239-240)发现环糊精葡萄糖基转移酶催化反应生成环糊精过程中添加小分子有机溶剂能大幅提高产率。HUANGXiaohong等(Chin J Appl Environ Biol，2005，11(1)：71-73)证明低浓度的乙醇，丙醇，甘油等提高壳多糖酶活性。

[0007] 目前PEG修饰反应普遍是在水相中进行，常用的PEG为与氨基反应的PEG，通过和蛋白药物的氨基进行反应生成稳定的酯键。但它的主要问题在于水解速度快，不利于控制反应，PEG也会与蛋白赖氨酸上的氨基反应，产生许多异构体，而蛋白药物要求为均一的单修饰产物。贠强等证明在pH7.6时，SC-mPEG的半衰期约为5分钟，经测定，PEG的水解半衰期随着有机溶剂的加入及浓度的提高而变长，有利于控制反应。同时聚乙二醇具有亲水性和亲脂性，加入适宜有机溶剂能够改善PEG的性质，提高修饰效率及降低成本。

[0008] 重组人干扰素β1b通过目前最常用的表达系统-大肠杆菌进行表达(USpatent4,518,584)。通过Lin等(Methods Enzymol.1986，119：183-192)的方法进行纯化。国外采用IFN1b治疗某些疾病，例如性疣、丙型肝炎及相关肝癌，美国食品和药物管理局(FDA)已于1993年批准IFNβ1b用于治疗多发性硬化症。但该蛋白体内半衰期短，易被酶水解和肾脏清除，需要多次注射，给患者带来了很大不便，且重复注射也会引起不良反应。重组人β1b干扰素在小鼠体内注射半衰期为1.1h，Katre等(US patent 4,917,888)用聚乙二醇修饰剂mPEG-SC5000对该蛋白进行修饰并用Sephacryl-200凝胶过滤得到单修饰产物，使半衰期提高5倍，Amartya Basu等(BioconjugateChem，2006，17(3)：618-630)用分支型40K mPEG-NHS对β1b进行修饰同时用Superdex 200 high load凝胶过滤柱得到单修饰产物，半衰期达到9.4h。

[0009] 复合干扰素(Consensus Interferon)是一种重组的非自然存在的I型干扰素，含166个氨基酸残基，等电点为5.4，理论分子量为19 600，20世纪80年代实现在基因工程菌中的表达。它具有抗病毒、抗增殖、天然杀伤细胞(NK)激活和基因诱生活性，主要用于丙型肝炎治疗，但同样存在分子量小，易被肾脏清除，体内半衰期短等缺点。Yun Q(Journal of ChemicalTechnology&Biotechnology，2006，81(5)：776-781)等对其进行修饰，极大改善了它的药代动力学性质。

发明内容

[0010] 本发明的目的在于提供一种有机溶剂辅助PEG修饰蛋白质药物的方法。

[0011] 为实现上述目的，本发明提供的有机溶剂辅助PEG修饰蛋白质药物的方法，主要步骤为：

[0012] 非特异氨基修饰：将在含有机溶剂的溶液中稳定的蛋白质分子加入缓冲液I进行溶解，调节pH至7-9，加入聚乙二醇修饰剂，蛋白和聚乙二醇修饰剂摩尔比为1∶1-1∶10；所述缓冲液I为0.02-0.2mol/L Tris-Cl或磷酸盐缓冲液(PB)，10-30％有机溶剂，pH7-9，恒温状态下，4℃-37℃进行修饰；或

[0013] N端氨基修饰：将在含有机溶剂的溶液中稳定的蛋白质分子加入缓冲液II进行溶解，调节pH至4-6，加入聚乙二醇修饰剂，蛋白和修饰剂摩尔比为1∶1-1∶10；所述缓冲液II为0.02-0.2mol/L NaAc-HAc或磷酸盐缓冲液，10-30％有机溶剂，pH4-6，恒温状态下，4℃-37℃进行修饰。

[0014] 所述有机溶剂辅助PEG修饰蛋白质药物的方法，其中非特异氨基修饰所用的聚乙二醇修饰剂为mPEG-SC5000、mPEG-SC10000、mPEG-SC20000、mPEG-SC30000、mPEG-SC40000或Y-shapemPEG-NHS40000；N端氨基修饰所用聚乙二醇修饰剂为mPEG-ALD20000、mPEG-ALD30000、mPEG-ALD40000或Y-shapemPEG-ALD40000。

[0015] 所述有机溶剂辅助PEG修饰蛋白质药物的方法，其中修饰时间为3-24小时。

[0016] 所述有机溶剂辅助PEG修饰蛋白质药物的方法，其中修饰后的蛋白采用凝胶过滤层析法进行单修饰产物纯化，层析柱为Hiload superdex 20016/60 prep grade层析柱，流动相为0.05-0.2mol/L Tris-HCl或磷酸盐缓冲液，0-20％有机溶剂，pH6-8。

[0017] 所述有机溶剂辅助PEG修饰蛋白质药物的方法，其中在含有机溶剂的溶液中稳定的蛋白质分子为重组人干扰素β1b或重组人复合干扰素或重组人干扰素α2b。

[0018] 所述有机溶剂辅助PEG修饰蛋白质药物的方法，其中所用有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、丙酮或四氢呋喃。

[0019] 本发明的有机溶剂辅助PEG修饰蛋白质药物的方法，可以增加蛋白药物稳定性，提高单修饰率，减少修饰剂量，降低成本且操作简单。

附图说明

[0020] 图1为本发明修饰结果与水相修饰结果比较的SDS-PAGE电泳图，M为分子量marker(从小到大依次为14.3kD，20.1kD，29kD，44.3kD，66.4kD，97.2kD，116kD)，1为重组人干扰素β1b原蛋白，2为实施例一非特异氨基修饰水相修饰对照，3为实施例一有机溶剂辅助非特异氨基修饰新方法修饰结果，4为实施例二N端氨基修饰水相修饰对照，5为实施例二有机溶剂辅助N端氨基修饰新方法修饰结果，6为PEG20K单修饰蛋白。

[0021] 图2为修饰前后蛋白凝胶过滤层析图；

[0022] 图3为本发明纯化的重组干扰素β1b单修饰蛋白的SDS-PAGE电泳图，图中M为分子量marker(从小到大依次为14.3kD，20.1kD，29kD，44.3kD，66.4kD，97.2kD，116kD)，1为重组人干扰素β1b原蛋白，2为PEG修饰后的未修饰蛋白与修饰蛋白混合物，3为修饰后再纯化的单修饰蛋白。

具体实施方式

[0023] 本发明的有机溶剂辅助PEG修饰蛋白质药物的方法，是将蛋白质药物用含有机溶剂的缓冲液I和缓冲液II进行溶解，溶解后调节pH至适宜值，预热后再加入PEG修饰剂恒温进行反应，反应一段时间后再用缓冲液III通过凝胶过滤纯化得到单修饰产物。纯化后的单修饰蛋白具有活性。

[0024] 具体地说，本发明的修饰蛋白质分子的方法如下：

[0025] 1)非特异氨基修饰：将制得的重组人干扰素β1b或重组人复合干扰素或重组人干扰素α2b加入缓冲液I(0.02-0.2mol/L Tris-Cl(或磷酸盐缓冲液)，10-30％乙醇(甲醇或异丙醇或乙腈)，pH7-9)进行溶解，稀释至适宜蛋白浓度，调节pH至7-9，加入一定比例的聚乙二醇修饰剂，包括mPEG-SC5000，mPEG-SC10000，mPEG-SC20000，mPEG-SC30000，Y-shapePEG-NHS 40000，蛋白和修饰剂摩尔比为1∶1-1∶10；

[0026] 2)N端氨基修饰：将制得的重组人干扰素β1b或重组人复合干扰素或重组人干扰素α2b，加入缓冲液II(0.02-0.2mol/L NaAc-HAc(或磷酸盐缓冲液)，10-30％乙醇(甲醇或异丙醇或乙腈)，pH4-6)进行溶解，稀释至适宜蛋白浓度，调节pH至4-6，加入一定比例的聚乙二醇修饰剂，包括mPEG-ALD5000，mPEG-ALD10000，mPEG-ALD20000，mPEG-ALD30000，mPEG-ALD40000，Y-shape PEG-ALD40000和过量的氰基硼氢化钠，蛋白和修饰剂摩尔比为1∶1-1∶10；

[0027] 3)加入修饰剂后，在恒温状态下，4℃-37℃，置于水浴中进行修饰，修饰时间从3h-24h；

[0028] 4)对修饰后蛋白进行电泳鉴定，分析修饰率并与不添加有机溶剂的水相修饰方法进行比较；

[0029] 5)用凝胶过滤层析法对修饰后蛋白进行单修饰产物纯化，用缓冲液III(0.05-0.2mol/L Tris-HCl(或磷酸盐缓冲液)，0-20％(甲醇或乙醇或异丙醇或乙腈)，pH6-8；)作为流动相；

[0030] 6)纯化后蛋白进行纯度及活性检测。

[0031] 以下结合附图举实施例作进一步说明，实施例中是以重组人干扰素β1b、重组人复合干扰素以及重组人干扰素α2b为例采用有机溶剂辅助方式对蛋白质分子进行修饰；实际操作中，有机溶剂可以是甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、丙酮或四氢呋喃中的一种，均能达到修饰的目的，为简明起见，实施例中只给出了乙醇。

[0032] 实施例一

[0033] 重组干扰素β1b的修饰：

[0034] 非特异氨基修饰：用5ml缓冲液I(50mM/LPB，20％乙醇，pH8)溶解重组人干扰素β1b 5mg至1mg/ml，调节pH至7.8，取1ml置于1.5ml离心管中，15℃水浴中放置30分钟以上，再加入mPEG-SC20000，修饰剂与蛋白摩尔比为1∶2，在10秒内迅速溶解修饰剂并充分振荡混合均匀，再迅速置于15℃水浴中反应16小时。

[0035] 水相修饰对照：用5ml缓冲液I(50mM/LPB，pH8)溶解重组人干扰素β1b 5mg至1mg/ml，调节pH至7.8，取1ml置于1.5ml离心管中，15℃水浴中放置30分钟以上，再加入mPEG-SC20000，修饰剂与蛋白摩尔比为1∶2，在10秒内迅速溶解修饰剂并充分振荡混合均匀，再迅速置于15℃水浴中反应16小时。

[0036] 实施例二

[0037] N末端氨基修饰：用5ml缓冲液II(50mM/LPB，20％乙醇，pH 5.2)溶解重组人干扰素β1b 5mg至1mg/ml，调节pH至5.2，取1ml置于1.5ml离心管中，15℃水浴中放置30min以上，再加入mPEG-ALD20000粉末，修饰剂与蛋白摩尔比分别为1∶2，同时加入10倍PEG摩尔量的氰基硼氢化钠，在10秒内迅速溶解修饰剂并充分振荡混合均匀，再迅速置于15℃水浴中反应16小时。

[0038] 水相修饰对照：用5ml缓冲液II(50mM/LPB，pH 5.2)溶解重组人干扰素beta 1b5mg至1mg/ml，调节pH至5.2，取1ml置于1.5ml离心管中，15℃水浴中放置30min以上，再加入mPEG-ALD20000粉末，修饰剂与蛋白摩尔比分别为1∶2，同时加入10倍PEG摩尔量的氰基硼氢化钠，在10秒内迅速溶解修饰剂并充分振荡混合均匀，再迅速置于15℃水浴中反应16小时。

[0039] 实施例三

[0040] SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析比较单修饰率：

[0041] 采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析实施例一和实施例二的修饰后样品，通过测定被修饰的单修饰蛋白在总蛋白中所占比例来确定单修饰率。以此来比较在同样修饰条件下，添加和不添加有机相的修饰效率。

[0042] 由图1可知添加有机相单修饰率明显高于不添加有机相的样品。

[0043] 实施例四

[0044] 凝胶排阻色谱法纯化修饰后单修饰产物：用Hiload Superdex200 16/60prep grade预装凝胶过滤柱在AKTA purifier蛋白纯化仪上进行单修饰产物纯化，流动相为50mMPB，pH7.0，平衡1个柱体积以上，上样1ml，流速1ml/min，紫外检测280nm，收集洗脱峰，再通过50mMPB，pH7.0溶液透析去除SDS等小分子干扰物质。

[0045] 图2为修饰前后蛋白凝胶过滤层析图。

[0046] 实施例五

[0047] 单修饰产物纯度分析：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法对纯化后的单修饰产物进行电泳分析。

[0048] 由图3可知洗脱峰在相应位置只有一条带，纯度达到电泳纯。

[0049] 实施例六

[0050] 单修饰产物生物活性分析：

[0051] 采用VSV攻击的Wish细胞病变法。WISH细胞形成单层后，加不同浓度的干扰素处理，对照组用营养液代替，37℃培养24h后倾去干扰素，加病毒VSV攻击，37℃继续培养，待7
对照细胞完全病变后判断结果。测出修饰前原蛋白活性约为2.49×10IU/mg，而单修饰产
7
物活性约为1.62×10IU/mg。

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