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一种低成本发酵制备耐有机溶剂蛋白酶的方法

阅读：706发布：2021-02-21

IPRDB可以提供一种低成本发酵制备耐有机溶剂蛋白酶的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了一种低成本发酵制备耐有机溶剂蛋白酶的方法，是以自己筛选的野生菌株为出发菌种，以太湖蓝藻为氮源，以玉米粉为碳源低成本发酵制备耐有机溶剂蛋白酶，发酵制备的蛋白酶最高酶活可达1200U/ml以上，所制备的蛋白酶在有机溶剂中保持着相当高的活性，如二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、丙酮和甲醇中，其相对活性均在90％以上，既大幅降低了耐有机溶剂蛋白酶的生产成本，又治理了环境污染，变废为宝，且所制备的蛋白酶可广泛应用于洗涤剂、丝绸、造纸、制革与脱毛、环境修复与保护等领域，属于生物技术领域。，下面是一种低成本发酵制备耐有机溶剂蛋白酶的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种低成本发酵制备耐有机溶剂蛋白酶的方法，是以自己筛选的野生菌株为出发菌种，以太湖蓝藻为氮源，以玉米粉为碳源低成本发酵制备耐有机溶剂蛋白酶，工艺为：(1)种子培养

种子培养基：牛肉膏5g/L，鱼蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH 7.2；

取250ml的三角瓶若干个，每个装种子培养基50ml，121℃灭菌30分钟，冷却；

在每个装种子培养基50ml的三角瓶中挑取一环菌接入，置于摇床培养，培养条件：温度30℃，转速200r/min，培养10小时即为发酵种子液；

(2)产酶培养

产酶培养基：蓝藻50g/L，玉米粉20g/L，硫酸锌0.15g/L，初始PH＝7.0，泡敌1.5ml/L；

注：蓝藻先65℃烘干。

取产酶培养基5升加入到7升发酵罐中，121℃灭菌40分钟，冷却；

按6％的接种量，将300ml发酵种子液加入到含产酶培养基的发酵罐中，设定发酵参数，，温度30℃，pH 7.0，转速200r/min，通气量1.5，L/min/L，发酵20小时；

(3)脂肪酶液制备

将发酵液用高速冷冻离心机在4℃10,800g离心10min的条件下离心，上清液即为脂肪酶粗酶液，工业大生产可用板框滤机压滤替代离心机离心；

(4)脂肪酶活力的测定

酶活力单位定义：1个酶活力单位U为在以下条件下1min释放1μg酪氨酸所需要的酪蛋白酶量；

取粗酶液100μg，加入偶联酪蛋白溶于pH＝7.8的50mM Tris-HCl缓冲液且浓度为

10g/L的偶联酪蛋白溶液500μg混匀，37℃反应10min，再加入浓度为100g/L的三氯乙酸

1.9ml终止反应，反应混合液在10080×g转速下离心15min，小心吸取上清液，加入浓度为

40g/L的NaOH 2ml显色，在440nm下比色，并记录吸光度，计算相应的酪氨酸含量，空白对照以水代替酶液进行测定。

说明书全文

一种低成本发酵制备耐有机溶剂蛋白酶的方法

技术领域

[0001] 本发明提供的一种低成本发酵制备耐有机溶剂蛋白酶的方法，是以自己筛选的野生菌株为出发菌种，以太湖蓝藻为氮源，以玉米粉为碳源低成本发酵制备耐有机溶剂蛋白酶的技术方法，发酵制备的蛋白酶最高酶活可达1200U/ml以上，所产耐有机溶剂蛋白酶可广泛应用于洗涤业、丝绸业、食品工业、造纸业、医药业、皮革与脱毛等领域，属于生物技术领域。

背景技术

[0002] 蛋白酶是分解蛋白质肽键的一类酶，它与人类的生活息息相关，在全球酶制剂销售总额中，蛋白酶占到60％以上，并有极为广泛的应用，但其广泛的应用受生产成本和酶学特性的制约，因此探索蛋白酶的微生物资源、发酵产酶制备技术、酶学特性的分析等受到全球许多研究者的关注。

[0003] 目前国内外市场上常见的蛋白酶在有机溶剂中容易失活，尤其在亲水性有机溶剂中更易失活。另外，一般的耐有机溶剂的蛋白酶的生产菌株的产酶量并不高，而且使用的氮源多为昂贵的蛋白胨、牛肉膏和酪蛋白等，生产成本居高不下，难以大规模发酵生产。

[0004] 蓝藻是影响我国淡水质量的有害藻类，目前太湖治理蓝藻的主要手段是打捞除藻，但造成的次级污染难于处理。蓝藻含有丰富的蛋白质，如果我们能探索研究出利用蓝藻含有丰富的蛋白质特性作为原料发酵生产制备耐有机溶剂的蛋白酶，不仅可以充分利用废弃物，治理太湖打捞出的蓝藻造成的次级环境污染，还能大幅降低发酵制备耐有机溶剂蛋白酶的生产成本问题，我们就是在这样的思想指导下，经过无数次的实验探索终于研究出一种低成本发酵制备耐有机溶剂蛋白酶的方法。

发明内容

[0005] 本发明提供了一种低成本发酵制备耐有机溶剂蛋白酶的方法，发明了以太湖蓝藻为氮源、以玉米粉为碳源低成本发酵制备耐有机溶剂蛋白酶相关的种子培养基配方、产酶培养基配方及发酵产酶的技术参数，所制备的耐有机溶剂蛋白酶发酵液粗酶活最高酶活可达1200U/ml以上，所产耐有机溶剂蛋白酶可广泛应用于洗涤业、丝绸业、造纸业、皮革与脱毛等领域，属于生物技术领域。

[0006] 本发明的技术方案：一种低成本发酵制备耐有机溶剂蛋白酶的方法，用我们自己筛选的野生菌株为出发菌种，经种子培养和产酶培养发酵制备耐有机溶剂蛋白酶，工艺为：

[0007] (1)种子培养

[0008] 种子培养基：牛肉膏5g/L，鱼蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH 7.2；

[0009] 取250ml的三角瓶若干个，每个装种子培养基50ml，121℃灭菌30分钟，冷却；

[0010] 在每个装种子培养基50ml的三角瓶中挑取一环菌接入，置于摇床培养，培养条件：温度30℃，转速200r/min，培养10小时即为发酵种子液；

[0011] (2)产酶培养

[0012] 产酶培养基：蓝藻50g/L，玉米粉20g/L，硫酸锌0.15g/L，初始PH＝7.0，泡敌1.5ml/L；

[0013] 注：蓝藻先65℃烘干。

[0014] 取产酶培养基5升加入到7升发酵罐中，121℃灭菌40分钟，冷却；

[0015] 按6％的接种量，将300ml发酵种子液加入到含产酶培养基的发酵罐中，[0016] 设定发酵参数，，温度30℃，pH 7.0，转速200r/min，通气量1.5，L/min/L，发酵20小时；

[0017] (3)脂肪酶液制备

[0018] 将发酵液用高速冷冻离心机在4℃ 10,800g离心10min的条件下离心，上清液即为脂肪酶粗酶液，工业大生产可用板框滤机压滤替代离心机离心；

[0019] (4)脂肪酶活力的测定

[0020] 酶活力单位定义：1个酶活力单位U为在以下条件下1min释放1μg酪氨酸所需要的酪蛋白酶量；

[0021] 取粗酶液100μL，加入偶联酪蛋白溶于pH＝7.8的50mM Tris-HCl缓冲液且浓度为10g/L的偶联酪蛋白溶液500μL混匀，37℃反应10min，再加入浓度为100g/L的三氯乙酸1.9ml终止反应，反应混合液在10080×g转速下离心15min，小心吸取上清液，加入浓度为40g/L的NaOH 2ml显色，在440nm下比色，并记录吸光度，计算相应的酪氨酸含量。空白对照以水代替酶液进行测定。本发明的有益效果：

[0022] 一般的耐有机溶剂的蛋白酶的生产菌株的产酶量并不高，而且使用的氮源多为昂贵的蛋白胨、牛肉膏和酪蛋白等，生产成本居高不下，难以大规模发酵生产，本发明提供了一种低成本发酵制备耐有机溶剂蛋白酶的方法，而且使用的氮源为影响我国淡水质量的有害藻类一蓝藻，不仅大大降低了生产成本，而且还治理了环境污染，变废为宝，且可实现大规模的工业化生产，所制备的蛋白酶：在某些亲水性有机溶剂如二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、丙酮和甲醇中，其相对活性均在90％以上；在其它有机溶剂中，除了有机溶剂四氢呋喃和异丙醇外，相对酶活均在80％以上；因此本发明一种发酵产低温脂肪酶的方法有广泛的工业使用价值和较显著的经济效益前景。

具体实施方式

[0023] 实施例1

[0024] 1、从斜面上挑取单菌落，划线于LB平板培养基(蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母浸出汁5g/L，琼脂20g/L，pH 7.2)中，将平板置于30℃培养箱培养24h。

[0025] 2、从平板上括取1环菌种接种到含50ml种子培养基(牛肉膏5g/L，鱼蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH 7.2)的250ml的三角瓶中，共接种10瓶，置于摇床培养，培养条件：温度30℃，转速200r/min，培养8小时即为发酵种子液。

[0026] 3、按6％的接种量，将发酵种子液300ml加入到含5升产酶培养基(蓝藻50g/L，玉米粉20g/L，硫酸锌0.15g/L，初始PH＝7.0，泡敌1.5ml/L)的7升发酵罐中，设定发酵参数，，温度30℃，pH 7.0，转速200r/min，通气量1.5L/min/L，发酵20小时取出；

[0027] 4、脂肪酶液制备

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