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一种用于分析酸性环境中微生物群落结构的基因组芯片

阅读：528发布：2020-05-13

IPRDB可以提供一种用于分析酸性环境中微生物群落结构的基因组芯片专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种用于分析酸性环境中微生物群落结构的基因组芯片。该芯片的探针包括至少10株氧化亚铁硫杆菌、至少2株嗜酸氧化硫硫杆菌、至少1株喜温嗜酸硫杆菌、至少1株Acidithiobacillus albertensis菌、至少6株氧化亚铁微螺菌、至少8株异养嗜酸菌、至少1株金属硫叶菌、至少1株嗜酸两面菌、至少1株勤奋金属球菌和至少2株嗜热硫化杆菌的全基因组DNA。这种芯片，能够检测酸性环境中丰度较低的微生物，具有高通量、同时、快速、准确、灵敏地分析酸性环境中微生物群落组成的优点。，下面是一种用于分析酸性环境中微生物群落结构的基因组芯片专利的具体信息内容。

1.一种用于分析酸性环境中微生物群落结构的基因组芯片，包括基片及固定于基片之上的细菌DNA探针，其特征在于：所述探针包括至少10株氧化亚铁硫杆菌、至少2株嗜酸氧化硫硫杆菌、至少1株喜温嗜酸硫杆菌、至少1株Acidithiobacillus albertensis菌、至少6株氧化亚铁微螺菌、至少8株异养嗜酸菌、至少1株金属硫叶菌、至少1株嗜酸两面菌、至少1株勤奋金属球菌和至少2株嗜热硫化杆菌的全基因组DNA。

2. 如权利要求1所述的基因组芯片，其特征在于：所述探针包括16 株氧化亚铁硫杆菌、3株嗜酸氧化硫硫杆菌、3株喜温嗜酸硫杆菌、2株 ^c/必/w'o6ac///^ a/6erterais菌、10株氧化亚铁微螺菌、14株异养嗜酸菌、1 株金属硫叶菌、l株嗜酸两面菌、1株勤奋金属球菌和3株嗜热硫化杆菌的全 基因组DNA。

3. 如权利要求1或2所述的基因组芯片，其特征在于：每个探针设8个 重复。

说明书全文

一种用于分析酸性环境中徼生物群落结构的基因组芯片 技术领域

本发明涉及基因芯片，尤其涉及用于分析酸性环境中微生物群落结构 的基因组芯片。 背景技术

传统的微生物群落研究方法是以分离培养为依据，包括对微生物细胞形

态、生长适温、pH值、GC含量、微生物总量、生物量、呼吸效率、酶活性 等性质的测定和分析。尽管这些传统的方法仍然是微生物群落研究的基础， 但是由于不同种类微生物对培养要求的差异，以分离培养为基础的微生物群 落分析不能提供足够准确而丰富的信息。特别是在在酸性环境中存在的微生 物大多数是属于化能自养的嗜酸性细菌，这些细菌在人工条件下很难进行分 离培养，特别是在固体培养基上。虽然荧光显微镜法、扫描电镜法和透射电 镜法等方法能观察微生物个体丰度和形态，但仍不能提供微生物群落结构多 样性的足够信息。20世纪80年代末90年代初发展了以核酸（基因）为基础 的分子生物学技术，该方法大大地减轻对微生物培养的依赖性，并迅速地广 泛应用于微生物群落结构分析。但是，目前在微生物群落分析中所用的核酸 限制性片段长度多态性分桥（RFLP/Restriction Fragment Length Polymorphism) 和变性梯度凝胶电泳（DGGE/denatured gradient gel electrophoresis)等方法灵 敏度低、特异性不高，而基因克隆与序列分析则工作量大。FISH检测技术尽 管灵敏度高、特异性强，但存在荧光染料种类的限制，每次检测的微生物种 类有限。因此，这些方法都难以同时、快速、准确、灵敏地进行微生物群落 结构的分析。 发明内容

本发明的目的在于提供了一种分析酸性环境中微生物群落结构的群落基 因组芯片。利用该芯片，可以实现快速、准确、灵敏地对酸性环境中微生物 群落结构进行分析和研究。

本发明的基因组芯片由基片及固定于基片之上的细菌DNA探针组成，这 些探针包括至少10株氧化亚铁硫杆菌（4c/^/w'otoc///w/e/roo;«'^«1s)、至少2 株嗜酸氧化硫硫杆菌"c^f/u'okj"7/M5fWooxiWara菌）、至少l株喜温嗜酸硫

杆菌(Jc/fi^/w'o6(3"7/Mis ca/c?ws菌)、至少1株y4c/^Y/H'c^"cz?/MS "/6eWe"w'j菌、 至少6株氧化亚铁微螺菌a印to^7/A77/"w sp.菌）、至少8株异养嗜酸菌 (y4czV^/n/zwwwsp.)、至少1株金属硫叶菌（Sulfolobus M^2///cus)、至少1株 嗜酸两面菌（Jc幽譜至少1株勤奋金属球菌（Afeto/Zcwpteraseiiw/a) 和至少2株嗜热硫化杆菌（^//o&"7/w)的全基因组DNA。

这些探针最好包括16株氧化亚铁硫杆菌（JcW决/o&cz7/w/e/roo;cWa"s)、 3株嗜酸氧化硫硫杆菌（Jc^f;»'o^c///us决/oo;d^ww菌）、3株喜温嗜酸硫杆 菌(i4c/c3?///H'<96<3c///us c"/dw5菌)、2株Jcifif///K'o6"c/〃w1s a/6erfe;w/s菌、10株氧 化亚铁微t累菌（Z^pto>s/?iW//ww sp.菌）、14株异养嗜酸菌（爿cZ^p/w'"w附j sp.)、 1株金属硫叶菌（Sulfolobus Afeto/Zz'cwj)、 1株嗜酸两面菌（JcW/amw j;?)、 1 株勤奋金属球菌（A/etoZ/o^/zaeram^/a)和3株嗜热硫化杆菌（SmZ/o^c"/"" 的全基因组DNA。

与现有的微生物群落分析方法相比，利用本发明的基因组芯片对微生物 进行群落分析，克服了过程复杂、耗时长、劳动强度大、嗜酸性细菌很难进 行分离培养的缺点。利用这种芯片，能够检测环境中丰度较低的微生物，适 用于分析酸性环境中微生物群落。具有高通量、同时、快速、准确、灵敏地 分析酸性环境中微生物群落组成的优点。

附图说明

图l:使用A^z说/o6a"7/船/em?o;cWa附菌的全基因组DNA与本发明的 基因组芯片杂交后进行特异性评估的杂交结果图；
图2:使用血/^/7io6a"7/w /em?ox/必w菌的全基因组DNA与本发明的 基因组芯片杂交后进行灵敏度评估杂交图；
图3:使用AW决/o6aa7/us /em?似/必"j菌的全基因组DNA与本发明的 基因组芯片杂交后进行定量性能评估线性图。

具体实施方式

实施例l:本发明基因组芯片的制备
将至少10株氧化亚铁硫杆菌（v4c^决/o6flcz7/w /e/roox!Wam)、至少2株 嗜酸氧化硫硫杆菌""'£/欣/0^"7/«5由'00:(:/必似菌）、至少l株喜温嗜酸硫杆 菌(爿czV/zY/n'o6ad〃M5 ca/dws菌)、至少1株Jc/^^/z/o6acz'〃W5 c/6eWera/s菌、 至少6株氧化亚铁微螺菌（Le;7f(w;^i7/wm sp.菌）、至少8株异养嗜酸菌 (爿ci^?/n7iw/w^.)、至少1株金属硫叶菌（Sulfolobus Afe&///o«)、至少1株 嗜酸两面菌（/4cWam^w.)、至少1株勤奋金属球菌（MetoZ/osptoeraso/w/a)
和至少2株嗜热硫化杆菌的全基因组用DNA抽提试剂盒进行 抽提。以抽提的全基因组DNA作探针，将其用50X的DMSO溶解，到终浓 度为50 pmol/nl，然后在相对湿度为55~58%的环境条件下使用OmniGrid Accent Arraying System (Genomic Solutions,美国)将探针点样在经氨基化表面 处理的硅化玻片上。每一玻片上有8个探针阵列重复。点好的芯片处于室温 下干燥过夜，最后在600mJ的辐射剂量下对芯片进行紫外线交联。 实施例2:芯片杂交特异性评估
选取氧化亚铁硫杆菌（A^zY/n'o^d/Zw/e/roojc/^^),简称A.f菌，来检 测芯片探针的杂交特异性。将A. f菌全基因组DAN用cy3荧光染料标记后与 寡核苷酸芯片在50'C杂交，结果显示芯片上与A. f菌对应的探针位置点上都 产生了很强的荧光信号（如附图l所示），并且在芯片上没有发现与非耙标基 因间的非特异性交互杂交现象。说明特异性的寡核苷酸探针与其对应的目标 基因之间具有很强的特异性。
实施例3: 芯片杂交灵敏度检测
使用JcW决!'o&a"7/w/em?oxWara 23270的纯基因组DNA来检测本发明 芯片的灵敏度。将纯基因组DNA按照一定的浓度梯度稀释(浓度分别为0.11 ， U5， 11.5， 115ng/ul)，并使用cy3进行标记后与芯片杂交。从芯片杂交分析 结果（见附图2)发现，该芯片对纯培养微生物基因组DNA的检测极限为0.11 ng/ul 。
实施例4: 芯片的定量性能测定
通过测定目标DNA浓度与芯片杂交信号之间的关系评估了芯片的用于 核酸定量的能力。将纯的JcWf/z/o6ac///t« /e/roox/ofa/w 23270基因组DNA按 照梯度稀释后使用cy3进行标记并与芯片进行杂交，每一浓度的DNA制备三 个平行杂交，每一探针对应的信号取其均值，以DNA浓度的对数值和对应的 荧光信号强度对数值为座标点作图（见附图3)，并对DNA浓度与荧光信号 强度作线性回归分析。结果显示：DNA浓度在1到500ng之间时，DNA浓度 与信号强度之间存在很强的线性相关性，r2 =0.982，同样的线性相关性也存于 16s rRNA基因探针的数量与信号强度之间。此外，当DNA浓度范围在0.11 到115ng/ul之间时，DNA浓度与芯片的总信号强度之间也存在很强的线性关 系，r2=0.91， p<0.05。这一结果表明芯片杂交对于特定浓度范围内的DNA具 有定量作用，因此也说明了本发明构建的芯片可以作为一种定量工具使用。
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