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一种PCR－DGGE研究环境微生物群落的引物设计方案

阅读：915发布：2020-05-14

IPRDB可以提供一种PCR－DGGE研究环境微生物群落的引物设计方案专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种使用聚合酶链反应－变性梯度凝胶电泳(PCR－DGGE)研究环境样品中微生物群落结构的引物设计方法，包括以下步骤：(1)选择用于实验的环境样品——农田土壤；(2)提取土壤中的所有微生物的基因组DNA；(3)将基因组DNA纯化后作为PCR扩增的模板；(4)选择一般用于原核生物16S rRNA基因扩增的通用引物对；(5)在引物对的正向引物的5′端加上GC发卡结构；(6)进行PCR扩增；(7)将PCR扩增产物在DGGE中电泳分离；(8)观察PCR产物是否被完全分开。这一发明对有些相关研究，特别是利用PCR－DGGE方法对环境样品(如土壤等)中的微生物多样性进行分析的研究提供了一种PCR引物的设计方案，为这类研究提供了一种保证实验正确性的方法。，下面是一种PCR－DGGE研究环境微生物群落的引物设计方案专利的具体信息内容。

权利要求

1一种使用聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)研究环境样品中微生物群落结构的PCR引物设计方法，包括以下步骤：a)选择用于实验的环境样品-农田土壤；

b)将用于步骤a)中的农田土壤经细胞裂解液裂解后，获得土壤中的所有微生物的基因组 DNA；

c)将步骤b)获得的基因组DNA纯化后作为PCR扩增的模板；

d)选择一般用于原核生物16S rRNA基因扩增的通用引物对；

e)在步骤d)选择的通用引物对的正向引物的一端加上GC发卡结构；

f)按照设计的PCR反应条件进行PCR扩增；

g)将步骤f)所述的PCR扩增产物作为样品，选择合适的电泳条件，在一定胶浓度和特定变性剂范围的变性胶中电泳；

h)将步骤g)后的变性胶经染色液染色一段时间后，观察每个泳道的电泳条带是否完全分开；

2权利要求1的方法，其中步骤a)中的农田土壤可以为任何一种待研究的土壤或者其它环境样品，本实验选用的土壤为我国吉林的农田土壤样品和河北曲周的农田土壤共计7种。

3权利要求1的方法，其中步骤c)中基因组DNA的纯化方法为采用上海生工的玻璃珠DNA 胶回收试剂盒，按照用户使用说明来进行。

4权利要求1的方法，其中步骤d)中的通用引物对可以为任何一种文献报道的引物对，但必须保证扩增产物片断大小应在200到700bp之间，这样有利于DGGE对这些片断的分离，本实验选用的引物对为F357和R518。

5权利要求1的方法，其中步骤e)中的一端为5′端，所加的GC发卡结构的序列为5′CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC C 3′。

6权利要求1的方法，其中步骤f)中合适的电泳条件为：使用Bio-Rad公司的Dcode基因突变检测系统在120V，60℃下电泳6h。

7权利要求1的方法，其中步骤g)中变性胶为聚丙烯酰胺凝胶，含有尿素和甲酰胺等变性剂，变性剂浓度范围为从30％到50％，胶浓度为10％。

8权利要求1的方法，其中步骤h)中的染色液为溴化乙锭浓度为0.5μg/mL 1倍的TAE缓冲液，染色时间为30min。

9权利要求1的方法，其中步骤h)中观察电泳条带采用的是YLN-2000凝胶影像分析系统。

说明书全文

技术领域：

聚合酶链反应(PCR)技术是目前分子生物学领域基本技术，主要用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段，它在遗传学、法医学等领域有着广泛的应用。另外PCR 扩增技术在分子克隆和DNA分析中有着以下几方面应用：(1)核酸探针制作、(2)DNA 文库建立、(3)DNA序列测定(4)突变分析等。

背景技术：

变性梯度凝胶电泳(DGGE)最初被用于基因的突变检测，任意位点的单碱基突变的DNA片段和原始的DNA片段能被分开，经过序列测定和比较就可以找出突变的位点。变性梯度凝胶电泳对不同DNA片段的分离原理是变性梯度凝胶电泳(DGGE) 中同样长度但具有不同序列的DNA片段能够被分离，因为在含有呈线形增加梯度变性剂(尿素和甲酰胺)的混合物的聚丙烯酰胺凝胶电泳中部分解链的双链DNA分子的电泳迁移率降低。具有不同序列的DNA分子有不同的解链行为，将在凝胶的不同位置停止迁移。

变性梯度凝胶电泳(DGGE)自1993年以来被用于环境微生物领域来研究环境样品中微生物的群落结构，它是建立在PCR反应对环境样品中的所有微生物的16S rRNA(原核生物)和18S rRNA(真核生物)等保守基因区间的DNA片断的扩增的基础上，这些被扩增出的DNA片断可以代表所有不同微生物的信息，这些使用同一引物对扩增出的不同微生物的DNA片断具有相同的碱基数，因此一般的电泳无法将它们分离开，这就为后续的进一步研究提出了新的问题。由于变性梯度凝胶电泳 (DGGE)可以将不同碱基顺序的相同大小的DNA片断予以分离，所以PCR-DGGE 可以对环境样品中的微生物群落进行研究。

由于变性梯度凝胶电泳(DGGE)在对DNA片断分离的过程中，所有的DNA片断都部分解链而形成具有碱基顺序特异性的“解链域”，这些“解链域”是PCR-DGGE 方法对微生物群落研究的基础，因为如果所有的相同大小的DNA片断在DGGE中完全解链的话，它们在DGGE中的电泳行为就不决定于不同的碱基顺序而决定于片断的大小，这样的完全解链片断就不能在DGGE中被分开。所以设法在DGGE中保证所分离的DNA片断部分解链而不是完全解链就是使用DGGE的关键所在，本研究基于这一方面，提出了一种PCR引物设计方案，即在PCR的正向引物的5′端添加GC 发卡结构，这样可以保证在DGGE过程中PCR扩增出的DNA片断部分解链，从而使得这些不同微生物的16S rRNA(原核生物)和18S rRNA(真核生物)的基因片断被分离，为后续的研究(不同微生物的分类)奠定了良好的基础。

发明内容：

将环境样品中的微生物群落的基因组DNA提取后，以基因组DNA为模板，选择能够扩增大多数原核微生物16S rRNA基因V3区的特异性引物对F357和R518(也可采用其他的引物对)并且在引物F357的5′端添加GC发卡结构，其序列为5′CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC C 3′(具体的添加在引物合成时进行)，将扩增出的PCR产物用胶浓度为10％、变性剂浓度从30％到50％的变性梯度凝胶电泳进行分离。电泳结束后，将胶用溴化乙锭染色30min，分析各个样品的电泳条带数，观察PCR产物是否被DGGE分离成几个单一的条带。

因为GC发卡结构是一个长约40bp的富含GC的DNA片断。由于G和C以三个氢键相连，所以GC发卡结构是一个自身的互补闭合结构，一般情况下难以被拆分。在PCR的正向引物5′端添加GC发卡结构，就使得扩增的PCR产物的5′端就具有 GC发卡结构，在DGGE中，这些PCR产物就在实验选定的一定变性剂范围内部分解链，从而可以将这些不同微生物的16S rRNA基因片断分开，为后续对这些片断的鉴定工作提供条件。这一发明对有些相关研究，特别是使用PCR-DGGE对环境样品中微生物群落组成和群落动态检测的研究提供了一种可行性的方案。

附图说明：

图示1为将7种土壤样品的微生物的基因组DNA纯化后，采用不同的设计引物，经PCR扩增后的产物用变性梯度凝胶电泳分离的图谱，其中各个样品分别为： 1′到7′为7种土壤样品使用引物对F357和R518增的PCR产物的DGGE图谱 1到7为7种土壤样品便用引物对F357GC和R518扩增的PCR产物的DGGE图谱

图示2为DGGE对DNA样品的分离示意图

具体实施方式：

分别将7种土壤样品中各种微生物的基因组DNA同时提取，采用玻璃珠DNA胶回收试剂盒(上海生工，产品号：SK111)，按照操作说明对DNA粗提液进行纯化，将纯化后的基因组DNA作为聚合酶链反应(PCR)的模板，使用Applied Biosystem的 GeneAmp PCR system 2700型基因扩增仪，采用对大多数细菌和古细菌的16S rRNA基因片段具有特异性的引物对：F357GC和R518，它们的序列分别为：F357GC：(5’-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC CCC TAC GGG AGG CAG CAG-3’)， R518：(5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’)，扩增片段长约230bp，同时，设置无GC发卡结构的引物对F357和R518作为对照扩增相同的样品。100μL的PCR反应体系组成如下：100ng的模板、30pmol每种引物、200μmol/L dNTPs：(每种10mmol/L)、10 μL的10倍PCR buffer(without MgCl2)、1.5mmol/L的MgCl2、5U的Taq DNA聚合酶、800ng的牛血清白蛋白BSA和适量的双蒸水补足100μL。PCR反应采用降落PCR 策略，即：预变性条件为94℃ 5min，前20个循环为94℃ 1min，65℃-55℃ 1min 和72℃ 3min(其中每个循环后复性温度下降0.5℃)，后10个循环为94℃ 1min， 55℃ 1min和72℃ 3min，最后在72℃下延伸7min。PCR反应的产物用1.7％琼脂糖凝胶电泳检测。

采用Bio-Rad公司Dcode的基因突变检测系统对PCR反应产物进行分离步骤如下：(1)制备含有变性剂(尿素和甲酰胺的混合物)的10％的聚丙烯酰胺凝胶，其中变性剂的浓度从30％到50％(100％的变性剂为7M的尿素和40％的去离子甲酰胺)， (2)在每个加样孔加样含有10％的加样缓冲液的样品20-25μL，(3)在120V的电压下，60℃电泳6h，(4)电泳完毕后，将凝胶在EB中染色30min，(5)将染色后的凝胶置于YLN-2000凝胶影像分析系统下观察并拍照。观察各个样品经变性梯度凝胶电泳(DGGE)分离后的PCR产物的电泳条带数是否被完全分开。实验结果参照说明书附图。

由附图可见，7种土壤样品的引物中具有GC发卡结构的不同微生物的PCR产物在DGGE中被分离成数目不等的电泳条带，引物中无GC发卡结构的不同微生物的 PCR产物在DGGE中都被分离成两个电泳条带的集合体，这说明无GC发卡结构的不同微生物的PCR产物在DGGE中都完全解链而成为两单链，而有GC发卡结构的不同微生物的PCR产物在DGGE中部分解链而被完全分开，说明GC发卡结构在PCR -DGGE研究环境样品微生物群落中是必要的。

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