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糖化工艺

阅读：108发布：2020-05-11

IPRDB可以提供糖化工艺专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及糖化工艺，具体的涉及酿造工艺中的糖化和过滤步骤，以及适用于酿造工艺中的糖化和过滤步骤的组合物。在包括GH10家族的木聚糖酶的酶活性的存在下制备醪液。，下面是糖化工艺专利的具体信息内容。

权利要求

1.用于生产具有提高的过滤性和/或在过滤后具有改善的提取物收率的醪液的方法，其包括在酶活性的存在下制备醪液并过滤醪液得到麦芽汁，其中所述酶活性包括下面的木聚糖酶和内切葡聚糖酶：a)GH家族10的木聚糖酶，该酶的量为所述总木聚糖酶和内切葡聚糖酶酶蛋白的至少

15％w/w，和；

b)GH5家族的内切葡聚糖酶，其量为所述总木聚糖酶和内切葡聚糖酶酶蛋白的至少

40％w/w。

2.权利要求1的方法，其中GH家族10的木聚糖酶以总木聚糖酶和内切葡聚糖酶酶蛋白的至少20％w/w的量存在。

3.权利要求1的方法，其中所述木聚糖酶是：

来自曲霉属(Aspergillus)菌种的菌株；或来自毁丝霉属(Myceliophotora)菌种的菌株；或来自腐质霉属(Humicola)菌种的菌株；或来自木霉属(Trichoderma)菌种的菌株；

或来自芽孢杆菌属(Bacillus)的菌株。

4.权利要求3的方法，其中所述木聚糖酶是来自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的菌株。

5.权利要求3的方法，其中所述木聚糖酶是

来自棘孢曲霉(SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9)；或来自嗜热毁丝霉(Myceliophotora thermophilia)(SEQ ID NO：13)；或来自特异腐质霉(Humicola insolens)(SEQ ID NO：

12)；或来自里氏木霉(T.reesei)(SEQ ID NO：17)。

6.权利要求1的方法，其中所述内切葡聚糖酶是：

来自腐质霉属菌种的内切葡聚糖酶；或来自热子囊菌属(Thermoascus)菌种；或来自曲霉属菌种；或来自木霉属的菌种。

7.权利要求6的方法，其中所述内切葡聚糖酶是来自棘孢曲霉的菌株。

8.权利要求6的方法，其中所述内切葡聚糖酶是来自里氏木霉的内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：18)；或来自橙色热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：6)。

9.权利要求1的方法，其中存在至少一种附加的酶，该酶选自下列：阿拉伯呋喃糖苷酶，阿魏酸酯酶和木聚糖乙酰酯酶。

10.一种组合物，用于生产具有提高的过滤性和/或在过滤后具有改善的提取物收率的醪液，其包含：a)GH10木聚糖酶，其量为总酶蛋白的至少15％w/w；和，b)GH5内切葡聚糖酶，其量为总酶蛋白的至少20％w/w。

11.权利要求10的组合物，其中所述木聚糖酶是来自曲霉属菌种的菌株；或来自毁丝霉属菌种的菌株；或来自腐质霉属菌种的菌株；或来自木霉属菌种的菌株；或来自芽孢杆菌属的菌株。

12.权利要求11的组合物，其中所述木聚糖酶是来自棘孢曲霉的菌株。

13.权利要求11的组合物，其中所述木聚糖酶是来自棘孢曲霉(SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9)；或来自嗜热毁丝霉(SEQ ID NO：13)；或来自特异腐质霉(SEQ ID NO：12)。

14.权利要求10的组合物，其中所述内切葡聚糖酶是来自腐质霉属菌种的内切葡聚糖酶；或来自热子囊菌属菌种；或来自曲霉属菌种；或来自木霉属的菌种。

15.权利要求14的组合物，其中所述内切葡聚糖酶是来自棘孢曲霉的菌株。

16.权利要求14的组合物，其中所述内切葡聚糖酶是来自里氏木霉的内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：18)；或来自橙色热子囊菌的内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：6)。

17.权利要求10的组合物，其中所述GH10家族的木聚糖酶以总木聚糖酶和内切葡聚糖酶酶蛋白的至少20％w/w的量存在。

18.根据上述权利要求10-17中任一项的组合物用于降低含有淀粉水解物的水溶液的粘度的用途。

19.根据上述权利要求10-17中任一项的组合物在方法中的用途，所述方法包括过滤含有淀粉水解物的水溶液。

20.根据上述权利要求18的组合物的用途，其中所述水溶液是用于制造啤酒的醪液。

21.根据上述权利要求18的组合物的用途，其中所述水溶液是饲料组合物。

说明书全文

糖化工艺

[0001] 本申请是申请日为2004年12月17日，申请号为200480041919.X(国际申请号为PCT/DK2004/000880)，名称为“糖化工艺”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

[0002] 本发明涉及但不限于酒精饮料例如啤酒或威士忌的制造工艺中的糖化和过滤步骤，以及可用于该工艺的糖化(mashing)和过滤步骤的组合物。

[0003] 发明背景

[0004] 酿造中经常使用酶。WO 97/42302中描述了在糖化中应用酶来改善醪液(mash)的过滤性和提高提取物收率。但是，糖化和过滤步骤的优化，以及改进的用于糖化和过滤步骤的酶组合物，仍然是人们所需要的。

[0005] 发明概述

[0006] 本发明提供一种可提高醪液(mash)的过滤性和/或过滤后提取物收率(extract yield)的醪液生产工艺，其包括：在酶活性的存在下制备醪液并过滤醪液而得到麦芽汁，其中酶活性包括葡糖苷水解酶(glucoside hydrolase)10家族的木聚糖酶，该酶的量占总木聚糖酶和内切葡聚糖酶酶蛋白的15％w/w。

[0007] 本发明进一步提供一种降低含有淀粉水解物的水溶液的粘度的工艺，其包括：检测至少一种木聚糖分解酶的针对不溶性小麦阿拉伯木聚糖的水解活性，选择在紧邻着分枝残基处切割而形成末端取代的寡聚木糖的木聚糖分解酶，并将所选择的木聚糖分解酶加入到含有淀粉水解物的水溶液中。

[0008] 本发明进一步提供一种降低含有淀粉水解物的水溶液的粘度的工艺，其包括：检测至少一种内切葡聚糖分解酶的针对大麦β-葡聚糖的水解活性，选择在10μg/ml纯化的酶及5mg/ml大麦β-葡聚糖，于50mM乙酸钠及0.01％Triton X-100中，pH 5.5，50℃的条件下，在1小时内能将70％的大麦β-葡聚糖降解到DP6或DP＜6的内切葡聚糖分解酶，并将选择到的内切葡聚糖分解酶加入含有淀粉水解物的水溶液中。

[0009] 本发明进一步提供一种组合物，其包含：占总酶蛋白的至少15％w/w的GH10木聚糖酶，和/或，占总酶蛋白的至少40％w/w的GH12，GH7，和/或GH5内切葡聚糖酶。

[0010] 本发明还涉及如下方面：

[0011] 1.用于生产具有提高的过滤性和/或在过滤后具有改善的提取物收率的醪液的方法，其包括在酶活性的存在下制备醪液并过滤醪液得到麦芽汁，其中所述酶活性包括GH家族10的木聚糖酶，该酶的量为所述组合物的总木聚糖酶和内切葡聚糖酶酶蛋白的至少15％w/w。

[0012] 2.上述项的方法，其中存在内切葡聚糖酶，该内切葡聚糖酶属于选自下列的GH家族：GH12，GH7和GH5。

[0013] 3.上述任一项的方法，其中所述内切葡聚糖酶活性属于GH家族GH12，GH7和/或GH5，其量为所述组合物的总木聚糖酶和内切葡聚糖酶酶蛋白的至少40％w/w。

[0014] 4.上述任一项的方法，其中GH家族10的木聚糖酶以总木聚糖酶和内切葡聚糖酶酶蛋白的至少20％，优选为25％，例如至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少60％，或甚至至少70％w/w的量存在。

[0015] 5.上述任一项的方法，其中GH家族12，7和/或5的内切葡聚糖酶的量以总木聚糖酶和内切葡聚糖酶酶蛋白的至少45％，优选为50％，例如至少55％，至少60％，至少70％，或乃至至少80％w/w的量存在。

[0016] 6.上述任一项的方法，其中所述木聚糖酶是A型木聚糖酶。

[0017] 7.上述任一项的方法，其中所述木聚糖酶是A型木聚糖酶，其I1，3末端/I1，3内部的比值为至少0.25，例如至少0.30，至少0.40，至少0.50，乃至至少0.60。

[0018] 8.上述任一项的方法，其中所述木聚糖酶具有CBM，优选为第家族1的CBM。

[0019] 9.上述任一项的方法，其中所述木聚糖酶是这样的木聚糖酶，在本文所描述的木聚糖酶结合测定中，该酶的大麦可溶性/不可溶性纤维结合比为至少0.50，优选为至少0.60，更优为至少0.70，例如0.80，0.90，1.00，1.10，或乃至至少1.20。

[0020] 10.上述任一项的方法，其中所述木聚糖酶是

[0021] a)来自丝状真菌的木聚糖酶，例如来自曲霉属(Aspergillus)菌种的菌株，优选来自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9)；来自毁丝霉属(Myceliophotora)菌种的菌株，优选来自嗜热毁丝霉(Myceliophotora thermophilia)(SEQ ID NO：13)；来自腐质霉属(Humicola)菌种的菌株，优选来自特异腐质霉(Humicola insolens)(SEQ ID NO：12)；或来自木霉属(Trichoderma)菌种的菌株，优选来自里氏木霉(T.reesei)(SEQ ID NO：17)；

[0022] b)与a)中任一序列具有至少50％，例如至少60％，70％，80％或乃至至少90％的同源性的木聚糖酶。

[0023] 11.上述任一项的方法，其中所述木聚糖酶来自细菌，例如来自芽孢杆菌属(Bacillus)的菌株，优选来自Bacillus halodurans。

[0024] 12.上述任一项的方法，其中所述内切葡聚糖酶是

[0025] a)来自腐质霉属菌种的内切葡聚糖酶，例如来自特异腐质霉的内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：3)；或来自特异腐质霉的内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：4)；或来自热子囊菌属(Thermoascus)菌种，例如来自橙色热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：6)；或来自曲霉属菌种，例如来自棘孢曲霉的内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：16)；或来自木霉属的菌种，例如SEQ ID NO：18所示的来自里氏木霉的内切葡聚糖酶，SEQ ID NO：19所示的来自绿色木霉(T.viride)的内切葡聚糖酶，或SEQ ID NO：20所示的来自里氏木霉的内切葡聚糖酶；

[0026] b)与a)的任一序列具有至少50％，例如至少60％，70％，80％或乃至至少90％的同源性的内切葡聚糖酶。

[0027] 13.上述任一项的方法，其中存在至少一种附加的酶，该酶选自下列：阿拉伯呋喃糖苷酶，阿魏酸酯酶和木聚糖乙酰酯酶。

[0028] 14.降低含有淀粉水解物的水溶液粘度的方法，其包括：

[0029] a)检测至少一种木聚糖分解酶的对于不溶性小麦阿拉伯木聚糖的水解活性，[0030] b)选择在紧邻着分枝残基处切割而保留末端取代的木糖寡聚的木聚糖分解酶，[0031] c)将所选的木聚糖分解酶加入到含有淀粉水解物的水溶液中。

[0032] 15.降低含有淀粉水解物的水溶液粘度的方法，其包括：

[0033] a)检测至少一种内葡聚糖分解酶的对于大麦beta-葡聚糖的水解活性，[0034] b)选择在如下条件：10μg/ml纯化的酶及5mg/ml大麦β-葡聚糖，于50mM乙酸钠及0.01％Triton X-100中，pH 5.5，50℃下，在1小时内将大于70％的大麦β-葡聚糖降解到DP 6或DP＜6的内葡聚糖分解酶，

[0035] c)将所选的内葡聚糖分解酶加入含有淀粉水解物的水溶液中。

[0036] 16.上述任一项的方法，其中所述含有淀粉水解物的水溶液是用于生产啤酒的醪液或饲料组合物。

[0037] 17.组合物，其包含：

[0038] k)GH10木聚糖酶，其量为总酶蛋白的至少15％w/w；和/或，

[0039] l)GH12，GH7和/或GH5内切葡聚糖酶，其量为总酶蛋白的至少20％w/w。

[0040] 18.根据上一项的组合物，其中所述木聚糖酶是A型木聚糖酶，优选地，该A型木聚糖酶的I1，3末端/I1，3内部的比值为至少0.25，例如至少0.30，至少0.40，至少0.50，或乃至至少0.60。

[0041] 19.根据上述项的组合物，其中所述木聚糖酶是来自丝状真菌，例如来自曲霉属菌种的菌株，优选来自棘孢曲霉(SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9)；来自毁丝霉属菌种的菌株，优选来自嗜热毁丝霉(SEQ ID NO：13)；来自腐质霉属菌种的菌株，优选来自特异腐质霉(SEQ ID NO：12)。

[0042] 20.根据上述项的组合物，其中所述木聚糖酶是来自细菌，例如来自芽孢杆菌菌株，优选来自Bacillus halodurans。

[0043] 21.根据上述项的组合物，其中所述内切葡聚糖酶是来自腐质霉属菌种的内切葡聚糖酶，例如来自特异腐质霉的内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：3)，或来自特异腐质霉的内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：4)；或来自热子囊菌属菌种，例如来自橙色热子囊菌的内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：6)；或来自曲霉属菌种，例如来自棘孢曲霉的内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：16)。

[0044] 22.根据上述项的组合物，其中所述GH 10家族的木聚糖酶以总木聚糖酶和内切葡聚糖酶酶蛋白的至少20％，优选为25％，例如至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少60％，或乃至至少70％w/w的量存在。

[0045] 23.根据上述项的组合物，其中所述GH家族12，7和/或5内切葡聚糖酶的内切葡聚糖酶以总木聚糖酶和内切葡聚糖酶酶蛋白的至少45％，优选为50％，例如至少55％，至少60％，至少70％，或乃至至少80％w/w的量存在。

[0046] 24.根据上述项的组合物在方法中的用途，所述方法包括降低含有淀粉水解物的水溶液的粘度。

[0047] 25.根据上述项的组合物在方法中的用途，所述方法包括过滤含有淀粉水解物的水溶液。

[0048] 26.根据上述项的组合物在方法中的用途，所述方法中含有淀粉水解物的水溶液是用于制造啤酒的醪液。

[0049] 27.根据上述项的组合物在方法中的用途，所述方法中含有淀粉水解物的水溶液是饲料组合物。

[0050] 本发明的其他方面前述的组合物在包括降低含有淀粉水解物的水溶液的粘度的工艺中的应用。在某些如上述的工艺中，所述含有淀粉水解物的水溶液是制造啤酒所用的醪液，或者其用于饲料组合物中。

[0051] 发明详述

[0052] 定义

[0053] 本公开自始至终使用了多种为本领域的普通技术人员所公知的术语，但还使用了某些具有特定意义的术语，其定义如下：

[0054] 此处“麦芽粉”(grist)理解为含有淀粉或糖，作为啤酒生产的基础的材料，例如大麦芽及辅料。

[0055] “麦芽”(malt)理解为任何发芽的谷类子实，特别指大麦子实。

[0056] “辅料”(adjuncts)理解为麦芽粉中非大麦芽的部分。其可以是任何富含糖的材料。

[0057] 术语“醪液”(mash)理解为水性淀粉浆，例如包括碎的大麦芽，碎的大麦和/或其他辅料或其组合，浸在水中以制备麦芽汁。

[0058] “麦芽汁”(wort)理解为糖化过程中提取麦芽粉后产生的、未经发酵的流出液(run-off)。

[0059] “麦酒糟”(spent grains)理解为提取麦芽粉并将麦芽汁从醪液中分离以后所留下的沥干(drained)后的固形物。

[0060] “啤酒”(beer)在这里理解为经过发酵的麦芽汁，例如以大麦芽及可选的辅料和啤酒花(hops)为原料酿造的酒精饮料。

[0061] 麦芽汁中的“提取物回收率”(extract recovery)是指从麦芽粉(麦芽和辅料)中浸出的可溶物的总和，表示为以干物质为基准的百分数。

[0062] “热稳定酶”(thermostable enzyme)是指在本发明的工艺的温度状况、温育时间和使用量下，能够充分地降解所述底物的酶。

[0063] “A型木聚糖酶”(Type A xylanase)是指在靠近分枝残基的位置切割阿拉伯木聚糖聚合物而形成末端取代的寡聚木糖的木聚糖酶。A型木聚糖酶可以用本公开的方法部分所描述的方法来鉴定。

[0064] “同源性”(homology)用于多肽或DNA序列并在本公开中提及时，指两个序列之间同源的程度，其表明第一个序列从第二个序列衍生。同源性可以适当地使用本领域中已知的计算机程序来确定，例如GCG程序包中的GAP(Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，August 1994，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA53711)(Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，443-453.)。采用下面的设置进行多肽序列比较：空位生成罚分(GAP creation penalty)为3.0；空位延伸罚分(GAP extension penalty)为0.1。

[0065] 术语“DP”是聚合度，这里用于指多糖水解物中的聚合物中的葡萄糖单位的平均数目。

[0066] 本公开中所使用的糖苷水解酶家族(glycoside hydrolase families，GH)和糖结合模块(carbohydrate binding modules，CBM)的编号是根据Coutinho，P.M和Henrissat，B.的观点(Coutinho，P.M.和Henrissat，B.(1999)CAZy-Carbohydrate-Active Enzymes server 于 URL：http://afmb.cnrs-mrs.fr/ ～ cazy/CAZY/index.html；或 Coutinho，P.M. 和 Henrissat，B.1999，The modular structure of cellulases and other carbohydrate-active enzymes：an integrated database approach.在″Genetics，Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation″.，K.Ohmiya，K.Hayashi，K.Sakka，Y.Kobayashi，S.Karita 和 T.Kimura 编 .，Uni Publishers Co.，Tokyo，pp.15-23中；及Bourne，Y. 和Henrissat，B.2001；Glycoside hydrolases and glycosyltransferases：families and functional modules，Current Opinion in Structural Biology 11：593-600.此分类系统基于一级结构的相似性来将葡糖苷水解酶分组。同一家族的成员还显示相同的催化机制，并在整体三维结构上具有相似性，即使同一家族的成员的底物特异性之间可能具有实质性的差异。

[0067] Humicola insolens内切葡聚糖酶的命名参照Karlsson，J的系统(Karlsson，J.2000.Fungal Cellulases，Study of hydrolytic properties of endoglucanasesfrom Trichoderma reesei and Humicola insolens.Lund University)。

[0068] 酿造工艺在本领域中是熟知的，一般包括制麦芽，糖化及发酵步骤。在传统发酵工艺中制麦芽起到下列作用：将不可溶淀粉转化为可溶淀粉，降解复杂的蛋白质，产生显色和呈味的化合物，产生供酵母生长的营养物，及生发酶(development of enzymes)。制麦芽工艺的三个主要步骤为浸泡，发芽和烘炉烘干(kilning)。

[0069] 浸泡包括将去壳的大麦粒(barley kernels)与水混合以提高湿度(moisture level)并活化休眠的麦粒的代谢过程，下一步，将湿大麦保持在合适的温度和湿度下使其发芽，直到实现充分改性(modification)，即，例如淀粉改性(degradation)和酶活化为止。最后一步是在烘炉中烘干绿麦芽，烘炉中的温度状况决定了大麦芽的颜色和存活下来用于糖化工艺的酶的量。在必须保持酶活性时，低温烘干是较合适的。经过高温烘干的麦芽中酶活性很低或者没有，但富含显色物质如焦糖，以及呈味物质。

[0070] 糖化是将碾磨过的大麦芽和固体辅料中的淀粉转化成可发酵和不可发酵的糖类从而产生具有所需组成(composition)的麦芽汁的工艺。传统的糖化包括将大麦芽和辅料在一定的温度和体积下与水混合以继续进行在制麦芽工艺中起始的生化变化。糖化在变化的温度下进行一段时间以活化负责降解蛋白和糖的内源麦芽酶类。糖化过程中发生的最重要的变化是淀粉分子向可发酵糖类的转化。在传统的糖化工艺中，负责淀粉转化的酶主要是α-和β-淀粉酶。α-淀粉酶将淀粉分子断裂成许多较短的、可被β-淀粉酶攻击的链，从而以很快的速度降解淀粉。产生的二糖是麦芽糖。

[0071] 传统上储藏啤酒的酿造经常使用一种称为“分步浸泡”(step-infusion)的方法。这种糖化程序包括在一系列不同温度下静置，每个温度有利于一种必需的内源酶活性。迄今为止双醪浸出(double-mash infusion)系统是啤酒尤其是储藏型啤酒的工业化生产中应用最广泛的系统。此系统制备两种单独的醪液。在该系统中，麦芽粉蒸煮锅用于煮辅料，而糖化槽则用于充分改性的、具有高度酶活性的麦芽。

[0072] 当使用酶含量低的麦芽粉例如辅料含量高的麦芽粉为原料酿造时，可以在添加的酶组合物的存在下进行糖化，该酶组合物包含水解麦芽粉淀粉所需的酶，这些酶可以包括α-淀粉酶，支链淀粉酶，β-淀粉酶和葡糖淀粉酶。

[0073] 糖化以后，需要将液体提取物(麦芽汁)和固形物(麦酒糟，即麦芽粉中不溶的谷粒和谷壳物质的部分)分开。麦芽汁的分离是重要的，因为固形物中含有大量的非淀粉多糖，蛋白质，改性不良的淀粉，脂肪物质，硅酸盐，和多酚(单宁)。谷类子实中存在的重要的非淀粉多糖是β-葡聚糖和阿拉伯木聚糖。大麦胚乳细胞壁含有75％的β-葡聚糖，20％的阿拉伯木聚糖和5％的残余蛋白质，以及少量的纤维素，葡甘露聚糖和酚酸。没有通过酶水解而改性的长链的大麦阿拉伯木聚糖在溶于水时会造成凝胶的形成，这些凝胶将大大增加麦芽汁的粘度并降低过滤性；β-葡聚糖也是如此，但程度要低一些。同样地，将β-葡聚糖降解为较小的寡聚物对于麦芽汁的质量也是非常重要的，因为未改性的β-葡聚糖以后会引起终产品啤酒中的浑浊稳定性(haze stability)问题。因此在糖化步骤中经常使用含有内切葡聚糖酶和木聚糖酶例如或的酶组合物来改善麦芽汁的分离。麦芽汁分离的目标包括但不仅限于下列方面：

[0074] ·获得较好的提取物回收率，

[0075] ·获得良好的过滤性，和

[0076] ·产生澄清的麦芽汁。

[0077] 浸出回收率(extraction recovery)和过滤性是酿造工艺中重要的经济性因素，而为了生产不起浑浊的啤酒，麦芽汁的澄清度是必不可少的。浸出回收率、过滤性和麦芽汁的澄清度很大程度上受麦芽粉的规格，例如辅料的种类和大麦芽，以及所用的糖化程序的影响。

[0078] 与麦酒糟分离后的麦芽汁可以用啤酒酵母发酵生产啤酒。

[0079] 关于常规酿造工艺的更多信息请参考酿造研究与教学会(Research and Teaching Institute of Brewing，Berlin(VLB))的Wolfgang Kunze所著“Technology Brewing and Malting”，2nd revised Edition 1999，ISBN3-921690-39-0。

[0080] 本发明的实施方案

[0081] 本发明提供一种生产具有更高的过滤性和/或更好的过滤后提取产率的醪液的工艺。该工艺包括：在酶活性的存在下制备醪液并过滤醪液得到麦芽汁，其中酶活性包括GH10家族的木聚糖酶，其量占总木聚糖和内切葡聚糖酶蛋白的至少15％，20％，优选25％，例如至少30％，或至少40％，至少50％或至少60％例如至少70％，至少80％，至少90％或乃至100％w/w。

[0082] 在一个优选的实施方案中，所述木聚糖酶是A型木聚糖酶，在一个特定的实施方案中该木聚糖酶是A型木聚糖酶，其具有I1，3末端/I1，3内部比值为至少0.25，例如至少0.30，至少0.40，至少0.50，或乃至至少0.60。

[0083] 优选地该木聚糖酶具有CBM，优选地为家族1的CBM。

[0084] 在另一个优选的实施方案中所述木聚糖酶是这样的木聚糖酶，其在本文中描述的木聚糖酶结合测定中具有的大麦可溶性/不可溶性纤维结合比为至少0.50，优选为至少0.60，更优为至少0.70，例如0.80，0.90，1.00，1.10或乃至至少1.20。

[0085] 在另一个优选的实施方案中，所述木聚糖酶来自丝状真菌，例如曲霉属(Aspergillus)菌种的菌株，优选地来自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9)；来自毁丝霉属(Myceliophotora)的菌种的菌株，优选地来自嗜热毁丝霉(SEQ ID NO：13)；来自腐质霉属(Humicola)菌种的菌株，优选地来自特异腐质霉(SEQ ID NO：12)。在另一个优选的实施方案中，所述木聚糖酶来自木霉属(Trichoderma)菌种的菌株，优选地来自里氏木霉(T.reesei)，例如SEQ ID NO：17所示的木聚糖酶。在一个更优选的实施方案中，所述木聚糖酶由来自与前述序列中的任何一个具有至少50％，例如至少
60％，70％，80％或乃至90％的同源性的木聚糖酶衍生而来。

[0086] 在另一个优选的实施方案中，所述木聚糖酶来自细菌，例如芽孢杆菌属(Bacillus)的菌株，优选地来自Bacillus halodurans。

[0087] 在另一个优选的实施方案中，所述内切葡聚糖酶为来自腐质霉属菌种的内切葡聚糖酶，例如来自特异腐质霉的内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：3)，或来自特异腐质霉的内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：4)，来自热子囊菌属(Thermoascus)的菌种，例如来自橙色热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：6)，或来自曲霉属的菌种，例如来自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：16)。

[0088] 在一个优选的实施方案中，所述木聚糖酶与前述任一序列具有至少50％，例如至少60％，70％，80％或乃至90％的同源性。

[0089] 在另一个优选的实施方案中，存在至少一种附加的酶，该酶是阿拉伯呋喃糖苷酶。

[0090] 本发明还提供一种工艺用于降低含有淀粉水解物的水溶液的粘度，该工艺包括：检测至少一种木聚糖分解酶的针对不溶性小麦阿拉伯木聚糖的水解活性，选择在紧邻着(next to)分枝残基处切割而形成末端取代的寡聚木糖的木聚糖分解酶，并将所选择的木聚糖分解酶加入到含有淀粉水解物的水溶液中。

[0091] 本发明进一步提供一种降低含有淀粉水解物的水溶液的粘度的工艺，其包括：检测至少一种内切葡聚糖分解酶的针对大麦β-葡聚糖的水解活性，选择在10μg/ml纯化的酶及5mg/ml大麦β-葡聚糖，于50mM乙酸钠及0.01％Triton X-100中，pH 5.5及50℃的条件下，在1小时内能将70％的大麦β-葡聚糖降解到DP6或DP＜6的内切葡聚糖分解酶，并将选择到的内切葡聚糖分解酶加入含有淀粉水解物的水溶液中。

[0092] 在上述两种工艺的优选的实施方案中，所述含有淀粉水解物的水溶液是用于制造啤酒的醪液。

[0093] 本发明进一步提供一种组合物，其包含：占总酶蛋白的至少15％w/w的GH10木聚糖酶，和/或，占总酶蛋白的至少40％w/w的GH12，GH7，和/或GH5内切葡聚糖酶。

[0094] 在一个优选的实施方案中所述组合物中的木聚糖酶是A型木聚糖酶，优选地，该A型木聚糖酶的具有I1，3末端/I1，3内部比值为至少0.25，例如至少0.30，至少0.40，至少0.50，或乃至至少0.60。

[0095] 在另一个优选的实施方案中，所述木聚糖酶来自丝状真菌，例如曲霉属菌种的菌株，优选地来自棘孢曲霉(SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9)；来自毁丝霉属的菌种的菌株，优选地来自嗜热毁丝霉(SEQ ID NO：13)；来自腐质霉属菌种的菌株，优选地来自特异腐质霉(SEQ ID NO：12)。在一个优选的实施方案中，所述组合物的木聚糖酶与前述序列中的任何一个具有至少50％，例如至少60％，70％，80％或乃至90％的同源性。

[0096] 在一个优选的实施方案中，所述组合物中的木聚糖酶来自细菌，例如芽孢杆菌属的菌株，优选为Bacillus halodurans。

[0097] 在另一个优选的实施方案中，所述组合物中的内切葡聚糖酶为来自腐质霉属菌种的内切葡聚糖酶，例如来自特异腐质霉的内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：3)，或来自特异腐质霉的内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：4)，来自热子囊菌属的菌种，例如来自橙色热子囊菌(thermoascus aurantiacus)的内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：6)，或来自曲霉属的菌种，例如来自棘孢曲霉的内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：16)，或来自木霉属的菌种，优选为里氏木霉和/或绿色木霉(T.viride)，例如SEQ ID NO：18所示的5家族的内切葡聚糖酶，SEQ ID NO：19所示的7家族的β-葡聚糖酶，或SEQ ID NO：20所示的12家族的β-葡聚糖酶。

[0098] 在一个优选的实施方案中，所述组合物的内切葡聚糖酶与前述序列中的任何一个具有至少50％，例如至少60％，70％，80％或乃至90％的同源性。

[0099] 在一个优选的实施方案中，所述组合物中GH10家族的木聚糖酶的量以总木聚糖和内切葡聚糖酶酶蛋白的至少25％，例如至少30％，至少35％，至少40％w/w，至少45％或甚至至少50％w/w存在。

[0100] 在一个优选的实施方案中，所述组合物中GH12，7和/或5家族的木聚糖酶的量占总木聚糖酶和内切葡聚糖酶酶蛋白的至少25％，优选30％，例如至少35％，至少40％，或乃至至少50％，例如55％或乃至至少60％w/w。

[0101] 根据前述方面的组合物可以用于包括降低含有淀粉水解物的水溶液的粘度的工艺。

[0102] 该组合物还可用于包括过滤含有淀粉水解物的水溶液的工艺。在一个优选的实施方案中，该含有淀粉水解物的水溶液是用于制造啤酒的醪液，在另一个优选的实施方案中该含有淀粉水解物的水溶液是饲料成分(composition)。

[0103] 本发明的方法(process)可以用于任何麦芽粉的糖化。根据本发明，麦芽粉可以包括任何含淀粉和/或糖的植物材料，该植物材料可以来自任何植物和植物部分，包括块茎，根，茎，叶和种子。优选地，麦芽粉包括谷类子实，例如大麦，小麦，黑麦，燕麦，玉米，稻，milo，粟类(millet)和高粱的子实；更优地，麦芽汁的麦芽粉的至少10％，更优地为至少15％，更优地为至少25％，或最优地为至少35％，例如至少50％，至少75％，至少90％，或乃至100％(w/w)是来自谷类子实。最优地，麦芽粉包括制成麦芽的谷类子实，例如大麦芽。
较优地，麦芽汁的麦芽粉的至少10％，更优地为至少15％，更优地为至少25％，或最优地为至少35％，例如至少50％，至少75％，至少90％，或乃至100％(w/w)是来自制成麦芽的谷类子实。

[0104] 对低麦芽麦芽粉(low malt grists)进行糖化时可以外加糖化酶，最常用作淀粉降解酶的酶包括支链淀粉酶，α-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶。淀粉降解酶在糖化中的使用对于技术人员是熟知的。

[0105] 含有易于发酵的碳水化合物例如糖和糖浆的辅料可以在本发明的糖化工艺之前，之中或之后加入到麦芽中，但优选地于糖化工艺之后加入。辅料的一部分在加到本发明的醪液中之前可以用蛋白酶和/或内切葡聚糖酶处理，或用热处理。

[0106] 在糖化工艺过程中，从麦芽粉中提取的淀粉被逐渐水解为可发酵的糖和较小的糊精。优选地，在分离麦芽汁之前，醪液对碘试验呈淀粉阴性。

[0107] 在本发明的工艺中应用合适的木聚糖酶和内切葡聚糖酶活性，使得β-葡聚糖和阿拉伯木聚糖水平得以充分降低，这样有助于麦芽汁的分离，从而确保了较短的循环时间，高提取物回收率和澄清的麦芽汁。

[0108] 由本发明的第一方面的工艺(process)制备的麦芽汁可以经过发酵生产啤酒。麦芽汁的发酵可包括将酵母浆(slurry)接种到麦芽汁中，其中酵母浆可以包含新鲜酵母，即先前没有用于本发明的酵母，或者，酵母也可以是回收的酵母。使用的酵母可以是任何适用于啤酒酿造的酵母，尤其是选自糖酵母属(Saccharomyces)的若干种，例如酿酒酵母(S.cerevisiae)和葡萄汁糖酵母(S.uvarum)，包括这些生物的天然和人工产生的变体。发酵麦芽汁以生产啤酒的方法对于技术人员是熟知的。

[0109] 本发明的工艺可以包括将二氧化硅水凝胶(hydrogel)加入到发酵后的麦芽汁中以增加啤酒的胶体稳定性。该工艺还可以包括向发酵后的麦芽汁中加入硅藻土并过滤以使啤酒澄清。通过发酵本发明的麦芽汁所生产的啤酒可以是任意种类的啤酒，例如爱儿啤酒(ale)，烈性爱儿啤酒(strong ale)，黑啤酒(stout)，英国黑啤酒(porter)，陈贮啤酒(lager)，捷克黄啤酒(pilsner)，苦啤酒(bitter)，出口啤酒(export beer)，麦芽酒(malt liquor)，发泡酒(happoushu)，朗别克啤酒(lambic)，大麦酒(barley wine)，高酒精啤酒(high-alcohol beer)，低酒精啤酒(low-alcohol beer)，低热量啤酒(low-calorie beer)，或轻淡啤酒(light beer)。

[0110] 通过本发明的工艺生产的啤酒可以经过蒸馏回收乙醇，例如用于制造威士忌(whisky)。任意种类的威士忌(在美国和爱尔兰拼作“whiskey”)都可以在考虑范围之内，如波旁威士忌(bourbon)，加拿大威士忌(Canadian whisky)，爱尔兰威士忌(Irish whiskey)，黑麦威士忌(rye)和苏格兰威士忌(scotch)。

[0111] 木聚糖酶

[0112] 用于本发明目的的木聚糖酶是归类为EC 3.2.1.8的酶。其正式名称为内-1，4-β-木聚糖酶(endo-1，4-β-xylanase)。其分类名称为1，4-β-D-木聚糖-木聚糖水解酶(1，4-β-D-xylan xylanohydrolase)；还可能使用其他的名称，例如内-(1-4)-β-木聚糖酶(endo-(1-4)-β-xylanase)；(1-4)-β-木聚糖4-木聚糖水解酶((1-4)-β-xylan 4-xylanohydrolase)；内-1，4-木聚糖酶(endo-1，4-xylanase)；木聚糖酶(xylanase)；β-1，4-木聚糖酶(β-1，4-xylanase)；内-1，4-木聚糖酶(endo-1，
4-xylanase)；内-β-1，4-木聚糖酶(endo-β-1，4-xylanase)；内-1，4-β-D-木聚糖酶(endo-1，4-β-D-xylanase)；1，4-β-木聚糖 -木聚糖水解酶 (1，4-β-xylan xylanohydrolase)；β-木聚糖酶(β-xylanase)；β-1，4-木聚糖-木聚糖水解酶(β-1，
4-xylan xylanohydrolase)；内-1，4-β-木聚糖酶(endo-1，4-β-xylanase)；β-D-木聚糖酶(β-D-xylanase)。催化的反应是木聚糖中的1，4-β-D-木糖苷键的内切水解(endohydrolysis)。

[0113] 本发明中将用到的木聚糖酶可以来自任何来源，包括哺乳动物，植物或动物来源，但目前更偏好微生物来源的木聚糖酶。特别地，所述木聚糖酶可以是可得自丝状真菌或酵母的木聚糖酶。

[0114] 已经在若干种真菌中发现了木聚糖酶，具体有曲霉属的菌种，例如黑曲霉(A.niger)，泡盛曲霉(A.awamori)，棘孢曲霉和米曲霉(A.oryzae)；木霉属的菌种，例如里氏木霉或T.harzianum；青霉属的菌种，例如沙门氏柏干酪青霉(P.camenbertii)；镰孢属(Fusarium)的菌种，例如尖孢镰孢(F.oxysporum)；腐质霉属的菌种，例如H.insolens；和Thermomyces lanuginosa，例如T.lanuginosa。在细菌种类中也已发现了木聚糖酶，例如在芽孢杆菌属中，如短小芽孢杆菌(B.pumilus)。

[0115] 优选地，根据本发明的工艺，所述木聚糖酶来自：丝状真菌例如曲霉属的种，芽孢杆菌属的种，腐质霉属的种，毁丝霉属的种，Poitrasia属的种，根毛霉属(Rhizomucor)的种，或木霉属。

[0116] 底物特异性已被证明是木聚糖酶在本发明的工艺中的性能的关键参数。在本发明的工艺中具有最佳性能的木聚糖酶看来是这样的酶，其与可溶的阿拉伯木聚糖的结合相当强，而与不可溶的阿拉伯木聚糖的结合相当弱。优选地，本发明中将要使用的木聚糖酶是这样的木聚糖酶，在本公开的方法描述部分所述的结合测定中，该酶在本文中描述的木聚糖酶结合测定中具有的大麦可溶性/不可溶性纤维结合比为至少0.50，优选为至少0.60，更优为至少0.70，例如0.80，0.90，1.00，1.10或乃至至少1.20。

[0117] 已鉴定的具有这些特征的若干木聚糖酶是葡糖苷水解酶10家族的成员。优选地，本发明将要使用的木聚糖酶是糖苷水解酶10家族(GH10)的木聚糖酶，最优地，所述木聚糖酶是GH10木聚糖酶，同时也是A型木聚糖酶，即，在靠近分枝残基处切割不溶性小麦阿拉伯木聚糖聚合物，而产生末端取代的寡聚木糖的木聚糖酶(请参见A型和B型定义的示例)。由于GH10酶能够更接近分枝的木糖单位，和GH11木聚糖酶相比，它们可以产生更小的寡糖。

[0118] 优选地，本发明中要使用的木聚糖酶具有功能性的CBM，例如第1家族的CBM。

[0119] 优选地，根据本发明的工艺，所述木聚糖酶选自下列：来自棘孢曲霉的木聚糖酶，由SEQ ID NO：8(AA XYL I)所示；来自棘孢曲霉的木聚糖酶，由SEQ ID NO：9(AA XYL II)所示；来自Bacillus halodurans的木聚糖酶，由SWISS PROT P07528(BH XYL A)所示；特异腐质霉的木聚糖酶，由SEQ ID NO：12(HI XYL III)所示；Myceliophotora thermophila的木聚糖酶，由SEQ ID NO：13(MT XYL I)所示；及Trichoderma reesei的木聚糖酶，例如由SEQ ID NO：17所示的木聚糖酶。另外还优选任何与上述任一序列具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，乃至至少90％的同源性的序列。

[0120] 内切葡聚糖酶

[0121] 用于本发明目的的内切葡聚糖酶是归类为EC 3.2.1.4的酶。本发明中要用到的内切葡聚糖酶可以来自任何来源，包括哺乳动物，植物或动物来源，但目前更偏好微生物来源的内切葡聚糖酶。特别地，所述内切葡聚糖酶可以是可得自丝状真菌或酵母的内切葡聚糖酶。

[0122] 优选地，所述内切葡聚糖酶是糖苷水解酶12家族(GH12)，第7家族(GH7)，或第5家族(GH5)的葡聚糖酶。更优地，所述内切葡聚糖酶是具有β-薄卷饼型(βjelly roll)或者b8/a8-桶(b8/a8-barrel)超结构的多肽。

[0123] 本发明中要用到的内切葡聚糖酶可以来自任何来源，包括哺乳动物，植物或动物来源，但目前更偏好微生物来源的内切葡聚糖酶。特别地，所述内切葡聚糖酶可以是可得自丝状真菌或酵母的内切葡聚糖酶。

[0124] 更优地，根据本发明的工艺，所述内切葡聚糖酶来自丝状真菌例如曲霉属和腐质霉属的种。

[0125] 优选地，根据本发明的工艺，所述内切葡聚糖酶选自下列：来自棘孢曲霉的内切葡聚糖酶，由SEQ ID NO：1(AA EG I)所示；来自棘孢曲霉的内切葡聚糖酶，由SEQ ID NO：2(AA EG II)所示；来自棘孢曲霉的内切葡聚糖酶，由SEQ ID NO：16(AA EG III)所示；来自特异腐质霉的内切葡聚糖酶，由SEQ ID NO：3(HI EG I)所示；来自特异腐质霉的内切葡聚糖酶，由SEQ ID NO：4(HI EG III)所示；来自特异腐质霉的内切葡聚糖酶，由SEQ ID NO：5(HI EG IV)所示；来自木霉属菌种的内切葡聚糖酶，由SEQ ID NO：19所示；或来自木霉属菌种的内切葡聚糖酶，由SEQ ID NO：20所示。另外还优选任何与上述任一序列具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，乃至至少90％的同源性的序列。

[0126] 其他GH12葡聚糖酶包括来自下列的内切葡聚糖酶：来自曲霉属的菌种，例如来自川地曲霉(Aspergillus kawachii)(SWISSPROT Q12679)，或黑曲霉(SWISSPROT O74705)，米曲霉(SWISSPROT O13454)；来自欧文氏杆菌属(Erwinia)的菌种，例如来自胡萝卜欧文氏杆菌(Erwinia carotovora)(SWISSPROT P16630)；及来自Thermotoga属的菌种，例如来自Thermotoga maritima(SWISSPROT Q60032或Q9S5X8)。另外还优选任何与上述任一GH12葡聚糖酶序列具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，乃至至少90％的同源性的序列。

[0127] 其他GH12葡聚糖酶包括来自下列的内切葡聚糖酶：来自蘑菇属(Agaricus)的菌种，例如来自双孢蘑菇(Agaricus bisporus)(SWISSPROTQ92400)；来自镰孢属的菌种，例如来自尖孢镰孢(SWISSPROT P46238)；来自链孢霉属(Neurospora)的菌种，例如来自粗糙链孢霉(Neurospora crassa)(SWISSPROT P38676)；及来自木霉属的菌种，例如来自Trichoderma longibrachiatum(SWISSPROT Q12714)。另外还优选任何与上述任一GH7葡聚糖酶序列具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，乃至至少90％的同源性的序列。

[0128] 其他GH5葡聚糖酶包括来自下列的内切葡聚糖酶：来自Acidothermus属的菌种，例如来自Acidothermus cellulolyticus(SWISSPROT P54583)；来自曲霉属的菌种，例如来自黑曲霉(SWISSPROT O74706)；及来自芽孢杆菌属的菌种，例如来自多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)(SWISSPROT P23548)。另外还优选任何与上述任一GH5葡聚糖酶序列具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，乃至至少90％的同源性的序列。

[0129] 阿拉伯呋喃糖苷酶

[0130] 阿拉伯呋喃糖苷酶EC 3.2.1.55，通用名α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶，其水解α-L-阿拉伯糖苷中的末端非还原α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基。该酶作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1，3)-和/或(1，5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖。

[0131] 材料和方法

[0132] 木聚糖酶活性

[0133] 木聚糖分解活性可以用FXU单位来表示，其在pH6.0下以remazol-木聚糖(xylan)(用Fluka产的Remazol Brilliant Blue R染色的4-O-甲基-D-葡糖醛酸-D-木聚糖)为底物测定。

[0134] 将木聚糖酶样品和remazol-木聚糖底物共温育，用乙醇沉淀掉未降解的染色底物背景。保留在上清中的蓝色(用分光光度在585nm测得)与木聚糖酶活性成比例。然后相对标准反应条件即50℃，pH6.0，反应时间30分钟下的酶标准品确定木聚糖酶单位。

[0135] Novozyme A/S，Demark可以根据要求提供小册子AF 293.6/1，在其中有对此分析方法的更详细的描述。此处将其引入作为参考。

[0136] 葡聚糖酶活性

[0137] 纤维素分解活性可以以真菌内切葡聚糖酶单位(fungal endoglucanase units，FBG)来衡量，其是在30℃，pH 5.0，反应时间30min的条件下以0.5％β-葡聚糖为底物测定的。真菌内切葡聚糖酶与β-葡聚糖反应释放出葡萄糖或者还原性碳水化合物，该葡萄糖或者还原性碳水化合物作为还原糖，用Somogyi-Nelson法测定。

[0138] 1真菌内切葡聚糖酶单位(FBG)是指在上述标准条件下，每分钟能释放具有相当于1微摩尔葡萄糖的还原能力的葡萄糖或者还原性碳水化合物的酶量。

[0139] 酶

[0140] L，来源于特异腐质霉的多组分酶组合物，其包含内切葡聚糖酶，木聚糖酶，戊聚糖酶和阿拉伯聚糖酶的混合物。 L的规格为45FBG/g，比重为大约1.2g/ml。 L可以自Novozymes A/S获得。

[0141] L，来源于棘孢曲霉的多组分酶组合物，其包含内切葡聚糖酶，阿拉伯聚糖酶和木聚糖酶的混合物。 L的规格为100FBG/g，比重为大约1.2g/ml。
Viscozyme可以自Novozymes A/S获得。

[0142] 枯草蛋白酶(subtilisin)来源于地衣形芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)的蛋白酶组合物。可以自Novozymes A/S获得。

[0143] 一种芽孢杆菌α-淀粉酶，可自Novozymes A/S获得。

[0144] 还使用了下面的单组分内切葡聚糖酶和木聚糖酶：

[0145] 内切葡聚糖酶：

[0146]

[0147] 木聚糖酶：

[0148]

[0149] 方法

[0150] 醪液制备

[0151] 除非另外说明，糖化如下述进行。除了注明的地方(例如关于酶的用量)外，醪液的制备按照EBC：4.5.1进行，使用按照EBC：1.1磨制的麦芽。糖化试验在有盖的500ml容器中进行，容器温育在水浴中并加搅拌，每个容器内盛有醪液，该醪液含50g麦芽粉并用预热到初始温育温度+1℃的水将总重调到300±0.2g。制得的麦芽汁的柏拉图度(Plato)大约为12％。

[0152] 糖化温度变化

[0153] 除非另外说明，糖化在下面的温度下进行：初始温育温度52℃下经过30min；然后经过升温步骤升到63℃，并在该温度下保持20min；再经过升温步骤升到72℃并保持30min，然后在78℃下煮浆(mashing off)5min。步间(step wise)的温度梯度是以1℃/min的上升率实现的。醪液在15分钟中冷却到20℃。这样总的温育时间为2小时11分钟。

[0154] 附加方法

[0155] 粗产品、麦芽汁、啤酒等的分析方法可以参见：Analyica-EBC，Analysis Committee of EBC，the European Brewing Convention(1998)，Verlag Hans Carl Geranke-Fachverlag。有关本发明的下列参数的测定方法如下所示。

[0156] 柏拉图度：折射计

[0157] β-葡聚糖：EBC：8.13.2(麦芽汁中的高分子量β-葡聚糖含量：荧光测定法)。

[0158] 浊度：EBC：4.7.1

[0159] 过滤性：滤液体积(ml)测定：根据EBC：4.5.1(麦芽提取物：欧啤协法醪液(Congress Mash))第8.2小节。过滤性：将320mm直径的棱沟滤纸(fluted filter paper)(Schleicher and Schüll No.5971/2，Machery，Nagel and Co.)安放在200mm直径的漏斗(funnels)中，漏斗装在500ml的烧瓶上，以此装置过滤1小时后，读取滤液的体积。

[0160] 提取物回收率：EBC：4.5.1(麦芽提取物：欧洲啤酒协会醪液，干提取物)术语麦芽汁中的提取物回收率定义为从麦芽粉(麦芽和辅料)中提取的可溶物(葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，麦芽三糖，糊精，蛋白质，胶质，无机物，其他物质)的总和，表示为以干物质为基准的百分数。剩下的不可溶部分定义为麦酒糟。

[0161]

[0162]

[0163] 其中：

[0164] E1＝样品中的浸出物含量，以％(m/m)计

[0165] E2＝麦芽粉中的浸出物含量，以％(m/m)计

[0166] P＝麦芽汁中的浸出物含量，以％柏拉图度计

[0167] M＝麦芽粉的含水量，以％(m/m)计

[0168] 800＝对于100g麦芽粉，加入到糖化醪中的蒸馏水的量。

[0169] 粘度：自动微粘度仪(Automated Microviscometer，AMVn)是基于滚球原理(rolling ball principle)。将待测样品导入玻璃毛细管中，该毛细管中有钢球滚动。通过测量钢球的滚动时间就可以确定被测流体的粘性性质。测量在毛细管中球滚过一段给定的测量距离所经过的滚动时间t0，由测量系统的校正常数K1(α)，滚动时间t0及球和样品的密度之差Δρ，通过下面的公式计算得到样品的动态粘度η：

[0170] η＝K1(α)·t0·(ρk-ρS)，其中

[0171] η＝样品的动态粘度[mPa·s]3

[0172] K(α)＝测量系统的校正常数[mPa·scm/g]

[0173] t0＝100mm的滚动时间[s]3

[0174] ρk＝球的密度[7,85g/cm]3

[0175] ρs＝被测样品的密度[g/cm]

[0176] 粘度可以基于浸提物本身的柏拉图度(Plato°)表示，也可以根据欧洲啤酒协会的糖化程序换算成8，6柏拉图度(Plato)。

[0177] 实施例1.通过结合测定鉴定木聚糖酶

[0178] 各纤维组分的制备

[0179] 可溶性纤维组分按如下制备：

[0180] 1.将50kg大麦磨粉，并在50℃搅拌下于450kg水中制成浆。

[0181] 2.在搅拌下浸提30分钟。

[0182] 3.用预热的沉降式离心机(于50℃)和固体排出式离心机(solids-ejecting centrifuge)制得无颗粒的澄清的组分。

[0183] 4.在50℃下用截留值为20000道尔顿的管状膜超滤上述澄清组分，持续超滤直至系统中粘度升高且流速显著降低。

[0184] 5.收集经过浓缩的组分并冷冻干燥。

[0185] 不可溶纤维组分按如下制备：

[0186] 1.将50kg大麦磨粉，并在50℃搅拌下于450kg水中制成浆。加入0.25kg Termamyl SC并将溶液在搅拌下加热到85℃，反应30分钟，取样用于碘试验测定淀粉。

[0187] 2.将所取的样在3000xg下离心5min(在10ml离心瓶中)。用折射计测量上清的柏拉图度。用碘颜色反应监测淀粉转化；如果显蓝色则有淀粉残留。

[0188] 3.持续反应直至柏拉图度数稳定。反应产物即可离心。

[0189] 4.使用沉降式离心机离心。在75℃下分离，弃去所得到的澄清无颗粒的上清组分，仅将固体组分用于后续的工艺。

[0190] 5.在500kg热水中将该固体组分制成浆，将此浆的温度调到50℃。

[0191] 6.用NaOH将pH调到7.5。用125g Alcalase 2.4L进行水解反应。水解反应过程中pH维持在pH＝7.5(pH-stat)，反应时间为120分钟。而后，在搅拌及无pH-stat的条件下，于T＝50℃反应过夜。

[0192] 7.用HCl将pH调至6.5。

[0193] 8.用沉降式离心机离心反应混合物。

[0194] 9.收集固体组分并在50℃下用500L水洗涤30分钟，重复离心步骤和洗涤步骤。

[0195] 10.将洗涤过的固体组分冷冻干燥。

[0196] 纤维组分分析

[0197] 用下面的方法分析纤维组分的糖类构成：将1g纤维加入50mL 1M HCl中并在100℃下保温振荡2小时。在此处理之后，立即在冰上冷却反应混合物，并加入11mL4M NaOH以中和该混合物。依照等.(2003)Biotech.Bioeng.vol.81，No.6，
p.726-731的描述，用装配了CarBoPac PA-1的Dionex BioLC system系统测定阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木糖的含量，如。结果显示在表1中。

[0198] 表1.大麦纤维组分中各种糖的单独含量(g/kg)

[0199]

[0200] 木聚糖酶结合测定

[0201] 木聚糖酶结合测定以下面的方法进行：在Eppendorf管中用500μl乙酸盐缓冲液(50mM，pH5.5，0.1％Triton X-100)以涡旋混合的方式洗涤纤维(10mg)，然后在13000g下离心2min。洗涤和离心进行两次。将含有酶的溶液*(500μl，于pH5.5的乙酸盐缓冲液中)加到底物中，将混合物充分地涡旋混合后在冰浴中保持10min。然后将盛有反应混合物的Eppendorf管在14000g离心3min，再以溶于0.2M磷酸钠缓冲液pH6.0+0.01％Triton X-100的0.2％自小麦AZCL-阿拉伯木聚糖(Megazyme)为底物测定初始和残留活性。在恒温混匀器中将盛有900μl底物的小瓶预热到37℃。加入100μl酶样品，然后在最大振荡下在37℃保温15min。将小瓶在冰上放置2min，然后于20.000g(20000)下离心1min。将2x200μl上清转移到微量滴定板中，测量终点590nm OD，并与对照比较。在对照中100μl酶样品不是与底物而是与900μl0.2M磷酸钠缓冲液pH6.0+0.01％Triton X-100共保温，随后全部活性被回收在上清中，此值被定为1。结果显示在表2中。

[0202] 两种具有最高的可溶性/不溶性大麦纤维结合比的木聚糖酶，棘孢曲霉木聚糖酶II和I，也是在糖化试验中性能最佳的两种木聚糖酶。

[0203]

[0204] 实施例2.鉴定木聚糖酶的特异性

[0205] 应用高场核磁共振(1H NMR)来鉴定针对不溶性小麦阿拉伯木聚糖(AX)(不溶性，Megazyme)的木聚糖酶特异性的差异。

[0206] 在1H NMR中，阿拉伯木聚糖或其寡糖(AXO)显示出由来自α-L-阿拉伯呋喃糖苷单位的异头质子H-1所引起的大约5.0-5.5ppm信号(化学位移)，它们之间存在的依赖于它们的局部环境的个体差异可以用来评价木聚糖酶针对这种高度分枝的聚合物的特异性。

[0207] 标准条件是：10mg/mL AX(于50mM乙酸钠缓冲液中，pH 5.5)与0.1XU/mL在30℃共保温120min，然后使木聚糖酶失活(95℃，20min)，将溶液在旋转蒸发器上浓缩。将样品从D2O(1mL)中蒸发两次，最后在分析之前重悬于D2O(～0.8mL)中。在30℃下于Varian1
Mercury 400MHz上记录 HNMR谱。经过100次扫描收集数据，并用HDO信号作为参比信号(4.67ppm)。

[0208] 木聚糖酶降解AX时，1H NMR会根据酶的特异性而发生变化。因此，如果产物寡糖中的阿拉伯糖位于末端的(terminal)木糖——相比于“内部的”(internal)木糖——上，阿拉伯呋喃糖苷H-1的化学位移将会改变。如果木聚糖酶能够把取代的木糖置于其+1亚位点上，就会造成这样的结果。在所应用的条件下，发现所有受试的GH10木聚糖酶都具有上述能力，而没有发现具有此特性的GH11木聚糖酶。A型指在紧邻着分枝残基处切割的木聚糖酶(产生末端取代的寡聚木糖)，而B型指在未取代的木糖单位之间切割，只产生内部取代的单位的木聚糖酶。A型木聚糖酶也能够在未取代的木糖单位之间切割。表3显示了本发明人所鉴定的A型和B型木聚糖的例子。对于本发明，优选A型木聚糖。

[0209] 表3.A型和B型木聚糖酶的示例

[0210]

[0211] 即使在A型木聚糖之间，对于在紧邻着分枝残基处切割或在未取代的木糖之间切割的偏好性也是不同的，如表4所示，其中I1，3末端/I1，3内部的比值与两种质子各自的总数之比值相关。因此，A型的切割会造成I1，3末端的上升，而B型的切割不会。两种质子的化学位移分别是：在末端木糖上1，3-联结的阿拉伯呋喃糖苷H-1：5.26ppm；在内部木糖上1，3-联结的阿拉伯呋喃糖苷H-1：5.32ppm。对于本发明，优选I1，3末端/I1，3内部比值为至少0.25，例如至少0.30，至少0.40，至少0.50，乃至至少0.60的A型木聚糖酶。

[0212]

[0213] 实施例3.鉴定内切葡聚糖酶的特异性

[0214] 通过与大麦β-葡聚糖共温育并分析降解产物来研究内切葡聚糖酶的特异性。将分别含0.1和10μg/ml纯化的酶，以及5mg/ml大麦β-葡聚糖(Megazyme，低粘度)，50mM乙酸钠，0.01％Triton X-100，pH5.5的不同Eppendorf管在搅动下在Eppendorf恒温混匀器中于50℃下保温。

[0215] 受试的酶为来自特异腐质霉的内切葡聚糖酶EG I，来自特异腐质霉的内切葡聚糖酶EG III，来自特异腐质霉的内切葡聚糖酶EG IV，棘孢曲霉EGII(XG5，Cel12B)，和棘孢曲霉EG III(XG53，Cel12A)。

[0216] 在1到21.5小时之间取样，并在95℃下加热30min使样品失活。将每个样品的一半体积在50℃下，50mM MES，1mM氯化钙，pH6.5中用地衣酶(lichenase)(0.085μg/ml，Megazyme，来自地衣芽孢杆菌)降解2小时，然后在95℃下加热30min使地衣酶失活。将经过和未经过地衣酶处理的样品用Milli Q水适当稀释，并在Dionex DX-500HPAEC-PAD系统(CarboPac PA-100柱；A缓冲液：150mM NaOH；B缓冲液：150mM NaOH+0.6M乙酸钠；流速：1ml/min；洗脱条件：0-3min：95％A+5％B；3-19min：线性梯度：95％A+5％B到50％A+50％B；19-21min：线性梯度：50％A+50％B到100％B；21-23min：100％B)上分析。纤维寡糖(DP1到DP6，每种100μM)混合物被用作Dionex系统的参比，利用纤维寡糖(cellooligo)标准品和已知的经过地衣酶处理的大麦β-葡聚糖的组成(例如，Izydorczyk，M.S.，Macri，L.J.，和MacGregor，A.W.，1997，Carbohydrate Polymers，35，249-258)鉴别色谱图中的峰。利用由纤维寡糖标准品得到的响应因子，并假设具有相同DP的含β-1，3键的寡糖具有相同的响应因子，对色谱图中的峰进行了定量。对于大于DP6的寡糖，使用DP6的响应因子。

[0217] 通过分析来自特异腐质霉的EG I所降解的产物(表5和6)，发现该酶可以降解β-1，3和β-1，4键。最开始，纤维二糖，纤维三糖，从一定程度上说还有昆布二糖(laminaribiose)，是地衣酶处理后增加的主要产物。这暗示亚位点-4/-3，-5/-4和+1/+2上的葡萄糖单位之间的β-1，3键都被接受。发现在最高的酶用量(10μg/ml)和最长的温育时间(21.5小时)下，生成的主要产物是葡萄糖和纤维二糖。

[0218] 使用来自特异腐质霉的EG III时，在21.5小时后，10μg/ml的酶浓度下，主要产物是四糖(主要是Glu(β-1，4)Glu(β-1，3)Glu(β-1，4)Glu和Glu(β-1，4)Glu(β-1，4)Glu(β-1，3)Glu，但不是Glu(β-1，3)Glu(β-1，4)Glu(β-1，4)Glu)，五糖(可能主要是 Glu(β-1，3)Glu(β-1，4)Glu(β-1，4)Glu(β-1，3)Glu 和 Glu(β-1，4)Glu(β-1，4)Glu(β-1，3)Glu(β-1，4)Glu)和更大的寡聚物。地衣酶处理后的降解产物的组成显示该酶专一地降解β-葡聚糖中的β-1，4键。进一步地，被水解的β-1，4键主要是那些没有被地衣酶降解的(在非还原端方向没有相邻的β-1，3键)。即使以10μg/ml处理21.5小时后，经过地衣酶处理后的Glu(β-1，4)Glu(β-1，3)Glu(“Lic3”)的量仍然没有显著减少，这暗示该酶对于在β-1，3键之间只有两个β-1，4键的片段只有有限的活性。经过地衣酶处理后出现了显著量的葡萄糖和昆布二糖，而非纤维三糖或纤维二糖，这暗示被接受的β-1，3键是在亚位点-3/-2和+1/+2上的葡萄糖单位之间，而不是在位点-4/-3或-5/-4上的葡萄糖单位之间。

[0219] 来自特异腐质霉的EG IV酶主要将β-葡聚糖降解为较大的寡聚物(表9和10)，但经过10μg/ml酶21.5小时的处理，生成了显著量的纤维二糖和DP4的寡聚物(可能主要是Glu(β-1，4)Glu(β-1，3)Glu(β-1，4)Glu和Glu(β-1，3)Glu(β-1，4)Glu(β-1，4)Glu)。该酶降解β-葡聚糖中相等量的β-1，4和β-1，3键，而且被切割的β-1，4键似乎是那些在非还原端方向没有相邻的β-1，3键的β-1，4键(和地衣酶不同)，EG IV有限水解以后用地衣酶处理使纤维三糖增加，而纤维二糖和葡萄糖只有在更广泛的EG IV水解后才会出现。这说明和亚位点-4/-3，尤其是-3/-2上的葡萄糖单位相比，亚位点-5/-4上的葡萄糖单位之间的β-1，3键被更好地接受。地衣酶处理后昆布二糖的出现说明亚位点+1/+2上的葡萄糖之间的β-1，3键也可被接受。

[0220] 使用棘孢曲霉EGII(XG5，Cel12B)时，葡萄糖似乎是主要的低分子量产物(表11和12)。对β-葡聚糖几乎没有被EG II降解的样品，地衣酶处理使纤维二糖，纤维三糖和昆布二糖增加，但不使葡萄糖增加。这暗示被接受的β-1，3键是在亚位点-5/-4，-4/-3或+1/+2上的葡萄糖单位之间，但可能不是-3/-2上的葡萄糖单位之间。EG II释放的葡萄糖可能是通过对降解产物的外切作用而释放的。该酶可以水解β-1，4和β-1，3键，尽管β-1，4键似乎受到偏好。在最高的酶浓度下20小时后，可观察到β-葡聚糖几乎全部被降解成了葡萄糖。

[0221] 棘孢曲霉EG III(XG53，Cel12A)快速地降解β-葡聚糖产生DP4(主要是Glu(β-1，3)Glu(β-1，4)Glu(β-1，4)Glu 和 Glu(β-1，3)Glu(β-1，4)Glu(β-1，4)Glu)及DP5(主要是Glu(β-1，4)Glu(β-1，4)Glu(β-1，3)Glu(β-1，4)Glu，但还有一些 Glu(β-1，4)Glu(β-1，3)Glu(β-1，4)Glu(β-1，4)Glu 和 Glu(β-1，4)Glu(β-1，4)Glu(β-1，4)Glu(β-1，3)Glu)的寡聚物(表13和14)。在最高酶浓度下20小时后还生成了显著量的纤维二糖，葡萄糖和纤维三糖。用地衣酶处理样品使葡萄糖，纤维三糖，昆布二糖，尤其是纤维二糖增加。这暗示亚位点-4/-3上的葡萄糖单位之间的β-1，3键受到偏好，但亚位点-5/-4，-3/-2，和+1/+2之间的β-1，3键也是可以被接受的。该酶可以降解β-1，4和β-1，3键。

[0222]

[0223]

[0224]

[0225]

[0226]

[0227]

[0228]

[0229]

[0230]

[0231]

[0232] 实施例4.糖化和过滤性能

[0233] 将常规标准处理： 2.7mg EP/kg干物质(dm)麦芽粉(系数1,000)与实验处理：添加多种内切葡聚糖酶的 1.4mg EP/kg dm麦芽粉作比较。
0.2g /kg dm麦芽粉相当于2.7mg酶蛋白/kg dm麦芽粉。

[0234]

[0235] 与标准处理(系数1.000)相比，添加了H.insolens EG I，Cel 7b(GH 7)8mg EP/kg dm的 1.4mg EP/kg dm减少了β-葡聚糖。

[0236]

[0237] 与标准处理相比，H.insolens，内切葡聚糖酶III，(Cel 12a，GH12)加1.4mg EP/kg dm降低了β-葡聚糖，O.D和粘度，还改善了过滤性。

[0238]

[0239] 与标准处理相比，添加了橙色热子囊菌内切葡聚糖酶BG025(GH 5)的1.4mg EP/kg dm显著地降低了β-葡聚糖水平。

[0240] 将常规标准处理： 0.2g/kg DM麦芽粉(系数1.000)与实验处理：添加多种木聚糖酶的 0.1g/kg DM麦芽粉作比较。

[0241] 来自真菌Bh和Cc的两种GH11，B型木聚糖酶中的任何一种对于β-葡聚糖，OD，提取物回收率，粘度和过滤性都没有任何正作用。

[0242]

[0243]

[0244]

[0245] 与标准处理相比较，棘孢曲霉木聚糖酶I和棘孢曲霉木聚糖酶II降低了粘度并改善了过滤性。

[0246] 将常规标准处理： 0.2g/kg dm麦芽粉(系数1.000)与实验处理：添加了棘孢曲霉木聚糖酶II和多种内切葡聚糖酶的 0.1g/kg和0g/kg dm麦芽粉作
比较。

[0247]

[0248] 棘孢曲霉木聚糖酶II和棘孢曲霉内切葡聚糖EG III的联合使用对于β-葡聚糖，粘度和过滤性有着显著的作用。

[0249]

[0250] 含有 3.6mg EP/kg dm，棘孢曲霉EG III 2mg EP/kg dm，和棘孢曲霉木聚糖酶II 4mg EP/kg dm的组合物对于β-葡聚糖，粘度，提取物回收率和过滤性的正作用显著地大于相当于常规标准剂量7.5倍的剂量的 (标准剂量＝3.6mg EP/
kg dm)(表22)。

[0251] 实施例5.SDS-PAGE凝胶中蛋白质条带的定量

[0252] 将酶组合物用去离子水稀释250倍，加样到4-20％Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶上(Nu Page，Invitrogen)，按照生产商的说明进行电泳。

[0253] 电泳完毕后用GelCode Blue(Pierce)染色过夜，然后在水中脱色至背景变得清晰。

[0254] 将由此得到的凝胶用光密度仪扫描，并用Amersham Biosciences的ImageMasterTM v.10软件，按照生产商提供的标准操作规程进行分析。结果用特定泳道中总密度的％条带密度表示。

[0255] 酶样品中的总蛋白量用Pierce的Micro BCA试剂盒，按照试剂盒提供的标准操作规程进行测定。

标题	发布/更新时间	阅读量
糖化罐-专利编号CN110756093A	2020-05-11	119
糖化方法-专利编号CN101443439A	2020-05-12	445
糖化方法-专利编号CN1671833A	2020-05-13	595
糖化方法-专利编号CN105623937A	2020-05-13	81
糖化工艺-专利编号CN1918277A	2020-05-12	607
糖化方法-专利编号CN101443439B	2020-05-11	605
糖化工艺-专利编号CN102220192A	2020-05-11	106
糖化工艺-专利编号CN102220193A	2020-05-11	984
糖化方法-专利编号CN101918525A	2020-05-12	656
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