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糖化血红蛋白的测定方法及糖化血红蛋白测定装置

阅读：1072发布：2020-07-18

IPRDB可以提供糖化血红蛋白的测定方法及糖化血红蛋白测定装置专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明的目的在于，在利用阳离子交换色谱测定含有异常血红蛋白D、异常血红蛋白S或异常血红蛋白C的血液样本的情况下，排除该异常血红蛋白带来的影响，得到反映提供血液样本的受试者的症状的SA1c测定结果。本发明通过SA1c的比例(％)的测定方法来解决上述课题，该方法的特征在于，在鉴定来自异常血红蛋白D、异常血红蛋白S或异常血红蛋白C的峰的情况下，计算出该峰的面积，使用该计算结果测定校正后的SA1c的比例(％)。，下面是糖化血红蛋白的测定方法及糖化血红蛋白测定装置专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种稳定型糖化血红蛋白sA1c的测定方法，该方法包括：

(1)在使血液样本溶血后供于阳离子交换色谱，从其它血红蛋白中分离并洗脱sA1c，获得显示出各血红蛋白分级的洗脱的色谱图的工序；

(2)根据获得的色谱图鉴定sA1c的峰，对该峰面积进行计算的工序；

(3)根据获得的色谱图鉴定除sA1c以外的血红蛋白的峰，对这些峰面积进行计算的工序；以及(4)对sA1c的峰面积占总血红蛋白的峰面积的比例(％)进行计算的工序；

(5)根据在血红蛋白A的非糖化峰之后出现的峰鉴定异常血红蛋白D、异常血红蛋白S或异常血红蛋白C的非糖化峰的工序；

(6)使用鉴定后的异常血红蛋白D、异常血红蛋白S或异常血红蛋白C的非糖化峰面积等推测其糖化峰的面积的工序，其中，使用该推测计算结果对所述工序4中的sA1c的峰面积的比例(％)进行校正。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述工序5中，在鉴定异常血红蛋白D或异常血红蛋白S的峰时，在该异常血红蛋白D或异常血红蛋白S的糖化峰与血红蛋白A的非糖化峰A0重合而洗脱，且sA1c相对于与血红蛋白A相关的全部峰面积之和的比例等于该异常血红蛋白的糖化峰面积相对于其它峰面积之和的比例的前提下，校正sA1c的峰面积相对于与血红蛋白A相关的全部峰面积的比例(％)。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述工序5中，在鉴定异常血红蛋白C的峰时，在该异常血红蛋白C的糖化峰在血红蛋白A的非糖化峰A0之后洗脱的前提下，校正sA1c的峰面积相对于与血红蛋白A相关的全部峰面积的比例(％)。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在所述工序5中，在鉴定异常血红蛋白D或异常血红蛋白S的峰时，在该异常血红蛋白D或异常血红蛋白S的糖化峰与血红蛋白A的非糖化峰A0重合而洗脱、且sA1c相对于与血红蛋白A相关的全部峰面积之和的比例等于该异常血红蛋白的糖化峰面积相对于其它峰面积之和的比例的前提下，按照下式校正sA1c峰面积相对于与血红蛋白A相关的全部峰面积的比例(％)，A1c％＝100sA1c/(A0+α)＝100X1c/(X0+β+X1c)A’＝A0+X1c

X1c＝[(A’+α－sA1c)－√{(A’+α－sA1c)2－4sA1c(X0+β)}]/2式中，A’是A0和与其同时洗脱的异常血红蛋白的糖化峰面积之和，表示色谱图上观测为A0的峰面积，sA1c、A0分别表示血红蛋白A的糖化、非糖化峰面积，X1c及X0分别表示与A0同时洗脱的异常血红蛋白的糖化峰面积、在A0之后洗脱的异常血红蛋白的非糖化峰面积，而且α＝A1a+A1b+LA1c+sA1c，β为从在A0之后洗脱的峰总面积中除去X0而得到的值。

5.根据权利要求1或3所述的方法，其中，在所述工序5中，在鉴定异常血红蛋白C的峰时，在该异常血红蛋白C的糖化峰在血红蛋白A的非糖化峰A0之后洗脱的前提下，按照下式校正sA1c的峰面积相对于与血红蛋白A相关的全部峰面积的比例(％)，A1c％＝100sA1c/(A’+α)

式中，A’是色谱图上观测为A0的峰面积，sA1c、A0分别为血红蛋白A的糖化、非糖化峰面积，而且α＝A1a+A1b+LA1c+sA1c。

6.一种稳定型糖化血红蛋白sA1c的测定装置，其具备以下各机构：(1)用于导入溶血的血液样本的样本导入机构、

(2)包含具有阳离子交换能力的树脂的分离机构、

(3)用于输送液体的送液机构、

(4)用于检测从所述分离机构洗脱的血红蛋白而得到色谱图的检测机构、(5)用于分析所述检测机构检测的色谱图的分析机构，其中，所述分析机构实施以下的a)～d)：

a)用于计算色谱图中出现的峰面积的基线的设定、

b)鉴定色谱图中出现的峰来自于何种血红蛋白、

c)计算色谱图中出现的峰面积、

d)计算sA1c的峰面积占总血红蛋白的峰面积的比例(％)，

在所述b中，在鉴定异常血红蛋白D、异常血红蛋白S或异常血红蛋白C的峰时，计算该异常血红蛋白的峰的面积，使用该计算结果在所述d中对sA1c的峰面积的比例(％)进行校正，并对该校正后的sA1c的峰面积的比例(％)进行测定。

7.根据权利要求6所述的测定装置，其中，将在血红蛋白A的非糖化峰之后出现的最显著的峰鉴定为异常血红蛋白D、异常血红蛋白S或异常血红蛋白C的峰，在分析机构中实施所述分析。

8.根据权利要求6或7所述的测定装置，其中，在所述b中，在鉴定异常血红蛋白D或异常血红蛋白S的峰时，在所述d中该异常血红蛋白D或异常血红蛋白S的糖化峰与血红蛋白A的非糖化峰A0重合而洗脱，且sA1c峰面积相对于与血红蛋白A相关的全部峰面积之和的比例等于该异常血红蛋白的糖化峰面积相对于其它峰面积之和的比例的前提下，校正sA1c的峰面积的比例(％)。

9.根据权利要求6或7所述的测定装置，其中，在所述b中，在鉴定异常血红蛋白C的峰时，在所述d中该异常血红蛋白C的糖化峰在血红蛋白A的非糖化峰A0之后洗脱的前提下，校正sA1c的峰面积的比例(％)。

说明书全文

糖化血红蛋白的测定方法及糖化血红蛋白测定装置

技术领域

[0001] 本发明涉及通过液相色谱法测定血液样本中的糖化血红蛋白的方法和装置，具体涉及对于可能混合存在含有异常血红蛋白的血液样本的血液样本组能够实施作为糖尿病诊断指标的糖化血红蛋白的测定的糖化血红蛋白的测定方法和测定装置。

背景技术

[0002] 血红蛋白具有由2个α链及2个β链构成的α2β2结构，除了占总血红蛋白约97％的血红蛋白A以外，由血红蛋白F、血红蛋白A2构成，所述血红蛋白F具有由2个α链及2个γ链构成的α2γ2结构、且占总血红蛋白的不足1％，所述血红蛋白A2具有由2个α链及2个δ链构成的α2δ2结构、且占总血红蛋白的不足1％。

[0003] 血红蛋白与存在于血中的糖(血糖)、其代谢物非酶促地结合(糖化)而形成糖化血红蛋白。占总血红蛋白的大半的血红蛋白A糖化而成的血红蛋白A1严格来说并不是糖化血红蛋白的全部，但在临床上多作为与糖化血红蛋白相同含义处理。血红蛋白A1可以进一步分离为A1a、A1b、A1c，不受饮食等引起的临时性血糖值上升的影响、反映过去2～3个月的血糖值变化而使浓度发生变化的、所谓的稳定型的血红蛋白A1c(以下，有时简称为“sA1c”)相对于总血红蛋白的比例(以下，有时简称为“A1c％”)被广泛用作糖尿病的诊断、糖尿病患者的随访指标。

[0004] 糖化血红蛋白的测定以往通过液相色谱法的方法来实施。对于利用液相色谱法进行的糖化血红蛋白的测定而言，大致分为以下方法：使用固定有离子交换物质的填充材料，利用电荷不同将各种血红蛋白分级进行测定的利用阳离子交换色谱的测定方法；使用固定有对糖的亲和性高的氨基苯硼酸基的填充材料的基于亲和色谱的测定方法。基于亲和色谱的测定方法利用对于糖链部分的亲和性，因此可测定包含sA1c的各种糖化血红蛋白(非专利文献2)，在该情况下也利用糖化血红蛋白相对于总血红蛋白的比例。另一方面，在基于阳离子交换色谱的测定方法中，可以在分离各种血红蛋白的基础上，仅测定sA1c来计算相对于总血红蛋白的比例A1c％。

[0005] 血红蛋白中也存在因血红蛋白基因发生突变而产生的血红蛋白E、血红蛋白D、血红蛋白S、血红蛋白C等各种异常血红蛋白。而且，近年来报告了以下情况(非专利文献1～3)：虽然稀少，但在应实施糖化血红蛋白测定的血液样本含有上述基因突变的结果产生的各种异常血红蛋白的情况下，在基于亲和色谱的测定方法中，可以得到反映提供血液样本的受试者的症状的测定结果，另一方面，在基于阳离子色谱的测定方法中，sA1c％测定值显示出很低的值，有时难以反映提供血液样本的受试者的症状。

[0006] 现有技术文献

[0007] 专利文献

[0008] 专利文献1：日本特开平9-264889号公报

[0009] 非专利文献

[0010] 非专利文献1：R.R.Little and W.L.Roberts,J Diabetes Sci Technol,Vol 3(3),446-451(2009).

[0011] 非专利文献2：R.R.Little et al.,Clin Chem,Vol 54(8),1277-1282(2008).[0012] 非专利文献3：L.Bry et al.,Clin Chem,Vol 47(2),153-163(2001).发明内容

[0013] 发明要解决的课题

[0014] 在应实施测定的血液样本含有异常血红蛋白D、异常血红蛋白S或异常血红蛋白C的情况下，通过阳离子交换色谱法实施sA1c的测定时，这些异常血红蛋白成分的一部分与血红蛋白A的非糖化成分A0同时或在其后洗脱。在该情况下，即使将与其对应的显著峰值从A1c％的计算中排除，A1c％也显示出很低的值，另一方面可以认为，在基于亲和色谱的糖化血红蛋白的测定中，糖化血红蛋白占总血红蛋白的值不受影响。因此，本发明在于，在通过阳离子交换色谱对含有已知全世界保有者很多的异常血红蛋白D、异常血红蛋白S或异常血红蛋白C的血液样本进行测定的情况下，排除这些异常血红蛋白带来的影响，得到反映提供血液样本的受试者的症状的A1c％测定结果。解决课题的方法

[0015] 本发明人等发现，将含有异常血红蛋白D、异常血红蛋白S或异常血红蛋白C的血液样本供于阳离子交换色谱而获得色谱图，进行分析，结果是出现了健康人的色谱图中没有的峰。进一步发现，对基于该峰的面积而校正的A1c％进行计算时，该校正的结果与通过不容易受到异常血红蛋白D、异常血红蛋白S或异常血红蛋白C的影响的亲和色谱得到的测定结果良好相关，从而完成了本发明。

[0016] 即，本发明是为了解决上述课题而进行深入研究，从而完成的。

[0017] [1]一种稳定型糖化血红蛋白sA1c的测定方法，该方法包括：

[0018] (1)在使血液样本溶血后供于阳离子交换色谱，从其它血红蛋白中分离并洗脱sA1c，获得显示出各血红蛋白分级的洗脱的色谱图的工序；

[0019] (2)根据获得的色谱图鉴定sA1c的峰，对该峰面积进行计算的工序；

[0020] (3)根据获得的色谱图鉴定除sA1c以外的血红蛋白的峰，对这些峰面积进行计算的工序；以及

[0021] (4)对sA1c的峰面积占总血红蛋白的峰面积的比例(％)进行计算的工序；

[0022] (5)根据在血红蛋白A的非糖化峰之后出现的峰鉴定异常血红蛋白D、异常血红蛋白S或异常血红蛋白C的非糖化峰的工序；

[0023] (6)使用鉴定后的异常血红蛋白D、异常血红蛋白S或异常血红蛋白C的非糖化峰面积等推测其糖化峰的面积的工序，其中，

[0024] 使用该推测计算结果对所述工序4中的sA1c的峰面积的比例(％)进行校正。

[0025] [2]根据[1]中记载的方法，其中，在所述工序5中，在鉴定异常血红蛋白D或异常血红蛋白S的峰时，在该异常血红蛋白D或异常血红蛋白S的糖化峰与血红蛋白A的非糖化峰A0重合而洗脱，且sA1c相对于与血红蛋白A相关的全部峰面积之和的比例等于该异常血红蛋白的糖化峰面积相对于其它峰面积之和的比例的前提下，校正sA1c的峰面积相对于与血红蛋白A相关的全部峰面积的比例(％)。

[0026] [3]根据[1]中记载的方法，其中，在所述工序5中，在鉴定异常血红蛋白C的峰时，在该异常血红蛋白C的糖化峰在血红蛋白A的非糖化峰A0之后洗脱的前提下，校正sA1c的峰面积相对于与血红蛋白A相关的全部峰面积的比例(％)。

[0027] [4]根据[1]或[2]中记载的方法，其中，在所述工序5中，在鉴定异常血红蛋白D或异常血红蛋白S的峰时，在该异常血红蛋白D或异常血红蛋白S的糖化峰与血红蛋白A的非糖化峰A0重合而洗脱，且sA1c相对于与血红蛋白A相关的全部峰面积之和的比例等于该异常血红蛋白的糖化峰面积相对于其它峰面积之和的比例的前提下，按照下式校正sA1c峰面积相对于与血红蛋白A相关的全部峰面积的比例(％)。

[0028] [数学式1]

[0029] A1c％＝100sA1c/(A0+α)＝100X1c/(X0+β+X1c)

[0030] A’＝A0+X1c

[0031] X1c＝[(A’+α－sA1c)－√{(A’+α－sA1c)2－4sA1c(X0+β)}]/2

[0032] 这里，A’是A0和与其同时洗脱的异常血红蛋白的糖化峰面积之和，表示色谱图上观测为A0的峰面积，sA1c、A0分别表示血红蛋白A的糖化、非糖化峰面积，X1c及X0分别表示与A0同时洗脱的异常血红蛋白的糖化峰面积、在A0之后洗脱的异常血红蛋白的非糖化峰面积，而且α＝A1a+A1b+LA1c+sA1c，β为从在A0之后洗脱的峰总面积中除去X0而得到的值。

[0033] [5]根据[1]或[3]所述的方法，其中，在所述工序5中，在鉴定异常血红蛋白C的峰时，在该异常血红蛋白C的糖化峰在血红蛋白A的非糖化峰A0之后洗脱的前提下，按照下式校正sA1c的峰面积相对于与血红蛋白A相关的全部峰面积的比例(％)。

[0034] [数学式2]

[0035] A1c％＝100sA1c/(A’+α)

[0036] 这里，A’是色谱图上观测为A0的峰面积。sA1c、A0分别为血红蛋白A的糖化、非糖化峰面积，而且α＝A1a+A1b+LA1c+sA1c。

[0037] [6]一种稳定型糖化血红蛋白sA1c的测定装置，其具备以下各机构：

[0038] (1)用于导入溶血的血液样本的样本导入机构、

[0039] (2)包含具有阳离子交换能力的树脂的分离机构、

[0040] (3)用于输送液体的送液机构、

[0041] (4)用于检测从所述分离机构洗脱的血红蛋白而得到色谱图的检测机构、[0042] (5)用于分析所述检测机构检测的色谱图的分析机构，其中，

[0043] 所述分析机构实施以下的a)～d)：

[0044] a)用于计算色谱图中出现的峰面积的基线的设定、

[0045] b)鉴定色谱图中出现的峰来自于何种血红蛋白、

[0046] c)计算色谱图中出现的峰面积、

[0047] d)计算sA1c的峰面积占总血红蛋白的峰面积的比例(％)，

[0048] 在所述b中，在鉴定异常血红蛋白D、异常血红蛋白S或异常血红蛋白C的峰时，计算该异常血红蛋白的峰的面积，使用该计算结果在所述d中对sA1c的峰面积的比例(％)进行校正，并对该校正后的sA1c的峰面积的比例(％)进行测定。

[0049] [7]根据[6]中记载的测定装置，其中，将在血红蛋白A的非糖化峰之后出现的最显著的峰鉴定为异常血红蛋白D、异常血红蛋白S或异常血红蛋白C的峰，在分析机构中实施所述分析。

[0050] [8]根据[6]或[7]中记载的测定装置，其中，在所述b中，在鉴定异常血红蛋白D或异常血红蛋白S的峰时，在所述d中该异常血红蛋白D或异常血红蛋白S的糖化峰与血红蛋白A的非糖化峰A0重合而洗脱，且sA1c峰面积相对于与血红蛋白A相关的全部峰面积之和的比例等于该异常血红蛋白的糖化峰面积相对于其它峰面积之和的比例的前提下，校正sA1c的峰面积的比例(％)。

[0051] [9]根据[6]或[7]中记载的测定装置，其中，在所述b中，在鉴定异常血红蛋白C的峰时，在所述d中该异常血红蛋白C的糖化峰在血红蛋白A的非糖化峰A0之后洗脱的前提下，校正sA1c的峰面积的比例(％)。

[0052] 以下，对本发明详细地进行说明。在后述的实施例所示的条件下，将含有异常血红蛋白D、异常血红蛋白S及异常血红蛋白C的血液样本供于阳离子交换色谱时，可以分别得到图5、图6及图7那样的色谱图。将该色谱图与将健康人的血液样本供于阳离子色谱而得到的色谱图(图4)相比，在非糖化的血红蛋白A的峰(A0)之后出现与各异常血红蛋白相对应的显著的峰(H-V0、H-V1及H-V2)。

[0053] 另外，在本发明中，H-V0、H-V1及H-V2是指，在色谱图上除了通过洗脱液的组成及其流速而设定了其鉴定洗脱时间的血红蛋白A以外的显著的峰。可以推测这些H-V0、H-V1及H-V2的峰为来自于各异常血红蛋白的非糖化峰，而且可以推测各异常血红蛋白的糖化峰与A0同时洗脱。

[0054] 因此，在本发明中发现，对于被认为来自异常血红蛋白的与A0同时洗脱的峰面积、即与A0同时洗脱的糖化异常血红蛋白峰的面积相对于在包含异常血红蛋白的显著的非糖化峰(H-V0、H-V1或H-V2)的被认为来自于异常血红蛋白的A0之后洗脱的峰面积的比例，在基于以下的假设测定该异常血红蛋白检体时，可以进行与血红蛋白A相关的A1c％的校正。

[0055] 本发明的特征在于，基于与血红蛋白A相关的糖化峰sA1c相对于来自包含A0的血红蛋白A的A1a、A1b、LA1c和sA1c之和的比例在异常血红蛋白的情况下也相同的假设，对A1c％进行校正。具体而言，为了解决与A0同时洗脱的异常血红蛋白的糖化峰在色谱图上无法分离的课题，按照上述假设，可以通过满足式(1)和式(2)的式(3)推测X1c及A0，根据式(1)的100sA1c/(A0+α)计算出经过校正的A1c％，从而实现上述课题。

[0056] A1c％＝100sA1c/(A0+α)＝100X1c/(X0+β+X1c)式(1)

[0057] A’＝A0+X1c式(2)

[0058] X1c＝[(A’+α－sA1c)－√{(A’+α－sA1c)2－4sA1c(X0+β)}]/2式(3)[0059] 这里，A’是指A0和与其同时洗脱的异常血红蛋白的糖化峰面积之和。A0和与其同时洗脱的异常血红蛋白的糖化峰在色谱图上无法分离，以其和的形式被观测到。sA1c、A0分别表示血红蛋白A的糖化、非糖化峰面积，X1c及X0分别表示与A0同时洗脱的异常血红蛋白的糖化峰面积、在A0之后洗脱的异常血红蛋白的非糖化峰面积。另外，α＝A1a+A1b+LA1c+sA1c，β为从在A0之后洗脱的峰总面积中除去X0而得到的值。

[0060] 需要说明的是，作为异常血红蛋白，在检测出H-V2峰、即异常血红蛋白C时，其糖化峰也很可能在A0之后洗脱，因此无法应用式(2)的假设，校正A1c％可以通过在式(1)中A0＝A’时计算式(4)来实现上述课题。

[0061] A1c％＝100sA1c/(A’+α)式(4)

[0062] 另外，通过使用本发明，如果能够使用上述式计算出异常血红蛋白糖化峰相对于被认为来自于异常血红蛋白的在A0之后洗脱的峰面积、即异常血红蛋白的显著的非糖化峰(H-V0、H-V1或H-V2)和与A0同时洗脱的异常血红蛋白糖化峰之和的比例，则即使异常血红蛋白为异常血红蛋白D、异常血红蛋白S、异常血红蛋白C以外，也可以计算。

[0063] 本发明的测定方法可以通过自动化的测定装置而容易地实施，可以示例出由以下各机构构成的装置：(1)用于导入溶血的血液样本的样本导入机构、(2)包含具有阳离子交换能力的树脂的分离机构、(3)用于输送液体的送液机构、(4)用于检测从上述分离机构洗脱的血红蛋白而得到色谱图的检测机构、(5)用于分析上述检测机构检测出的色谱图的分析机构。另外，本发明涉及使电脑运行上述(1)～(5)的机构的稳定型糖化血红蛋白sA1c的测定程序。

[0064] 上述(1)的样本导入机构用于将一定量的血液样本导入后述的分离机构，使用市售的自动进样器，可以使用六通阀等构成。需要说明的是，sA1c的测定使用溶血的血液样本，可以通过样本导入机构实施溶血操作，也可以将实施溶血操作后的血液样本供于样本导入机构。溶血可以通过将含有血球成分的血液样本添加于高渗溶液等来进行。

[0065] 上述(2)的包含具有阳离子交换能力的树脂的分离机构可以使用填充有键合了砜类等的、所谓的阳离子交换色谱用的修饰基团的树脂的柱等。作为阳离子交换色谱用的树脂，可以示例出例如非多孔性阳离子交换体等，另外，作为填充所述树脂的柱，可以示例出例如东曹株式会社制造的非多孔性阳离子交换体柱TSKgel(注册商标)SP-NPR等。

[0066] 上述(3)的用于输送液体的送液机构用于将洗脱液输送至分离机构，所述洗脱液用于洗脱从样本导入机构导入的血液样本、血红蛋白，可以示例出泵。需要说明的是，作为洗脱液，可以使用现有的各种洗脱液，例如可以装备利用盐浓度不同的3种洗脱液用于进行梯度洗脱的混合器等。

[0067] 上述(4)的用于检测从分离机构洗脱的血红蛋白而得到色谱图的检测机构只要能够检测出血红蛋白即可，没有限制，可以示例出例如能够基于415nm的吸光度检测出作为蛋白质的血红蛋白的洗脱的吸光检测器、电导率检测器等。

[0068] 上述(5)的分析机构是用于分析检测机构检测的色谱图的机构，本发明的测定装置的特征在于该分析机构。该分析机构首先进行用于计算色谱图中出现的峰面积的基线设定。虽然提出了各种基线的设定方法(例如参照专利文献1)，但没有特别限制。在基线的设定之后，对于色谱图中出现的峰来自何种血红蛋白进行了鉴定。为了进行该鉴定，可以在装置中设置存储各血红蛋白的预想的洗脱时间的存储机构，以根据洗脱时间进行鉴定的方式构成。需要说明的是，基线的设定与峰鉴定也可以顺序颠倒。由此，在进行了对色谱图中出现的各峰面积的计算后，求出用sA1c的峰面积除以总血红蛋白的峰面积之和而得到的比例(％)，在峰鉴定时，异常血红蛋白D、异常血红蛋白S所对应的峰分别被鉴定为H-V0、H-V1时，预先计算出色谱图的全部峰面积总计(Total area)及A1a、A1b、HbF、LA1c、sA1c、A’、H-V0或H-V1的各峰面积，通过式(3)确定X1c面积，或者通过式(2)确定A0面积，通过式(1)计算出A1c％。

[0069] 需要说明的是，在峰鉴定时，异常血红蛋白C所对应的峰被鉴定为H-V2时，预先计算出A1a、A1b，HbF、LA1c、sA1c、A’、H-V2的各峰面积，通过式(4)计算出A1c％。此时，对于式(4)的分母而言，可以预先计算Total area、X0及β的各峰面积，用Total area-X0-β-HbF进行计算。

[0070] 上述分析机构只要能够对检测机构所检测的色谱图实施上述的分析即可，没有限制，例如，可以通过在具备处理器的电脑中安装用于上述分析的程序而构成。所述电脑可以是整体不可分割地安装于本发明的装置中的形式，也可以是所谓的外置的形式。

[0071] 基于图11对本发明的测定装置进行更具体的说明。导入样本导入机构11的溶血的血液样本被送至分离机构13，另外，洗脱液通过送液机构12被送至分离机构13，由此将血红蛋白类分级而洗脱。洗脱后的血红蛋白通过检测机构14进行检测，得到色谱图，得到的色谱图利用分析机构15进行分析。分析机构15包含基线设定模块16、峰鉴定模块17、峰面积计算模块18、以及sA1c比例计算模块19，首先，基线设定模块16进行用于计算色谱图中出现的峰面积的基线设定。

[0072] 接着，峰鉴定模块17对色谱图中出现的峰来自何种血红蛋白进行鉴定。这里，峰鉴定模块17例如可以通过对预先存储于存储机构的不含有异常血红蛋白D、异常血红蛋白S及异常血红蛋白C的血液样本的色谱图与由检测机构14得到的色谱图进行比较，分别判定有无来自异常血红蛋白D、S、C的峰(H-V0、H-V1、H-V2)。作为其它鉴定方法，可以示例出例如：将从含有异常血红蛋白D、S或C的血液样本的色谱图得到的来自异常血红蛋白的峰的洗脱时间预先存储于存储机构，判断是否出现与色谱图上的该时间符合的峰，在出现了峰的情况下，将该峰鉴定为来自异常血红蛋白D、S或C的峰(H-V0、H-V1、H-V2)。接着，峰面积计算模块18计算出各血红蛋白类的峰面积。

[0073] 最后，sA1c比例计算模块19求出sA1c的峰面积相对于总血红蛋白的峰面积之和的比例(％)、A1c％。这里，在峰鉴定模块17鉴定到来自异常血红蛋白D、S或C的峰的情况下，sA1c比例计算模块19对作为本发明的特征的A1c％进行校正。当然，在峰鉴定模块17未鉴定到来自异常血红蛋白D、S或C的情况下，A1c％计算模块19不对A1c％进行校正而计算A1c％。具体而言，在峰鉴定模块17判断存在H-V0或H-V1时，预先计算色谱图的全部峰面积总计(Total area)及A1a、A1b、HbF、LA1c、sA1c、A’、H-V0或H-V1的各峰面积，通过式(3)得到X1c面积，通过式(2)确定A0面积，通过式(1)计算出A1c％。另一方面，在峰鉴定模块17判断存在H-V2时，计算出A1a、A1b、HbF、LA1c、sA1c、A’、H-V2的各峰面积，通过式(4)计算出A1c％。或者计算出Total area、X0、β及HbF的各峰面积，通过Total area-X0-β-HbF计算出式(4)的分母，计算出A1c％。

[0074] 对于如上所述计算得到的A1c％，进一步使用National Glycohemoglobin Sandardization Program(NGSP)、国际临床化学联合会(IFCC)、日本糖尿病学会(JDS)等各学会所确定的标准品进行校准，进行校正，由此计算作为用于实施按照该学会所确定的基准的诊断等的指标A1c％，另外，可以排除异常血红蛋白D、S及C所带来的影响，实现与基于亲和色谱的测定结果的良好的相关性。由此，通过分析机构15分析得到的结果可以经由输出机构20来显示或打印。本发明也涉及使电脑运行分析机构内的各模块的稳定型糖化血红蛋白sA1c的测定程序。

[0075] 图12是根据硬件结构对分析机构15进行说明的图。分析机构15具备处理器21、存储器22、输出接口23、辅助存储机构24、输入接口25、输入机构26等。处理器21通过运行辅助存储机构24中记载的程序，从而进行用于实现上述的分析机构15所起到的作用的处理。存储器22中存储处理器21正在运行的程序、由该程序临时使用的数据。存储器22可以包括只读存储器(ROM)、随机存取存储器(RAM)。上述21～26通过数据总线27而电连接。输出接口23是将色谱图、计算得到的sA1c的比例(％)输出至监视器、打印机等输出机构的接口电路。输入接口25是输入从检测机构输出的色谱图的接口电路。输入机构26用于接受用户的操作输入，为了装置的启动、结束、输入与血液样本相关的信息等，具备键盘等通常的输入设备。各机构通过总线而电连接。

[0076] 在本发明的测定装置中装备上述示例的监视器、打印机等显示机构的情况下，在鉴定到来自异常血红蛋白D、S、C的峰(分别为H-V0、H-V1、H-V2)时，可以将该情况显示于这些显示机构，以便引起注意。另外，也可以示例出以将与鉴定到H-V0、H-V1或H-V2的血液样本相关的测定结果(A1c％)和应用了本发明的情况一起显示的方式构成的装置。

[0077] 发明的效果

[0078] 虽然报告了在应实施测定的血液样本含有异常血红蛋白D、异常血红蛋白S或异常血红蛋白C的情况下，在通过阳离子交换色谱实施sA1c的测定时，即使将来自异常血红蛋白D、异常血红蛋白S或异常血红蛋白C的显著的峰排除而计算，sA1c占总血红蛋白的值也显示出低值，但根据本发明，可以排除异常血红蛋白D、异常血红蛋白S或异常血红蛋白C所带来的影响，实现与报告为不容易受到这些异常血红蛋白的影响的亲和色谱的测定结果的良好相关，得到反映提供血液样本的受试者的症状的A1c％的测定结果。

附图说明

[0079] 图1是示出对于含有异常血红蛋白D的血液样本和不含异常血红蛋白D的血液样本、利用亲和色谱法得到的测定结果与利用阳离子交换色谱法得到的测定结果的相关性的图。

[0080] 图2是示出对于含有异常血红蛋白S的血液样本和不含异常血红蛋白S的血液样本、利用亲和色谱法得到的测定结果与利用阳离子交换色谱法得到的测定结果的相关性的图。

[0081] 图3是示出对于含有异常血红蛋白C的血液样本和不含异常血红蛋白C的血液样本、利用亲和色谱法得到的测定结果与利用阳离子交换色谱法得到的测定结果的相关性的图。

[0082] 图4是示出对于不含异常血红蛋白D、异常血红蛋白S及异常血红蛋白C的血液样本、通过阳离子交换色谱法得到的色谱图。

[0083] 图5是对于含有异常血红蛋白D的血液样本通过阳离子交换色谱法得到的色谱图。

[0084] 图6是对于含有异常血红蛋白S的血液样本通过阳离子交换色谱法得到的色谱图。

[0085] 图7是对于含有异常血红蛋白C的血液样本通过阳离子交换色谱法得到的色谱图。

[0086] 图8是示出对于含有异常血红蛋白D的血液样本和不含异常血红蛋白D的血液样本、利用亲和色谱法得到的测定结果与通过本发明的方法得到的测定结果的相关性的图，所述本发明的方法基于以异常血红蛋白D所对应的显著的峰(H-V0)面积、其它色谱图上的峰面积信息为基础校正A1c％。

[0087] 图9是示出对于含有异常血红蛋白S的血液样本和不含异常血红蛋白S的血液样本、利用亲和色谱法得到的测定结果与通过本发明的方法得到的测定结果的相关性的图，所述本发明的方法基于以异常血红蛋白S所对应的显著的峰(H-V1)面积、其它色谱图上的峰面积信息为基础校正A1c％。

[0088] 图10是示出对于含有异常血红蛋白C的血液样本和不含异常血红蛋白C的血液样本、利用亲和色谱法得到的测定结果与通过本发明的方法得到的测定结果的相关性的图，所述本发明的方法基于以异常血红蛋白C所对应的显著的峰(H-V2)面积、其它色谱图上的峰面积信息为基础校正A1c％。

[0089] 图11是用于说明本发明的测定装置的图。

[0090] 图12是用于说明本发明的测定装置的图。

[0091] 符号说明

[0092] 1 阳离子交换色谱装置

[0093] 11 样本导入机构

[0094] 12 送液机构

[0095] 13 分离机构

[0096] 14 检测机构

[0097] 15 分析机构

[0098] 16 基线设定模块

[0099] 17 峰鉴定模块

[0100] 18 峰面积计算模块

[0101] 19 sA1c比例计算模块

[0102] 20 输出机构

具体实施方式

[0103] 图1、图2及图3是分别示出对于含有异常血红蛋白D、异常血红蛋白S及异常血红蛋白C的血液样本(分别为38、33及53种)和不含这些异常血红蛋白的血液样本(22种、空心)、利用亲和色谱法得到的测定结果与利用阳离子交换色谱法得到的测定结果的相关性的图。需要说明的是，对于前者，通过市售的装置(Sebia公司、Capillarys2)确认了含有异常血红蛋白D、异常血红蛋白S及异常血红蛋白C。

[0104] 基于亲和色谱法的测定利用市售的装置(Trinity Biotech公司、Ultra2)，基于阳离子色谱法的测定是使用了装备有非多孔性阳离子交换体柱的东曹株式会社制造的自动糖化血红蛋白分析仪器HLC-723G8(商品名)的阳离子交换色谱所得到的测定结果。

[0105] 图1、图2及图3的纵轴表示利用阳离子交换色谱得到的测定结果，横轴表示利用亲和色谱法得到的测定结果，所有结果均为sA1c占总血红蛋白的比例(％)，均是使用专用试剂校准装置后，将从装置输出的测定结果之间绘制而成的。

[0106] 可知，对于不含异常血红蛋白的血液样本(22种、空心)而言，亲和色谱法的结果与阳离子交换色谱法的结果显示出良好的相关性，对于含有异常血红蛋白D、异常血红蛋白S或异常血红蛋白C的血液样本(分别为38、33及53种、均涂黑)而言，阳离子交换色谱法的结果与亲和色谱法的结果相比显示出低值。

[0107] 图4是将健康人的血液样本供于阳离子交换色谱测定而得到的色谱图的例子。对于健康人的血液样本而言，在血红蛋白A的峰(A0)之后未出现来自其它成分的显著的峰。另一方面，图5、图6及图7分别是将含有异常血红蛋白D、异常血红蛋白S及异常血红蛋白C的受试者的血液样本供于阳离子交换色谱测定而得到的色谱图的例子。根据这些图5、图6及图7可知，对于含有异常血红蛋白D、异常血红蛋白S及异常血红蛋白C的血液样本而言，在血红蛋白A的(A0)之后出现在图4中未观察到的来自这些异常血红蛋白的显著的峰(分别为H-V0、H-V1及H-V2)。

[0108] 由此，来自异常血红蛋白D、异常血红蛋白S及异常血红蛋白C的峰(分别为H-V0、H-V1及H-V2)可以通过与不含这些异常血红蛋白的样本的色谱图进行比较来鉴定。因此，如果预先存储了在给定的条件下H-V0、H-V1及H-V2出现的洗脱时间(在附图的例子中，分别为1.0分钟、1.2分钟、1.3分钟)，则只要在相同条件下实施sA1c的测定，就可以根据洗脱时间鉴定来自异常血红蛋白D、异常血红蛋白S或异常血红蛋白C的峰。

[0109] 实施例

[0110] 实施例1

[0111] 对于含有异常血红蛋白D的血液样本，实施了本发明的下述方法：在通过阳离子交换色谱法得到的色谱图(图5)中，计算出色谱图的全部峰面积总计(Total area)及A1a、A1b、HbF、LA1c、sA1c、A’、H-V0的各峰面积，根据式(3)得到X1c面积，根据式(2)确定A0面积，根据式(1)计算出A1c％。需要说明的是，H-V0的峰检测范围为1.00±0.07分钟。

[0112] (1)A’的峰面积

[0113] 根据色谱图计算出A’的峰面积为921.2。

[0114] (2)α的峰面积

[0115] 根据色谱图计算出α的峰面积为8.0+6.7+38.1+63.9＝116.7。

[0116] (3)sA1c的峰面积

[0117] 根据色谱图计算出sA1c的峰面积为63.9。

[0118] (4)X0的峰面积

[0119] 根据色谱图计算出X0＝H-V0的峰面积为576.7。

[0120] (5)β的峰面积

[0121] 使用Total area，关于峰面积，可以用Total area-HbF-α-A’-X0进行计算，因此根据色谱图计算出β的峰面积为1645.2-12.6-116.7-921.2-576.7＝18.0。

[0122] (6)X1c的计算

[0123] 将上述的数值代入式(3)，计算出X1c＝40.7。

[0124] (7)A0的计算

[0125] 将以上得到的X1c的值代入式(2)，计算出A0＝880.5。

[0126] (8)A1c％的计算

[0127] 将上述得到的数值代入式(1)，计算出A1c％＝6.4％。

[0128] (9)换算为NGSP值(换算因子1.1151、0.6558)

[0129] NGSP值换算值(％)＝6.4×1.1151+0.6558＝7.8(％)

[0130] 实施例2

[0131] 对于含有异常血红蛋白S的血液样本，实施了本发明的下述方法：在通过阳离子交换色谱法得到的色谱图(图6)中，计算出色谱图的全部峰面积总计(Total area)及A1a、A1b、HbF、LA1c、sA1c、A’、H-V1的各峰面积，根据式(3)得到X1c面积，根据式(2)确定A0面积，根据式(1)计算出A1c％。需要说明的是，H-V1的峰检测范围为1.16±0.09分钟。

[0132] (1)A’的峰面积

[0133] 根据色谱图计算出A’的峰面积为899.0。

[0134] (2)α的峰面积

[0135] 根据色谱图计算出α的峰面积为11.8+7.8+31.4+78.6＝129.6。

[0136] (3)sA1c的峰面积

[0137] 根据色谱图计算出sA1c的峰面积为78.6。

[0138] (4)X0的峰面积

[0139] 根据色谱图计算出X0＝H-V1的峰面积为573.6。

[0140] (5)β的峰面积

[0141] 使用Total area，关于峰面积，可以用Total area-HbF-α-A’-X0进行计算，因此根据色谱图计算出β的峰面积为1619.0-10.5-129.6-899.0-573.6＝6.3。

[0142] (6)X1c的计算

[0143] 将上述的数值代入式(3)，计算出X1c＝50.7。

[0144] (7)A0的计算

[0145] 将以上得到的X1c的值代入式(2)，计算出A0＝848.3。

[0146] (8)A1c％的计算

[0147] 将上述得到的数值代入式(1)，计算出A1c％＝8.0％。

[0148] (9)换算为NGSP值(换算因子1.1151、0.6558)

[0149] NGSP值换算值(％)＝8.0×1.1151+0.6558＝9.6(％)

[0150] 实施例3

[0151] 对于含有异常血红蛋白C的血液样本，实施了本发明的下述方法：在通过阳离子交换色谱法得到的色谱图(图7)中，计算出A1a、A1b，LA1c、sA1c、A0的各峰面积，根据式(4)计算出A1c％。需要说明的是，H-V2的峰检测范围为1.34±0.09分钟。

[0152] (1)A0的峰面积

[0153] 根据色谱图计算出A0的峰面积为1140.3。

[0154] (2)α的峰面积

[0155] 根据色谱图计算出α的峰面积为10.8+11.8+34.8+89.9＝147.3。

[0156] (3)sA1c的峰面积

[0157] 根据色谱图计算出sA1c的峰面积为89.9。

[0158] (8)A1c％的计算

[0159] 将上述得到的数值代入式(4)，计算出A1c％＝6.7％。

[0160] (9)换算为NGSP值(换算因子1.1151、0.6558)

[0161] NGSP值换算值(％)＝6.7×1.1151+0.6558＝8.1(％)

[0162] 实施例4

[0163] 对于图5、6、7所示的将含有异常血红蛋白D、S及C的血液样本供于利用阳离子色谱法进行测定而得到的色谱图，将应用了实施例1、2、3中所示的本发明的结果分别示出图8、9及10。如这些附图所示，应用了本发明的结果是，与利用亲和色谱法得到的测定结果的差异得到改善，相关系数的斜率与图1、2、3的情况相比，分别从0.8841改善为0.9731，从0.8767改善为0.9732，以及从0.8919改善为1.018。

[0164] 另外，虽然参照特定的实施方式对本发明进行了详细说明，但对于本领域技术人员而言，可以在不脱离本发明的本质和范围的情况下实施各种变更、修正是显而易见的。

[0165] 需要说明的是，将2016年5月11日申请的日本专利申请2016-095191号的说明书、权利要求书、附图及说明书摘要的全部内容引用于此，并引入作为本发明的说明书的公开内容。

标题	发布/更新时间	阅读量
糖化罐-专利编号CN110756093A	2020-05-11	118
糖化方法-专利编号CN101443439A	2020-05-12	444
糖化方法-专利编号CN1671833A	2020-05-13	594
糖化方法-专利编号CN105623937A	2020-05-13	81
糖化工艺-专利编号CN1918277A	2020-05-12	607
糖化方法-专利编号CN101443439B	2020-05-11	605
糖化工艺-专利编号CN102220192A	2020-05-11	105
糖化工艺-专利编号CN102220193A	2020-05-11	984
糖化方法-专利编号CN101918525A	2020-05-12	655
糖化床-专利编号CN108455233A	2020-05-13	396

糖化血红蛋白的测定方法及糖化血红蛋白测定装置

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