酿造中经常使用酶。WO 97/42302中描述了在糖化中应用酶来改善醪液 (mash)的过滤性和提高提取物收率。但是，糖化和过滤步骤的优化，以及改 进的用于糖化和过滤步骤的酶组合物，仍然是人们所需要的。
发明概述
本发明提供一种可提高醪液(mash)的过滤性和/或过滤后提取物收率 (extract yield)的醪液生产工艺，其包括：在酶活性的存在下制备醪液并过滤 醪液而得到麦芽汁，其中酶活性包括葡糖苷水解酶(glucoside hydrolase) 10家族的木聚糖酶，该酶的量占总木聚糖酶和内切葡聚糖酶酶蛋白的15％ w/w。
本发明进一步提供一种降低含有淀粉水解物的水溶液的粘度的工艺，其 包括：检测至少一种木聚糖分解酶的针对不溶性小麦阿拉伯木聚糖的水解 活性，选择在紧邻着分枝残基处切割而形成末端取代的寡聚木糖的木聚糖 分解酶，并将所选择的木聚糖分解酶加入到含有淀粉水解物的水溶液中。
本发明进一步提供一种降低含有淀粉水解物的水溶液的粘度的工艺，其 包括：检测至少一种内切葡聚糖分解酶的针对大麦β-葡聚糖的水解活性， 选择在10μg/ml纯化的酶及5mg/ml大麦β-葡聚糖，于50mM乙酸钠及 0.01％ Triton X-100中，pH 5.5，50℃的条件下，在1小时内能将70％的大 麦β-葡聚糖降解到DP6或DP＜6的内切葡聚糖分解酶，并将选择到的内切 葡聚糖分解酶加入含有淀粉水解物的水溶液中。
本发明进一步提供一种组合物，其包含：占总酶蛋白的至少15％w/w 的GH10木聚糖酶，和/或，占总酶蛋白的至少40％w/w的GH12，GH7， 和/或GH5内切葡聚糖酶。
本发明的其他方面前述的组合物在包括降低含有淀粉水解物的水溶液 的粘度的工艺中的应用。在某些如上述的工艺中，所述含有淀粉水解物的 水溶液是制造啤酒所用的醪液，或者其用于饲料组合物中。
发明详述
定义
本公开自始至终使用了多种为本领域的普通技术人员所公知的术语，但 还使用了某些具有特定意义的术语，其定义如下：
此处“麦芽粉”(grist)理解为含有淀粉或糖，作为啤酒生产的基础的 材料，例如大麦芽及辅料。
“麦芽”(malt)理解为任何发芽的谷类子实，特别指大麦子实。
“辅料”(adjuncts)理解为麦芽粉中非大麦芽的部分。其可以是任何 富含糖的材料。
术语“醪液”(mash)理解为水性淀粉浆，例如包括碎的大麦芽，碎的大 麦和/或其他辅料或其组合，浸在水中以制备麦芽汁。
“麦芽汁”(wort)理解为糖化过程中提取麦芽粉后产生的、未经发酵 的流出液(run-off)。
“麦酒糟”(spent grains)理解为提取麦芽粉并将麦芽汁从醪液中分离 以后所留下的沥干(drained)后的固形物。
“啤酒”(beer)在这里理解为经过发酵的麦芽汁，例如以大麦芽及可 选的辅料和啤酒花(hops)为原料酿造的酒精饮料。
麦芽汁中的“提取物回收率”(extract recovery)是指从麦芽粉(麦芽 和辅料)中浸出的可溶物的总和，表示为以干物质为基准的百分数。
“热稳定酶”(thermostable enzyme)是指在本发明的工艺的温度状况、 温育时间和使用量下，能够充分地降解所述底物的酶。
“A型木聚糖酶”(Type A xylanase)是指在靠近分枝残基的位置切割 阿拉伯木聚糖聚合物而形成末端取代的寡聚木糖的木聚糖酶。A型木聚糖 酶可以用本公开的方法部分所描述的方法来鉴定。
“同源性”(homology)用于多肽或DNA序列并在本公开中提及时， 指两个序列之间同源的程度，其表明第一个序列从第二个序列衍生。同源 性可以适当地使用本领域中已知的计算机程序来确定，例如GCG程序包中 的GAP(Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，August 1994， Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，443-453.)。采用下面的设置进行多肽序列比较：空位生成罚分 (GAP creation penalty)为3.0；空位延伸罚分(GAP extension penalty)为 0.1。
术语“DP”是聚合度，这里用于指多糖水解物中的聚合物中的葡萄糖 单位的平均数目。
本公开中所使用的糖苷水解酶家族(glycoside hydrolase families，GH) 和糖结合模块(carbohydrate binding modules，CBM)的编号是根据 Coutinho，P.M和Henrissat，B.的观点(Coutinho，P.M.和Henrissat，B.(1999) CAZy-Carbohydrate-Active Enzymes server于URL：http：//afmb.cnrs-mrs.fr/～ cazy/CAZY/index.html；或Coutinho，P.M.和Henrissat，B.1999，The modular structure of cellulases and other carbohydrate-active enzymes：an integrated database approach.在″Genetics，Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation″.，K.Ohmiya，K.Hayashi，K.Sakka，Y.Kobayashi，S.Karita和T. Kimura编.，Uni Publishers Co.，Tokyo，pp.15-23中；及Bourne，Y.和 Henrissat，B.2001；Glycoside hydrolases and glycosyltransferases：families and functional modules，Current Opinion in Structural Biology 11：593-600.此分类 系统基于一级结构的相似性来将葡糖苷水解酶分组。同一家族的成员还显 示相同的催化机制，并在整体三维结构上具有相似性，即使同一家族的成 员的底物特异性之间可能具有实质性的差异。
Humicola insolens内切葡聚糖酶的命名参照Karlsson，J的系统(Karlsson， J.2000.Fungal Cellulases，Study of hydrolytic properties of endoglucanases from Trichoderma reesei and Humicola insolens.Lund University)。
酿造工艺在本领域中是熟知的，一般包括制麦芽，糖化及发酵步骤。在 传统发酵工艺中制麦芽起到下列作用：将不可溶淀粉转化为可溶淀粉，降 解复杂的蛋白质，产生显色和呈味的化合物，产生供酵母生长的营养物， 及生发酶(development of enzymes)。制麦芽工艺的三个主要步骤为浸泡，发 芽和烘炉烘干(kilning)。
浸泡包括将去壳的大麦粒(barley kernels)与水混合以提高湿度(moisture level)并活化休眠的麦粒的代谢过程，下一步，将湿大麦保持在合适的温度 和湿度下使其发芽，直到实现充分改性(modification)，即，例如淀粉改 性(degradation)和酶活化为止。最后一步是在烘炉中烘干绿麦芽，烘炉中的 温度状况决定了大麦芽的颜色和存活下来用于糖化工艺的酶的量。在必须 保持酶活性时，低温烘干是较合适的。经过高温烘干的麦芽中酶活性很低 或者没有，但富含显色物质如焦糖，以及呈味物质。
糖化是将碾磨过的大麦芽和固体辅料中的淀粉转化成可发酵和不可发 酵的糖类从而产生具有所需组成(composition)的麦芽汁的工艺。传统的糖化 包括将大麦芽和辅料在一定的温度和体积下与水混合以继续进行在制麦芽 工艺中起始的生化变化。糖化在变化的温度下进行一段时间以活化负责降 解蛋白和糖的内源麦芽酶类。糖化过程中发生的最重要的变化是淀粉分子 向可发酵糖类的转化。在传统的糖化工艺中，负责淀粉转化的酶主要是α- 和β-淀粉酶。α-淀粉酶将淀粉分子断裂成许多较短的、可被β-淀粉酶攻击 的链，从而以很快的速度降解淀粉。产生的二糖是麦芽糖。
传统上储藏啤酒的酿造经常使用一种称为“分步浸泡”(step-infusion) 的方法。这种糖化程序包括在一系列不同温度下静置，每个温度有利于一 种必需的内源酶活性。迄今为止双醪浸出(double-mash infusion)系统是啤 酒尤其是储藏型啤酒的工业化生产中应用最广泛的系统。此系统制备两种 单独的醪液。在该系统中，麦芽粉蒸煮锅用于煮辅料，而糖化槽则用于充 分改性的、具有高度酶活性的麦芽。
当使用酶含量低的麦芽粉例如辅料含量高的麦芽粉为原料酿造时，可 以在添加的酶组合物的存在下进行糖化，该酶组合物包含水解麦芽粉淀粉 所需的酶，这些酶可以包括α-淀粉酶，支链淀粉酶，β-淀粉酶和葡糖淀粉酶。
糖化以后，需要将液体提取物(麦芽汁)和固形物(麦酒糟，即麦芽 粉中不溶的谷粒和谷壳物质的部分)分开。麦芽汁的分离是重要的，因为 固形物中含有大量的非淀粉多糖，蛋白质，改性不良的淀粉，脂肪物质， 硅酸盐，和多酚(单宁)。谷类子实中存在的重要的非淀粉多糖是β-葡聚 糖和阿拉伯木聚糖。大麦胚乳细胞壁含有75％的β-葡聚糖，20％的阿拉伯 木聚糖和5％的残余蛋白质，以及少量的纤维素，葡甘露聚糖和酚酸。没有 通过酶水解而改性的长链的大麦阿拉伯木聚糖在溶于水时会造成凝胶的形 成，这些凝胶将大大增加麦芽汁的粘度并降低过滤性；β-葡聚糖也是如此， 但程度要低一些。同样地，将β-葡聚糖降解为较小的寡聚物对于麦芽汁的 质量也是非常重要的，因为未改性的β-葡聚糖以后会引起终产品啤酒中的 浑浊稳定性(haze stability)问题。因此在糖化步骤中经常使用含有内切葡 聚糖酶和木聚糖酶例如Ultraflo或Viscozyme的酶组合物来改善麦芽汁的 分离。麦芽汁分离的目标包括但不仅限于下列方面：
●获得较好的提取物回收率，
●获得良好的过滤性，和
●产生澄清的麦芽汁。
浸出回收率(extraction recovery)和过滤性是酿造工艺中重要的经济性因 素，而为了生产不起浑浊的啤酒，麦芽汁的澄清度是必不可少的。浸出回 收率、过滤性和麦芽汁的澄清度很大程度上受麦芽粉的规格，例如辅料的 种类和大麦芽，以及所用的糖化程序的影响。
与麦酒糟分离后的麦芽汁可以用啤酒酵母发酵生产啤酒。
关于常规酿造工艺的更多信息请参考酿造研究与教学会(Research and Teaching Institute of Brewing，Berlin(VLB))的Wolfgang Kunze所著 “Technology Brewing and Malting”，2nd revised Edition 1999，ISBN 3-921690-39-0。
本发明的实施方案
本发明提供一种生产具有更高的过滤性和/或更好的过滤后提取产率的 醪液的工艺。该工艺包括：在酶活性的存在下制备醪液并过滤醪液得到麦 芽汁，其中酶活性包括GH10家族的木聚糖酶，其量占总木聚糖和内切葡聚 糖酶蛋白的至少15％，20％，优选25％，例如至少30％，或至少40％，至 少50％或至少60％例如至少70％，至少80％，至少90％或乃至100％w/w。
在一个优选的实施方案中，所述木聚糖酶是A型木聚糖酶，在一个特 定的实施方案中该木聚糖酶是A型木聚糖酶，其具有I1，3末端/I1，3内部比值为至 少0.25，例如至少0.30，至少0.40，至少0.50，或乃至至少0.60。
优选地该木聚糖酶具有CBM，优选地为家族1的CBM。
在另一个优选的实施方案中所述木聚糖酶是这样的木聚糖酶，其在本 文中描述的木聚糖酶结合测定中具有的大麦可溶性/不可溶性纤维结合比为 至少0.50，优选为至少0.60，更优为至少0.70，例如0.80，0.90，1.00，1.10 或乃至至少1.20。
在另一个优选的实施方案中，所述木聚糖酶来自丝状真菌，例如曲霉 属(Aspergillus)菌种的菌株，优选地来自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus) (SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9)；来自毁丝霉属(Myceliophotora)的菌 种的菌株，优选地来自Myceliophotora thermophilia(SEQ ID NO：13)；来 自腐质霉属(Humicola)菌种的菌株，优选地来自Humicola insolens(SEQ ID NO：12)。在另一个优选的实施方案中，所述木聚糖酶来自木霉属 (Trichoderma)菌种的菌株，优选地来自T.reesei，例如SEQ ID NO：17所 示的木聚糖酶。在一个更优选的实施方案中，所述木聚糖酶由来自与前述 序列中的任何一个具有至少50％，例如至少60％，70％，80％或乃至90％ 的同源性的木聚糖酶衍生而来。
在另一个优选的实施方案中，所述木聚糖酶来自细菌，例如芽孢杆菌 属(Bacillus)的菌株，优选地来自Bacillus halodurans。
在另一个优选的实施方案中，所述内切葡聚糖酶为来自腐质霉属菌种 的内切葡聚糖酶，例如来自Humicola insolens的内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：3)，或来自Humicola insolens的内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：4)，来自 热子囊菌属(Thermoascus)的菌种，例如来自橙色热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：6)，或来自曲霉属的菌种，例 如来自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：16)。
在一个优选的实施方案中，所述木聚糖酶与前述任一序列具有至少 50％，例如至少60％，70％，80％或乃至90％的同源性。
在另一个优选的实施方案中，存在至少一种附加的酶，该酶是阿拉伯 呋喃糖苷酶。
本发明还提供一种工艺用于降低含有淀粉水解物的水溶液的粘度，该 工艺包括：检测至少一种木聚糖分解酶的针对不溶性小麦阿拉伯木聚糖的 水解活性，选择在紧邻着(next to)分枝残基处切割而形成末端取代的寡聚木 糖的木聚糖分解酶，并将所选择的木聚糖分解酶加入到含有淀粉水解物的 水溶液中。
本发明进一步提供一种降低含有淀粉水解物的水溶液的粘度的工艺，其 包括：检测至少一种内切葡聚糖分解酶的针对大麦β-葡聚糖的水解活性， 选择在10μg/ml纯化的酶及5mg/ml大麦β-葡聚糖，于50mM乙酸钠及 0.01％Triton X-100中，pH 5.5及50℃的条件下，在1小时内能将70％的大 麦β-葡聚糖降解到DP6或DP＜6的内切葡聚糖分解酶，并将选择到的内切 葡聚糖分解酶加入含有淀粉水解物的水溶液中。
在上述两种工艺的优选的实施方案中，所述含有淀粉水解物的水溶液 是用于制造啤酒的醪液。
本发明进一步提供一种组合物，其包含：占总酶蛋白的至少15％w/w 的GH10木聚糖酶，和/或，占总酶蛋白的至少40％w/w的GH12，GH7， 和/或GH5内切葡聚糖酶。
在一个优选的实施方案中所述组合物中的木聚糖酶是A型木聚糖酶，优 选地，该A型木聚糖酶的具有I1，3末端/I1，3内部比值为至少0.25，例如至少0.30， 至少0.40，至少0.50，或乃至至少0.60。
在另一个优选的实施方案中，所述木聚糖酶来自丝状真菌，例如曲霉属 菌种的菌株，优选地来自棘孢曲霉(SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9)；来 自毁丝霉属的菌种的菌株，优选地来自Myceliophotora thermophilia(SEQ ID NO：13)；来自腐质霉属菌种的菌株，优选地来自Humicola insolens(SEQ ID NO：12)。在一个优选的实施方案中，所述组合物的木聚糖酶与前述序列中 的任何一个具有至少50％，例如至少60％，70％，80％或乃至90％的同源性。
在一个优选的实施方案中，所述组合物中的木聚糖酶来自细菌，例如芽 孢杆菌属的菌株，优选为Bacillus halodurans。
在另一个优选的实施方案中，所述组合物中的内切葡聚糖酶为来自腐 质霉属菌种的内切葡聚糖酶，例如来自Humicola insolens的内切葡聚糖酶 (SEQ ID NO：3)，或来自Humicola insolens的内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：4)， 来自热子囊菌属的菌种，例如来自橙色热子囊菌(thermoascus aurantiacus)的 内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：6)，或来自曲霉属的菌种，例如来自棘孢曲霉 的内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：16)，或来自木霉属的菌种，优选为T.reesei 和/或绿色木霉(T.viride)，例如SEQ ID NO：18所示的5家族的内切葡聚 糖酶，SEQ ID NO：19所示的7家族的β-葡聚糖酶，或SEQ ID NO：20所示 的12家族的β-葡聚糖酶。
在一个优选的实施方案中，所述组合物的内切葡聚糖酶与前述序列中 的任何一个具有至少50％，例如至少60％，70％，80％或乃至90％的同源性。
在一个优选的实施方案中，所述组合物中GH10家族的木聚糖酶的量以 总木聚糖和内切葡聚糖酶酶蛋白的至少25％，例如至少30％，至少35％， 至少40％w/w，至少45％或甚至至少50％w/w存在。
在一个优选的实施方案中，所述组合物中GH12，7和/或5家族的木聚 糖酶的量占总木聚糖酶和内切葡聚糖酶酶蛋白的至少25％，优选30％，例 如至少35％，至少40％，或乃至至少50％，例如55％或乃至至少60％w/w。
根据前述方面的组合物可以用于包括降低含有淀粉水解物的水溶液的 粘度的工艺。
该组合物还可用于包括过滤含有淀粉水解物的水溶液的工艺。在一个 优选的实施方案中，该含有淀粉水解物的水溶液是用于制造啤酒的醪液， 在另一个优选的实施方案中该含有淀粉水解物的水溶液是饲料成分 (composition)。
本发明的方法(process)可以用于任何麦芽粉的糖化。根据本发明，麦芽 粉可以包括任何含淀粉和/或糖的植物材料，该植物材料可以来自任何植物 和植物部分，包括块茎，根，茎，叶和种子。优选地，麦芽粉包括谷类子 实，例如大麦，小麦，黑麦，燕麦，玉米，稻，milo，粟类(millet)和高粱的 子实；更优地，麦芽汁的麦芽粉的至少10％，更优地为至少15％，更优地 为至少25％，或最优地为至少35％，例如至少50％，至少75％，至少90％， 或乃至100％(w/w)是来自谷类子实。最优地，麦芽粉包括制成麦芽的谷 类子实，例如大麦芽。较优地，麦芽汁的麦芽粉的至少10％，更优地为至 少15％，更优地为至少25％，或最优地为至少35％，例如至少50％，至少 75％，至少90％，或乃至100％(w/w)是来自制成麦芽的谷类子实。
对低麦芽麦芽粉(low malt grists)进行糖化时可以外加糖化酶，最常用 作淀粉降解酶的酶包括支链淀粉酶，α-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶。淀粉降解 酶在糖化中的使用对于技术人员是熟知的。
含有易于发酵的碳水化合物例如糖和糖浆的辅料可以在本发明的糖化 工艺之前，之中或之后加入到麦芽中，但优选地于糖化工艺之后加入。辅 料的一部分在加到本发明的醪液中之前可以用蛋白酶和/或内切葡聚糖酶处 理，或用热处理。
在糖化工艺过程中，从麦芽粉中提取的淀粉被逐渐水解为可发酵的糖 和较小的糊精。优选地，在分离麦芽汁之前，醪液对碘试验呈淀粉阴性。
在本发明的工艺中应用合适的木聚糖酶和内切葡聚糖酶活性，使得β- 葡聚糖和阿拉伯木聚糖水平得以充分降低，这样有助于麦芽汁的分离，从 而确保了较短的循环时间，高提取物回收率和澄清的麦芽汁。
由本发明的第一方面的工艺(process)制备的麦芽汁可以经过发酵生产 啤酒。麦芽汁的发酵可包括将酵母浆(slurry)接种到麦芽汁中，其中酵母浆 可以包含新鲜酵母，即先前没有用于本发明的酵母，或者，酵母也可以是 回收的酵母。使用的酵母可以是任何适用于啤酒酿造的酵母，尤其是选自 糖酵母属(Saccharomyces)的若干种，例如酿酒酵母(S.cerevisiae)和葡 萄汁糖酵母(S.uvarum)，包括这些生物的天然和人工产生的变体。发酵 麦芽汁以生产啤酒的方法对于技术人员是熟知的。
本发明的工艺可以包括将二氧化硅水凝胶(hydrogel)加入到发酵后的麦 芽汁中以增加啤酒的胶体稳定性。该工艺还可以包括向发酵后的麦芽汁中 加入硅藻土并过滤以使啤酒澄清。通过发酵本发明的麦芽汁所生产的啤酒 可以是任意种类的啤酒，例如爱儿啤酒(ale)，烈性爱儿啤酒(strong ale)， 黑啤酒(stout)，英国黑啤酒(porter)，陈贮啤酒(lager)，捷克黄啤酒 (pilsner)，苦啤酒(bitter)，出口啤酒(export beer)，麦芽酒(malt liquor)， 发泡酒(happoushu)，朗别克啤酒(lambic)，大麦酒(barley wine)，高 酒精啤酒(high-alcohol beer)，低酒精啤酒(low-alcohol beer)，低热量啤 酒(low-calorie beer)，或轻淡啤酒(light beer)。
通过本发明的工艺生产的啤酒可以经过蒸馏回收乙醇，例如用于制造 威士忌(whisky)。任意种类的威士忌(在美国和爱尔兰拼作“whiskey”) 都可以在考虑范围之内，如波旁威士忌(bourbon)，加拿大威士忌(Canadian whisky)，爱尔兰威士忌(Irish whiskey)，黑麦威士忌(rye)和苏格兰威 士忌(scotch)。
木聚糖酶
用于本发明目的的木聚糖酶是归类为EC 3.2.1.8的酶。其正式名称为内 -1，4-β-木聚糖酶(endo-1，4-β-xylanase)。其分类名称为1，4-β-D-木聚糖-木 聚糖水解酶(1，4-β-D-xylan xylanohydrolase)；还可能使用其他的名称，例 如内-(1-4)-β-木聚糖酶(endo-(1-4)-β-xylanase)；(1-4)-β-木聚糖4-木聚糖 水解酶((1-4)-β-xylan 4-xylanohydrolase)；内-1，4-木聚糖酶 (endo-1，4-xylanase)；木聚糖酶(xylanase)；β-1，4-木聚糖酶(β-1，4-xylanase)； 内-1，4-木聚糖酶(endo-1，4-xylanase)；内-β-1，4-木聚糖酶 (endo-β-1，4-xylanase)；内-1，4-β-D-木聚糖酶(endo-1，4-β-D-xylanase)； 1，4-β-木聚糖-木聚糖水解酶(1，4-β-xylan xylanohydrolase)；β-木聚糖酶 (β-xylanase)；β-1，4-木聚糖-木聚糖水解酶(β-1，4-xylan xylanohydrolase)； 内-1，4-β-木聚糖酶(endo-1，4-β-xylanase)；β-D-木聚糖酶(β-D-xylanase)。 催化的反应是木聚糖中的1，4-β-D-木糖苷键的内切水解(endohydrolysis)。
本发明中将用到的木聚糖酶可以来自任何来源，包括哺乳动物，植物 或动物来源，但目前更偏好微生物来源的木聚糖酶。特别地，所述木聚糖 酶可以是可得自丝状真菌或酵母的木聚糖酶。
已经在若干种真菌中发现了木聚糖酶，具体有曲霉属的菌种，例如黑 曲霉(A.niger)，泡盛曲霉(A.awamori)，棘孢曲霉和米曲霉(A.oryzae)； 木霉属的菌种，例如T.reesei或T.harzianum；青霉属的菌种，例如沙门氏 柏干酪青霉(P.camenbertii)；镰孢属(Fusarium)的菌种，例如尖孢镰孢(F. oxysporum)；腐质霉属的菌种，例如H.insolens；和Thermomyces lanuginosa， 例如T.lanuginosa。在细菌种类中也已发现了木聚糖酶，例如在芽孢杆菌属 中，如短小芽孢杆菌(B.pumilus)。
优选地，根据本发明的工艺，所述木聚糖酶来自：丝状真菌例如曲霉属 的种，芽孢杆菌属的种，腐质霉属的种，毁丝霉属的种，Poitrasia属的种， 根毛霉属(Rhizomucor)的种，或木霉属。
底物特异性已被证明是木聚糖酶在本发明的工艺中的性能的关键参 数。在本发明的工艺中具有最佳性能的木聚糖酶看来是这样的酶，其与可 溶的阿拉伯木聚糖的结合相当强，而与不可溶的阿拉伯木聚糖的结合相当 弱。优选地，本发明中将要使用的木聚糖酶是这样的木聚糖酶，在本公开 的方法描述部分所述的结合测定中，该酶在本文中描述的木聚糖酶结合测 定中具有的大麦可溶性/不可溶性纤维结合比为至少0.50，优选为至少0.60， 更优为至少0.70，例如0.80，0.90，1.00，1.10或乃至至少1.20。
已鉴定的具有这些特征的若干木聚糖酶是葡糖苷水解酶10家族的成 员。优选地，本发明将要使用的木聚糖酶是糖苷水解酶10家族(GH10)的 木聚糖酶，最优地，所述木聚糖酶是GH10木聚糖酶，同时也是A型木聚 糖酶，即，在靠近分枝残基处切割不溶性小麦阿拉伯木聚糖聚合物，而产 生末端取代的寡聚木糖的木聚糖酶(请参见A型和B型定义的示例)。由 于GH10酶能够更接近分枝的木糖单位，和GH11木聚糖酶相比，它们可以 产生更小的寡糖。
优选地，本发明中要使用的木聚糖酶具有功能性的CBM，例如第1家族 的CBM。
优选地，根据本发明的工艺，所述木聚糖酶选自下列：来自棘孢曲霉 的木聚糖酶，由SEQ ID NO：8(AA XYL I)所示；来自棘孢曲霉的木聚 糖酶，由SEQ ID NO：9(AA XYL II)所示；来自Bacillus halodurans的 木聚糖酶，由SWISS PROT P07528(BH XYL A)所示；Humicola insolens 的木聚糖酶，由SEQ ID NO：12(HI XYL III)所示；Myceliophotora thermophila 的木聚糖酶，由SEQ ID NO：13(MT XYL I)所示；及Trichoderma reesei 的木聚糖酶，例如由SEQ ID NO：17所示的木聚糖酶。另外还优选任何与上 述任一序列具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，乃至至少90％ 的同源性的序列。
内切葡聚糖酶
用于本发明目的的内切葡聚糖酶是归类为EC 3.2.1.4的酶。本发明中要 用到的内切葡聚糖酶可以来自任何来源，包括哺乳动物，植物或动物来源， 但目前更偏好微生物来源的内切葡聚糖酶。特别地，所述内切葡聚糖酶可 以是可得自丝状真菌或酵母的内切葡聚糖酶。
优选地，所述内切葡聚糖酶是糖苷水解酶12家族(GH12)，第7家族 (GH7)，或第5家族(GH5)的葡聚糖酶。更优地，所述内切葡聚糖酶是 具有β-薄卷饼型(βjelly roll)或者b8/a8-桶(b8/a8-barrel)超结构的多肽。
本发明中要用到的内切葡聚糖酶可以来自任何来源，包括哺乳动物， 植物或动物来源，但目前更偏好微生物来源的内切葡聚糖酶。特别地，所 述内切葡聚糖酶可以是可得自丝状真菌或酵母的内切葡聚糖酶。
更优地，根据本发明的工艺，所述内切葡聚糖酶来自丝状真菌例如曲 霉属和腐质霉属的种。
优选地，根据本发明的工艺，所述内切葡聚糖酶选自下列：来自棘孢 曲霉的内切葡聚糖酶，由SEQ ID NO：1(AA EG I)所示；来自棘孢曲霉的 内切葡聚糖酶，由SEQ ID NO：2(AA EG II)所示；来自棘孢曲霉的内切 葡聚糖酶，由SEQ ID NO：16(AA EG III)所示；来自Humicola insolens的 内切葡聚糖酶，由SEQ ID NO：3(HI EG I)所示；来自Humicola insolens 的内切葡聚糖酶，由SEQ ID NO：4(HI EG III)所示；来自Humicola insolens 的内切葡聚糖酶，由SEQ ID NO：5(HI EG IV)所示；来自木霉属菌种的 内切葡聚糖酶，由SEQ ID NO：19所示；或来自木霉属菌种的内切葡聚糖酶， 由SEQ ID NO：20所示。另外还优选任何与上述任一序列具有至少50％，至 少60％，至少70％，至少80％，乃至至少90％的同源性的序列。
其他GH12葡聚糖酶包括来自下列的内切葡聚糖酶：来自曲霉属的菌 种，例如来自川地曲霉(Aspergillus kawachii)(SWISSPROT Q12679)， 或黑曲霉(SWISSPROT O74705)，米曲霉(SWISSPROT O13454)；来自 欧文氏杆菌属(Erwinia)的菌种，例如来自胡萝卜欧文氏杆菌(Erwinia carotovora)(SWISSPROT P16630)；及来自Thermotoga属的菌种，例如 来自Thermotoga maritima(SWISSPROT Q60032或Q9S5X8)。另外还优 选任何与上述任一GH12葡聚糖酶序列具有至少50％，至少60％，至少 70％，至少80％，乃至至少90％的同源性的序列。
其他GH12葡聚糖酶包括来自下列的内切葡聚糖酶：来自蘑菇属 (Agaricus)的菌种，例如来自双孢蘑菇(Agaricus bisporus)(SWISSPROT Q92400)；来自镰孢属的菌种，例如来自尖孢镰孢(SWISSPROT P46238)； 来自链孢霉属(Neurospora)的菌种，例如来自粗糙链孢霉(Neurospora crassa)(SWISSPROT P38676)；及来自木霉属的菌种，例如来自 Trichoderma longibrachiatum(SWISSPROT Q12714)。另外还优选任何与 上述任一GH7葡聚糖酶序列具有至少50％，至少60％，至少70％，至少 80％，乃至至少90％的同源性的序列。
其他GH5葡聚糖酶包括来自下列的内切葡聚糖酶：来自Acidothermus 属的菌种，例如来自Acidothermus cellulolyticus(SWISSPROT P54583)； 来自曲霉属的菌种，例如来自黑曲霉(SWISSPROT O74706)；及来自芽孢 杆菌属的菌种，例如来自多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)(SWISSPROT P23548)。另外还优选任何与上述任一GH5葡聚糖酶序列具有至少50％， 至少60％，至少70％，至少80％，乃至至少90％的同源性的序列。
阿拉伯呋喃糖苷酶
阿拉伯呋喃糖苷酶EC 3.2.1.55，通用名α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶，其水 解α-L-阿拉伯糖苷中的末端非还原α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基。该酶作用于 α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1，3)-和/或(1，5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木 聚糖和阿拉伯半乳聚糖。
材料和方法
木聚糖酶活性
木聚糖分解活性可以用FXU单位来表示，其在pH6.0下以remazol-木 聚糖(xylan)(用Fluka产的Remazol Brilliant Blue R染色的4-O-甲基-D-葡糖 醛酸-D-木聚糖)为底物测定。
将木聚糖酶样品和remazol-木聚糖底物共温育，用乙醇沉淀掉未降解的 染色底物背景。保留在上清中的蓝色(用分光光度在585nm测得)与木聚 糖酶活性成比例。然后相对标准反应条件即50℃，pH6.0，反应时间30分 钟下的酶标准品确定木聚糖酶单位。
Novozyme A/S，Demark可以根据要求提供小册子AF 293.6/1，在其中 有对此分析方法的更详细的描述。此处将其引入作为参考。
葡聚糖酶活性
纤维素分解活性可以以真菌内切葡聚糖酶单位(fungal endoglucanase units，FBG)来衡量，其是在30℃，pH 5.0，反应时间30min的条件下以 0.5％β-葡聚糖为底物测定的。真菌内切葡聚糖酶与β-葡聚糖反应释放出葡 萄糖或者还原性碳水化合物，该葡萄糖或者还原性碳水化合物作为还原糖， 用Somogyi-Nelson法测定。
1真菌内切葡聚糖酶单位(FBG)是指在上述标准条件下，每分钟能释 放具有相当于1微摩尔葡萄糖的还原能力的葡萄糖或者还原性碳水化合物 的酶量。
酶
UltrafloL，来源于Humicola insolens的多组分酶组合物，其包含内切 葡聚糖酶，木聚糖酶，戊聚糖酶和阿拉伯聚糖酶的混合物。UltrafloL的 规格为45FBG/g，比重为大约1.2g/ml。UltrafloL可以自Novozymes A/S 获得。
ViscozymeL，来源于棘孢曲霉的多组分酶组合物，其包含内切葡聚 糖酶，阿拉伯聚糖酶和木聚糖酶的混合物。ViscozymeL的规格为100 FBG/g，比重为大约1.2g/ml。Viscozyme可以自Novozymes A/S获得。
Alcalase，枯草蛋白酶(subtilisin)来源于地衣形芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的蛋白酶组合物。Alcalase可以自Novozymes A/S获得。
Termamyl SC，一种芽孢杆菌α-淀粉酶，可自Novozymes A/S获得。
还使用了下面的单组分内切葡聚糖酶和木聚糖酶：
内切葡聚糖酶：
AA EG I        棘孢曲霉                            SEQ ID NO：1
AA EG II       棘孢曲霉             Cel12b         SEQ ID NO：2
AA EG III      棘孢曲霉             Cel12a         SEQ ID NO：16
HI EG I        Humicola insolens    Cel12a，GH12   SEQ ID NO：3.
HI EG III      Humicola insolens    Cel12a，GH12   SEQ ID NO：4.
HI EG IV       Humicola insolens    Cel5a，GH12    SEQ ID NO：5
HI EG V        Humicola insolens    Cel45a，GH45   SEQ ID NO：8
TA EG BG025    橙色热子囊菌                        SEQ ID NO：6
木聚糖酶：
AA XYL I        棘孢曲霉                      GH10，Type A     SEQ ID NO：8
AA XYL II       棘孢曲霉                      GH10，Type A     SEQ ID NO：9
AA XYL III      棘孢曲霉                      GH11，Type B     SEQ ID NO：10
BH XYL A        Bacillus halodurans           GH10，Type A     SWISS PROT P07528.
HI XYL I        Humicola insolens             GH11，Type B     SEQ ID NO：11
HI XYL III      Humicola insolens             GH10，Type A     SEQ ID NO：12
MT XYL I        Myceliophotora thermophila    GH10，Type A     SEQ ID NO：13
MT XYL III      Myceliophotora thermophila    GH11，Type B     SEQ ID NO：14
TL XYL          Thermomyces lanuginosus       GH11，Type B     SEQ ID NO：15
方法
醪液制备
除非另外说明，糖化如下述进行。除了注明的地方(例如关于酶的用 量)外，醪液的制备按照EBC：4.5.1进行，使用按照EBC：1.1磨制的麦芽。 糖化试验在有盖的500ml容器中进行，容器温育在水浴中并加搅拌，每个 容器内盛有醪液，该醪液含50g麦芽粉并用预热到初始温育温度+1℃的水 将总重调到300±0.2g。制得的麦芽汁的柏拉图度(Plato)大约为12％。
糖化温度变化
除非另外说明，糖化在下面的温度下进行：初始温育温度52℃下经过 30min；然后经过升温步骤升到63℃，并在该温度下保持20min；再经过 升温步骤升到72℃并保持30min，然后在78℃下煮浆(mashing off)5min。 步间(step wise)的温度梯度是以1℃/min的上升率实现的。醪液在15分钟中 冷却到20℃。这样总的温育时间为2小时11分钟。
附加方法
粗产品、麦芽汁、啤酒等的分析方法可以参见：Analytica-EBC，Analysis Committee of EBC，the European Brewing Convention(1998)，Verlag Hans Carl Geranke-Fachverlag。有关本发明的下列参数的测定方法如下所示。
柏拉图度：折射计
β-葡聚糖：EBC：8.13.2(麦芽汁中的高分子量β-葡聚糖含量：荧光测定 法)。
浊度：EBC：4.7.1
过滤性：滤液体积(ml)测定：根据EBC：4.5.1(麦芽提取物：欧啤 协法醪液(Congress Mash))第8.2小节。过滤性：将320mm直径的棱沟滤 纸(fluted filter paper)(Schleicher and Schüll No.597，Machery，Nagel and Co.)安放在200mm直径的漏斗(funnels)中，漏斗装在500ml的烧瓶上， 以此装置过滤1小时后，读取滤液的体积。
提取物回收率：EBC：4.5.1(麦芽提取物：欧洲啤酒协会醪液，干提取 物)术语麦芽汁中的提取物回收率定义为从麦芽粉(麦芽和辅料)中提取 的可溶物(葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，麦芽三糖，糊精，蛋白质，胶质，无 机物，其他物质)的总和，表示为以干物质为基准的百分数。剩下的不可 溶部分定义为麦酒糟。
$a)---E_1=\frac{P(M+800)}{100-P}$
$b)E_2=\frac{E_1·100}{100-M}$
其中：
E1＝样品中的浸出物含量，以％(m/m)计
E2＝麦芽粉中的浸出物含量，以％(m/m)计
P＝麦芽汁中的浸出物含量，以％柏拉图度计
M＝麦芽粉的含水量，以％(m/m)计
800＝对于100g麦芽粉，加入到糖化醪中的蒸馏水的量。
粘度：自动微粘度仪(Automated Microviscometer，AMVn)是基于滚 球原理(rolling ball principle)。将待测样品导入玻璃毛细管中，该毛细管 中有钢球滚动。通过测量钢球的滚动时间就可以确定被测流体的粘性性质。 测量在毛细管中球滚过一段给定的测量距离所经过的滚动时间t0，由测量系 统的校正常数K1(α)，滚动时间t0及球和样品的密度之差Δρ，通过下面的公 式计算得到样品的动态粘度η：
η＝K1(α)·t0·(ρk-ρs)，其中
η＝样品的动态粘度[mPa·s]
K(α)＝测量系统的校正常数[mPa·scm3/g]
t0＝100mm的滚动时间[s]
ρk＝球的密度[7,85g/cm3]
ρs＝被测样品的密度[g/cm3]
粘度可以基于浸提物本身的柏拉图度(Plato°)表示，也可以根据欧洲啤酒 协会的糖化程序换算成8,6柏拉图度(Plato)。
实施例1.通过结合测定鉴定木聚糖酶
各纤维组分的制备
可溶性纤维组分按如下制备：
1.将50kg大麦磨粉，并在50℃搅拌下于450kg水中制成浆。
2.在搅拌下浸提30分钟。
3.用预热的沉降式离心机(于50℃)和固体排出式离心机 (solids-ejecting centrifuge)制得无颗粒的澄清的组分。
4.在50℃下用截留值为20000道尔顿的管状膜超滤上述澄清组分，持 续超滤直至系统中粘度升高且流速显著降低。
5.收集经过浓缩的组分并冷冻干燥。
不可溶纤维组分按如下制备：
1.将50kg大麦磨粉，并在50℃搅拌下于450kg水中制成浆。加入0.25 kg Termamyl SC并将溶液在搅拌下加热到85℃，反应30分钟，取样 用于碘试验测定淀粉。
2.将所取的样在3000xg下离心5min(在10ml离心瓶中)。用折射 计测量上清的柏拉图度。用碘颜色反应监测淀粉转化；如果显蓝色 则有淀粉残留。
3.持续反应直至柏拉图度数稳定。反应产物即可离心。
4.使用沉降式离心机离心。在75℃下分离，弃去所得到的澄清无颗粒 的上清组分，仅将固体组分用于后续的工艺。
5.在500kg热水中将该固体组分制成浆，将此浆的温度调到50℃。
6.用NaOH将pH调到7.5。用125g Alcalase 2.4L进行水解反应。水 解反应过程中pH维持在pH＝7.5(pH-stat)，反应时间为120分钟。 而后，在搅拌及无pH-stat的条件下，于T＝50℃反应过夜。
7.用HCl将pH调至6.5。
8.用沉降式离心机离心反应混合物。
9.收集固体组分并在50℃下用500L水洗涤30分钟，重复离心步骤和 洗涤步骤。
10.将洗涤过的固体组分冷冻干燥。
纤维组分分析
用下面的方法分析纤维组分的糖类构成：将1g纤维加入50mL 1M HCl中并在100℃下保温振荡2小时。在此处理之后，立即在冰上冷却反应混合 物，并加入11mL 4M NaOH以中和该混合物。依照Srensen等.(2003) Biotech.Bioeng.vol.81，No.6，p.726-731的描述，用装配了CarBoPac PA-1 的Dionex BioLC system系统测定阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木糖的含量， 如。结果显示在表1中。
            表1.大麦纤维组分中各种糖的单独含量(g/kg)   阿拉伯糖   半乳糖   葡萄糖   木糖   可溶性纤维   不溶性纤维   34.9   102.3   14.8   10.4   486.6   42.3   38.1   207.2
木聚糖酶结合测定
木聚糖酶结合测定以下面的方法进行：在Eppendorf管中用500μl乙酸 盐缓冲液(50mM，pH5.5，0.1％Triton X-100)以涡旋混合的方式洗涤纤维 (10mg)，然后在13000g下离心2min。洗涤和离心进行两次。将含有酶 的溶液*(500μl，于pH5.5的乙酸盐缓冲液中)加到底物中，将混合物充 分地涡旋混合后在冰浴中保持10min。然后将盛有反应混合物的Eppendorf 管在14000g离心3min，再以溶于0.2M磷酸钠缓冲液pH6.0+0.01％Triton X-100的0.2％自小麦AZCL-阿拉伯木聚糖(Megazyme)为底物测定初始 和残留活性。在恒温混匀器中将盛有900μl底物的小瓶预热到37℃。加入 100μl酶样品，然后在最大振荡下在37℃保温15min。将小瓶在冰上放置2 min，然后于20.000g(20000)下离心1min。将2×200μl上清转移到微量滴 定板中，测量终点590nm OD，并与对照比较。在对照中100μl酶样品不 是与底物而是与900μl 0.2M磷酸钠缓冲液pH6.0+0.01％Triton X-100共 保温，随后全部活性被回收在上清中，此值被定为1。结果显示在表2中。
两种具有最高的可溶性/不溶性大麦纤维结合比的木聚糖酶，棘孢曲霉 木聚糖酶II和I，也是在糖化试验中性能最佳的两种木聚糖酶。   表2.可溶性/不溶性大麦纤维结合比。与可溶性/不溶性大麦纤维组分保温10min后上清中   测到的相对活性，和由此得到的在可溶性和不溶性大麦纤维的上清中所测得的活性之比值。   木聚糖   GH家族   不溶性大麦   纤维   可溶性大麦   纤维   比值   可溶性/不溶性   棘孢曲霉Xyl II   10   86   104   1.21   棘孢曲霉Xyl I   10   105   56   0.52   Humicola insolens Xyl II   11   82   37   0.45   Thermomyces lanuginosus Xyl   11   83   14   0.17   Humicola insolens Xyl I   11   74   7   0.09   Bacillus halodurans Xyl A   11   79   7   0.09
实施例2.鉴定木聚糖酶的特异性
应用高场核磁共振(1H NMR)来鉴定针对不溶性小麦阿拉伯木聚糖 (AX)(不溶性，Megazyme)的木聚糖酶特异性的差异。
在1H NMR中，阿拉伯木聚糖或其寡糖(AXO)显示出由来自α-L-阿拉 伯呋喃糖苷单位的异头质子H-1所引起的大约5.0-5.5ppm信号(化学位移)， 它们之间存在的依赖于它们的局部环境的个体差异可以用来评价木聚糖酶 针对这种高度分枝的聚合物的特异性。
标准条件是：10mg/mL AX(于50mM乙酸钠缓冲液中，pH 5.5)与0.1 XU/mL在30℃共保温120min，然后使木聚糖酶失活(95℃，20min)，将 溶液在旋转蒸发器上浓缩。将样品从D2O(1mL)中蒸发两次，最后在分 析之前重悬于D2O(～0.8mL)中。在30℃下于Varian Mercury 400MHz 上记录1H NMR谱。经过100次扫描收集数据，并用HDO信号作为参比信 号(4.67ppm)。
木聚糖酶降解AX时，1H NMR会根据酶的特异性而发生变化。因此， 如果产物寡糖中的阿拉伯糖位于末端的(terminal)木糖——相比于“内部的” (internal)木糖——上，阿拉伯呋喃糖苷H-1的化学位移将会改变。如果木聚 糖酶能够把取代的木糖置于其+1亚位点上，就会造成这样的结果。在所应 用的条件下，发现所有受试的GH10木聚糖酶都具有上述能力，而没有发现 具有此特性的GH11木聚糖酶。A型指在紧邻着分枝残基处切割的木聚糖酶 (产生末端取代的寡聚木糖)，而B型指在未取代的木糖单位之间切割， 只产生内部取代的单位的木聚糖酶。A型木聚糖酶也能够在未取代的木糖 单位之间切割。表3显示了本发明人所鉴定的A型和B型木聚糖的例子。 对于本发明，优选A型木聚糖。
表3.A型和B型木聚糖酶的示例   A型   B型   棘孢曲霉Xyl I   棘孢曲霉Xyl II   Bacillus halodurans Xyl A   Humicola insolens Xyl III   Myceliophotora thermophila Xyl I   Biobake(Quest)   Humicola insolens Xyl I   Myceliophotora thermophila Xyl III   Thermomyces lanuginosus Xyl I
即使在A型木聚糖之间，对于在紧邻着分枝残基处切割或在未取代的 木糖之间切割的偏好性也是不同的，如表4所示，其中I1，3末端/I1，3内部的比值 与两种质子各自的总数之比值相关。因此，A型的切割会造成I1，3末端的上升， 而B型的切割不会。两种质子的化学位移分别是：在末端木糖上1，3-联结 的阿拉伯呋喃糖苷H-1：5.26ppm；在内部木糖上1，3-联结的阿拉伯呋喃糖 苷H-1：5.32ppm。对于本发明，优选I1，3末端/I1，3内部比值为至少0.25，例如至 少0.30，至少0.40，至少0.50，乃至至少0.60的A型木聚糖酶。   表4.木聚糖酶特异性，在紧邻着分枝残基处切割或在未取代的木糖之   间切割的偏好性   I1，3末端/I1，3内部   Myceliophotora thermophila Xyl I   0.64   棘孢曲霉Xyl II   0.60   Humicola insolens Xyl III   0.30   棘孢曲霉Xyl I   0.28
实施例3.鉴定内切葡聚糖酶的特异性
通过与大麦β-葡聚糖共温育并分析降解产物来研究内切葡聚糖酶的特 异性。将分别含0.1和10μg/ml纯化的酶，以及5mg/ml大麦β-葡聚糖 (Megazyme，低粘度)，50mM乙酸钠，0.01％ Triton X-100，pH5.5的不 同Eppendorf管在搅动下在Eppendorf恒温混匀器中于50℃下保温。
受试的酶为来自Humicola insolens的内切葡聚糖酶EG I，来自Humicola insolens的内切葡聚糖酶EG III，来自Humicola insolens的内切葡聚糖酶EG IV，棘孢曲霉EG II(XG5，Cel12B)，和棘孢曲霉EG III(XG53，Cel12A)。
在1到21.5小时之间取样，并在95℃下加热30min使样品失活。将每 个样品的一半体积在50℃下，50mM MES，1mM氯化钙，pH6.5中用地 衣酶(lichenase)(0.085μg/ml，Megazyme，来自地衣芽孢杆菌)降解2 小时，然后在95℃下加热30min使地衣酶失活。将经过和未经过地衣酶处 理的样品用Milli Q水适当稀释，并在Dionex DX-500 HPAEC-PAD系统 (CarboPac PA-100柱；A缓冲液：150mM NaOH；B缓冲液：150mM NaOH+0.6M乙酸钠；流速：1ml/min；洗脱条件：0-3min：95％A+5％B；3-19 min：线性梯度：95％A+5％B到50％A+50％B；19-21min：线性梯度：50％ A+50％B到100％B；21-23min：100％B)上分析。纤维寡糖(DP1到DP6， 每种100μM)混合物被用作Dionex系统的参比，利用纤维寡糖(cellooligo) 标准品和已知的经过地衣酶处理的大麦β-葡聚糖的组成(例如，Izydorczyk， M.S.，Macri，L.J.，和MacGregor，A.W.，1997，Carbohydrate Polymers， 35，249-258)鉴别色谱图中的峰。利用由纤维寡糖标准品得到的响应因子， 并假设具有相同DP的含β-1，3键的寡糖具有相同的响应因子，对色谱图中 的峰进行了定量。对于大于DP6的寡糖，使用DP6的响应因子。
通过分析来自Humicola insolens的EG I所降解的产物(表5和6)， 发现该酶可以降解β-1，3和β-1，4键。最开始，纤维二糖，纤维三糖，从一 定程度上说还有昆布二糖(laminaribiose)，是地衣酶处理后增加的主要产物。 这暗示亚位点-4/-3，-5/-4和+1/+2上的葡萄糖单位之间的β-1，3键都被接受。 发现在最高的酶用量(10μg/ml)和最长的温育时间(21.5小时)下，生成 的主要产物是葡萄糖和纤维二糖。
使用来自Humicola insolens的EG III时，在21.5小时后，10μg/ml的 酶浓度下，主要产物是四糖(主要是Glu(β-1，4)Glu(β-1，3)Glu(β-1，4)Glu和 Glu(β-1，4)Glu(β-1，4)Glu(β-1，3)Glu，但不是 Glu(β-1，3)Glu(β-1，4)Glu(β-1，4)Glu)，五糖(可能主要是 Glu(β-1，3)Glu(β-1，4)Glu(β-1，4)Glu(β-1，3)Glu和 Glu(β-1，4)Glu(β-1，4)Glu(β-1，3)Glu(β-1，4)Glu)和更大的寡聚物。地衣酶处理 后的降解产物的组成显示该酶专一地降解β-葡聚糖中的β-1，4键。进一步地， 被水解的β-1，4键主要是那些没有被地衣酶降解的(在非还原端方向没有相 邻的β-1，3键)。即使以10μg/ml处理21.5小时后，经过地衣酶处理后的 Glu(β-1，4)Glu(β-1，3)Glu(“Lic3”)的量仍然没有显著减少，这暗示该酶对于在 β-1，3键之间只有两个β-1，4键的片段只有有限的活性。经过地衣酶处理后出 现了显著量的葡萄糖和昆布二糖，而非纤维三糖或纤维二糖，这暗示被接 受的β-1，3键是在亚位点-3/-2和+1/+2上的葡萄糖单位之间，而不是在位点 -4/-3或-5/-4上的葡萄糖单位之间。
来自Humicola insolens的EG IV酶主要将β-葡聚糖降解为较大的寡聚 物(表9和10)，但经过10μg/ml酶21.5小时的处理，生成了显著量的纤 维二糖和DP4的寡聚物(可能主要是Glu(β-1，4)Glu(β-1，3)Glu(β-1，4)Glu和 Glu(β-1，3)Glu(β-1，4)Glu(β-1，4)Glu)。该酶降解β-葡聚糖中相等量的β-1，4 和β-1，3键，而且被切割的β-1，4键似乎是那些在非还原端方向没有相邻的 β-1，3键的β-1，4键(和地衣酶不同)，EG IV有限水解以后用地衣酶处理使 纤维三糖增加，而纤维二糖和葡萄糖只有在更广泛的EG IV水解后才会出 现。这说明和亚位点-4/-3，尤其是-3/-2上的葡萄糖单位相比，亚位点-5/-4 上的葡萄糖单位之间的β-1，3键被更好地接受。地衣酶处理后昆布二糖的出 现说明亚位点+1/+2上的葡萄糖之间的β-1，3键也可被接受。
使用棘孢曲霉EGII(XG5，Cel12B)时，葡萄糖似乎是主要的低分子量 产物(表11和12)。对β-葡聚糖几乎没有被EG II降解的样品，地衣酶处 理使纤维二糖，纤维三糖和昆布二糖增加，但不使葡萄糖增加。这暗示被 接受的β-1，3键是在亚位点-5/-4，-4/-3或+1/+2上的葡萄糖单位之间，但可 能不是-3/-2上的葡萄糖单位之间。EG II释放的葡萄糖可能是通过对降解产 物的外切作用而释放的。该酶可以水解β-1，4和β-1，3键，尽管β-1，4键似乎 受到偏好。在最高的酶浓度下20小时后，可观察到β-葡聚糖几乎全部被降 解成了葡萄糖。
棘孢曲霉EG III(XG53，Cel12A)快速地降解β-葡聚糖产生DP4(主要 是Glu(β-1，3)Glu(β-1，4)Glu(β-1，4)Glu和Glu(β-1，3)Glu(β-1，4)Glu(β-1，4)Glu) 及DP5(主要是Glu(β-1，4)Glu(β-1，4)Glu(β-1，3)Glu(β-1，4)Glu，但还有一些 Glu(β-1，4)Glu(β-1，3)Glu(β-1，4)Glu(β-1，4)Glu和 Glu(β-l，4)Glu(β-1，4)Glu(β-1，4)Glu(β-1，3)Glu)的寡聚物(表13和14)。在 最高酶浓度下20小时后还生成了显著量的纤维二糖，葡萄糖和纤维三糖。 用地衣酶处理样品使葡萄糖，纤维三糖，昆布二糖，尤其是纤维二糖增加。 这暗示亚位点-4/-3上的葡萄糖单位之间的β-1，3键受到偏好，但亚位点 -5/-4，-3/-2，和+1/+2之间的β-1，3键也是可以被接受的。该酶可以降解β-1，4 和β-1，3键。   表5：内切葡聚糖酶Humicola insolens EG I降解大麦β-葡聚糖产物，表示为占降解产物的重量％   酶用量(μg/ml)   0.1   0.1   0.1   10   10   10   温育时间(小时)   1   2.5   21.5   1   2.5   21.5   Glu   0.10   0.28   0.35   3.68   15.45   40.96   Cel2   0.40   0.93   1.51   13.80   27.32   28.76   Cel3   0.69   1.64   2.38   9.91   6.00   0.00   Cel4   0.25   0.48   0.68   2.37   0.85   0.00   Cel5   0.00   0.40   0.35   1.66   0.11   0.00   Cel6   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   Lam2   0.00   0.00   0.13   0.07   0.06   2.12   DP3   0.63   0.00   0.06   0.86   3.51   5.33   DP4   0.00   0.00   0.08   1.29   4.40   4.13   DP5   0.87   2.38   3.65   22.91   23.44   9.14   DP6   1.12   2.66   4.50   16.08   4.16   3.41   DP＞6   95.93   91.23   86.30   27.38   14.70   6.16   Glu：葡萄糖.Celi：具有DPi的纤维寡糖.Lam2：昆布二糖.DPi：具有Dpi的寡糖，其葡萄糖单位间具有单独的β-1，3   键，其余为β-1，4键.DP＞6：由六个以上葡萄糖单位组成的寡糖.   表6.内切葡聚糖酶Humicola insolens EG I降解大麦β-葡聚糖及后续地衣酶降解的产物，表示为占降解产物的   重量％   酶用量(μg/ml)   0.1   0.1   0.1   10   10   10   温育时间(小时)   1   2.5   21.5   1   2.5   21.5   Glu   0.14   0.17   0.45   5.15   16.24   43.66   Cel2   3.38   4.99   10.09   36.73   43.18   35.48   Cel3   1.24   3.31   5.26   14.14   6.42   0.17   Cel4   0.21   0.79   1.39   3.79   0.90   0.00   Cel5   0.00   0.16   0.62   1.18   0.84   0.00   Cel6   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   Lam2   2.95   2.43   3.58   9.90   7.53   4.99   DP3   61.59   58.54   52.42   3.56   6.49   5.46   DP4   20.92   19.72   16.97   5.19   6.01   4.58   DP5   4.33   4.10   5.46   13.49   9.44   2.84   DP6   2.23   2.88   2.75   4.84   1.00   2.47   DP＞6   3.01   2.91   0.29   2.04   1.96   0.34   Glu：葡萄糖.Celi：具有DPi的纤维寡糖.Lam2：昆布二糖.DPi：具有Dpi的寡糖，其葡萄糖单位间具有单独的β-1，3   键，其余为β-1，4健.DP＞6：由六个以上葡萄糖单位组成的寡糖.   表7：内切葡聚糖酶Humicola insolens EG III降解大麦β-葡聚糖的结果，表示为占降解产物的重量％   酶用量(μg/ml)   0.1   0.1   0.1   10   10   10   温育时间(小时)   1   2.5   21.5   1   2.5   21.5   Glu   0.00   0.08   0.06   0.30   0.25   0.68   Cel2   0.00   0.00   0.00   0.08   0.01   0.53   Cel3   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   Cel4   0.00   0.00   0.00   0.00   0.03   0.00   Cel5   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   Ccl6   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   Lam2   0.00   0.00   0.00   0.00   0.03   0.24   DP3   1.07   0.00   0.00   0.66   0.05   0.00   DP4   0.00   0.14   0.53   5.99   7.95   39.08   DP5   0.78   0.00   0.75   4.50   6.68   25.08   DP6   0.00   0.00   0.36   1.26   1.92   7.08   DP＞6   98.15   99.78   98.29   87.22   83.09   27.31   Glu：葡萄糖.Celi：具有DPi的纤维寡糖.Lam2：昆布二糖.DPi：具有Dpi的寡糖，其葡萄糖单位间具有单独的β-1，3   键，其余为β-1，4键.DP＞6：由六个以上葡萄糖单位组成的寡糖   表8：内切葡聚糖酶Humicola insolens EG III降解大麦β-葡聚糖及后续地衣酶降解的结果，表示为占降解产物的   重量％   酶用量(μg/ml)   0.1   0.1   0.1   10   10   10   温育时间(小时)   1   2.5   21.5   1   2.5   21.5   Glu   0.15   0.29   1.37   6.70   14.43   13.80   Cel2   0.32   0.19   0.44   0.21   0.24   0.90   Cel3   1.03   0.00   2.01   0.93   0.45   0.15   Cel4   0.00   0.00   0.00   0.00   0.03   0.00   Cel5   0.80   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   Cel6   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   Lam2   4.10   1.26   2.10   7.43   13.20   13.77   “Lic3”   59.81   65.09   61.00   47.76   40.48   56.20   “Lic4”   22.63   23.12   21.54   18.78   7.08   9.72   “Lic5”   4.24   4.45   4.92   10.59   15.64   2.88   “Lic6”   3.91   2.82   3.67   3.28   2.90   2.05   “Lic7”   3.00   2.79   2.93   4.32   5.54   0.55   Glu：葡萄糖.Celi：具有DPi的纤维寡糖.Lam2：昆布二糖.DPi：具有Dpi的寡糖，其葡萄糖单位间具有单独的β-1，3   键，其余为β-1，4键.DP＞6：由六个以上葡萄糖单位组成的寡糖.   表9：内切葡聚糖酶Humicola insolens EG IV降解大麦β-葡聚糖的产物，表示为占降解产物的重量％Glu：葡萄糖   酶用量(μg/ml)   0.1   0.1   0.1   10   10   10   温育时间(小时)   1   25   21.5   1   2.5   21.5   Glu   0.00   0.00   0.00   0.13   0.63   0.66   Cel2   0.14   0.38   1.07   7.02   5.51   12.11   Cel3   0.09   0.19   0.77   2.89   1.72   1.02   Cel4   0.81   0.20   0.34   1.10   0.55   0.13   Cel5   0.15   0.28   0.30   0.00   0.00   0.00   Cel6   0.00   0.29   0.00   0.00   0.00   0.00   Lam2   0.00   0.00   0.00   0.00   0.04   0.16   DP3   0.00   0.00   0.00   0.68   0.00   0.11   DP4   0.00   0.00   0.00   1.03   1.83   12.77   DP5   0.18   0.21   0.07   0.59   0.71   3.25   DP6   0.00   0.13   0.26   5.78   6.04   2.44   DP＞6   98.63   98.32   97.20   80.77   82.96   67.36   Celi：具有DPi的纤维寡糖.Lam2：昆布二糖.DPi：具有Dpi的寡糖，其葡萄糖单位间具有单独的β-1，3键，其余为   β-1，4键.DP＞6：由六个以上葡萄糖单位组成的寡糖.   表10：内切葡聚糖酶Humicola insolens EG IV降解大麦β-葡聚糖及后续地衣酶降解的产物，表示为占降解产物   的重量％.   酶用量(μg/ml)   0.1   0.1   0.1   10   10   10   温育时间(小时)   1   2.5   21.5   1   2.5   21.5   Glu   0.07   0.05   0.09   1.83   2.93   7.24   Cel2   0.40   0.50   1.97   4.53   7.23   19.84   Cel3   1.45   2.05   5.59   11.84   12.00   6.94   Cel4   0.81   1.13   1.90   1.48   0.57   0.08   Cel5   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   Cel6   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   Lam2   2.10   3.92   3.82   5.43   7.41   11.87   DP3   63.45   61.92   60.26   54.03   47.65   30.59   DP4   22.95   23.32   21.96   16.11   11.03   15.88   DP5   4.97   4.99   3.46   3.03   2.51   4.01   DP6   3.82   0.20   0.49   0.11   3.04   1.00   DP＞6   0.00   1.93   0.47   1.60   5.62   2.55   Celi：具有DPi的纤维寡糖.Lam2：昆布二糖.DPi：具有Dpi的寡糖，其葡萄糖单位间具有单独的β-1，3键，其余   为β-1，4键.DP＞6：由六个以上葡萄糖单位组成的寡糖.   表11：内切葡聚糖酶棘孢曲霉EG II(XG5，Cel12B)降解大麦β-葡聚糖的产物，表示为占降解产物的重量％   酶用量(μg/ml)   0.16   0.16   16   16   温育时间(小时)   1   20   1   20   Glu   0.17   2.30   33.64   99.25   Cel2   0.00   0.00   0.54   0.00   Cel3   0.00   0.00   0.60   0.00   Cel4   0.00   0.00   0.52   0.00   Cel5   0.00   0.00   0.11   0.00   Cel6   0.00   0.00   0.00   0.00   Lam2   0.00   0.12   2.97   0.00   DP3   0.00   0.45   0.09   0.16   DP4   0.00   0.06   1.85   0.02   DP5   0.00   0.20   1.69   0.16   DP6   0.00   0.28   4.58   0.00   DP＞6   99.83   96.59   53.42   0.41   Glu：葡萄糖.Celi：具有DPi的纤维寡糖.Lam2：昆布二糖.DPi：具有Dpi的寡糖，其葡萄糖单位间具有单独的β-1，3   键，其余为β-1，4键.DP＞6：由六个以上葡萄糖单位组成的寡糖.   表12：内切葡聚糖酶棘孢曲霉EG II(XG5，Cel12B)降解大麦β-葡聚糖及后续地衣酶降解的产物，表示为占降解   产物的重量％   酶用量(μg/ml)   0.016   0.016   1.6   1.6   温育时间(小时)   1   20   1   20   Glu   0.20   2.21   26.22   99.53   Cel2   4.88   0.61   1.31   0.00   Cel3   3.76   3.44   4.10   0.00   Cel4   0.00   0.20   0.82   0.00   Cel5   0.00   0.88   0.00   0.00   Cel6   0.00   0.00   0.00   0.00   Lam2   0.17   2.17   9.95   0.00   DP3   61.15   59.72   36.11   0.27   DP4   23.43   21.49   14.35   0.04   DP5   3.82   3.83   3.38   0.16   DP6   0.08   2.52   2.20   0.00   DP＞6   2.51   2.94   1.55   0.00   Glu：葡萄糖.Celi：具有DPi的纤维寡糖.Lam2：昆布二糖.DPi：具有Dpi的寡糖，其葡萄糖单位间具有单独的β-1，3   键，其余为β-1，4键.DP＞6：由六个以上葡萄糖单位组成的寡糖   表13：内切葡聚糖酶棘孢曲霉EG III(XG53，Cel12A)降解大麦β-葡聚糖的产物，表示为占降解产物的重量％   酶用量(μg/ml)   0.1   0.1   10   10   温育时间(小时)   1   20   1   20   Glu   0.05   0.23   1.42   13.28   Cel2   0.09   0.78   4.20   20.68   Cel3   0.15   1.21   2.69   7.57   Cel4   0.17   0.91   1.19   0.00   Cel5   0.08   0.00   0.00   0.00   Cel6   0.00   0.00   0.00   0.00   Lam2   0.00   0.15   0.25   0.03   DP3   0.33   0.16   0.00   0.42   DP4   0.28   8.71   40.77   33.42   DP5   1.24   15.49   30.18   20.94   DP6   0.79   6.69   0.26   1.65   DP＞6   96.83   65.67   19.04   2.01   Glu：葡萄糖.Celi：具有DPi的纤维寡糖.Lam2：昆布二糖.DPi：具有Dpi的寡糖，其葡萄糖单位间具有单独的β-1，3   键，其余为β-1，4键.DP＞6：由六个以上葡萄糖单位组成的寡糖.   表14：内切葡聚糖酶棘孢曲霉EG III(XG5，Cel12A)降解大麦β-葡聚糖及后续地衣酶降解的产物，表示为占降   解产物的重量％   酶用量(μg/ml)   0.1   0.1   10   10   温育时间(小时)   1   20   1   20   Glu   1.08   6.84   7.12   16.22   Cel2   3.37   16.31   21.82   30.46   Cel3   3.90   5.25   4.40   7.66   Cel4   0.70   2.35   0.65   0.03   Cel5   0.58   0.00   0.00   0.10   Cel6   0.00   1.22   0.00   0.00   Lam2   4.12   16.93   16.24   5.07   DP3   57.22   33.12   6.11   0.99   DP4   18.69   12.16   38.91   35.81   DP5   4.39   1.46   2.41   2.62   DP6   3.44   2.16   0.26   0.78   DP＞6   2.51   2.19   2.08   0.26   Glu：葡萄糖.Celi：具有DPi的纤维寡糖.Lam2：昆布二糖.DPi：具有Dpi的寡糖，其葡萄糖单位间具有单独的β-1，3   键，其余为β-1，4键.DP＞6：由六个以上葡萄糖单位组成的寡糖.
实施例4.糖化和过滤性能
将常规标准处理：Ultraflo2.7mg EP/kg干物质(dm)麦芽粉(系数 1,000)与实验处理：添加多种内切葡聚糖酶的Ultraflo1.4mg EP/kg dm麦 芽粉作比较。0.2g Ultraflo/kg dm麦芽粉相当于2.7mg酶蛋白/kg dm麦芽 粉。   表15.Humicola insolens EG I内切葡聚糖酶(Cel 7b，GH 7)和Humicola insolens EG V内切葡聚糖酶(Cel   45a，GH45)的作用   β-葡聚糖   提取物   粘度   过滤性   最佳性能   Ultraflo2.7mg EP/kg dm   1.000   1.000   1.000   1.000   -   Ultraflo1.4mg EP/kg dm+HI   EG I 1,25mg EP/kg dm   1.184   0.997   1.032   0.904   -   Ultraflo1.4mg EP/kg dm+HI   EG V 1,25mg EP/kg dm   2.986   0.996   1.033   0.865   -   Ultraflo1.4mg EP/kg dm+HI   EG I 8mg EP/kg dm   0.377   0.992   1.021   0.962  **β-葡聚糖   Ultraflo1.4mg EP/kg dm+HI   EG V 8mg EP/kg dm   3.262   1.000   1.055   0.865   -   β-葡聚糖(n＝4)，提取物％(n＝4，基于干物质)，粘度(n＝4，换算为8,6柏拉图度，cP)，过滤性(n＝2)   10min后
与标准处理(系数1.000)相比，添加了H.insolens EG I，Cel 7b(GH 7)8 mg EP/kg dm的Ultraflo1.4mg EP/kg dm减少了β-葡聚糖。   表16.Humicola insolens EGIII内切葡聚糖酶(Cel 12a，GH12)和Humicola insolens EG IV内切葡聚糖酶   (Cel 5a，GH 12)的作用   β-葡聚   糖   OD   提取物   粘度   过滤性   最佳性能   Ultraflo2.7mgEP/kg dm   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   -   Ultraflo1.4mg EP/kg dm   +HI EG IV 1,25mg EP/kg dm   3.019   0.975   1.002   1.002   0.979   -   Ultraflo1.4mg EP/kg dm   +HI EG III 1,25mg EP/kg dm   0.628   0.949   1.000   0.999   0.957   -   U1traflo1.4mg EP/kg dm   +HI EG IV 8,0mg EP/kg dm   2.045   1.013   0.999   1.006   1.085   -   Ultraflo1.4mg EP/kg dm   +Hl EG III 8,0mg EP/kg dm   0.341   0.937   1.003   0.938   1.085  ***   β-葡聚糖，   粘度，过滤   性   β-葡聚糖(n＝4)，提取物％(n＝4.基于干物质)，粘度(n＝4，换算为8,6柏拉图度，cP)，过滤性(n＝2)   10min后
与标准处理相比，H.insolens，内切葡聚糖酶III，(Cel12a，GH12)加 Ultraflo1.4mg EP/kg dm降低了β-葡聚糖，O.D和粘度，还改善了过滤性。   表17.橙色热子囊菌内切葡聚糖酶(GH 5)的作用   β-葡聚糖   OD   提取物   粘度   过滤性   最佳性能   U1traflo2.7mg EP/kg dm   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   Ultraflo1.4mg EP/kg dm+   AT EG 5 1,25mg EP/kg dm   1.627   1.065   1.002   1.015   1.037   Ultraflo1.4mg EP/kg dm+   ATEG 8mg EP/kg dm   0.432   1.033   1.001   1.017   1.000  **   β-葡聚糖   β-葡聚糖(n＝4)，提取物％(n＝4，基于干物质)，粘度(n＝4，换算为8,6°柏拉图度(Plato)，cP)，过滤性   (n＝2)10min后
与标准处理相比，添加了橙色热子囊菌内切葡聚糖酶BG025(GH 5) 的Ultraflo1.4mg EP/kg dm显著地降低了β-葡聚糖水平。
将常规标准处理：Ultraflo0.2g/kg DM麦芽粉(系数1.000)与实验处 理：添加多种木聚糖酶的Ultraflo0.1g/kg DM麦芽粉作比较。
来自真菌Bh和Cc的两种GH11，B型木聚糖酶中的任何一种对于β-葡 聚糖，OD，提取物回收率，粘度和过滤性都没有任何正作用。   表18.Bh木聚糖酶B(GH 11，B型)和Cc木聚糖酶II(GH 11，B型)的作用   β-葡聚糖   OD   提取物   粘度   过滤性   最佳性   能   Ultraflo2.7mg EP/kg dm   1.000   1.000   1.000   1.000   1,000   -   Ultraflo1.4mg EP/kg dm+   BH XYL 0,7mg EP/kg dm   3.223   1.100   1.000   1.032   1.082   -   Ultraflo1.4mg EP/kg dm+   CC XYL II 0,7mg EP/kg dm   3.279   1.025   0.998   1.028   1.012   -   Ultraflo1.4mg EP/kg dm+   BH XYL B 5mg EP/kg dm   3.231   1.025   1.000   1.048   1,035   -   Ultraflo1.4mg EP/kg dm+   CC XYL II 5mg EP/kg dm   3.213   1.038   1.003   1.030   1.082   -   β-葡聚糖(n＝4)，提取物％(n＝4，基于干物质)，粘度(n＝4，换算为8,6柏拉图度，cP)，过滤性(n＝2)10min   后   表19.棘孢曲霉木聚糖酶I(GH10，A型)和Myceliophotora thermophila木聚糖酶III(GH 11，B型)的作用.   β-葡聚糖   OD   提取物   粘度   过滤性   最佳性能   Ultraflo2.7mg EP/kg dm   1.000   1.000   1000   1.000   1,000   -   Ultraflo1.4mg EP/kg dm+ AA   XYL 1 5mg EP/kg dm   3.401   1.125   1.006   0.981   1,143  ***粘度，过滤性   Ultraflo1.4mg EP/kg dm+MT   XYL II 5mg EP/kg dm   3.740   0.990   1.005   1.019   0,939   -   Ultraflo1.4mg EP/kg dm+AA   XYL I 0,7mg EP/kg dm   3.894   1.010   1.006   1.006   0,980   -   Ultraflo1.4mg EP/kg dm+MT   XYL II 0,7mg EP/kg dm   3.218   0.927   1.007   1.020   0,776   -   β-葡聚糖(n＝4)，提取物％(n＝4，基于干物质)，粘度(n＝4，换算为8,6柏拉图度，cP)，过滤性(n＝2)10min   后   表20.Thermomyces lanuginosus木聚糖酶(GH 11，B型)和棘孢曲霉木聚糖酶II(GH10，A型)的作用.   β-葡聚糖   提取物   粘度   过滤性   最佳性能   Ultraflo2.7mg EP/kg dm   1.000   1.000   1.000   1.000   -   Ultraflo1.4mg EP/kg dm+   AA XYL II 0,7mg EP/kg dm   2.296   1.002   0.985   0.981   -   Ultraflo1.4mg EP/kg dm+   TL XYL 0,7mg EP/kg dm   2.375   0.994   1.015   0.868   -   Ultraflo1.4mg EP/kg dm+   AA XYL II 5mg EP/kg dm   2.152   1.000   0.970   1.075  ***粘度，过滤性   Ultraflo1.4mg EP/kg dm+   TL XYL 5mg EP/kg dm   2.357   1.004   1.032   0.906   -   β-葡聚糖(n＝4)，提取物％(n＝4，基于干物质)，粘度(n＝4，换算为8,6柏拉图度，cP)，过滤性(n＝2)10min   后
与标准处理相比较，棘孢曲霉木聚糖酶I和棘孢曲霉木聚糖酶II降低了 粘度并改善了过滤性。
将常规标准处理：Ultraflo0.2g/kg dm麦芽粉(系数1.000)与实验处 理：添加了棘孢曲霉木聚糖酶II和多种内切葡聚糖酶的Ultraflo0.1g/kg 和0g/kg dm麦芽粉作比较。   表21.棘孢曲霉β-葡聚糖酶EGI(XG 5)和棘孢曲霉内切葡聚糖酶EGIII(XG53)与棘孢曲霉木聚糖酶II和/或   Viscozyme内切葡聚糖酶组合物联合使用的作用   β-葡聚糖   提取物   粘度   过滤性   最佳性能   Ultraflo：2.7mg EP/kg dm   1000   1.000   1000   1.000   AA EG II 4mg EP/kg dm   AA XYL II 4mg EP/kg dm   Viscozyme1.7mg EP/kg dm   5.795   0.997   0.981   1.140   AA EG III 1mg EP/kg dm   AA XYL II 4mg EP/kg dm   Viscozyme1.7mg EP/kg dm   2.631   1.000   0.964   1.118  **   粘度，过滤性   AA EG III 2mg EP/kg dm   AA XYL II 4mg EP/kg dm   Viscozyme1.7mg EP/kg dm   1.317   1.003   0.955   1.011   AA EG III 4mg EP/kg dm，   AA XYL II 4mg EP/kg dm   0.918   1.004   0.956   1.236  ***   β-葡聚糖，粘   度，过滤性   AA EG II 8mg EP/kg dm   AA XYL II 4mg EP/kg dm   6.601   1.003   0.977   1.096   β-葡聚糖(n＝4)，提取物％(n＝4，基于干物质)，粘度(n＝4，换算为8,6柏拉图度，cP)，过滤性(n＝2)10   min后
棘孢曲霉木聚糖酶II和棘孢曲霉内切葡聚糖EG III的联合使用对于β- 葡聚糖，粘度和过滤性有着显著的作用。  表22.递增量的Viscozyme与本发明的组合物的比较。绝对值。   β-葡聚糖   OD   提取物％   粘度  Viscozyme3.6mg EP/kg dm   189   0.030   85.0   1.38  Viscozyme9mg EP/kg dm   155   0.030   85.0   1.35  Viscozyme13.5mg EP/kg dm   127   0.031   85.2   1.34  Viscozyme18mg EP/kg dm   101   0.028   85.5   1.32  Viscozyme27mg EP/kg dm   75   0.030   85.7   1.30  Viscozyme3.6mg EP/kg dm AA  EG III 2mg EP/kg dm  AA XYL II 4mgEP/kg dm   0   0.030   85.8   1.22  β-葡聚糖(mg/l，n＝4)，提取物％(n＝4，干麦芽中的提取物，％(m/m))，粘度(n＝4，换算为8,6  柏拉图度，cP)
含有Viscozyme3.6mg EP/kg dm，棘孢曲霉EG III 2mg EP/kg dm，和 棘孢曲霉木聚糖酶II 4mg EP/kg dm的组合物对于β-葡聚糖，粘度，提取物 回收率和过滤性的正作用显著地大于相当于常规标准剂量7.5倍的剂量的 Viscozyme(标准剂量＝3.6mg EP/kg dm)(表22)。
实施例5.SDS-PAGE凝胶中蛋白质条带的定量
将酶组合物用去离子水稀释250倍，加样到4-20％Tris-甘氨酸 SDS-PAGE凝胶上(Nu Page，Invitrogen)，按照生产商的说明进行电泳。
电泳完毕后用GelCode Blue(Pierce)染色过夜，然后在水中脱色至背 景变得清晰。
将由此得到的凝胶用光密度仪扫描，并用Amersham Biosciences的 ImageMasterTM v.10软件，按照生产商提供的标准操作规程进行分析。结果 用特定泳道中总密度的％条带密度表示。
酶样品中的总蛋白量用Pierce的Micro BCA试剂盒，按照试剂盒提供的 标准操作规程进行测定。
                            序列表
<110>诺维信公司(Novozymes A/S)
<120>糖化工艺
<130>10429.204-W0
<160>20
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>332
<212>PRT
<213>棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)
<400>1
Met Lys Leu Leu Asn Leu Leu Val Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala
1               5                   10                  15
Val Ala Ala Pro Thr His Glu His Thr Lys Arg Ala Ser Val Phe Glu
            20                  25                  30
Trp Ile Gly Ser Asn Glu Ser Asp Ala Glu Phe Gly Thr Ala Ile Pro
        35                  40                  45
Gly Thr Trp Gly Ile Asp Tyr Ile Phe Pro Asp Thr Ser Ala Ile Ala
    50                  55                  60
Thr Leu Val Ser Lys Gly Met Asn Ile Phe Arg Val Gln Phe Met Met
65                  70                  75                  80
Glu Arg Leu Val Pro Asn Ser Met Thr Gly Ser Tyr Asp Asp Ala Tyr
                85                  90                  95
Leu Asn Asn Leu Thr Thr Val Val Asn Ala Ile Ala Ala Ala Gly Val
            100                 105                 110
His Ala Ile Val Asp Pro His Asn Tyr Gly Arg Tyr Asn Asn Glu Ile
        115                 120                 125
Ile Ser Ser Thr Ala Asp Phe Gln Thr Phe Trp Gln Asn Leu Ala Gly
    130                 135                 140
Gln Phe Lys Asp Asn Asp Leu Val Ile Phe Asp Thr Asn Asn Glu Tyr
145                 150                 155                 160
Asn Thr Met Asp Gln Thr Leu Val Leu Asp Leu Asn Gln Ala Ala Ile
                165                 170                 175
Asp Gly Ile Arg Ala Ala Gly Ala Thr Ser Gln Tyr Ile Phe Ala Glu
            180                 185                 190
Gly Asn Ser Trp Ser Gly Ala Trp Thr Trp Ala Asp Ile Asn Asp Asn
        195                 200                 205
Met Lys Ala Leu Thr Asp Pro Gln Asp Lys Leu Val Tyr Glu Met His
    210                 215                 220
Gln Tyr Leu Asp Ser Asp Gly Ser Gly Thr Ser Gly Val Cys Val Ser
225                 230                 235                 240
Glu Thr Ile Gly Ala Glu Arg Leu Gln Ala Ala Thr Gln Trp Leu Lys
                245                 250                 255
Asp Asn Gly Lys Val Asp Ile Leu Gly Glu Tyr Ala Gly Gly Ala Asn
            260                 265                 270
Asp Val Cys Arg Thr Ala Ile Ala Gly Met Leu Glu Tyr Met Ala Asn
        275                 280                 285
Asn Thr Asp Val Trp Lys Gly Ala Val Trp Trp Thr Ala Gly Pro Trp
    290                 295                 300
Trp Ala Asp Tyr Met Phe Ser Met Glu Pro Pro Ser Gly Pro Ala Tyr
305                 310                 315                 320
Ser Gly Met Leu Asp Val Leu Glu Pro Tyr Leu Gly
                325                 330
<210>2
<211>238
<212>PRT
<213>棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)
<400>2
Met Lys Leu Ser Leu Leu Ser Leu Ala Thr Leu Ala Ser Ala Ala Ser
1               5                   10                  15
Leu Gln Arg Arg Ser Asp Phe Cys Gly Gln Trp Asp Thr Ala Thr Ala
            20                  25                  30
Gly Asp Phe Thr Leu Tyr Asn Asp Leu Trp Gly Glu Ser Ala Gly Thr
        35                  40                  45
Gly Ser Gln Cys Thr Gly Val Asp Ser Tyr Ser Gly Asp Thr Ile Ala
    50                  55                  60
Trp His Thr Ser Trp Ser Trp Ser Gly Gly Ser Ser Ser Val Lys Ser
65                  70                  75                  80
Tyr Val Asn Ala Ala Leu Thr Phe Thr Pro Thr Gln Leu Asn Cys Ile
                85                  90                  95
Ser Ser Ile Pro Thr Thr Trp Lys Trp Ser Tyr Ser Gly Ser Ser Ile
            100                 105                 110
Val Ala Asp Val Ala Tyr Asp Thr Phe Leu Ala Glu Thr Ala Ser Gly
        115                 120                 125
Ser Ser Lys Tyr Glu Ile Met Val Trp Leu Ala Ala Leu Gly Gly Ala
    130                 135                 140
Gly Pro Ile Ser Ser Thr Gly Ser Thr Ile Ala Thr Pro Thr Ile Ala
145                 150                 155                 160
Gly Val Asn Trp Lys Leu Tyr Ser Gly Pro Asn Gly Asp Thr Thr Val
                165                 170                 175
Tyr Ser Phe Val Ala Asp Ser Thr Thr Glu Ser Phe Ser Gly Asp Leu
            180                 185                 190
Asn Asp Phe Phe Thr Tyr Leu Val Asp Asn Glu Gly Val Ser Asp Glu
        195                 200                 205
Leu Tyr Leu Thr Thr Leu Glu Ala Gly Thr Glu Pro Phe Thr Gly Ser
    210                 215                 220
Asn Ala Lys Leu Thr Val Ser Glu Tyr Ser Ile Ser Ile Glu
225                 230                 235
<210>3
<211>435
<212>PRT
<213>Humicola insolens
<400>3
Met Ala Arg Gly Thr Ala Leu Leu Gly Leu Thr Ala Leu Leu Leu Gly
1               5                   10                  15
Leu Val Asn Gly Gln Lys Pro Gly Glu Thr Lys Glu Val His Pro Gln
            20                  25                  30
Leu Thr Thr Phe Arg Cys Thr Lys Arg Gly Gly Cys Lys Pro Ala Thr
        35                  40                  45
Asn Phe Ile Val Leu Asp Ser Leu Ser His Pro Ile His Arg Ala Glu
    50                  55                  60
Gly Leu Gly Pro Gly Gly Cys Gly Asp Trp Gly Asn Pro Pro Pro Lys
65                  70                  75                  80
Asp Val Cys Pro Asp Val Glu Ser Cys Ala Lys Asn Cys Ile Met Glu
                85                  90                  95
Gly Ile Pro Asp Tyr Ser Gln Tyr Gly Val Thr Thr Asn Gly Thr Ser
            100                 105                 110
Leu Arg Leu Gln His Ile Leu Pro Asp Gly Arg Val Pro Ser Pro Arg
        115                 120                 125
Val Tyr Leu Leu Asp Lys Thr Lys Arg Arg Tyr Glu Met Leu His Leu
    130                 135                 140
Thr Gly Phe Glu Phe Thr Phe Asp Val Asp Ala Thr Lys Leu Pro Cys
145                 150                 155                 160
Gly Met Asn Ser Ala Leu Tyr Leu Ser Glu Met His Pro Thr Gly Ala
                165                 170                 175
Lys Ser Lys Tyr Asn Pro Gly Gly Ala Tyr Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys
            180                 185                 190
Asp Ala Gln Cys Phe Val Thr Pro Phe Ile Asn Gly Leu Gly Asn Ile
        195                 200                 205
Glu Gly Lys Gly Ser Cys Cys Asn Clu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn
    210                 215                 220
Ser Arg Ala Ser His Val Ala Pro His Thr Cys Asn Lys Lys Gly Leu
225                 230                 235                 240
Tyr Leu Cys Glu Gly Glu Glu Cys Ala Phe Glu Gly Val Cys Asp Lys
                245                 250                 255
Asn Gly Cys Gly Trp Asn Asn Tyr Arg Val Asn Val Thr Asp Tyr Tyr
            260                 265                 270
Gly Arg Gly Glu Glu Phe Lys Val Asn Thr Leu Lys Pro Phe Thr Val
        275                 280                 285
Val Thr Gln Phe Leu Ala Asn Arg Arg Gly Lys Leu Glu Lys Ile His
    290                 295                 300
Arg Phe Tyr Val Gln Asp Gly Lys Val Ile Glu Ser Phe Tyr Thr Asn
305                 310                 315                 320
Lys Glu Gly Val Pro Tyr Thr Asn Met Ile Asp Asp Glu Phe Cys Glu
                325                 330                 335
Ala Thr Gly Ser Arg Lys Tyr Met Glu Leu Gly Ala Thr Gln Gly Met
            340                 345                 350
Gly Glu Ala Leu Thr Arg Gly Met Val Leu Ala Met Ser Ile Trp Trp
        355                 360                 365
Asp Gln Gly Gly Asn Met Glu Trp Leu Asp His Gly Glu Ala Gly Pro
    370                 375                 380
Cys Ala Lys Gly Glu Gly Ala Pro Ser Asn Ile Val Gln Val Glu Pro
385                 390                 395                 400
Phe Pro Glu Val Thr Tyr Thr Asn Leu Arg Trp Gly Glu Ile Gly Ser
                405                 410                 415
Thr Tyr Gln Glu Val Gln Lys Pro Lys Pro Lys Pro Gly His Gly Pro
            420                 425                 430
Arg Ser Asp
        435
<210>4
<211>254
<212>PRT
<213>Humicola insolens
<400>4
Met Leu Lys Ser Ala Leu Leu Leu Gly Pro Ala Ala Val Ser Val Gln
1               5                   10                  15
Ser Ala Ser Ile Pro Thr Ile Pro Ala Asn Leu Glu Pro Arg Gln Ile
            20                  25                  30
Arg Ser Leu Cys Glu Leu Tyr Gly Tyr Trp Ser Gly Asn Gly Tyr Glu
        35                  40                  45
Leu Leu Asn Asn Leu Trp Gly Lys Asp Thr Ala Thr Ser Gly Trp Gln
    50                  55                  60
Cys Thr Tyr Leu Asp Gly Thr Asn Asn Gly Gly Ile Gln Trp Ser Thr
65                  70                  75                  80
Ala Trp Glu Trp Gln Gly Ala Pro Asp Asn Val Lys Ser Tyr Pro Tyr
                85                  90                  95
Val Gly Lys Gln Ile Gln Arg Gly Arg Lys Ile Ser Asp Ile Asn Ser
            100                 105                 110
Met Arg Thr Ser Val Ser Trp Thr Tyr Asp Arg Thr Asp Ile Arg Ala
        115                 120                 125
Asn Val Ala Tyr Asp Val Phe Thr Ala Arg Asp Pro Asp His Pro Asn
    130                 135                 140
Trp Gly Gly Asp Tyr Glu Leu Met Ile Trp Leu Ala Arg Tyr Gly Gly
145                 150                 155                 160
Ile Tyr Pro Ile Gly Thr Phe His Ser Gln Val Asn Leu Ala Gly Arg
                165                 170                 175
Thr Trp Asp Leu Trp Thr Gly Tyr Asn Gly Asn Met Arg Val Tyr Ser
            180                 185                 190
Phe Leu Pro Pro Ser Gly Asp Ile Arg Asp Phe Ser Cys Asp Ile Lys
        195                 200                 205
Asp Phe Phe Asn Tyr Leu Glu Arg Asn His Gly Tyr Pro Ala Arg Glu
    210                 215                 220
Gln Asn Leu Ile Val Tyr Gln Val Gly Thr Glu Cys Phe Thr Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ala Arg Phe Thr Cys Arg Asp Phe Arg Ala Asp Leu Trp
                245                 250
<210>5
<211>388
<212>PRT
<213>Humicola insolens
<400>5
Met Lys His Ser Val Leu Ala Gly Leu Phe Ala Thr Gly Ala Leu Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Gly Ala Trp Gln Gln Cys Gly Gly Val Gly Phe Ser Gly Ser
            20                  25                  30
Thr Ser Cys Val Ser Gly Tyr Thr Cys Val Tyr Leu Asn Asp Trp Tyr
        35                  40                  45
Ser Gln Cys Gln Pro Gln Pro Thr Thr Leu Arg Thr Thr Thr Thr Pro
    50                  55                  60
Gly Ala Thr Ser Thr Thr Arg Ser Ala Pro Ala Ala Thr Ser Thr Thr
65                  70                  75                  80
Pro Ala Lys Gly Lys Phe Lys Trp Phe Gly Ile Asn Gln Ser Cys Ala
                85                  90                  95
Glu Phe Gly Lys Gly Glu Tyr Pro Gly Leu Trp Gly Lys His Phe Thr
            100                 105                 110
Phe Pro Ser Thr Ser Ser Ile Gln Thr His Ile Asn Asp Gly Phe Asn
        115                 120                 125
Met Phe Arg Val Ala Phe Ser Met Glu Arg Leu Ala Pro Asn Gln Leu
    130                 135                 140
Asn Ala Ala Phe Asp Ala Asn Tyr Leu Arg Asn Leu Thr Glu Thr Val
145                 150                 155                 160
Asn Phe Ile Thr Gly Lys Gly Lys Tyr Ala Met Leu Asp Pro His Asn
                165                 170                 175
Phe Gly Arg Tyr Tyr Glu Arg Ile Ile Thr Asp Lys Ala Ala Phe Ala
            180                 185                 190
Ser Phe Phe Thr Lys Leu Ala Thr His Phe Ala Ser Asn Pro Leu Val
        195                 200                 205
Val Phe Asp Thr Asn Asn Glu Tyr His Asp Met Asp Gln Gln Leu Val
    210                 215                 220
Phe Asp Leu Asn Gln Ala Ala Ile Asp Ala Ile Arg Ala Ala Gly Ala
225                 230                 235                 240
Thr Ser Gln Tyr Ile Met Val Glu Gly Asn Ser Trp Thr Gly Ala Trp
                245                 250                 255
Thr Trp Asn Val Thr Asn Asn Asn Leu Ala Ala Leu Arg Asp Pro Glu
            260                 265                 270
Asn Lys Leu Val Tyr Gln Met His Gln Tyr Leu Asp Ser Asp Gly Ser
        275                 280                 285
Gly Thr Ser Thr Ala Cys Val Ser Thr Gln Val Gly Leu Gln Arg Val
    290                 295                 300
Ile Gly Ala Thr Asn Trp Leu Arg Gln Asn Gly Lys Val Gly Leu Leu
305                 310                 315                 320
Gly Glu Phe Ala Gly Gly Ala Asn Ser Val Cys Gln Gln Ala Ile Glu
                325                 330                 335
Gly Met Leu Thr His Leu Gln Glu Asn Ser Asp Val Trp Thr Gly Ala
            340                 345                 350
Leu Trp Trp Ala Gly Gly Pro Trp Trp Gly Asp Tyr Ile Tyr Ser Phe
        355                 360                 365
Glu Pro Pro Ser Gly Ile Gly Tyr Thr Tyr Tyr Asn Ser Leu Leu Lys
    370                 375                 380
Lys Tyr Val Pro
385
<210>6
<211>305
<212>PRT
<213>Humicola insolens
<400>6
Met Arg Ser Ser Pro Leu Leu Arg Ser Ala Val Val Ala Ala Leu Pro
1               5                   10                  15
Val Leu Ala Leu Ala Ala Asp Gly Arg Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys
            20                  25                  30
Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp Ala Lys Lys Ala Pro Val Asn Gln Pro
        35                  40                  45
Val Phe Ser Cys Asn Ala Asn Phe Gln Arg Ile Thr Asp Phe Asp Ala
    50                  55                  60
Lys Ser Gly Cys Glu Pro Gly Gly Val Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln
65                  70                  75                  80
Thr Pro Trp Ala Val Asn Asp Asp Phe Ala Leu Gly Phe Ala Ala Thr
                85                  90                  95
Ser Ile Ala Gly Ser Asn Glu Ala Gly Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu
            100                 105                 110
Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Lys Met Val Val Gln
        115                 120                 125
Ser Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn His Phe Asp Leu Asn
    130                 135                 140
Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gln Phe
145                 150                 155                 160
Gly Gly Leu Pro Gly Gln Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Asn Glu
                165                 170                 175
Cys Asp Arg Phe Pro Asp Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe
            180                 185                 190
Asp Trp Phe Lys Asn Ala Asp Asn Pro Ser Phe Ser Phe Arg Gln Val
        195                 200                 205
Gln Cys Pro Ala Glu Leu Val Ala Arg Thr Gly Cys Arg Arg Asn Asp
    210                 215                 220
Asp Gly Asn Phe Pro Ala Val Gln Ile Pro Ser Ser Ser Thr Ser Ser
225                 230                 235                 240
Pro Val Asn Gln Pro Thr Ser Thr Ser Thr Thr Ser Thr Ser Thr Thr
                245                 250                 255
Ser Ser Pro Pro Val Gln Pro Thr Thr Pro Ser Gly Cys Thr Ala Glu
            260                 265                 270
Arg Trp Ala Gln Cys Gly Gly Asn Gly Trp Ser Gly Cys Thr Thr Cys
        275                 280                 285
Val Ala Gly Ser Thr Cys Thr Lys Ile Asn Asp Trp Tyr His Gln Cys
    290                 295                 300
Leu
305
<210>7
<211>335
<212>PRT
<213>橙色热子囊菌(thermoascus aurantiacus)
<400>7
Met Lys Leu Gly Ser Leu Val Leu Ala Leu Ser Ala Ala Arg Leu Thr
1               5                   10                  15
Leu Ser Ala Pro Leu Ala Asp Arg Lys Gln Glu Thr Lys Arg Ala Lys
            20                  25                  30
Val Phe Gln Trp Phe Gly Ser Asn Glu Ser Gly Ala Glu Phe Gly Ser
        35                  40                  45
Gln Asn Leu Pro Gly Val Glu Gly Lys Asp Tyr Ile Trp Pro Asp Pro
    50                  55                  60
Asn Thr Ile Asp Thr Leu Ile Ser Lys Gly Met Asn Ile Phe Arg Val
65                  70                  75                  80
Pro Phe Met Met Glu Arg Leu Val Pro Asn Ser Met Thr Gly Ser Pro
                85                  90                  95
Asp Pro Asn Tyr Leu Ala Asp Leu Ile Ala Thr Val Asn Ala Ile Thr
            100                 105                 110
Gln Lys Gly Ala Tyr Ala Val Val Asp Pro His Asn Tyr Gly Arg Tyr
        115                 120                 125
Tyr Asn Ser Ile Ile Ser Ser Pro Ser Asp Phe Gln Thr Phe Trp Lys
    130                 135                 140
Thr Val Ala Ser Gln Phe Ala Ser Asn Pro Leu Val Ile Phe Asp Thr
145                 150                 155                 160
Asn Asn Glu Tyr His Asp Met Asp Gln Thr Leu Val Leu Asn Leu Asn
                165                 170                 175
Gln Ala Ala Ile Asp Gly Ile Arg Ser Ala Gly Ala Thr Ser Gln Tyr
            180                 185                 190
Ile Phe Val Glu Gly Asn Ser Trp Thr Gly Ala Trp Thr Trp Thr Asn
        195                 200                 205
Val Asn Asp Asn Met Lys Ser Leu Thr Asp Pro Ser Asp Lys Ile Ile
    210                 215                 220
Tyr Glu Met His Gln Tyr Leu Asp Ser Asp Gly Ser Gly Thr Ser Ala
225                 230                 235                 240
Thr Cys Val Ser Ser Thr Ile Gly Gln Glu Arg Ile Thr Ser Ala Thr
                245                 250                 255
Gln Trp Leu Arg Ala Asn Gly Lys Lys Gly Ile Ile Gly Glu Phe Ala
            260                 265                 270
Gly Gly Ala Asn Asp Val Cys Glu Thr Ala Ile Thr Gly Met Leu Asp
        275                 280                 285
Tyr Met Ala Gln Asn Thr Asp Val Trp Thr Gly Ala Ile Trp Trp Ala
    290                 295                 300
Ala Gly Pro Trp Trp Gly Asp Tyr Ile Phe Ser Met Glu Pro Asp Asn
305                 310                 315                 320
Gly Ile Ala Tyr Gln Gln Ile Leu Pro Ile Leu Thr Pro Tyr Leu
                325                 330                 335
<210>8
<211>327
<212>PRT
<213>棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)
<400>8
Met Val Gln Ile Lys Ala Ala Ala Leu Ala Val Leu Phe Ala Ser Asn
1               5                   10                  15
Val Leu Ser Asn Pro Ile Glu Pro Arg Gln Ala Ser Val Ser Ile Asp
            20                  25                  30
Ala Lys Phe Lys Ala His Gly Lys Lys Tyr Leu Gly Thr Ile Gly Asp
        35                  40                  45
Gln Tyr Thr Leu Asn Lys Asn Ala Lys Thr Pro Ala Ile Ile Lys Ala
    50                  55                  60
Asp Phe Gly Gln Leu Thr Pro Glu Asn Ser Met Lys Trp Asp Ala Thr
65                  70                  75                  80
Glu Pro Asn Arg Gly Gln Phe Ser Phe Ser Gly Ser Asp Tyr Leu Val
                85                  90                  95
Asn Phe Ala Gln Ser Asn Gly Lys Leu Ile Arg Gly His Thr Leu Val
            100                 105                 110
Trp His Ser Gln Leu Pro Ser Trp Val Gln Ser Ile Ser Asp Lys Asn
        115                 120                 125
Thr Leu Ile Gln Val Met Gln Asn His Ile Thr Thr Val Met Gln Arg
    130                 135                 140
Tyr Lys Gly Lys Val Tyr Ala Trp Asp Val Val Asn Glu Ile Phe Asn
145                 150                 155                 160
Glu Asp Gly Ser Leu Cys Gln Ser His Phe Tyr Asn Val Ile Gly Glu
                165                 170                 175
Asp Tyr Val Arg Ile Ala Phe Glu Thr Ala Arg Ala Val Asp Pro Asn
            180                 185                 190
Ala Lys Leu Tyr Ile Asn Asp Tyr Asn Leu Asp Ser Ala Ser Tyr Pro
        195                 200                 205
Lys Leu Thr Gly Leu Val Asn His Val Lys Lys Trp Val Ala Ala Gly
    210                 215                 220
Val Pro Ile Asp Gly Ile Gly Ser Gln Thr His Leu Ser Ala Gly Ala
225                 230                 235                 240
Gly Ala Ala Val Ser Gly Ala Leu Asn Ala Leu Ala Gly Ala Gly Thr
                245                 250                 255
Lys Glu Val Ala Ile Thr Glu Leu Asp Ile Ala Gly Ala Ser Ser Thr
            260                 265                 270
Asp Tyr Val Asn Val Val Lys Ala Cys Leu Asn Gln Pro Lys Cys Val
        275                 280                 285
Gly Ile Thr Val Trp Gly Ser Ser Asp Pro Asp Ser Trp Arg Ser Ser
    290                 295                 300
Ser Ser Pro Leu Leu Phe Asp Ser Asn Tyr Asn Pro Lys Ala Ala Tyr
305                 310                 315                 320
Thr Ala Ile Ala Asn Ala Leu
                325
<210>9
<211>406
<212>PRT
<213>棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)
<400>9
Met Val Gly Leu Leu Ser Ile Thr Ala Ala Leu Ala Ala Thr Val Leu
1               5                   10                  15
Pro Asn Ile Val Ser Ala Val Gly Leu Asp Gln Ala Ala Val Ala Lys
            20                  25                  30
Gly Leu Gln Tyr Phe Gly Thr Ala Thr Asp Asn Pro Glu Leu Thr Asp
        35                  40                  45
Ile Pro Tyr Val Thr Gln Leu Asn Asn Thr Ala Asp Phe Gly Gln Ile
    50                  55                  60
Thr Pro Gly Asn Ser Met Lys Trp Asp Ala Thr Glu Pro Ser Gln Gly
65                  70                  75                  80
Thr Phe Thr Phe Thr Lys Gly Asp Val Ile Ala Asp Leu Ala Glu Gly
                85                  90                  95
Asn Gly Gln Tyr Leu Arg Cys His Thr Leu Val Trp Tyr Asn Gln Leu
            100                 105                 110
Pro Ser Trp Val Thr Ser Gly Thr Trp Thr Asn Ala Thr Leu Thr Ala
        115                 120                 125
Ala Leu Lys Asn His Ile Thr Asn Val Val Ser His Tyr Lys Gly Lys
    130                 135                 140
Cys Leu His Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Leu Asn Asp Asp Gly Thr
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Thr Asn Ile Phe Tyr Thr Thr Ile Gly Glu Ala Tyr Ile Pro
                165                 170                 175
Ile Ala Phe Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asp Pro Asp Ala Lys Leu Phe
            180                 185                 190
Tyr Asn Asp Tyr Asn Leu Glu Tyr Gly Gly Ala Lys Ala Ala Ser Ala
        195                 200                 205
Arg Ala Ile Val Gln Leu Val Lys Asn Ala Gly Ala Lys Ile Asp Gly
    210                 215                 220
Val Gly Leu Gln Ala His Phe Ser Val Gly Thr Val Pro Ser Thr Ser
225                 230                 235                 240
Ser Leu Val Ser Val Leu Gln Ser Phe Thr Ala Leu Gly Val Glu Val
                245                 250                 255
Ala Tyr Thr Glu Ala Asp Val Arg Ile Leu Leu Pro Thr Thr Ala Thr
            260                 265                 270
Thr Leu Ala Gln Gln Ser Ser Asp Phe Gln Ala Leu Val Gln Ser Cys
        275                 280                 285
Val Gln Thr Thr Gly Cys Val Gly Phe Thr Ile Trp Asp Trp Thr Asp
    290                 295                 300
Lys Tyr Ser Trp Val Pro Ser Thr Phe Ser Gly Tyr Gly Ala Ala Leu
305                 310                 315                 320
Pro Trp Asp Glu Asn Leu Val Lys Lys Pro Ala Tyr Asn Gly Leu Leu
                325                 330                 335
Ala Gly Met Gly Val Thr Val Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ala
            340                 345                 350
Thr Ala Thr Gly Lys Thr Thr Thr Thr Thr Thr Gly Ala Thr Ser Thr
        355                 360                 365
Gly Thr Thr Ala Ala His Trp Gly Gln Cys Gly Gly Leu Asn Trp Ser
    370                 375                 380
Gly Pro Thr Ala Cys Ala Thr Gly Tyr Thr Cys Thr Tyr Val Asn Asp
385                 390                 395                 400
Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu
                405
<210>10
<211>231
<212>PRT
<213>棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)
<400>10
Met Ala Arg Leu Ser Gln Phe Leu Leu Ala Cys Ala Leu Ala Val Lys
1               5                   10                  15
Ala Phe Ala Ala Pro Ala Ala Glu Pro Val Glu Glu Arg Gly Pro Asn
            20                  25                  30
Phe Phe Ser Ala Leu Ala Gly Arg Ser Thr Gly Ser Ser Thr Gly Tyr
        35                  40                  45
Ser Asn Gly Tyr Tyr Tyr Ser Phe Trp Thr Asp Gly Ala Ser Gly Asp
    50                  55                  60
Val Glu Tyr Ser Asn Gly Ala Gly Gly Ser Tyr Ser Val Thr Trp Ser
65                  70                  75                  80
Ser Ala Ser Asn Phe Val Gly Gly Lys Gly Trp Asn Pro Gly Ser Ala
                85                  90                  95
His Asp Ile Thr Tyr Ser Gly Ser Trp Thr Ser Thr Gly Asn Ser Asn
            100                 105                 110
Ser Tyr Leu Ser Val Tyr Gly Trp Thr Thr Gly Pro Leu Val Glu Tyr
        115                 120                 125
Tyr Ile Leu Glu Asp Tyr Gly Glu Tyr Asn Pro Gly Ser Ala Gly Thr
    130                 135                 140
Tyr Lys Gly Ser Val Tyr Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Asn Ile Tyr Thr
145                 150                 155                 160
Ala Thr Arg Thr Asn Ala Pro Ser Ile Gln Gly Thr Ala Thr Phe Thr
                165                 170                 175
Gln Tyr Trp Ser Ile Arg Gln Thr Lys Arg Val Gly Gly Thr Val Thr
            180                 185                 190
Thr Ala Asn His Phe Asn Ala Trp Ala Lys Leu Gly Met Asn Leu Gly
        195                 200                 205
Thr His Asn Tyr Gln Ile Val Ala Thr Glu Gly Tyr Tyr Ser Ser Gly
    210                 215                 220
Ser Ala Ser Ile Thr Val Ala
225                 230
<210>11
<211>227
<212>PRT
<213>Humicola insolens
<400>11
Met Val Ser Leu Lys Ser Val Leu Ala Ala Ala Thr Ala Val Ser Ser
1               5                   10                  15
Ala Ile Ala Ala Pro Phe Asp Phe Val Pro Arg Asp Asn Ser Thr Ala
            20                  25                  30
Leu Gln Ala Arg Gln Val Thr Pro Asn Ala Glu Gly Trp His Asn Gly
        35                  40                  45
Tyr Phe Tyr Ser Trp Trp Ser Asp Gly Gly Gly Gln Val Gln Tyr Thr
    50                  55                  60
Asn Leu Glu Gly Ser Arg Tyr Gln Val Arg Trp Arg Asn Thr Gly Asn
65                  70                  75                  80
Phe Val Gly Gly Lys Gly Trp Asn Pro Gly Thr Gly Arg Thr Ile Asn
                85                  90                  95
Tyr Gly Gly Tyr Phe Asn Pro Gln Gly Asn Gly Tyr Leu Ala Val Tyr
            100                 105                 110
Gly Trp Thr Arg Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Val Ile Glu Ser Tyr
        115                 120                 125
Gly Thr Tyr Asn Pro Gly Ser Gln Ala Gln Tyr Lys Gly Thr Phe Tyr
    130                 135                 140
Thr Asp Gly Asp Gln Tyr Asp Ile Phe Val Ser Thr Arg Tyr Asn Gln
145                 150                 155                 160
Pro Ser Ile Asp Gly Thr Arg Thr Phe Gln Gln Tyr Trp Ser Ile Arg
                165                 170                 175
Lys Asn Lys Arg Val Gly Gly Ser Val Asn Met Gln Asn His Phe Asn
            180                 185                 190
Ala Trp Gln Gln His Gly Met Pro Leu Gly Gln His Tyr Tyr Gln Val
        195                 200                 205
Val Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Glu Ser Asp Ile Tyr Val
    210                 215                 220
Gln Thr His
225
<210>12
<211>389
<212>PRT
<213>Humicola  insolens
<400>12
Met Arg Ser Ile Ala Leu Ala Leu Ala Ala Ala Pro Ala Val Leu Ala
1               5                   10                  15
Gln Ser Gln Leu Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Trp Asn Gly Pro
            20                  25                  30
Thr Thr Cys Val Ser Gly Ala Thr Cys Thr Lys Ile Asn Asp Trp Tyr
        35                  40                  45
His Gln Cys Leu Pro Gly Gly Asn Asn Asn Asn Pro Pro Pro Ala Thr
    50                  55                  60
Thr Ser Gln Trp Thr Pro Pro Pro Ala Gln Thr Ser Ser Asn Pro Pro
65                  70                  75                  80
Pro Thr Gly Gly Gly Gly Gly Asn Thr Leu His Glu Lys Phe Lys Ala
                85                  90                  95
Arg Gly Lys Gln Tyr Phe Gly Thr Glu Ile Asp His Tyr His Leu Asn
            100                 105                 110
Asn Asn Gln Leu Met Glu Ile Ala Arg Arg Glu Phe Gly Gln Ile Thr
        115                 120                 125
His Glu Asn Ser Met Lys Trp Asp Ala Thr Glu Pro Ser Arg Gly Ser
    130                 135                 140
Phe Ser Phe Gly Asn Ala Asp Arg Val Val Asp Trp Ala Thr Ser Asn
145                 150                 155                 160
Gly Lys Leu Ile Arg Gly His Thr Leu Leu Trp His Ser Gln Leu Pro
                165                 170                 175
Gln Trp Val Gln Asn Ile Asn Asp Arg Asn Thr Leu Thr Gln Val Ile
            180                 185                 190
Glu Asn His Val Arg Thr Val Met Thr Arg Tyr Lys Gly Lys Ile Phe
        195                 200                 205
His Tyr Asp Val Val Asn Glu Ile Leu Asp Glu Asn Gly Gly Leu Arg
    210                 215                 220
Asn Ser Val Phe Ser Arg Val Leu Gly Glu Asp Phe Val Gly Ile Ala
225                 230                 235                 240
Phe Arg Ala Ala Arg Ala Ala Asp Pro Asp Ala Lys Leu Tyr Ile Asn
                245                 250                 255
Asp Tyr Asn Leu Asp Ser Ala Asn Tyr Ala Lys Thr Arg Gly Met Ile
            260                 265                 270
Asn Leu Val Asn Lys Trp Val Ser Gln Gly Val Pro Ile Asp Gly Ile
        275                 280                 285
Gly Thr Gln Ala His Leu Ala Gly Pro Gly Gly Trp Asn Pro Ala Ser
    290                 295                 300
Gly Val Pro Ala Ala Leu Gln Ala Leu Ala Gly Ala Asn Val Lys Glu
305                 310                 315                 320
Val Ala Ile Thr Glu Leu Asp Ile Gln Gly Ala Gly Ala Asn Asp Tyr
                325                 330                 335
Val Thr Val Ala Asn Ala Cys Leu Asn Val Gln Lys Cys Val Gly Ile
            340                 345                 350
Thr Val Trp Gly Val Ser Asp Arg Asp Thr Trp Arg Ser Asn Glu Asn
        355                 360                 365
Pro Leu Leu Tyr Asp Arg Asp Tyr Arg Pro Lys Ala Ala Tyr Asn Ala
    370                 375                 380
Leu Met Asn Ala Leu
385
<210>13
<211>375
<212>PRT
<213>Myceliophthora thermophila
<400>13
Met His Leu Ser Ser Ser Leu Leu Leu Leu Ala Ala Leu Pro Leu Gly
1               5                   10                  15
Ile Ala Gly Lys Gly Lys Gly His Gly His Gly Pro His Thr Gly Leu
            20                  25                  30
His Thr Leu Ala Lys Gln Ala Gly Leu Lys Tyr Phe Gly Ser Ala Thr
        35                  40                  45
Asp Ser Pro Gly Gln Arg Glu Arg Ala Gly Tyr Glu Asp Lys Tyr Ala
    50                  55                  60
Gln Tyr Asp Gln Ile Met Trp Lys Ser Gly Glu Phe Gly Leu Thr Thr
65                  70                  75                  80
Pro Thr Asn Gly Gln Lys Trp Leu Phe Thr Glu Pro Glu Arg Gly Val
                85                  90                  95
Phe Asn Phe Thr Glu Gly Asp Ile Val Thr Asn Leu Ala Arg Lys His
            100                 105                 110
Gly Phe Met Gln Arg Cys His Ala Leu Val Trp His Ser Gln Leu Ala
        115                 120                 125
Pro Trp Val Glu Ser Thr Glu Trp Thr Pro Glu Glu Leu Arg Gln Val
    130                 135                 140
Ile Val Asn His Ile Thr His Val Ala Gly Tyr Tyr Lys Gly Lys Cys
145                 150                 155                 160
Tyr Ala Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Leu Asn Glu Asp Gly Thr Tyr
                165                 170                 175
Arg Glu Ser Val Phe Tyr Lys Val Leu Gly Glu Asp Tyr Ile Lys Leu
            180                 185                 190
Ala Phe Glu Thr Ala Ala Lys Val Asp Pro His Ala Lys Leu Tyr Tyr
        195                 200                 205
Asn Asp Tyr Asn Leu Glu Ser Pro Ser Ala Lys Thr Glu Gly Ala Lys
    210                 215                 220
Arg Ile Val Lys Met Leu Lys Asp Ala Gly Ile Arg Ile Asp Gly Val
225                 230                 235                 240
Gly Leu Gln Ala His Leu Val Ala Glu Ser His Pro Thr Leu Asp Glu
                245                 250                 255
His Ile Asp Ala Ile Lys Gly Phe Thr Glu Leu Gly Val Glu Val Ala
            260                 265                 270
Leu Thr Glu Leu Asp Ile Arg Leu Ser Ile Pro Ala Asn Ala Thr Asn
        275                 280                 285
Leu Ala Gln Gln Arg Glu Ala Tyr Lys Asn Val Val Gly Ala Cys Val
    290                 295                 300
Gln Val Arg Gly Cys Ile Gly Val Glu Ile Trp Asp Phe Tyr Asp Pro
305                 310                 315                 320
Phe Ser Trp Val Pro Ala Thr Phe Pro Gly Gln Gly Ala Pro Leu Leu
                325                 330                 335
Trp Phe Glu Asp Phe Ser Lys His Pro Ala Tyr Asp Gly Val Val Glu
            340                 345                 350
Ala Leu Thr Asn Arg Thr Thr Gly Gly Cys Lys Gly Lys Gly Lys Gly
        355                 360                 365
Lys Gly Lys Val Trp Lys Ala
    370                 375
<210>14
<211>226
<212>PRT
<213>Myceliophthora thermophila
<400>14
Met Val Thr Leu Thr Arg Leu Ala Val Ala Ala Ala Ala Met Ile Ser
1               5                   10                  15
Ser Thr Gly Leu Ala Ala Pro Thr Pro Glu Ala Gly Pro Asp Leu Pro
            20                  25                  30
Asp Phe Glu Leu Gly Val Asn Asn Leu Ala Arg Arg Ala Leu Asp Tyr
        35                  40                  45
Asn Gln Asn Tyr Arg Thr Ser Gly Asn Val Asn Tyr Ser Pro Thr Asp
    50                  55                  60
Asn Gly Tyr Ser Val Ser Phe Ser Asn Ala Gly Asp Phe Val Val Gly
65                  70                  75                  80
Lys Gly Trp Arg Thr Gly Ala Thr Arg Asn Ile Thr Phe Ser Gly Ser
                85                  90                  95
Thr Gln His Thr Ser Gly Thr Val Leu Val Ser Val Tyr Gly Trp Thr
            100                 105                 110
Arg Asn Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Val Gln Glu Tyr Thr Ser Asn Gly
        115                 120                 125
Ala Gly Ser Ala Gln Gly Glu Lys Leu Gly Thr Val Glu Ser Asp Gly
    130                 135                 140
Gly Thr Tyr Glu Ile Trp Arg His Gln Gln Val Asn Gln Pro Ser Ile
145                 150                 155                 160
Glu Gly Thr Ser Thr Phe Trp Gln Tyr Ile Ser Asn Arg Val Ser Gly
                165                 170                 175
Gln Arg Pro Asn Gly Gly Thr Val Thr Leu Ala Asn His Phe Ala Ala
            180                 185                 190
Trp Gln Lys Leu Gly Leu Asn Leu Gly Gln His Asp Tyr Gln Val Leu
        195                 200                 205
Ala Thr Glu Gly Trp Gly Asn Ala Gly Gly Ser Ser Gln Tyr Thr Val
    210                 215                 220
Ser Gly
225
<210>15
<211>225
<212>PRT
<213>Thermomyces lanuginosus
<400>15
Met Val Gly Phe Thr Pro Val Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ala Thr Gly
1               5                   10                  15
Ala Leu Ala Phe Pro Ala Gly Asn Ala Thr Glu Leu Glu Lys Arg Gln
            20                  25                  30
Thr Thr Pro Asn Ser Glu Gly Trp His Asp Gly Tyr Tyr Tyr Ser Trp
        35                  40                  45
Trp Ser Asp Gly Gly Ala Gln Ala Thr Tyr Thr Asn Leu Glu Gly Gly
    50                  55                  60
Thr Tyr Glu Ile Ser Trp Gly Asp Gly Gly Asn Leu Val Gly Gly Lys
65                  70                  75                  80
Gly Trp Asn Pro Gly Leu Asn Ala Arg Ala Ile His Phe Glu Gly Val
                85                  90                  95
Tyr Gln Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Ala Val Tyr Gly Trp Thr Arg
            100                 105                 110
Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Asn Phe Gly Thr Tyr Asp
        115                 120                 125
Pro Ser Ser Gly Ala Thr Asp Leu Gly Thr Val Glu Cys Asp Gly Ser
    130                 135                 140
Ile Tyr Arg Leu Gly Lys Thr Thr Arg Val Asn Ala Pro Ser Ile Asp
145                 150                 155                 160
Gly Thr Gln Thr Phe Asp Gln Tyr Trp Ser Val Arg Gln Asp Lys Arg
                165                 170                 175
Thr Ser Gly Thr Val Gln Thr Gly Cys His Phe Asp Ala Trp Ala Arg
            180                 185                 190
Ala Gly Leu Asn Val Asn Gly Asp His Tyr Tyr Gln Ile Val Ala Thr
        195                 200                 205
Glu Gly Tyr Phe Ser Ser Gly Tyr Ala Arg Ile Thr Val Ala Asp Val
    210                 215                 220
Gly
225
<210>16
<211>237
<212>PRT
<213>棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)
<400>16
Met Lys Ala Phe Tyr Phe Leu Ala Ser Leu Ala Gly Ala Ala Val Ala
1               5                   10                  15
Gln Gln Thr Gln Leu Cys Asp Gln Tyr Ala Thr Tyr Thr Gly Ser Val
            20                  25                  30
Tyr Thr Ile Asn Asn Asn Leu Trp Gly Lys Asp Ala Gly Ser Gly Ser
        35                  40                  45
Gln Cys Thr Thr Val Asn Ser Ala Ser Ser Ala Gly Thr Ser Trp Ser
    50                  55                  60
Thr Lys Trp Asn Trp Ser Gly Gly Glu Asn Ser Val Lys Ser Tyr Ala
65                  70                  75                  80
Asn Ser Gly Leu Ser Phe Asn Lys Lys Leu Val Ser Gln Ile Ser Arg
                85                  90                  95
Ile Pro Thr Ala Ala Gln Trp Ser Tyr Asp Asn Thr Gly Ile Arg Ala
            100                 105                 110
Asp Val Ala Tyr Asp Leu Phe Thr Ala Ala Asp Ile Asn His Val Thr
        115                 120                 125
Trp Ser Gly Asp Tyr Glu Leu Met Ile Trp Leu Ala Arg Tyr Gly Gly
    130                 135                 140
Val Gln Pro Leu Gly Ser Lys Ile Ala Thr Ala Thr Val Glu Gly Gln
145                 150                 155                 160
Thr Trp Glu Leu Trp Tyr Gly Val Asn Gly Ala Gln Lys Thr Tyr Ser
                165                 170                 175
Phe Val Ala Pro Thr Pro Ile Thr Ser Phe Gln Gly Asp Val Asn Asp
            180                 185                 190
Phe Phe Lys Tyr Leu Thr Gln Asn His Gly Phe Pro Ala Ser Ser Gln
        195                 200                 205
Tyr Leu Ile Thr Leu Gln Phe Gly Thr Glu Pro Phe Thr Gly Gly Pro
    210                 215                 220
Ala Thr Leu Thr Val Ser Asp Trp Ser Ala Ser Val Gln
225                 230                 235
<210>17
<211>347
<212>PRT
<213>T.reesei
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(347)
<400>17
Met Lys Ala Asn Val Ile Leu Cys Leu Leu Ala Pro Leu Val Ala Ala
1               5                   10                  15
Leu Pro Thr Glu Thr Ile His Leu Asp Pro Glu Leu Ala Ala Leu Arg
            20                  25                  30
Ala Asn Leu Thr Glu Arg Thr Ala Asp Leu Trp Asp Arg Gln Ala Ser
        35                  40                  45
Gln Ser Ile Asp Gln Leu Ile Lys Arg Lys Gly Lys Leu Tyr Phe Gly
    50                  55                  60
Thr Ala Thr Asp Arg Gly Leu Leu Gln Arg Glu Lys Asn Ala Ala Ile
65                  70                  75                  80
Ile Gln Ala Asp Leu Gly Gln Val Thr Pro Glu Asn Ser Met Lys Trp
                85                  90                  95
Gln Ser Leu Glu Asn Asn Gln Gly Gln Leu Asn Trp Gly Asp Ala Asp
            100                 105                 110
Tyr Leu Val Asn Phe Ala Gln Gln Asn Gly Lys Ser Ile Arg Gly His
        115                 120                 125
Thr Leu Ile Trp His Ser Gln Leu Pro Ala Trp Val Asn Asn Ile Asn
    130                 135                 140
Asn Ala Asp Thr Leu Arg Gln Val Ile Arg Thr His Val Ser Thr Val
145                 150                 155                 160
Val Gly Arg Tyr Lys Gly Lys Ile Arg Ala Trp Asp Val Val Asn Glu
                165                 170                 175
Ile Phe Asn Glu Asp Gly Thr Leu Arg Ser Ser Val Phe Ser Arg Leu
            180                 185                 190
Leu Gly Glu Glu Phe Val Ser Ile Ala Phe Arg Ala Ala Arg Asp Ala
        195                 200                 205
Asp Pro Ser Ala Arg Leu Tyr Ile Asn Asp Tyr Asn Leu Asp Arg Ala
    210                 215                 220
Asn Tyr Gly Lys Val Asn Gly Leu Lys Thr Tyr Val Ser Lys Trp Ile
225                 230                 235                 240
Ser Gln Gly Val Pro Ile Asp Gly Ile Gly Ser Gln Ser His Leu Ser
                245                 250                 255
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Gly Ala Leu Gln Gln Leu Ala Thr
            260                 265                 270
Val Pro Val Thr Glu Leu Ala Ile Thr Glu Leu Asp Ile Gln Gly Ala
        275                 280                 285
Pro Thr Thr Asp Tyr Thr Gln Val Val Gln Ala Cys Leu Ser Val Ser
    290                 295                 300
Lys Cys Val Gly Ile Thr Val Trp Gly Ile Ser Asp Lys Asp Ser Trp
305                 310                 315                 320
Arg Ala Ser Thr Asn Pro Leu Leu Phe Asp Ala Asn Phe Asn Pro Lys
                325                 330                 335
Pro Ala Tyr Asn Ser Ile Val Gly Ile Leu Gln
            340                 345
<210>18
<211>419
<212>PRT
<213>T.reesei
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(419)
<400>18
Met Asn Lys Pro Met Ser Ser Leu Leu Leu Ala Ala Thr Leu Leu Ala
1               5                   10                  15
Gly Gly Ser Ile Ala Gln Gln Thr Val Trp Gly Gln Cys Gly Gly Gln
            20                  25                  30
Gly Trp Ser Gly Pro Thr Ser Cys Val Ala Gly Ser Ala Cys Ser Thr
        35                  40                  45
Leu Asn Pro Tyr Tyr Ala Gln Cys Ile Pro Gly Ala Thr Thr Met Ser
    50                  55                  60
Thr Thr Thr Lys Pro Thr Ser Val Ser Ala Ser Thr Thr Arg Ala Ser
65                  70                  75                  80
Ala Thr Ser Ser Ala Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Leu Thr Arg Phe
                85                  90                  95
Ala Gly Val Asn Ile Ala Gly Phe Asp Phe Gly Cys Gly Thr Asp Gly
            100                 105                 110
Thr Cys Val Thr Ser Lys Val Tyr Pro Pro Leu Lys Asn Tyr Ala Gly
        115                 120                 125
Thr Asn Asn Tyr Pro Asp Gly Val Gly Gln Met Gln His Phe Val Asn
    130                 135                 140
Asp Asp Lys Leu Thr Ile Phe Arg Leu Pro Val Gly Trp Gln Tyr Leu
145                 150                 155                 160
Val Asn Asn Asn Leu Gly Gly Thr Leu Asp Ser Asn Asn Phe Gly Lys
                165                 170                 175
Tyr Asp Gln Leu Val Gln Ala Cys Leu Ser Leu Gly Val Tyr Cys Ile
            180                 185                 190
Val Asp Ile His Asn Tyr Ala Arg Trp Asn Gly Gly Ile Ile Gly Gln
        195                 200                 205
Gly Gly Pro Thr Asn Asp Gln Phe Thr Ser Leu Trp Ser Gln Leu Ala
    210                 215                 220
Gln Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Lys Val Trp Phe Gly Ile Met Asn Glu
225                 230                 235                 240
Pro His Asp Val Asn Ile Asn Thr Trp Ala Thr Thr Val Gln Ala Val
                245                 250                 255
Val Thr Ala Ile Arg Asn Ala Gly Ala Thr Ser Gln Phe Ile Ser Leu
            260                 265                 270
Pro Gly Asn Asp Trp Gln Ser Ala Gly Ala Phe Ile Ser Asp Gly Ser
        275                 280                 285
Ala Ala Ala Leu Ser Gln Val Lys Asn Pro Asp Gly Ser Thr Pro Asn
    290                 295                 300
Leu Ile Phe Asp Leu His Lys Tyr Leu Asp Ser Asp Asn Ser Gly Thr
305                 310                 315                 320
His Ala Asp Cys Val Thr Asn Asn Val Asn Asp Ala Phe Ser Pro Val
                325                 330                 335
Ala Thr Trp Leu Arg Gln Asn Asn Arg Gln Ala Ile Leu Thr Glu Thr
            340                 345                 350
Gly Gly Gly Asn Thr Gln Ser Cys Ile Gln Tyr Leu Cys Gln Gln Phe
        355                 360                 365
Gln Tyr Ile Asn Gln Asn Ser Asp Val Tyr Leu Gly Tyr Val Gly Trp
    370                 375                 380
Gly Ala Gly Ser Phe Asp Ser Thr Tyr Ile Leu Thr Glu Thr Pro Thr
385                 390                 395                 400
Gly Ser Gly Ser Ser Trp Thr Asp Thr Ser Leu Val Ser Ser Cys Ile
                405                 410                 415
Ser Arg Lys
<210>19
<211>459
<212>PRT
<213>绿色木霉(T.viride)
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(459)
<400>19
Met Ala Pro Ser Val Thr Leu Pro Leu Thr Thr Ala Ile Leu Ala Ile
1               5                   10                  15
Ala Arg Leu Val Ala Ala Gln Gln Pro Gly Thr Ser Thr Pro Glu Val
            20                  25                  30
His Pro Lys Leu Thr Thr Tyr Lys Cys Thr Lys Ser Gly Gly Cys Val
        35                  40                  45
Ala Gln Asp Thr Ser Val Val Leu Asp Trp Asn Tyr Arg Trp Met His
    50                  55                  60
Asp Ala Asn Tyr Asn Ser Cys Thr Val Asn Gly Gly Val Asn Thr Thr
65                  70                  75                  80
Leu Cys Pro Asp Glu Ala Thr Cys Gly Lys Asn Cys Phe Ile Glu Gly
                85                  90                  95
Val Asp Tyr Ala Ala Ser Gly Val Thr Thr Ser Gly Ser Ser Leu Thr
            100                 105                 110
Met Asn Gln Tyr Met Pro Ser Ser Ser Gly Gly Tyr Ser Ser Val Ser
        115                 120                 125
Pro Arg Leu Tyr Leu Leu Asp Ser Asp Gly Glu Tyr Val Met Leu Lys
    130                 135                 140
Leu Asn Gly Gln Glu Leu Ser Phe Asp Val Asp Leu Ser Ala Leu Pro
145                 150                 155                 160
Cys Gly Glu Asn Gly Ser Leu Tyr Leu Ser Gln Met Asp Glu Asn Gly
                165                 170                 175
Gly Ala Asn Gln Tyr Asn Thr Ala Gly Ala Asn Tyr Gly Ser Gly Tyr
            180                 185                 190
Cys Asp Ala Gln Cys Pro Val Gln Thr Trp Arg Asn Gly Thr Leu Asn
        195                 200                 205
Thr Ser His Gln Gly Phe Cys Cys Asn Glu Met Asp Ile Leu Glu Gly
    210                 215                 220
Asn Ser Arg Ala Asn Ala Leu Thr Pro His Ser Cys Thr Ala Thr Ala
225                 230                 235                 240
Cys Asp Ser Ala Gly Cys Gly Phe Asn Pro Tyr Gly Ser Gly Tyr Lys
                245                 250                 255
Ser Tyr Tyr Gly Pro Gly Asp Thr Val Asp Thr Ser Lys Thr Phe Thr
            260                 265                 270
Ile Ile Thr Gln Phe Asn Thr Asp Asn Gly Ser Pro Ser Gly Asn Leu
        275                 280                 285
Val Gly Ile Thr Arg Lys Tyr Gln Gln Asn Gly Val Asp Ile Pro Ser
    290                 295                 300
Ala Gln Pro Gly Gly Asp Thr Ile Ser Ser Cys Pro Ser Ala Ser Ala
305                 310                 315                 320
Tyr Gly Gly Leu Ala Thr Met Gly Lys Ala Leu Ser Ser Gly Met Val
                325                 330                 335
Leu Val Phe Ser Ile Trp Asn Asp Asn Ser Gln Tyr Met Asn Trp Leu
            340                 345                 350
Asp Ser Gly Asn Ala Gly Pro Cys Ser Ser Thr Glu Gly Asn Pro Ser
        355                 360                 365
Asn Ile Leu Ala Asn Asn Pro Asn Thr His Val Val Phe Ser Asn Ile
    370                 375                 380
Arg Trp Gly Asp Ile Gly Ser Thr Thr Asn Ser Thr Ala Pro Pro Pro
385                 390                 395                 400
Pro Pro Ala Ser Ser Thr Thr Phe Ser Thr Thr Arg Arg Ser Ser Thr
                405                 410                 415
Thr Ser Ser Ser Pro Ser Cys Thr Gln Thr His Trp Gly Gln Cys Gly
            420                 425                 430
Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Cys Lys Thr Cys Thr Ser Gly Thr Thr Cys
        435                 440                 445
Gln Tyr Ser Asn Asp Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu
    450                 455
<210>20
<211>232
<212>PRT
<213>T.reesei
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(232)
<400>20
Met Lys Phe Leu Gln Val Leu Pro Ala Leu Ile Pro Ala Ala Leu Ala
1               5                   10                  15
Gln Thr Ser Cys Asp Gln Trp Ala Thr Phe Thr Gly Asn Gly Tyr Thr
            20                  25                  30
Val Ser Asn Asn Leu Trp Gly Ala Ser Ala Gly Ser Gly Phe Gly Cys
        35                  40                  45
Val Thr Ala Val Ser Leu Ser Gly Gly Ala His Ala Asp Trp Gln Trp
    50                  55                  60
Ser Gly Gly Gln Asn Asn Val Lys Ser Tyr Gln Asn Ser Gln Ile Ala
65                  70                  75                  80
Ile Pro Gln Lys Arg Thr Val Asn Ser Ile Ser Ser Met Pro Thr Thr
                85                  90                  95
Ala Ser Trp Ser Tyr Ser Gly Ser Asn Ile Arg Ala Asn Val Ala Tyr
            100                 105                 110
Asp Leu Phe Thr Ala Ala Asn Pro Asn His Val Thr Tyr Ser Gly Asp
        115                 120                 125
Tyr Glu Leu Met Ile Trp Leu Gly Lys Tyr Gly Asp Ile Gly Pro Tle
    130                 135                 140
Gly Ser Ser Gln Gly Thr Val Asn Val Gly Gly Gln Ser Trp Thr Leu
145                 150                 155                 160
Tyr Tyr Gly Tyr Asn Gly Ala Met Gln Val Tyr Ser Phe Val Ala Gln
                165                 170                 175
Thr Asn Thr Thr Asn Tyr Ser Gly Asp Val Lys Asn Phe Phe Asn Tyr
            180                 185                 190
Leu Arg Asp Asn Lys Gly Tyr Asn Ala Ala Gly Gln Tyr Val Leu Ser
        195                 200                 205
Tyr Gln Phe Gly Thr Glu Pro Phe Thr Gly Ser Gly Thr Leu Asn Val
    210                 215                 220
Ala Ser Trp Thr Ala Ser Ile Asn
225                 230