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用酶催化合成药物L-多巴的方法

阅读：112发布：2021-02-22

IPRDB可以提供用酶催化合成药物L-多巴的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明属于药物L-多巴的制取技术领域。为解决现有技术中很难通过生物催化合成制取药物L-多巴的技术问题，本发明提供一种用酶催化合成药物L-多巴的方法。该方法以L-酪氨酸为原料，通过无载体固定化酪氨酸酶的催化生成L-多巴。，下面是用酶催化合成药物L-多巴的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用酶催化合成药物L-多巴的方法，其特征在于，以L-酪氨酸为原料，用无载体固定化酪氨酸酶催化生成L-多巴，其中，生成的L-多巴会进一步被无载体固定化酪氨酸酶催化反应生成对应的多巴醌，用L-抗坏血酸将该对应的多巴醌还原成L-多巴。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的L-酪氨酸和L-抗坏血酸溶解于一缓冲液中。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的缓冲液pH值为5.4-8.0。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的缓冲液为磷酸缓冲液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的磷酸缓冲液浓度为50-200mmol/L。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，是将无载体固定化酪氨酸酶填充至一柱子中，然后将L-酪氨酸和L-抗坏血酸的混合液缓慢流过该柱子，以得到产物L-多巴。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将无载体固定化酪氨酸酶加到一含有L-酪氨酸和L-抗坏血酸的连续式反应器内，不断加入含有L-酪氨酸和L-抗坏血酸的反应液至该反应器，将生成的产物L-多巴不断导出该反应器。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将无载体固定化酪氨酸酶加到一含有L-酪氨酸和L-抗坏血酸的分批式反应器内，搅拌反应一段时间得到产物L-多巴。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该无载体固定化酪氨酸酶通过如下方法制得：S1.将新鲜白蘑菇与磷酸缓冲液混合并捣碎，过滤去除残渣，得到剩余酪氨酸酶酶原液冷冻保存冻存1个月以上；

S2.将冻存的酪氨酸酶酶原液解冻，并冷冻离心去沉淀得酶液；

S3.步骤S2中的酶液在磁力搅拌的同时加入硫酸铵固体，使上述溶液的硫酸铵饱和度在0℃约为50％；

S4.步骤S3完成后，按12.5％的戊二醛与酶液的体积比为1∶50的比例，逐滴加入戊二醛，并搅拌得交联悬浊液；

S5.以步骤S4中的交联悬浊液经过离心后所得到的不溶于水的颗粒用S1中所用的缓冲液清洗数次，至上清中不含有酪氨酸酶活性为止；

S6.步骤S5中得到的不溶于水的颗粒经冷冻干燥使其完全干燥后得到棕褐色的粉末状即为无载体固定化酪氨酸酶。

说明书全文

用酶催化合成药物L-多巴的方法

【技术领域】

[0001] 本发明属于一种用酶催化合成药物L-多巴的方法，尤其涉及了用一种无载体固定化酪氨酸酶催化L-多巴的合成方法。【背景技术】

[0002] 酶作为一种生物催化剂，近年来已被人们广泛应用于食品生产与检测、环保技术、生物制药等领域。但酶对环境敏感、反应后难以回收等缺点限制了酶制剂产品的开发和应用。在这种情况下，固定化酶技术应运而生。酶的固定化是用固体材料将酶束缚或限制在一定区域内，但仍能进行其特有的催化反应，并可回收并重复利用的一类技术。与游离酶相比，固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时，克服了游离酶的不足，呈现稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用等一系列优点。改进传统固定化方法以及应用工艺条件的优化研究是目前酶固定化研究的主要趋势。

[0003] 传统酶的固定化方法有吸附法、包埋法、共价交联等，这些方法都是需要把酶分子固定在载体上，这样会使酶的活性/浓度受到“稀释”，而且也会使酶受到伤害。在2001年，Roger Sheldon教授提出的一种新型的无载体酶固定化的方法——Cross-Linked Enzyme Aggregates(交联酶聚集体)，使用戊二醛作为交联剂把处于沉淀状态的酶分子交联固定下来，所得到的固定化酶显示了良好的催化活性。这种技术已经证明在水解酶、氧化还原酶和裂合酶等多种酶的固定化方面都有广泛的应用价值，值得在工业应用中推广。

[0004] L-多巴，英文名为L-3，4 dihydroxyphenylalanine。是体内合成去甲肾上腺素、多巴胺等的前体物质，通过血脑屏障进入中枢，经多巴脱羧酶转化成多巴胺而发挥作用，对改善肌强直(一种受累后骨骼肌肉在收缩后不易放松，连续收缩后减轻或消失，寒冷能使症状加重为特征的肌肉疾病)和运动迟缓等效果明显，对震颤、流涎、姿势不稳及吞咽困难有一定效果，临床上用于震颤麻痹(帕金森病)，是治疗帕金森病的首选药物。对轻、中度病情者效果较好，重度或老年人效果较差，可使肝昏迷(一种由严重肝病引起的以代谢紊乱为基础的中枢神经系统的综合病征)病人清醒、症状改善。目前中国市场销售的L-多巴主要靠从植物中提取得到，这样得到的L-多巴受原料限制，产量小，无法满足日益增长的市场需求。L-多巴也可以通过化学法合成。但L-多巴及其制剂主要用于神经性疾病，所需纯度极高。化学合成法选择性差，会同时生成D型和L型的多巴(互为对映异构体)，很难将D型和L型多巴分离开来，而D-多巴对人体有较大的毒害作用，不能用作药剂使用。国外也有通过发酵法生产L-多巴。发酵法虽然产量较高，但其生产周期较长，而且发酵液成分相对复杂，分离提纯的成本高。专利US5837504A应用苯丙氨酸羟化酶催化L-酪氨酸合成L-多巴，虽然L-多巴得率不错，但是操作复杂，而且效率不高。酪氨酸酶可以催化L-酪氨酸氧化成L-多巴的反应，但由于游离的酪氨酸酶会快速催化L-多巴继续氧化生成一系列的下游产物并最终生成黑色素，导致其L-多巴产率很低，而且酶和产物很难分离，所以无法投入生产。固定化的酪氨酸酶具有稳定性好、便于重复利用等优点。目前还未查到有涉及应用固定化酪氨酸酶特别是无载体固定化的酪氨酸酶进行L-多巴的生产。【发明内容】

[0005] 为此，本发明要解决的技术问题是如何应用无载体固定化酶技术对酪氨酸酶进行固定化并以此催化合成药物L-多巴。

[0006] 为解决上述技术问题，本发明涉及一种用酶催化合成药物L-多巴的方法。该方法以L-酪氨酸为原料，用无载体固定化酪氨酸酶催化生成L-多巴。其中，生成的L-多巴会继续氧化生成对应的多巴醌，本方法进一步用L-抗坏血酸，将对应的多巴醌还原成L-多巴。

[0007] 其中，所述的L-酪氨酸和L-抗坏血酸可溶解于一缓冲液中。所述的缓冲液pH值为5.4-8.0。所述的缓冲液可以为磷酸缓冲液。所述的磷酸缓冲液浓度为50-200mmol/L。

[0008] 作为优选，无载体固定化酪氨酸酶可填充至一柱子中，然后将L-酪氨酸和L-抗坏血酸的混合液缓慢流过该柱子，以得到产物L-多巴。

[0009] 作为优选，无载体固定化酪氨酸酶可加到一含有L-酪氨酸和L-抗坏血酸的连续式反应器内，不断加入含有L-酪氨酸和L-抗坏血酸的反应液至该反应器，将生成的含有产物L-多巴的反应液不断导出该反应器。

[0010] 作为优选，无载体固定化酪氨酸酶可加到一含有L-酪氨酸和L-抗坏血酸的分批式反应器内，搅拌反应一段时间得到产物L-多巴。

[0011] 作为优选，该无载体固定化酪氨酸酶可通过如下方法制得：

[0012] S1.将新鲜白蘑菇与磷酸缓冲液混合并捣碎，过滤去除残渣，得到剩余酪氨酸酶酶原液冷冻保存冻存1个月以上；

[0013] S2.将冻存的酪氨酸酶酶原液解冻，并冷冻离心去沉淀得酶液；

[0014] S3.步骤S2中的酶液在磁力搅拌的同时加入硫酸铵固体，使上述溶液的硫酸铵饱和度在0℃约为50％；

[0015] S4.步骤S3完成后，按12.5％的戊二醛与酶液的体积比为1∶50的比例，逐滴加入戊二醛，并搅拌得交联悬浊液；

[0016] S5.以步骤S4中的交联悬浊液经过离心后所得到的不溶于水的颗粒用S1中所用的缓冲液清洗数次，至上清中不含有酪氨酸酶活性为止；

[0017] S6.步骤S5中得到的不溶于水的颗粒经冷冻干燥使其完全干燥后得到棕褐色的粉末状即为无载体固定化酪氨酸酶。

[0018] 本发明方法具有如下有益效果：

[0019] 1、植物提取L-多巴有很大的局限，因为植物来源很有限，生产成本也很高。相对于植物提取法，固定化酶技术应用前景更广，成本会明显降低，最重要的是能够满足L-多巴的巨大需求量。

[0020] 2、相对于化学合成法本发明所得产物专一性更好，副反应少，反应条件温和，更有利于环保。

[0021] 3、相对于微生物发酵法本发明生产周期快，成分较单一，分离成本低。

[0022] 4、由于酪氨酸酶自身的原因，它的产物L-多巴对其有抑制作用。直接用游离酪氨酸酶进行L-多巴生产由于L-多巴会被继续氧化导致其产率极低。已查到文献利用其他方法固定的酪氨酸酶生产L-多巴170小时转化率约60％。而用本方法2小时转化率就可以达到60％。【具体实施方式】

[0023] 本发明的技术方案：用无载体固定化酪氨酸酶生产L-多巴的方法，以L-酪氨酸为原料，通过无载体固定化的酪氨酸酶催化生成L-多巴。由于生成的L-多巴会继续被氧化生成多巴醌，因此在反应液中加入L-抗坏血酸使生成的多巴醌还原成为L-多巴。

[0024] 本发明的反应式可表述为下式：

[0025]

[0026] 其中，R为-CH2CH(NH2)COOH

[0027] 下面结合具体实施例更进一步说明本发明。

[0028] 首先，本发明提供一种应用无载体固定化酶技术对酪氨酸酶进行固定化的方法。应当指出的是，本发明的无载体固定化酪氨酸酶的方法不仅限于本实施例方法，使用其他无载体固定化酪氨酸酶的方法，并使用本发明构思合成药物L-多巴的方案，皆应视为被本发明的权利要求所涵盖。

[0029] 本实施例中，无载体固定化酪氨酸酶的方法包括步骤如下：

[0030] S1将市场买来的新鲜白蘑菇用匀浆机按照蘑菇∶磷酸缓冲液(50mM，pH6.0)＝1∶2(kg/L)的比例将其捣碎，过滤去除残渣，剩余酶液分装后-20℃冰箱冻存1个月以上；

[0031] S2在4℃条件下将S1中冻存的酪氨酸酶酶原液解冻并冷冻离心去沉淀得酶液；

[0032] S3步骤S2中的酶液在磁力搅拌的同时加入硫酸铵固体，使上述溶液的硫酸铵饱和度(0℃)为50％；

[0033] S4步骤S3完成后，按体积比1∶50(12.5％的戊二醛：酶液)逐滴加入戊二醛(12.5％，v/v)并于4℃搅拌16h得交联悬浊液；

[0034] S5以步骤S4中的悬浊液经过离心后所得到的不溶于水的颗粒用S1中所用的缓冲液清洗数次，至上清中不含有酪氨酸酶活性为止；

[0035] S6步骤S5中得到的不溶于水的颗粒经冷冻干燥使其完全干燥后得到棕褐色的粉末状即为无载体固定化酪氨酸酶。

[0036] 实施例一

[0037] 将无载体固定化酪氨酸酶填装至一柱子里，让L-酪氨酸和L-抗坏血酸的混合液通过该装有无载体固定化酪氨酸酶的柱子，流出的产物混合液中便可获得L-多巴。此方法0.5h后转化率可达25％以上。

[0038] 实施例二

[0039] 将无载体固定化酪氨酸酶和L-酪氨酸和L-抗坏血酸的混合液加入一分批式反应

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