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微小RNA-199b-5p在医学和诊断领域中的应用

阅读：532发布：2021-02-06

IPRDB可以提供微小RNA-199b-5p在医学和诊断领域中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及微小RNA-199b-5p在医学和诊断学领域中的应用。具体地说，本发明涉及miR199b-5p在抗癌症治疗中的应用以及作为组织病理学和转移标记。，下面是微小RNA-199b-5p在医学和诊断领域中的应用专利的具体信息内容。

1.由以下序列：

CCAGAGGACACCTCCACTCCGTCTACCCAGTGTTTAGACTATCTGTTCAGGACTCCCAAATTGTACAGTAGTCTGCACATTGGTTAGGCTGGGCTGGGTTAGACCCTCGG(SEQ ID No:1)或相应核糖核苷酸序列：

CCAGAGGACACCUCCACUCCGUCUACCCAGUGUUUAGACUAUCUGUUCAGGACUCCCAAAUUGUACAGUAGUCUGCACAUUGGUUAGGCUGGGCUGGGUUAGACCCUCGG(SEQ ID No:10)或SEQ ID No:10的一部分：

CCCAGUGUUUAGACUAUCUGUUC(SEQ ID NO:11)，构成的寡核苷酸序列在制备用于治疗和/或预防特征在于基因CD133表达的肿瘤的药物中的用途，所述肿瘤选自：髓母细胞瘤、结肠癌和乳腺癌。

2.以下组分在制备用于评估肿瘤的组织病理学阶段和是否存在转移的试剂盒中的用途，所述评估是通过实时PCR检测生物学样品中包含SEQ ID NO:1或由其构成的序列的表达并检测癌症干细胞中表达的一种或多种基因，所述肿瘤选自：髓母细胞瘤、结肠癌和乳腺癌，所述基因选自：CD133、c-myc、Nanog、Oct4、TCFL1、ZIC1、KLF5、HMGA1、HMGB3，所述组分为：a)包含SEQ ID NO:1或由其构成的所述序列的以下扩增引物：正向引物:CGGGAATTCCCAGAGGACACCTCCAC(SEQ ID NO:3)反向引物:CGGCTCGAGCCGAGGGTCTAACCCAG(SEQ ID NO:4)b)标准化所述序列的表达值的对照引物对：正向引物:GAA AAG CCT TGT TTG TGC TTG C(SEQ ID NO:5)反向引物:GGG CCA TGC TAA TCT TCT CTG T(SEQ ID NO:6)；

c)检测所述一种或多种基因的序列的一对或多对以下引物和探针：cd133

正向引物:TCCACAGAAATTTACCTACATTGGAA(SEQ ID NO:49)反向引物:GGGTCAGCAGAGAGCAGATGA(SEQ ID NO:50)探针:AGTATGATTCATACTGGTGGCTGGGTGGC(SEQ ID NO:51)c myc:

正向引物:GCTGGATTTTTTTCGGGTAGTG(SEQ ID NO:52)反向引物:TAGTTCCTGTTGGTGAAGCTAACG(SEQ ID NO:53)探针CAGCAGCCTCCCGCGACG(SEQ ID NO:54)nanog:

正向引物:CCGAAGAATAGCAATGGTGTGA(SEQ ID NO:55)反向引物:GCATCCCTGGTGGTAGGAAGA(SEQ ID NO:56)探针:CAGCACCTACCTACCCCAGCCTTTA(SEQ ID NO:57)oct4:

正向引物:AACCCGGAGGAGGTAGTCCTT(SEQ ID NO:58)反向引物:AATAACCTACCCACAAATGTCATTCA(SEQ ID NO:59)探针:CATGCATGAGTCAGTGAACAGGGAA(SEQ ID NO:60)tcfl1:

正向引物:CCAAGGAAGAGAACGTTGACATAG(SEQ ID NO:61)反向引物:CCGAGGGAGCAGGATCAAG(SEQ ID NO:62)探针:AGGCTCTTTGTGTTTTTCCTTGTCTTTTGTCC(SEQ ID NO:63)zic1:

正向引物:CGCGCTCCGAGAATTTAAAG(SEQ ID NO:64)反向引物:CGGTCACAGCCCTCAAACTC(SEQ ID NO:65)探针:TCCACAAAAGGACGCACACAGGG(SEQ ID NO:66)KLF5:

正向引物:TTTAACCCCACCTCCATCCTATG(SEQ ID NO:67)反向引物:GGCAGGGTGGTGGGTAAATT(SEQ ID NO:68)探针:TGCTTCTAAACTGGCAATTCACAATC(SEQ ID NO:69)HMGA1:

正向引物:CCCCAGGCAGACCTTATATGAG(SEQ ID NO:70)反向引物:TGCTTGAGGTCAGGAGTTCGA(SEQ ID NO:71)探针:CATGGGAGTCCCACCGTATTGTCCA(SEQ ID NO:72)HMGB3:

正向引物:CGCTATGATCGGGAAATGAAG(SEQ ID NO:73)反向引物:TGGCCTTTTGGGAGCATTAG(SEQ ID NO:74)探针:ATTATGGACCAGCTAAGGGAGGCAAG(SEQ ID NO:75)d)标准化所述基因的序列表达的以下引物和探针：正向引物:GCCAACCGCGAGAAGATG(SEQ ID NO:81)反向引物:ACAGCCTGGATAGCAACGTACA(SEQ ID NO:82)探针:CCCAATCATGTTTGAGACCTTCAAC(SEQ ID NO:83)。

3.以下组分在制备用于评估肿瘤的组织病理学阶段和是否存在转移的试剂盒中的用途，所述评估是通过实时Taqman PCR检测生物学样品中包含SEQ ID NO:1或由其构成的序列的表达并检测在癌症干细胞中表达的一种或多种基因，所述肿瘤选自：髓母细胞瘤、结肠癌和乳腺癌，所述基因选自：CD133、c-myc、Nanog、Oct4、TCFL1、ZIC1、KLF5、HMGA1、HMGB3，所述组分为：a1)检测包含SEQ ID NO:1或由其构成的所述序列表达的以下引物和探针正向引物:AGGACACCTCCACTCCGTCTAC(SEQ ID NO:7)反向引物:GCCTAACCAATGTGCAGACTACTG(SEQ ID NO:8)探针:CAGTGTTTAGACTATCTGTTCAGGACTCCCAAATTG(SEQ ID NO:9)；

b1)检测所述一种或多种基因表达的一对或多对以下引物和相关探针：cd133

正向引物:TCCACAGAAATTTACCTACATTGGAA(SEQ ID NO:49)反向引物:GGGTCAGCAGAGAGCAGATGA(SEQ ID NO:50)探针:AGTATGATTCATACTGGTGGCTGGGTGGC(SEQ ID NO:51)c myc:

正向引物:GCTGGATTTTTTTCGGGTAGTG(SEQ ID NO:52)反向引物:TAGTTCCTGTTGGTGAAGCTAACG(SEQ ID NO:53)探针:CAGCAGCCTCCCGCGACG(SEQ ID NO:54)nanog:

正向引物:CCGAAGAATAGCAATGGTGTGA(SEQ ID NO:55)反向引物:GCATCCCTGGTGGTAGGAAGA(SEQ ID NO:56)探针:CAGCACCTACCTACCCCAGCCTTTA(SEQ ID NO:57)oct4:

正向引物:AACCCGGAGGAGGTAGTCCTT(SEQ ID NO:58)反向引物:AATAACCTACCCACAAATGTCATTCA(SEQ ID NO:59)探针:CATGCATGAGTCAGTGAACAGGGAA(SEQ ID NO:60)tcfl1:

正向引物:CCAAGGAAGAGAACGTTGACATAG(SEQ ID NO:61)反向引物:CCGAGGGAGCAGGATCAAG(SEQ ID NO:62)探针:AGGCTCTTTGTGTTTTTCCTTGTCTTTTGTCC(SEQ ID NO:63)zic1:

正向引物:CGCGCTCCGAGAATTTAAAG(SEQ ID NO:64)反向引物:CGGTCACAGCCCTCAAACTC(SEQ ID NO:65)探针:TCCACAAAAGGACGCACACAGGG(SEQ ID NO:66)KLF5:

正向引物:TTTAACCCCACCTCCATCCTATG(SEQ ID NO:67)反向引物:GGCAGGGTGGTGGGTAAATT(SEQ ID NO:68)探针:TGCTTCTAAACTGGCAATTCACAATC(SEQ ID NO:69)HMGA1:

正向引物:CCCCAGGCAGACCTTATATGAG(SEQ ID NO:70)反向引物:TGCTTGAGGTCAGGAGTTCGA(SEQ ID NO:71)探针:CATGGGAGTCCCACCGTATTGTCCA(SEQ ID NO:72)HMGB3:

正向引物:CGCTATGATCGGGAAATGAAG(SEQ ID NO:73)反向引物:TGGCCTTTTGGGAGCATTAG(SEQ ID NO:74)探针:ATTATGGACCAGCTAAGGGAGGCAAG(SEQ ID NO:75)c1)标准化所述基因序列表达的以下引物对和探针：正向引物:GCCAACCGCGAGAAGATG(SEQ ID NO:81)反向引物:ACAGCCTGGATAGCAACGTACA(SEQ ID NO:82)探针:CCCAATCATGTTTGAGACCTTCAAC(SEQ ID NO:83)。

4.体外诊断试剂盒，其通过实时PCR检测生物学样品中包含SEQ ID NO:1或由其构成的序列的表达并检测癌症干细胞中表达的一种或多种基因，来评估肿瘤的组织病理学阶段和是否存在转移，所述基因选自：CD133、c-myc、Nanog、Oct4、TCFL1、ZIC1、KLF5、HMGA1、HMGB3，所述肿瘤选自：髓母细胞瘤、结肠癌和乳腺癌，所述试剂盒包含以下组分或由以下组分构成：a)包含SEQ ID NO:1或由其构成的所述序列的以下扩增引物：正向引物:CGGGAATTCCCAGAGGACACCTCCAC(SEQ ID NO:3)反向引物:CGGCTCGAGCCGAGGGTCTAACCCAG(SEQ ID NO:4)b)标准化所述序列的表达值的对照引物对：正向引物:GAA AAG CCT TGT TTG TGC TTG C(SEQ ID NO:5)反向引物:GGG CCA TGC TAA TCT TCT CTG T(SEQ ID NO:6)；

c)检测所述一种或多种基因的序列的一对或多对以下引物和探针：cd133

正向引物:TCCACAGAAATTTACCTACATTGGAA(SEQ ID NO:49)反向引物:GGGTCAGCAGAGAGCAGATGA(SEQ ID NO:50)探针:AGTATGATTCATACTGGTGGCTGGGTGGC(SEQ ID NO:51)c myc:

正向引物:GCTGGATTTTTTTCGGGTAGTG(SEQ ID NO:52)反向引物:TAGTTCCTGTTGGTGAAGCTAACG(SEQ ID NO:53)探针CAGCAGCCTCCCGCGACG(SEQ ID NO:54)nanog:

正向引物:CCGAAGAATAGCAATGGTGTGA(SEQ ID NO:55)反向引物:GCATCCCTGGTGGTAGGAAGA(SEQ ID NO:56)探针:CAGCACCTACCTACCCCAGCCTTTA(SEQ ID NO:57)oct4:

正向引物:AACCCGGAGGAGGTAGTCCTT(SEQ ID NO:58)反向引物:AATAACCTACCCACAAATGTCATTCA(SEQ ID NO:59)探针:CATGCATGAGTCAGTGAACAGGGAA(SEQ ID NO:60)tcfl1:

正向引物:CCAAGGAAGAGAACGTTGACATAG(SEQ ID NO:61)反向引物:CCGAGGGAGCAGGATCAAG(SEQ ID NO:62)探针:AGGCTCTTTGTGTTTTTCCTTGTCTTTTGTCC(SEQ ID NO:63)zic1:

正向引物:CGCGCTCCGAGAATTTAAAG(SEQ ID NO:64)反向引物:CGGTCACAGCCCTCAAACTC(SEQ ID NO:65)探针:TCCACAAAAGGACGCACACAGGG(SEQ ID NO:66)KLF5:

正向引物:TTTAACCCCACCTCCATCCTATG(SEQ ID NO:67)反向引物:GGCAGGGTGGTGGGTAAATT(SEQ ID NO:68)探针:TGCTTCTAAACTGGCAATTCACAATC(SEQ ID NO:69)HMGA1:

正向引物:CCCCAGGCAGACCTTATATGAG(SEQ ID NO:70)反向引物:TGCTTGAGGTCAGGAGTTCGA(SEQ ID NO:71)探针:CATGGGAGTCCCACCGTATTGTCCA(SEQ ID NO:72)HMGB3:

正向引物:CGCTATGATCGGGAAATGAAG(SEQ ID NO:73)反向引物:TGGCCTTTTGGGAGCATTAG(SEQ ID NO:74)探针:ATTATGGACCAGCTAAGGGAGGCAAG(SEQ ID NO:75)d)标准化所述基因的序列表达的以下引物和探针：正向引物:GCCAACCGCGAGAAGATG(SEQ ID NO:81)反向引物:ACAGCCTGGATAGCAACGTACA(SEQ ID NO:82)探针:CCCAATCATGTTTGAGACCTTCAAC(SEQ ID NO:83)。

5.体外诊断试剂盒，其通过实时Taqman PCR检测生物学样品中包含SEQ ID NO:1或由其构成的序列的表达并检测在癌症干细胞中表达的一种或多种基因，来评估肿瘤的组织病理学阶段和是否存在转移，所述肿瘤选自：髓母细胞瘤、结肠癌和乳腺癌，所述基因选自：CD133、c-myc、Nanog、 Oct4、TCFL1、ZIC1、KLF5、HMGA1、HMGB3，所述诊断试剂盒包含以下组分或由以下组分构成：a1)检测包含SEQ ID NO:1或由其构成的所述序列表达的以下引物和探针正向引物:AGGACACCTCCACTCCGTCTAC(SEQ ID NO:7)反向引物:GCCTAACCAATGTGCAGACTACTG(SEQ ID NO:8)探针:CAGTGTTTAGACTATCTGTTCAGGACTCCCAAATTG(SEQ ID NO:9)；

b1)检测所述一种或多种基因表达的一对或多对以下引物和相关探针：cd133

正向引物:TCCACAGAAATTTACCTACATTGGAA(SEQ ID NO:49)反向引物:GGGTCAGCAGAGAGCAGATGA(SEQ ID NO:50)探针:AGTATGATTCATACTGGTGGCTGGGTGGC(SEQ ID NO:51)c myc:

正向引物:GCTGGATTTTTTTCGGGTAGTG(SEQ ID NO:52)反向引物:TAGTTCCTGTTGGTGAAGCTAACG(SEQ ID NO:53)探针:CAGCAGCCTCCCGCGACG(SEQ ID NO:54)nanog:

正向引物:CCGAAGAATAGCAATGGTGTGA(SEQ ID NO:55)反向引物:GCATCCCTGGTGGTAGGAAGA(SEQ ID NO:56)探针:CAGCACCTACCTACCCCAGCCTTTA(SEQ ID NO:57)oct4:

正向引物:AACCCGGAGGAGGTAGTCCTT(SEQ ID NO:58)反向引物:AATAACCTACCCACAAATGTCATTCA(SEQ ID NO:59)探针:CATGCATGAGTCAGTGAACAGGGAA(SEQ ID NO:60)tcfl1:

正向引物:CCAAGGAAGAGAACGTTGACATAG(SEQ ID NO:61)反向引物:CCGAGGGAGCAGGATCAAG(SEQ ID NO:62)探针:AGGCTCTTTGTGTTTTTCCTTGTCTTTTGTCC(SEQ ID NO:63)zic1:

正向引物:CGCGCTCCGAGAATTTAAAG(SEQ ID NO:64)反向引物:CGGTCACAGCCCTCAAACTC(SEQ ID NO:65)探针:TCCACAAAAGGACGCACACAGGG(SEQ ID NO:66)KLF5:

正向引物:TTTAACCCCACCTCCATCCTATG(SEQ ID NO:67)反向引物:GGCAGGGTGGTGGGTAAATT(SEQ ID NO:68)探针:TGCTTCTAAACTGGCAATTCACAATC(SEQ ID NO:69)HMGA1:

正向引物:CCCCAGGCAGACCTTATATGAG(SEQ ID NO:70)反向引物:TGCTTGAGGTCAGGAGTTCGA(SEQ ID NO:71)探针:CATGGGAGTCCCACCGTATTGTCCA(SEQ ID NO:72)HMGB3:

正向引物:CGCTATGATCGGGAAATGAAG(SEQ ID NO:73)反向引物:TGGCCTTTTGGGAGCATTAG(SEQ ID NO:74)探针:ATTATGGACCAGCTAAGGGAGGCAAG(SEQ ID NO:75)c1)标准化所述基因序列表达的以下引物对和探针：正向引物:GCCAACCGCGAGAAGATG(SEQ ID NO:81)反向引物:ACAGCCTGGATAGCAACGTACA(SEQ ID NO:82)探针:CCCAATCATGTTTGAGACCTTCAAC(SEQ ID NO:83)。

说明书全文

微小RNA-199b-5p在医学和诊断领域中的应用

[0001] 本发明涉及微小RNA-199b-5p在医学和诊断领域中的应用。具体地说，本发明涉及miR199b-5p在抗癌症治疗中以及作为组织病理学和转移标记物中的应用。
[0002] 微小RNA(miRNA)是长约22个核苷酸的单链RNA，它们构成一类新的基因调节剂[1]。在动物中，miRNA通过结合它们的靶mRNA的3’-非翻译区(3’UTR)内的不完美互补位点起调节作用。在几种肿瘤类型中观察到许多miRNA的表达改变：例如，B-细胞性淋巴瘤(簇生miR-17)[2，3]、恶性淋巴瘤(miR-15a，miR-16-1；靶向BCL2)[4]、成胶质细胞瘤(miR-21上调)[5]、结肠直肠瘤(miR-143，miR-145下调)[6]、肺癌(miR-29)[7]和乳腺癌(miR-10b)[8]，其中几种肿瘤类型在分析中。
[0003] 髓母细胞瘤(MB)是最常见的恶性脑肿瘤。其看来源自干细胞和源自小脑外颗粒层(external granule layer)中的颗粒神经元前体(granule neuron precursor)[9]，或者源自小脑脑室区的多能前体[10-12]。从临床观点看，目前的多重联合治疗包括基础外科手术切除(radical surgical resection)，然后进行放疗和化疗。虽然这些治疗能提高存活率，但依然有约三分之一的MB患者无法治愈。主要的死因是肿瘤扩散相关的复发，此时目前的治疗选择几乎无效[13]。这些治疗还有毒性，能导致长期残疾[14-16]。因此，十分需要用于患髓母细胞瘤的儿童的新型、有效、低毒的疗法。
[0004] MB细胞还可含有功能上重要的、具有干(细胞)样特性的细胞亚组，它们能独特地促进肿瘤生长[17、18]。最近的研究证明祖细胞和干细胞均能对Sonic-Hedgehog(Shh)途径起反应，还能用作MB的起源细胞[19]。
[0005] Notch活性已显示能调节产生MB的粒细胞祖细胞，其中MB中Notch2基因拷贝数增加15％[12，20]。bHLH HES1是主要的Notch-反应基因，其持续表达阻止神经祖细胞迁移到脑室区外和神经元标记物的表达[21]。缺乏Hes1的小鼠显示神经发生不成熟，表现为神经bHLH转录因子上调，从而导致成年神经管缺陷(major neural-tube defect)[22]；源自这些小鼠的祖细胞的自我更新潜能受损，倾向于神经元谱系[23]。
[0006] MB中的HES1的表达与更糟的临床结果明显相关[24]。众所周知，由于与其它途径有相互作用，例如Polycomb组基因BMI-1[26]，有人认为颗粒细胞前体发育中与Sonic-Hedgehog(Shh)相互作用[25]。
[0007] 明显需要用于治愈髓母细胞瘤和通过组织病理学标记物作早期诊断及检测转移的新医学干预方法。本发明人已经证明转移患者中miRNA 199b-5p表达丧失，他们假定了遵循癌症发生期间发生的甲基化过程的后生沉默的调节机制，鉴定了MB患者中风险较低的新分子标记物。MiR-199b-5p过表达阻断几种癌症干细胞基因表达，损伤MB细胞植入无胸腺/裸鼠的小脑的潜能，尤其感兴趣的是，其减少MB肿瘤干细胞样(CD133+)细胞亚群。为此原因，miR-199b-5p可用作抗癌疗剂以及测定肿瘤的组织病理学状态和了解转移是否存在的标记物。本发明人鉴定到转移患者中miR-199b-5p丧失，估计该丧失是癌症发生期间的沉默机制所致。本发明人鉴定了疾病复发和侵袭性风险低的髓母细胞瘤患者中特定类别的新分子标记物。实际上，miR-199-5p不利地影响CD133+癌症干细胞，其在异种移植常位小脑癌症动物模型中显示损伤肿瘤在小脑中的体内生长和发生。出于以上原因，miR-199b-5p可用于抗癌症治疗以及为诊断目的用作肿瘤的组织病理学状态标记物和用作与转移存在与否相关的预测标记物。
[0008] 本发明人在MB细胞系的筛选中发现miR-199b-5p通过靶向转录因子HES1而能作为Notch信号传导途径的调节剂。miR-199b-5p下调HES1表达不利地调节MB细胞的增殖率和不依赖支持物的生长。MiR-199b-5p过表达阻断几种癌症干细胞基因表达，损伤MB细胞植入无胸腺/裸鼠的小脑的潜能，尤其感兴趣的是，其减少MB肿瘤干细胞样(CD133+)细胞亚群。在对61位MB患者的分析中，非转移病例中miR 199b-5p的表达显著高于转移病例中的(P＝0.001)。miR-199b-5p表达水平高的那些患者的存活数据作统计学相关性分析表明总体存活率优于那些miR-199b-5p低表达患者。这些数据显示转移MB患者中miR-199b-5p下调，提示可能有通过遗传学或后生修饰的沉默机制。脱甲基化试剂(例如，5-氮杂-脱氧胞苷)诱导后，在一组MB细胞系中观察到miR-199b-5p表达增强，从而支持miR-199b-5p调节的后生机制。此外，两个髓母细胞瘤细胞系(Med8和UV238)显示5-氮杂-脱氧胞苷处理后miR-199b-5p显著上调。本发明人在小鼠小脑中开发了诱导型异种移植常位模型，其中用携带miR-199b-5p的腺病毒事先感染MB细胞(Daoy细胞系)并将它们注射入无胸腺/裸鼠的小脑显示通过miR-199b-5p不利地影响肿瘤生长，特别是不利地影响MB癌症干细胞而有临床益处，从而为本思路提供进一步的证据。
[0009] 因此，本发明的具体目的是包含以下序列或由其构成的寡核苷酸序列：CCAGAGGACACCTCCACTCCGTCTA AGGACTCCCAAATTG
TACAGTAGTCTGCACATTGGTTAGGCTGGGCTGGGTTAGACCCTCGG(SEQ ID No：1)
[0010] 或包含相应核糖核苷酸序列或由其构成：CCAGAGGACACCUCCACUCCGUCUACCCAGUGUUUAGACUAUCUGUUCAGGACUCCCAAAUUGUACAGUAGUCUGCACAUUGGUUAGGCUGGGCUGGGUUAGACCCUCGG(SEQ ID No：10)
[0011] 或包含SEQ ID No：10的一部分或由其构成：
[0012] CCCAGUGUUUAGACUAUCUGUUC(SEQ ID NO：11)，
[0013] 以便用于治疗和/或预防特征在于基因CD133表达的肿瘤，所述肿瘤选自：髓母细胞瘤、淋巴瘤、成胶质细胞瘤、结肠癌和乳腺癌。
[0014] 特别是，黑体序列对应于成熟的miR-199b-5p序列。
[0015] 可通过病毒载体(用于脱氧核糖核苷酸序列)，例如腺病毒载体，SNALP技术(用于核糖核苷酸序列)，LNA技术或通过连接胆固醇的结合分子或利用接头C1-7来修饰O-2-甲基将以上序列携带入人体。具体地说，腺病毒可以是6217bp的AdV5载体，含CMV启动子和限制性位点以供克隆序列SEQ ID NO：1，其图谱示于图15和16。
[0016] 本发明的另一目的是体外诊断方法以便通过研究生物学样品中包含SEQ ID NO：1或由其构成的序列以及在癌症干细胞中表达的一种或多种基因的表达来评估肿瘤的组织病理学状态(阶段)或测定是否存在转移，所述基因选自：CD133、c-myc、Nanog、Oct4、TCFL1、ZIC1、KLF5、HMGA1、HMGB3。
[0017] 具体地说，肿瘤可选自下组：结肠癌、髓母细胞瘤、成胶质细胞瘤、乳腺癌、淋巴瘤和肺癌；优选结肠癌、髓母细胞瘤、成胶质细胞瘤、乳腺癌和淋巴瘤；最优选结肠癌、髓母细胞瘤、成胶质细胞瘤、淋巴瘤。
[0018] 按照本发明的实施方式，本发明的诊断方法包括应用于结肠癌、髓母细胞瘤和成胶质细胞瘤的miR199b-5p和CD133表达分析。按照第二实施方式，诊断方法包括应用于结肠癌、乳腺癌和淋巴瘤的miR199b-5p和HMGA1表达分析。
[0019] 优选利用以下扩增引物，通过实时PCR来评估检测包含SEQ ID NO：1或由其构成的序列的表达：
[0020] 正向引物：CGGGAATTCCCAGAGGACACCTCCAC(SEQ ID NO：3)
[0021] 反向引物：CGGCTCGAGCCGAGGGTCTAACCCAG(SEQ ID NO：4)
[0022] 和一对对照引物以标准化序列的表达值，例如以下引物：
[0023] 正向引物：GAA AAG CCT TGT TTG TGC TTG C(SEQ ID NO：5)
[0024] 反向引物：GGG CCA TGC TAA TCT TCT CTG T(SEQ ID NO：6)。
[0025] 在备选方式中，检测包含SEQ ID NO：1或由其构成的序列的表达包括以下步骤或由以下步骤构成：
[0026] a)逆转录RNA；和b)利用以下引物和探针，通过TaqMan试验表达所述序列：
[0027] 正向引物：AGGACACCTCCACTCCGTCTAC(SEQ ID NO：7)
[0028] 反向引物：GCCTAACCAATGTGCAGACTACTG(SEQ ID NO：8)
[0029] 探针：CAGTGTTTAGACTATCTGTTCAGGACTCCCAAATTG(SEQ ID NO：9)。
[0030] 按照本发明的具体实施方式，通过实时PCR扩增以下序列中的至少一个来检测所述一种或多种基因：
[0031] CD133：CTATGTGGTACAGCCGCGTGATTTCCCAGAAGATACTTTGAGAAAATTCTTACAGAAGGCATATGAATCCAA AATTGATTA(SEQ ID NO：13)
[0032] c-myc：AGGAGGAACAAGAAGATGAGGAAGAAATCGATGTT(SEQ ID NO：14)
[0033] Nanog：GCAAATGTCTTCTGCTGAGATGCCTCACACGGAGACTGTCTCTCCTCTTCCTTCCTCCATGGATCTGCTTATTCAGGACAGC(SEQ ID NO：15)
[0034] Oct4：ACTGCAGCAGATCAGCCACATCGCCCAGCAGCTTGGGCTCGAGAAGGATGTGGTCCGAGTGTGGTTCTGTAACCGGCGCCA(SEQ ID NO：16)
[0035] TCFL1：CCGCGGGACTATTTCGCCGAAGTGAGAAGGCCTCAGGACAGCGCG TTCTTT(SEQ ID NO：17)
[0036] ZIC1：CAGTTCGCTGCGCAAACACATGAAGGTCCACGAATCCTCCTCGCAGGGCTC(SEQ ID NO：18)[0037] KLF5：GCATCCACTACTGCGATTACCCTGGTTGCACAAAAGTTTATACCAAGTCTTCTCA(SEQ ID NO：19)
[0038] HMGA1：AAAAACAAGGGTGCTGCCAAGACCCGGAAAACCACCACAACTCCAGGAAGG(SEQ ID NO：20)
[0039] HMGB3：TTTTCCAAGAAGTGCTCTGAGAGGTGGAAGACGATGTCCGGGAAAGAGAAA(SEQ ID NO：21)；
[0040] 利用以下扩增引物对：
[0041] CD133：
[0042] 正向引物：CTATGTGGTACAGCCGCGTG(SEQ ID NO：22)
[0043] 反向引物：TAATCAATTTTGGATTCATATGCCTTC(SEQ ID NO：23)
[0044] c-myc
[0045] 正向引物：ATGAGGAGACACCGCCCAC(SEQ ID NO：24)
[0046] 反向引物：AACATCGATTTCTTCCTCATCTTCTT(SEQ ID NO：25)
[0047] Nanog：
[0048] 正向引物：GCAAATGTCTTCTGCTGAGATGC(SEQ ID NO：26)
[0049] 反向引物：GCTGTCCTGAATAAGCAGATCCAT(SEQ ID NO：27)
[0050] Oct4：
[0051] 正向引物：ACTGCAGCAGATCAGCCACA(SEQ ID NO：28)
[0052] 反向引物：TGGCGCCGGTTACAGAAC(SEQ ID NO：29)
[0053] TCFL1：
[0054] 正向引物：CCGCGGGACTATTTCGC(SEQ ID NO：30)
[0055] 反向引物：AAAGAACGCGCTGTCCTGAG(SEQ ID NO：31)
[0056] ZIC1：
[0057] 正向引物：CAGTTCGCTGCGCAAACA(SEQ ID NO：32)
[0058] 反向引物：GAGCCCTGCGAGGAGGAT(SEQ ID NO：33)
[0059] KLF5：
[0060] 正向引物：GCATCCACTACTGCGATTACCC(SEQ ID NO：34)
[0061] 反向引物：TGAGAAGACTTGGTATAAACTTTTGTGC(SEQ ID NO：35)
[0062] HMGA1：
[0063] 正向引物：AAAAACAAGGGTGCTGCCAA(SEQ ID NO：36)
[0064] 反向引物：CCTTCCTGGAGTTGTGGTGGT(SEQ ID NO：37)
[0065] HMGB3：
[0066] 正向引物：TTTTCCAAGAAGTGCTCTGAGAGG(SEQ ID NO：38)
[0067] 反向引物：TTTCTCTTTCCCGGACATCG(SEQ ID NO：39)
[0068] 并且利用以下引物对以标准化以下基因序列的表达：
[0069] 正向引物：CGT GCT GCT GAC CGA GG(SEQ ID NO：79)
[0070] 反向引物：GAA GGT CTC AAA CAT GAT CTG GGT(SEQ ID NO：80)。
[0071] 或者，可通过实时TaqMan扩增以下序列中的至少一个来检测所述一种或多种基因：
[0072] cd133
[0073] TCCACAGAAATTTACCTACATT
[0074] GGAAGAGTATGATTCATACTGGTGGCTGGGTGGCCTGGTCATCTGCTCTCTGCTGACCC(SEQ ID NO：40)
[0075] c myc
[0076] GCTGGATTTTTTTCGGGTAGTGGAAAACCAGCAGCCT
[0077] CCCGCGACGATGCCCCTCAACGTTAGCTTCACCAACAGGAACTA(SEQ ID NO：41)[0078] nanog：
[0079] CCGAAGAATAGCAATGGTGTGACGCAGAAGGCCTCAGCACCTACCTACCCCAGCCTTTACTCTTCCTACCACCAGGGATG(SEQ ID NO：42)
[0080] oct 4：
[0081] AACCCGGAGGAGGTAGTCCTTTGTTACATGCATGAGTCAGTGAACAGGGAATGGGTGAATGACATTTGTGGGTAGGTTATT(SEQ ID NO：43)
[0082] tcfl1：
[0083] CCAAGGAAGAGAACGTTGACATAGAAGGCTCTTTGTGTTTTTCCTTGTCTTTTGTCCTCAGACTTGATCCTGCTCCCTCGG(SEQ ID NO：44)
[0084] zic 1：
[0085] CGCGCTCCGAGAATTTAAAGATCCACAAAAGGACGCACACAGGGAGAAGCCCTTCAAGTGCGAGTTTGAGGGCTGTGACC(SEQ ID NO：45)
[0086] KLF5：
[0087] TTTAACCCCACCTCCATCCTATGCTGCTACAATTGCTTCTAAACTGGCAATTCACAATCCAAATTTACCCACCACCCTGCC(SEQ ID NO：46)
[0088] HMGA1：
[0089] CCCCAGGCAGACCTTATATGAGACATGGGAGTCCCACCGTATTGTCCAGGCTGGTCTCGAACTCCTGACCTCAAGCA(SEQ ID NO：47)
[0090] HMGB3：
[0091] CGCTATGATCGGGAAATGAAGGATTATGGACCAGCTAAGGGAGGCAAGAAGAAGAAGGATCCTAATGCTCCCAAAAGGCCA(SEQ ID NO：48)；
[0092] 利用以下引物和探针作扩增：
[0093] cd133
[0094] 正向引物：TCCACAGAAATTTACCTACATTGGAA(SEQ ID NO：49)
[0095] 反向引物：GGGTCAGCAGAGAGCAGATGA(SEQ ID NO：50)
[0096] 探针：AGTATGATTCATACTGGTGGCTGGGTGGC(SEQ ID NO：51)
[0097] c myc：
[0098] 正向引物：GCTGGATTTTTTTCGGGTAGTG(SEQ ID NO：52)
[0099] 反向引物：TAGTTCCTGTTGGTGAAGCTAACG(SEQ ID NO：53)
[0100] 探针CAGCAGCCTCCCGCGACG(SEQ ID NO：54)
[0101] nanog：
[0102] 正向引物：CCGAAGAATAGCAATGGTGTGA(SEQ ID NO：55)
[0103] 反向引物：GCATCCCTGGTGGTAGGAAGA(SEQ ID NO：56)
[0104] 探针：CAGCACCTACCTACCCCAGCCTTTA(SEQ ID NO：57)
[0105] oct 4：
[0106] 正向引物：AACCCGGAGGAGGTAGTCCTT(SEQ ID NO：58)
[0107] 反向引物：AATAACCTACCCACAAATGTCATTCA(SEQ ID NO：59)
[0108] 探针：CATGCATGAGTCAGTGAACAGGGAA(SEQ ID NO：60)
[0109] tcfl 1：
[0110] 正向引物：CCAAGGAAGAGAACGTTGACATAG(SEQ ID NO：61)
[0111] 反向引物：CCGAGGGAGCAGGATCAAG(SEQ ID NO：62)
[0112] 探针：AGGCTCTTTGTGTTTTTCCTTGTCTTTTGTCC(SEQ ID NO：63)
[0113] zic 1：
[0114] 正向引物：CGCGCTCCGAGAATTTAAAG(SEQ ID NO：64)
[0115] 反向引物：CGGTCACAGCCCTCAAACTC(SEQ ID NO：65)
[0116] 探针：TCCACAAAAGGACGCACACAGGG(SEQ ID NO：66)
[0117] KLF5：
[0118] 正向引物：TTTAACCCCACCTCCATCCTATG(SEQ ID NO：67)
[0119] 反向引物：GGCAGGGTGGTGGGTAAATT(SEQ ID NO：68)
[0120] 探针：TGCTTCTAAACTGGCAATTCACAATC(SEQ ID NO：69)
[0121] HMGA1：
[0122] 正向引物：CCCCAGGCAGACCTTATATGAG(SEQ ID NO：70)
[0123] 反向引物：TGCTTGAGGTCAGGAGTTCGA(SEQ ID NO：71)
[0124] 探针：CATGGGAGTCCCACCGTATTGTCCA(SEQ ID NO：72)
[0125] HMGB3：
[0126] 正向引物：CGCTATGATCGGGAAATGAAG(SEQ ID NO：73)
[0127] 反向引物：TGGCCTTTTGGGAGCATTAG(SEQ ID NO：74)
[0128] 探针：ATTATGGACCAGCTAAGGGAGGCAAG(SEQ ID NO：75)
[0129] 并且利用以下引物对和探针以标准化基因序列的表达：
[0130] 正向引物：GCCAACCGCGAGAAGATG(SEQ ID NO：81)
[0131] 反向引物：ACAGCCTGGATAGCAACGTACA(SEQ ID NO：82)
[0132] 探针：CCCAATCATGTTTGAGACCTTCAAC(SEQ ID NO：83)。
[0133] 本发明还有一目的是一种体外诊断试剂盒，其通过实时PCR检测生物学样品中包含SEQ ID NO：1或由其构成的序列和在癌症干细胞中表达的一种或多种基因的表达，从而评估肿瘤的组织病理学阶段和是否存在转移，所述基因选自：CD133、c-myc、Nanog、Oct4、TCFL1、ZIC1、KLF5、HMGA1、HMGB3，通过实时TaqMan试验检测，所述试剂盒包含以下组分或由以下组分构成：
[0134] a)包含SEQ ID NO：1或由其构成的所述序列的以下扩增引物：
[0135] 正向引物：CGGGAATTCCCAGAGGACACCTCCAC(SEQ ID NO：3)
[0136] 反向引物：CGGCTCGAGCCGAGGGTCTAACCCAG(SEQ ID NO：4)
[0137] b)标准化所述序列的表达值的对照引物对；
[0138] c)显示所述一种或多种基因的序列的一对或多对的以下引物和相应探针：
[0139] cd133
[0140] 正向引物：TCCACAGAAATTTACCTACATTGGAA(SEQ ID NO：49)
[0141] 反向引物：GGGTCAGCAGAGAGCAGATGA(SEQ ID NO：50)
[0142] 探针：AGTATGATTCATACTGGTGGCTGGGTGGC(SEQ ID NO：51)
[0143] c myc：
[0144] 正向引物：GCTGGATTTTTTTCGGGTAGTG(SEQ ID NO：52)
[0145] 反向引物：TAGTTCCTGTTGGTGAAGCTAACG(SEQ ID NO：53)
[0146] 探针CAGCAGCCTCCCGCGACG(SEQ ID NO：54)
[0147] nanog：
[0148] 正向引物：CCGAAGAATAGCAATGGTGTGA(SEQ ID NO：55)
[0149] 反向引物：GCATCCCTGGTGGTAGGAAGA(SEQ ID NO：56)
[0150] 探针：CAGCACCTACCTACCCCAGCCTTTA(SEQ ID NO：57)
[0151] oct 4：
[0152] 正向引物：AACCCGGAGGAGGTAGTCCTT(SEQ ID NO：58)
[0153] 反向引物：AATAACCTACCCACAAATGTCATTCA(SEQ ID NO：59)
[0154] 探针：CATGCATGAGTCAGTGAACAGGGAA(SEQ ID NO：60)
[0155] tcfl1：
[0156] 正向引物：CCAAGGAAGAGAACGTTGACATAG(SEQ ID NO：61)
[0157] 反向引物：CCGAGGGAGCAGGATCAAG(SEQ ID NO：62)
[0158] 探针：AGGCTCTTTGTGTTTTTCCTTGTCTTTTGTCC(SEQ ID NO：63)
[0159] zic 1：
[0160] 正向引物：CGCGCTCCGAGAATTTAAAG(SEQ ID NO：64)
[0161] 反向引物：CGGTCACAGCCCTCAAACTC(SEQ ID NO：65)
[0162] 探针：TCCACAAAAGGACGCACACAGGG(SEQ ID NO：66)
[0163] KLF5：
[0164] 正向引物：TTTAACCCCACCTCCATCCTATG(SEQ ID NO：67)
[0165] 反向引物：GGCAGGGTGGTGGGTAAATT(SEQ ID NO：68)
[0166] 探针：TGCTTCTAAACTGGCAATTCACAATC(SEQ ID NO：69)
[0167] HMGA1：
[0168] 正向引物：CCCCAGGCAGACCTTATATGAG(SEQ ID NO：70)
[0169] 反向引物：TGCTTGAGGTCAGGAGTTCGA(SEQ ID NO：71)
[0170] 探针：CATGGGAGTCCCACCGTATTGTCCA(SEQ ID NO：72)
[0171] HMGB3：
[0172] 正向引物：CGCTATGATCGGGAAATGAAG(SEQ ID NO：73)
[0173] 反向引物：TGGCCTTTTGGGAGCATTAG(SEQ ID NO：74)
[0174] 探针：ATTATGGACCAGCTAAGGGAGGCAAG(SEQ ID NO：75)
[0175] d)标准化所述基因的序列表达的以下引物和探针：
[0176] 正向引物：GCCAACCGCGAGAAGATG(SEQ ID NO：81)
[0177] 反向引物：ACAGCCTGGATAGCAACGTACA(SEQ ID NO：82)
[0178] 探针：CCCAATCATGTTTGAGACCTTCAAC(SEQ ID NO：83)。
[0179] 特别是，b)中标准化所述序列表达的对照引物可以是以下引物：
[0180] 正向引物：GAA AAG CCT TGT TTG TGC TTG C(SEQ ID NO：5)
[0181] 反向引物：GGG CCA TGC TAA TCT TCT CTG T(SEQ ID NO：6)。
[0182] 此外，本发明涉及体外诊断试剂盒，其通过TaqMan测试检测生物学样品中包含SEQ ID NO：1或由其构成的序列和在癌症干细胞中表达的一种或多种基因的表达来评估肿瘤的组织病理学阶段和是否存在转移，所述基因选自：CD133、c-myc、Nanog、Oct4、TCFL1、ZIC1、KLF5、HMGA1、HMGB3，
[0183] 所述诊断试剂盒包含以下组分或由以下组分构成：
[0184] a1)检测包含SEQ ID NO：1或由其构成的所述序列表达的以下引物和探针[0185] 正向引物：AGGACACCTCCACTCCGTCTAC(SEQ ID NO：7)
[0186] 反向引物：GCCTAACCAATGTGCAGACTACTG(SEQ ID NO：8)
[0187] 探针：CAGTGTTTAGACTATCTGTTCAGGACTCCCAAATTG(SEQ ID NO：9)；
[0188] b1)检测所述一种或多种基因表达的一对或多对以下引物和相应探针：
[0189] cd133
[0190] 正向引物：TCCACAGAAATTTACCTACATTGGAA(SEQ ID NO：49)
[0191] 反向引物：GGGTCAGCAGAGAGCAGATGA(SEQ ID NO：50)
[0192] 探针：AGTATGATTCATACTGGTGGCTGGGTGGC(SEQ ID NO：51)
[0193] c myc：
[0194] 正向引物：GCTGGATTTTTTTCGGGTAGTG(SEQ ID NO：52)
[0195] 反向引物：TAGTTCCTGTTGGTGAAGCTAACG(SEQ ID NO：53)
[0196] 探针：CAGCAGCCTCCCGCGACG(SEQ ID NO：54)
[0197] nanog：
[0198] 正向引物：CCGAAGAATAGCAATGGTGTGA(SEQ ID NO：55)
[0199] 反向引物：GCATCCCTGGTGGTAGGAAGA(SEQ ID NO：56)
[0200] 探针：CAGCACCTACCTACCCCAGCCTTTA(SEQ ID NO：57)
[0201] oct 4：
[0202] 正向引物：AACCCGGAGGAGGTAGTCCTT(SEQ ID NO：58)
[0203] 反向引物：AATAACCTACCCACAAATGTCATTCA(SEQ ID NO：59)
[0204] 探针：CATGCATGAGTCAGTGAACAGGGAA(SEQ ID NO：60)
[0205] tcfl 1：
[0206] 正向引物：CCAAGGAAGAGAACGTTGACATAG(SEQ ID NO：61)
[0207] 反向引物：CCGAGGGAGCAGGATCAAG(SEQ ID NO：62)
[0208] 探针：AGGCTCTTTGTGTTTTTCCTTGTCTTTTGTCC(SEQ ID NO：63)
[0209] zic 1：
[0210] 正向引物：CGCGCTCCGAGAATTTAAAG(SEQ ID NO：64)
[0211] 反向引物：CGGTCACAGCCCTCAAACTC(SEQ ID NO：65)
[0212] 探针：TCCACAAAAGGACGCACACAGGG(SEQ ID NO：66)
[0213] KLF5：
[0214] 正向引物：TTTAACCCCACCTCCATCCTATG(SEQ ID NO：67)
[0215] 反向引物：GGCAGGGTGGTGGGTAAATT(SEQ ID NO：68)
[0216] 探针：TGCTTCTAAACTGGCAATTCACAATC(SEQ ID NO：69)
[0217] HMGA1：
[0218] 正向引物：CCCCAGGCAGACCTTATATGAG(SEQ ID NO：70)
[0219] 反向引物：TGCTTGAGGTCAGGAGTTCGA(SEQ ID NO：71)
[0220] 探针：CATGGGAGTCCCACCGTATTGTCCA(SEQ ID NO：72)
[0221] HMGB3：
[0222] 正向引物：CGCTATGATCGGGAAATGAAG(SEQ ID NO：73)
[0223] 反向引物：TGGCCTTTTGGGAGCATTAG(SEQ ID NO：74)
[0224] 探针：ATTATGGACCAGCTAAGGGAGGCAAG(SEQ ID NO：75)
[0225] c1)标准化以上报道的基因序列表达的以下引物和探针对：
[0226] 正向引物：GCCAACCGCGAGAAGATG(SEQ ID NO：81)
[0227] 反向引物：ACAGCCTGGATAGCAACGTACA(SEQ ID NO：82)
[0228] 探针：CCCAATCATGTTTGAGACCTTCAAC(SEQ ID NO：83)。
[0229] 通过各种优选实现方式以及附图说明性而非限制性地描述本发明，其中：
[0230] 图1显示miR199b-5b对Daoy MB细胞增殖和分化的体外功能。
[0231] A)碘化丙啶(propidium iodine)的代表性FACS分析显示稳定的199bSC1克隆在S期的细胞百分比降低，G0-G1期的细胞百分比升高。199bSC1和199bMC1克隆中G0-G1红峰缺乏肩峰信号排除了凋亡过程。B)3-4，5-二甲基噻唑-2-基-5-3-羧基甲氧基苯基-2-4-磺苯基-2H-四唑盐(MTS)增殖试验显示与仅含空载体的稳定克隆(蓝色菱形)相比，稳定的199bSC1(红色三角形)和199bMC1(绿色叉号)克隆增殖率降低。2-OM转染(粉色正方形)降低miR-199b-5b过表达的这种作用。显示的数据是两次独立实验的平均值±SD，每次实验采用三个重复样本。C)实时PCR显示与野生型细胞的稳定199bSC1和199bMC1克隆相比，miR-199b-5b过表达后分化标记物(例如，MASH1、MATH3和神经发生素
2(NEUROGENIN 2))和增殖标记物(例如，c-MYC、细胞周期蛋白D1)的代表性mRNA表达。D)miR-199b-5p的稳定199bSC1克隆在软琼脂试验中显示菌落形成减少。该图显示进行的三次独立实验的菌落计数：平均值±SD，每次实验采用三个重复样本。E)利用抗-c-Myc和抗-细胞周期蛋白D1抗体的代表性蛋白质印迹显示这两种蛋白在稳定的199bSC1克隆中下调；还参见右图中的密度计分析。F)E显示miR-199b表达后GABRA6和MATH3蛋白上调，提示诱导了分化。利用抗-层粘连蛋白-β抗体标准化核c-Myc和细胞周期蛋白D1表达。
利用抗-β-肌动蛋白抗体标准化胞质GABRA6和MATH3蛋白质表达。
[0232] 图2显示miR-199b-5p过表达减少Daoy细胞的CD133+区室。
[0233] A-F)稳定199bSC1(D)和199bMC1(F)克隆的代表性FACS分析显示干细胞标记物CD133(B)阳性细胞的百分比降低；A、C和E是阴性对照(无抗体)。
[0234] 图3显示HES1转染逆转了miR-199b-5p作用。
[0235] A)代表性蛋白质印迹和密度计分析显示稳定199bSC1克隆中过表达HES1 cDNA对重现HES1表达使细胞周期蛋白D1表达恢复。B)3-4，5-二甲基噻唑-2-基-5-3-羧基甲氧基苯基-2-4-磺苯基-2H-四唑盐(MTS)增殖试验显示与单独的稳定199bSC1克隆(淡蓝色菱形)相比，表达HES1的稳定199bSC1克隆(深蓝色正方形)增殖率升高。数据显示的是两次独立实验的平均值±SD，每次实验采用三个重复样本。C)实时PCR显示，与野生型细胞相比，一旦在稳定199bSC1克隆中用HES1拯救细胞，分化标记物(例如，MASH1、MATH3和神经发生素2)和增殖标记物(例如，c-MYC、细胞周期蛋白D1)的代表性mRNA表达。拯救实验中GABRA 6和MAP2的表达下调。D)与单独的稳定199bSC1克隆相比，表达HES1的稳定199bSC1克隆的代表性FACS分析显示S期细胞的分数升高，而G1期的降低。E-H)HES1再表达逆转miR-199b-5p表达对Daoy细胞的SP的影响。用HES1 cDNA和GFP-编码质粒转染199bSC1稳定克隆，48小时后用Hoechst和维拉帕米(verapamil)(E-F)或单用Hoechst(G-H)处理并通过FACS分析。分析GFP-阳性细胞(P5门)(图E和G)中是否存在染料-排除-细胞(F-H，P6门)。未转染的GFP阴性细胞(P3门)未作分析。
[0236] 图4显示过表达miR-199b-5p的Daoy细胞的肿瘤原性降低。
[0237] A)9周的异种移植实验，5只小鼠皮下注射对照Daoy细胞(CTR侧)和过表达miR-199b-5p的Daoy细胞(199b侧)。对于CTR细胞，在5/5只小鼠中肿瘤肉眼可见，对于过表达细胞，在3/5只小鼠中检测到。如图所示，生长9周后，CTR和199b注射侧的肿瘤总体积差异在统计学上显著(平均值±SD)。B)肿瘤生长9周后4号小鼠的光子发射。199b侧(199bLuc-1)的光子发射总低于对照侧(Ctl-Luc-4)。还比较了肿瘤尺寸。C)将光子发射(见B)转换成细胞数后，5只小鼠中的一只不显示明显差异(平均值±SD)(双尾不成对t检验)。D)在第四室中分别注射以下的3只小鼠的光子发射：199bLuc-1、用模拟序列AdV5感染的Ctl-Luc-4和用miR-199b-5p AdV5感染的Ctl-Luc-4。E)动物的整个脑和注射部位(白色箭头)。小脑的苏木精/曙红染色；黑色箭头，肿瘤发生起始部位。F)肿瘤生长一个月后，D的注射小鼠的BLI。各组之间的差异是统计学显著的。G)两只所选小鼠在一定时间(0-8周)的BLI，Ctl-luc4-AdV5-模拟序列(mock)#7显示肿瘤负荷产生，Ctl-luc4-AdV5-199b#3显示降低。H)常位注射后10周的AdV5-模拟序列#2和AdV5-199b#3小鼠的小脑的苏木精-曙红染色，显示围绕外颗粒层的和第四室内的肿瘤细胞(白色星形)。在蓝色部分，显示了DAPY染色以及GFP检测。显示了放大率。
[0238] 图5显示注射入小脑的异种移植MB细胞的高分辨率分子成像。
[0239] 外科手术和注射12周时，AdV5-模拟序列#7(A)和AdV5-199b#5(B)小鼠的PET-CT合并图像同时显示FLT摄取区域(蓝-绿，白色箭头)，采用3D体积扫描法(volume rendering)。AdV5-模拟序列#7小鼠颅骨的枕骨-顶骨部分中明显有更大的骨缺陷。下部：PET-CT获取的肿瘤质量测量值表(cm3)(补充材料所述)。
[0240] 图6显示人小脑和肿瘤中miR199b的表达水平和预后相关性。
[0241] A)显示了两种年龄范围的健康人小脑中miR-199b-5p表达水平的箱线图。年轻对照的外植体中显示miR-199b-5p表达较高(Mann-Whitney检验，P＝0.006)。B)2
MiR-199b-5p高度表达的情况大多是M0P＝0.001(Pearson κ 检验)。C)卡-迈(Kaplan-Meier)存活预测比较了miR-199b-5p表达水平低与表达水平高(相比于中等水平)的患者(有随访数据可用的45位患者)。D)通过实时PCR检测未处理或用5-氮杂-C处理的一组5种MB细胞系(DAC-/+)的MiR-199b-5p表达；脱甲基化诱导两种细胞系：med8a和uw228中的miR-199b-5p转录。
[0242] E)miR-199b-5p和Notch途径之间的相互作用
[0243] M0和M+患者显示miR-199b-5p的表达水平不同，可能是后生机制驱动。左侧：在诱导miR-199b-5p表达的条件下(1)，HES1的水平降低，缓解对神经原性bHLH的抑制(2)。进而促进神经原性程序和增殖降低，SP和CD133+细胞(3)。右侧：在低miR-199b-5p表达条件下，HES1的水平较高(1)，阻遏促神经(pro-neural)bHLH基因，伴有增殖升高，SP和CD133+区室增大(4)。
[0244] 图7显示miR199b-5p表达与MB患者存活相关：卡-迈分析显示miR199b-5p水平低的患者与Mir-199b-5p水平高(33°和66°百分比)的患者(有90/108患者的随访数据可用)。
[0245] 图8显示miR199b-5p表达与MB患者存活相关：卡-迈分析显示miR199b-5p水平低的患者与Mir-199b-5p水平高(33°和66°百分比)的患者(有90/108患者的随访数据可用)。
[0246] 图9.A)用miR-199b-5p和miR-199a的表达构建物瞬时转染HEK293细胞的代表性蛋白质印迹。MiR-199b-5p过表达降低内源性HES1蛋白的水平；相反，转染后48小时，miR-199a诱导HES1水平升高。右侧：通过密度计分析作定量测定。B)用miR-199b-5p的表达构建物和利用空载体瞬时转染D283细胞的代表性蛋白质印迹。MiR-199b-5p过表达仍降低内源性HES1蛋白的水平。下部是通过密度计分析的定量测定。C)D283和SH-SY5Y细胞表达类似水平的miR-199b-5p和miR-124a，后者已知优先表达在中枢神经系统中。相反，D283Med细胞显示miR-199b-5p水平明显较低。显示的数据是两次独立实验的平均值±SD，每次实验采用三个重复样本。D)一套人组织(安变公司(Ambion))的代表性MiR-199b-5p表达谱；miR-199b-5p表达程度不同，在十二指肠、淋巴结、肺、骨骼肌、右室(最高)、肾脏、整体心脏和甲状腺表达较高。
[0247] MiR-199b-5p作用于其假定的靶基因HES1的3’UTR。
[0248] E-F)miR-199b结合位点突变的含野生型3’UTR和HES1 3’UTR的报道载体的萤光素酶活性，用或不用miR-199b-5p的表达载体共同转染。miR-199b-5p表达将野生型3’UTR的萤光素酶活性降低50％，而2’-O-甲基-寡聚核糖核苷酸(2-OM；400nM)阻断该作用。miR-199b-5p与结合位点突变的HES1 3’UTR联用没作用。显示了代表性实验，其中数据是分别在HEK293和Daoy细胞系中的三个重复样本的平均值±SD。G-I)前(Pre)-miR-199克隆并转染入Daoy细胞，通过qRT PCR和蛋白质印迹评估3个稳定克隆的HES1表达。利用抗-HES1多克隆抗体显示HES1蛋白质水平明显降低；密度计分析也显示该降低(G；右图)。
H)将抗miR-199b-5p的2’-O-甲基-寡聚核糖核苷酸(2-OM)转染入稳定的199bSC1克隆，代表性蛋白质印迹和密度计分析定量测定显示恢复HES1表达。显示的定量测定数据是两次独立实验的平均值±SD，每次实验采用三个重复样本。
[0249] 图10.小鼠胚胎小脑中的Mmu-miR-199b表达，通过人miR-199b-5p调节其它潜在的靶标。
[0250] A)可在E14.5和新生小鼠(p0)小脑中检测Mmu-miR-199b的原位mRNA表达中。染色是弥散的，在小脑的整个区域；表达从E14.5到p0降低。Mmu-miR-124a(脑特异性miRNA)用作对照。左侧：放大倍数，50×；右侧：放大倍数，200×。B)定量测定小鼠小脑的发育和分化期间mmu-miR-199b表达的降低。相对于let-7A给出成熟miR-199b-5p的表达水平，显示的数据是两次独立实验的平均值±SD，每次实验采用三个重复样本。C)代表性蛋白质印迹显示在较高表达miR-199b-5p的稳定克隆中GSK3-β的蛋白质水平，预计其是靶标。如右图所示密度计分析进行的定量测定所示，GSK3-β水平未下调，而有略微增加，其中所示数据是两次独立实验的平均值±SD，每次实验采用三个重复样本。D)预计MiR-199b-5p能结合其它UTR(参见补充表S1)。当检测Daoy细胞中miR-199b-5p过表达是否下调所示携带全长3’UTR的报道基因的生产性翻译时，无一观察到受影响。所示数据是两次独立实验的平均值±SD，每次实验采用三个重复样本。E)细胞运动性试验利用博伊登室系统(0.5％FBS作为化学引诱物)比较199bSC1细胞系与Daoy空载体CTR(对照)细胞系。固定运动性较高的细胞，苏木精染色，用显微镜计数。所示数据是两次独立实验的平均值±SD，每次实验采用三个重复样本，它们显示对照(CTR)和199bSC1细胞系之间没有差别。F)如所示瞬时转染后，过表达miR-199b-5p的D283MED和ONS76细胞的增殖试验(MTS)。199b-5p转染的D283MED细胞(蓝色菱形)显示与对照，空载体转染(绿色三角形)相比，细胞增殖降低。ONS76细胞显示增殖率较高，然而该增殖率受199b-5p转染子的影响(比较空载体转染的橙色叉号与紫色正方形)。所示数据是两次独立实验的平均值±SD，每次实验采用三个重复样本。G)通过2-O-甲基寡聚核糖核苷酸反义(2-OM-a)转染使得miR-199b-5p的内源性表达沉默导致Daoy细胞增殖，可能解除内源性miR-199b-5p对HES1 3’UTR的控制。所示数据是两次独立实验的平均值±SD，每个实验采用三个重复样本。
[0251] 图11.miR-199b-5p对Daoy细胞侧群(side population)的作用的FACS分析。
[0252] A，C，E)Hoechst 33342染色检测到Daoy 199bSC1稳定克隆的SP细胞减少。B，D，F)加入维拉帕米迫使染料也进入SP细胞。Daoy细胞显示5.2％分数的SP细胞，而过表达miR-199b-5p的稳定199bSC1和199bMC1克隆不显示显著水平的SP细胞(分别是0.2％，0.4％)。
[0253] 图12.用于体内研究的过表达miR-199b-5p的生物发光Daoy细胞。
[0254] 用萤光素酶表达载体(Luc)转染含空载体(Ctl)的Daoy稳定克隆和过表达miR-199b-5p(199b)的Daoy稳定克隆，从而分别产生Ctl-Luc#4克隆和199bLuc-1及199b-Luc-3克隆。所有这些克隆与酶底物荧光素温育时，评估它们的生物发光表达。A)微板中显示的细胞连续稀释液发出的光。通过加利福尼亚州阿拉米达仙秦公司(Xenogen Corp.Alameda，CA)的IVIS 200成像系统获得生物发光信号。B)细胞数和光子发射之间的相关性。用于体内研究的199b-Luc1和Ctl-Luc#4克隆，所示数据是两次独立实验的平均值±SD。C)与携带空载体的萤光素酶克隆相比，萤光素酶克隆中miR-199b-5p的代表性表达数据。D)与空载体克隆相比，显示199b-Luc克隆中HES1表达降低的代表性免疫印迹分析。E，F)源自4号小鼠的异种移植物的苏木精和曙红染色：对照注射侧显示异种移植物浸润肌肉组织，而199b-注射侧没有。G、H)巢蛋白(Nestin)是成神经细胞标记，其表达与分化状态较低相关：4号小鼠199b-注射侧的异种移植物显示巢蛋白阳性降低。用多克隆抗体(Abcam)免疫组化方法进行巢蛋白染色。放大倍数，100×。I)5号小鼠的肿瘤外植体中转基因miR-199b-5p的代表性基因表达水平。miR-199b-5p过表达丧失。L，M，N)利用抗-HES1、抗-KI67、抗-Gabra6、抗-巢蛋白、抗-Math3抗体的免疫组化，AdV5-模拟序列和AdV5-199b小鼠小脑的异种移植物的苏木精染色。AdV5-模拟序列小脑肿瘤组织中见到Hes1、Ki67、巢蛋白和Math3蛋白显著表达，而在小脑的AdV5-199b肿瘤细胞中见到Hes1、Ki67巢蛋白和Math3表达极低。在AdV5-模拟序列小脑肿瘤组织和AdV5-199b小鼠之间很少见到Gabra6表达差异。左侧：放大倍数，25×；右侧：放大倍数，100×。
[0255] 图13.DAPT处理后的内源性miR199b过表达诱导Daoy细胞系中涉及胚胎干细胞和癌症干细胞的基因下调。
[0256] A)Daoy细胞系作DAPT处理(6小时、12小时、24小时)的时程实验的代表性数据，其中每4小时补加和替换培养基，采用实时定量检测测定与第0时相比的miR199b表达倍数。B)代表性蛋白质印迹显示DAPT诱导12小时后，Daoy细胞系中HES1下调。C)不用和用DAPT处理12小时的Daoy细胞系中CD133、c-Myc Oct4、KFL5、Nanog、TCF7L1、HMGA1、HMGB3、ZIC1、MYBL2、TEAD4、ILF3的相对基因表达水平。D)不用和用DAPT处理12小时的Daoy细胞系中PDGFR-A、PDGFR-B和SPARC的相对基因表达。采用实时cDNA定量检测所用的引物和它们的相对表达DDct值列于补充表格S3。
[0257] 图14.Mir-199-b-5p干扰注射入小鼠小脑的Daoy细胞的植入潜能。
[0258] A)利用异种移植有过表达miR-199b的Daoy Luc1细胞系的199b-Luc1小鼠的1IVIS 3D，通过稳定克隆分析作体内生物发光分析。(参见3号小鼠；参见图4的附加数据，主要文字)。小鼠一周扫描一次，共8周。B)到8周，携带ADV5-199b感染细胞的小鼠的BLI检测(光子/秒/cm-2)显示降低。C)560nm和660nm的IVIS光谱获取的图像以产生对象的图形。以3D轴(x，y，z)显示的Clt-Luc-4 AdV5-模拟序列异种移植的小鼠，其中与数字小鼠图相比较显示了肿瘤负荷的延伸，从而能利用Living Images软件显示3D重建上的3D骨架和器官。D)如上所述，对Ctl-luc AdV5 199b异种移植小鼠进行分析。3D图像的视频见附于单独的文件。
[0259] 图15.含序列SEQ ID NO：1的腺病毒载体AdV5-CMV-KpnI-NotIpA 6217bp图谱。
[0260] 图16.载体AdV5-CMV-KpnI-NotIpA 6217bp的序列(SEQ ID NO：2)。
[0261] 图17：A)对照SNALP(Daoy SNALP CTR)和SNALP miR 199b-5p(Daoy SNALP 199b)处理后第0、24、48和72小时的人MB细胞系Daoy的增殖试验(MTS)；B)通过实时PCR检测对照SNALP(Daoy SNALP CTR)和SNALP miR 199b-5p(Daoy SNALP 199b)处理后72小时的人MB细胞系Daoy的miR 199b-5p表达；C)对照SNALP(Daoy SNALP CTR)和SNALP miR 199b-5p(Daoy SNALP 199b)处理后72小时的人MB细胞系Daoy中膜联蛋白V的凋亡试验；D)蛋白质印迹检测对照SNALP(Daoy SNALP CTR)和SNALP miR 199b-5p(Daoy SNALP 199b)处理后72小时的人MB细胞系Daoy中的Hes1表达。
[0262] 图 18：A) 对 照 SNALP(HT29SNALP CTR) 和 SNALP miR 199b-5p(HT29 SNALP199b)处理后第0、24、48和72小时的人结肠癌细胞系的增殖试验(MTS)；在该侧，对照SNALP(HT29SNALP CTR)和SNALP miR 199b-5p(HT29 SNALP 199b)处理后作Hes1的蛋白质印迹分析；B)对照SNALP(MDA-231T SNALP CTR)和SNALP miR 199b-5p(MDA-231T SNALP 199b)处理后第0、24、48和72小时的人乳腺癌细胞系MDA-231T的增殖试验(MTS)。在该侧，对照SNALP和SNALP miR 199b-5p处理后作Hes 1的蛋白质印迹分析。
[0263] 图19：A)对照SNALP(4T1 SNALP CTR)和SNALP miR 199b-5p(4T1 SNALP 199b)处理后第0、24、48和72小时的人结肠癌细胞系的增殖试验(MTS)；B)通过实时PCR检测对照SNALP(4T1 SNALP CTR)和SNALP miR 199b-5p(4T1 SNALP 199b)处理后小鼠乳腺癌细胞系4T1中的miR 199b-5p表达；C)对照SNALP(4T1 SNALP CTR)和SNALP miR 199b-5p(4T1 SNALP
199b)处理后72小时的小鼠乳腺癌细胞系4T1中膜联蛋白V的凋亡试验；D)对照SNALP和SNALP miR 199b-5p处理后Hes1的蛋白质印迹分析。
[0264] 图20：A)通过实时PCR和Pearson检验检测到28个乳腺癌组织中miR 199b-5p表达与基因HMGA1逆相关(p＝0.046)。B)通过实时PCR检测28个乳腺癌组织中miR 199b-5p与基因c-myc和CD133的表达。
[0265] 图21：A)通过实时PCR和Pearson检验检测到15个结肠癌组织中miR 199b-5p表达与基因HMGA1逆相关(p＝0.08)。B)通过实时PCR检测15个结肠癌组织中miR 199b-5p与基因c-myc和CD133的表达。
[0266] 实施例1：研究miRNA 199b-5p在癌症中的功能
[0267] 材料与方法
[0268] 伦理公开
[0269] 所有动物的处理符合国家和国际指导规范。获得了动物保健机构和伦理委员会CEINGE“-费德里科那不勒斯第二大学，协议#13-08/01/2007(Istituzioni per la Cura degli Animali e comitato etico CEINGE”-Universitàdegli Studi di Napoli Federico II，Protocol #13-08/01/2007)和意大利卫生部，兽医公共卫生处DL 116/92(Ministero della Salute Italiano，Dipartimento SanitàPubblica Veterinaria DL 116/92)的伦理批准，证实所有实验符合法律。
[0270] 流式细胞术分析
[0271] 利用CELL Quest 3.3版本软件和加利福尼亚州圣何塞BD公司(Becton Dickinson，San Jose，CA)的FACSCalibur进行S-期部分和细胞周期动力学的流式细胞术分析。按照生产商的使用说明书，利用同一仪器进行CD133研究，抗体来自加利福尼亚州奥本的MB公司(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)。简言之，用Fc受体封闭试剂封闭细胞，4℃，将细胞与MB公司的抗-CD133/1(AC133)-藻红蛋白抗体避光温育10分钟。然后用PBS清洗并重悬细胞。CD133的表达水平高于免疫球蛋白G(iGG)对照的细胞视作阳性。为分析侧群，37℃，将细胞(106/mL)与Hoechst 33342(5μmol/L；西格玛公司(Sigma))在含有2％FBS的EMEM中温育90分钟。为确保正确鉴定侧群细胞，如上所述加入50μM维拉帕米(西格玛公司)温育细胞。
[0272] 稳定Daoy萤光素酶克隆的体内成像
[0273] 将表达萤光素酶的载体(克隆在plentiV5载体中的萤火虫萤光素酶基因；英杰公司(Invitrogen))转染入稳定的199bSC1克隆或对照空载体克隆来产生稳定的Daoy细胞克隆。然后将100,000个199b-Luc1和Ctl-Luc-4活细胞与1∶1的PBS∶基质胶(matrigel)溶液(加利福尼亚州圣何塞的BD生物科学公司(BD Biosciences))混合。利用阿佛丁(西格玛公司)的3％叔戊醇溶液(费希尔公司(Fisher))麻醉6周龄雌性无胸腺小鼠，剂量为每10克体重3毫克。在小鼠的每侧皮下注射总体积为0.1mL的基质胶PBS细胞悬液。细胞植入后获取小鼠的图像，利用加利福尼亚州阿拉米达仙秦公司的IVIS3D成像系统每周获取生物发光(BLI)来监测肿瘤生长。为获取生物发光，腹膜内异氟烷麻醉小鼠，注射每10克体重100μL D-荧光素(15mg/mL储备液)，荧光素注射后10分钟成像30秒；每只小鼠作4次获取(腹部、背部和每侧)。为定量测定生物发光，利用XC公司(Xenogen-Caliper)的Living Images软件包3.0测定各感兴趣区域的整合光子通量(每秒光子数)。从肿瘤生长开始时收集发射数据，至少6周，然后按照注射日的生物发光标准化。每周沿长轴和短轴作卡尺测量肿瘤大小，利用下式预计肿瘤体积：宽度2x长度x0.52。
[0274] 动物制备和PET/CT成像
[0275] 先将小鼠在通风笼中(26℃)维持1小时，再作成像研究。腹膜内给予氯胺酮(100mg/kg)和赛拉嗪(10mg/kg)(注射体积，100μl/10g)的混合物进行麻醉。在侧尾静脉中给予3′-脱氧-3′-[18F]氟胸苷([18F]FLT)后1小时利用动物PET扫描仪(GE Healthcare eXplore Vista，FWHM 1.6mm)进行PET(50μL；7.4MBq；扫描时间，18分钟)，3′-脱氧-3′-[18F]氟胸苷是肿瘤增殖标记物。PET后24小时内进行高分辨率CT研究(GE Healtcare eXplore Locus；空间分辨，45μm)。
[0276] 数据分析
[0277] 从PET研究计算最大(SUVmax)和平均(SUVmean)标准化摄取值(SUV)(SUV＝组织活性(MBq/cc)/[注射剂量(MBq)/体重(g)])。利用Osirix 3.3(MAC OS 10.5操作系统)对PET/CT图像作后加工以获得多层重建(MPR)、最大强度投影(MIP)、3D体积扫描和合并图像。利用MicroView(GE eXplore Locus)获得附加3D重建。
[0278] 利用内部开发的软件(基于IDL，IV公司(ITT Vis Inc))，通过以SUV＞50％SUVmax总结所有空间相连体素来计算病损体积。这些方法测定的病损概况用于AdV5-模拟序列和AdV5-199b之间依据ROI的比较。
[0279] 图5所示结果(主要文字)显示植入部位有广泛颅骨缺陷水平的肿瘤块，可能是颅骨内高水平的肿瘤发生和高水平的软骨性骨降解伴有PET处相应FLT摄取所致。在该PET-CT分析中，我们证实与异种移植有过表达miR-199b-5p的细胞的小鼠(AdV5-199p#5)相比，对照小鼠(AdV5-模拟序列#7)的小脑中存在增大的肿瘤。
[0280] 标准细胞培养
[0281] 人Daoy和D283-MED MB细胞系得自美国模式培养物保藏所(ATCC，马纳萨斯，弗吉尼亚州)，维持在补加了10％胎牛血清(FBS)、10U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素(CP公司(Celbio Pero)，米兰，意大利)的Eagle最低基础培养基(EMEM；西格玛公司)。HEK-293和SH-5YSY细胞维持在补加了10％FBS、10U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的Dulbecco改进Eagle培养基(DMEM；西格玛公司)。
[0282] 转染Daoy细胞和萤光素酶试验
[0283] 为测定miR-199b-5p对阻遏萤光素酶-3’UTR融合构建物的活性，在没有和有2-OM(400nM)存在下，联用Polyfect试剂(恰根公司(Qiagen))和pGL3基础载体将pREYZO-miR-199b-5p构建物和pRL-CMV-3’UTR靶构建物以10∶1的比例共同转染入HEK293细胞。利用双重萤光素酶报道试验系统(威斯康星州麦迪逊的普罗迈格公司(Promega，Madison，WI))萤光素酶活性。
[0284] AZA处理
[0285] 用补加10％FBS和抗生素的DMEM培养5种MB细胞系(d283、Daoy、med8a、ons76、uw228)。达到85％汇合后，给培养基添加5-氮杂-脱氧胞苷(AZA)(西格玛公司)至5μM的终浓度。在72小时期间，每日用新鲜的AZA-增强培养基替换培养基。采用标准的酚(TRIzol)-氯仿方案提取RNA。
[0286] 载体克隆
[0287] 利用EcoRI-XhoI限制性位点，将前-miR-199b克隆入pcDNA3修饰载体(pREYZO)(D’angelo等.，2004)。将HES1和GSK-3β靶结合位点(3’UTR)串联克隆入pRL-巨细胞病毒(CMV)载体(威斯康星州麦迪逊的普罗迈格公司)的3’UTR，在XbaI位点中Renilla萤光素酶(RL)的编码区下游。利用以下引物从基因组DNA扩增HES1 3’UTR(包括199b结合位点)：HES1_3′UTR是AAAATCTAGACAGTTCGAAGACATAAAAGCC，HES1_3′UTR是AAAATCTAGAAACGCAGTGTCACCTTCC，将其克隆入TK载体(威斯康星州麦迪逊的普罗迈格公司)的XbaI位点，萤火虫萤光素酶基因的上游。采用标准RT-PCR方案，从Daoy cDNA获得HES1全长cDNA。
[0288] 定点诱变
[0289] 按照生产商的方法，利用加利福尼亚州拉霍亚斯特拉塔基因公司的快变定点诱变试剂盒(QuikChange site-directed mutagenesis kit，Stratagene，La Jolla，CA)定点突变HES1 3’UTR中的miR-199b-5p结合位点。以下引物用于诱变(仅给出有义序列，下划线标出了共用序列内的突变核苷酸)：HES1 3’UTR有义AACAGGAACTTGAATATTTGTAGAGAAGAGGACTTT。
[0290] TaqMan miRNA试验
[0291] 逆转录酶反应
[0292] 逆转录酶(RT)反应包含40ng RNA样品、50nM茎-环RT引物、1x RT缓冲液(P/N：4319981，应用生物系统公司(Applied Biosystems))、0.25mM各种dNTP、3.33U/ml MultiScribe RT(P/N：4319983，应用生物系统公司)和0.25U/ml RNA酶抑制剂(P/N：N8080119；应用生物系统公司)。15μl反应在应用生物系统公司9700热循环仪中进行以下温育：16℃、30分钟，42℃、30分钟，85℃、5分钟，然后维持于4℃。
[0293] 实时PCR
[0294] 采用标准TaqMan PCR试剂盒方案，利用应用生物系统公司7900HT序列检测系统进行实时PCR。20μl PCR混合物包含2μl RT产物、10μl TaqMan通用PCR主混合物(应用生物系统公司)、0.2mM TaqMan探针。95℃下，在96-孔板中温育反应10分钟，然后进行60轮以下循环：95℃、15秒，60℃，1分钟。
[0295] RNA分离、cDNA制备和实时定量PCR
[0296] 利用Trizol试剂(英杰公司)从细胞系中提取总RNA。利用英杰公司的Super Script II第一链试剂盒(First Strand Kit)从总RNA(4μg)合成cDNA。采用标准方案，利用应用生物系统公司ABI PRISM 7900HT序列检测系统进行实时定量PCR。为计算miR-199b-5p前体的相对基因表达，按照U6miRNA标准化各前-miRNA的相对量；利用β-肌动蛋白基因标准化其它基因。利用引物表达软件2.0版(应用生物系统公司)设计各基因的实时PCR引物。索取后可获得引物序列。
[0297] 用于分析涉及癌症干细胞生物学特性的基因的Unigene ID和引物序列以及2^-DCt值示于表1。
[0298] 表1
[0299]
[0300]
[0301] 蛋白质印迹
[0302] 30μg胞质或核裂解物加载在12％聚丙烯酰胺凝胶上，印迹到聚偏二氟乙烯膜(PVDF；伯乐公司(BioRad)，米兰，意大利)。然后将膜与以下温育：抗-HES1(日本镰仓东丽工业公司Tetsuo Sudo博士馈赠(TORAY Industries，Tebiro Kamakura))、多克隆兔抗体(1∶500)、抗-GSK3-β(BD生物科学公司)单克隆抗体(1∶2500)、抗-c-Myc多克隆抗体(1∶200)(美国加利福尼亚州圣克鲁斯的圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA))、抗-GABRA6抗体(美国加利福尼亚州圣克鲁斯的圣克鲁斯生物技术公司)(1∶200)、抗-MATH3抗体(美国加利福尼亚州圣克鲁斯的圣克鲁斯生物技术公司)(1∶200)和抗-细胞周期蛋白D 1(1∶200)多克隆家兔抗体(细胞信号传导公司(Cell Signaling))。抗-β-肌动蛋白抗体(1∶1.000)(西格玛公司)用作等量加载胞质裂解物的对照，多克隆抗-β-层粘连蛋白抗体(1∶50)(美国加利福尼亚州圣克鲁斯的圣克鲁斯生物技术公司)用作等量加载核裂解物的对照。
[0303] 软琼脂试验
[0304] 将Daoy细胞和稳定的199b克隆接种在补加了2％FBS、含有0.3％琼脂糖的1ml EMEM。维持培养两周，每周用补加了2％FBS的EMEM替换。利用莱卡Leica(Nussloch，德国)DC500复合显微镜计数直径超过100μm的菌落。
[0305] 增殖试验MTS
[0306] 利用威斯康星州麦迪逊的普罗迈格公司的Celltiter96水性非放射性细胞增殖试验试剂盒(CellTiter96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Kit)。将3
细胞以1x 10 个细胞/孔接种在96-孔板的含或不含FBS的EMEM中。0、24、48和72小时后，将MTS([3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑])和PMS(吩嗪甲基硫酸酯(phenazine methosulfate))加入各孔，4小时后，利用帕金
3
埃尔默公司(Perkin Elmer)的多标记计数器Victor 检测各孔的490nm吸光度(OD490)。用
5孔实施各条件，各试验重复两次。
[0307] 免疫组化
[0308] 97℃下，在pH 6的10mM柠檬酸盐缓冲液中进行去屏蔽(unmask)45分钟。室温下，用含背景降低组分的抗体稀释液(DC公司(Dako Cytomation))封闭30分钟；4℃，利用多克隆抗-HES1(1∶1000)、抗-巢蛋白(1∶1000)、抗-GABRA6(1∶100)、抗-MATH3(1∶100)抗体过夜。室温下，利用Kit LSAB DAKO使信号显示15分钟(生物素)，利用Kit LSAB DAKO15分钟(链霉亲和素)。
[0309] DAB购自DC公司，封片，利用Leica(Nussloch，德国)DC500复合显微镜检查。
[0310] 锁定核酸原位杂交
[0311] 室温下，将鼠胚胎脑或人多组织阵列的干燥载玻片在4％低聚甲醛中固定10分钟，室温下用1x PBS洗涤两次，3分钟。洗涤期间，新鲜制备乙酰化溶液，其含有：0.01％三乙醇胺和0.0025mM乙酸酐，二亚乙基焦碳酸酯(DEPC)水配制。然后将载玻片置于乙酰化溶液的烧杯中，温和搅拌10分钟。然后在DEPC处理水中用5μg/ml的蛋白激酶K处理载玻片5分钟，随后在室温下用1x PBS洗涤3分钟，室温下与杂交溶液预杂交6小时。利用150μl变性杂交、1pM锁定核酸DIG-标记探针(Exiqon，miRCURY)进行杂交。60℃杂交过夜。将载玻片浸在预热60℃的5x SSC，小心除去盖玻片；然后在60℃将载玻片在0.2x SSC中温育1小时，随后在室温下在0.1M Tris，pH 7.5，0.15M NaCl中温育10分钟。除去残余溶液，载玻片置于加湿室中；室温下将500μl封闭缓冲液(0.1M Tris配制的1％FCS，pH
7.5，0.15M NaCl)置于载玻片上以便温育1小时。用封闭溶液稀释抗-DIG-碱性磷酸酶抗体2,000倍，4℃温育过夜。玻片用0.1M Tris，pH 7.5，0.15M NaCl洗涤3次，然后在0.1M Tris，pH 9.5，0.1M NaCl，50mM MgCl中平衡。用BCIP/NTB(西格玛公司)染色载玻片，脱水并封片；利用莱卡Leica(Nussloch，德国)DC500复合显微镜获取图像。
[0312] DAPT处理Daoy细胞系
[0313] 人Daoy细胞系得自美国模式培养物保藏所(ATCC，马纳萨斯，弗吉尼亚州)，维持在补加了10％胎牛血清(FBS)(CP公司，米兰，意大利)、10U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素(CP公司，米兰，意大利)的EMEM中(西格玛阿尔德里奇公司(Sigma Aldrich)，米兰，意大利)。HEK-293和SH-5YSY细胞维持在补加了10％FBS(CP公司)、10U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素(CP公司)的DMEM中(西格玛公司)。
[0314] 如下所示用N-[N-(3，5-二氟苯乙酰基)-1-丙氨酰基]-S-苯基甘氨酸叔丁酯(DAPT(西格玛阿尔德里奇公司)处理Daoy细胞，在含有10％FBS的培养基中生长过夜。后一早上，将培养基替换为含有10μM DAPT的培养基，每4小时用该培养基替换。采用包括相应体积的DMSO作为载体的对照试验，miR199b处理0、6、12、24小时后进行表达测定。
[0315] 体外细胞运动性试验
[0316] “细胞运动性”试验利用对照DAOY细胞系和稳定的DAOY-199bSC1克隆。用8-μm孔径的Transwells(柯萨公司(Costar))进行细胞运动性试验。通过胰蛋白酶处理悬浮细胞，4
洗涤并重悬在含有0.1％BSA的100μl无血清DMEM中(5x 10 个细胞)，置于Transwells的上室中。下室注有补充了0.5％FBS作为化学引诱物的600μl无血清DMEM。细胞在37℃迁移1小时。迁移至聚碳酸酯膜较低侧的细胞用2.5％戊二醛固定，用苏木精溶液(西格玛公司)染色。计数细胞，每个条件分析3个Transwell，每个实验重复两次。
[0317] 患者样品
[0318] 从3个不同的中心收集总共61例MB：12例外科MB样本获自意大利那不勒斯圣托伯诺医院神经外科部门(Department of Neurosurgery，Santobono Hospital，Naples，Italy)；18例获自法国巴黎居里研究院(Institute Curie，Paris，France)；31例获自加拿大多伦多市病患儿童医院(The Hospital for Sick Children，Toronto，Canada)。患者的特征见表2。肿瘤样品分析前获得知情同意。所有样品在放疗或化疗前的诊断时获得，29例按照WHO标准[14]经组织病理学检查，所有患者的M状态信息可用。对照人组织从马里兰州巴尔的摩市马里兰大学的发育疾病NICHD脑和组织库获得。如以上细胞系所述，利用英杰公司的Trizol试剂提取总RNA，通过TaqMan微小RNA试验分析miR-199b-5p表达水平。2
按照中值，将miR-199b-5p表达水平分成两组(低和高)，采用Pearson κ 检验在转移和非转移组之间作比较。采用时序检验(Log-rank test)确定显著性，通过SPSS软件进行存活分析。P值为0.05时有统计学显著性。
[0319] 表2
[0320]
[0321]
[0322]
[0323]
[0324]
[0325] 续表2
[0326]
[0327] 腺病毒构建
[0328] miR199b序列按照5’XhoI，3’HindI III定向克隆入VQ Ad5CMV K-NpA穿梭载体，载体由ViraQuest公司.，创新腺病毒技术和试剂(ViraQuest Inc.，Innovative Adenovirus Technologies and Reagents)提供，其提供了载体重组和199b腺病毒构建(参见图16的载体序列SEQ ID NO：2和图15的含序列SEQ ID NO：1的载体)。它们还提供从质粒VQ Ad5CMVeGFP产生的对照骨架E3萤光素酶病毒。
[0329] 腺病毒感染
[0330] 在500μl完全细胞培养基中，细胞与腺病毒接触1小时实现重组病毒感染，然后加入其它培养基。测定转染效率时，我们利用腺病毒(AdV模拟序列和AdV 199b)的GFP-表达作为对照。
[0331] 异种移植入SCID小鼠小脑的右室
[0332] 为建立小脑内异种移植模型，用三溴甲醇(Avertin )(50mg/kg)麻醉6-8周龄SCID小鼠；之后，作出小的皮肤切口(1mm)并用加利福尼亚州福斯特城精密科学工具公司(Fine Science Tools，Foster City，CA)的微型外科手术钻产生钻孔(0.7mm直径)。将感染5
有腺病毒模拟序列、腺病毒199b和199b LUC1稳定克隆(10)的Daoy Luc细胞悬浮在5μL PBS中，利用垂直插入头盖表面的10-AL，26-号Hamilton Gastight 1701注射器针头经钻孔缓慢注射入右小脑半球(立体趋向座标(stereotactic coordinate)离前囱前后5.5mm；
右侧2.1mm；背腹5.0mm)。通过生物发光每周监测小鼠以评估肿瘤生长，共8周。
[0333] 3D获得
[0334] IVIS图谱：本系统获得不同波长(560到660nm)的照相和结构光图像以及两个或更多个生物发光图像，产生对象的表面拓扑学特征(网孔)。改进特定的用户可改进DLIT算法参数(例如，分析波长、源图谱和组织特性)，我们能重建对象中发光来源的位置、几何特征和强度。Living Image 软件提供能展示在3D重建基础上展示3D骨架和器官的数字小鼠图谱。
[0335] 动物PET和SPECT-CT
[0336] 然后用2.5％异氟烷麻醉小鼠，并在整个成像过程中维持于1％异氟烷麻醉。分别18 18
采用[ F]FDG和[ F]氟化物PET成像检测肿瘤细胞诱导代谢和骨架变化。利用GE保健公司(GE Healthcare)的Explorer-Vista小动物PET-CT系统获得3个床位置的图像(每个床位置10分钟，总共30分钟)，轴向分辨率为1.2mm。
[0337] 结果
[0338] Hsa-miR-199b-5p通过3’UTR结合使HES1表达沉默
[0339] 我们对mirBase靶标数据库[27]作计算机分析以鉴定可能靶向一种Notch途径效应物HES1的miRNA，一种调节MB细胞增殖的基本机制。MiR-199b-5p和miR-199a-5p是更好评分的miRNA，预计能结合人bHLH HES1的3’UTR。相比于miR-199a-5p，瞬时过表达下miR-199b-5p能降低HES1表达，因此我们将注意力集中于它(图9A、B)。肺肿瘤中miR-199b-5p丧失[28]，其经作图位于膀胱癌中缺失的基因组区域[29]。肝细胞癌中*MiR-199a(也称为miR-199a-5p，含与miR-199b-5p相同的序列)也降低[30-32]。两个MB细胞系(成人组织和小鼠小脑)中miR-199b-5p表达的分析示于图9C、D和10A、B。
[0340] 为测定HES1是否为miR-199b-5p的靶标，将HES1 3’UTR克隆到萤光素酶报道基因载体的下游；前-miR-199b-5p也克隆入哺乳动物表达载体。然后转染HEK-293细胞，相对萤光素酶活性显示miR-199b-5p共转染降低报道基因活性，因而表明与3’UTR结合和萤光素酶mRNA的生产性翻译不稳定(图9，9E)。作为对照，miR-199b-5p结合位点有突变的HES1 3’UTR不受miR-199b-5p影响(图9，9E)，当成熟miR-199b-5p的互补2-O’-甲基寡聚核糖核苷酸(2-OM)共转染时，其抵消miR-199b-5p转染的作用，从而恢复报道基因活性(图9，9E)。在Daoy MB细胞中获得类似结果(图9图9F)。
[0341] 为测定miR-199b-5p在MB细胞生物学特性中的作用，将miR-199b-5p表达构建物转染入Daoy细胞，选择过表达miR-199b-5p的几个稳定克隆。通过实时PCR证实过表达(图9，9G)。3个克隆显示HES1蛋白质水平降低，其中1个(199bSC1)表现为没有检测到HES1。选择199bSC1和199bMC1克隆作进一步研究(图9，9H)。miR-199b-5p对HES1蛋白质表达的这些作用不局限于稳定克隆或Daoy细胞，因为瞬时转染miR-199b-5p的表达构建物的D283MED细胞也显示HES1水平降低(图9，9B)。
[0342] 为强化这些结果，用miR-199b-5p的反义2-OM转染199bSC1克隆，其用作负对照(图9，9I)。此处，HES1水平恢复，提示2-OM阻断miR-199b-5p导致的HES1阻遏，从而进一步证实miR-199b-5p直接靶向HES1。还以此方式研究了miR-199b-5p的其它潜在靶标(图9，图10C、D)。
[0343] miR-199b-5p过表达降低细胞增殖并损伤MB细胞系的克隆原性潜能
[0344] 与对照克隆相比，199bSC1和199bMC1克隆在标准培养条件下的增殖率降低。因此，我们在这些克隆中找寻潜在的细胞周期改变。与单用空载体相比，199bSC1克隆的FACS分析显示，S-期部分减少31％，G0-G1的细胞增加15％(图1A)。这提示脱离细胞周期在降低Daoy细胞199bSC1克隆增殖率中有作用。相反，199bMC1克隆的细胞周期不显示明显改变。我们相信这些结果是因为199bMC1降低HES1蛋白质水平的总体效率较低。比较199bSC1和199bMC1克隆和空载体克隆及针对miR-199b-5p设计的2-OM的瞬时转染子的体外增殖试验评估到，这些细胞周期表型转变成体外增殖率降低(图1B)。199bMC1和1999SC1克隆均显示增殖率显著降低。转染该反义2-OM诱导稳定199bSC1克隆增殖显著增加，与HES1表达水平恢复一致。D283和ONS76细胞也证实Daoy细胞增殖的这些结果(图10F)。野生型Daoy细胞中也证实miR-199b-特异性2-OM的作用，它可能作用于内源性miR-199b(图10G)。
[0345] 通过实时方法评估miR-199b-5p对增殖和分化的分子标记物的诱导作用。如图1C所示，大多数在成熟神经元中表达[33]的MAP2在稳定的199bSC1和199bMC1克隆中上调。据报道，用丁酸苯酯分化后，Daoy细胞类似地表达GFAP[34]，在稳定的199bSC1克隆中，GFAP水平增加。在我们的过表达miR-199b-5p的稳定细胞系中，基因表达图谱与Hes1-/-小鼠的大脑中所见表型一致[23]。在其它基因中，GABRA6-一种小脑颗粒细胞分化标记物-也在稳定克隆中显著过表达(图1C)。
[0346] 正和负bHLH转录因子的微调级联对于神经发生至关重要，其中诸如MASH1、MATH3和NGN2等基因诱导神经发生，HES1-突变型小鼠显示这些激活剂型bHLH上调[35]。两个miR-199b-5p稳定克隆均显示促神经bHLH表达增加。与它们的增殖率降低一致的是，增殖标记物c-Myc和细胞周期蛋白D1降低。在分析的两种克隆中，199bSC显示更一致的表型；我们将这些结果解释为该克隆中HES1沉默更有效。
[0347] 由于miR-199b-5p稳定199bSC1克隆显示表型更强和更一致，我们随后采用标准克隆原性试验中对其检测以测定miR-199b-5p是否影响不依赖支持物的生长。与空载体克隆相比，集落形成潜能降低80％(图1D)。与增殖率的这种降低一致的是，增殖标记物c-Myc和细胞周期蛋白D1降低(图1E)。我们还在蛋白质水平证实199bSC1克隆中GABRA6和MATH3上调(图1F)；后者已知受HES1直接阻遏[35]。
[0348] MiR-199b-5p消耗Daoy细胞系中侧群区室并负调节MB肿瘤干细胞群
[0349] Notch途径与具有前体干细胞标记物的MB肿瘤细胞部分相关[36]，HES1在多能祖细胞的自我更新中有作用[23]。在动物模型中，肿瘤细胞的该侧群(SP)在肿瘤植入中有作用[37]。因此，我们检查了miR-199b-5p对排斥Hoechst 33342染料的肿瘤细胞群体的影响，该方案能鉴定这些SP细胞。Daoy细胞系中的流式细胞术确定这点，与维拉帕米处理细胞(负对照)相比，这些细胞系的SP占细胞的最多4.9％(图11A、B)。这种维拉帕米处理是根据维拉帕米对负责Hoechst 33342染料排斥的离子泵的抑制作用，从而能看到SP细胞[38]。染色199bSC1和199bMC1细胞表明SP消除，因为Hoechst-处理样品和Hoechst加维拉帕米样品之间几乎没差别(图11C-F)。
[0350] 还知晓中枢神经系统肿瘤干细胞表达CD133抗原，这些细胞唯一能在NOD-SCID小鼠中形成肿瘤[18、39]。此外，Notch途径在自我更新途径起核心作用，其抑制导致CD133-阳性(CD133+)消耗。Daoy细胞通过诱导祖细胞样细胞凋亡[36]。最近，证明CD133+Daoy细胞促进裸鼠侧面的肿瘤生长，而CD133-细胞不促进[40]。为这些原因，我们评估相比于稳定199bSC1和199bMC1克隆的Daoy细胞的CD133阳性率(图2)。野生型细胞是14.8％CD133+，而在稳定的199bSC1和199bMC1克隆中，该阳性率分别降低至2.4％和6.5％CD133+(图2C-F)。因此，这证明miR-199b-5p在负调节该部分肿瘤引发细胞中的作用。
[0351] HES1过表达拯救miR-199b-5p克隆表型
[0352] 为证实细胞表型与HES1的下调直接相关，我们进行体外细胞拯救实验。我们选择拯救稳定的199bSC1克隆所示的更一致表型。免疫印迹评估到，当将全长HES1 cDNA克隆并转染入稳定的Daoy-细胞199bSC1克隆时，HES1表达恢复(图3A)。我们还注意到在稳定的199bSC1克隆中下调的细胞周期蛋白D1再表达。HES1表达恢复还逆转了miR-199b-5p对细胞增殖的影响(图3B)。同时，将HES1 cDNA转染入199bSC1克隆降低促神经bHLH和分化标记物的诱导，提高增殖基因的水平(图3C)。此外，HES1 cDNA瞬时转染入稳定的199bSC1克隆导致S期细胞的百分比升高，除去对G0-G1期的阻断(图3D)。这与过表达miR-199b-5p的稳定199bSC1克隆中所见的作用相反(参见图1C和图3C)。还评估了HES1表达恢复对稳定199bSC1克隆SP的影响。评估HES1转染细胞(GFP阳性)排斥Hoechst染料的能力时，它们显示SP升高最低，最多1.3％。虽然高于稳定的199b克隆所检测的(图3E-H)，其仍低于野生型细胞的SP细胞水平(图11)。这可能是瞬时转染后HES1的短时再表达所致，可能不足以进行完全的表型拯救。然后我们试图拯救对CD133区室的影响；然而，HES1瞬时转染入199bSC1克隆未导致CD133+细胞显著增加。我们相信这是短时瞬时转染所致，从而不使Daoy细胞体系重组。
[0353] 源自稳定199SC1克隆的异种移植物中肿瘤生长减弱
[0354] 本文的发现表明miR-199b-5p是肿瘤形成的潜在抑制剂。因此，为研究miR-199b-5p在体内肿瘤模型中的作用，我们用携带萤光素酶cDNA的表达载体稳定199bSC1和对照Daoy克隆。检验所得克隆的萤光素酶表达水平，还验证了亲代表型，HES1和miR-199b-5p表达的保留情况(参见图12A-D)。然后将这些稳定的199b-Luc1和Ctl-Luc-4Daoy克隆分别注射入5只无胸腺裸/裸鼠的左和右侧。对注射小鼠作每周体内生物发光成像(BLI)来评估肿瘤生长。8周时，所有小鼠在各侧显示可见团块，而只有注射
199b-Luc1的3侧显示肿瘤植入。总之，对照侧和miR-199b-5p侧之间观察到肿瘤体积有明显差别(图4A)。与对照侧相比，生物发光测量显示miR-199b-5p侧的发光明显降低(例如，4号小鼠，图4B)。9周后，该5只小鼠中的4只显示在对照侧和miR-199b-5p相反侧之间这些生物发光信号有统计学显著的差别(图4C)。综合起来，这些数据显示miR-199b-5p能削弱无胸腺裸/裸鼠中的体内肿瘤形成。外植5号和4号小鼠的异种移植肿瘤，分析miR-199b-5p和HES1表达并作组织病理学评估(图12E-H)。
[0355] 为进一步研究miR-199b-5p调节MB生长的能力，我们将199bSC1稳定克隆常位注射入5周龄裸鼠的第四室(图4D、E)。通过生物发光成像(BLI)体内非侵入性监测肿瘤生长4周后，在注射199bSC1克隆的小鼠中，肿瘤生长显著低于注射对照(CTL)-细胞侧观察到的。我们还注射感染了编码miR-199b的腺病毒的CTL细胞以进一步证实这些作用：与以前的结果一致，这些小鼠也显示4周后BLI降低(图4F)。图4G显示了细胞植入8周后进一步的BLI获取。此时，处死两只小鼠，作进一步的组织病理学分析。苏木精-曙红染色冷冻的组织显示AdV5-模拟序列#2和AdV5-199b#3注射动物小脑中的肿瘤块。利用荧光显微镜检查连续平行冷冻组织学切片中腺病毒感染细胞表达的内源性绿色荧光蛋白(GFP)。然后，我们利用抗-HES1抗体，通过免疫组化染色其它石蜡包埋组织来评估HES1蛋白质表达。总体上，我们评估了感染细胞中腺病毒表达的持久水平，由于腺病毒携带的miR199b表达导致HES1表达下调，因此通过BLI(参见图4G-H)和抗体染色(Hes1，Ki67，Gabra6，巢蛋白，Math-3)随时间追踪肿瘤生长，补充附图12L-M。然后，在注射后12周时对额外的两只裸鼠(AdV5-模拟序列#7；AdV5-199b#5)作PET-CT研究以评估肿瘤增殖活性(图5A、B)。
生物发光的补充获取数据及两段视频分别显示注射AdV5-模拟序列和AdV5-199b的两只小鼠的3D重建(图14)。这些分析显示与AdV5-模拟序列#7对照小鼠相比，AdV5-199b#5小
3 3
鼠的肿瘤块明显减小，PET-CT分析还提供肿瘤体积(分别是0.024cm 和0.044cm)。总体上，这些数据表明miR199b-5p过表达的有益作用，在该常位异种移植裸鼠模型中对MB细胞的肿瘤生长有负面影响。
[0356] 人髓母细胞瘤肿瘤中miR-199b-5p的表达
[0357] 为测定miR-199b-5p是否在健康的人儿童小脑中有效表达，我们利用美国马里兰大学的发育疾病NICHD脑和组织库获得的13份对照样品。我们检测miR-199b-5p表达，比较从0-1岁儿童获得的5份小脑样品与13-16岁儿童的6份样品(图6A)。MiR-199b-5p显示较年轻对照的外植体中表达较高(Mann-Whitney检验，P＝0.006)。
[0358] 为测定miR-199b-5p表达是否在人MB中有作用，分析一组61位MB患者的样品(参见实验流程)。实际上，HES1蛋白质水平早已显示与MB患者的负面结果相关[24]。然后根据整体中值将整个患者群(n＝61)分成两组，低与高miR-199b-5p表达。非转移(M0)和转移(M1，M2和M3)病例之间的miR-199b-5p表达分布显示非转移病例中miR-199b-5p2
表达明显高于转移病例中的(P＝0.001，Pearson κ- 检验；图6B)。
[0359] 在有随访信息可用的患者亚组中(n＝45)，高水平表达miR-199b的患者的存活曲线显示正面趋势，总体存活优于低表达患者。然而，卡-迈存活的时序检验未显示明显差别(P＝0.182；图6C)，可能是因为长期随访的患者数量有限。
[0360] 这些数据显示转移MB中miR-199b-5p下调，表明通过后生或遗传改变的沉默机制。因此，我们在5-氮杂-脱氧胞苷诱导去甲基化后通过实时PCR检验了一组MB细胞系中的miR-199b-5p表达(图6D)。实际上，两个细胞系(Med8和UV238)显示miR-199b-5p显著上调，因此支持miR-199b-5p表达的后生控制的假设。需要进一步的研究来鉴定肿瘤发生期间经由miR-199b-5p表达的后生灭活的这种调节作用机制。
[0361] 支持信息
[0362] 通过靶预测分析，观察到miR-199a-5p和miR-199b-5p可能高评分值地靶向HES1。为测定该潜在的结合是否转化为活细胞中有效的HES1调节，我们将两种miRNA转染入HEK-293细胞系(图9A、B)。我们将前-miRNA克隆入表达由CMV启动子驱动的两种构建物。瞬时转染48小时后，miR-199b-5p的确下调HES2表达。此时，我们还排除了不同细胞类型中miR-199a-5p对HES1 3’UTR的作用。
[0363] 然后，我们采用实时方案(参见实验流程)评估Daoy和D283MED细胞中成熟miR-199b-5p的表达水平(参见图9C)。MiR-199b-5p显示在SH-SY5Y细胞-一种成神经细胞瘤细胞系-中表达水平低，而Daoy细胞表达较多的miR-199b-5p。与Daoy细胞系不同，源自转移性MB患者腹水的D283MEDMB细胞系中，两种miRNA的表达水平也不同[1]。与4
Daoy细胞比较时，miR-199b-5p的表达低10-倍，可能反映出不同肿瘤细胞来源[2]。还评*
估了miR-199a(也称为miR-199a-3p)的表达(数据未显示)，最近证明其与MET原癌基因*
有关[3]。前-miR-199a过表达后，我们未在Daoy细胞中观察到miR-199a 过表达。这可能是前-miR-199b-5p特定加工成产生miR-199a所致(数据未显示)。还在正常人组织中评估了MiR-199b-5p表达(图9D)：其在十二指肠和淋巴结中高表达，观察到在成年人(完整)大脑和皮层中表达较低。
[0364] 为证实miR-199b-5p对不同MB细胞系的作用，我们瞬时转染D283MED细胞，通过蛋白质印迹评估HES1的下调。如图9G所示，miR-199b-5p过表达导致HES1表达水平降低。MTS试验评估到，对HES1蛋白质的这种作用转化成细胞增殖降低(图10F)。在该例中，我们比较了用miR-199b-5p瞬时转染的D283MED和ONS76细胞系；在两种情况中，与模拟转染的细胞相比，我们观察到增殖降低。
[0365] 因此，我们想知道miR-199b-5p在内源性水平是否参与细胞增殖控制。为此，我们利用针对成熟的miR-199b-5p序列的2-甲基-寡聚核糖核苷酸(199b-OM)以降低其内源性水平。由于在检验的MB细胞系中，Daoy细胞显示最高量的miR-199b-5p(数据未显示)，用199b-OM转染它们(图10G)。与用对照OM(混杂的2-O-甲基寡聚核糖核苷酸)转染的Daoy细胞的增殖率相比，这些细胞显示体外增殖率较高。
[0366] 发育小脑中的Mmu-miR-199b-5p表达
[0367] 为解决小脑发育期间mir199如何表达这一问题，我们利用mmu-miR-199b-5p鼠同源物并测定其在发育小鼠小脑中的表达。我们采用为利用洋地黄毒苷(DIG)标记的锁定核酸探针而开发的方法。原位杂交实验利用E14.5的胚胎和P0的新生小鼠大脑，如图10A所示。比较mmu-miR-199b-5p表达与作为对照的miR-124a的表达，后者已知是中枢神经系统中的丰富miRNA。与miR-124a相比，mmu-miR-199b-5p的表达分布更广。mmu-miR-199b-5p表达还随着小脑发育而降低，而miR-199a在内颗粒细胞层(IGL)和Purkinje神经元中维持其表达。然后，采用实时PCR，通过检测成熟miRNA的水平及其表达分析来评估不同发育阶段的小鼠小脑中mmu-miR-199b-5p的表达。数据显示即使与miR-124a相比，mmu-miR-199b-5p表达水平较低，mmu-miR-199b-5p表达在发育中仍受调控，从胚胎日16.5降低至成年发育的小鼠小脑(图10B)。
[0368] 其它潜在靶标的MiR-199b-5p调节
[0369] miR-199b-5p的预计靶标有激酶GSK3-β，其是参与Shh和Wnt途径的信号转导的蛋白质，因此是调节小脑细胞稳态的途径中的关键激酶。为此，我们利用已获得的稳定199bSC1克隆评估miR-199b-5p下调GSK3-β的能力。该克隆对于GSK3-β蛋白质水平不显示任何明显的降低作用(图10C)。该作用可解释为miR-199b-5p结合无法接近GSK3-β的3’UTR，如Pita算法评估的高ΔΔG所实际提示的(参见表3；[4])。我们还选择3种其它基因来检验miR-199b-5p是否能调节它们：Nanog，NHLH2和细胞周期蛋白L1。下调时，这些基因能导致类似于稳定miR-199b-5p克隆中所见的表型。我们未检测到miR-199b-5p*
对所选这些基因3’UTR的任何下调作用(图10D)。最近，有人证明miR-199a 调节MET原癌基因[3]。由于其与miR-199b-5p具有相同的序列，有兴趣在我们的分析中检测该原癌基因的水平，这将是未来研究的论题。
[0370] 表3
[0371]
[0372] 产生过表达miR-199b-5p的生物发光Daoy细胞以供体内研究
[0373] 最近出现了依据萤光素酶的体内成像方法作为强有力的工具在常位动物模型中研究肿瘤细胞的植入潜能[5]。为测定miR-199b-5p在体内肿瘤模型中的作用，我们用携带萤光素酶cDNA的表达载体稳定199bSC1和对照Daoy克隆。检验这些克隆以评估萤光素酶表达水平(图12A、B)：这些体外实验显示细胞数量和生物发光测量值之间的高相关性。因此，该萤光素酶表达能使得肿瘤相关生物发光非侵入性地成像并定量测定肿瘤生长。验证所得稳定克隆对亲代表型，HES1和miR-199b-5p表达的保留情况，如附图12C、D所示。外植4号小鼠的异种移植物，采用苏木精和曙红染色作加工以测定其形态学特征。对照侧形成的肿瘤的侵袭性和侵蚀性高于miR-199b-5p-注射侧形成的那些肿瘤，这可从前者侵入肌肉组织观察到(图12E；黑色箭头)。用抗巢蛋白的抗体染色显示miR-199b-5p侧形成的肿瘤显示较少的细胞具有神经祖细胞的特征，与Notch途径下调一致(图12G、H)[6]。在199b-和对照注射侧形成肿瘤的5号小鼠的外植体显示转基因(miR-199b-5p)表达丧失，可能导致肿瘤潜能恢复(图12I)。
[0374] 为进一步表征miR-199b-5p抵消体内肿瘤生长的能力，我们建立Ctl-Luc1和199b-Luc4细胞的常位植入体。此外，我们还注射已经感染了表达miR-199b-5p的重组腺病毒(AdV5-199b)的野生型Daoy细胞，然后使生物发光体内成像(BLI技术公司(BLI technologies))。我们利用199b-Luc4-和AdV-199b-感染的细胞作为对照，然后利用AdV5-模拟序列病毒感染Ctl-Luc1克隆。注射后4周的结果示于图5，还显示了4和8周的小鼠的更多BLI分析(图4G和14)。
[0375] DAPT处理的Daoy细胞系显示miR-199b内源性表达增加和胚胎干细胞样基因表达信号
[0376] 为测定我们是否能增加miR-199b-5p的内源性水平，我们用N-[N-(3，5-二氟苯乙酰基)-1-丙氨酰基]-S-苯基甘氨酸叔丁酯(DAPT，西格玛阿尔德里奇公司)处理Daoy细胞，其有效阻断早老蛋白-分泌酶复合物，因而有效阻止Notch应答的活化[7，8]。如图13A所示，我们发现用DAPT处理后，12小时时，miR-199b-5p水平增加9-倍。处理后24小时内，该活化后快速抑制其表达。采用蛋白质印迹分析(检测到)HES1水平改变支持这些数据(图13B)，因此表明miR-199b-5p过表达后，观察到抑制HES1蛋白质水平。这些数据促使我们测定DAPT处理后，HES1丧失和miR199过表达的何种程度能影响涉及胚胎干细胞(ES)和癌症干细胞的基因表达信号。
[0377] 按照最近一项研究中的结果[9]，我们应用实时定量检测富集并与胚胎干细胞(ES)身份相关的基因(前8列表)的表达概况和包括乳腺、膀胱和神经胶质瘤在内的数种实体瘤的“干细胞”特性。在此，我们选择干细胞基因的标记物(MB和成胶质细胞瘤)，例如CD133和c-Myc，和作为ES细胞特性的关键调节剂的基因：Oct4、KFL5和Nanog。我们还观察成人干细胞/祖细胞功能、ES和肿瘤细胞增殖和/或癌症进展相关的基因。按照这些标准，基因列表包括：CD133、c-Myc、Oct4、KFL5、Nanog、TCF7L1、HMGA1、HMGB3、ZIC1、MYBL2、TEAD4和ILF3。如附图S5C所示，DAPT诱导的Daoy细胞系中CD133和c-Myc基因表达下调。然后，在DAPT诱导miR-199b-5p过表达的Daoy中也观察到Oct4、Nanog、KFL5、TCF7L1、HMGA1、HMGB3、ZIC1、MYBL2和TEAD4基因表达水平下调，引物和原始2^DCt值列于表S3。因此，这证实了miR-199b-5p上调与Notch途径的抑制一致，其调节干细胞群体，从早已知晓直接或间接参与该现象的那些所选标记物可以看出。此时，还要测定抑制Notch途径能何种程度上调节miR-199b-5p过表达。这些问题是进一步研究的主题。
[0378] 其它研究证明转移性MB患者和MB细胞系中PDGFR-A、PDGFR-B和SPARC基因过表达[10，11]。因此，我们还分析了上述Daoy细胞系模型中的PDGFR-A、PDGFR-B和SPARC基因表达，DAPT处理后其内源性miR199b上调。如图13D所示，与仅用载体处理相比，DAPT处理的Daoy细胞系中PDGFR-B和SPARC表达下调，还观察到PDGFR-A低度上调。此时，还要测定通过RAS/MAPK途径的PDGFR-A表达的这种低度增加是否足以驱动过表达miR-199b-5p的MB细胞的转移潜能；通过检验肿瘤中miR-199b-5p表达，这是我们获得的作用的相反作用。这些结果也与文献中的数据相矛盾，虽然在勘误框架内[11]，但MB转移肿瘤中发现的PDGFR-A过表达因GenBank和昂飞公司(Affymetrix)不正确的序列和探针注释而误判：虽然GenBank序列J03278包括PDGFR-B的完整编码区，但给出的基因座是‘PDGFRA’，昂飞公司探针1771注释为‘J03278 HUMPDGFRA人血小板衍生生长因子(PDGF)受体mRNA’。在这10
些新报道的数据 中，观察到转移性MB肿瘤中PDGFR-B上调。这些最新的结果符合我们在Daoy细胞系中观察到的，在这些细胞系中DAPT处理后miR-199b-5p过表达诱导PDGFR-B和SPARC表达下调。进而与转移性患者中miR199b-5p表达丧失结合起来，加强了miR199b-5p表达及其参与MB癌症产生、损伤它们的转移潜能中的重要性。最后，此处所示的数据通过将miR199b-5p过表达主要功能与抑制早已参与这些作用机制的基因操控的ES和癌症干细胞维持相关联而证实其作用。
[0379] 最近，儿童期MB患者的特定表达模式显示包括miR199b-5p在内的9种miRNA也与ErbB2-和/或c-Myc-过表达肿瘤簇生[12]。特别是，它们显示miR-135a和b、miR-10b、miR-125b和miR-153表达较高，而这些ErB2-阳性患者显示miR-199b表达较低。值得注意的是，Gilbertson等[13]证明ErbB2-HER4-阳性肿瘤在儿童期MB中是独立预后标记物，尤其是Erb-2，因其在MB中的负面存活作用而是更坏的预后标记物。总之，文献的那些结果进一步加强mir199b-5p的重要性，其表达在MB肿瘤中下调并与这些Erb-2-阳性组的侵袭性相关。
[0380] 通过小-动物PET和SPECT-CT分析的高分辨率分子成像
[0381] 动物准备和PET/CT成像
[0382] 将小鼠维持在通风笼中(26℃)1小时，然后进行成像研究。腹膜内给予氯胺酮(100mg/kg)和赛拉嗪(10mg/kg)的混合物(注射体积，100μl/10g)进行麻醉。在侧尾静18 18
脉中给予3′-脱氧-3′-[ F]氟胸苷([ F]FLT)(肿瘤增殖标记物)后1小时利用动物PET扫描仪(GE保健(GE Healthcare)eXplore Vista，FWHM 1.6mm)进行PET(50μL；7.4MBq；
扫描时间，18分钟)。PET后24小时内进行高分辨率CT研究(GE保健eXplore Locus；空间分辨，45μm)。
[0383] 数据分析
[0384] 从PET研究计算最高(SUV最高(max))和平均(SUV平均(mean))标准化摄取值(SUV)(SUV＝组织活性(MBq/cc)/[注射剂量(MBq)/体重(g)])。利用Osirix 3.3(MAC OS 10.5操作系统)对PET/CT图像作后加工以获得多层重建(MPR)、最大强度投影(MIP)、3D体积扫描和合并图像。利用MicroView(GE eXplore Locus)获得附加3D重建。
[0385] 利用内部开发的软件(基于IDL，ITT Vis公司)，通过以SUV＞50％SUVmax总结所有空间相连体素来计算病损体积。这些方法测定的病损概况用于AdV5-模拟序列和AdV5-199b之间依据ROI的比较。
[0386] 讨论
[0387] MB中改变的信号传导途径之间的相互联系在很大程度上依旧未知，仍难于按照降低治疗相关致死率和发病率的风险类别确定具体的患者层次。在本项研究中，我们鉴定了经由miRNA miR-199b-5p的HES1基因调节机制。HES1是小脑发育的关键调节剂，最近的观察结果表明用Shh处理小脑颗粒细胞提高HES1水平[20]。这提示HES1是Shh和Notch2信号传导级联的转录靶标。
[0388] 我们在此报道了miR-199b-5p驱动的HES1表达的新型调节水平，miR-199b-5p结合HES1 3’UTR并导致非生产性翻译。值得注意的是，我们还研究了miR-199b-5p对与NHLH2、细胞周期蛋白L1和Nanog的3’UTR融合的报道构建物的作用(图10D)。在利用两种不同算法获得的miR-199b-5p的预计靶标中(表3)，这些基因是与miR-199b过表达后所得表型相关的可能候选对象。然而，在获得对HES1 3’UTR作用的相同条件下测试时，我们未获得报道基因的活性下调。此外，稳定的199bSC1克隆具有与对照相当的GSK3-β蛋白质水平。值得注意的是，按照Pita算法分析时，miR-199b-5p结合GSK3-β的3’UTR的ΔΔG值非常高，表明3’UTR的可接近性不佳[41](表3)。最近，还证明具有miR-199b-5p*相同序列的miR-199a 可能通过Met原癌基因下调起作用而参与级联活化[42]。进一步的研究还会感兴趣测定经由miR-199b的该靶标下调，即便由于我们的细胞体系中miR-199b过表达后并未诱导凋亡而看似不可能。
[0389] 分析过表达miR-199b-5p的克隆提示miR-199b-5p能损伤MB细胞增殖和植入潜能。实际上，过表达miR-199b-5p的克隆中细胞周期蛋白D1丧失提示这是Ccnd1-/-小鼠中所见的类似作用，该小鼠的正常小脑功能获得减缓所致的早期GNP增殖和早期共济失调减轻，因此影响瘤前病损向MB进展[43]。
[0390] 我们的数据还与Hes1遗传敲减小鼠细胞报道的体内数据一致。miR-199b-5p的作用可以解释为触发凋亡，但我们的细胞荧光试验提示损伤MB细胞增殖与过表达miR-199b-5p的细胞的大量凋亡无关(参见图1A的细胞周期试验)。这与从Hes1-/-小鼠获得的神经祖细胞的报道数据一致，其中凋亡迹象仅在有限的细胞类型中见到[22]。
[0391] 我们证明miR-199b-5p和肿瘤M期之间的相关性表明可伴随肿瘤切除研究miR-199b-5p表达水平。如此能鉴定会产生侵袭性肿瘤和将来形成转移灶的患者亚组，从而注意到弥散性疾病是与存活不佳相关的最强效独立因素。虽然与M状态相关，但miR-199b-5p过表达不导致Daoy细胞的细胞运动性降低(图10E)。这很可能是Daoy细胞的极高运动性所致，表明为克服该表型，需要采取调控Notch途径以外的其它步骤。然而，值得注意的是，最近发现与转移性MB相关的两种基因，PDGFR-B和SPARC的表达[44，45]在miR-199b-5p过表达存在下降低，如我们在图13D中所示和补充材料所述。
[0392] 鉴于我们经由miR-199b-5p调控来调节Notch途径的数据，未来的研究有兴趣致力于Notch-调节基因在转移性MB患者中的作用。此外，更好地重现人疾病的发育小鼠模型是重要的任务。在此情况中，纯合Smo/Smo小鼠模型具有柔脑脊膜扩散(leptomeningeal spread)的观察结果证实Notch途径参与MB生长的调节[25，46]。如图6和表2所示，我们证明miR-199b-5p表达水平有极大差异，这可能是结局更差的患者亚组中遗传染色体改变或后生沉默所致。我们关于一组MB细胞系的数据(参见图6D)支持该最新假设。一些MB细胞系对采用增加miR-199b的治疗没反应的原因可能是该基因本身的遗传丧失，或者miR-199b表达有严格细胞类型调控，从而反映出细胞系的不同起源。
[0393] 目前，人们不断有兴趣阐明赋予“癌症干细胞”独特特性的机制[47]。最近，有人证明成胶质细胞瘤CD133+细胞通过诱导受损DNA修复而在电离辐射后有较好的存活机会[48]。实际上，表达CD133抗原的Daoy细胞是辐射耐受性的，因此支持Daoy细胞代表研究肿瘤干细胞区室的模型的假设[49]。在此，miR-199b-5p能影响Daoy细胞的该侧群和CD133+群体，即，癌症干细胞。
[0394] 结合CD133，我们还评估了最近证明与实体瘤侵袭性相关的几种癌症干细胞基因的表达水平，如附图S5B所示，这些基因的表达与N-[N-(3，5-二氟苯乙酰基)-1-丙氨酰基]-S-苯基甘氨酸叔丁酯(DAPT)处理Daoy细胞的“干细胞”表型的总体降低一致。如此阻止Notch反应活化(参见补充材料)，因而阻断早老蛋白-分泌酶复合物并增强miR199b-5p表达[50，51]。迄今为止，这是首次报道miRNA的表达能消耗该肿瘤细胞区室，从而表明靶向大脑肿瘤中这些细胞是有希望的治疗方法。
[0395] 公布的文献强烈暗示存在髓母细胞瘤的3岁以上儿童从放疗中极大获益，但仍难于治疗更年轻的儿童。全切除或次全切除MB的患者之间没有明显的存活差异支持这样一种观点，即，潜在的神经学缺陷风险高时，可避免完全切除MB。最近的试验证明化疗的有益作用，虽然并非普遍见到[52，53]。在此，我们设想将miR199b-5p原位利用和递送入3岁以下患MB儿童(HES1阳性)的小脑以损伤引起肿瘤的CD133+癌症细胞的维持。与化疗联用，以及可能消除放疗和避免完全肿瘤切除造成的大脑损伤，该方法应能总体改善MB的现有疗法。因此，我们预计可能利用包封的稳定核酸脂质颗粒(SNALP)治疗MB。这些颗粒已经证明能在非人灵长类中有效全身递送，利用含有agomir 199b-5p分子的包封纳米颗粒可绕过血脑屏障[54]。这些基因治疗方法如何进一步发展是将来临床前动物研究的问题。
[0396] 如我们的模型所示(图6E)，我们描绘了M0和M+患者中两种不同的miR-199b-5p表达水平，可能是癌症发生期间后生调节所致。在我们的“中高”模型中，miR-199b-5p表达增加阻遏HES1，然后导致促神经bHLH基因表达增加，从而驱动细胞分化。在“中低”模型中，miR-199b-5p表达因后生控制机制而降低，然后HES1过表达，从而导致细胞增殖和SP诱导，因此CD133+细胞增加。就许多其它转录因子而言，HES1是不同信号转导途径之间的结合点，其表达平衡决定基础细胞决定(cell decision)，例如是否开始分化程序。就此而言，miR-199b-5p可视作复杂Notch信号转导途径的一部分，作为HES1 bHLH转录因子表达水平的微调物。可认为这些现象在涉及活化Notch途径的各种组织和癌症中发生。
[0397] 实施例2：评估用SNALP miR199b-5p治疗MB、结肠癌和乳腺癌细胞系的作用[0398] 材料和方法
[0399] SNALP制剂
[0400] 采用其它文献(71-73)中的SNALP(稳定的核酸脂质颗粒)技术，利用瑞士卡姆的类脂公司(Lipoid GMBH，Cam，Switzerland)提供的不同脂质配制mir 199b-5p及其相关对照混杂物(即，附图中的CTR)。利用CE试剂公司(Carlo Erba Reagenti)的分析级溶剂。挤压工艺的Nucleopore Track膜25mm聚碳酸酯滤器购自英国布兰特福德的霍曼公司(Whatman，Brentford，UK)。透析膜、盐和所有其它化学品购自意大利米兰的西格玛-阿尔德里奇公司(Sigma-Aldrich)。
[0401] 利用由可电离氨基脂质二油酰基二甲基铵丙烷(DODAP)与其它中性脂质，即二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、卵磷脂酰胆碱(EPC)和二硬脂酰基磷脂酰基乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE2000)构成的液体混合物制备SNALP。用miRNA的水溶液水化脂质层将miRNA包封入SNALP。利用加拿大大不列颠哥伦比亚省温哥华的北方脂质公司的热桶挤压系统(Thermobarrel Extruder Systems，Northern Lipids Inc.，Vancouver，BC，Canada)使得到的悬液经过三个堆叠的100nm聚碳酸酯滤器10次。用300mM pH 4.0的柠檬酸盐缓冲液透析制品约1小时以除去过量的乙醇；然后用HBS(20mM HEPES，145mM NaCl，pH 7.6)进一步透析12-18小时以除去柠檬酸盐缓冲液，中和DODAP并释放囊泡表面结合的任何miRNA。通过DEAE-琼脂糖CL-6B柱层析除去未包封的ODN。优化实验条件，即，水溶液中的miRNA浓度和不同脂质之比以将大量miRNA包封入囊泡。制备后，将SNALP溶解于有机溶剂中，miRNA提取入水溶液，通过UV分光光度法定量测定。可通过光子相关光谱法(N5 Beckmann Coulter，迈阿密)检测不同SNALP制剂的颗粒平均直径和尺寸分布。采用M3-PALS技术(ZN公司(Zetasizer Nano)，马尔文(Malvern)，伍斯特郡，英国)测定SNALP的ζ电势。通过混合基于(N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基铵甲基硫酸盐(DOTAP)/胆固醇或DOTAP/胆固醇/DSPE-PEG2000的阳离子脂质体悬液与含有鱼精蛋白的水溶液及小牛胸腺DNA与miRNA或仅有miRNA的水溶液，然后在室温下温育10-15分钟来制备miRNA/脂质隐蔽纳米复合物。以基于DOTAP/胆固醇的脂质体为例，得到的颗粒随后在50℃与DSPE-PEG的胶束分散体温育10-15分钟。室温下NP静置10分钟。通过对复合物超速离心和对上清液作UV分析来测定形成复合物的miRNA的百分比。优化配制条件，即，原始水溶液中miRNA的浓度、鱼精蛋白的存在、阳离子脂质的用量以获得更高复合效率。通过光子相关光谱法检测纳米复合物的颗粒平均直径和尺寸分布，通过M3-PALS技术测定SNALP的ζ电势。
[0402] SNALP中寡核苷酸miR 199b-5p的序列是CCCAGUGUUUAGACUAUCUGUUC(SEQ ID NO：11)，其相关序列混杂CTR：gguuguaugcauucccuaucuac(SEQ ID NO：12)。
[0403] 增殖试验MTS
[0404] 利用试剂盒CellTiter96水性非放射性细胞增殖试验(CellTiter96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay，普罗迈格公司)进行增殖试验(MTS)72小时。将对照SNALP和miR 199b-5p处理的细胞系daoy，MDA-231T和4t1以每100μl完全培养基1000和3000个细胞(分别是daoy、MDA-231T和4t1)的浓度转移入96多孔(板)。每个实验点五个重复样本。24、48或72小时后，向各孔中加入20μl 5x溶液。4小时后，利用帕金埃尔默公司的多标记计数器Victor3检测甲 的490nm吸光度。
[0405] 凋亡试验
[0406] 通过FACSCalibur(BD公司，圣何塞，加利福尼亚州)在对照SNALP和miR 199b-5p处理的daoy、MDA-231T和4t1中进行凋亡试验，利用软件CELL Quest 3.3版。通过抗体(米氏生物技术公司(Miltenyi Biotec)，奥本，加利福尼亚州)进行膜联蛋白V分析。用碘化丙啶染色细胞，然后在4℃与抗-膜联蛋白V的FITC抗体(米氏生物技术公司)避光温育10分钟。然后用PBS洗涤细胞。
[0407] 蛋白质印迹Hes1：参见下文
[0408] RT syber green 199b和CD133：参见下文
[0409] 细胞培养
[0410] 鼠乳腺癌细胞系4T1由美国模式培养物保藏所获得(参考文献74，ATCC，马纳萨斯，弗吉尼亚州)，在补加了10％FBS、10U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素(CP公司，米兰，意大利)的Dulbecco改进Eagle培养基(DMEM；西格玛公司)中传代培养。细胞系HT29(人结肠癌)和MDA-231T(人乳腺癌)由美国模式培养物保藏所获得(ATCC，马纳萨斯，弗吉尼亚州)，在补加了10％FBS、10U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素(CP公司，米兰，意大利)的Dulbecco改进Eagle培养基(DMEM；西格玛公司)中维持。
[0411] 结果
[0412] MiR 199b-5p由SNALP携带入髓母细胞瘤、乳腺癌和结肠癌细胞系并评估毒性和靶Hes1抑制作用
[0413] 如材料与方法所述，通过SNALP配制成熟形式的miR 199b-5p(核糖核苷酸序列)与对照。用1μg寡核苷酸处理Daoy、MDA231T、HT29和4T1细胞系，通过增殖试验MTS评估活力(图17A和18A)。如图17A、18A、20A-B所示，与对照相比，miR 199b-5p SNALP处理后各细胞系在24、48和72小时显示增殖率降低。处理72小时后，两种细胞系中miR 199b-5p表达均增加(图17B和18B)。处理72小时后，通过膜联蛋白V分析评估处理的毒性(图17C和18C)。如图17C和18C所示，两种细胞系均未在对照和miR 199b-5p之间显示凋亡水平有差异。此外，处理72小时后，通过蛋白质印迹评估Hes1表达，如图17D和18D所示。
SNALP携带的miR199b-5p过表达显示Hes1降低，从而证明治疗的效力。
[0414] 乳腺癌和结肠癌组织中miR 199b-5p的表达
[0415] 评估乳腺癌(29份组织)和结肠癌(13份组织)中miR 199b-5p的表达。如图19所示，癌组织中miR 199b-5p的表达水平低于健康对照，从而证明肿瘤进展期间这些肿瘤中miR 199b-5p也沉默。与癌组织相比，健康对照中基因Cd133的表达水平也较低，因为其是癌症干细胞标记物。
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