骨组织提供对身体的支持，并且包括矿物质(包括钙和磷)，胶 原蛋白和非胶原蛋白基质，和细胞。活组织在称为沉积的骨形成和称 为再吸收的骨分解之间表现出动态平衡。在骨，骨细胞，成骨细胞和 破骨细胞中发现的三种类型的细胞都涉及这种平衡。成骨细胞促进骨 组织的形成，而破骨细胞与再吸收相关。与骨形成相比，骨基质和矿 物质的再吸收或溶解是一个快速而有效的过程，并且能从骨释放大量 矿物质。破骨细胞参与骨骼组织正常重塑的调节和激素诱导的再吸 收。例如，反应于胞外液中钙离子降低的浓度的甲状旁腺激素的分泌 刺激再吸收。相反，再吸收的抑制作用是降钙素的功能。另外，维生 素D的代谢物改变骨对甲状旁腺激素和降钙素的反应。
骨保护素配体(OPGL)是细胞因子TNF家族的一员，通过与NF-κB (RANK，也称作破骨细胞分化和激活受体，或ODAR)的受体激活剂 结合而促进破骨细胞的形成。另一方面，骨保护素(OPG)，通过隔离 OPGL并且阻止OPGL与ODAR缔合而抑制破骨细胞的形成。因此，与ODAR 缔合的OPGL的量与骨沉积和再吸收之间的平衡相关。
骨骼成熟之后，骨骼中骨的量反映骨形成和骨再吸收的平衡(或 失衡)。在骨成熟之后第四个十年之前骨质达到高峰。在第四和第五 个十年之间，平衡转移并且骨再吸收占优势。骨量随着年龄不可避免 的减少在女性要比男性开始得早，并且某些女性在绝经期之后显著加 快(主要是高加索人和亚洲人血统的那些)。
骨质稀少是与一般骨质低于正常水平的任何降低相关的状况。这 样的状况可以由骨合成速度减慢或者骨破坏速度加快或者这两者而发 生的一种状况。骨质稀少的一个常见形式是原发性骨质疏松，也称作 绝经后和老年骨质疏松。这种骨质疏松形式是随着年龄骨普遍损失的 结果，并且经常是伴随骨形成正常速度的骨再吸收加速的结果。在美 国，很多白人女性发生有症状的骨质疏松症。骨质疏松和45岁和更 年老妇女髋部，股骨，颈和转子间骨折的发生率之间存在直接关系。 老年男性在50和70岁之间可能发生有症状的骨质疏松。在某些情况 下，骨质疏松可能由OPGL提高的水平或活性而产生。因此，能调节 破骨细胞生成中OPGL的活性的分子是有用的。
已经鉴定出几种因子，它们对绝经后和老年骨质疏松有作用。它 们包括伴随老化和归于钙和其他矿物质降低的肠吸收的不适当钙消耗 的激素水平的改变。一些治疗包括激素治疗法或为了延迟该过程的饮 食补充。最近，抗吸收剂例如双磷酸盐和选择性雌激素受体修饰剂 (SERMs)用于防止和治疗减少的骨量。因此，将那些治疗与能调节OPGL 活性的分子结合在治疗某些骨质稀少疾病中是有用的。
发明概述
在一些实施方案中，本发明提供一种抗体，包括重链和轻链，其 中重链包括SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或者其片段，轻链包括SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或者其片段。
在一些实施方案中，本发明提供一种抗体，包括重链和轻链，其 中重链含有包括SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列或者其片段的可变 区，其中轻链含有包括SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列或者其片段 的可变区。
在一些实施方案中，本发明提供一种包括重链和轻链的抗体，其 中重链包括SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或者其片段。
在一些实施方案中，本发明提供一种包括重链和轻链的抗体，其 中重链含有包括SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列或者其片段的可变 区。
在一些实施方案中，本发明提供一种包括重链和轻链的抗体，其 中轻链包括SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或者其片段。
在一些实施方案中，本发明提供一种包括重链和轻链的抗体，其 中轻链含有包括SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列或者其片段的可变 区。
在一些实施方案中，本发明提供一种包括重链和轻链的抗体， (a)其中重链包括第一可变区，其中第一可变区包括与SEQ ID NO： 13所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的序列，和(b)其中轻链 包括第二可变区，其中第二可变区包括与SEQ ID NO：14所示的氨基 酸序列具有至少90％同一性的序列，和(c)其中所述抗体与骨保护素 配体(OPGL)相互作用。
在一些实施方案中，第一可变区包括与SEQ ID NO：13所示的氨 基酸序列具有至少95％同一性的序列，并且第二可变区包括与SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的序列。
在一些实施方案中，第一可变区包括与SEQ ID NO：13所示的氨 基酸序列具有至少99％同一性的序列，并且第二可变区包括与SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列具有至少99％同一性的序列。
在一些实施方案中，本发明提供了重链，包括SEQ ID NO：2所 示的氨基酸序列或者其片段。在一些实施方案中，本发明提供含有可 变区和恒定区的重链，其中可变区包括SEQ ID NO：13所示的氨基酸 序列或者其片段。
在一些实施方案中，本发明提供了轻链，包括SEQ ID NO：4所 示的氨基酸序列或者其片段。在一些实施方案中，本发明提供含有SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列或者其片段的轻链。
在本发明的一些实施方案中，提供了单链抗体。在本发明的一些 实施方案中，提供了单链Fv抗体。在本发明的一些实施方案中，提 供了Fab抗体。在本发明的一些实施方案中，提供了Fab′抗体。在 本发明的一些实施方案中，提供了(Fab′)2抗体。
在一些实施方案中，提供了含有本发明的抗体的药物组合物。在 一些实施方案中，提供了含有治疗有效量的抗OPGL抗体的药物组合 物。
在一些实施方案中，药物组合物含有一种抗OPGL抗体和至少一 种选自下组的治疗剂：骨形态发生因子，转化生长因子-β(TGF-β)， 白介素-1(IL-1)抑制剂，IL-1ra，KineretTM，TNFα抑制剂，可溶TNFα 受体，EnbrelTM，抗-TNFα抗体，RemicadeTM，D2E7抗体，甲状旁腺素， 甲状旁腺素类似物，甲状旁腺素相关蛋白，甲状旁腺素相关蛋白类似 物，前列腺素，双磷酸盐，阿仑特罗，氟化物，钙，非甾族抗炎药 (NSAID)，COX-2抑制剂，CelebrexTM，VioxxTM，免疫抑制剂，甲氨喋 呤，来氟米特，丝氨酸蛋白酶抑制剂，分泌性白细胞蛋白酶抑制剂 (SLPI)，IL-6抑制剂，抗IL-6抗体，IL-8抑制剂，抗IL-8抗体，IL-18 抑制剂，IL-18结合蛋白，抗IL-18抗体，白介素-1转化酶(ICE) 调节剂，成纤维细胞生长因子(FGF)，FGF调节剂，PAF拮抗剂，角 质细胞生长因子(KGF)，KGF-相关分子，KGF调节剂；基质金属蛋白 酶(MMP)调节剂，一氧化氮合酶(NOS)调节剂，糖皮质激素受体调 节剂，谷氨酸受体调节剂，脂多糖(LPS)水平调节剂，去甲肾上腺 素，去甲肾上腺素模拟物，和去甲肾上腺素调节剂。
在本发明的一些实施方案中，提供了治疗骨质稀少疾病的方法， 包括施用药学有效量的抗体。在一些实施方案中，提供了治疗骨质稀 少疾病的方法，包括施用药物组合物。
在一些实施方案中，提供了治疗患者中的伴随骨损失的炎症状况 的方法，包括施用药物组合物。
在一些实施方案中，提供了治疗患者中的伴随骨损失的自身免疫 疾病的方法，包括施用药物组合物。
在一些实施方案中，提供了治疗患者中的类风湿性关节炎的方 法，包括施用本发明的药物组合物。
在本发明的实施方案中，提供了检测生物样品中OPGL水平的方 法，包括使样品接触抗体。
附图的简要说明
图1表示编码αOPGL-1抗体重链的cDNA序列(SEQ ID NO：1)。
图2表示αOPGL-1抗体重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
图3表示编码αOPGL-1抗体轻链的cDNA序列(SEQ ID NO：3)。
图4表示αOPGL-1抗体轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。
图5表示αOPGL-1κ轻链表达质粒αOPGL-1-κ/pDSRa19的示意 图。
图6表示αOPGL-1IgG2重链表达质粒，αOPGL-1-IgG2/pDSRa19 的示意图。
图7表示αOPCL-1与OPGL-包被的EIA板的剂量-依赖性结合。
图8表示αOPGL-1与膜-结合的OPGL的特异性结合。
图9表示可溶性OPGL对αOPGL-1结合OPGL-包被的EIA板的抑制 作用。
图10表示αOPGL-1与OPGL-包被的EIA板的特异性结合。
图11表示αOPGL-1对破骨细胞形成的剂量-依赖性抑制作用。
图12表示αOPGL-1对OPGL结合ODAR的剂量-依赖性抑制作用。
图13表示对猕猴施用单剂量αOPGL-1之后的平均血清浓度时间 曲线。
图14表示对猕猴施用单剂量αOPGL-1之后血清中N-Tx浓度的平 均变化百分率。
图15表示对猕猴施用单剂量αOPGL-1之后尿液中N-Tx浓度的平 均变化百分率。
图16表示对猕猴施用单剂量αOPGL-1之后抗体阳性和阴性血清- 浓度时间曲线。
图17表示αOPGL-1抗体重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO： 13)。
图18表示αOPGL-1抗体轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO： 13)。
图19表示生产αOPGL-1的细胞培养方法。
图20表示对猕猴施用单剂量αOPGL-1之后血清钙变化百分率。
图21表示对猕猴施用单剂量αOPGL-1之后血清钙变化百分率。
优选实施方案的详细描述
这里使用的标题是为了组织的目的而不应理解为限制描述的主 题。本申请中引述的所有的参考文献特别在此为了任何目的引作参 考。
定义
标准技术可以用于重组DNA，寡核苷酸合成，和组织培养和转化 (例如电穿孔，脂转染)。根据厂商说明或者本领域常规技术或者根 据这里的描述，可以实施酶促反应和纯化技术。根据本领域公知的 常规方法和根据本说明书中引述和讨论的各个一般性和更具体的参 考文献中的描述，一般可以实施上述技术和方法。参见，例如，Sambrook 等，分子克隆：实验手册(第二版，冷泉港实验出版社，冷泉港， 纽约(1989))，其在这里为了任何目的引作参考。除了指出具体定义， 使用的相关的术语，这里描述的分析化学，合成有机化学，和医学 和药物化学额实验方法和技术是本领域公知的和通用的。标准技术 可以用于化学合成，化学分析，药物制备，配方和送递，和对患者 的治疗。
根据本发明公开中使用的，下面的术语，除非另有说明，应该理 解为具有下面的定义：
这里使用的术语“分离的多核苷酸”应该指基因组多核苷酸， cDNA，或合成来源的或者它们的组合，根据其来源，“分离的多核苷 酸”(1)与“分离的多核苷酸”是在自然界发现的多核苷酸的全部或 部分没有缔合，(2)与不与自然界中的相连的多核苷酸连接，或(3) 作为较大序列的部分，自然界中不存在。
术语“分离的蛋白质”在这里指cDNA，重组RNA，或合成来源的 或者它们的组合编码的蛋白质，其(1)没有正常发现的至少一些蛋 白质，(2)基本上没有相同来源例如来自相同物种的其他蛋白质， (3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)自然界中不存在。
这里使用的术语“多肽”作为遗传术语指天然蛋白质，或者具有 天然序列的一个或多个氨基酸缺失，添加和/或取代的序列。术语“多 肽”还包括αOPGL-1(如下所述，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4)， 或αOPGL-1的一个或多个氨基酸缺失，添加和/或取代的序列。根据 一些实施方案，本发明包括图2表示的人重链免疫球蛋白分子(SEQ ID NO：2)和图4表示的人轻链免疫球蛋白分子(SRQ ID NO：4)或者 其片段或类似物。
这里使用的对于一种物质使用的术语“天然存在的”指物质能在 自然界中发现的事实。例如，能从自然界来源中分离的并且人们在实 验中或者其他情况下还没有意向改变的生物体(包括病毒)中存在的 多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
这里使用的术语“可操作性连接”指允许它们以它们想要的方式 发挥功能的关系中的成分。例如，与编码序列“可操作性连接”的调 控序列以在与调控序列相容的条件下实现编码序列的表达的方式连 接。
这里使用的术语“调控序列”指可以使它们连接的编码序列表达 和加工的多核苷酸序列。这样的调控序列的性质根据宿主生物而不 同。根据一些实施方案，原核生物的调控序列可以包括启动子，核糖 体结合位点，和转录终止序列。根据一些实施方案，真核生物的调控 序列可以包括启动子和转录终止序列。在一些实施方案中，“调控序 列”可以包括前导序列和/或融合配偶体序列。
这里提到的术语“多核苷酸”意思是长度至少10个碱基的核苷 酸的多聚体形式。在一些实施方案中，碱基可以是核糖核苷酸或脱氧 核糖核苷酸或这两种类型核苷酸的修饰形式。该术语包括单链和双链 形式的DNA。
这里提到的术语“寡核苷酸”包括天然存在的，和由天然存在的 和/或非天然存在的寡核苷酸键连接在一起的修饰的核苷酸。寡核苷 酸是一般包括200个碱基或更短长度的多核苷酸子集。在一些实施方 案中，寡核苷酸长度是10-60个碱基。在一些实施方案中，寡核苷 酸长度是12，13，14，15，16，17，18，19或20-40个碱基。寡核 苷酸可以是单链或双链的，例如用于构建基因突变体。本发明的寡核 苷酸可以是有义或反义寡核苷酸。
术语“天然存在的核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。 术语“修饰的核苷酸”包括带有被修饰或被取代糖基等的核苷酸。术 语“寡核苷酸键”包括如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，硒代磷酸酯， 二硒代磷酸酯，phosphoroanilothioate，phosphoroaniladate，氨 基磷酸酯等这样的寡核苷酸键。参见，例如LaPlanche等，Nucl.Acids Res.14：9081(1986)；Stec等，J.Am.Chem.Soc.106：6077(1984)； Stein等，Nucl.Acids Res.16：3209(1988)；Zon等，Anti-Cancer Drug Design 6：539(1991)；Zon等，Oligonucleotides and Analogues： A Practical Approach，pp87-108(F.Eckstein，Ed.，Oxford University Press，Oxford England(1991))；Stec等，美国专利No.5151510； Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90：543(1990)，这些文献 的公开内容为任何目的在此引作参考。寡核苷酸可以包括检测标记。
通过公知的方法容易计算相关多肽的同一性和相似性。这样的方 法包括但不限于下面文献中描述的那些：
Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，编著，Oxford University Press，New York(1988)；Biocomputing：Informatics和Genome Projects，Smith，D.W.，编著，Academic Press，New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data，Part 1，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，编著，Humana Press，New Jersey(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje， G.，Academic Press(1987)；Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和 Devereux，J.，编著，M.Stockton Press，New York(1991)；和Carillo等，S/AM J.Applied Math.，48：1073(1988)。
设计测定同一性的优选方法，所示分析的序列之间最大匹配性。 在公众能得到的计算机程序中描述了测定同一性的方法。测定两个序 列之间的同一性的优选的计算机程序方法包括但不限于GCG程序包， 包括GAP(Devereux等，Nucl.Acids Res.12：387(1984)；Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，WI，BLASTP， BLASTN，和FASTA(Altschul等，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990))。 BLASTX程序公众能从生物技术信息国家中心(NCBI)和其他来源获得 (BLAST Manual，Altschul等，NCB/NLM/NIH Bethesda，MD20894； Altschul等，上文(1990))。公知的Smith Waterman算法也可以用 来测定同一性。
一些用于比对两个氨基酸序列的比对系统可能导致两个序列只有 短的区域匹配，即使两个全长序列之间没有显著相关性，这个小的比 对的区可能具有非常高的序列同一性。因此，在一些实施方案中，选 择的比对方法(GAP程序)会导致跨越靶多肽的至少50个连续氨基酸 的比对。
例如，使用计算机算法GAP(Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，WI)，对要测定序列同一性百分比的两个多 肽进行它们各自氨基酸最佳匹配的比对(“匹配跨度”，根据算法测 定)。在一些实施方案中，空位开放罚分(计算为3X平均对角线；“平 均对角线”是比较使用的比较矩阵的对角线的平均值；“对角线”是 通过特定比较矩阵对各完美氨基酸匹配赋予的分值或数)和空位延伸 罚分(其通常是空位开放罚分的1/10倍)，以及比较矩阵例如PAM250 或BLOSUM 62与算法结合使用。在一些实施方案中，算法也使用标准 比较矩阵(有关PAM250比较矩阵，参见Dayhoff等，Atlas of Protein Sequence and Structure，5(3)(1978)；有关BLOSUM 62比较矩阵， 参见Henikoff等，Proc.Natl.Acad.SciUSA，89：10915-10919 (1992))。
在一些实施方案中，多肽序列比较的参数包括如下：
算法：Needleman等，J.Mol.Biol.，48：443-453(1970)；
比较矩阵：Henikoff等的BLOSUM 62，上文(1992)；
空位罚分：12
空位长度罚分：4
相似性阈值：0
GAP程序采用上面的参数是有用的。在一些实施方案中，对于使 用GAP算法的多肽比较是默认参数(对于末端空位没有罚分)。
根据这里使用的，二十种常见氨基酸和它们的缩写常规用法如 下。参见Immunology-A Synthesis(第二版，E.S.Golub和D.R.Gren， 编著，SinauerAssociates，Sunderland，Mass(1991))，在这里为了 任何目的引作参考。二十种常见氨基酸，非天然氨基酸例如α-，α-二 取代氨基酸，N-烷基氨基酸，乳酸，和其他不是常见的氨基酸的立体 异构体(例如D-氨基酸)也可以是本发明多肽的合适的成分。不是常 见的氨基酸的例子包括：4-羟基脯氨酸，γ-羧基谷氨酸，ε-N，N，N- 三甲基赖氨酸，ε-N-乙酰基赖氨酸，O-磷酸丝氨酸，N-乙酰基丝氨酸， N-甲酰基甲硫氨酸，3-甲基组氨酸，5-羟基赖氨酸，σ-N-甲基精氨酸， 和其他类似氨基酸和亚氨基酸(例如4-羟基脯氨酸)。根据标准用法 和习惯，在这里使用的多肽符号中，左手方向是氨基末端方向，右手 方向是羧基末端方向。
类似地，除非另外具体说明，单链多核苷酸序列的左手末端是5’ 端；双链多核苷酸序列的左手方向称作5’方向。新生的RNA转录物5’ 至3’添加的方向称作转录方向；具有和RNA一样的序列并且是RNA转 录物的5’至5’端的DNA链上的序列区称作“上游序列”；具有和RNA 一样的序列并且是RNA转录物的3’至3’端的DNA链上的序列区称作“下 游序列”。
保守氨基酸取代可以包括非天然存在的氨基酸残基，其一般通过 化学肽合成插入而不是通过生物系统合成插入。这些包括肽模拟物和 氨基酸部分的其他反向或倒置形式。
根据共同侧链性质可以将天然存在的残基分为几类：
1)疏水性：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
2)中性亲水性：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
3)酸性：Asp，Glu；
4)碱性：His，Lys，Arg；
5)影响链取向的残基：Gly，Pro；和
6)芳香的：Trp，Tyr，Phe。
例如，非保守性取代可以包括用这些类中的一个的成员交换另一 类的成员。可以将这样的取代的残基导入与非人抗体同源的人抗体的 区中，或者到该分子的非同源区中。
根据一些实施方案，进行这样的变化，要考虑氨基酸的亲水指数。 以疏水性和电荷特征为基础对每一个氨基酸标定亲水指数。它们是： 异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)； 半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨 酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨 酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨 酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)； 和精氨酸(-4.5)。
氨基酸亲水指数在对蛋白质赋予相互作用生物学功能中的重要性 在本领域是公知的。Kyte等，J.Mol.Biol.157：105-131(1982)。 已知一些氨基酸可以取代具有相似亲水性指数或分数而且仍然保留相 似的生物学活性的其他氨基酸。以亲水指数为基础进行改变，在一些 实施方案中，包括其亲水指数在±2之内的氨基酸的取代。在一些实施 方案中，包括其亲水指数在±1之内的那些，在一些实施方案中，包括 其亲水指数在±0.5之内的那些。
本领域还知道，以亲水性为基础可以有效进行相似氨基酸的取 代，特别是在这样产生的生物功能蛋白质或肽是为了在免疫实施方案 中使用的情况下，如本申请情况下。在一些实施方案中，蛋白质的最 大局部平均亲水性，根据其相邻氨基酸的亲水性所支配的，与其免疫 原性和抗原性相关，即与蛋白质的生物学性质相关。
对这些氨基酸残基标定下面的亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨 酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)； 天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)； 脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)； 甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)； 酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；和色氨酸(-3.4)。以相似亲水 值为基础进行改变，在一些实施方案中，包括其亲水指数在±2之内的 氨基酸的取代，在一些实施方案中，包括其亲水指数在±1之内的那些， 在一些实施方案中，包括其亲水指数在±0.5之内的那些。人们根据亲 水性还可以从一级氨基酸序列鉴定表位。这些区也称作“表位核心 区”。
表1所示例示的氨基酸取代作用。
              表1：氨基酸取代作用     原残基     举例的取代     优选的取代     Ala     Val，Leu，Ile     Val     Arg     Lys，Gln，Asn     Lys     Asn     Gln     Gln     Asp     Glu     Glu     Cys     Ser，Ala     Ser     Gln     Asn     Asn     Glu     Asp     Asp     Gly     Pro，Ala     Ala     His     Asn，Gln，Lys，Arg     Arg     Ile     Leu，Val，Met，Ala，     Phe，正亮氨酸     Leu     Leu     正亮氨酸，Ile，     Val，Met，Ala，Phe     Ile     Lys     Arg，1，4二氨基-     丁酸，Gln，Asn     Arg     Met     Leu，Phe，Ile     Leu     Phe     Leu，Val，Ile，Ala，     Tyr     Leu     Pro     Ala     Gly     Ser     Thr，Ala，Cys     Thr     Thr     Ser     Ser     Trp     Tyr，Phe     Tyr     Tyr     Trp，Phe，Thr，Ser     Phe     Val     Ile，Met，Leu，Phe，     Ala，正亮氨酸     Leu
本领域技术人员应用公知技术能确定这里提到的多肽的合适的变 体。在一些实施方案中，本领域技术人员可以鉴定通过导向于不认为 对活性是重要的区而可以改变但是不破坏活性的分子的合适的部位。 在一些实施方案中，人们可以鉴定相似多肽之间保守的分子的残基和 部分。在一些实施方案中，即使对于生物活性或者对结构重要的区也 可以进行保守氨基酸取代而不破坏生物活性或者不会不利地影响多肽 结构。
另外，本领域技术人员能综述结构功能研究，鉴定对于活性或结 构重要的相似多肽中的残基。考虑这样一种比较，人们能预知蛋白质 中氨基酸残基的重要性，相当于对相似蛋白质中对活性或结构重要的 氨基酸残基。本领域技术人员对于这样预测的重要的氨基酸残基可以 选择化学相似氨基酸取代作用。
本领域技术人员还能分析与相似多肽中的结构相关的三维结构和 氨基酸序列。根据这样的信息，本领域技术人员可以预测抗体三维结 构的氨基酸序列比对。在一些实施方案中，本领域技术人员可以选择 对预计在蛋白质表面上的氨基酸残基不进行基团变化，因为这样的残 基在与其他分子的重要的相互作用中涉及。此外，本领域技术人员可 以制备在各个期望的氨基酸残基处包含单一氨基酸取代作用的试验变 体。然后可以应用本领域技术人员公知的活性测定来对这些变体进行 筛选。这样的变体也可以被用来收集关于合适的变体的信息。例如， 如果有人发现特定氨基酸残基的变化导致破坏的不期望的降低的，或 者不合适的活性，则可以避免这样的变化。换句话说，以从这样的常 规实验获得的信息为基础，本领域技术人员容易确定哪里应该避免进 一步的取代作用，不管是单独的或者是与其他突变一起的。
关于二级结构的预测已经出版了大量科学出版物。参见Moult J.，Curr.Op.in Biotech.，7(4)：422-427(1996)，Chou等， Biochemistry，13(2)：222-245(1974)；Chou等，Biochemistry， 113(2)：211-222(1974)；Chou等，Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol. Biol.，47：45-148(1978)；Chou等，Ann.Rev.Biochem.，47：251-276 和Chou等，Biophys.J.，26：367-384(1979)。此外，目前可获得 计算机程序辅助预测二级结构。预测二级结构的一种方法以同源性模 拟为基础。例如，序列同一性大于30％，或相似性大于40％的两种多 肽或蛋白质经常具有相似结构拓扑学。蛋白质结构数据库(PDB)的 最新增长提供对二级结构增强的可预测性，包括多肽或蛋白质结构中 可能的折叠数目。参见Holm等，Nucl.Acid.Res.，27(1)：244-247 (1999)。有人提议(Brenner等，Curr.Op.Struct.Biol.，7(3)： 369-376(1997))，在给定多肽或蛋白质中存在有限数目的折叠，并 且一旦确定临界数目的折叠，结构预测将合适地变得更精确。
预测二级结构的另外的方法包括″穿线法″(Jones，D.，Curr.Opin. Struct.Biol.，7(3)：377-87(1997)；Sippl等，Structure，4(1)： 15-19(1996))，″图形分析″(Bowie等，Science，253：164170(1991)； Gribskov等，Meth.Enzym.，183：146-159(1990)；Gribskov等，Proc. Nat Acad.Sci.，84(13)：4355-4358(1987))，和″进化的键″(参 见Holm，上文(1999)，和Brenner，上文(1997))。
在一些实施方案中，抗体变体包括与母体多肽的氨基酸序列相比 糖基化位点的数目和/或类型已经改变的抗体变体。在一些实施方案 中，蛋白质变体包括比天然蛋白质更多或更少数目的N-连接糖基化位 点。一个N-连接糖基化位点特征在于序列：Asn-X-Ser或Asn-X-Thr， 其中指定为X的氨基酸残基可以是除了脯氨酸的任何氨基酸残基。产 生这个序列的氨基酸残基的取代作用提供添加N-连接糖链的可能的新 位点。或者，去除这个序列的取代作用会去除存在的N-连接糖链。 还提供了N-连接糖链的重排，其中一个或多个N-连接糖基化位点(一 般是天然存在的那些)被去除并且产生一个或多个新的N-连接位点。 另外的优选的抗体变体包括半胱氨酸变体，与母体氨基酸序列相比， 其中一个或多个半胱氨酸残基被缺失或者取代成另一个氨基酸(例 如，丝氨酸)。在抗体必须重新折叠成生物活性构型，例如在分离不 溶性包涵体之后，则半胱氨酸变体可以是有用的。半胱氨酸变体一般 比天然蛋白质具有更少的半胱氨酸残基，并且一般具有偶数以使没有 配对的半胱氨酸产生的相互作用最小化。
根据一些实施方案，氨基酸取代是那些，其：(1)降低对蛋白水 解的易感性，(2)降低对氧化作用的易感性，(3)改变形成蛋白质复 合体的结合亲和性，(4)改变结合亲和性，和/或(4)对这样的多 肽赋予或改变其他生理化学或功能性质。根据一些实施方案，天然存 在的序列中(在一些实施方案中，在形成分子间相互作用的结构域之 外的多肽部分)可以进行一个或多个氨基酸取代(在一些实施方案中， 保守氨基酸取代)。在一些实施方案中，一个保守性氨基酸取代一般 基本不改变母体序列的结构特征(例如，置换氨基酸应该不会倾向于 破坏母体序列中存在的螺旋，或者破坏其他类型的表征母体序列的二 级结构)。本领域公知的多肽二级和三级结构的例子描述在Proteins， Structures and Molecular Principles(Creighton，编著，W.H. Freeman and Company，纽约(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden和J.Tooze，编著，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991))；和Thornton等，Nature 354：105(1991)， 这些文献在这里引作参考。
这里使用的术语″多肽片段″指具有氨基-末端和/或羧基-末端缺 失的多肽。在一些实施方案中，片段至少5至467个氨基酸长。可以 理解，在一些实施方案中，片段至少5，6，8，10，14，20，50，70， 100，150，200，250，300，350，400，或450个氨基酸长。
在制药工业中肽类似物通常被用作具有和模板肽类似性质的非肽 药物。这些非肽化合物类型称作″肽模拟物″。Fauchere，J.Adv.Drug Res.15：29(1986)；Veber和Freidinger TINS p.392(1985)； 和Evans等J.Med.Chem.30：1229(1987)，这些文献为了任何 目的在此引作参考。经常借助计算机化分子模型开发这样的化合物。 与治疗有用的肽结构相似的肽模拟物可以被用来产生相似治疗或预 防作用。一般情况下，肽模拟物结构上与范例多肽(即，具有生物 化学性质或药学性质)，例如人抗体相似，但是具有通过本领域公知 的方法通过选自下组的键任选地置换的一个或多个肽键：-CH2NH-， -CH2S-，-CH2-CH2-，-CH＝CH-(顺式和反式)，-COCH2-，-CH(OH)CH2-， 和-CH2SO-。带有相同类型的D-氨基酸的共有序列的一个或多个氨基 酸的体系取代作用(例如，D-赖氨酸置换L-赖氨酸)在一些实施方 案中可以用来制备更稳定的肽。另外，包括共有序列或基本上相同 的共有序列变体的受限制肽可以通过本领域公知的方法制备(Rizo 和Gierasch，Ann.Rev.Biochem.61：387(1992)，在这里为了 任何目的引作参考)；例如，通过添加能形成使肽环化的分子内二硫 桥的内半胱氨酸残基。
″抗体″或″抗体肽″指完整抗体，或与完整抗体竞争特异性结合的 其结合片段。在一些实施方案中，通过重组DNA技术制备结合片段。 在一些实施方案中，通过完整抗体的酶促或化学裂解制备结合片段。 结合片段包括但不限于Fab，Fab′，F(ab′)2，Fv，和单链抗体。
术语″重链″包括具有赋予对于OPGL的特异性的足够可变区序列 的任何多肽。术语″轻链″包括具有赋予对于OPGL的特异性的足够可 变区序列的任何多肽。全长重链包括可变区结构域，VH，和三个恒定 区结构域，CH1，CH2，和CH3。VH结构域在多肽的氨基末端，CH3结构 域在羧基末端。这里使用的术语″重链″包括全长重链及其片段。全长 轻链包括可变区结构域，VL，和恒定区结构域，CL。和重链一样，轻 链的可变区结构域在多肽的氨基末端。术语″轻链″，如这里使用的， 包括全长轻链及其片段。Fab片段由一条轻链和CH1和一条重链的可 变区构成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。Fab′ 片段包含一条轻链和一条重链，其在CH1和CH2结构域之间包含更多 的恒定区，这样在两条重链之间能形成链间二硫键，形成F(ab′)2 分子。Fv区包括来自重链和轻链的可变区，但是没有恒定区。单链抗 体是Fv分子，其中重链和轻链可变区通过柔性接头连接，形成单链 多肽，其形成抗原-结合区。WO 88/01649和美国专利Nos.4,946,778 和5,260,203详细讨论单链抗体。
在一些实施方案中，二价抗体而不是″多特异性″或″多功能″抗 体，一般理解其每个结合位点是相同的。
当过量抗体将与反受体结合的受体的量减少至少大约20％，40％， 60％，80％，85％，或更多(根据体外竞争结合分析测定的)时，抗体 基本上抑制配体与受体的粘附。
术语″表位″包括能与免疫球蛋白或T-细胞受体特异性结合的任何 多肽决定簇。在一些实施方案中，表位决定簇包括象氨基酸这样的分 子的化学活性表面基团，糖侧链，磷酰基，或磺酰基，并且，在一些 实施方案中，可以具有特异的三维结构特征，和/或特异的电荷特征。 表位是抗体结合的抗原的区。在一些实施方案中，当它优先识别蛋白 质和/或大分子的复杂混合物中的其靶抗原，就说抗体特异性结合抗 原。在一些实施方案中，当离解常数≤1μM时，在一些实施方案中， 当离解常数≤100nM时，在一些实施方案中，当离解常数≤10nM时，就 说抗体特异性结合抗原。
这里使用的术语“试剂”指化合物，化合物的混合物，生物大分 子，或从生物材料制备的提取物。
如这里使用的，术语“标记”或“标记的”指插入可检测标记 物，例如通过插入放射标记的氨基酸或连接能被标记的抗生物素蛋白 (例如能被光学方法或比色法检测的含有荧光标记物或酶活性的链霉 抗生物素蛋白)检测的生物素部分多肽。在一些实施方案中，标记或 标记物也可以是治疗性的。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域公 知的并且可以使用。多肽的标记的例子包括但不限于下组：放射性同 位素或放射性核素(例如3H，14C，15N，35S，90Y，99Tc，111In，125I， 131I)，荧光标记物(例如FITC，诺丹明，镧系磷光剂)，酶标记(例 如辣根过氧化物酶，β-半乳糖苷酶，荧光素酶，碱性磷酸酶)，化学 发光剂，生物素基，预先确定的第二报道分子识别的多肽表位(例如 亮氨酸拉链对序列，二抗的结合位点，金属结合结构域，表位标记)。 在一些实施方案中，标记通过各种长度的间隔臂连接以减小可能的空 间位阻。
这里使用的术语“生物样品”包括但不限于任何量的来自活物或 以前是活物的物质。这样的活物包括但不限于人，小鼠，猴，大鼠， 兔，和其他动物。这样的物质包括但不限于血液，血清，尿液，细胞， 组织，器官，骨，骨髓，淋巴结和皮肤。
术语“骨质稀少疾病”包括但不限于骨质疏松，骨质稀少，佩 吉特氏病，溶骨性转移灶，牙周炎，类风湿性关节炎和由于固定导致 的骨损失。除了这些骨疾病之外，已知一些癌症提高破骨细胞活性并 且诱导骨再吸收，例如乳腺癌，前列腺癌和多发性骨髓瘤。现在已知 这些癌症产生导致骨中OPGL过量表达的因子，并且导致增加的破骨 细胞数目和活性。
这里使用的术语“药剂或药物”指当适当地对患者施用时能诱导 期望的治疗效果的化合物或组合物。
这里使用的术语“调节剂”是改变分子的活性或功能的化合物。 例如，与不存在调节剂下发现的活性或功能值相比，调节剂可以引起 分子的一些活性或功能值的提高或降低。在一些实施方案中，调节剂 是抑制剂，降低分子的至少一种活性或功能值。一些例示的分子的活 性和功能包括但不限于结合亲和性，酶活性，和信号转导。一些例示 的抑制剂包括但不限于蛋白质，肽，抗体，肽体，碳水化合物或小有 机分子，肽体描述于例如WO01/83525。
如这里使用的，“基本上纯”指主体物质是占优势存在的物质(例 如以摩尔为基础，它在组合物中比任何其他各种物质更丰富)。在一 些实施方案中，基本上纯化的级分是其中主体物质包括占存在的全部 大分子物质至少大约50％(摩尔比)的组合物。在一些实施方案中， 基本上纯的组合物含有组合物中存在的所有的大分子物质的大约80 ％，85％，90％，95％，或99％以上。在一些实施方案中，主体物质 被纯化至基本上均质(通过常规检测方法不能检测到组合物中的杂质 物质)，其中组合物基本上由单一大分子物质组成。
术语患者包括人和动物受试者。
在本申请中，除非另外具体说明，单数包括复数。在本申请中， “或”的使用除非另有说明意思是“和/或”。此外，术语“包括” 以及其他形式，例如“includes”和“included”不是局限性的。还 有，除非另有说明，术语“元素”或“成分”包括包括一个单位的元 素和成分以及包括一种以上亚单位的元素和成分这两种情况。
破骨细胞形成中涉及骨保护素配体(OPGL)，细胞因子的肿瘤坏 死因子(TNF)家族成员。提高的破骨细胞活性与很多骨质稀少疾病 有关，包括绝经后骨质疏松，佩吉特氏病，溶骨转移灶，和类风湿性 关节炎。因此，OPGL活性降低可以导致破骨细胞活性的降低并且可以 降低骨质稀少疾病的严重性。根据本发明的一些实施方案，针对OPGL 的抗体可以被用来治疗骨质稀少疾病，包括但不限于上面提到的那 些。
在本发明的一些实施方案中，提供了抗人骨保护素配体(OPGL) 的全长人单克隆抗体。在一些实施方案中，提供了包括重链和轻链免 疫球蛋白，特别是相应于可变区的序列的氨基酸序列及其编码核苷酸 序列。在一些实施方案中，提供了相应于互补决定区(CDR)，特别是 从CDR1至CDR3的序列。根据一些实施方案，也提供了表达这样的免 疫球蛋白分子和单克隆抗体的杂交瘤细胞系。在一些实施方案中，提 供了抗人OPGL的纯化的人单克隆抗体。
在人工酵母染色体(YAC)中克隆和再构建兆碱基大小的人基因 座并且将它们导入小鼠种系的能力为说明非常大或粗略作图基因座的 功能成分以及制备有用的人疾病模型提供了一条途径。此外，应用用 它们的人等价物取代小鼠基因座这样的技术能为发育期间人基因产物 的表达和调节，它们与其他系统的联系，以及它们在疾病诱导和进展 中的参与提供独特视角。
这样一种策略重要的实施是小鼠体液免疫系统的“人源化”。将 人免疫球蛋白(Ig)基因座导入小鼠，其中内源Ig基因已失活，为 抗体程序表达和组装以及它们在B-细胞发育中的作用的机理研究提供 了机会。此外，这样的策略为制备完全的人单克隆抗体(Mabs)提供 了来源。在一些实施方案中，预期完全的人抗体将小鼠固有的或小鼠 产生的Mabs免疫原性和变应性反应最小化，因此，在一些实施方案 中，提高施用的抗体的效力和安全性。在一些实施方案中，在慢性和 复发人疾病例如骨质疏松，炎症，自身免疫和癌症的治疗中可以使用 完全的人抗体，包括反复施用抗体。
人们能通过基因工程产生小鼠抗体产生缺陷，具有人Ig基因座 大片段的小鼠株，预期这样的小鼠在没有小鼠抗体存在下能产生人抗 体。大的人Ig片段可以保留大的可变基因多样性，以及抗体产生和 表达的适当调节。通过利用抗体多样性和选择以及缺失对人蛋白质的 免疫耐受性的小鼠机制，这些小鼠株中重复产生的人抗体所有组成成 分可以得到抗所有感兴趣的抗原，包括人抗原的高亲和力抗体。利用 杂交瘤技术，可以制备和选择具有期望的特异性的抗原特异性人 Mabs。
在一些实施方案中，人们可以使用来自人之外的物种的恒定区以 及人可变区。
天然存在的抗体结构
天然存在的抗体结构单元一般包括四聚体。每一个这样的四聚体 一般由两个相同的多肽链对组成，每一对具有一条全长“轻链”(在 一些实施方案中，大约25kDa)和一条全长“重链”(在一些实施方案 中，大约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分一般包括大约100至110 或更多氨基酸的可变区，其一般负责抗原识别。每条链的羧基末端部 分一般定义负责效应物功能的恒定区。人轻链一般分类为κ和λ轻链。 重链一般分类为μ，δ，γ，α，或ε，抗体同种型分别定义为IgM，IgD， IgG，IgA，和IgE。IgG有几个亚类，包括但不限于IgG1，IgG2，IgG3， 和IgG4。IgM有几个亚类，包括但不限于IgM1和IgM2。类似地，IgA 分为几个亚类，包括但不限于IgA1和IgA2。一般情况下，全长轻链 和重链中，可变区和恒定区通过大约12个或更多个氨基酸的“J”区 连接，重链也包括大约10个以上氨基酸的“D”区。参见，例如， Fundamental Immunology第七章(Paul，W.编著，第二版，Raven Press， N.Y.(1989))(为所有的目的全文引作参考)。各个轻/重链对的可 变区一般形成抗原结合位点。
可变区一般具有相同的相对保守的构架区(FR)的一般结构，通 过三个超可变区，也称作互补决定区或CDR连接。各对两个链的CDRs 一般通过构架区排列，其可以与特异性表位结合。从N-末端至C-末 端，轻链和重链可变区一般包括结构域FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3， CDR3，和FR4。氨基酸在每个结构域的排列一般根据Kabat Sequences of Proeins of Immunological Interest的定义(Nation Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987和1991))，或Chothia & Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987)；Chothia等，Nature342：878- 883(1989)。
双特异性和双功能抗体
双特异性和双功能抗体一般是具有两个不同的重链/轻链对和两 个不同的结合位点的人工杂合抗体。通过各种方法可以制备双特异性 抗体，包括但不限于杂交瘤的融合或Fab’片段的连接。参见，例如， Songsivilai & Lachmann Clin。Exp.Immunol.79：315-321(1990)， Kostelny等，J.Immunol.148：1547-1553(1992)。
抗体的制备
根据一些实施方案，本发明包括特异性结合OPGL的一些抗体。 在一些实施方案中，通过用全长OPGL，OPGL的可溶形式，或者其片 段免疫，可以制备抗体。在一些实施方案中，本发明的抗体可以是多 克隆或单克隆的，和/或可以是重组抗体。在一些实施方案中，本发 明的抗体是例如通过对能产生人抗体的转基因动物免疫而制备的(参 见，例如，PCT公开申请No.WO93/12227)。
在一些实施方案中，αOPGL-1的轻链和重链可变区的互补决定区 (CDRs)可以嫁接于来自相同或另一种物种的构架区(FRs)。在一些 实施方案中，αOPGL-1的轻链和重链可变区的CDRs可以嫁接于共有 人FRs。为了产生共有人FRs，在一些实施方案中，来自几种人重链 或轻链氨基酸序列的FRs被比对，以鉴定共有氨基酸序列。在一些实 施方案中，αOPGL-1重链或轻链的FRs被来自不同重链或轻链的FRs 置换。在一些实施方案中，αOPGL-1轻链和重链的FRs中罕见氨基酸 不被置换，而其余FR氨基酸被置换。罕见氨基酸是通常在FRs中没 有发现它们的位置上的特异氨基酸。在一些实施方案中，来自αOPGL -1的嫁接的可变区可以与和αOPGL-1的恒定区不同的恒定区使用。 在一些实施方案中，嫁接的可变区是单链Fv抗体的一部分。CDR嫁接 描述于例如美国专利No.6180370，5693762，5693761，5585089和 5530101，为了任何目的引作参考。
根据一些实施方案，通过使用转基因小鼠制备本发明的抗体，所 述小鼠具有插入的产生人抗体基因组的大部分，但是使得内源鼠抗 体的产生有缺陷。这样的小鼠能产生人免疫球蛋白分子和抗体，但 是鼠免疫球蛋白分子和抗体的产生有缺陷。用来实现该结果的技术 在这里说明书中公开的专利，申请和参考文献中公开。在一些实施 方案中，人们可以使用例如PCT公开申请No.WO98/24893中公开的那 些，该专利文献在此为任何目的引作参考。也参见Mendez等，Nature Genetics15：146-156(1997)，该专利文献在此为任何目的引作参考。
根据一些实施方案，如下制备对OPGL特异性的完全的人单克隆 抗体。用感兴趣的抗原免疫包含人免疫球蛋白基因的转基因小鼠。获 得来自表达抗体的小鼠的淋巴细胞(例如B-细胞)。这样回收的细胞 与骨髓型细胞系融合制备无限增殖杂交瘤细胞系，并且对这样的杂交 瘤细胞系进行筛选和选择，来鉴定产生对感兴趣的抗原特异性的抗体 的杂交瘤细胞系。在一些实施方案中，提供了产生对OPGL特异性抗 体的杂交瘤细胞系的制备。
在一些实施方案中，杂交瘤细胞系AMG6.1，AMG6.4，AMG6.5，AMG7.1 和AMG7.2产生本发明的抗体。在一些实施方案中，杂交瘤细胞系 AMG6.1，AMG6.4和AMG6.5产生本发明的抗体。在一些实施方案中， 本发明的抗体结合OPGL，离解常数(Kd)大约为0.23和0.29nM。在 本发明的一些实施方案中，抗体与Kd以小于0.23nM的OPGL结合。
在一些实施方案中，本发明的抗体是IgG2同种型。在本发明的 一些实施方案中，抗体包括人κ轻链和人IgG2重链。在一些实施方 案中，克隆本发明的抗体用于在哺乳动物细胞中表达。在一些实施方 案中，抗体的可变区与IgG2同种型恒定区之外的恒定区连接。
在一些实施方案中，对αOPGL-1的重链和轻链的保守性修饰(并 且对编码核苷酸进行相应的修饰)会产生具有和αOPGL-1的那些相 似的功能和化学特征的OPGL的抗体。相反，通过选择重链和轻链氨 基酸序列中的取代可以完成αOPGL-1的功能和/或化学特征的显著修 饰，它们对保持下面的性质的作用显著不同：(a)取代作用区域中的 分子主链的结构，例如，作为片层或螺旋构象，(b)靶位点的分子的 电荷或疏水性，或(c)侧链体积。
例如，“保守性氨基酸取代”可以包括非天然氨基酸残基对天然 氨基酸残基的取代，使得对那个位点的氨基酸残基的极性或电荷几乎 没有或没有影响。此外，多肽中的任何天然残基也可以被丙氨酸取代， 这一点以前对于“丙氨酸扫描诱变”已经描述过。
本领域技术人员在期望这样的取代时能确定期望的氨基酸取代作 用(不管是保守性的或非保守性的)。在一些实施方案中，氨基酸取 代可以用来鉴定αOPGL-1的重要的残基，或者提高或降低抗体对这 里描述的OPGL的亲和性。
在一些实施方案中，本发明的抗体能在杂交瘤细胞系之外的细胞 系中表达。在一些实施方案中，编码特定抗体的序列能被用来转化 合适的哺乳动物宿主细胞。根据一些实施方案，通过任何公知的将 多核苷酸导入宿主细胞的方法能进行转化，包括，例如在病毒(或 病毒载体)中包装多核苷酸和用病毒(或载体)转导宿主细胞或者 通过本领域公知的转染方法，例如美国专利No.4399216，4912040， 4740461和4959455中举例说明的那些(这些专利文献在此为了任何 目的引作参考)。在一些实施方案中，使用的转化方法可以根据要转 化的宿主而定。将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞中的方法是本领 域公知的，包括但不限于葡聚糖介导的转染，磷酸钙沉淀，1，5-二 甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物介导的转染，原生质融合，电 穿孔，多核苷酸在脂质体中的胶囊化作用，和直接将DNA微注射到核 中。
可获得的作为用于表达的宿主的哺乳动物细胞系是本领域公知 的，包括但不限于从美国典型培养物保藏中心(ATCC)可获得的很多 无限增殖细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，HeLa细 胞，小仓鼠肾(BHK)细胞，猴肾细胞(COS)，人肝细胞癌细胞(例 如Hep G2)和很多其它细胞系。在一些实施方案中，通过测定哪一种 细胞系有高表达水平并且产生具有组成型OPGL结合性质的抗体可以 选择细胞系。
根据一些实施方案，本发明的抗体可用于检测生物样品中的 OPGL。在一些实施方案中，这使得可以鉴定产生蛋白质的细胞或组织。 在一些实施方案中，与OPGL结合并且阻断与其它结合化合物相互作 用的抗体在调节破骨细胞分化和骨再吸收中具有治疗性用途。在一些 实施方案中，抗OPGL抗体可以阻断OPGL结合ODAR，这可以导致信号 转导级联中的阻断和NF-kB介导的转录激活作用的丧失。应用例如荧 光素酶报道分子测定测量NF-kB介导的转录激活作用的分析是本领域 技术人员公知的。
在一些实施方案中，提供了治疗骨病的方法，包括施用治疗有效 量的抗OPGL抗体。在一些实施方案中，提供了治疗骨病的方法，包 括施用治疗有效量的抗OPGL抗体和另一种治疗剂。在一些这样的实 施方案中，以治疗有效量施用所述另外的治疗剂。在一些实施方案中， 所述骨病是特征在于净骨损失的疾病，包括但不限于骨质稀少和骨质 溶解。在一些实施方案中，使用抗OPGL抗体的治疗抑制骨再吸收速 度。因此，在一些实施方案中，为了补偿骨形成低于正常水平，可以 应用治疗来降低再吸收速度高于正常的骨再吸收速度，或者将骨再吸 收降低至低于正常水平。在一些实施方案中，可以对抗体测定不存在 或存在OPG下与OPGL的结合，并且检查它们抑制OPGL介导的破骨细 胞生成和/或骨再吸收的能力。
根据一些实施方案可以治疗的状况包括但不限于下组：
骨质疏松症，包括但不限于原发性骨质疏松症，内分泌骨质疏松 症(包括但不限于甲状腺功能亢进，甲状旁腺功能亢进，库欣综合征， 和肢端肥大症)，骨质疏松症的遗传和先天形式(包括但不限于成骨 不全，高胱氨酸尿症，门克斯综合征，赖-戴综合征)，和由于肢端固 定的骨质疏松症；
成年人和少年骨佩吉特氏病(畸形性骨炎)；
骨髓炎，即导致骨损失的骨感染性病变；
高钙血症，包括但不限于实体肿瘤(包括但不限于乳房，肺和肾) 和血液恶性病变(包括但不限于多发性骨髓瘤，淋巴瘤和白血病)导 致的高钙血症，特发性高钙血症，和与甲状腺功能亢进和肾功能失调 相关的高钙血症；
骨质稀少，包括但不限于手术之后的骨质稀少，施用甾族药物诱 导的骨质稀少，与小肠和大肠疾病相关的骨质稀少，和与慢性肝和肾 病相关的骨质稀少；
骨坏死，即骨细胞死亡，包括但不限于与创作性损伤有关的骨坏 死，与戈谢病有关的骨坏死，与镰状细胞贫血有关的骨坏死，与系统 性红斑狼疮有关的骨坏死，与类风湿性关节炎有关的骨坏死，与牙周 病有关的骨坏死，与溶骨性转移有关的骨坏死，与其它状况有关的骨 坏死；和
与类风湿性关节炎有关的软骨损失和关节侵蚀。
在一些实施方案中，可以单独地或者与至少一种用于治疗骨病的 另外的治疗剂一起使用抗OPGL抗体。在一些实施方案中，与治疗有 效量的另外一种治疗剂结合使用抗OPGL抗体。可以与抗OPGL抗体一 起施用的举例的治疗剂包括但不限于指定为BMP-1至BMP-12的骨形 态发生因子，转化生长因子-β(TGF-β)和TGF-β家族成员；白介素- 1(IL-1)抑制剂，包括但不限于IL-1ra及其衍生物和KineretTM；TNFα 抑制剂，包括但不限于可溶性TNFα受体，EnbrelTM，抗-TNFα抗体， RemicadeTM，和D2E7抗体；甲状旁腺素及其类似物；甲状旁腺素相关 蛋白及其类似物；E系列前列腺素；双磷酸盐(例如阿仑特罗和其他)； 骨增强矿物例如氟化物和钙；非甾族抗炎药物(NSAIDs)，包括但不 限于COX-2抑制剂，例如CelebrexTM和VioxxTM；免疫抑制剂，例如甲 氨蝶呤或来氟米特，丝氨酸蛋白酶抑制剂，包括但不限于分泌性白细 胞蛋白酶抑制剂(SLPI)；IL-6抑制剂(包括但不限于抗IL-6抗体)， IL-8抑制剂(包括但不限于抗IL-8抗体)，IL-18抑制剂(包括但不 限于IL-18结合蛋白和抗IL-18抗体)，白介素-1转化酶(ICE)调节 剂；成纤维细胞生长因子FGF-1至FGF-10和FGF调节剂；PAF拮抗剂； 角质形成细胞生长因子(KGF)，KGF-相关分子，和KGF调节剂；基质 金属蛋白酶(MMP)调节剂；一氧化氮合酶(NOS)调节剂，包括但不 限于，诱导型NOS的调节剂；糖皮质激素受体调节剂；谷氨酸受体调 节剂；脂多糖(LPS)水平调节剂；和去甲肾上腺素和调节剂及其模 拟物。
在一些实施方案中，抗OPGL抗体与特定治疗剂一起使用来治疗 各种炎症状况，自身免疫状况，或伴随骨损失的其他试剂。在一些实 施方案中，根据状况和期望的治疗水平，可以施用两种，三种或更多 试剂。在一些实施方案中，通过包含在相同配方中一起提供这些试剂。 在一些实施方案中，通过包含在相同配方中一起提供这样的试剂和抗 OPGL抗体。在一些实施方案中，通过包含在治疗试剂盒中可以一起提 供这样的试剂。在一些实施方案中，通过包含在治疗试剂盒中可以一 起提供这样的试剂和抗OPGL抗体。在一些实施方案中，可以分开提 供这样的试剂。在一些实施方案中，当通过基因治疗施药时，相同载 体中可以包含编码蛋白质试剂和/或抗OPGL抗体的基因。在一些实 施方案中，编码蛋白质试剂和/或抗OPGL抗体的基因可以处于相同 启动子区的控制下。在一些实施方案中，编码蛋白质试剂和/或抗OPGL 抗体的基因可以在分开的载体中。
在一些实施方案中，本发明涉及包括抗OPGL抗体和至少一种白 介素-1(IL-1)抑制剂的治疗方案，和应用这样的治疗方案的治疗方 法。在一些实施方案中，治疗方案包括抗OPGL抗体和IL-1抑制剂和 至少一种这里描述的另外的分子。在一些实施方案中，治疗方法与抗 OPGL抗体联合使用IL-1抑制剂和/或TNFα抑制剂。在一些实施方案 中，抗OPGL抗体与IL-1抑制剂和/或TNFα抑制剂联合可以用于治 疗象哮喘，类风湿性关节炎和多发性硬化这样的状况。
白介素-1(IL-1)是抗炎细胞因子。在一些例子中，IL-1是很多 疾病和医学状况中的介导物。在一些例子中，巨噬细胞/单细胞系细 胞生产IL-1。在一些例子中，IL-1以两种形式产生：IL-1α(IL-1α) 和IL-1β(IL-1β)。
如果自发的或实验性疾病或医学状况与体液或组织中升高的IL- 1水平有关和/或如果来自身体的细胞或组织在培养物中产生升高水 平的IL-1，则认为这种疾病或医学状况是“白介素-1介导的疾病”。 在一些实施方案中，通过下面另外两种状况识别这样的白介素-1介 导的疾病：(1)通过施用IL-1或上调IL-1的表达能从实验上用动物 模拟与疾病或医学状况相关的病理发现；和(2)通过用抑制IL-1作 用的试剂治疗能抑制或消除疾病或医学状况中实验动物模型中诱导 的病理。在一些实施方案中，上述状况中的一项或多项符合IL-1-介 导的疾病。在一些实施方案中，所有三种状况都符合IL-1-介导的疾 病。
急性和慢性白介素-1(IL-1)-介导的疾病包括但不限于下组： 急性胰腺炎；肌萎缩侧索硬化(ALS，或Lou Gehrig’s病)；阿尔茨海 默病；恶病质/厌食，包括但不限于AIDS-诱导的恶病质；哮喘和其它 肺病；动脉粥样硬化；自身免疫性脉管炎；慢性疲劳综合征，梭状芽 孢杆菌相关疾病，包括但不限于梭状芽孢杆菌相关腹泻，冠状动脉状 况和适应症，包括但不限于充血性心衰，冠状动脉再狭窄，心肌梗塞， 心肌功能障碍(例如与脓毒症有关)，和冠状动脉旁路移植；癌症， 包括但不限于白血病，包括但不限于多发性骨髓瘤白血病和髓细胞白 血病(例如AML和CML)，和肿瘤转移；糖尿病(包括但不限于胰岛素 依赖性糖尿病)；子宫内膜异位；发热；纤维肌瘤；肾小球肾炎；移 植物抗宿主疾病和/或移植物排斥；出血性休克；痛觉过敏；炎性肠 病；关节炎症状况，包括但不限于骨关节炎，牛皮癣关节炎，和类风 湿性关节炎；炎性眼病，包括但不限于例如与角膜移植有关的那些； 局部缺血，包括但不限于脑局部缺血(包括但不限于作为例如创伤， 癫痫，出血或中风的结果的脑损伤，这些的每一种情况都可以导致神 经变性)；Kawasaki’s病；学习障碍；肺病(包括但不限于急性呼吸 窘迫综合症，或ARDS)；多发性硬化；肌病(例如肌肉蛋白质代谢， 包括但不限于脓毒症中的肌肉蛋白质代谢)；神经毒性(包括但不限 于HIV诱导的这样的状况)；骨质疏松症；疼痛，包括但不限于与癌 症相关的疼痛；帕金森氏病；牙周病；早产；牛皮癣；再灌注损伤； 脓毒性休克；放射治疗副作用；颞颌关节病；睡眠障碍；葡萄膜炎； 从例如由劳损，扭伤，软骨损伤，创伤，整形术，感染，或其它疾病 过程引起的炎症。
在一些实施方案中，IL-1抑制剂可以是能特异性防止细胞受体激 活成IL-1的任何蛋白质或分子。举例说明的机理包括但不限于下调 IL-1产生，结合游离IL-1，干扰IL-1与其受体结合，干扰IL-1受体 复合体的形成(即IL-1受体与IL-1受体辅助蛋白缔合)，干扰与其 受体结合之后IL-1信号传递的调节。
一些白介素-1抑制剂包括但不限于IL-1受体拮抗剂，包括但不 限于KineretTM，IL-1ra，IL-1ra变体，和IL-1ra衍生物，这里统称 为“IL-1ra蛋白质”；抗-IL-1受体单克隆抗体(参见，例如，EP623674， 为任何目的在此引作参考)；IL-1结合蛋白，包括但不限于，可溶性 IL-1受体(参见，例如，美国专利No.5492888，美国专利No.5488032， 和美国专利No.5464937，美国专利No.5319071，和美国专利 No.5180812，为任何目的在此引作参考)；抗-IL-1单克隆抗体(参见， 例如，WO9501997，WO9402627，WO9006371，美国专利No.4935343， EP364778，EP267611和EP220063，为任何目的在此引作参考)；IL-1 受体辅助蛋白及其抗体(参见，例如，WO96/23067和WO99/37773， 为任何目的在此引作参考)；白介素-1β转化酶(ICE)或caspase的 抑制剂(参见，例如，WO99/46248，WO99/47545，和WO99/47154， 为任何目的在此引作参考)，其可以用来抑制IL-1β产生和分泌；白 介素-1β蛋白酶抑制剂；和阻断IL-1的体内合成或胞外释放的其他化 合物和蛋白质。
例示的IL-1抑制剂公开于，例如美国专利No.5747444，5359032； 5608035；5843905；5359032；5866576；5869660；5869315；5872095； 5955480；5965564；国际专利申请(WO)98/21957，96/09323，91 /17184，96/40907，98/32733，98/42325，98/44940，98/47892， 98/56377，99/03837，99/06426，99/06042，91/17249，98/32733， 98/17661，97/08174，95/34326，99/36426，99/36415；欧洲专 利申请(EP)534978和894795；和法国专利申请FR2762514。所有上 述参考文献的公开内容为任何目的在此引作参考。
白介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)是作为白介素-1的天然抑制 剂起作用的人蛋白质并且是IL-1家族的成员，包括IL-1α和IL-1β。 一些受体拮抗剂，包括IL-1ra和变体及其衍生物，以及制备和使用 它们的方法描述于美国专利No.5075222；WO91/08285；WO91/17184； AU9173636；WO92/16221；WO93/21946；WO94/06457；WO94/21275； FR2706772；WO94/21235；DE4219626；WO94/20517；WO96/22793； WO97/28828；和WO99/36541，它们为任何目的在此引作参考。在一些 实施方案中，IL-1受体拮抗剂可以是糖基化的。在一些实施方案中， IL-1受体拮抗剂可以是非糖基化的。
美国专利No.5075222(′222专利)中描述了IL-1ra的三种形式 及其变体。第一种形式在美国专利No.5075222中被称作“IL-li”，表 征为SDS-PAGE上的22-23kD的分子，等电点大约是4.8，从Mono Q FPLC 柱子上用大约含52mM NaCl的Tris缓冲液，pH7.6洗脱。第二种形 式，IL-1raβ，表征为22-23kD蛋白质，从Mono Q柱子上用48mM NaCl洗脱。IL-1raα和IL-1raβ是糖基化的。第三种形式，IL-1rax，表征 为20kD蛋白质，从Mono Q柱子上用48mM NaCl洗脱，并且是非糖 基化的。美国专利No.5075222还描述了一些编码抑制剂的基因的分 离方法，在合适的载体中克隆那些基因的方法，将那些基因转化和转 染到一些细胞类型中的方法，和表达那些基因产生抑制剂的方法。
在一些实施方案中，IL-1ra氨基酸序列中进行了缺失，插入，和 /或取代(分别或统称作“变体”)。在一些实施方案中，IL-1ra变体 是生物活性的(例如具有抑制IL-1的能力)。
在一些实施方案中，本发明涉及包括抗OPGL抗体和至少一种TNFα 抑制剂的治疗方案，和应用该治疗方案的方法。在一些实施方案中， 治疗方案包括抗OPGL抗体和TNFα抑制剂和至少一种这里描述的另外 的分子。
一些疾病和医学状况是由TNF介导的并且归类为炎症状况。如这 里使用的“TNF-介导的疾病”包括但不限于与体液或组织中升高水平 的TNF相关的和/或其中细胞或组织取自在培养物中产生高水平TNF 的个体的疾病或医学状况。在一些实施方案中，如果(1)通过施用 或上调TNF表达在动物中能实验性模拟与疾病或医学状况相关的病理 发现和/或(2)通过用抑制TNF作用的试剂治疗能抑制或破坏疾病 或医学状况的实验动物模型中诱导的病理，则认为疾病是TNF-介导疾 病。
一些疾病和医学状况是TNF介导的，并且可以分类为炎症状况。 如这里使用的，“TNF介导的疾病”包括但不限于：恶病质和厌食； 癌症，包括但不限于，白血病；慢性疲劳综合征；冠状动脉状况和 /或适应症，包括但不限于，充血性心衰，冠状再狭窄，心肌梗塞， 心肌功能障碍(包括但不限于与脓毒症有关的这样的状况)，和冠状 动脉旁路移植；抑郁症；糖尿病，包括但不限于，青少年起病1型 糖尿病，糖尿病，和胰岛素抗性(包括但不限于与肥胖有关的胰岛 素抗性)；子宫内膜异位，子宫内膜炎，和相关的状况；纤维肌瘤和 痛觉缺失；移植物抗宿主排斥；痛觉过敏；炎性肠病，包括但不限 于克隆氏病和艰难梭菌-相关腹泻；局部缺血，包括但不限于，作为 创伤，癫痫，出血，和/或中风结果的脑损伤；肺病，包括但不限 于成人呼吸窘迫综合征，哮喘，肺纤维化；多发性硬化；神经炎性 疾病；眼部疾病和状况，包括但不限于角膜移植，眼退化和葡萄膜 炎；疼痛，包括但不限于，与癌相关的疼痛；胰腺炎，牙周病；毛 发红糠疹(PRP)；前列腺炎，包括细菌性和非细菌性前列腺炎，和相 关状况；牛皮癣和相关状况；肺纤维化；再灌注损伤；风湿病，包 括但不限于类风湿性关节炎，骨关节炎，青少年关节炎(包括但不 限于青少年类风湿性关节炎)，血清反应阴性多关节炎，强直性脊柱 炎，Reiter’s综合征和反应性关节炎，Still’s病，牛皮癣关节炎， 肠病关节炎，多肌炎，皮肌炎，硬皮病，系统性硬化，脉管炎(例 如Kawasaki’s病)，脑脉管炎，赖姆病，葡萄球菌诱导(“脓毒性”) 的关节炎，斯耶格伦综合征，风湿热，多软骨炎和风湿性多肌病和 巨细胞动脉炎)；脓毒性休克；放疗副作用；系统性红斑狼疮(SLE)； 颞颌关节病；甲状腺炎；和组织移植和/或例如由劳损，扭伤，软 骨损伤，创伤，整形术，感染(例如HIV，艰难梭菌和相关物种)或 其他疾病过程引起的炎症。
在一些实施方案中，TNF抑制剂通过下调或抑制TNF产生，结合 游离THF，干扰TNF与其受体结合，和干扰与其受体结合之后TNF信 号传递调节中的至少一种而发挥作用。术语“TNF抑制剂”包括但不 限于可溶性TNF受体，包括但不限于，可溶性肿瘤坏死因子受体I型 (sTNF-RI；也称作p55受体)，可溶性肿瘤坏死因子受体II型(也 称作p75受体)，和EnbrelTM；抗TNF抗体，包括但不限于，RemicadeTM 和D2E7(参见，例如美国专利No.6090382和6258562)；抗TNF受体 抗体；sTNF-RI(参见，例如，WO98/24463)，Etanercept(EnbrelTM)； TNF-α转化酶(TACE)的抑制剂；和影响TNF活性的其他分子。
例示的TNF-α抑制剂描述于，例如，欧洲专利申请
EP 308 378；EP 422 339；EP 393 438；EP 398 327；EP 412 486；EP 418 014，EP 417 563，EP 433 900；EP 464 533；EP 512 528；EP 526 905；EP 568 928；EP 607 776，其中描述了来氨米特抑制 TNF-α的用途；EP 663 210；EP 542 795；EP 818 439；EP 664 128；EP 542 795；EP 741 707；EP 874 819；EP 882 714；EP 880 970；EP 648 783；EP 731 791；EP 895 988；EP 550 376；EP 882 714；EP 853 083；EP 550 376；EP 943 616；EP 939 121；EP 614 984；EP 853 083；美国专利号5,136,021； 5,929,117；5,948,638；5,807,862；5,695,953；5,834,435；5,817,822；5830742； 5,834,435；5,851,556；5,853,977；5,359,037；5,512,544；5,695,953；5,811,261； 5,633,145；5,863,926；5,866,616；5,641,673；5,869,677；5,869,511；5,872,146； 5,854,003；5,856,161；5,877,222；5,877,200；5,877,151；5,886,010；5,869,660； 5,859,207；5,891,883；5,877,180；5,955,480；5,955,476；5,955,435；5,994,351； 5,990,119；5,952,320；5,962,481；国际专利申请WO 90/13575， WO 91/03553，WO 92/01002，WO 92/13095，WO 92/16221，WO 93/07863，WO 93/21946，WO 93/19777，WO 95/34326，WO 96/28546，WO 98/27298，WO 98/30541，WO 96/38150，WO 96/38150，WO 97/18207，WO 97/15561，WO 97/12902，WO 96/25861，WO 96/12735，WO 96/11209，WO 98/39326，WO 98/39316，WO 98/38859，WO 98/39315，WO 98/42659，WO 98/39329，WO 98/43959，WO 98/45268，WO 98/47863，WO 96/33172，WO 96/20926，WO 97/37974，WO 97/37973，WO 97/47599，WO 96/35711，WO 98/51665，WO 98/43946，WO 95/04045，WO 98/56377，WO 97/12244，WO 99/00364，WO 99/00363，WO 98/57936，WO 99/01449，WO 99/01139，WO 98/56788，WO 98/56756，WO 98/53842，WO 98/52948，WO 98/52937，WO 99/02510，WO 97/43250，WO 99/06410，WO 99/06042，WO 99/09022，WO 99/08688，WO 99/07679，WO 99/09965，WO 99/07704，WO 99/06041，WO 99/37818，WO 99/37625，WO 97/11668，WO 99/50238，WO 99/47672，WO99/48491； 日本专利申请10147531，10231285，10259140，和10130149， 10316570，11001481，和127,800/1991；德国专利申请19731521；和 英国专利申请2218101，2326881，2246569。
所有上面提到的参考文献公开内容为了任何目的在此引作参考。
EP393438和EP422339描述了可溶性TNF受体I型(也已知为 sTNFR-I或30kDa TNF抑制剂)和可溶性TNF受体I I型(也已知为 sTNFR-II或40kDa TNF抑制剂)，这里统称作“sTNFRs”。EP393438和 EP422339还描述了sTNFR-I和sTNFR-II的修饰形式，包括但不限于， 片段，功能衍生物，和变体。此外，EP393438和EP422339描述了编 码抑制剂的基因的分离方法，在合适的载体中克隆基因的方法，将基 因转化和转染到一些细胞类型中的方法，和表达基因产生抑制剂的方 法。
sTNFR-I和sTNFR-II是神经生长因子/TNF受体的受体超家族成 员，包括神经生长因子受体(NGF)，B细胞抗原CD40，4-1BB，大鼠 T-细胞抗原MR COX40，fas抗原，和CD27和CD30抗原(Smith等(1990) Science248：1019-1023)。这组细胞表面受体的保守特征是富含半胱 氨酸的胞外配体结合结构域，它们可以分为在非常保守的位置包含4 -6个半胱氨酸残基大约40个氨基酸的四个重复基序(Smith等 (1990)，上文)。
EP393438公开了40kDa TNF抑制剂Δ51和40kDa TNF抑制剂Δ53， 它们是全长重组40kDa TNF抑制剂蛋白质的截短形式。Δ51和Δ53分 别在成熟蛋白质的羧基末端缺失51或53个氨基酸。
公开的PCT申请No.WO98/01555描述了不包含第四结构域 (sTNFR-I的氨基酸残基Thr127-Asn161和sTNFR-II的氨基酸残基Pro141 -Thr179)；第三结构域的一部分(sTNFR-I的氨基酸残基Asn111-Cys126 和sTNFR-II的氨基酸残基Pro123-Lys140)；和任选地，不包含第一结 构域的一部分(sTNFR-I的氨基酸残基Asp1-Cys19和sTNFR-II的氨 基酸残基Leu1-Cys32)的sTNFR-I和sTNFR-II的截短形式。在一些 实施方案中，截短的sTNFRs包括式R1-[Cys19-Cys103]-R2和R4-[Cys32- Cys115]-R5代表的蛋白质。这些蛋白质分别是sTNFR-I和sTNFR-II的 截短形式。
如这里使用的，“R1-[Cys19-Cys103]-R2”代表一种或多种蛋白质， 其中[Cys19-Cys103]是sTNFR-I的残基19至103，WO98/01555的图1 提供了其序列；其中R1代表Cys19的甲二磺酰化或非甲二磺酰化胺基 或者选自Cys18至Asp1的一个或多个氨基末端氨基酸残基；和其中R2 代表Cys103的羧基或者选自Phe104至Leu110的一个或多个羧基末端氨基 酸残基。
本发明举例的截短的sTNFR-I包括但不限于sTNFR-I2.6D/C105， sTNFR-I2.6D/C106，sTNFR-I2.6D/N105，sTNFR-I2.3D/d8，sTNFR- I2.3D/d18，sTNFR-I2.3D/d15，或者是甲二磺酰化或者是非甲二磺酰 化的，其变体和衍生物。一些举例的截短的sTNFR-I描述于，例如， 公开的PCT申请No.WO98/01555。
如这里使用的，“R3-[Cys32-Cys115]-R4”代表一种或多种蛋白质， 其中[Cys32-Cys115]是sTNFR-II的残基Cys32至Cys115，WO98/01555的 图8提供了其序列；其中R3代表Cys32的甲二磺酰化或非甲二磺酰化 胺基或者选自Cys31至Leu1的一个或多个氨基末端氨基酸残基；并 且其中R4代表Cys115的羧基或者选自Ala116至Arg122的一个或多 个羧基末端氨基酸残基。
在一些实施方案中，本发明涉及包括抗OPGL抗体和至少一种丝 氨酸蛋白酶抑制剂的治疗方案，和应用这种治疗方案的治疗方法。在 一些实施方案中，治疗方案包括抗OPGL抗体和一种丝氨酸蛋白酶抑 制剂和至少一种这里描述的另外的分子。
内源蛋白水解酶可以降解入侵的生物体，抗原-抗体复合体，和 一些不再需要或有用的组织蛋白质。感染物质可以将另外的蛋白水解 酶导入生物体。蛋白酶抑制剂可以调节内源和入侵的蛋白水解酶。
在一些实施方案中，天然存在的蛋白酶抑制剂通过局部地和暂时 地限制它们的反应来控制内源蛋白酶。在一些实施方案中，蛋白酶抑 制剂可以抑制通过感染物质导入体内的蛋白酶。在一些情况下，特别 容易受蛋白水解攻击和感染的组织，包括但不限于呼吸道的那些，富 含蛋白酶抑制剂。
蛋白酶抑制剂占人血浆蛋白质的大约10％。从这种来源分离了至 少八种抑制剂，并且在文献中表征。这些包括但不限于，α2-巨球蛋 白(α2M)，α1-蛋白酶抑制剂(α1PI)，α1-抗胰凝乳蛋白酶(α1Achy)， α1-抗胶原酶(α1AC)，和内-α-胰蛋白酶抑制剂(I-α-I)。
在一些情况下，蛋白酶/蛋白酶抑制剂平衡的破坏能导致在蛋白 酶介导的组织破坏，包括但不限于，肺气肿，关节炎，肾小球肾炎， 牙周炎，肌萎缩，肿瘤入侵，和各种其他病理状况。在一些情况下， 例如象脓毒症或急性白血病这样的严重病理过程，存在的游离蛋白水 解酶的量由于酶从分泌细胞释放而增加。
此外，在一些情况下，减小生物体调节抑制剂能力也可以引起蛋 白酶/蛋白酶抑制剂平衡的改变。这样的减小的调节抑制剂能力的非 限制性例子是α1-蛋白酶抑制剂缺乏，这与肺气肿发生有关。
在一些情况下，当这样的异常状况存在时能发生对生物体的严重 破坏，除非能采取措施来控制蛋白水解酶。因此，已经探索了能对生 物体施用以控制蛋白水解酶的蛋白酶抑制剂。
白细胞弹性蛋白酶，胰蛋白酶，组织蛋白酶G，和胰弹性蛋白酶 是已知为丝氨酸蛋白酶的一类蛋白酶的非限制性例子。
在一些情况下，当胞外释放时，白细胞弹性蛋白酶降解结缔组织 和其他有价值蛋白质。尽管正常功能的生物体降解一定量的结缔组 织和其他蛋白质，过量白细胞弹性蛋白酶的存在可能与各种病理状 态有关，包括但不限于肺气肿和类风湿性关节炎。在一些实施方案 中，为了阻碍白细胞弹性蛋白酶的作用，当它以大于正常量存在时， 就寻求对白细胞弹性蛋白酶特异性的蛋白酶抑制剂。如果能以药学 有用的纯的形式和足够量分离或制备，则这样一种蛋白酶抑制剂是 有用的。
一些白细胞弹性蛋白酶抑制剂描述于，例如，Schiessler等，“人 粘液分泌中巨细胞中性蛋白酶的酸-稳定抑制剂”，Neutral Proteases of Human Polymorphoneuclear Leucocytes，Havemann等(编著)，Urban and Schwarzenberg，Inc.(1978)，和Travis和Salvesen， Ann.Rev.Biochem.52：655-709(1983)。
在一些情况下，在各种各样的急性状况，包括但不限于胰腺炎期 间，胰蛋白酶引起一些软的器官组织的降解，例如胰组织。如果能以 药学有用的纯的形式和足够量分离或制备，则胰蛋白酶抑制剂是有用 的。
组织蛋白酶G是白细胞中存在的另一种蛋白酶。在一些实施方案 中，组织蛋白酶G能体外降解各种蛋白质，包括补体途径的那些。胰 弹性蛋白是在胰腺炎中有作用的另一种蛋白酶。因此，这些蛋白酶的 抑制剂也可能是有药用价值的。
在一些实施方案中，相信对丝氨酸蛋白酶不同抑制剂的底物特异 性和敏感性只是几种氨基酸残基改变的结果。类似地，有可能构思一 类丝氨酸蛋白酶抑制剂，其中相对少的氨基酸的改变会导致不同蛋白 酶的抑制作用。在一些实施方案中，这类抑制剂的成员抑制每一种丝 氨酸蛋白酶。
举例的丝氨酸蛋白酶抑制剂是分泌性白细胞蛋白酶抑制剂 (SLPI)及其片段和类似物。举例的丝氨酸蛋白酶抑制剂还包括但不 限于，抗-白细胞蛋白酶(ALP)，粘液蛋白酶抑制剂(MPI)，人精液 血浆抑制剂-1(HUSI-1)，支气管粘液抑制剂(BMI)，和子宫颈粘液 抑制剂(CUSI)。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂也可以是LPS 调节剂。参见，例如，Jin等(1997)，Ce1188(3)：417-26。在一 些实施方案中，这些分子适合在导致骨损失的状况中使用，因为它们 优先涉及软骨。
举例的丝氨酸蛋白酶抑制剂描述于，例如，美国专利No.4760130； 美国专利No.5900400；和美国专利No.5633227；这些专利文献在此为 了任何目的引作参考。上述文献中公开的分子以及其所有的变体或类 似物统称为“丝氨酸蛋白酶抑制剂”。
IL-18是促炎细胞因子，发现它诱导干扰素-γ，并且以前称作 干扰素γ诱导因子(IGIF)。在一些情况下，已经证明IL-1上调IL- 18产生，并且IL-18诱导大量促炎细胞因子的产生，包括IL-6和 MMP-1。参见，例如，Dinarello等(1998)，J.Leukocyte Biol.63： 658-64。在一些情况下，caspase I对于IL-18产生也是重要的。 实验还提示TNF-α调节IL-18产生，并且同时抑制TNF-α和IL-18保 护肝脏不中毒。参见，例如，Faggioni等(2000)，PNAS97：2367- 72。
IL-18通过回忆IL-1系统的受体系统而体内起作用。IL-18与细 胞表面受体(IL-18R)相互作用，该受体与辅助蛋白(IL-18RAcP) 相互作用。形成IL-18，IL-18R和IL-18RacP复合体时进行IL-18-介 导的信号传递。IL-18的天然抑制剂是IL-18bp。在一些实施方案中， 通过结合IL-18分子并且防止与IL-18R相互作用，IL-18bp作为“引 诱受体”起作用。
在一些实施方案中，本发明涉及包括抗OPGL抗体和至少一种IL- 18抑制剂的治疗方案，和应用这样的治疗方案的治疗方法。在一些实 施方案中，治疗方案包括抗OPGL抗体和IL-18抑制剂和至少一种这 里描述的另外的分子。根据一些实施方案可以治疗的例示的状况包括 但不限于炎症，自身免疫疾病，IL-1介导的疾病，和TNF-介导的疾 病。根据一些实施方案可以用抗OPGL抗体和至少一种IL-18抑制剂 治疗的例示的状况包括但不限于关节炎，包括但不限于类风湿性关节 炎；系统性红斑狼疮(SLE)；移植物抗宿主疾病(GvHD)；肝炎，败 血症；和伴随这些疾病的骨和软骨损失。
举例的IL-18抑制剂包括但不限于与IL-18结合的抗体；与IL-18R 结合的抗体；与IL-18 RAcP；IL-18bp；IL-18R片段(例如IL-18受 体的可溶胞外结构域)结合的抗体；与IL-18结合并且减小或阻止其 与IL-18R相互作用的肽；与IL-18R结合并且减小或阻止其与IL-18 或与IL-18 RAcP相互作用的肽；与IL-18 RAcP结合并且减小或阻止 其与IL-18R相互作用的肽；减小或阻止IL-18产生或者IL-18，IL-18R 和IL-18 RAcP之间相互作用的小分子。
一些IL-18抑制剂描述于，例如，1994年7月14日授权的美国 专利No.5912324；1999年12月8日公开的EP0962531；1994年11月 15日公开的EP712931；1994年7月14日授权的美国专利No.5914253； 1997年7月10日公开的WO97/24441；2000年5月9日授权的美国专 利No.6060283；1996年12月26日公开的EP850952；1998年9月16 日公开的EP864585；1998年9月24日公开的WO98/41232；2000年4 月25日授权的美国专利No.6054487；1997年8月14日公开的 WO99/09063；1997年11月3日公开的WO99/22760；1998年1月23 日公开的WO99/37772；1998年3月20日公开的WO99/37773；2000年 1月26日公开的EP0974600；2000年3月9日公开的WO00/12555；1997 年10月31日公开的日本专利申请JP111399/94；1998年2月8日公 开的以色列专利申请IL121554AO；这些专利文献在此为了任何目的引 作参考。
在一些实施方案中，抗OPGL抗体可以与至少一种用于炎症的治 疗剂一起施用。在一些实施方案中，抗OPGL抗体可以与至少一种用 于免疫疾病的治疗剂一起施用。用于炎症和免疫疾病的举例的治疗剂 包括但不限于皮质类固醇，包括但不限于，泼尼松龙；非甾族抗炎药 物(NSAIDs)，包括但不限于，环加氧酶1型(COX-1)和环加氧酶2 型(COX-2)抑制剂；疾病修饰抗风湿药物(DMARDs)，包括但不限于， 甲氨蝶呤，羟基氯奎，氯奎，环孢菌素，金化合物(例如醋硫葡金， 金硫丁二酸盐，和葡糖硫金)，来氟米特；IV型磷酸二酯酶抑制剂， 包括但不限于，环戊苯吡酮和己酮可可碱；他克莫司(FK-506)；西 罗莫司(瑞帕霉素)；霉酚酸；5-脂肪氧化酶抑制剂，包括但不限于， 弃白通；白介素-6(IL-6)调节剂；38kDa促细胞分裂剂激活蛋白激 酶的小分子调节剂(p38-MAPK)；炎症途径中涉及的胞内分子的小分 子调节剂，其中这样的胞内分子包括但不限于，jnk，IKK，NF-Kb， ZAP70，和1ck。用于炎症的一些举例的治疗剂描述于，例如， C.A.Dinarello和L.L.Moldawer  Proinflammatory and Anti- Inflammatory Cytokines in Rheumatoid Arthritis：A Primer for Clinicians第三版(2001)Amgen Inc.Thousand Oaks，CA。用 于炎症和自身免疫疾病的举例的治疗剂，包括但不限于，干扰素-γ (IFN-γ)调节剂；OX40/OX40L的调节剂(包括可溶形式的OX40)；4 -1BB/4-1BB配体的调节剂(包括可溶形式的4-1BB)；和B细胞 -T细胞共同刺激途径的调节剂，包括但不限于，受体配体对CD28/B7， CD40/CD40L，ICOS/B7RP1，和AGP-3/TACI/BAFFR(AGP-3结合TACI和 BAFFR受体两者)的调节剂。一些举例的B细胞-T细胞共同刺激途 径的调节剂，包括但不限于，CD28，B7.1和B7.2(包括可溶形式的B7.1 或B7.2和可溶形式的CTLA4，这两者可以融合成异源肽或蛋白质，它 减少或防止降解和/或延长半衰期，降低毒性，降低免疫原性，或通 过提高溶解度或循环半衰期提高治疗性蛋白质的生物活性)；CD40和 CD40L的抑制剂(包括可以与异源肽或蛋白质融合的可溶形式的 CD40)；ICOS和B7RP1的抑制剂(包括可以与异源肽或蛋白质融合的 可溶形式的ICOS)和AGP-3，TACI和BAFFR的抑制剂(包括可溶形式 的TACI和BAFFR)。ICOS，B7RP1及其抑制剂描述于，例如，WO00/46240。 AGP-3，TACI和BAFFR及其抑制剂描述于，例如，WO00/47740， WO01/85872，WO02/15273，WO98/39361，和Bulow和Bram(1997) Science278：138-140。
在一些实施方案中，抗OPGL抗体被用来治疗骨损失，包括但不 限于，恶性或转移肿瘤引起的骨的溶骨性破坏产生的骨损失。在一些 实施方案中，抗OPGL抗体可以被用来治疗与癌症相关的骨损失。举 例的癌症包括但不限于乳房癌，前列腺癌，甲状腺癌，肾癌，肺癌， 食道癌，直肠癌，膀胱癌，子宫颈癌，卵巢癌和肝癌，以及胃肠道癌。 在一些实施方案中，抗OPGL抗体可以被用来治疗与例如一些血液恶 病变相关的骨损失，包括但不限于，多发性骨髓瘤和淋巴瘤，包括何 杰金氏病。
在一些实施方案中，单独施用抗OPGL抗体。在一些实施方案中， 抗OPGL抗体与至少一种其他治疗剂一起施用，包括但不限于，至少 一种其他癌症治疗剂。举例的癌症治疗剂包括但不限于放疗和化疗。 在一些实施方案中，化疗可以包括用一种或几种下面的药物治疗：蒽 环霉素，紫杉醇，他莫西芬，阿霉素，5-氟尿嘧啶，和本领域公知的 其他药物。在一些实施方案中，癌症治疗剂是黄体激素释放激素 (LHRH)拮抗剂。在一些实施方案中，LHRH拮抗剂是肽拮抗剂。
在一些实施方案中，LHRH拮抗剂包括肽：Ac-D-Nal-4-Cl-Phe-D- Pal-Ser-N-Me-Tyr-D-Asn-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2(SEQ ID NO： 20)，其中Nal是3-(2-萘基)丙氨酰基；4-Cl-Phe是(4’-氯苯基) 丙氨酰基；Pal是3-(3’-吡啶基)丙氨酰基；和Lys(iPr)是N-ε-2- 丙基-赖氨酰基。
在一些实施方案中，LHRH拮抗剂是LHRH拮抗剂十肽。一些举例 的十肽描述于，例如，美国专利No.5843901，这里为了任何目的引作 参考。
根据一些实施方案举例的治疗抗体包括但不限于小鼠，小鼠-人 嵌合，CDR-嫁接，人源化和完全的人抗体，和合成抗体，包括但不限 于，通过筛选抗体库选择的那些。举例的抗体包括但不限于，与肿瘤 细胞上存在的细胞表面蛋白质Her2，CDC20，CDC33，粘蛋白样糖蛋白， 和表皮生长因子受体(EGFR)结合，并且任选地诱导对展示这些蛋白 质的肿瘤细胞的细胞抑制和/或细胞毒性作用。举例的抗体还包括 HERCEPTINTM(司徒曼布)，其可以被用来治疗乳房癌和其他形式的癌， 和RITUXANTM(利妥希玛)，ZEVALINTM(ibritumomab tiuxetan)，和 LYMPHOCIDETM(epratuzumab)，其可以被用来治疗非何杰金氏淋巴瘤 和其他形式的癌症。一些举例的抗体还包括ERBITUXTM(IMC-C225)， BEXXARTM(I131tositumomab)，和Campath。
在一些实施方案中，癌症治疗剂是选择性诱导肿瘤细胞编程性细 胞死亡的多肽，包括但不限于，TNF-相关多肽TRAIL。在一些实施方 案中，在至少一种癌症治疗剂治疗之前，同时和可以顺序施用抗OPGL 抗体。在一些实施方案中，可以预防性施用抗OPGL抗体，以便防止 或减轻转移癌引起的骨损失。在一些实施方案中，可以施用抗OPGL 抗体治疗由于转移而存在的骨损失状况。
在一些实施方案中，抗OPGL抗体可以被用来防止和/或治疗与 多发性骨髓瘤相关的骨损失和/或防止和/或治疗疾病本身。多发性 骨髓瘤是B细胞产生的肿瘤，它可以导致显著发病率和/或死亡率。 在一些实施方案中，多发性骨髓瘤的临床表现是局灶性骨损失，它可 能是由于局部区域提高的破骨细胞激活作用。通过放射性分析，很多 骨髓瘤患者存在骨病变并且有骨骼疼痛。在一些情况下，骨髓瘤患者 易病理性骨折，可能是自发发生的或由于损伤。在一些情况下，骨髓 瘤期间发生的骨骼病变不只是导致骨折，而且还畸形，偶尔神经压迫， 特别是在棘突中。在一些患者中，发生血清钙病理性增加(高血钙)， 在疾病治疗中引起显著问题。在一些实施方案中，可以对患者施用抗 OPGL抗体来减少或阻断骨再吸收和钙释放，这可以降低骨折和脊柱畸 形的危险。
在一些情况下，骨髓瘤细胞不直接参予骨破坏，取而代之的是产 生胞外信号，它导致破骨细胞分化和激活。在一些情况下，破骨细 胞产生高水平的细胞因子IL-6，特别是当它们变得被活化时。IL-6 是B细胞生长因子，并且是鼠和人骨髓瘤细胞体外生长的原因。骨 髓瘤细胞还直接或间接产生OPGL，它可以导致骨髓腔中包埋的骨髓 瘤细胞周围局部骨溶解。在一些情况下，紧邻骨髓瘤细胞的正常破 骨细胞接着产生IL-6，其可以导致肿瘤细胞的局部扩充。骨髓瘤细 胞以克隆方式扩充并且占据骨腔，所述骨腔是由于不适当的骨再吸 收产生的。
已经观察到，对啮齿动物施用OPG诱导破骨细胞群的快速死亡(参 见，例如Lacey等(2000)Am.J.Pathol.157：435-448)。破骨细胞 数目的减少阻碍那些细胞对增加的IL-6产生的作用，并且因此影响 骨小梁中骨髓瘤细胞的生长和存活。因此，在一些实施方案中，对骨 髓瘤患者施用抗OPGL抗体不只是阻断骨的高度再吸收，而且还影响 肿瘤本身的扩大和存活。
B-细胞表达OPGL的受体，ODAR。骨髓瘤细胞也表达ODAR，另外 可以产生OPGL。在一些情况下，OPGL和ODAR两者在相同的细胞种群 中表达可以产生影响骨髓瘤细胞存活的自分泌刺激。因此，在一些实 施方案中，施用抗OPGL抗体可以降低肿瘤细胞存活率，从而减小或 消除骨髓瘤患者的肿瘤负担。
在一些实施方案中，本发明提供含有治疗有效量的抗OPGL抗体 和药学可接受稀释剂，载体，增溶剂，乳化剂，防腐剂和/或佐剂的 药物组合物。
在一些实施方案中，本发明提供含有治疗有效量的抗OPGL抗体 和治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，和药学可接受稀释剂，载体， 增溶剂，乳化剂，防腐剂和/或佐剂的药物组合物。在一些实施方案 中，所述至少一种另外的治疗剂选自：骨形态发生因子，转化生长因 子-β(TGF-β)，白介素-1(IL-1)抑制剂，包括但不限于IL-1ra及 其衍生物和KineretTM；TNFα抑制剂，包括但不限于可溶性TNFα受体， EnbrelTM，抗-TNFα抗体，RemicadeTM，和D2E7抗体；甲状旁腺素及 其类似物；甲状旁腺素相关蛋白及其类似物；E系列前列腺素；双磷 酸盐(例如阿仑特罗和其他)；骨增强矿物例如氟化物和钙；非甾族 抗炎药物(NSAIDs)，包括但不限于COX-2抑制剂，例如CelebrexTM和 VioxxTM；免疫抑制剂，例如甲氨蝶呤或来氟米特，丝氨酸蛋白酶抑制 剂，包括但不限于分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(sLPI)；IL-6抑制剂 (包括但不限于抗IL-6抗体)，IL-8抑制剂(包括但不限于抗IL-8 抗体)，IL-18抑制剂(包括但不限于IL-18结合蛋白和抗IL-18抗体)， 白介素-1转化酶(ICE)调节剂；成纤维细胞生长因子FGF-1至FGF- 10和FGF调节剂；PAF拮抗剂；角质形成细胞生长因子(KGF)，KGF- 相关分子，和KGF调节剂；基质金属蛋白酶(MMP)调节剂；一氧化 氮合酶(NOS)调节剂，包括但不限于，诱导型NOS的调节剂；糖皮 质激素受体调节剂；谷氨酸受体调节剂；脂多糖(LPS)水平调节剂； 和去甲肾上腺素和调节剂及其模拟物。
在一些实施方案中，可接受的配方材料优选是使用的剂量和浓度 对接受者没有毒性。
在一些实施方案中，所述药物组合物可以含有用于改变，保持或 保留例如pH，渗透压，粘度，澄清度，颜色，等张性，气味，无菌， 稳定性，溶解或释放速度，组合物的吸收或渗透的配方材料。在一 些实施方案中，合适的配方材料包括但不限于，氨基酸(例如甘氨 酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，精氨酸或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化 剂(例如抗坏血酸，亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲液(例如硼酸盐， 碳酸氢盐，Tris-HCl，柠檬酸盐，磷酸盐或其他有机酸)；填充剂(例 如甘露糖醇或甘氨酸)；螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合 剂(例如咖啡因，聚乙烯吡咯烷酮，β-环糊精或羟丙基-β-环糊 精)；填料；单糖；二糖；和其他碳水化合物(例如葡萄糖，甘露糖 或糊精)；蛋白质(例如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白)；着色剂， 矫味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)； 低分子量多肽；成盐抗衡离子(例如钠)；防腐剂(例如苯扎氯铵， 苯甲酸，水杨酸，硫汞撒，苯乙醇，羟苯甲酸甲酯，羟苯甲酸丙酯， 氯己定，山梨酸或过氧化氢)；溶剂(例如甘油，丙二醇或聚乙二醇)； 糖醇(例如甘露糖醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或湿润剂(例 如普流罗尼类，PEG，脱水山梨糖醇酯，polysorbates，如polysorbate 20，polysorbate 80，triton，tromethamine，卵磷脂，胆甾醇，四 丁酚醛)，稳定增强剂(例如蔗糖或山梨糖醇)；张力增强剂(例如 碱金属卤化物，优选氯化钠或氯化钾，甘露糖醇，山梨糖醇)；送递 赋形剂；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂(Remington’s Pharmaceutical Science，18版，A.R.Gennaro编著，Mack Publish Company(1990))。
在一些实施方案中，抗OPGL抗体和/或治疗分子与本领域公知 的半衰期延长赋形剂连接。这样的赋形剂包括但不限于Fc结构域， 聚乙二醇和葡聚糖。这样的赋形剂描述于，例如，美国申请登记号No.09 /428082和公开的PCT申请No.WO99/25044，这里为了任何目的引作 参考。
在一些实施方案中，本领域技术人员根据，例如，想要的给药途 径，送递方式和期望的剂量，来确定优化的药物组合物。例如，参见， Remington’s Pharmaceutical Science，上文。在一些实施方案中， 这样的组合物可以影响本发明的抗体的物理状态，稳定性，体内释放 速度和体内清除速度。
在一些实施方案中，药物组合物中的主要赋形剂或载体性质上可 以是含水或不含水的。例如，在一些实施方案中，合适的赋形剂或载 体可以是注射用水，生理盐水或人工脑脊液，可能补充有肠胃外施用 组合物中常用的其他材料。在一些实施方案中，中性缓冲盐水或与血 清白蛋白混合的盐水是其他举例的赋形剂。在一些实施方案中，药物 组合物含有大约pH7.0-8.5的Tris缓冲液，或大约pH4.0-5.5的乙酸 盐缓冲液，其可以进一步含有山梨糖醇或其合适的取代物。在一些实 施方案中，含有抗OPGL抗体，有或没有至少一种另外的治疗剂的组 合物，可以通过将具有期望程度纯度的选择的组合物与任选的配方试 剂混合来制备用于贮存(Remington’s Pharmaceutical Science， 上文)，其是冻干饼或水溶液形式。此外，在一些实施方案中，使用 合适的赋形剂例如蔗糖，可以将含有抗OPGL抗体，有或没有至少一 种另外的治疗剂的组合物配制成冻干物。
在一些实施方案中，可以选择本发明的药物组合物用于肠胃外给 药。在一些实施方案中，可以选择药物组合物用于吸入或者通过消 化道例如口服送递。这样的药学可接受组合物的制备是本领域公知 的。
在一些实施方案中，配方成分以给药点可接受的浓度存在。在一 些实施方案中，使用缓冲液将组合物保持在生理pH或稍微较低的pH， 一般在大约5至大约8的pH范围。
在一些实施方案中，当涉及肠胃外给药时，治疗组合物可以是药 学可接受赋形剂中无热原的，肠胃外可接受的，含有期望的抗OPGL 抗体，有或没有另外的治疗剂的水溶液形式。在一些实施方案中，用 于肠胃外注射的赋形剂是无菌蒸馏水，其中将有或没有至少一种另外 的治疗剂的抗OPGL抗体配制成无菌等张溶液，适当保存。在一些实 施方案中，制备涉及配制期望的分子和试剂，例如可注射微球，可生 物降解的颗粒，聚合化合物(例如聚乳酸或聚乙醇酸)，珠或脂质体， 它可以提供产品的可控或持续释放，然后通过延效型注射送递。在一 些实施方案中，也可以使用透明质酸，有在循环中促进保持的作用。 在一些实施方案中，可以使用可植入的药物送递装置引入期望的分 子。
在一些实施方案中，药物组合物可以配制成用于吸入的制剂。在 一些实施方案中，可以将有或没有至少一种另外的治疗剂的抗OPGL 抗体配制成用于吸入的干燥粉末。在一些实施方案中，也可以用用于 气溶胶送递的推进剂配制含有有或没有至少一种另外的治疗剂的抗 OPGL抗体的吸入用溶液。在一些实施方案中，溶液可以喷雾。肺部给 药进一步描述于PCT申请No.PCT/US94/001875，它描述了化学修饰蛋 白质的肺部递送。
在一些实施方案中，涉及可以口服给药的制剂。在一些实施方案 中，可以用固体剂型例如片剂和胶囊的复合中常规使用的那些载体或 者不用那些载体，可以配制以这种方式给药的有或没有至少一种另外 的治疗剂的抗OPGL抗体。在一些实施方案中，可以设计当生物利用 率最大并且预先全身性降解最小的消化道中的点释放制剂的活性部分 的胶囊。在一些实施方案中，可以含有至少一种另外的试剂以有利于 抗OPGL抗体和/或任何另外的治疗剂的吸收。在一些实施方案中， 还可以使用稀释剂，矫味剂，低熔点蜡，植物油，润滑剂，悬浮剂， 片剂崩解剂和粘合剂。
在一些实施方案中，药物组合物在适合片剂制备的无毒性赋形剂 混合物中可以含有有效量的抗OPGL抗体，有或没有至少一种另外的 治疗剂。在一些实施方案中，通过将片剂溶解于无菌水中，或其他合 适的赋形剂中，可以制备单剂型的溶液。在一些实施方案中，合适的 赋形剂包括但不限于惰性稀释剂，例如碳酸钙，碳酸钠或碳酸氢钠， 乳糖，或磷酸钙；或粘合剂，例如淀粉，明胶，或阿拉伯胶；或润滑 剂，例如硬脂酸镁，硬脂酸或滑石。
另外的药物组合物对于本领域技术人员是明显的，包括涉及持续 或控制释放送递配方中含有抗OPGL抗体，有或没有至少一种另外的 治疗剂的制剂。在一些实施方案中，各种各样的其他持续或控制释放 送递方式的配制技术，例如脂质体载体，可生物降解微颗粒或多孔珠 和延效型注射剂，是本领域技术人员公知的。参见，例如，PCT申请 No.PCT/US93/00829，它描述了用于送递药物组合物的多孔聚合物微颗 粒的控制释放。在一些实施方案中，持续释放制剂可以含有有形产物 形式的半渗透性聚合物基质，例如膜，或微胶囊。持续释放的基质可 以包括聚酯，水凝胶，聚交酯(US3773919和EP058481)，L-谷氨酸和 γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等，Biopolymers，22：547 -556(1983))，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等， J.Biomed.Mater.Res.15：167-277(1981)和Langer，Chem.Tech.， 12：98-105(1982))，乙酸亚乙基乙烯酯(Langer等，上文)或聚- D(-)-3-羟基丁酸(EP133988)。在一些实施方案中，持续释放的组 合物还可以包括脂质体，它可以通过本领域公知的几种方法制备。参 见，例如Eppstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：3688-3692 (1985)；EP036676；EP088046和EP143949。
一般体内施用的药物组合物是无菌的。在一些实施方案中，可以 通过经无菌过滤膜过滤来实现。在一些实施方案中，在组合物被冻干 的情况下，可以在冻干和重新配置之前或之后利用该方法灭菌。在一 些实施方案中，肠胃外给药的组合物可以以冻干形式或溶液贮存。在 一些实施方案中，一般将肠胃外组合物放到有灭菌出口的容器中，例 如有皮下注射针头可穿孔的盖的静脉内溶液袋或小瓶。
在一些实施方案中，一旦配制了药物组合物，它可以作为溶液， 混悬液，凝胶，乳状液，固体保存在无菌小瓶中，或者作为脱水或 冻干的粉末剂保存在无菌小瓶中。在一些实施方案中，这样的制剂 可以以即用形式或者以给药之前重新配制的形式(例如冻干的)贮 存。
在一些实施方案中，本发明涉及制备单剂量给药单位的试剂盒。 在一些实施方案中，每个试剂盒可以包括盛有干燥蛋白质的第一容 器和盛有含水配方的第二容器。在本发明的一些实施方案中，包括 包含单腔或多腔预填充注射器(例如液体注射器和溶解注射器)的 试剂盒。
在一些实施方案中，治疗上要使用的含有有或没有至少一种另外 的治疗剂的抗OPGL抗体的药物组合物的有效量取决于，例如，治疗 内容和主体。本领域技术人员明白根据一些实施方案，治疗的适当剂 量水平因此部分地根据送递的分子，使用有或没有至少一种另外的治 疗剂的抗OPGL抗体的适应症，给药途径，和患者尺寸(体重，体表 面积或器官大小)和/或状况(年龄和一般健康状况)而不同。在一 些实施方案中，医师可以调整剂量和改变给药途径，以获得最佳治疗 效果。在一些实施方案中，根据上面提到的因素，一般剂量范围可以 是大约0.1微克/千克至最多大约10毫克/千克或更多。在一些实施 方案中，剂量可以是0.1微克/千克至最多大约100毫克/千克；或者 1微克/千克至最多大约100毫克/千克；或者5微克/千克至最多大约 100毫克/千克。
在一些实施方案中，给药频率要考虑使用的制剂中抗OPGL抗体 和/或任何另外的治疗剂的药物动力学参数。在一些实施方案中，医 师施用组合物，直到达到实现期望的效果的剂量。在一些实施方案中， 因此可以以单一剂量，或随时间作为两个或多个剂量给药(其可以含 有或不含有相同量的期望的分子)，或者作为通过植入装置或导管连 续输注来施用组合物。本领域技术人员按常规确定精确的合适的剂 量，并且这是平常他们完成的常规任务。在一些实施方案中，通过应 用合适的剂量反应数据可以确定合适的剂量。
在一些实施方案中，药物组合物的给药途径是公知的方法，例如， 口服，静脉内注射，腹膜内，脑内(实质内)，脑室内，肌内，眼内， 动脉内，肝门内，或病变内途径；通过持续释放系统或者通过植入装 置。在一些实施方案中，可以通过浓注或连续输液或者通过植入装置 施用组合物。
在一些实施方案中，通过植入其上吸附期望的分子或者将期望的 分子制成胶囊的膜，海绵状物或者其它合适的材料可以局部施用组合 物。在一些实施方案中，施用植入装置的情况下，可以将装置植入任 何合适的组织或器官，期望的分子的送递可以通过扩散，随时间释放 药团，或连续给药。
在一些实施方案中，期望以离体的方式使用含有抗OPGL抗体， 有或没有至少一种另外的治疗剂的药物组合物。在这样的情况下，取 自患者的细胞，组织和/或器官接触含有抗OPGL抗体，有或没有至少 一种另外的治疗剂的药物组合物，然后接着将这些细胞，组织和/或 器官植回患者。
在一些实施方案中，通过使用这里描述的方法植入经基因工程处 理的细胞来表达和分泌多肽，能送递抗OPGL抗体和/或任何另外的治 疗剂。在一些实施方案中，这样的细胞可以是动物细胞或人细胞，并 且可以是自体的，异源的，或异种的。在一些实施方案中，细胞可以 无限繁殖。在一些实施方案中，为了减少免疫应答机会，可以将细胞 制成胶囊以避免周围组织浸润。在一些实施方案中，胶囊材料一般是 生物相容的半渗透性聚合物外壳或膜，它使得蛋白质产物释放，但是 阻止患者免疫系统或者来自周围组织的其它有害因子破坏细胞。
实施例
提供下面的实施例，包括实施的实验和获得的结果，只是详细说 明的目的，而不是要限制本发明。
                      实施例1
             αOPGL-1重链和轻链的克隆
使用表达全长人OPGL cDNA的CHO细胞免疫包含人免疫球蛋白基 因的转基因小鼠。来自免疫小鼠的淋巴结与鼠骨髓瘤细胞融合产生杂 交瘤。在ELISA分析中对杂交瘤细胞系上清液测定与人OPGL反应的 抗体。发现抗-OPGL表达杂交瘤细胞系AMG6.5，AMG6.4，和AMG6.1表 达对OPGL有高亲和性的抗体(Kd分别是0.28nM，0.29nM，和0.23nM)， 选择AMG6.5进行克隆。来自AMG6.5和AMG6.4的重链和轻链cDNA克 隆是相同的，使用AMG6.5克隆αOPGL-1轻链cDNA，同时使用AMG6.4 克隆αOPGL-1重链cDNA。
αOPGL-1轻链的克隆
利用PCR扩增方法，从由AMG6.5总RNA制备的第一cDNA链获得 αOPGL-1κ轻链可变区。使用带有延伸的5’-接头(5’- GGCCGGATAGGCCTCACNNNNNNT-3’(SEQ ID NO：15))的随机引物，和Gibco SuperScript IITM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis试剂盒(cat.no.18089-011)提供的材料和方法，从AMG6.5 总RNA制备第一cDNA链。下面的寡核苷酸用于PCR：
5′κ  RACE引物：
5′-GAT GAC CCA GTC TCC AGC CAC CCT G-3′(SEQ ID NO：5)
3′κ  RACE引物：
5′-AAG GGT CAG AGG CCA AAG GAT GG-3′(SEQ ID NO：6)
将扩增的DNAs克隆到pCRII-TOPO(Invitrogen)中并且对得到 的质粒测序。使用κ链共有序列设计全长αOPGL-1κ链PCR扩增用的 引物。5’αOPGL-1κ引物在起始Met密码子之前插入用于克隆的Xbal 位点(TCTAGA)和“CCACC”Kozak序列。3’αOPGL-1κ引物在终止密 码子后面插入Sa/I位点用于克隆。
5′αOPGL-1 к 引物：
5′-CAA C TC TAG ACC ACC ATG GAA ACC CCA GCG-3′(SEQ ID NO：7)
         Xbal 位点 Kozak M   E   T   P   A(SEQ ID NO：16)
3′αOPGL-1  κ    引物：
5′-TTT GAC  GTC GAC TTA TCA ACA CTC TCC CCT GTT GAA G-3′(SEQ ID NO：8)
            Sa/l 位点*   *   C   E   G   R   N   F(SEQ ID NO：17)
使用如上所述的AMG6.5第一cDNA链，通过使用5’或3’ αOPGL-1κ引物的PCR扩增，获得全长αOPGL-1κ链cDNA克隆。PCR反 应产生编码αOPGL-1κ链的235个氨基酸残基(包括20氨基酸κ链信 号序列)的738bp片段(图4，SEQ ID NO：4)。使用QlAquick PCR纯 化试剂盒(Qiagen cat.no.28104)纯化之后，使用该片段构建κ轻 链表达载体。
用Xbal和SalI酶切上面产生的738bp全长κ片段，使用Promega Wizard DNA Clean-Up系统(Promega cat.no.A7100)纯化，并且克 隆到pDSRα19中产生质粒αOPGL-1-κ/pDSRα19(图5)。先前有人描 述过pDSRα19(参见WO90/14363，这里为了任何目的引作参考(参见， 例如，图12))。简要地说，为了制备pDSRα19，用下面的方法修饰 pDSRα2：将FSH polyA从大约1400个碱基对缩短到885个碱基对， 现在末端在Ndel位点；二氢叶酸还原酶(DHFR)启动子现在含有209 个碱基对，从5’端缩短粒大约1kb；从DHFR polyA序列缺失大约550 个碱基对的Bg111片段。
对αOPGL-1κ轻链表达克隆测序，确认它编码AMG6.5杂交瘤中鉴 定的相同的肽。最终的表达载体αOPGL-1-κ/pDSRα19为5476bp并 且包含表2所示的7个功能区。
             表2：αOPGL-1-κ/pDSRα19的特征
质粒碱基对数
2-881
来自牛垂体糖蛋白激素的α-亚基(α-FSH)的转录终止/多 腺苷酸化信号(Goodwin等，Nucleic Acids Res.1983 11：6873-82； Genbank登记号X00004)
882-2027
包含内源小鼠DHFR启动子，cDNA编码序列，和DHFR转录终止/ 多腺苷酸化信号的小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)小基因(Gasser等， Proc Natl Acad Sci USA1982 79：6522-6；Nunberg等，Cell 1980 19： 355-64；Setzer等，J Biol Chem.1982 257：5143-7；McGrogan等， J Biol Chem.1985 260：2307-14)
2031-3947
包含氨苄西林抗性标记基因和质粒在大肠杆菌中复制的起点的 pBR322序列(Genbank登记号J01749)
3949-4292
SV40早期启动子，增强子和复制起点(Takebe等，Mol Cell Biol 1988 8：466-72，Genbank登记号J02400)
4299-4565
来自HTLV-1 LTR结构域的翻译增强子元件(Seiki等，Proc Natl Acad Sci USA 1983 80：3618-22，Genbank登记号J02029)
4574-4730
来自SV40 16S的内含子，19S剪接供体/受体信号(Okayama和 Berg，Mol Cell Biol 1983 3：280-9，Genbank登记号J02400)
4750-5476
Xbal和Sa/I位点之间的αOPGL-1κ轻链cDNA。
图5所示载体的环形质粒图。
αOPGL-1重链的克隆
从用Clontech MarathonTM cDNA扩增试剂盒(cat no.K1802-1) 制备的AMG6.4杂交瘤双链cDNA克隆αOPGL-1 IgG2重链。通过使 用人种系IgG2重链恒定区特异性引物(下文所示)和RACE引物和 MarathonTMcDNA扩增试剂盒中提供的其他材料和方法实施的cDNA末 端5’和3’快速扩增(RACE)技术实现AMG6.4重链cDNA的扩增。
5′IgG2 RACE引物
5′-GGC ACG GTC ACC ACG CTG CTG AG-3′(SEQ ID NO：91
3′IgG2 RACE  引物
5′-CCT CCA CCA AGG GCC CAT CGG TCT-3′(SEQ ID NO：10)
将600bp 5’RACE产物和1200bp 3’RACE产物克隆到pCR2.1 (Invitrogen)中并且测序。该序列信息被用来设计用于克隆全长序 列的αOPGL-1重链特异性引物。重链5’引物(5’αOPGL-1 Ig G2引 物)针对有义链并且在天然起始位点前有HindIII位点和共有Kozak 序列。重链3’引物(3’αOPGL-1 Ig G2引物)是反义引物，并且在 重链Ig G2序列的最后一个氨基酸之后包含SalI位点和终止密码 子。
5′αOPGL-1 IgG2引物：
5′-CAG AAGCTTGA   ATG GAG TTT GGG CTG AGC TGG CTT TTT CTT GTG GC-3′
                                      (SEQ ID NO：11
HindIII    Kozak  M  E  F  G  L  S  W  L  F  L  V  A
                                      (SEQ ID NO：18)
3′αOPGL-1 IgG2引物：
5′-GCA T GTCGAC TTA TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA GAG-3′(SEQ ID NO：12)
         Sa/I    *    *  K  G    P   S   L   S   L     (SEQ ID NO：19)
通过使用5’-和3’-αOPGL-1  Ig G2引物进行PCR扩增，使用上 述双链cDNA产生全长重链cDNA。PCR产生编码αOPGL-1  Ig G2重链 蛋白质的467个氨基酸残基(包括19个氨基酸IgG信号序列)的1433bp 片段(图2，SEQ ID NO：2)。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen cat no.28104)纯化之后，使用该片段如下构建重链表达载体。
使用HindIII和SalI酶切上述产生的编码全长Ig G2重链片段 的DNA，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen  cat no．28704) 纯化，并且将该片段克隆到pDSRα19中。得到的表达质粒称作αOPGL-1- IgG2/pDSRα19(图6)。所有的载体成分与上述αOPGL-1-κ/pDSRα19 载体相同，除了在Xbal和SalI位点之间αOPGL-1-IgG2重链cDNA 置换αOPGL-1κ轻链cDNA。对αOPGL-1-IgG2重链表达克隆测序，证 实它编码AMG6.4杂交瘤中鉴定的相同的多肽。
                      实施例2
              在CHO细胞中的αOPGL-1表达
通过将αOPGL-1-κ/pDSRα19和αOPGL-1-IgG2/pDSRα19共转 染到二氢叶酸还原酶缺陷(DHFR-)中国仓鼠卵巢细胞(CHO AM-1/ D，美国专利No.6210924)接着分离并分析各个克隆来实现αOPGL-1 抗体的稳定表达。
在转染之前的这天(第0天)，用生长在CHO d-培养基(DMEM- 高葡萄糖，10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素/谷氨酰胺，1X丙酮 酸钠，1％非必须氨基酸(NEAA))(Gibco)和1％h t补充物 (Gibco))中的1.5×106AM-1/D细胞在100mm组织培养皿中铺板。 第一天，将400微升无血清RPMI1640培养基(Gibco)等分到12×75 mm聚丙烯试管中。向培养基滴加24微升TranslT-LT1试剂(Mirus Corporation)并且将混合物在室温下温育10分钟。然后向混合物滴 加总共15微克线性质粒DNA(7.5微克的αOPGL-1-κ/pDSRα19和7.5 微克的αOPGL-1-IgG2/pDSRα19，用Pvul消化)，在室温下温育10 分钟。
从细胞去除CHO d-培养基，用10毫升Dulbecco’s磷酸缓冲 盐水(Gibco)洗涤。向细胞加入6毫升补加有HT，L-glu，NEAA 和丙酮酸钠(Gibco)的无血清MEM培养基。向板滴加DNA/LT1复 合体，小心来回摇晃，使DNA平均分给细胞。在组织培养箱中培养6 小时之后，用新鲜CHO d-培养基替换培养基。48小时之后，将细 胞分给10个CHO选择培养基(DMEM-高葡萄糖，10％透析过的胎牛 血清，1％青霉素/链霉素/谷氨酰胺，1％非必须氨基酸和1X丙酮 酸钠)(Gibco)中的100mm培养皿。每周更换两次培养基直到菌 落出现。
10-14天之后，使用1x胰蛋白酶-EDTA(Gibco)中浸泡的5 mm克隆皿(Labcore)挑选菌落，并且在24孔组织培养板中用CHO 选择培养基培养。当细胞开始汇合之后，加入无血清培养基(CHO选 择培养基，FBS阴性)，然后在48小时之后收集。通过用辣根过氧化 物酶(HRP)-偶联的山羊抗-人IgG Fc抗体(Pierce，Rockford， IL)进行蛋白质印迹对这些条件培养基分析抗体表达，来测定αOPGL- 1重链，和用山羊抗-人κ链抗体抗体(Pierce，Rockford，IL)接 着用HRP-偶联的兔抗-山羊IgG(H+L抗体)(Pierce，Rockford，IL) 来测定αOPGL-1轻链。使最高表达克隆扩展并且在液氮中保存。
                       实施例3
                    αOPGL-1的制备
细胞系125Q的制备和产生
通过在96孔板中在无血清条件下的两轮限制稀释克隆产生 αOPGL-1的CHO细胞。以各种悬浮容器中生产和生长特征为基础选择 克隆。进行EIA来选择产生最高水平αOPGL-1的克隆。然后通过让克 隆在100毫升，250毫升，500毫升，1升和3升旋转瓶以及在3升Aplkon 生物反应器中生长来测定生长特征，包括倍增时间和密度。选择在培 养中以最快倍增时间达到最高密度的克隆，并且标记为细胞系125Q。 当克隆扩展得到足够细胞以大约1×107细胞/毫升冷冻360安瓿时， 将细胞重新悬浮于冷藏的无血清培养基(补加有10毫升/升非必须 氨基酸和10毫升/升L-谷氨酰胺(Gibco/LTI/Invitrogen)，和10％ 二甲亚砜(JT Baker)的90％VM-Soy Batch培养基(详情参见表3)) 并且冷冻。在限制接近的设备中保存安瓿并且浸在液氮真空瓶中的液 氮中。
以小规模旋转器和较大规模生物反应器中的生长和生产为基础， 根据用于生产αOPGL-1的细胞系选择125Q细胞系。
细胞培养
通过在125Q细胞系中表达而制备αOPGL-1，125Q细胞系是从质 粒αOPGL-1-κ/pDSRα19和αOPGL-1-Ig G2/pDSRα19表达αOPGL-1 的CHO细胞的克隆细胞系。图19所示用于αOPGL-1的细胞培养方法。 对于每一轮制备，来自125Q细胞系小瓶的细胞最初在50毫升补加有 10毫升/升非必须氨基酸和10毫升/升L-谷氨酰胺 (Gibco/LTI/Invitrogen)(VM-Soy Supp)的VM-Soy Batch培养基 (成分参见表3)中在125毫升锥形摇瓶中以100rpm培养5天。 然后用全部培养物接种500毫升旋转烧瓶中的VM-Soy Supp达到3× 105活细胞/毫升(3E5vc/ml)，并且以70rpm旋转培养3-4 天。使用来自500毫升旋转烧瓶的全部培养物接种3L旋转烧瓶中的 VM-Soy Supp达到3E5vc/ml，并且以70rpm旋转培养3-4 天。
然后将3L旋转烧瓶中的培养物吸取到两个3L旋转烧瓶中，在没 有酚红的VM-Soy Supp中达到3E5vc/ml并且在相同的条件下培 养。然后用这些旋转烧瓶培养物接种另外四个旋转烧瓶，在没有酚红 的VM-Soy Supp中达到3E5vc/ml并且在相同的条件下培养。用 来自四个3L旋转烧瓶的四升培养物接种20L生物反应器中的10L没 有酚红的VM-Soy Supp，生物反应器以分批进料方式运行7-10天。 以分批进料方式，加入含有浓缩培养基的营养进料(“进料”在下面 的表3中所示)保持细胞生长和培养物存活。
然后用来自20L生物反应器的全部培养物接种150L生物反应器 中的70L没有酚红的VM-Soy Supp，生物反应器以分批进料方式运行 9-10天。最后，用来自150L生物反应器的全部培养物接种2000L生 物反应器中的大约880LVM-Soy(没有补充物或酚红)，生物反应器以 分批进料方式运行。测定分批进料方式过程中进料速度，使得每一个 生物反应器培养物中的葡萄糖水平保持在0.6g/L。每天测定细胞密度 和葡萄糖浓度并且相应调节进料速度。
2000L生物反应器中的生产持续大约两周，期间细胞组成型产生 αOPGL-1并且分泌到细胞培养基中。
设置pH，温度和溶解的氧含量来控制生产反应器：pH是7.0并 且通过二氧化碳气体和加入碳酸钠控制；溶解的氧是120毫米汞柱并 且通过空气，氮气和氧气流控制。在整个过程中细胞保持37℃。所有 的气体通过0.22微米或更小孔径的膜过滤器。
在制备结束时，将细胞培养液加给盘式堆积离心机并且从细胞分 离培养物上清液。通过Cuno 90SP深度过滤器接着0.2微米Posidyne 过滤器(Pall Co.)进一步澄清浓缩物。然后使用50kD NMWL膜 (Millipore Biomax50)通过切向流超滤(UF)浓缩澄清的条件培 养基。将条件培养基浓缩15至30倍。然后通过纯化或冷冻处理得到 的浓缩条件培养基(CCM)，用于后面的纯化。图19总结了生产方法。
细胞培养基
整个细胞培养过程中使用的细胞培养基以Dulbecco’s  Modified Eagle’s培养基/Ham’s营养F12(DMEM/F12，1∶1)为基础，并且含 有补充水平的氨基酸，另外的营养物和盐，大豆水解产物和重组人胰 岛素(NucellinZn，Eli Lilly)。表3列出成分，该培养基称作VM-Soy。 在使用之前通过0.2微米孔径膜过滤器将培养基溶液过滤。
                 表3  细胞培养基成分
                基本培养基和进料的成分      成分  VMSoy分批培养基(ml/L)   进料(mg/L)      成分 无机盐 CaCl2(无水) CuSO4.5H2O Fe(NO3)3.9H2O FeSO4.7H2O KCl MgCl2(无水) MgSO4(无水) NaCl       116.60       0.0026       0.1000       0.8340       311.80       57.2g0       97.680       905.990     233.2     0.0052     0.2     1.668     623.6     114.56     195.36     1811.98 NaH2PO4.H2O Na2HPO4 ZnSO4.7H2O 其它成分 D-葡萄糖 次黄嘌呤钠 亚油酸 硫辛酸 酚红 腐胺    .2HCl 丙酮酸钠 氨基酸 L-丙氨酸 L-精氨酸HCl L-天冬酰胺.H2O L-天冬氨酸 L-半胱氨酸.HCl.H2O L-胱氨酸.2HCl L-谷氨酸 L-谷氨酰胺 甘氨酸 L-组氨酸.HCl.H2O L-异亮氨酸 L-亮氨酸 L-赖氨酸HCl L-甲硫氨酸 L-苯丙氨酸 L-脯氨酸 L-丝氨酸 L-苏氨酸 L-色氨酸 L-酪氨酸.2Na.2H2O L-缬氨酸 维生素 生物素蛋白     125.00     142.040     0.8640     3151.00     5.40     0.090     0.2060     8.10     0.1620     110.00     26.70     295.00     45.00     39.90     35.120     62.580     44.10     657.00     52.50     62.950     108.940     118.10     182.50     34.480     70.960     57.50     73.50     106.90     18.040     111.580     105.70     0.0073     250     284.08     1.728     12302     10.8     0.18     0.412     16.2     0.324     220     53.4     590     90     79.8     70.24     125.16     88.2     1314     105     125.9     217.88     236.2     365     68.96     141.92     115     147     213.8     36.08     223.16     211.4     0.0146 D-泛酸钙 氯化胆碱 叶酸 i-肌醇 烟酰胺 吡哆醛 HCl 吡哆醇 HCl 维生素 B2 维生素 B1HCl 胸苷 维生素 B12 附加成分     4.480     17.960     5.30     25.20     4.040     4.00     0.0620     0.4380     4.340     0.3635     1.360     8.96     35.92     10.6     50.4     8.08     8     0.124     0.876     8.68     0.727     2.72 Nucellin Zn，(rhu胰岛素) 亚硒酸 乙醇胺 三碘甲腺原氨酸 氢化可的松 柠檬酸铁 Pluronic F-68 大豆水解物 NaHCO3 NaCl     5.00     0.0050     0.0012     0.000040     0.020     122.450     1000.00     6000.00     3000.00     3500.00     15     0.015     0.0037     0.00012     0.06     122.450     500     6000.00     3000.00
纯化方法
CHO细胞中表达的αOPGL-1分泌到胞外培养基中。可以应用一系 列步骤制备纯物质。该方法使用疏水性电荷诱导，阳离子交换，和疏 水性相互作用色谱法，以及低pH步骤和病毒过滤器。下面描述这些 方法。
A.疏水性电荷诱导色谱法(HCIC)
该色谱法步骤去除大多数宿主细胞蛋白质和DNA。浓缩条件培养 基(CCM)通过Cuno 30SP过滤器过滤后通过Cuno VR07带电荷 的纤维素基过滤器，然后加样到MEP HyperCel树脂上。加样之 后，柱子用平衡缓冲液(20mM Tris pH7.2)冲洗。使用低pH 缓冲液(20mM乙酸钠，pH5.0)从树脂洗脱抗体。从柱子上洗 脱时，以柱子流出物的280nm吸光度为基础收集产物。
B.病毒灭活
将MEP合并液滴定至pH3.7并且保持大约60分钟，将可能的污 染逆转录病毒灭活。保持步骤之后，将pH调节至大约6.0。
C.病毒过滤
调节了pH的合并液通过Millipore Viresolve NFR过滤器或等 同物过滤。抗体流过过滤器，而≥50nm的可能的污染病毒留下。
D.阳离子交换色谱法(CEX)
使用SP琼脂糖凝胶HP(AmershamPharmacia)或等同物通过阳离 子交换色谱法进一步纯化抗体。阳离子交换色谱法步骤去除另外 的CHO细胞蛋白质，DNA，低分子量蛋白质，和聚集形式的αOPGL-1。 将病毒过滤合并液加样到阳离子交换树脂上，加样之后，用平衡 缓冲液(20mM NaMES pH6.2)冲洗柱子。然后用递增盐线性梯 度(20mM NaMES pH6.2，0M NaCl至20mM NaMES pH6.2；0.3 M NaCl)洗脱抗体。从柱子上洗脱时，以柱子流出物的280nm 吸光度为基础收集产物。
E.疏水性相互作用色谱法(HIC)
使用Phenyl Toyopearl 650S(Tosoh Biosep)或等同物通过疏 水性相互作用色谱法进一步纯化抗体。疏水性相互作用色谱法被 用作精制步骤并且去除另外的CHO细胞蛋白质，DNA，低分子量 蛋白质，和聚集形式的αOPGL-1。在加样到柱子上之前通过加入 硫酸铵将阳离子交换合并液调节至15-25℃下电导率＞105 mS/cm。加样之后，用平衡缓冲液(1M磷酸钾，pH8)冲洗柱 子。然后用递减盐浓度的线性梯度(1M磷酸钾，0mM Tris pH8 至0M磷酸钾，20mM Tris pH8)洗脱抗体。从柱子上洗脱时， 以柱子流出物的280nm吸光度为基础收集产物。
F.浓缩和渗滤
通过使用50kD NMWL膜(Millipore Biomax 50)的切向流超滤 将HIC柱合并液浓缩并且渗滤到配制缓冲液中。配制缓冲液含有 10mM乙酸盐，5％山梨糖醇，pH5.2和30mg/mL的αOPGL-1。
最后过滤和贮存
纯化的产品通过0.2微米P\/DF过滤器(Millipore)，取样，并 且在大约-30℃安全冷冻库中储存。
                      实施例4
              αOPGL-1的结合特异性
如实施例1和2中讨论的用两个表达载体转染的CHO细胞中产生 的抗体可以在下面的实施例4，5，和6中使用。
人OPG结合并中和大鼠，小鼠和猕猴以及人中的OPGL。αOPGL-1以 高亲和性结合人OPGL，但是不显著与鼠OPGL结合(表4)。
表4：αOPGL-1对细胞膜表达的人，猕猴或小鼠序列的OPGL的亲 和性     OPGL物种     αOPGL-1     ED50(ng/ml)     人     16     猕猴     19     小鼠     没有特异性结合
这些物种的OPGL在CHO细胞中表达为全长的膜结合的蛋白质。 通过与αOPGL-1和FITC-标记的抗人IgG2二抗温育的细胞的FACS分 析来评价αOPGL-1与细胞表面表达的OPGL的结合。αOPGL-1结合人 和猕猴OPGL，但是不特异性结合小鼠OPGL。
另外，据报道，人OPG表现出与肿瘤坏死因子相关编程性细胞死 亡诱导配体(TRAIL)弱的结合(Truneh等，2000)，该配体是TNF家 族相关成员，它表现出与OPGL的DNA和氨基酸序列同源性(Lacey等， 1998)。但是，检测不到OPG与其他TNF-相关蛋白质例如TNFα，TNFβ， 或CD40配体结合。
EIA板上αOPGL-1特异性结合OPGL(图7)。室温下重组可溶OPGL (2微克/毫升)包被到96-孔EIA板上16-24小时。用PBS中1％BSA 封闭之后，向孔中加入各种浓度的在1％BSA/PBS中稀释的αOPGL-1 (大约2ng/ml至1000ng/ml)并且在室温下温育平板大约2小时。 使用TMB-H202(四甲联苯胺和过氧化氢)底物混合物使用山羊抗-人 IgG(Fab′)-HRP检测结合的抗体。读取450nm和650nm的吸光度。
αOPGL-1特异性结合转染细胞表面上表达的OPGL(图8)。在FACS 缓冲液(PBS，0.1％BSA，0.01％叠氮化钠)中稀释的αOPGL-1(100ng/ml) 用各种浓度的OPGL，TNFα，TNFβ，TRAIL，或CD40配体(大约0.1ng/ml 至1000ng/ml)预先温育，然后加给大约200,000 CHO REN 218-9细 胞，它们是细胞表面上稳定表达膜结合的OPGL的CHO细胞。2-8℃ 下1小时之后，通过离心去除没有结合的抗体并且洗涤。细胞然后在 2-8℃下与FITC-标记的F(ab′)2山羊抗-人IgG(Fcγ片段特异性) 温育30分钟。离心和洗涤之后，使用流式细胞术测定细胞表面荧光。 图8说明αOPGL-1与CHO REN 218-9细胞的结合是特异性的，并且加 入可溶OPGL会竞争性减小，但是加入TNFα，TNFβ，TRAIL，或CD40 配体则不这样。
在竞争实验中，加入外源OPGL会抑制αOPGL-1与EIA平板上OPGL 结合(图9)，但是加入TNFα，TNFβ，TRAIL，或CD40配体则不这样 (图10)。以和上面对于αOPGL-1与EIA平板上OPGL结合方法基本 上相同的方法进行该程序，但是在加给OPGL包被板之前，恒定浓度 的αOPGL-1(100ng/mL)用各种浓度的可溶OPGL或其他配体(每种大 约1ng/ml至1000ng/ml)预先温育。
                      实施例5
                  αOPGL-1中和活性
破骨细胞形成的抑制
RAW264.7(ATCC No.TIB-71，Manassas，VA)是鼠巨噬细胞细胞 系，它来自Abelson鼠白血病病毒诱导的肿瘤。RAW264.7细胞在OPGL 存在下分化为破骨细胞样细胞。对于OPGL存在下RAW细胞培养形式 中产生破骨细胞的基础分析的详细描述见Simonet等(1997)Cell 89p. 309，和Lacey等(1998)Cell 93 p.165，它们在这里为了任何目 的引作参考。
配体刺激RAW细胞分化为破骨细胞样细胞，通过TRAP活性和破 骨细胞的性质能测定分化作用。因此，能测定αOPGL-1对破骨细胞生 成的作用。
在细胞培养基(DMEM，10％FBS，0.292mg/ml L-Glut，100单位 /毫升青霉素G，100微克/毫升硫酸链霉素)中，在恒定量的OPGL(40 ng/ml)和不同量的αOPGL-1(6.3ng/ml至200ng/ml)存在下，RAW 细胞温育4天。第四天结束时，通过渗透作用和酸化作用，接着用对 -硝基苯磷酸酯处理5分钟将细胞染色用于酒石酸盐-抗性酸磷酸酶 (TRAP)活性测定。简要地说，从培养基抽吸细胞，向各个孔加入100 微升柠檬酸盐缓冲液(410毫升0.1M柠檬酸，590毫升0.1M柠檬 酸盐，三钠盐，1mL tritonX-100)，并且将平板在室温下温育3-5 分钟。然后加入100微升PNPP溶液(157.8mg酸磷酸酶试剂(Sigma 104100)，7.2ml酒石酸盐溶液(Sigma cat.no.387-3)，和22.8ml 柠檬酸盐缓冲液)，并且将平板在室温下温育3-5分钟。加入50微 升0.5M NaOH溶液终止反应。
TRAP将对-硝基苯基磷酸酯转化为对-硝基苯酚，通过405nm的 光密度测定进行定量测定。因此对于破骨细胞发育是替代标记的TRAP 活性与405nm的光密度相关联。图11所示光密度对αOPGL-1浓度的 图，并且证明在该项分析中αOPGL-1抑制破骨细胞形成。
OPGL结合其受体的抑制作用
通过αOPGL-1阻断OPG配体与其相关受体，破骨细胞分化和激 活受体(ODAR，也称作RANK)结合的能力证明αOPGL-1的效力。这项 分析应用均匀的时间分辨荧光共振(HTRF)测定αOPGL-1与铕-偶联 骨保护素配体(Eu-OPGL)的结合。如果αOPGL-1抑制Eu-OPGL结合 ODAR，荧光输出将减小，存在的αOPGL-1的量与荧光量成反比关系。
用铕标记OPGL，当在337nm光激发时其在620nm发射。ODAR与 FLAG融合并且与Fc融合，Fc-ODAR-FLAG融合蛋白用与别藻蓝蛋白 (APC)连接的抗-FLAG抗体标记，别藻蓝蛋白是当在620nm光激发 时在665nm发射的荧光团。因此，当Eu-标记的OPG配体结合Fc- ODAR-FLAG/抗-FLAG-APC复合体时，当在337nm光激发时三元复合体 在665nm发射。
0.05μg/ml的Eu-OPGL与测定缓冲液(50mM Tris pH8，100 mMNaCl，0.05％NaN3，1％BSA，和0.05％Tween 20)中各种浓度(0.1至 150ng/ml)的αOPGL-1在室温下温育大约1小时(预温育混合物)。 还在测定缓冲液中制备Fc-ODAR-FLAG(1μg/ml)和抗-FLAG-APC (2.5μg/ml)的混合物并且在室温下温育1小时(荧光染料混合物)。 然后合并等体积的预温育混合物和荧光染料混合物并且在室温下温育 3小时。在Packard Discovery HTRF微量板分析仪上对板读数测定荧 光度，使用337nm激发波长和665nm发射波长。
当αOPGL-1与Eu-OPG配体预温育之后与Fc-ODAR-FLAG/抗-FLAG- APC混合时，665nm的荧光密度以剂量依赖方式减小，如图12所示， 证明αOPGL162能有效抑制OPGL与ODAR的结合。
                     实施例6
                 猕猴的药物动力学
六只雄性和六只雌性猕猴，鼠龄小于4.5年并且体重2-4kg分 成4个剂量组。第1组由三只雄性和三只雌性组成。第2，3，和4组 各自由一只雄性和一只雌性组成。对第1组的动物施用单一SC剂量 的1mg/kg αOPGL-1，而对第2，3，和4组的动物分别施用单一IV 剂量的0.1，1.0，或10.0mg/kg的αOPGL-1。
动物接受转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达的αOPGL-1。取 血清样品测定αOPGL-1水平，抗体分析，骨更新标记物血清N-端肽(血 清N-Tx)分析，碱性磷酸酶(ALP)分析，和血清钙(血清Ca)分析。 收集尿液分析N-端肽(尿N-Tx)和肌酐。
通过三阶段分布表征IV给药之后的血清浓度-时间曲线(图13)。 最初，有一个快速分布期，接着是一个显著减慢的平台期，它表现出 是浓度-依赖性的。第三观察期是快速消除期。
应用利用WinNonlin Professional(v1.5)的完全血清浓度-时 间曲线的非-区室分析，和试验物质施用之后最多14天的数据指数分 析，以及使用SAAM II(v1.1.2)的10,000ng/mL以上分析，来研 究αOPGL-1在猴子中的药物动力学。所有IV给药分布的初始体积平 均是28.9ml/kg，类似于血浆浓度。所有IV给药分布的稳定态体积 (Vss)平均是39ml/kg。指数分析表明αOPGL-1有6.02小时的平 均分布半衰期(t1/2α)，延续的第二期随着剂量的加大，半衰期(t1/2β) 从0.1mg/kg剂量的86.9小时延长至10.0mg/kg剂量的444小时。 所有的IV给药组非区室估计终末消除半衰期(t1/2z)平均31小时。 发现αOPGL-1的清除率(CL，CL/F)是非线性的，接受IV给药10mg/kg 剂量的动物平均清除率是0.120ml/hr/kg)比接受0.1mg/kg (0.401ml/hr/kg)的低3.3-倍。
皮下给药之后，吸收慢，132小时时平均峰值浓度(Cmax)是11， 600ng/ml。SC给药之后暴露范围高度可变，导致0.387±0.281 ml/hr/kg的平均清除率和202±80.1小时的平均存留时间。平均生 物利用度是89％。
表5中总结了前面的数据。
表5：IV和SC施用单一剂量αOPGL-1之后猕猴体内平均(±SD) 非-区室药物动力学参数a                                          非-区室参数估计   参数     单位          1.0mg/kg     0.1mg/kg     1.0mg/kg     10mg/kg          SC(n＝6)     IV(n＝2)     IV(n＝2)     IV(n＝2)     平均值     SD     平均值     平均值     平均值   Tmax   Cmax   t1/2，Z   AUC(0-∞)   CL，CL/F   MRT   Vss     hr     ng/ml     hr    μg*hr/ml     ml/hr/kg     hr     ml/kg     132     11600     34.9     3520     0.387     202     N/Ac     60.2     3410     111     1750     0.281     80.1     N/A     0     4330     30.7     253     0.401     84.8     33.7     0     38200     31.4     3950     0.256     124     31.7     0     326000     NDb     99900     0.120     519     55.9
a对三个有显著图报道的值
b没有测定，PK样品在平台(β)期结束，因此没有观察到终末期
c不可应用
给药后24小时之内αOPGL-1引起血清N-Tx水平快速降低(图 14)。发现最大效果的发生平均时间在IV给药从0.1增加至10mg/kg 之后12小时至7天，接受SC给药1.0mg/kg的动物在12小时和11 天之间。最大效果随着剂量范围从0.1至1mg/kg而提高大约80至 91％。但是，没有进一步抑制的较高剂量观察到最大抑制作用是91％。 IV给药0.1mg/kg之后28天和SC给药1mg/kg之后70天血清N-Tx 平均水平回到基线。尿液N-Tx表现出与血清N-Tx相似趋势，除了第 105天的研究所有的组回到基线值(图15)。
IV给药10.0mg/kg之后7天血清Ca的抑制随着给药增加至低 于基线平均值31.6％的平均最低点。所有的其他给药组血清Ca平均降 低少于它们基线平均值的26.4％。第17天，被处理动物所有的血清 Ca水平回到它们的基线平均值的10％之内(图20)。
因为骨再吸收和形成密切相关，与形成标记物N-Tx相比，还观 察到骨形成标记物(ALP)的变化在ALP水平上下降缓慢得多并且延 长更长时间的抑制作用(图21)。αOPGL-1给药之后观察到的骨形成 标记(ALP)之前骨再吸收标记的减少证明αOPGL-1是骨抗-再吸收剂。
大多数动物(12只中的9只)产生抗αOPGL-1抗体。抗αOPGL-1 抗体发生率不是剂量或途径依赖性的。当没有给药组具有抗体阴性和 阳性动物时不可能评估抗αOPGL-1抗体对0.1mg/kg以上αOPGL-1药 物动力学的作用。0.1mg/kgIV时，αOPGL-1的大多数在抗体产生之 前清除，因此没有观察到对αOPGL-1处理的效果(图16)。
本申请要求2001年6月26日递交的美国临时申请登记号No. 60/301,172的优先权，对于任何目的，其在这里被引作参考。
                          序列表
                          序列表
<110>W.J.博伊尔
     F.H.马丁
     J.R.科尔瓦兰
     G.C.达维斯
<120>抗OPGL抗体
<130>06843.0049-00000
<150>60/301,172
<151>2001-06-26
<160>20
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1426
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>1
aagcttgacc accatggagt ttgggctgag ctggcttttt cttgtggcta ttttaaaagg    60
tgtccagtgt gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc    120
cctgagactc tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt    180
ccgccaggct ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggt attactggga gtggtggtag    240
tacatactac gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa    300
cacgctgtat ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc    360
gaaagatcca gggactacgg tgattatgag ttggttcgac ccctggggcc agggaaccct    420
ggtcaccgtc tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg cgccctgctc    480
caggagcacc tccgagagca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga    540
accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc tctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccagc    600
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cttcggcacc cagacctaca cctgcaacgt agatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga    720
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ccctgaggtc acgtgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccccgagg tccagttcaa    900
ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccacggg aggagcagtt    960
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ctccaaaacc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc eatcccggga    1140
ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct accccagcga    1200
catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacacctcc    1260
catgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag    1320
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cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatgataa gtcgac                   1426
<210>2
<211>467
<212>PRT
<213>小鼠
<400>2
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1               5                   10                  15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
            20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
        35                  40                  45
Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Val Ser Gly Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala
65                  70                  75                  80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
                85                  90                  95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Pro Gly Thr Thr Val Ile Met Ser Trp Phe
        115                 120                 125
Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
    130                 135                 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser
145                 150                 155                 160
Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
                165                 170                 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
            180                 185                 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
        195                 200                 205
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys
    210                 215                 220
Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu
225                 230                 235                 240
Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala
                245                 250                 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
            260                 265                 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
        275                 280                 285
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
    290                 295                 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Ash Ser Thr Phe
305                 3l0                 315                 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
                325                 330                 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile
            340                 345                 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
        355                 360                 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
    370                 375                 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385                 390                 395                 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
                405                 410                 415
Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
            420                 425                 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
        435                 440                 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
    450                 455                 460
Pro Gly Lys
465
<210>3
<211>728
<212>DNA
<213>小鼠
<400>3
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<210>4
<211>235
<212>PRT
<213>小鼠
<400>4
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<220>
<223>3’kappa RACE引物
<400>6
aagggtcaga ggccaaagga tgg                                             23
<210>7
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>5’抗-OPGL-1 kappa引物
<400>7
caactctaga ccaccatgga aaccccagcg                                     30
<210>8
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>3’抗-OPGL-1 kappa引物
<400>8
tttgacgtcg acttatcaac actctcccct gttgaag                              37
<210>9
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>5’IgG2 RACE引物
<400>9
ggcacggtca ccacgctgct gag                                             23
<210>10
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>3’IgG2 RACE引物
<400>10
cctccaccaa gggcccatcg gtct                                            24
<210>11
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>5’抗-OPGL-1 IgG2引物
<400>11
cagaagcttg accaccatgg agtttgggct gagctggctt tttcttgtgg c              51
<210>12
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>3’抗-OPGL-1 IgG2引物
<400>12
gcatgtcgac ttatcattta cccggagaca gggagag                              37
<210>13
<211>122
<212>PRT
<213>小鼠
<400>13
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Gly Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Asp Pro Gly Thr Thr Val Ile Met Ser Trp Phe Asp Pro Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
           115                 120
<210>14
<211>108
<212>PRT
<213>小鼠
<400>14
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Gly Arg
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
lle Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Phe Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
                85                  90                  95
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>15
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>随机引物
<220>
<221>misc_特征
<222>(18)..(23)
<223>N是A，C，G，或T
<400>15
ggccggatag gcctcacnnn nnnt                                           24
<210>16
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>5’抗-OPGL-1 kappa引物的部分的翻译
<400>16
Met Glu Thr Pro Ala
1               5
<210>17
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>3’抗-OPGL-1 kappa引物的部分的翻译
<400>17
Cys Glu Gly Arg Asn Phe
1               5
<210>18
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>5’抗-OPGL-1 IgG2引物的部分的翻译
<400>18
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala
1               5                   10
<210>19
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>3’抗-OPGL-1 IgG2引物的部分的翻译
<400>19
Lys Gly Pro Ser Leu Ser Leu
1               5
<210>20
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>LHRH拮抗剂肽
<220>
<221>MISC_特征
<222>(1)..(1)
<223>Xaa是Ac-D-Nal，其中Nal是3-(2-萘基)丙氨酰基
<220>
<221>MISC_特征
<222>(2)..(2)
<223>Xaa是(4’-氯苯基)丙氨酰基
<220>
<221>MISC_特征
<222>(3)..(3)
<223>Xaa是D-Pal，其中Pal是3-(3’-吡啶基)丙氨酰基
<220>
<221>MISC_特征
<222>(5)..(5)
<223>Xaa是N-甲基酪氨酸
<220>
<221>MISC_特征
<222>(6)..(6)
<223>Xaa是D-天冬酰胺
<220>
<221>MISC_特征
<222>(8)..(8)
<223>Xaa是N-epsilon-2-丙基-赖氨酰基
<220>
<221>MISC_特征
<222>(10)..(10)
<223>Xaa是D-丙氨酸-NH2
<400>20
Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Leu Xaa Pro Xaa
1               5                   10