本发明涉及特定的靶体释放系统;即是，为了骨再生通过螯合剂组合物系统对骨释放生长促进因子。含有这些系统的组合物和制备它们的方法也是本发明的部分。

一贯认为，许多造成哺乳动物骨损失的身体状况和疾病有，例如，有意的和偶然的外创伤，骨质疏松症和牙周疾病。因此，在医学和牙科领域通常需要提供刺激和提高哺乳动物（例如病人）骨再生的组合物。

多肽生长因子（GF）是一类对于骨再生可能有用的蛋白质，它也被描述成组织生长促进因子。生长因子是刺激限定的靶细胞群体的多肽。作为多功能分子，它们可以刺激或抑制细胞繁殖以及影响细胞功能，取决于靶细胞的类型和其它单肽的存在。生长因子的例子有血小板衍生的生长因子（PDGF），胰岛素样生长因子（IGF），转化生长因子（TGF）如β的（TGF-β）和α的（TGF-α），表皮生长因子（EGF），成纤维细胞生长因子（FGF）包括酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），神经生长因子（NGF），和骨形态发生蛋白质（BMP），包括成骨和骨诱导因子。组织生长因子的组合会有益于促进骨再生。例如PDGF和IGF-Ⅰ或PDGF和IGF-Ⅱ的组合促进骨再生和伤口愈合[参见，例如，Lynch  et  al.，Proc.Nat′l.Acad.Sci.（USA）84，7696-7700（1987）;Lynch  et  al.，J.Clin.Invest.84，640-646（1989）;Lynch  et  al.，J.Clin.Periodontol.16，545-588（1989）;Lynch  et  al.，J.Periodontol.62，458-467（1991）;和美国专利4，861，753和5，019，559]。

PDGF是约28-35千道尔顿（KD）的多肽。它们被发现在体内许多的细胞类型中。从人血小板得到的PDGF含两种多肽序列，PDGF-A和PDGF-B多肽[参见H.N.Antoniaces  and  M.Hunkapiller，Science  220，963-965（1983）]。PDGF-A由位于染色体7上的基因编码[C.Betsholtz  et  al.，Nature  320，695-699（1986）]，而PDGF-B由位于染色体22上的[R.Dalla-Favera，Science  218，686-688（1982）]病态癌基因编码（R.Doolittle  et  al.，Science  221，275-277（1983），Waterfield  et  al.，Nature  304，35-39（1983）]。

因为PDGF的两种多肽链是由位于不同的染色体的两种不同基因编码的，所以人PDGF以三种形式出现，PDGF-A和PDGF-B的二硫化物连接的异种二聚体，或两种不同的同二聚体（PDGF-A的同二聚体和PDGF-B的同二聚体）。PDGF在骨形成中的作用不清楚。一些研究表明它促进骨再吸收[Tashjian  et  al.，Endocrinology  111，118-124（1982）;Canalis  et  al.，J.Cell  Physiol.140，530-537（1989）]。其它研究显示PDGF在刺激离体成骨细胞繁殖，给新生鼠骨膜下重复注射施用时，新骨在体内形成[Piche  and  Graves，Bone  10，131-138（1989），Joyce  et  al.，Clinical  and  Experimental  Approaches  to  Dermal  and  Epidermal  Repair：Normal  and  Chronic  Wounds，pp.391-416（1991）]。

IGF，或生长调节素，是约7.5KD的具有与人胰岛素原强同源性的多肽[Humbel，Hormonal  Proteins  and  Peptides  12，57-59（1984）]IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ具有62%的序列同源。它们的作用由两个明显不同的受体调节。IGF-Ⅰ受体被称为Ⅰ型受体（IGF-ⅠR），而IGF-Ⅱ受体被称为Ⅱ型受体（IGF-ⅡR）。

业已详尽地研究了IGF-Ⅰ本身对骨生长的作用。在体内，通过成年兔胫骨中连续局部施用植入肽室内的IGF-Ⅰ未显著改变骨的形成[Aspenberg  et  al.，Acta  Orthop.Scand.，60，607-10（1989）]。连续地系统地施用生长调节素C（IGF-Ⅰ）也未能在鼠体促进由于股骨骨切开术造成的骨伤的恢复[Kirkeby  and  Ekeland，Acta  Orthop.Scand.;61;335-38（1990）]。少量动物的初步研究表明，持续14天将IGF-Ⅰ连续注入一条后脚的动脉，在较老的鼠（而非幼鼠）的这条脚导致增加的皮层骨形成。该作用似乎是成骨细胞数量增加和破骨细胞数量减少的结果[Spencer  et  al.，Bone  12，21-26（1991）]。将IGF-Ⅰ局部施于垂体切除的幼鼠的生长面结果使在单侧纵向上产生小的但显著的骨生长作用（A.M.Isgaard  et  al.，J.Physiol.250，E367-372（1986）]。已从骨基质分离出IGF-Ⅰ和PDGF[Hanschka  et  al.，J.Biol.chem.261，665-74（1986）;和Canalis  et  al.，Cal.Tiss.Internatl.43，346-51（1988）]。

在体外IGF-Ⅰ对骨细胞作用的数据明显不一致。Pfeilschifler等[Endocrinology 127，69-75（1990）]报道，单独的IGF对在培养的胎鼠颅盖的骨基质接合中只有轻微作用。当IGF-Ⅰ与PDGF-BB，TGF-β结合，或与PDGF-BB和TGF-β两者结合时，对骨基质形成可见显著作用。相反，McCarthy等[Endocrinology 124，307-7（1989）]报道IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ在骨培养物中明显刺激DNA和胶原合成。Hock等[Endocrinology 122，254-60（1988）]发现IGF-Ⅰ在体外主要刺激前成骨细胞复制并且对胶原和骨基质合成的刺激与细胞复制无关。Canalis等[J.Cell.Physiol.140，530-537（1989）]报道PDGF-BB抗IGF-Ⅰ对胶原合成的刺激作用，IGF-Ⅰ防止胶原降解中PDGF的作用且PDGF-BB和IGF-Ⅰ对颅盖DNA合成具另外的作用。Piche和Graves[Bone 10，131-8（1989）]也报道，在体外IGF-Ⅰ刺激重要的3H-胸苷掺入于骨衍生细胞中，也未提高在这一点上的PDGF的活性。IGF-Ⅰ与PDGF，EGF和TGF-B组合导致被骨细胞的摄取几乎相等于由10%胎牛血清所获得的。IGF-Ⅰ和Ⅱ的受体已在胎鼠骨的富成骨细胞培养物中被证明[Centrella et al.，J.Cell Biol（摘要）107，62a（1988）]。最近Canalis等对IGF-Ⅰ在骨代谢中的作用作了评论[J.Endocrinol.Invest.12，577-84（1989）]。

另一类对它的骨生长作用作了研究的生长因子是FGF。在体内，在骨折位点对aFGF和bFGF两者和它们相应的mRNA作了检测[Joyce  et  al.，（1991）同上]。aFGF和bFGF均已从骨基质中分离[Hauschka  et  al.，（1986）同上]。曾将bFGF和IGF组合使用以促进皮肤伤口的愈合[Lynch  et  al.，J.Clin.Invest.（1989）同上]。

在体外，bFGF未明显改变3H-胸苷掺入骨折愈伤组织中[Joyce等，（1991）同上]。已报道bFGF提高胎颅盖骨培养物中的致有丝分裂但不直接刺激成骨细胞的分化功能[Canalis et al.，J.Clin.Invest.81，1572（1988）]。如bFGF一样，aFGF同样被报道有对骨的生物作用，但一般需要较高的浓度[Canalis，J.Clin.Invest.79，52-58（1987）]。aFGF和bFGF均趋于减少胎鼠颅盖模型中基质的合成[Canalis et al.，（1989）同上]。培养的牛骨细胞可合成bFGF和aFGF，并在其细胞外基质中存贮[Globus et al.，Endocrinology 124，1539（1989）]。已报道bFGF在体外提高骨髓细胞形成骨样节的能力[Noff et al.，F.E.B.S.Letters 250，619-21（1989）]。aFGF和bFGF均增加顶骨培养的细胞中的DNA合成，同时bFGF为α1-1型原胶原mRNA的较强的刺激剂[McCarthy et al.，Endocrinology 125，2118-26（1989）]。它们对牙周韧带衍生细胞来说均是促有丝分裂的和趋化性的且结合到预处理的牙本质上[Terranova et al.，J.Periodontol.60，293-301（1989）];Terranova et al.，J.Periodontol.58，247-257（1987）;Terranova，In the Biological Mechanisms ofTooth  Extraction  and  Root  Resorption，Davidovitch  Z.ed.;pp.23-34（1989）]。

TGF-β族蛋白质也显示具有像骨生长调节剂一样的潜力。在体外TGF-β由成骨细胞产生并刺激这些细胞繁殖和胶原合成[Robey  et  al.，J.Cell  Biol.105，457-463（1987）;Rosen  et  al.，Exper.Cell  Res.165，127-138（1986）;Hock  et  al.，Cal.Tissue  Int.32，385（摘要）（1988）]。体内注射TFG-β刺激软骨形成和骨形成[Joyce  et  al.，J.Cell  Biol.110，2195-2207（1990）;Noda  et  al.，Endocrinology  124，2991-2996（1989）]。

骨诱导因子，如骨形态发生蛋白质成骨质素和骨诱导蛋白质1，也可刺激骨形成。它们通常结构上相似于TGF-β，其特征，当皮下或肌内移植入哺乳动物时，具有诱导异位软骨和骨形成的能力（美国专利4，877，864;4，619，989;4，455，256;4，596，574;和4，563，489;Wozney  et  al.，Science  242，1528-1534（1988）]。

靶向性释放虽然生长因子显示具有调节骨生长的能力，其作为治疗剂的效用却受到将其释放到骨缺损位点的能力的限制。在疾病如骨质疏松症中，这种缺损在各种时间出现在整个骨骼系统。因此，理想的是对骨骼组织最好给骨缺损处靶向释放生长因子。目前释放蛋白质（如，多聚体，骨移植物和脂质体）的方法，由于只是无靶向地局部释放或全身分布，是不令人满意的。

已知各种具有配合到氨基膦酸或氨基羧酸配位体的一种金属的氨基膦酸和氨基羧酸复合物对骨释放药剂[美国专利4，508，704;4，515，767;4，560，548;4，606，907;4，897，254;4，898，724;5，059，412;5，064，633;和5，066;478]。

很清楚，人们需要将所需的生长因子优先释放到骨位点并保留其活性达到预期之用途。更优选的是能将所需的生长因子优先释放到损伤或亏损的骨位点并且仍保留其预期的活性。最优选的是能将所需的生长因子优先释放到损伤或亏损的骨位点并且根据由体内天然的骨的体内平衡机制决定的“所需”来激活骨生长因子。本发明能满足上述目的。

本发明提供了通过施用骨生长促进因子刺激和增强骨生长的化合物。所述的骨生长促进因子是以一种让其优先定位于骨骼组织的方式与一种聚氨基亚甲基膦酸配合物相连而修饰过的。用于该释放系统的化合物由下式表示：GF-[（CL）z-L-AP]q（Ⅰ）其中：GF为生长促进因子或其组合物;

CL为共价健合到GF上的酸可裂解连接基团;

z为0，1或2;

q为1至天然GF中存在的氨基的总数;

L为连接部分;和AP为聚氨基亚甲基膦酸配合基。

本发明还考虑了将式Ⅰ化合物施于哺乳动物的制剂，和用式Ⅰ化合物靶向性释放于骨的方法，和制备式Ⅰ化合物的方法。

当使用含式Ⅰ化合物的组合物或制剂时，受伤或亏损骨处得到治疗，并且骨再生。天然和重组的组织生长因子可由以下各处购得：R  &  D  Systems（Minneapolis，MN），Collaborative  Research，Inc.（Bedford，MA），Genzyme，Inc（Cambridge，MA），ICN  Biomedicals，INC，（Cleveland，OH），Peprotech，Inc.（Rocky  Hill，NJ）和UBI（Lake  Placid，NY）。骨诱导蛋白质可从骨中纯化[Celeste  et  al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，（USA）87，9843-9847（1990）;Nang  et  al.，Proc.Natl.Acad.Sci（USA）85，9484-9488（1988）;美国专利4，455，256和4，619，989]。

式Ⅰ化合物中虽然前面提到的任一生长促进因子（GF）都可采用，较好的GF选自PDGF，IGF，FGF，TGF或软骨/骨诱导因子（BMP）。

PDGF，最好与IGF-Ⅰ结合，当单独或直接施于病骨时显示增加新骨形成（美国专利4，861，757和5，019，559和未决美国专利申请582，332号，1990年9月13日，H.Antoniades和S.Lynch提交的）。PDGF每分子含有30个游离氨基它可能被修饰从而增加PDGF对骨的亲合力。PDGF可从R  &  D  Systems和Genzyme，Inc.购得。PDGF在美国专利4，861，757和5，019，559中作了描述。

当单独或优选与PDGF组合，直接将IGF-Ⅰ施用于病骨时，显示出增加新骨形成。每分子IGF-Ⅰ含有4个可能被修饰从要增加PDGF对骨亲合力的游离氨基。IGF-Ⅰ可从R  &  D  Systems和Genzyme，Inc.购得。IGF-Ⅰ由R.E.Humbel在Eur.J.Biochem.190，445-462（1990）中作了描述。

IGF-Ⅱ当直接施用于病骨时显示出增加新骨形成。每分子IGF-Ⅱ含有2个可能被修饰从而增加PDGF对骨亲合力的游离氨基。IGF-Ⅱ可从R  &  D  Systems和Genzyme，Inc.购得。IGF-Ⅱ可由R.E.Humbel在Eur.J.Biochem.190，445-462（1990）中作了描述。

bFGF当直接施用于病骨时显示出增加新骨形成。每分子bFGF含有15个可能被修饰从而增加PDGF对骨亲合力的游离氨基。bFGF可由R  &  D  Systems和Genzyme，Inc.购得。bFGF由Gospodarowicz等在Endocrinol.Rev.8，95-114（1987）中作了描述。

aFGF是一种低分子量的同二聚体多肽，当直接施用于病骨时，它显示出增加新骨形成。aFGF每分子含有14个可能被修饰从而增加PDGF对骨亲合力的游离氨基。aFGF可从R  &  D  Systems和Genzyme，Inc.购得。aFGF由Gospodarowicz等在Endocrinol.Rev.8，95-114（1987）中作了描述。

TGF-β1是一种低分子量（约25KDa，氨基酸）同二聚体多肽，当直接施用于病骨时，它显示出增加新骨形成。每分子TGF-β1含有18个可能被修饰从而增加PDGF对骨亲合力的游离氨基。TGF-β1可从R & D Systems和Genzyme，Inc.购得。TGF-β1由Sporn等在J.Cell Biol.105，1039-1045（1987）中作了描述。

当在间质组织内施用BMP时显示出增加新骨形成。BMP由Celeste等在[Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）87，9843-9847（1990）]中作了评述，并结果如下：BMP

聚氨基亚甲基膦酸配合物（式Ⅰ的AP）或是共价键合到式Ⅰ（Z＝0）的GF上，或是具有可切连接基团（L）存在（Z＝1）。该AP配合物可以是直链或支链部分，环状部分，聚合物（包括致密星形高聚物（dense  star  polymer），其树状物（dendrimer）和树突（dendron）），或芳基部分，它的配合物至少含有2个，优选3个或更多的，氮原子。该配合物优选下式之一的聚氨基亚甲基膦酸配合物：

其中：每个R1各自独立地为氢，C1-C4烷基，苯基，羟基C1-C4烷基，-CH2COOH，-CH2PO3H2或L部分;

前提条件是只有一个R1可以是L部分并且必须有一个L部分存在和前提条件是至少有总数的一半的R1为-CH2PO3H2;

每个R2和R3各自独立地为氢，C1-4烷基或L部分;前提条件是式Ⅱ中只有一个L部分存在;

n各自独立地为2，3或4;

n′各自独立地为2，3或4;和m为0至10;或

其中：R1，R2，R3，n和m如前所定义;或

其中：R1如前所定义。

连接部分（式Ⅰ中的L）由下式表示：

其中：G为氢，NH2或

R4为能与蛋白质连接的亲电子基团;

R5和R6各自独立地为氢或-COOH;

前提条件是当G为氢时，则R5或R6之一为COOH;

R7为氢，羟基或C1-C4烷氧基;和y为0，1，2，3或4;

前提条件是当y为0，1，2，3或4时，则R5或R6只有一个可以是COOH。

本发明中的下列术语定义如下。术语“直链或支链部分”是指具有1至约100个碳原子的烷基，它可以是直链部分如，例如，乙基，丙基，正丁基，正十二烷及其他，或支链部分如，例如，异丙基，叔丁基，2，5，7-三甲基十二烷基等等。直链或支链部分均必须含至少2个氮原子，优选3至50个氮原子，且更优选3至25个。这些部分的一些例子包括：

其中：PDTMP＝（N-丙基羧基）亚乙基二胺-N，N′，N′-三亚甲基膦酸;

APEDTMP＝[N-（4-氨基苯基）乙基]亚乙基二胺-N，N′，N′-三亚甲基膦酸;

CEDTMP＝1-（羧基）亚乙基二胺-N，N，N′，N′-四亚甲基膦酸;

ABEDTMP＝[1-（4-氨基苯甲基）]亚乙基二胺-N，N，N′，N′-四亚甲基膦酸;

APIPTMP＝N-（4-氨基苯基）-N，N-双-[丙基-（亚胺基二亚甲基膦酸）];

APDTMP＝N-[（4-氨基苯基）乙基]-N，N-双-[乙基-（亚胺基二亚甲基膦酸];和ABDTMP＝N-[1-（4-氨基苄基）-N，N′-亚乙基二胺-N′，N″-亚乙基胺-N，N，N′，N′-五亚甲基膦酸;

优选ABEDTMP和ABDTMP。这些化合物示于实施例中。

术语“环部分”是指具有至少2个氮原子，优选3至10个，且最优选3至8个氮原子的且存在的碳原子约两倍于氮原子的脂族饱和环系。此部分的一些例子包括1，4，7，10-四氮杂环十二烷，1，5，8，12-四氮杂环十四烷，2-[（4-氨基苄基）-1，4，7，10-四氮杂环十二烷]-1，4，7-10-四亚甲基膦酸，1-[（α-羧酸）-4-氨基-2-甲氧苄基]-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-4，7，10-三亚甲基膦酸，和1-[（α-膦酰基）（4-氨基苯基）乙基]-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-4，7，10-三亚甲基膦酸。

术语“芳基部分”是指具有一个或多个附加环或芳环或被直链或被支链取代的芳环系。该芳环骨架中的原子总数为3至30，优选6至16，且最优选8至16。芳基部分至少含有2个氮原子，优选3至10个，且最优选3至8个。此部分的一些例子包括吡唑基，3-甲基吡唑基，5-甲基吡唑基，咪唑基，4-甲基咪唑基，5-甲基咪唑基，1，4-二甲基咪唑基，1，5-二甲基咪唑基，哒嗪基，嘧啶基，2，4，6-三甲基嘧啶基，吡嗪基，嘌呤基，喋啶基，3，6，9，15-四氮杂二环[9.3.1]十五烷-1（15），11，13-三烯-3，6，9-三亚甲基膦酸（PCTMP），6-（α-羧基-4-氨基苄基）-3，6，9，15-四氮杂二环[9.3.1]十五烷-1（15），11，13-三烯-3，9-二亚甲基膦酸（PCAPCDMP），13-（4-氨基苄基-3，6，9，15-四氮杂二环[9.3.1]十五烷-1（15），11，13-三烯-3，6，9-三亚甲基膦酸（PCABTMP），和6-[（α-膦酰-4-氨基苯基）乙基]-3，6，9，15-四氮杂二环[9.3.1]十五烷-1（15），11，13-三烯-3，9-二亚甲基膦酸（PCAPCTMP）。PCTMP，PCAPCDMP和PCAPCTMP，优选PCTMP和PCAPCTMP，且在Kiefer等的未决美国专利申请805，551号，申请日1991年10月10日（由未记载的委托证书转让给The  Dow  Chemical  Company）中讲述，该文的描述被参考和结合于本文。也可存在其它杂原子如氧。

术语“聚合物，包括致密星状聚合物”如1988年6月16日公开的欧洲专利申请0271180，所述的定义，该文的描述通过参考被结合入本文。“致密星状聚合物”还可参考“STARBURSTTM”聚合物（Michigan Molecular Institute，Midland，MI的商标）或STARBURSTTM树状物并在同一欧洲专利公开中已描述。优选的STARBURSTTM树状物具有聚氨基亚氨基基团，其中表面具有转化成氨基亚甲基膦酸基团的氨基并在表面上带有至少1个4-氨基苯基部分。该STARBURSTTM树状物按1988年6月15日公开的欧洲专利申请0271180中描述的方法制备，通过参考，将该文结合于本文中。“聚合物”也包括Arborol（G.R.Newkome，J.Org.Chem.50，2004-2006（1985），和含胺的直链或支链聚合物（V.P.Torchilin et al.，Byull.Eksp.Biol.Med.102，63-65（1986）。

下式同样包括在式Ⅰ的AP术语定义的范围内：H2N-（CH2）n-C（PO3H）2OH其中n为1-3。

这样的化合物描述在美国专利5，039，819;5，019，651;4，922，007;4，621，077;4，134，969;4，117，086;4，108，962;和3，962，432中。

术语“可切连接物”（式Ⅰ的CL）是指在聚氨基亚甲基膦酸（式Ⅰ的AP）[在连接部分（式Ⅰ的L）]具有双官能螯合剂（BFCA）和GF的蛋白质之间的键合在某些生理条件下是可逆的或可切的。本行业中已教导这样的键合并且包括含有硫脲，硫醚，肽，酯和二硫基的键合[C.F.Meares  et  al.，Int′l  J.Cancer，Supp.2，99-102（1988）和本文中包括的参考文献，美国专利5，045，312]。本行业中还教导了在分子和蛋白质之间的含脒键合的连接基团。这些连接基团可通过含亚氨基酯的分子与蛋白质中的氨基反应制备[O.R.Zaborsky，Immobilized  Enzymes  in  Food  and  Microbial  Processes，P187-202，A.C.Olson  and  C.C.Cooney，eds.，Plenum，New  York（1974）]。在本行业中同样教导的有酰胺，二酯，硫醚，烃类，和二硫键合[C.H.Paik  et  al.，J.Nucl.Med.30，1693-1701（1989）和M.K.Haseman，Eur.J.Nucl.Med.12，455-460（1986）]。在美国专利5，094，848中教导了可裂解的二磷酸酯和酰胺化的二磷酸酯连接基团。这些连接基团在现场被酶如磷酸二酯酶，5′-核苷酸酶，和酸性磷酸酶切除。美国专利5，094，849中还教导了亚烷基hydrizide键形式的可裂解连接基团。这些连接基团通过含羰基的分子与含酰肼部分的分子反应形成。此外，曾提出乙酰糖苷作为选择性的可裂解连接基团[L.F.Tietze，Nachr.Chem.，Tech.Lab.36，728-737（1988）]。酸可裂解的连接范围会特别有利。特别优选的是PH5时的切除速率至少比PH7时的大10倍以上的酸可切连接物，该两种速率都是在37℃测定的。美国专利4，542，225和4，618，492和本文中提到的参考文献和参考并结合在本文中的我们的1993年3月4日申请的未决美国专利申请026，800号中描述了一些酸可切连接物的例子。在最后的一份专利申请中，优选的酸可裂解连接基团为4-异硫氰酰苯二甲酸酐。

术语“存在可耦合到蛋白质上的基团”和“能被连接到蛋白质上的亲电子基团”是指能键合到蛋白质（例如GF）上的氨基酸上的亲电子基团（式Ⅰ的L中的R4）。本行业熟练技术人员已知的适合的基团的一些例子包括，但不限于，氨基，马来酰亚胺基，叠氮基，异硫氰酰基，乙烯基吡啶基，溴乙酰胺基，羧基，和N-羟基琥珀酰亚胺基活性酯。当这些亲电子基团存在时，配合物（式Ⅰ的L-AP，优先连接）为BF-CA。

术语“聚氨基亚甲基膦酸部分”（式Ⅰ的AP）由各种各样的可能的基团表示，如环状部分，直链或支链部分，芳基部分，包括稠密星状聚合物（如上定义）的聚合物。它们具有至少一个这样的部分，即在2个氮原子之间含有一个亚甲基（-CH2-）n（其中n为2，3，4）（聚氨基亚甲基）。该部分中，可以存在多于1个这样的聚氨基亚甲基。该部分还含有至少2个经氮原子共价连接到聚氨基亚甲基上的亚甲基膦酸基（-CH2-PO3H2）聚氨基亚甲基膦酸部分优选由式Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ代表的但不限于此。聚氨基亚甲基膦酸部分最好具有如本文所述的存在一个可耦合到蛋白质或能被连接到蛋白质的亲电子基团上的基团。聚氨基亚甲基膦酸部分（由式Ⅰ中L-AP表示）可以通过可切连接物（由式Ⅰ中CL表示）连于蛋白质（式Ⅰ中的GF），最好是如本文所述的酸可切连接物。

术语“生长因子”和“组织生长促进因子”意思是任何刺激哺乳动物细胞繁殖，分化，代谢或移动的分子。这些因子可以由天然来源得到或由重组DNA技术或化学合成制得。这些因子是纯化过的为好。

本文所采用的术语“纯化的”是指，在与其它生长因子混合前，该因子占特定蛋白质重量的90%或更高（即，它基本上没有与其天然伴生的其它蛋白质，脂类，和碳水化合物）。纯化的蛋白制备物通常在聚丙烯酰胺凝胶上产生每个亚单位的单个大谱带。本发明组合物中所用的纯化的因子最优选的是由氨基末端氨基酸序列分析判定的纯的因子。

本发明的配合物（式Ⅰ的AP）可以是其药用的盐的形式。本文中所采用的术语“配合物”可理解包括这些盐。术语“药用的盐”意思是药用可允许的阳离子。在用于达到所需效果的剂量下，这些阳离子基本上是无毒的。举例说明，这些盐包括碱金属的，如钠和钾;碱土金属的，如钙和镁;铵;ⅢA族的轻金属包括铝的;和有机伯，仲和叔胺的，如三烷基胺，包括三乙胺，普鲁卡因，二苄基胺，N，N-二苄基亚乙基二胺，二氢阿必乙基胺（dihydroabieehylamide），N-（C1-C4）烷基哌啶，和任何其它适合的胺的盐。优选钠和钾盐。术语“药用的”意思是适合于给温血动物例如，哺乳动物，特别是人施用的，且包括无毒，例如，适合药用且对温血动物无毒。本发明化合物的药用盐通过常规离子交换方式或用适当的碱处理配合物或式Ⅰ化合物而制备。

聚氨基亚甲基膦酸的制备已知有各种制备本发明聚氨基亚甲基膦酸部分的方法。下面对其中的几个作讨论。

A.由胺制备有许多文献描述了由胺制备聚氨基亚甲基膦酸，特别是直链或支链部分。例如，美国专利2，599，807，该文的描述通过参考文献被结合入本文，教导了通过在有碱如碳酸钠存在下PH＞10的条件下加热胺水溶液和氯代亚甲基膦酸制备聚氨基亚甲基膦酸。下面所示的参考文献给出的其它例子描述了采用下表中所示的各种膦酰甲基化试剂从相应的亚乙基二胺（EDA）制备亚乙基二胺四亚甲基膦酸（EDTMP）。

EDTMP的制备

＊  EDTA＝亚乙基二胺四亚甲基羧酸＊＊＝该文的公开引入本文作为参考美国专利4，937，333，（本文参考并结合了该文的描述），和D.W.Swinkels等的Recl.Trav.Chim.Pays-BAS  110，124-128（1991）中可见由相应的胺制备环状聚氨基亚甲基膦酸的另外的例子。

经中间体氨基亚甲基膦酸酯或混合的氨基亚甲基膦酸酯从胺制备聚氨基亚甲基膦酸可见于1991年6月13日公开的WO91/07911，本文参考结合了该文的描述。该方法采用膦酸甲基化试剂（例如：甲醛和亚磷酸二烷基酯）的水溶液形成膦酸全烷基酯。然后将该酯水解成氨基亚甲基膦酸。该文献还描述了如何用强碱（例如，正丁基锂）和用卤代烷基或芳基烷基化处理该酯使烷基或芳基取代在氮和磷之间的碳上。

B.由羧酸制备聚氨基亚甲基膦酸按各种已知方法可将聚氨基亚甲基羧酸转化成相应的聚氨基亚甲基膦酸。一般的转换相应羧酸的反应涉及能供给膦酸基团的试剂。例如，EDTA与PCl3在硝基苯中的反应给出EDTMP（例如，美国专利3，832，392）本文参考并结合了该文的描述。

C.具有胺基的能转化成聚氨基亚甲基膦酸的双官能螯合剂（BFCA）的制备Simon等人的（由未记载的委托书转让给The  Dow  Chemical  Company）1990年8月9日申请的未决美国专利申请565，379号教导了制备能被连于蛋白质的各种直链或支链聚氨基亚甲基膦酸的方法，本文参考结合了该文的描述。1984年9月27日公开的WO  84/03698，描述了可以被膦酰亚甲基产化产生BFCA的开链聚胺碱化的双官能螯合剂中间体。直链或支链聚亚烷基聚膦酸BFCA的合成在美国4，808，541中也作了描述，本文参考结合了该文的描述。

美国专利3，994，966和4，622，420以及各种本文中给出的文献描述了如何制备各种带有可连于蛋白质胺基的不同基团的亚乙基二胺和二亚乙基三胺碱化的BFCA。所有的上述BFCA可由胺转化成聚氨基亚甲基膦酸BFC从而可连在蛋白质的胺基上。

含由氨基羧酸键合的开链聚氨基亚甲基膦酸BFCA可以，如1988年8月24日公开的欧洲专利申请0279307中所描述的，从相应的聚胺中间体制备，本文参考并结合了该文的描述。美国专利4，994，560;5，006，643和5，064，956也描述了怎样制备各种含BFCA的开链胺或环胺。它可被膦酰甲基化而产生相应的聚氨基亚甲基膦酸BFCA。

1990年2月7日公开的欧洲专利申请0353450中教导了环聚胺BFCA，并描述了怎样制备许多不同的含BFCA的环胺，然后可再将其羧甲基化产生氨基亚甲基羧化物。该含BFCA中间体的胺另外可以被膦酰甲基化产生相应的聚氨基亚甲基膦酸BFCA。同样，美国专利4，885，363描述了各种含有中间体的1，4，7，10-四氮杂环十二烷碱化的胺。该中间体可通过膦酰甲基化作用转化成聚氨基亚甲基膦酸BFCA。以1，4，7，10-四氮杂环十二烷四亚甲基膦酸为骨架的环BFCA和以二亚乙基三氨基五亚甲基膦酸为骨架的开链BFCA是聚氨基亚甲基膦酸BFCA配合物的优选基团。

聚氨基亚甲基膦酸BFCA上的连接蛋白质的基团可被环状聚氨基亚甲基膦酸本身取代，且由J.P.L.Cox在J.Chem.Soc.，Chem.Commun.797（1989），和M.K.Moi等在J.Amer.Chem.Soc.110，6266-6267（1988）中例举出来。同样的化合物示于WO  89/11475，1989年11月30日公开。

以1，4，8，11-四氮杂环十四烷为骨架的环胺化合物由M.K.moi等在Inorg.Chem.26，3458-3463（1987）中作了描述。它们可以从上面提到的方法转化成四氨基亚甲基膦酸的对映化合物。可用于本发明的类似化合物描述于美国专利4，678，667中。T.J.McMurry等在Bioconjugate  Chem.3（2），108-117（1992）中描述了另外的环聚胺的例子。这些中间体双官能环胺可以膦酰甲基化而得到相应的聚氨基亚甲基膦酸BFCA（式Ⅰ的L-AP部分）。

双环多氮杂大环羧酸BFCA中间体，公开在Kiefer等的（由未记载的委托书转让给Tne  Dow  Chemical  Company）1991年12月10日提交的未决美国专利申请805，270号中，本文参考结合了该文的描述，可被膦酰甲基化而得到聚氨基亚甲基膦酸BFCA。

双环多氮杂大环羧酸BFCA，公开在Kiefer等的（由未记载的委托书转让给Tne  Dow  Chemical  Company）1991年12月10日提交的未决美国专利申请805，551号，本文参考结合了该文的描述，教导了制备各种具有聚氨基亚甲基膦酸BFCA的双环多氮杂大环膦酸BFCA的方法。

D.具有还原成胺基的硝基的双官能螯合剂（BFCA）的制备当需要将硝基，特别是硝基苯基还原成相应的氨基时，尤其是对于在上面C段中描述的化合物，这种还原很容易由本行业已知的方法来完成。例如，列在John  Wiley  &  Sons出版的Survey  of  Organic  Synthesis  1，411-417（1970）和此文中包含的文献中的方法。

E.具有转化成亲电基团的氨基的双官能螯合剂（BFCA）的制备本发明配位体（例如式Ⅰ的L）的BFCA具有可耦合到蛋白质的基团或能够被连于蛋白质的亲电基团。将该氨基转化成能被连于蛋白质的亲电基团的方法是本行业熟知的。以下一些文献提供了适合的方法：C.F.Meares  et  al.，Acc.Chem.Res.17，202-209（1984）和此文给出的参考文献;D.Parker，Chem.Soc.Rev.19，271-291（1990）和此文给出的参考文献;C.F.Meares  et  al.，J.of  Protein  Chem.2，215-228（1984）和此文给出的参考文献;C.F.Meares“Protein  Tailoring  Food  Med  Uses”，Amer.Chem.Soc.Symp.，339-352（1985），ed.R.E.Feeney  and  J.R.Whitaker，pub.Dekker，NY，NY。前面已经给出了BFCA的例子。此外，许多试剂可用来形成在水溶液中将含胺的分子与含羧化物的分子结合在一起的酰胺键。例如，市场上可购买到的水溶羰基二亚胺已被开发作此用途[J.V.Staros，Anal.Biochem.156，220-222（1986）]。

另一种将两个亲核基连在一起的方法是通过与芳酰氯或其化学等同物反应，将其中之一如胺基转化成Micheal受体。这样将氨基转化成可再与不同亲核的胺反应的芳酰胺基（Chem.Abst.83：802956）。

M.J.Poznansky和R.L.Juliano在Pharmacol.Rev.36，278-336（1984）和WO  90/14844中描述了其它的制备药物载体结合物的方法。

F.由其它方法制备BFCA将两个亲核部分连在一起的分子称为双官能交联剂。如果分子的两个反应末端相同，它们被称为“同双官能”交联剂。如果分子的两个反应末端不同，它们被称为“异双官能”交联剂。

T.Kitagawa等在Chem.Pharm.Bull.29，1130-1135（1981）和该文给出的参考文献中公开了怎样制备用于蛋白质修饰的异双官能交联剂。这样的试剂具有两个选择性反应基团如马来酰亚胺基（它与硫醇部分反应）和N-羟基琥珀酰亚胺基酯（它与氨基如赖氨酸反应）。如果一个分子含有胺基而另一个分子含有硫醇基，上述试剂可让两个分子结合在一起。类似的含马来酰亚胺基的化合物由O.Nielsen在Synthesis  819-821（1991）中作了报道。

已开发出其它的双官能交联剂用于将BFCA或其它亲电分子连于蛋白质或其它亲核底物（美国专利4，680，338和该文中给出的参考文献）;二醛交联剂[S.Avamead  et  al.，Scand.J.Immunol.8，7-23（1978）];和市场上可购得的交联剂参见Pierce  1989  Handbook  and  General  Cataloq.pp283-311（Pierce，Rockford，IL）。

含亲电基团如胺（但也包括其它类似亲电基团）的蛋白质和小分子可以通过与市场上可购得的Traut试剂[I.Wower，Nuc.Acid  Res.9，4285-4291（1981）]反应将氨基转化为成可再选择性地与马亚酰亚胺基反应的Sulphydryl基团。

G.可切连接物在某些生理条件下可逆或可切的聚氨基亚甲基膦酸BFCA与GF之间的键合有时是有利的。在本行业和上面给出的例子教导了这样的键合。特别有利的是酸可切的连接物。在美国专利4，542，225和4，618，492和其中提到的参考文献中描述了酸可切连接物的例子。这些可切连接物在连接物的一个末端具有与胺基反应的环酐，和在连接物的另一个末端的与Sulphydryl反应的马来酰亚胺基。在酐和氨基（在此与羧酸形成酰胺）之间的健合在酸性PH下很容易切开。美国专利4，764，368也描述了应用环己-1，2-二羧酸酐作为一种引入小分子和大分子之间的酸可切酰胺功能团的方法。WO  90/14844描述了使用糖衍生物作为弱酸条件下的可切连接物。

H.金属离子的存在出人意料的是，金属离子的添加不显著抑制聚氨基亚甲基膦酸对钙表面的亲合力。例如，钙或钐离子的添加不干扰1，4，7，10-四氮杂环十二烷四亚甲基膦酸（DOTMP）对羟磷灰石的钙化表面的亲合力。

例如，美国专利4，976，950中当与钐，钬，钆或镱离子螯合时DOTMP在活体显示出移至钙化位点。同样当与钙或其它金属离子螯合时亚乙基二胺四亚甲基膦酸（EDTMP）在活体也显示出移至钙化位点（欧洲专利申请0462787，1991年12月27日公开）。

I.连接蛋白质的氨基膦酸簇具有聚氨基亚甲基膦酸的聚合物，包括如1988年6月15日公开的欧洲专利申请027180中所描述的稠密星形高聚物，可通过胺与甲醛和亚磷酸二烷基酯水溶液反应形成膦酸全烷基酯而制备。再水解该膦酸酯成为稠密星形高聚物之氨基亚甲基膦酸。具体地，该致密星高聚物为在其表面具有胺基的PAMAM形式。上述胺基再与膦酰甲基化试剂反应形成聚氨基亚甲基膦酸，再结合到GF上。作为骨找寻（seeking）部分的致密星形高聚物的优点为它可以水溶，具有可控大小，和可结合至GF上的特定的基团和基团的量。

式Ⅰ的L-AP的聚合物也包括能被连于蛋白质（例如GF）上的arborol（G.R.Newkome，J.Org.Chem.50，2004-2006（1985））。arborol为monocascade球，拥有外表面被极性官能团复盖的三维微环境。可以通过本行业已知的将酯和醇转化胺的方法（例如，John  Wiley出版的Survey  of  Organic  Synthesis  1，411-417（1970）和其中给出的参考文献）将上述arborol转化成聚胺。该arborol聚胺可以通过上述方法转化成聚氨基亚甲基膦酸。以带有适当的基团如对硝基苄基溴化物的arborol  cascade高聚物为原料，该arborol可含有能连于蛋白质的基团。因而可制备含有聚氨基亚甲基膦酸基团和通过稳定共价键或可切键连于蛋白质的基团的arborol。

含胺的并且能连于蛋白质的基团的直链或支链其它的聚合物也曾作过描述[V.P.Torchilin  et  al.，Byull.Eksp.Biol.Med.102，63-65（1986）]。通过上面描述的方法可以将这样的含聚胺的聚合物转化成含聚氨基亚甲基膦酸基团的聚合物。

通过调节蛋白质对含聚氨基亚甲基膦酸簇的反应基团的化学计量，可以改变蛋白质的类型。通过调节引入含反应基团键合物的步骤期间的化学计量，可将簇形化合物连接到两个相同或不同的蛋白质分子上。

J.替代方法为了将聚氨基亚甲基膦酸BFCA有选择性地连于GF上的不重要的胺基，可以通过先将GF与来自细胞的可溶性或固体支持的固定的形式的受体混合形成GF-受体聚集体来完成。然后该聚集体可再与过量的反应形式的聚氨基亚甲基膦酸BFCA反应。因为GF键合到受体上，因此只有不涉及与GF受体相互作用的胺基可被修饰。以这种方式修饰的GF在活体与其受体作用产生生物活性。在修饰的GF和受体之间的聚集体则可分裂成新的选择性修饰的GF和可再用的受体，它分离之后会产生仍能识别受体的全活性修饰GF。

式Ⅰ化合物可以几种不同途径制备。例如，可将AP部分与L反应形成L-AP部分;然后L-AP部分连到CL上;再将CL-L-AP基团连于GF。另一种情况下，将GF与CL反应形成GF-CL部分;此GF-CL再与L-AP反应形成式Ⅰ化合物。GF的修饰程度由式Ⅰ的q项描述，它由调节GF，CL和L-AP分子之间反应的浓度，时间，温度，PH，和化学计量而试验性地得到。

剂型本发明的剂型为固体或液体形式。这些制剂可以成为直接使用的单个物质提供，或是以在使用前的适当时机将两种成分混合的两种或更多的物质（例如，药盒形式）提供。不论是预混还是药盒，剂型都会需要医药学上可接受的载体或助剂。

本发明的化合物还可以非肠道给药，即，皮下，静脉内，肌内，或腹腔内，成为带有药物载体的生理上可接受稀释剂中化合物的可注射剂。所述的药物载体可以是如下的消毒液体或液体的混合物，如水，盐水，葡萄糖水溶液和相关的糖水溶液，醇如乙醇，异丙醇，或十六醇，甘油如丙二醇或聚乙二醇，甘油缩酮如2，2-二甲基-1，3-二噁烷-4-甲醇，醚如聚（乙二醇）400，油，脂肪酸，脂肪酸酯或甘油酯，或乙酰化脂肪酸甘油酯。上述载体加或未加医药学上可接受的表面活性剂如肥皂或洗涤剂;悬浮剂如果胶，碳聚物（carbomer），甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，或羧甲基纤维素;或乳化剂和其它药物助剂。

可用在本发明非肠道制剂的油的例子为石油，动物，植物油，或合成得的油，例如，花生油，豆油，芝麻油，棉籽油，玉米油，橄榄油，凡士林，和矿物油。适合的脂肪酸包括油酸，硬脂酸，和异硬脂酸。适合的脂肪酸酯为，例如，油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。适合的肥皂包括脂肪碱金属，铝，和三乙醇胺盐和适合的洗涤剂包括阳离子洗涤剂，例如，二甲基二烷基铵卤化物，烷基吡啶鎓卤化物，和乙酸烷基胺;阴离子洗涤剂，例如，磺酸的烷基、芳基、和链烯酯，硫酸和硫代琥珀酸的烷基，链烯基，醚和单甘油酯;非离子洗涤剂，例如，脂肪胺氧化物，脂肪酸烷醇酰胺，和聚环氧乙烷聚丙烯共聚物，和两性洗涤剂，例如，烷基-β-氨基丙酸，和2-烷基-咪唑啉季胺盐，及其混合物。本发明的非肠道组合物一般含有溶于溶液的按重量计约0.001%至约10%的式Ⅰ化合物。采用防腐剂和缓冲剂也是有益的。为减小或消除注射部位的刺激感，该组合物可含有具约为12至约17的亲水-亲油平衡值（HLB）的非离子表面活性剂。该表面活性剂可以是具有上述HLB的单个成分或可以是具有所需HLB的两或多个成分的混合物。用在非肠道制剂中的表面活性剂的例子为聚乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯类，例如，脱水山梨醇单油酸酯。

其它可能的式Ⅰ化合物制剂包括：口服剂，采用已知的口服药物制剂，其中一些可含过量的氢氧化镁[P.J.Neuvonen  et  al.，Eur.J.Clin.Pharmacol.35，495-501（1988）]，采用已知的B.Kari，Diabetes  35，217（1986），B.R.Meyer  et  al.，Clin.Pharmacol.Ther.44，607（1988）的方法的透皮释放;采用将化合物吸收到活性炭颗粒上，再移植或注射的移植剂[A.Hagiware，Gan  to  Kagaku  Ryoho  15，1038-1042（1988）或Chem.Abst.109：156158n（1988）];和经鼻释放，或单独或与增渗剂组合[W.A.Lee.Bio  Pharm.22-25（Nov/Dec，1990）或Wall  Street  J.B1，（1989年8月16日）]以及由R.Langer，Sci  249，1527-1583（1990年9月28日）所描述的。制剂也可以通过直接局部施用法局部施于受伤或亏损骨处。后一种方法需要外科医生暴露受伤或亏损骨的位置。

采用本发明化合物的骨再生比没处理（即，不施用外源药剂）或用同样水平的未修饰生长促进因子（即，只是式Ⅰ的GF）处理所得的更有效。由于GF产品费用相对高以及当以高剂量全身释放时GF产生不利毒性影响的潜在能力，也需要使用配合物以保证释放至所需的位点并且减少GF总剂量和其对哺乳动物的毒性作用。

根据本发明的哺乳动物（特别是病人）的再生骨的方法，给哺乳动物施药时或是通过直接施于受伤或亏损骨区，或是非直接施用，例如，经全身循环（如下列非肠道，肌内或皮下注射）有效量的包括式Ⅰ化合物的组合物。

用于帮助GF骨内释放的式Ⅰ的（CL）2-L-AP的需要量可以是任何有效量。为治疗任何需要这种释放系统的疾病所施用的式Ⅰ化合物的量可根据以下因素有很大的变化：所采用的具体剂量单位，疗程，被治疗患者的年龄和性别，被治疗的病症的性质和程度，和其它医学专业人员熟知的因素。此外，式Ⅰ化合物可与其它已知的用于治疗骨疾病的药剂组合使用。

根据本发明施用的式Ⅰ化合物的有效量通常为约0.005至50mg/Kg患者体重，且施用的次数可以是每天一次或多次。式Ⅰ化合物可以如上述的医药物受剂型给药。式Ⅰ化合物可具有一或多个不同活性化合物，同时或顺序给药;且这些化合物可与其它已知的再生骨活性药剂一起给药。

本发明将由下列实施例的考虑因素作进一步阐明，它旨在纯粹解释本发明。

定义本发明实施例和未在上文定义的术语如下：BMP＝骨形态形成蛋白质BSA＝牛血清白蛋白FCS＝胎牛血清HPLC＝高压液相色谱HSA＝人血清白蛋白PBS＝磷酸盐缓冲盐水RP-HPLC＝反相HPLCSCN-BDTMP＝4-异硫代氰酰苄基二亚乙基三氨基五亚甲基膦酸除下列说明的外，所有的溶剂和试剂从商业厂家获得未再纯化。

所有的水都通过Barnstead NANOpureTM离子交换/碳床水纯化系统并具有约18.5兆欧的电阻率乙酸为由Aldrich  Chemical  Co.得的纯度大于99.99%的冰乙酸1%HSA的1.0ml等份在PBS（20mM磷酸盐，PH  7.4，0.15M  NaCl）中的试样是从Institute  of  Molecular  Biology.Inc.（IMB）而得的冰冻物125I-PDGE由IMB得到（以135ml等份试样冰冻，它含100μg非放射性IGF和26.5μCi无载体125I-PDGF），以及未标定的纯化重组PDGF-BB和IGF-I，以上均溶于0.1M乙酸中用来洗涤或浓缩蛋白质水溶液的10，000和3，000分子量截止的是CentriconTM滤膜（Amicon Division of W.R.Grace and Co.）生长因子修饰一般方法纯化的重组人PDGF-BB和重组人IGF-I及其分别的放射性碘形式由Institute  of  Molecular  Billogy，Inc.提供。由氨基酸组合物和胺未端氨基酸序列确定PDGF-β和IGF-I的特性。基本上根据Eveleigh和Winter的方法[J.W.eveleigh  and  G.D.Winter，“Amino  Acid  Composition  Determination”Protein  Sequence  Determination，pp.91-95（1970）]通过气相水解蛋白质接着用RPHPLC确定氨基酸组合物。基本上根据Hunkapiller和Hood的方法[M.W.Hunkapiller  and  L.E.Hood，Methodsin  Enzymology  91，486-489，（1983）]通过Edman降解然后通过HPLC制备和分析PTH氨基酸来确定胺末端氨基酸序列。采用考马斯蓝的扫描光密度计和银色染色的SDSPAGF凝胶和RP-HPLC确定纯度。

原料实施例APDGF-BB和IGF-I的制备由标准重组DNA技术生产并按常规色谱法纯化PDGF-BB和IGF-I。两种方法都是本行业熟练技术人员熟知的。（PDGF：美国专利4，061，757和5，045，633;IGF-I：Y.Sato  et  al.，J.Biochem.101，1247-1252（1987）和Wong  et  al.，Gene，68，193-203（1988）。

PDGF-BB（由IMB提供）的1至20胺末端氨基酸残基分析得到单一，完整的胺未端且与由cDNA序列预计的那些残基一致。

人IGF-I（由IMB提供）的1至53的胺末端残基的序列分析产生单一完整的与cDNA序列预计的那些残基一致的胺末端。发现该氨基酸组合物与按完整的人IGF-I基因预计的一致。两种生长因子纯度都大于95%。

实施例BPDGF-BB和IGF-I的生物活性每种因子的效力或生物活力由细胞培养促有丝分裂试验（cell  culture  Mitogenic  assay）测定，其中将半数最大刺激有效剂量[ED50]定义为一个单位。两种生物测定都是根据测定[3H]-胸苷掺入BALB/C3T3小鼠成纤维细胞的DNA。将添加10%FCS的DMEM中的3T3细胞以每孔2500个细胞接种入96孔测定板。使用前将测定板培养（37℃）七天。这使血清成分去除并导致在细胞中静止。PDGF-BB生物测定中在第七天下午加入标准物和测试样品，重复三次，并让其培养过夜持续18小时。然后将细胞暴露于1.0μCi的3H-胸苷6小时，该胸苷是根据FDGF的生物活性掺入的。

在IGF-I的生物测定中，在加入测试样品和标准物之前，将细胞与PDGF-BB预培养。预培养能使细胞在有表皮生长因子（EGF）存在加入IGF-I时对IGF-I反应。在一整夜培养期过后，将细胞与根据IGF-I的生物活性掺入的1.0μCi3H-胸苷混合。

在PDGF-BB和IGF-I的两种测定中，粗略洗涤之后，将细胞进行细胞溶解并在液体闪烁计数器上定量。所得的数据绘成剂量应答曲线，由此可以完成单位活性测定。

将适宜测定中导致50%最大细胞反应的（ED50值）的GF浓度定义为一个单位。将PDGF和IGF-I测定中最大反应定义为对5%胎牛血清（GCS）标准物的细胞反应。根据促有丝分裂的单位数除以氨基酸分析测定的质量计算出特异的活性。蛋白质修饰前的PDGF-BB和IGF-I的效力为1至3ng/mL（PDGF-BB参见图3，IGF-I参见图4）。典型地，特异活性在3至10×105单位/每毫克蛋白质的范围内。

实施例C放射性标记的125I-PDGF实施例A中描述的“冷”PDGF用[125I]-Bolton Hunter方法标记，该法主要标记可接近的赖氨酸和N-末端残基的伯胺。也可从NEN在市场上购买得到125I-PDGF。NEN通常提供的125I-PDGF是在含1%BSA作载体蛋白质的柠檬酸钠缓冲盐水溶液中的。使用前，必须从市场上购买的125IPDGF去除该BSA以使PDGF有效修饰。为产生无载体的125I-PDGF，采用抗体亲合色谱。固定的抗PDGF抗体（由IMB提供）显示特异结合到AB和BB PDGF异构体，并且不结合到AA同二聚体上。将42.6μCi125I-PDGF的中性PH缓冲液加到200μL抗PDGF柱上。用PBS将BSA从柱上彻底冲洗掉并且用0.1M乙酸洗脱125I-PDGF。根据35μCi/μg的特异活性，估计125I-PDGF的具体机率平均为每1.8个PDGF二聚体连一个[125I]。

实施例D放射标记的125I-IGF采用乳过氧化物酶或氯胺T方法（该方法将酪蛋白残基碘化形成碘酪氨酰产物）对上述“冷”IGF进行[125I]标记。125I-IGF-I可以从NEN购买到。所提供的125I-IGF-I是无载体的，并且从100μLPH45的100mm柠檬酸钠中冷冻干燥。根据208μCi/μg的特异活性，对125I-IGF-I机率进行平均估价，每1.4个IGF-I蛋白链连有一个[125I]。

实施例E两种PDGF溶液的制备将含有放射活性PDGF的小瓶放入进行了125I调节的Capintec剂量校准器的孔中。用200μL 0.1M乙酸洗涤含有50μg PDGF的小瓶，并加至含有在135μL 0.1M乙酸中的100μg冷IGF和125I-PDGF的小瓶中。用多于7份的200μL0.1M乙酸洗涤含有冷IGF的小瓶，合并洗涤液，得到含有放射性与非放射活性PDGF和非放射活性IGF的一个样品。振摇合并的样品小瓶至混合，移出两等份溶液，每份750μl。将每等份样品置于centricon10的分离膜上，标上1和2。取出适当的体积与γ读数，并在分离此样品之前和之后对所取出样品的体积和放射活性进行检验。将两等份样品离心旋转，并放入新的已标定重量的过滤杯中。

然后用1.0mL  3.0M碳酸氢钠缓冲液处理每份膜过滤物（1和2），并再次离心。除去两只过滤杯，用新的已标定重量的过滤杯代替。两只膜保留的样品读数均为10.5μCi。然后用另外的1.0mL  3.0M碳酸氢钠缓冲液处理两份膜过滤物，并再次离心。除去两只过滤杯并用新的已标定重量的过滤杯代替。膜上两种样品的读数均为10.5μCi。进行上述洗涤步骤以除去可透过膜的载体非放射活性IGF。膜上剩余的物质是容易共轭的。

实施例F制备H2N-BDO3TMP将513g（1.3mmol）游离碱1-（α-羧基-2-甲氧基-5-硝基苄基）-1，4，7，10-四氮杂环十二烷加至搅拌的776mg（4.7mmol）亚磷酸三乙酯与141mg（4.7mmol）仲甲醛的浆料中。将所得浆料在搅拌下加热至95℃2小时，冷却至室温并真空浓缩，得到粘稠的油。用碱性氧化铝柱对该油进行色谱，用氯仿洗脱，然后蒸发溶剂，得到淡黄色粘稠油状的酯（55%），即1-（α-羧基-2-甲氧基-5-硝基苄基）-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-4，7，10-三亚甲基膦酸六乙酯。

用3mL浓盐酸在100℃将250mg（0.3mmol）该酯搅拌水解18小时。将该水溶液冻干，得到奶色固体1-（α-羧基-2-甲氧基-5-硝基苄基）-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-4，7，10-三亚甲基膦酸（O2N-BDO 3TMP）（80%）。

将100mg的部分H2N-BDO 3TMP溶于20ml水中。用氮气净化反应体系后，加入120mg 10%Pd/C，并在持续的剧烈搅拌下将此悬浮液置于氢气氛下。3小时后经过滤除去催化剂，冻干滤液得到89.1mg巧克力色固体H2N-BDO 3TMP。将89.1mg H2N-BDO 3TMP溶于4.26mL水中，制备该配体的23.4mM溶液。

实施例G制备SCN-BDTMP（1）向100mL三颈烧瓶中装入2.0g（5.76mmol）1-（4-硝基苄基）-二乙三胺三盐酸盐[采用M.W.Brechbiel等人在Inorg.Chem.25，2772-2781（1986）中所述方法制备]。另外制备10.93g（0.108mol）浓HCl和6.91g（0.086mol）亚磷酸的溶液并加至反应瓶中。反应瓶装有温度计、回流冷凝器和搅棒。在持续搅拌下使反应溶液回流。向加液漏斗中癍入12.0g（0.144mol）37%（重量）甲醛溶液，漏斗接在反应瓶上，以大约1mL/分钟的速度向加热的混合物中滴加甲醛溶液。反应物再保持回流16小时，然后在真空下减小其体积，得到琥珀色半固体。将该固体溶于约2mL水中，并在剧烈搅拌下滴加至约800mL甲醇中。过滤除去所得白色沉淀并在45℃干燥，得到2.32g（57%）米色固体粗产品1-（4-硝基苄基）-二亚乙基三胺五亚甲基膦酸（O2N-BDTMP）。

（2）在1.5cm  Q-Sepharose（Pharmacia）阴离子交换柱上纯化500mg的1-（4-硝基苄基）二乙三胺五亚甲基膦酸部分粗品，用0-1M乙酸铵梯度洗脱。所需产物1-（4-硝基苄基）二亚乙基三胺五亚甲基膦酸在UV280nm具有最大保留峰。收集最后的洗脱峰，得到约43mL含纯产物的溶液。将该体积减小至约26mL并用200mg  10%Pd/C处理。该悬浮液置于氢气氛下并剧烈搅拌约2.5小时。HPLC（阴离子交换，经30分钟以2mL/分钟的速度用0-1M乙酸铵梯度洗脱）表明还原产物略微移向了较短保留时间。然后将悬浮液过滤，冻于滤液得到259mg白色玻璃状固体。HPLC表明其纯度为92%。经上述制备阴离子交换色谱进一步纯化该产物，得到144mg白色固体1-（4-氨基苄基）二亚乙基三胺五亚甲基膦酸的铵盐，阴离子交换HPLC表明其纯度＞95%。该产物进一步的特征如下。

去偶P31NMR表明了预期2∶2∶1比率的3个单峰。

1H NMR（D2O）δ  2.59-3.67（m，17H），4.13（b，2H），6.91（d，2H），7.21（d，2H）.

13CNMR（D2O）δ  52.0，52.6，53.3，53.4，54.1，54.9，55.8，57.1，57.1，58.3，58.3，65.2，120.5，131.1，133.5，146.8.

（3a）将146mg  1-（4-氨基苄基）二亚乙基三胺五亚甲基膦酸溶于1.913mL水中制备0.09M该酸的铵盐溶液。将328μL的部分该溶液（含约25mg该膦酸）置于含1mL水和1mL氯仿的10mL小瓶中。向所形成的乳液中加入100μL硫光气，并剧烈搅拌约1小时。除去氯仿层，并且用水提取的水溶液部份用4份1mL的氯仿萃取。将该产物的洗涤水溶液在干冰/丙酮浴中冷冻并冻干得到26.5mg疏松的白色粉末。将其中的0.5mg溶于200μL水中。用3.8mL水稀释6μL该溶液，并且所得UV谱表明最大吸收在270和283nm处，证实了该产物为1-（4-异硫氰基苄基）二亚乙基三胺五亚甲基膦酸（SCN-BDTMP）。

（3b）将43mg（51μM）的部分1-（4-氨基苄基）二亚乙基三胺五亚甲基膦酸溶于2mL水中，并与1mL氯仿混合。向搅拌着的该溶液中一次加入150μL硫光气。剧烈搅拌2.5小时后除去氯仿层，并用水提取的水部份、用三份3mL氯仿萃取。将洗涤的产物水溶液在干冰/丙酮浴中冷冻，并冷冻干燥得到45.4mg疏松的白色粉末。将其中2.4mg溶于960μL水中。用3.8mL水稀释6μL该溶液，并且所得UV谱表明峰值在272和282nm处，证实了该产物为1-（4-异硫氰基苄基）二亚乙基三胺五亚甲基膦酸。

（3c）制备3.47mM和34.7mM的SCN-BDTMP溶液将100mg的部分（1.389×10-5mol）SCN-BDTMP溶于400μL 0.3M碳酸氢钠缓冲液中。所得溶液PH为7.51，通过加入5μL 50%（重量）氢氧化钠将PH调至9.48。终溶液为34.7mM SCN-BDTMP。

将5μL如上述制备的34.7mM  SCNBDTMP溶液加至45μL0.1M碳酸氢钠中并彻底混合。终溶液为3.47mM  SCN-BDTMP。

实施例H制备四种IGF溶液分别用100μL水重新配制每瓶100μL冻于放射标记125I-IGF-I（得自NEN）或冻干重组IGF-I（得自IMB），得到1mg/mL IGF溶液，该溶液在20mM Tris-HCl中含有0.5M氯化钠，并含有0.25%BSA作载体蛋白。将重组IGF瓶中的内容物溶于10mM乙酸中，并转入含有溶解在535mg 10mM乙酸中的碘化IGF的玻璃血清瓶中。将合并的含有微量125I-IGF-I的IGF溶液用每次1L的10mM乙酸透析三次（Spectra/Por 7TM膜，得自Spectrum Medical Industries）。将透析袋中的内容物分成四份相等的体积，并放在4只分离的CentriconTMmicrocon-centrator膜过滤器中（可透过3000分子量）然后旋转CentriconTM使溶液浓缩，用PH＝9.48的1.6mL 0.3M碳酸氢钠缓冲液洗涤膜中的内容物一次。该方法制成4种CentriconTM膜单位，所含IGF的量如下所示：IGF<

>＊大约实施例Ⅰ制备两种IGF溶液将每等份150μL的冷冻放射标记的125I-IGF（其中在0.1M乙酸中含有300μg IGF-I和23.6μCi无载体125I-IGF）解冻，然后用0.1M乙酸稀释成终体积约1.5mL。将每等份700μL的该溶液分别置于两只CentriconTMmicroconcentrator膜过滤器上（可透过3000分子量）然后旋转该CentriconTM使该溶液浓缩，连续两次用PH＝9.48的每份1mL的0.3M碳酸氢钠缓冲液洗涤膜中的内容物。IGF的计算量（包括微量125I-IGF）在1号膜上为130μg（1.7×10-8mol），在2号膜上为127μg。

实施例J制备1，3-丙二胺-N-（羧基丙基）-N，N′，N′-三亚甲基膦酸（PDTMP）

化合物PDTMP的结构如下式所示：

将商品级的3-氨基丙基-2-吡咯烷（5.0g）缓缓加至在6M盐酸（50mL）中的亚磷酸（9.7g）溶液中。将此黄色溶液加热至回流，并用2小时滴加福尔马林（9.23ml 37%溶液）进行处理。再回流18小时后将溶液冷却并除去溶剂，得到粘稠的油。将此油滴入200mL甲醇中，过滤并干燥后得到5.15g PDTMP。该化合物在去偶31P-NMR谱的8.2ppm和7.5ppm（相对于H3PO4）处显示出预期的比率为2∶1的两个单峰。

该方法可以用作式Ⅰ中的配体AP，其中L与COOH基团连接。

实施例K制备乙二胺-N-（4-氨基苯乙基）-N，N′，N′-三亚甲基膦酸（APEDTMP）化合物APEDTMP的结构如下式所示：

向三只250mL Erlenmeyer烧瓶中装入120mL乙二胺（EDA），烧瓶装有装在搅拌上的拌棒。称出三份10g的对硝基苯乙基溴样品，并用30分钟将其缓缓加至含EDA的搅拌着的烧瓶中。在加入对硝基苯乙基溴之后，将这些烧瓶在室温搅拌过夜（16小时）。将烧瓶中的内容物转入一只500mL圆底烧瓶中并接上样品蒸馏装置。在28-32℃和真空下从所需产物中蒸馏过量的EDA。将大多数起始EDA除去后，将粘稠的油溶于水中并用75mL二氯甲烷（CH2Cl2）萃取三次。合并CH2Cl2层并旋转蒸发浓缩，得到29.34克粘稠的黑色油状液体。

将所有这些样品与100mL  1.5M  HCl一起加入500mL圆底烧瓶中。用活性炭、加热至90℃处理水层，然后经纸滤器过滤。真空汽提水层并在真空干燥器中干燥过夜。

用冷甲醇洗涤所得干燥的固体并过滤，得到15.60g  N-（对硝基苯乙基）乙二胺盐酸盐。蒸发滤液并用甲醇洗涤得到另外6.77g产物，总产率为72%。

向一只250mL三颈烧瓶中装入20.0g（0.063moles）N-（对硝基苯乙基）乙二胺盐酸盐。向该烧瓶中加入9.0g去离子水和在17.16g（0.209moles）亚磷酸的溶液中的22.79g（0.219moles）浓盐酸。

将该烧瓶与一个回流冷凝器连接，装上一个装在搅拌器上的搅棒。在一支10mL注射器中装入17.74g（0.219moles）37%甲醛溶液并与预先标定的注射器泵连接，使其以0.1mL/分钟的流速传送。使反应溶液达到回流温度，然后在持续搅拌下用3小时向该烧瓶中缓缓加入甲醛溶液。

加入甲醛溶液后使反应回流，并再搅拌3小时。使反应冷却并真空除去水，得到粘稠的黑色固体。将其慢慢加至甲醇中得到淡棕色固体。将该沉淀过滤并干燥，得到20g（产率65%）N-（对硝基苯乙基）乙二胺-N，N′，N′-三亚甲基膦酸。将10g该三膦酸样品溶于20mL水中并用2mL浓氢氧化铵中和。然后用反相制备HPLC纯化该粗品铵盐，用水洗脱。将按此方法纯化的N-（对硝基苯乙基）乙二胺-N，N′，N′-三亚甲基膦酸（710mg，1.21μmoles）样品溶于50mL水中并置于可容235mL体积的氢气瓶中。向该瓶中渐渐吹入氮气以替换空气。加入约50mg10%披钯碳作为催化剂，用水洗掉容器侧面的催化剂。一旦所有催化剂位于水下，将充满氮气的瓶置于Parr氢化振荡器装置上。真空除去氮气后引入氢气。重复这种冲洗以确保所有氧气被除去。最后充入氢气使压力达35psi。通过振摇该瓶开始氢化并继续振摇直至停止摄取氢气（2.5小时）。可以使用此压降和已知的氢气体积以计算所用氢气的摩尔数，在此例中是理论值的99.2%。将反应混合物（从减压氢化装置中移出后）经玻璃漏斗小心地真空过滤，每次用25mL水洗涤所分离的催化剂四次。然后将合并的水滤液冷冻并冻干过夜，得到580mg（产率86%）N-（4-氨基苯基）乙基乙二胺-N，N′，N′-三亚甲基膦酸的铵盐（APEDTMP）。

该化合物的去偶31P-NMR谱分别显示出预期的1∶2比率的在8.0ppm（相对于H3PO4）处的单峰和在16.9ppm处的单峰。

该化合物可以用作式Ⅰ中的配体AP，其中L与NH2基团连接。

实施例L制备1-（羧基）乙二胺四亚甲基膦酸（CEDTMP）化合物CEDTMP的结构如下所示：

向在6M盐酸（50mL）中的亚磷酸（12.9g）溶液中加入5.0g 2，3-二氨基丙酸二盐酸盐（Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI）。将该溶液加热至回流，并用45分钟加福尔马林（37%甲醛水溶液，12.3mL）进行处理。再回流18小时后，除去溶剂，将油溶于甲醇（20mL）中。然后边搅拌边将该溶液加至无水乙醇（200mL）中，得到细沉淀。然后过滤并干燥此固体，得到7.37g CEDTMP。将一份该溶液稀释10倍并通过高效液相色谱（HPLC）进行分析。HPLC在DionexTM2010;Ion Supression Chromatography System（Sunnyvale，CA）上用AS-7阴离子交换柱（8mm×25cm）进行，并且以0.6mL/分钟的流速用0.03M硝酸洗脱，在330nm处进行紫外测定监测。该化合物的保持时间为10.11分钟。

该化合物可以用作式Ⅰ中的配体AP，其中L与COOH基团连接。

实施例M制备1-（4-氨基苯基）乙二胺四亚甲基膦酸（ABEDTMP）化合物ABEDTMP的结构如下式所示：

向50mL圆底烧瓶中加入0.6g（0.2256moles）1-（4-硝基苄基）乙二胺和浓HCl（1.24g，0.0118mole），然后加入亚磷酸（0.0925g，0.0113mole）。使该溶液回流，然后用90分钟滴加0.956g（0.0118mole）30%甲醛进行处理。然后使反应保持回流过夜，冷却至室温后滴加至100mL冷甲醇中。过滤并干燥所得沉淀，得到1-（4-硝基苄基）乙二胺四亚甲基膦酸，将其在氢化瓶中溶于60mL水中。加入50mg5%披钯碳样品，将此瓶与Parr氢化装置连接并振摇直至停止摄取氢气。过滤该溶液以除去催化剂，将所得澄清的滤液冷冻并冻干得到1.28g（86%）1-（4-氨基苄基）乙二胺四亚甲基膦酸。该化合物得到预期的去偶31P-NMR谱。

该化合物可以用作式Ⅰ中的配体AP，其中L与NH2基团连接。

实施例N制备N4-（对氨基苯基）-降亚精胺（norspermidine）如US2809985中所述制备[二（氰基乙基）]（对氨基苯基）胺。将9.0g（42mmol）该二腈样品溶于90mL乙醇和10mL50%NaOH中，并用6g  Raney镍（w-2级）处理，置于氢气氛下并振摇。持续振摇直至停止摄取氢气，此时滤除催化剂。真空减小滤液的体积成为粘稠的油，将其溶于40mL  50%NaOH，并且每次用75mL氯仿萃取三次。用硫酸钠干燥合并的氯仿层，倾析并真空旋转蒸发，得到7.2g（产率77%）标题化合物。通过质子NMR使产物表示其特征。

该化合物可以用作式Ⅰ中的配体AP，其中L与NH2基团连接。

实施例O制备N″（4-氨基苯基）-二亚丙基三胺-N′，N′，N′″，N′″-四亚甲基膦酸（APIPMP）化合物APIPMP的结构如下式所示：

将实施例N中制备的N4-（对氨基苯基）降亚精胺（3.65g，16.4μmoles）加至25mL水中，用6.2g（75.6mmoles）亚磷酸在13mL（163mmoles）浓HCl中的溶液进行处理。将所得深蓝色溶液加热至100℃，并用2.75小时滴加5.9g（73mmoles）37%（重量）甲醛水溶液处理。使溶液再保持回流15小时，然后冷却至室温并滴入乙醇中。将所得棕色沉淀真空过滤并滴入乙醇中。将所得棕色沉淀真空过滤并真空干燥，得到3.84g（产率40%）棕色固体标题化合物（APIPMP）。当如实施例1所述在阴离子交换HPLC系统上进行分析时，所得产物的保留时间为5.50分钟（小峰）和10.50分钟（主峰）。

该化合物可以用作式Ⅰ中的配体AP，其中L与NH2基团连接。

实施例P制备N″-（4-氨基苯乙基）二乙三胺-N′，N′，N′″，N′″-四亚甲基膦酸四钠盐（APDTMP）化合物APDTMP的结构以下式表示：

将二乙三胺（20g，0.045mole）溶于200mL甲苯中，用对硝基苯乙基溴（10g，0.89mole）在150mL甲苯中的溶液处理5分钟。搅拌3小时后从胶质固体中倾析出上清液，并用每份100mL的水萃取三次。将合并的水层真空减小至很小的体积，并用100mL氯仿反萃取。然后真空蒸发氯仿，得到9.32g（83%）N″-（对硝基苯乙基）二乙三胺。

将5g该胺样品溶于3N  HCl中，使PH小于2。将所得溶液注入过量甲醇中。过滤并真空干燥所得溶液，得到3g相应的盐酸盐。将1.3g（0.004mole）的部分该盐溶于20mL水中，并用亚磷酸（1.5g，0.018mole）和浓盐酸（2.0g，0.019moles）处理。使该溶液回流并滴加37%甲醛（1.5g，0.019moles）。再回流两小时后将该溶液冷却至室温并真空蒸发，得到粘稠的油。在剧烈搅拌下，将该油滴加至150mL甲醇中。过滤并真空干燥所得白色沉淀，得到1.65g（产率66%）N″-（4-硝基苯乙基）二乙三胺-N′，N′，N′″，N′″-四亚甲基膦酸。在实施例L所述HPLC方法中，该产物显示出保留时间为16.9分钟的单峰。

将700mg（1.1mmole）该化合物样品溶于44mL（4.4mmole）0.1N  NaOH中。向该溶液中加入悬浮于56mL水中的100mg  10%披钯碳，将整个反应混合物在剧烈搅拌下置于氢气氛下。在停止摄取氢气后，滤除催化剂并真空蒸发滤液，得到0.80g（产率100%）吸湿的黄色固体N″-（4-氨基苯乙基）二亚乙基三胺-N′，N′，N′″，N′″-四亚甲基膦酸四钠盐（APDTMP）。在实施例1所述的HPLC系统上该标题化合物显示出保留时间为5.95分钟的单峰。

该化合物可以用作式Ⅰ中的配体AP，其中L与NH2基团连接。

实施例Q制备4-异硫氰基邻苯二甲酸酐（ACL-3，酸可裂解键）

向4-氨基邻苯二甲酸（2.7183g，15.00mmol）和无水碳酸钾（8.75g，63.3mmol）在70mL四氢呋喃中的浆料中加入硫光气（2.30mL，30.18mmol）。将反应混合物在室温搅拌10分钟，然后加热回流1小时。冷却至室温后，将反应产物溶液经硅藻土过滤，然后在干燥的氮气流下以及在高效烟橱中（避免露出硫光气）浓缩至干。于是得到粗品4-异硫氰基邻苯二甲酸;1H NMR（300 MHz，丙酮-d6）d 10.22（br s，2H），7.81（br s，1H），7.61（s，1H），7.48（br s，1H）;13c NMR（75 MHz，丙酮-d6）d 167.8，167.7，138.3，135.8，134.4，131.7，131.7，128.6，126.5.

将所得4-异硫氰基邻苯二甲酸立即在三氟乙酸酐和二氯甲烷的混合物中、在氮气氛下加热回流2小时。冷却至室温后减压浓缩反应混合物。从30mL四氯化碳中重结晶所得固体，得到带褐色的紫色结晶4-异硫氰基邻苯二甲酸酐，产量为2.3778g（理论值的77%）。该标题化合物的熔点为106-108℃;

1H NMR（300 MHz，丙酮-d6）d 8.15（d，J＝8.1 Hz，1H），8.06（d，J＝1.7 Hz，1H），7.97（dd，J＝8.1，1.7 Hz，1H）;13c NMR（75 MHz，丙酮-d6）d 163.3，162.6 139.8 134.8，134.6，130.6，128.2，123.5，111.6;IR（CHCL3）2010（br），1840，1740 cm-1;MS m/e 205，161，133（碱），74.

终产物实施例1与比较例APDGF与SCN-BDTMP的共轭将400μL的部分34.7mM SCNBDTMP溶液（1.389×10-5moles）（实施例G中所制备的）加至1份实施例E产品中。该化学计量得到794∶1摩尔比的异硫氰酸基团/每个蛋白质上的氨基（样品1）。

将400μL的部分0.3M碳酸氢钠缓冲液加至2等份样品E产品中作为对照（比较例A）。

将样品1和2充分混合。将样品在室温留在膜上14.5小时。然后将样品全速离心使样品浓缩1小时。离心后，每份样品在膜上的读数为10.0μCi。在每只膜上加上1.0mL  0.1M磷酸钠缓冲液。旋动混合后，再次全速离心该样品40分钟。移去该滤液杯并用新的、已标定重量的过滤杯替换。每个样品在膜上的读数为9.9μCi。

向每个样品中加入740μL HSA溶液使膜上体积达到800μL。将各个溶液混合并转入新的、已标定重量的过滤杯中。用500μL 1%HSA洗涤各个膜单位。将CentriconTM单位加盖、倒过来并全速离心约10分钟，使膜上的保留物转入盖子中。将洗涤液吸入相应的过滤杯中。再用200μL HSA溶液洗涤CentriconTM盖，然后将其转入过滤杯中。各种最终溶液在1.42mL HSA和0.15M氯化钠中分别含有约18.5μg（1）和19.0μg（比较例A）。

实施例2每个IGF与一个SCN-BDTMP的共轭将10μL（3.47×10-8mole）3.47mM SCN-BDTMP溶液（实施例G中制备）加至实施例H的CentriconTMno.1（含约41.2μg IGF）中。另外加入pH＝9.35的390μL 0.1M碳酸氢钠缓冲液。然后充分混合残留在CentriconTM膜上的溶液，并在室温放置14小时。然后翻转旋转膜单位以移出膜上的成分。向其中加入158μL 0.1M碳酸氢钠使终体积达约600μL。

实施例3每个IGF与两个SCN-BDTMP的共轭将20μL（6.94×10-8mole）3.47mM SCN-BDTMP溶液（实施例G中制备的）加至实施例H的CentriconTMno.2（含约41.7μg IGF）中。另外加入pH＝9.35的390μL 0.1M碳酸氢钠缓冲液。然后充分混合残留在CentriconTM膜上的溶液，并在室温放置14小时。然后翻转旋转膜单位以移出膜上的成分。向其中加入86μL 0.1M碳酸氢钠使终体积达约600μL。

实施例4每个IGF与四个SCN-BDTMP的共轭将400μL（1.39×10-5mole）34.7mM SCN-BDTMP溶液（实施例G中制备）加至实施例H的CentriconTMno.3（含约45.7μg IGF）中。然后充分混合残留在CentriconTM膜上的溶液，并在室温放置14小时。然后翻转旋转膜单位以除去膜上的成分。向其中加入208μL 0.1M碳酸氢钠使终体积达约600μL。

比较例B实施例2、3和4的对照将pH＝9.35的400μL 0.1M碳酸氢钠缓冲液加至实施例H的CentriconTMno.4（含约47.7μg IGF）中。另外加入390μL pH＝9.35的0.1M碳酸氢钠缓冲液。然后充分混合残留在CentriconTM膜上的溶液，并在室温放置14小时。然后翻转旋转膜单位以移出去膜上的成分。向其中加入23μL 0.1M碳酸氢钠使终体积达约600μL。

实施例5每个IGF与四个SCN-BDTMP的共轭将400μL（1.39×10-5mole）34.7mM SCN-BDTMP溶液（实施例G中制备）加至实施例I的CentriconTMno.1（含约130μg IGF）中。然后充分混合残留在CentriconTM膜上的溶液，并在室温放置13小时。离心该膜单位使蛋白质溶液浓缩。加入缓冲液用0.5mL 0.1M磷酸钠缓冲液（pH＝7.4）洗涤膜上的残留物，然后离心1小时。然后加入572μL 1%HSA溶液、旋动和吸移除去CentriconTM上的残留物。再用0.5mL 1%HSA洗涤该膜以完全移去膜上的成分。所回收的合并溶液终体积约为1.5mL，估计在约1%HSA中含9.5μg/100μL修饰的IGF。

比较例C实施例5的对照将400μL 0.3M碳酸氢钠缓冲液（pH＝9.48）加至实施例I的CentriconTMno.2（含约127μg IGF）中。然后充分混合残留在CentriconTM膜上的溶液，并在室温放置13小时。旋转该膜单位使蛋白质溶液浓缩。通过加入缓冲液用0.5mL 0.1M磷酸钠缓冲液（pH＝7.4）洗涤膜上的残留物，然后在离心机上旋转1小时。通过加入855μL 1%HSA溶液、回荡和吸移除CentriconTM膜上的残余物。再用0.5mL 1%HSA洗涤该膜以完全移除膜上的成分。所回收的合并溶液终体积约为1.4mL，估计在约1%HSA中含9.5μg/100μL。

实施例6采用ACL-3用BDTMP修饰的IGF将175μL ACL-3（在200μL三氟乙醇中12.1mg的ACL-3，实施例Q中制备）加至在约500μL 0.3M碳酸氢盐缓冲液（pH＝9.5）中含约100μg IGF的CentriconTM上。所得pH为8.85。在室温15分钟后，离心CentriconTM单位直至体积降至约243μL（243mg重），此过程约需进行2小时。向该浓缩的溶液中加入约300μL ABDTMP溶液（7.1mg，在pH＝9.5的300μL碳酸氢盐缓冲液中10.5μmoles）。所得pH为9.27。将该溶液在室温放置46小时。测得pH为9.78，体积约为0.485μL。将其置于离心机（Clay-Adams）中6小时，使体积减至117μL。加入2mL 0.3M碳酸氢钠缓冲液，并再次离心该溶液。离心10小时后体积约为49μL。再加入500μL 0.3M碳酸氢钠并离心CentriconTM单位4小时，得到52μL终体积。加入547μL 0.1M磷酸钠缓冲液（pH＝7.02）并充分混合。CentriconTM单位中的总重量为599mg，或者其体积约为600μL。估计该样品中的浓度是每600μL溶液100μg IGF（16.7μg/100μL）。

比较例D实施例6的对照将175μL三氟乙醇加至在约500μL 0.3M碳酸氢盐缓冲液（pH＝9.5）中含约100μg IGF的CentriconTM中。所得pH为9.50。在室温15分钟后，离心CentriconTM单位直至体积降至约230μL（230mg重），此过程约需进行约2小时。向该浓缩的溶液中加入300μL 0.3M碳酸氢钠缓冲液。所得pH为9.46。将其在室温放置46小时。测得pH为9.79，体积约为397μL。将其置于离心机（Clay-Adams）中6小时，使体积减至27μL。加入2mL 0.3M碳酸氢钠缓冲液，再次离心该溶液。离心10小时后体积约为21μL。另外加入500μL 0.3M碳酸氢钠并离心CentriconTM单位4小时，得到27μL终体积。加入573μL 0.1M磷酸钠缓冲液（pH＝7.02）并充分混合。CentriconTM单位上的总重量为603mg，或者其体积约为600μL。估计该样品中IGF的浓度为每600μL溶液100μg IGF（16.7μg/100μL）。

实施例7采用ACL-3用BDTMP修饰的IGF将210μL等份IGF溶液（含微量125I标记的IGF的在缓冲液中的100μg IGF）置于CentriconTM膜过滤装置的膜上。将500μL 0.3M碳酸氢钠加至CentriconTM单位上，然后离心使膜上剩下不超过50mg。将膜上的成分（洗涤的IGF）溶于多于500μL的0.3M碳酸氢钠中，并用溶于300μL温热三氟乙醇的19.4mg ACL-3处理。将此样品放置15分钟后离心2小时。离心一结束将300μL体积的ABHDP（357μmoles）加至含修饰的IGF的CentriconTM单位上，将将该溶液放置约16小时。在此时PH保持在约10。然后将CentriconTM离心约4小时以减小体积。用500μL碳酸氢钠缓冲液稀释膜上所剩的物质（修饰的IGF），并通过离心再次浓缩。膜上所剩残余物的体积为221mg。向其中加入1.279mL 0.1M磷酸钠（pH＝7.02），使终体积总共达到1.5mL。然后将CentriconTM翻转旋转以移除膜上剩余的物质。将该物质用于实施例V中所示的鼠中生物分布研究。

比较例E实施例7的对照采用与实施例7相同的方法，只是加入温热的三氟乙醇不含连接ACL-3的化合物。

实施例8采用ACL-3用BDTMP修饰的PDGF将100μL PDGF溶液置于CentriconTM膜过滤装置的膜上。该PDGF溶液在每200μL 0.1M磷酸钠、0.01M柠檬酸钠、0.5M NaCl和1%牛血清白蛋白（pH＝4.6）中含10μCi的125I标记的PDGF（22μCi/μg）。向CentriconTM单位中加入500μL 0.3M碳酸氢钠，然后离心至在膜上仅剩50mg。将膜上的成分（洗涤的PDGF）溶于多于500μL 0.3M碳酸氢钠中。然后用36.7mg溶于300μL温热三氟乙醇中的ACL-3处理膜上所剩的物质，放置15分钟并离心2小时。离心一结束将300μL ABHDP（357μmoles）加至含修饰PDGF的CentriconTM单位上，并放置该溶液约16小时。此时pH保持在约10。然后离心CentriconTM约4小时以减小体积。用500μL碳酸氢钠缓冲液稀释膜上所剩的物质（修饰的PDGF），并通过离心再次浓缩。膜上所剩残余物的体积为329mg。向CentriconTM膜上加入1.171mL 0.1M磷酸钾（pH＝7.02），使终体积总共达到1.5mL。然后将CentriconTM翻转旋转以移除膜上所剩物质。该物质用于实施例Ⅵ中所示的鼠中生物分布研究。

比较例E实施例8的对照采用与实施例8相同的方法，只是加入温热的三氟乙醇不含连接ACL-3的化合物。

生物学实施例：生物分布实施例Ⅰ125I-PDGF-（SCN-BDTMP）使用重175-230g的Spraque-Daawley鼠，在注射前5天适应水土。通过尾静脉给这些鼠注射50μL实施例1的两种样品（样品1和比较例A）（约200，000cpm）。在2、6和18小时后通过颈脱位处死鼠，取出各组织、称重，并通过在装有与NaⅠ结晶偶合的多通道分析仪的闪烁计数器中记数5分钟测定各组织中的放射活性量。将各组织中的该数与50μL标准品中的数进行比较，以确定各组织中注射剂量的百分数。从标准品中减去尾随脉冲中的数，得到调节了尾随脉冲中测得量的所注射的百分剂量。得到背景数，并从组织数中减去背景数。通过将股骨中的百分剂量乘以25估测骨中的百分剂量。假定肌肉占鼠体重的43%而血液占鼠体重的6.5%，可以得到肌肉和血液数。这些对各个躯体部分调整的百分剂量是鼠模型可接受的值。[W.F.Goeckeler等人，J  of  Nucl.Med.28（4），495-504（1987）]。表Ⅰ中给出了该结果，除非另外指明，其中每个数据点代表五只鼠的平均值。

表Ⅰ调节了尾随脉冲中测得剂量的百分注射剂量

＊3只鼠的平均数＊＊4只鼠的平均数＊是比较A显然SCN-BDTMP与PDGF共轭导致PDGF靶向于骨。与天然的、未修饰的PDGF相比，SCN-BDTMP共轭的PDGF进入骨的功效超出8倍。此外，在骨中的残留时间增加了约30倍。

实施例Ⅱ125I-IGF-（SCN-BDTMP）使用重175-230g的Spraque-Daawley鼠，在注射前5天适应水土。通过尾静脉给这些鼠注射50μL实施例2、3、4或比较B的种样品之一。在30分钟后通过颈脱位处死鼠，取出各组织、称重，并通过在装有与NaⅠ结晶偶合的多通道分析仪的闪烁计数器中记数5分钟测定各组织中的放射活性量。将各组织中的该数与50μL标准品中的数进行比较，以确定各组织中注射剂量的百分数。从标准品中减去尾随脉冲中的数，得到调节了尾随脉冲中测得量的所注射的百分剂量。得到背景数，并从组织数中减去背景数。通过将股骨中的百分剂量乘以25估测骨中的百分剂量。假定肌肉占鼠体重的43%而血液占鼠体重的6.5%，可以得到肌肉和血液数。表Ⅱ中给出了该结果，其中每个数据点代表五只鼠的平均值。

表Ⅱ调节了尾随脉冲中测得剂量的百分注射剂量

通过式Ⅰ的AP加上所检测骨的数目的IGF的修饰程度取决于反应物的化学计量。结果总结于表Ⅲ中，其中每个数据点代表五只鼠的平均数。

表Ⅲ

显然该结果证明IGF-I向骨靶向释放可以通过SCN-BDTMP与IGF共轭实现。如表Ⅲ中所示，靶向的程度显然与修饰程度直接相关。

实施例Ⅲ125I-IGF-（SCN-BDTMP）重175-230g的Spraque-Daawley鼠在注射前5天适应水土。通过尾静脉给这些鼠注射50μL实施例5或C的样品。在2、6和18小时后通过颈脱位处死鼠，取出各组织、称重，并通过在装有与NaⅠ结晶偶合的多通道分析仪的闪烁计数器中记数5分钟测定各组织中的放射活性量。将各组织中的该数与50μL标准品中的数进行比较，以确定各组织中注射剂量的百分数。从标准品中减去尾随脉冲中的数，得到调节了尾随脉冲中测得量的所注射的百分剂量。通过将股骨中的百分剂量乘以25倍估算骨中的百分剂量。假定肌肉占鼠体重的43%而血液占鼠体重的6.5%，可以得到肌肉和血液数。表Ⅳ中给出了该结果，其中每个数据点代表四只鼠的平均值。

表Ⅳ调节了尾随脉冲中测得剂量的百分注射剂量

实施例ⅣIGF-I-（SCN-BDTMP）的生物活性对上述实施例的各个样品进行IGF-I促有丝分裂活性分析以测定其效能。该方案以能力渐进模型为基础，在该模型中分析细胞系以剂量依赖方式对各种含量的IGF-I产物应答。将鼠成纤维细胞系的细胞接种于96井分析板中并生长至融合导致静止。在加入样品和标准品之前，用PDGF-BB对细胞预先培养，使其当在EGF存在下加入IFG-I时能够对IGF-I产生应答。培养过夜后将细胞置于1.0μCi3H-胸苷中，根据加至分析孔中的IGF-I的量加入不同量的3H-胸苷。充分洗涤后，使细胞溶解，并在装有NaⅠ结晶偶合的多通道分析仪的闪烁记数器中计量。将所得数据制图，得到剂量应答曲线，由该曲线可以进行单位活性测定。

把一个单位定义为在上述分析中导致50%最大细胞应答的IGF-I浓度（ED50值）。最大应答定义为对5%FCS标准品产生细胞应答。由外原IGF-I引起的最大应答通常是基线的3-5倍。

在该分析稀释前，通过在操作之前已将示踪器插入储备样品的125I-IGF-I示踪测定IGF-I的浓度，对25μL储备样品和各25μL的该两种样品记数。在储备样品中IGF-I的每分钟记数（CPM）/μg的比率用于测定该两种样品中IGF-I的浓度以进行生物分析。各等份储备样品的平均值为5.135CPM/μg。通过CPM/μL测定各个样品的值并用每份储备样品的值5.135CPM/μg去除这个数。这些测量与计算得到以下值：实施例5样品为107.2μg/mL;实施例C为110.8μg/mL。该结果示于表Ⅴ中。

表Ⅴ

＊比较B＊＊比较C

实施例Ⅴ125I-IGF-ACL-3-BDTMP）将配有口径28号注射针的500μL注射器吸入一剂（150μL）实施例7和比较例E的物质，并对5只鼠给每只鼠的尾静脉注射。6小时后将鼠麻醉并解剖，以获取放射标记物的器官分布。由于所包括的放射活性量低，只对样品记数10分钟。在注射了实施例7的修饰IGF物质的鼠股骨中测得的最终记数（减去背景）是注射了比较例E的对照物质的鼠骨股中所测记数（减去背景）的3.8倍，如下面表Ⅵ所示。

表Ⅵ

实施例Ⅵ125I-PDGF-ACL-3-BDTMP）将配有口径28号注射针的500μL注射器吸入一剂（100μL）该物质，并对5只鼠给每只鼠的尾静脉中注入Centicon  1（实验）和Centicon  2（对照）。6小时后将鼠麻醉并解剖，以获取放射标记物的器官分布。由于所包括的放射活性量低，只对样品记数10分钟。在注射了Centricon  1（实验）物质的鼠股骨中测得的最终记数（减去背景）是注射了Centricon  2（对照）物质的鼠骨股中所测记数（减去背景）的3.8倍，如下面表Ⅶ所示。

表Ⅶ

该数据表明用本发明所述技术GF修饰导致生物活性GF骨靶向释放。

尽管参照优选的具体方案已对本发明进行了描述，但是本领域的普通技术人员在阅读并理解了该说明书之后显然可以对其进行不背离上文所述或下文所要求的本发明精神与范围的改变与修改。