适于家蚕丝腺表达的改造人酸性成纤维细胞生长因子基因及其表达系统和应用专利检索-成纤维细胞解剖与生理专利检索查询-专利查询网

积极推动地理标志专门立法

2022-03-10 地理标志，立法，知识产权
保护知识产权是对创新最大的激励

2022-03-10 保护知识产权，创新，激励
谢商华：加快制定知识产权基本法

2022-03-10 知识产权基本法
擦亮“双奥之城”品牌

2022-03-10 双奥，知识产权
让冰雪运动“热”力全开

2022-03-10 冰雪运动，知识产权
携手共奋进　走好强国路

2022-03-10 强国，知识产权
坚持创新引领　方能稳中求进

2022-03-10 创新，稳中求进，知识产权
答好“两张卷” 奋进新征程

2022-03-10 知识产权
专家解读政府工作报告中的创新和知识产权相关部署

2022-03-10 政府工作报告，创新，知识产权
今年政府工作报告指出：加强知识产权保护和运用

2022-03-10 政府工作报告，知识产权保护

适于家蚕丝腺表达的改造人酸性成纤维细胞生长因子基因及其表达系统和应用

阅读：182发布：2021-03-02

IPRDB可以提供适于家蚕丝腺表达的改造人酸性成纤维细胞生长因子基因及其表达系统和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了适于家蚕丝腺表达的改造人酸性成纤维细胞生长因子基因及其表达系统和应用，改造人酸性成纤维细胞生长因子基因如SEQ？ID？NO.1第7-450位所示，其编码的氨基酸如SEQ？ID？NO.2所示，将改造人酸性成纤维细胞生长因子基因与分泌型丝胶1基因启动子和分泌型丝胶1基因终止子构成表达框，并用增强子hr3增强表达，同时连入piggyBac转座臂和荧光筛选标记基因构建表达系统，该表达系统能够在家蚕丝腺中高效表达重组人酸性成纤维细胞生长因子，并且具有生物活性，能够用于大规模生产重组人酸性成纤维细胞生长因子，具有良好的市场前景。，下面是适于家蚕丝腺表达的改造人酸性成纤维细胞生长因子基因及其表达系统和应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.适于家蚕丝腺表达的改造人酸性成纤维细胞生长因子基因，其特征在于：所述改造人酸性成纤维细胞生长因子基因如SEQ ID NO.1第7-450位所示。

2.根据权利要求1所述适于家蚕丝腺表达的改造人酸性成纤维细胞生长因子基因，其特征在于：所述改造人酸性成纤维细胞生长因子基因编码的氨基酸如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1或2所述适于家蚕丝腺表达的改造人酸性成纤维细胞生长因子基因的表达系统。

4.根据权利要求3所述的表达系统，其特征在于：所述表达系统含有顺序连接的增强子hr3，分泌型丝胶1基因启动子、改造人酸性成纤维细胞生长因子基因、丝胶1基因的终止子和piggyBac转座序列。

5.根据权利要求4所述的表达系统，其特征在于：所述表达系统还含有荧光筛选标记基因表达框，所述荧光筛选标记基因表达框位于所述增强子hr3上游。

6.根据权利要求5所述的表达系统，其特征在于：所述表达系统为如SEQ ID NO.3所示的序列通过AscI酶切后连入pBac[3×p3EGFPaf]载体的AscI位点而得。

7.权利要求3-6任一项所述表达系统在家蚕丝腺表达重组人酸性成纤维细胞生长因子中的应用。

8.利用权利要求3-6任一项所述表达系统在家蚕丝腺中表达人酸性成纤维细胞生长因子的方法，其特征在于，包括如下步骤：将所述表达系统转化解除滞育家蚕蚕卵，用无毒胶水封口后经甲醛蒸汽消毒，孵化，筛选转基因阳性蛾圈，取阳性转基因家蚕茧壳，在液氮中粉碎成粉末，然后溶解于含20mM Tris-Cl，8M Urea，pH7.0的缓冲液中，离心收集上清，经镍离子亲和层析柱纯化，得重组人酸性成纤维细胞生长因子。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：茧壳粉末溶解于缓冲液后茧壳粉末的浓度为20mg/mL。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述纯化的具体方法为：将离心收集的上清流过镍离子亲和层析柱，然后分别用0mM，20mM，40mM咪唑的萃取缓冲液对柱子进行梯度漂洗，随后用120mM咪唑的萃取缓冲液进行柱洗脱，并收集各组分的流出样品，将洗脱组份样品倒入1kDa分子量截留的透析袋中，置于含20mM Tris-Cl，pH7.0的缓冲液中于4℃透析24h，期间每6h更换透析缓冲液一次，再将透析袋放入含2.0mM GSH、0.2mM GSSG、1mM DTT和20mM Tris-Cl、pH7.0的复性缓冲液中进行透析复性24h，最后利用含20mM Tris-Cl，pH7.0的缓冲液中于4℃透析48h，期间每隔6h更换一次透析缓冲液。

说明书全文

适于家蚕丝腺表达的改造人酸性成纤维细胞生长因子基因

及其表达系统和应用

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程领域，特别涉及适于家蚕丝腺表达的改造人酸性成纤维细胞生长因子基因，还涉及含有该基因的表达系统和应用。

背景技术

[0002] 进入21世纪以来，随着人类对医用、药用、食用、美容、保健等各种用途的功能性蛋白需求量的日益增大，依靠提取、生产天然来源的蛋白质已无法满足快速增长的市场需求。建立和完善各种高效的原核和真核表达系统，利用大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、昆虫以及哺乳动物等作为宿主生物反应器，是实现低成本、规模化生产具有生物学活性的重组外源蛋白的有效和可持续方法，并成为当今世界研究的热点。利用中国仓鼠卵巢细胞作为生物反应器生产外源蛋白是目前最为标准的表达模式，但其运营成本和对环境的要求极为苛刻，严重限制了其大规模推广应用。为了建立低成本、规模化、安全可持续的高效生产外源蛋白的生物工厂，自2000年以来，科研人员开始尝试利用转基因生物，如哺乳动物、鸟类、昆虫以及植物的器官作为生物反应器来生产重组外源蛋白。

[0003] 家蚕以泌丝著称，是最早被人类所完全驯化利用的经济动物(昆虫)之一。家蚕的丝腺是合成、分泌蚕丝蛋白的器官，是整个蚕丝业的生物学基础。经过数千年的人工驯化，家蚕的丝腺具备了超强的蛋白质合成与分泌能力，一头体重5g左右家蚕能合成分泌约0.5g蚕丝蛋白，为目前已知昆虫之最。蚕丝蛋白主要由丝素蛋白(fibroin)和包裹在其外层的丝胶蛋白(sericin)构成：丝素蛋白是蚕丝的主体，约占75％，由蚕的后部丝腺合成，主要包括丝素重链(FibH chain)、丝素轻链(FibL chain)和丝素P25三种；其余的25％为丝胶蛋白，由蚕的中部丝腺合成，包括丝胶1(Sericin1)、丝胶2(Sericin2)和丝胶
3(Sericin3)三种主要组分，其中又以丝胶1蛋白含量最高，均可溶于水。随着现代分子生物学和转基因技术的发展，家蚕绢丝腺的高效合成与分泌丝蛋白这一特征，以及所具备的糖基化、甲基化等对外源蛋白保持活性极其重要的蛋白质翻译后修饰加工能力，饲养成本低，可工厂化生产，对人畜安全等特点，使其成为理想的生物反应器模型，备受各国研究人员关注并竞相开发利用。

[0004] 2000年，田村等人利用pBac转座子介导显微注射家蚕蚕卵并获得了稳定遗传的转基因家蚕；2003年，夏庆友等人完成了家蚕基因组计划，家蚕丝腺中涉及丝蛋白合成的重要编码基因如丝素重链(FibH chain)基因、丝素轻链(FibL chain)基因、丝胶1(Sericin1)基因、丝胶2(Sericin2)基因、丝胶3(Sericin3)基因以及丝素P25基因等的启动子调控元件被克隆，同时对表达系统进行优化，获得了高效的转基因家蚕丝胶1表达系统。这些基础研究结果使得利用转基因家蚕组织特异表达系统，在丝腺中大规模生产重组外源蛋白成为可能。

[0005] 人酸性成纤维细胞生长因子(haFGF)是肝素结合蛋白，属于成纤维细胞生长因子家族成员，具有促进有丝分裂的活性，具有广泛临床医学应用价值，在医学上，aFGF(FGF1)主要外用于创口的愈合，它可以促进受损部位血管的恢复和重建，恢复和重建受损组织的功能，增强受损部位抗感染能力，提高受损部位愈合后的强度和弹性，减少疤痕的形成，显著缩短修复时间。主要应用于烧伤、外科创伤、难愈性体表溃疡、口腔粘膜糜烂等疾病的治疗。此外aFGF在美容应用方面，它能平衡色素分布改善肤色肤质，加速各种美容整形手术后皮肤创伤的修复，平皱保湿，增加皮肤弹性。在美容护肤品中添加一定量的酸性成细胞生长因子可以随时补充肌肤细胞必要的营养成份，保持肌肤细胞旺盛的活力，维持肌肤细胞弹性及光彩，抵抗肌肤老化，平衡肌肤细胞的分泌状态，抑制暗疮粉刺的形成，使皮肤光滑红润。根据世界卫生组织(WHO)的统计，中国大陆的烧烫伤药每年约有100～200万剂的需求量，总市值约3～5亿美元；全球市值估计在10亿美元至15亿美元。因此，急需一种能够大规模生产具有活性的重组haFGF的方法，具有高效率、低成本的特点，具有巨大的市场开发前景。

发明内容

[0006] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供适于家蚕丝腺表达的改造人酸性成纤维细胞生长因子基因；本发明的目的之二在于提供含有改造人酸性成纤维细胞生长因子基因的表达系统；本发明的目的之三在于提供表达系统在家蚕丝腺表达重组人酸性成纤维细胞生长因子中的应用；本发明的目的之四在于提供表达系统在家蚕丝腺中表达人酸性成纤维细胞生长因子的方法。

[0007] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

[0008] 1、适于家蚕丝腺表达的改造人酸性成纤维细胞生长因子基因，所述改造人酸性成纤维细胞生长因子基因如SEQ ID NO.1第7-450位所示。

[0009] 优选的，所述改造人酸性成纤维细胞生长因子基因编码的氨基酸如SEQ ID NO.2所示。

[0010] 2、含有所述适于家蚕丝腺表达的改造人酸性成纤维细胞生长因子基因的表达系统。

[0011] 优选的，所述表达系统含有顺序连接的增强子hr3，分泌型丝胶1基因启动子、改造人酸性成纤维细胞生长因子基因、丝胶1基因的终止子和piggyBac转座序列。

[0012] 优选的，所述表达系统还含有荧光筛选标记基因表达框和piggyBac转座臂序列，所述荧光筛选标记基因表达框位于所述增强子hr3上游。

[0013] 最优选的，所述表达系统为如SEQ ID NO.3所示的序列通过AscI酶切后连入pBac[3×p3EGFPaf]载体的AscI位点而得。

[0014] 3、所述表达系统在家蚕丝腺表达重组人酸性成纤维细胞生长因子中的应用。

[0015] 4、利用所述表达系统在家蚕丝腺中表达人酸性成纤维细胞生长因子的方法，包括如下步骤：将所述表达系统转化解除滞育家蚕蚕卵，用无毒胶水封口后经甲醛蒸汽消毒，孵化，筛选转基因阳性蛾圈，取阳性转基因家蚕茧壳，在液氮中粉碎成粉末，然后溶解于含20mMTris-Cl，8M Urea，pH7.0的缓冲液中，离心收集上清，经镍离子亲和层析柱纯化，得重组人酸性成纤维细胞生长因子。

[0016] 优选的，茧壳粉末溶解于缓冲液中茧壳粉末的浓度为20mg/mL。

[0017] 最优选的，所述纯化的具体方法为：所述纯化的具体方法为：将离心收集的上清流过镍离子亲和层析柱，然后分别用0mM，20mM，40mM咪唑的萃取缓冲液对柱子进行梯度漂洗，随后用120mM咪唑的萃取缓冲液进行柱洗脱，并收集各组分的流出样品，将洗脱组份样品倒入1kDa分子量截留的透析袋中，置于含20mM Tris-Cl，pH7.0的缓冲液中于4℃透析24h，期间每6h更换透析缓冲液一次，再将透析袋放入含2.0mM GSH、0.2mM GSSG、1mM DTT和
20mM Tris-Cl、pH7.0的复性缓冲液中进行透析复性24h，最后利用含20mM Tris-Cl，pH7.0的缓冲液中于4℃透析48h，期间每隔6h更换一次透析缓冲液。

[0018] 本发明的有益效果在于：本发明通过优化人酸性成纤维细胞生长因子的编码序列，获得适合家蚕密码子偏好的人酸性成纤维细胞生长因子基因序列，将优化的人酸性成纤维细胞生长因子基因序列与含有分泌型丝胶1基因启动子和终止子构成表达框并利用增强子Hr3增强表达、荧光标记基因筛选和piggyBac转座臂构建高效表达系统，该系统能够在家蚕中部丝腺特异高效表达，并随着蚕丝一起分泌至茧壳丝胶层，获得活性与天然人酸性成纤维细胞生长因子相似的重组人酸性成纤维细胞生长因子，为将家蚕茧丝应用于化妆品乃至保健品产业成为可能。

附图说明

[0019] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

[0020] 图1为转基因表达载体phSHSASer结构图(3×p3EGFP表示转基因荧光筛选标记基因；hr3表示增强子hr3；Ser1表示分泌型丝胶1基因启动子；haFGFhis6表示经过密码子优化的人酸性成纤维细胞生长因子基因编码序列；Ser1PA表示分泌型丝胶1基因的终止子；ITR表示piggyBac转座臂序列)。

[0021] 图2为转基因G1代蚕卵荧光筛选结果图(A：卵绿色荧光图；B：卵白光图；C：蛾子绿色荧光图；D：蛾子白光图)。

[0022] 图3为重组haFGF在转基因家蚕丝腺中的免疫荧光染色图(A-C：sghaFGF转基因家蚕中部丝腺横切面分别在绿色荧光，蓝色荧光以及重合下的图像；D-F：正常家蚕中部丝腺横切面分别在绿色荧光，蓝色荧光，以及重合下的图像，标尺大小为50μm)。

[0023] 图4为重组haFGF在sghaFGF转基因家蚕蚕丝中的免疫荧光染色图(A-B：sghaFGF转基因蚕丝分别在白光和绿色荧光下的图像；C-D：正常蚕丝分别在白光和绿色荧光下的图像)。

[0024] 图5为转基因家蚕茧壳中重组haFGF蛋白检测结果(A：SDS-PAGE电泳图，箭头所示为差异蛋白条带；B：Western blot检测，箭头所示为杂交条带；C：茧壳溶出总蛋白中重组蛋白的含量)。

[0025] 图6为转基因家蚕茧壳中重组haFGF蛋白的分离纯化(A：SDS-PAGE电泳图；B：westernblot图；1：FGF1茧壳粗提物；2：流穿组份；3：0mM咪唑漂洗5mL；4：20mM咪唑漂洗
5mL；5：40mM咪唑漂洗5mL；6：120mM咪唑漂洗5mL)。

[0026] 图7为重组haFGF蛋白的纯化得率。

[0027] 图8为重组haFGF蛋白促进NIH/3T3细胞生长图。

[0028] 图9为重组haFGF蛋白促进NIH/3T3细胞增殖测试结果。

[0029] 图10为NIH/3T3细胞增殖(EdU)测试图。A-C分别表示空白对照处理组的NIH/3T3在红色荧光，蓝色荧光和重合下的图像；D-F分别表示重组haFGF处理组的NIH/3T3在红色荧光，蓝色荧光和重合下的图像；G-I分别表示FGF1标准品处理组的NIH/3T3在红色荧光，蓝色荧光和重合下的图像。红色荧光所示为吸收EdU的细胞，蓝色荧光所示为细胞核，标尺大小为100μm。

具体实施方式

[0030] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0031] 本实施例使用的家蚕品种为大造(P50)，由本实验室保存。幼虫在25℃人工气候箱中用人工饲料饲养。小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3由本实验室保存，并培养于含有10％(v/v)胎牛血清(FBS，Gibco)的DMEM培养基中，在37℃、CO2浓度为5％的条件下培养。质粒载体pSLfa1180fa(Carsten Horn.et al2000)、pBac[3×p3EGFPaf](Carsten Horn.et al2000)，pBac[3×p3DsRedaf](Aichun Zhao.et al2010)由本实验室保存。

[0032] DNA聚合酶Ex-Taq，LA-Taq，限制性内切酶，碱性磷酸酶，测序克隆载体pMD19-T simple载体，DNA Ligation Kit Ver.2.0和荧光定量PCR试剂盒SYBR premix Ex TaqTM购自TaKaRa公司。转化用大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1，质粒DNA提取试剂盒Easy pure Plasmid MiniPrep Kit购自北京全式金生物技术有限公司。琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒Gel Extraction Mini Kit(50)购自上海华舜生物技术有限公司。转基因注射用超纯质粒提取试剂盒QIA prep Spin Miniprep Kit(50)购自QIAGEN。Total RNA Kit II(50)试剂盒购自Omega Bio-Tec公司。人酸性成纤维细胞生长因子多克隆抗体(anti-aFGF1antibody)和人酸性成纤维细胞生长因子标准品(FGF1std)均购自Abcam公司。

[0033] 实施例1

[0034] 1、基因合成

[0035] 从NCBI下载人酸性成纤维细胞生长因子(human acidic fibroblast growth factor，haFGF)氨基酸序列，根据家蚕密码子使用偏好型进行优化设计编码序列，为方便纯化在人酸性成纤维细胞生长因子(haFGF)氨基酸序列的C端融合6个组氨酸氨基酸，形成haFGF-his6，并在haFGF-his6的核苷酸序列两端分别接上BamHI和NotI酶切位点，即如SEQ ID NO.1所示的序列，表达框编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0036] 2、转基因表达载体的构建

[0037] 人工合成经过密码子优化设计的haFGF-his6编码序列(SEQ ID NO.1)的双链，用BamHI和NotI酶切后替换psl1180[hr3Pser1spRedSer1PA]载体(公开于公开号为102492692A的中国专利)中的红色荧光蛋白基因Red，得psl1180[hr3CQSer1sphaFGF1-his6Ser1]，其功能区核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其中第4～11位为AscI酶切位点，第33～39位为NcoI酶切位点，第40～986位为增强子hr3，第987～992位为NcoI酶切位点，第995～1676位为分泌型丝胶1基因启动子，1671位～1676位为BamHI酶切位点，第1677～2120位为haFGF-his6，第2121～2128位为NotI，第2129～2507位为丝胶
1基因的终止子，第2508～2513位为HindⅢ，第2514～2521位为AscI酶切位点，再通过AscI位点构建到pBac[3×p3EGFPaf]载体的AscI位点中，形成转基因表达系统，命名为phShaFGF-his6Ser1，其结构如图1所示。图1中3×p3EGFP表示绿色荧光标记基因，用于筛选转基因的荧光标记基因；hr3表示增强子hr3；Ser1表示分泌型丝胶1基因启动子；
haFGFhis6表示经过密码子优化设计的人酸性成纤维细胞生长因子基因编码序列(SEQ ID NO.1)；Ser1PA表示丝胶1基因的终止子；ITR表示piggyBac转座臂序列。

[0038] 3、显微注射与荧光筛选

[0039] 将制备的转基因表达系统phShaFGF-his6Ser1和辅助载体pHA3PIG质粒分别稀释至浓度为400ng/μL，转基因表达系统phShaFGF-his6Ser1与辅助载体pHA3PIG质粒按1：1的摩尔比混合。将混合后的质粒注射400粒已解除滞育的大造早期胚胎(产卵后2～5h)，随后用无毒胶水对注射孔进行封口，经35％的甲醛蒸汽消毒5分钟后，置于25℃、相对湿度为85％的环境中孵化，孵化获得169头G0代幼虫，将孵化的幼虫采用人工饲料饲育，至成虫后进行自交或回交共获得的81个蛾圈G1代蚕卵，将获得的G1代蚕卵在第7天用宏观体视荧光显微镜(Olypus MVX10，日本)下检测绿色荧光(图2)，绿色荧光观察采用波长为460～490nm的激发光，经观察筛选并获得11个在眼睛或神经特异激发绿色荧光的转基因阳性蛾圈，阳性率为14％，将转基因阳性蛾圈命名为sghaFGF-his6。

[0040] 实施例2sghaFGF-his6家蚕中部丝腺和蚕丝中外源蛋白的组织定位[0041] 将sghaFGF家蚕和正常家蚕五龄第6天的中部丝腺和蚕丝于4％多聚甲醛中固定30min，然后用1×PBS漂洗三次，每次10min，再用体积分数为70％的乙醇换洗多次后，置于体积分数为70％的乙醇中4℃保存。随后，利用石蜡对丝腺组织进行包埋，并将包埋好的组织材料蜡块用Leica RM2235型号石蜡切片机进行切片，切片厚度为4-7μm。最后，将TM
蜡带进行分段粘于包被有多聚赖氨酸的防脱载玻片上。利用 O.C.T. 试剂对蚕丝样品进行包埋，并在冷冻切片机中将样品横切成10μm的薄片。将薄片收集到载玻片上进行免疫杂交，一抗为anti-FGF1多克隆抗体，二抗为FITC-labeled goat anti-rabbit IgG(Beyotime)，细胞利用DAPI进行染色。最后在荧光显微镜(Nikon)下对免疫荧光信号进行观察，结果如图3和图4所示。结果显示：在sghaFGF家蚕的中部丝腺腺腔的丝胶层和蚕丝的丝胶层出现明显的免疫荧光信号(图3A-C，图4A-B)，而正常家蚕中未出现免疫荧光信号(图3D-F，图4C-D)，结果说明重组haFGF蛋白在中部丝腺细胞中合成并分泌至丝胶层，最后随着腺腔内的丝胶蛋白一起分泌到蚕丝的丝胶层中。

[0042] 实施例3

[0043] 1.检测茧壳总蛋白中重组人酸性成纤维细胞生长因子(haFGF)含量[0044] 将sghaFGF-his6转基因家蚕的G1代11个不同的阳性蛾圈中的阳性个体分别单独饲养，并对上蔟后的11个阳性蛾圈中分别选取1个阳性个体的茧壳的haFGFhis6蛋白进行SDS-PAGE检测，检测方法如下：将茧壳于液氮中粉碎成粉末，按照20mg/mL的茧壳浓度溶于浓度为20mM Tris-Cl，8M Urea(pH7.0)的缓冲液中4℃过夜振荡，之后在18000rpm、4℃条件下离心15min，离心收集上清，将离心收集的上清在12％的SDS-PAGE分离胶电泳检测，并利用考马斯亮蓝染色，结果如图5A所示。结果显示，转基因阳性个体的茧壳蛋白泳道在17kDa分子量附近出现与野生型家蚕组的差异蛋白条带，且分子量与重组haFGF蛋白的理论分子量大小一致。根据差异条带进行灰度计算(Bandscan)，估算出差异蛋白的含量，结果表明不同阳性蛾圈来源的茧壳溶出蛋白中重组haFGF蛋白的含量为3.6-6.8％(图5C)。

[0045] 为进一步对该差异蛋白进行鉴定，选择其中7个含量最高的转基因个体的茧壳蛋白进行Western Blot检测，具体步骤如下：将茧壳于液氮中粉碎成粉末，按照20mg/mL的茧壳浓度溶于20mM Tris-Cl，pH7.0，8M Urea的缓冲液中4℃过夜振荡，之后在18000rpm、4℃条件下离心15min，离心收集上清，将离心后的上清液在12％的SDS-PAGE分离胶中电泳检测，然后采用电转膜法将SDS-PAGE胶中的蛋白转移至PVDF膜上，再将PVDF膜置于含
5％脱脂奶粉的TBST缓冲液中，4℃过夜封闭。免疫杂交前，于室温利用TBST缓冲液清洗PVDF膜3次，每次10min。利用含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液按10000倍稀释比例配置抗FGF1抗体(Abcam)杂交液，将PVDF膜浸入杂交液中室温振荡孵育2h，TBST洗膜5次，每次
5min。利用TBST缓冲液按20000倍稀释比例配置HRP标记的羊抗兔IgG(购自碧云天公司)得二抗杂交液，将TBST清洗后的PVDF膜浸入二抗杂交液中于室温振荡孵育2h，TBST洗膜5次，每次5min。将清洗后的PVDF膜置于干净的保鲜膜上，将ECL显色液(Amersham Biosciences)均匀滴在PDVF膜面上，室温避光孵育5min，利用Chemiscope Series(Clinx science instruments)仪器进行曝光和成像，结果如图5B所示。结果显示，转基因茧壳蛋白在17kDa分子Marker附近出现的差异条带可以与抗FGF1抗体发生特异的反应，而野生型茧壳蛋白未出现差异条带。

[0046] 2.重组人酸性成纤维细胞生长因子(haFGF)的分离纯化

[0047] 将茧壳中的重组蛋白进行镍离子亲和层析纯化，具体方法如下：将25mL提取茧壳蛋白溶液流过镍离子亲和层析柱，然后分别用5mL含0mM，20mM，40mM咪唑的萃取缓冲液对柱子进行梯度漂洗，随后用5mL含120mM咪唑的萃取缓冲液进行柱洗脱，并收集各组分的流出样品，将洗脱组份样品倒入1kDa分子量截留的透析袋中，置于2L含20mM Tris-Cl，pH7.0的缓冲液中于4℃透析24h，期间每6h更换透析缓冲液一次，以彻底除去Urea，再将透析袋放入2L含2.0mM reduced glutathione(GSH)、0.2mM oxidized glutathione(GSSG)、1mMDTT和20mM Tris-Cl(pH7.0)的复性缓冲液(参考Rika Hino等，2006)中进行透析复性24h，最后利用2L含20mM Tris-Cl，pH7.0的缓冲液中于4℃透析48h，期间每隔6h更换一次透析缓冲液。将各组分进行SDS-PAGE和Western Blot检测，同时以为经亲和纯化的离心上清液、流穿组分和经透析复性后洗脱液的作为对照，结果如图6所示。结果显示，重组haFGF蛋白可在120mM咪唑的漂洗峰中被分离出来，对泳道中的重组蛋白纯度进行计算，结果表明重组haFGF蛋白的纯度为90％。

[0048] 按照与上述相同的方法，区别在于分别用80mM咪唑漂洗5mL、200mM咪唑漂洗5mL，收集洗脱液。然后分别将未经亲和纯化的茧壳蛋白、80mM咪唑漂洗5mL、120mM咪唑漂洗5mL、200mM咪唑漂洗5mL、12.5ng haFGF蛋白标准品、25ng haFGF蛋白标准品和50ng haFGF蛋白标准品(Abcam)进行SDS-PAGE检测，结果如图7所示。并根据检测结果计算其重组haFGF蛋白的得率和纯度，结果表明从1g的sghaFGF茧壳中可溶出含650μg重组haFGF蛋白的粗提物，经过分离纯化，可以获得约350μg的90％纯度的重组haFGF蛋白，纯化得率约为60％。

[0049] 由于在纯化过程中使用了变性剂尿素，所以重组haFGF蛋白的生物学活性可能遭到破坏，为了获得具有活性的重组haFGF蛋白，本实施例利用谷胱甘肽复性系统对纯化后的重组蛋白进行蛋白复性。

[0050] 3.促NIH/3T3细胞增殖实验

[0051] 将NIH/3T3细胞培养于含有10％(v/v)胎牛血清(FBS，Gibco)的DMEM培养基中，在37℃、CO2浓度为5％的条件下培养，收集生长至96％汇合度的NIH/3T3细胞按照500个/孔的细胞浓度贴壁平铺于96孔板中，并用含0.5％(v/v)胎牛血清(FBS，Gibco)的DMEM培养基饥饿处理24小时，将纯化的重组haFGF添加至96孔板至终浓度为200ng/mL，并以等浓度的hFGF1标准品作为阳性对照，然后加入肝素至浓度为8U/mL，在孵育的24，48和72小时三个时间点对细胞进行增殖检测。检测方法为：首先在显微镜下观察经过蚕丝孵育后的细胞的生长状况，结果如图8所示：复性后的重组haFGF蛋白可以促进NIH/3T3细胞的生长，商业化的FGF1蛋白标准品也可以促进细胞的生长。随后，向96孔板内加入CCK-8试剂(购自上海碧云天生物技术有限公司)，添加剂量为10uL/孔，于37℃反应4h后，测定不同处理组的细胞分别在孵育24h，48h和72h三个时间点时在450nm处的吸光值。每个测试组分别设置3个平行试验，且重复3次以上，结果图9所示。结果显示：复性后的重组haFGF蛋白处理组在450nm处的吸光度值要明显高于对照组，等量的FGF1标准品在24h和48h时间点的吸光值要略高于复性后的重组haFGF蛋白处理组，但是在72h时间点复性后的重组haFGF蛋白处理组的吸光值略高于FGF1标准品组。

[0052] 随后利用EdU标记进行细胞增殖检测，实验步骤参照免疫荧光染色(EdU)Click-iT？EdUImaging Kits提供的说明书进行，具体为：将NIH/3T3培养于含有10％(v/v)胎牛血清(FBS， Gibco)的DMEM培养基中，培养条件为37℃，5％CO2，收集生长至96％汇合度的NIH/3T3细胞按照500/100μL/孔的细胞浓度贴壁平铺于96孔板中，并用含0.5％(v/v)胎牛血清(FBS，Gibco)的DMEM培养基中饥饿处理24小时。将纯化的重组haFGF按照200ng/mL的工作浓度添加至96孔板中，并以等浓度的hFGF1标准品作为阳性对照，肝素的工作浓度为8U/mL，24h后，PBS清洗孔内细胞两次，加入含3.7％甲醛的PBS进行固定，100μL/孔。随后，加入含0.5％ X-100的PBS进行透化。之后利用10μM的Alexa
555azide对EdU的摄入量进行检测并在荧光显微镜下进行观察，其中红色荧光为吸入EdU的细胞，紫色为细胞核染色，结果如图10所示。结果显示：重组haFGF和FGF1标准品处理的NIH/3T3细胞红色荧光信号明显强于未处理组，说明复性后重组haFGF具有促进细胞增殖的活性，可以提高细胞对EdU的吸收。证实本发明构建的转基因家蚕表达系统可以高效的表达具有生物学活性的人酸性成纤维细胞生长因子重组蛋白。

[0053] 综上所述，本发明中将人酸性成纤维细胞生长因子(haFGF)的基因序列根据家蚕基因组密码子使用的偏好型人工改造，然后与含有分泌型丝胶1基因启动子和Ser1PA表示分泌型丝胶1基因的终止子构成表达框最终形成表达系统，通过显微注射家蚕胚胎，建立转基因家蚕品系sghaFGF-his6，获得11个不用阳性蛾圈来源的品系，对sghaFGF-his6家蚕中的重组蛋白进行SDS-PAGE和western blot检测，结果显示重组haFGF蛋白在家蚕中部丝腺中合成并分泌到茧丝中。茧丝可溶蛋白中重组haFGF蛋白的含量最高的为6.7％。随后对茧丝中的重组haFGF蛋白进行纯化，结果显示可从1g的sghaFGF-his6蚕丝总纯化获得350μg纯度为90％的重组蛋白。由于在溶解重组蛋白过程中使用了变性剂尿素，导致重组蛋白的活性被破坏。因此，又利用谷胱甘肽复性系统对纯化后的重组蛋白进行蛋白复性。将复性后的重组haFGF进行促细胞增殖实验，发现转基因家蚕表达的重组haFGF蛋白具有促进NIH/3T3细胞的增殖的能力，且效率与等量的商业化haFGF蛋白的相当。结果说明通过转基因家蚕可以重组表达具有生物学活性的人酸性成纤维细胞生长因子。证实了本发明建立的表达系统phShaFGF-his6Ser1可实现外源蛋白在转基因家蚕丝腺中的高效分泌表达，并生产具有生物学活性的重组蛋白。因此，phShaFGF-his6Ser1表达系统可为家蚕丝腺生产重组活性蛋白的基础技术体系。

[0054] 最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

标题	发布/更新时间	阅读量
永生化鸡胚成纤维细胞-专利编号CN107002044A	2020-05-12	894
ETS2和MESP1由成纤维细胞生成心脏祖细胞-专利编号CN102844428A	2020-05-11	890
成纤维细胞生长因子11-专利编号CN1414101A	2020-05-13	874
ETS2和MESP1由成纤维细胞生成心脏祖细胞-专利编号CN102844428B	2020-05-11	366
防止成纤维细胞皱缩-专利编号CN104582683A	2020-05-12	966
成纤维细胞增殖剂-专利编号CN101795668B	2020-05-12	499
一种成纤维细胞培养液-专利编号CN102690782A	2020-05-13	506
成纤维细胞生长因子11-专利编号CN1181110A	2020-05-13	114
诱导成纤维细胞形成软骨细胞的方法-专利编号CN100482784C	2020-05-11	565
诱导成纤维细胞形成软骨细胞的方法-专利编号CN1661010A	2020-05-11	855

适于家蚕丝腺表达的改造人酸性成纤维细胞生长因子基因及其表达系统和应用

适于家蚕丝腺表达的改造人酸性成纤维细胞生长因子基因

技术领域

背景技术

发明内容

附图说明

具体实施方式

IPRDB

热门服务

关于我们

友情链接

联系方式