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重组人成纤维细胞生长因子21在预防治疗动脉粥样硬化及相关疾病中的应用

阅读：857发布：2021-03-01

IPRDB可以提供重组人成纤维细胞生长因子21在预防治疗动脉粥样硬化及相关疾病中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种可用于预防治疗动脉粥样硬化及相关疾病的基因工程蛋白-重组人成纤维细胞生长因子21。该重组人FGF21蛋白受申请人已获专利保护(专利号：ZL200810223501.0)。重组人FGF21蛋白可以通过促进血管内皮细胞内脂肪的外流，减少其在血管内皮的堆积，从而有效地缓解和控制动脉粥样硬化的病程。因此，重组人FGF21蛋白相对于其他上市的药物而言，它具有可以针对动脉粥样硬化及冠心病发病的源头进行预防治疗的优点。此外，通过对大量临床数据的分析，发明人发现FGF21可以用于辅助诊断动脉粥样硬化和冠心病的指标，其在血清中的含量升高与冠心病的发病具有显著的相关性。鉴于重组人FGF21蛋白在预防治疗以及诊断动脉粥样硬化的广泛作用，发明人认为其临床应用价值巨大。，下面是重组人成纤维细胞生长因子21在预防治疗动脉粥样硬化及相关疾病中的应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.重组人成纤维细胞生长因子21(以下简称重组人FGF21)在预防动脉粥样硬化及相关疾病中的应用。

2.FGF21作为单纯冠心病和由其他疾病引起的并发性冠心病的发病辅助诊断指标的应用。

3.FGF21作为动脉粥样硬化诊断辅助诊断指标的应用。

4.权利要求1述及FGF21，其特征为由申请人独立自主研发并获得专利授权的体外重组FGF21(专利号ZL200810223501.0)。

5.权利要求1所述的应用，其特征在于：重组人FGF21体内给药后，动脉粥样硬化病变的进展得到缓解，体重增长显著减缓；同时，肝脏组织的重量以及肝脏／体重比值减小。

6.权利要求1，5述及应用，其特征在于：

1)重组FGF21蛋白能通过细胞外调节蛋白激酶1／2(以下简称ERK1／2)信号途径上调对氧磷酶1(以下简称PON1)在人脐静脉内皮细胞(简称HUVEC细胞)中的表达，抑制细胞凋亡。

2)重组FGF21蛋白通过上调ABCA1基因的表达，从而促使脂质从细胞流出，减少脂质在细胞中的堆积。

7.权利2,3述及FGF21，其特征为天然的人FGF21，其信息可从美国国立生物技术信息中心查得(序列号：AAQ89444.1，GI：37183289)。

8.权利2，7所述的FGF21作为冠心病发病辅助诊断指标，其特征为：人血清中FGF21含量的正常值为167.9±15.6ng／L；如果血清中FGF21的含量达到或者超过

513.5±47.5ng／L，表明其患有冠心病的可能，但不作为确诊的唯一依据。

9.权利要求3,7所述的FGF21作为动脉粥样硬化诊断辅助诊断指标，其特征为：在人体血清中FGF21含量异常升高时，判断其可能患有动脉粥样硬化，并建议其做进一步的确诊。

10.权利要求2述及其他疾病为糖尿病，高血脂症和肥胖病。

说明书全文

重组人成纤维细胞生长因子21在预防治疗动脉粥样硬化

及相关疾病中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及具有药理作用的蛋白，具体涉及一种蛋白在诊断或治疗与冠心病相关疾病中的应用。

背景技术

[0002] 动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是心脑血管疾病的重要病理基础，也是代谢综合症的一个重要枢纽，动脉管壁增厚、失去弹性和管腔缩小是各种AS的共同特点。流行病学和临床研究表明：AS主要发生在40岁以上的中老年人群，49岁以后进展较快，但在一些青壮年人甚至儿童的尸检中，也曾发现他们的动脉有早期的粥样硬化病变。冠状动脉粥样硬化性心脏病是指冠状动脉粥样硬化使血管腔狭窄或阻塞，或因冠状动脉功能改变导致心肌缺血缺氧或坏死而引起的心脏病，通称为冠状动脉性心脏病(CHD)，简称冠心病。CHD是AS发展的结果，是严重危害人类健康的常见病。糖尿病，高血脂症和肥胖病等疾病会伴随或者诱发动脉粥样硬化甚至冠心病。

[0003] 流行病学调查结果表明，CHD已经成为人类死亡的主要原因之一。在欧美国家，因患CHD死亡的人数占人口死亡数的1／3-1／2。而在我国，近年来CHD发病呈增长趋势，加上我国人口基数大，该如何控制和治疗CHD患者病情的发展，是一个亟待解决的问题。同时，糖尿病，高血脂症，肥胖病都是我国发病率较高且且发病呈现年轻化趋势的代谢性疾病。

[0004] 就目前临床治疗而言，尽管他汀类药物能显著缓解AS的发生发展，但其依然未能完全抑制和逆转AS病情的恶化。因此，探索AS发病的分子调控机制及确证新的药物靶点，从而进一步阐明AS的发病机理、开发新的治疗药物，均具有重要的基础研究意义和应用价值。

[0005] 成纤维细胞生长因子21(以下简称FGF21)是一个具有210个氨基酸残基的多肽，主要表达于肝脏和脂肪组织。近期的研究发现：在病理和生理的条件下，FGF21直接参与调节机体内脂质和糖的代谢过程，并与脂、糖代谢紊乱所引发的一系列代谢综合症密切相关。此外，动物及临床研究还发现：FGF21不仅与多种肥胖引发的代谢综合征的发病密切相关，更为重要的是，体外给予FGF21治疗能显著降低糖尿病动物体内心血管疾病危险因子的水平。然而，就FGF21与冠心病的研究而言，无论是动物还是临床方面，都知之甚少。脂质代谢紊乱是AS发病的主要机制之一，而高血糖则是AS发病的高风险因素之一，但FGF21是否与AS发病相关它通过哪些途径调节体内的代谢过程这些均有待于进一步深入探索。

[0006] 在临床诊断方面，动脉粥样硬化和冠心病这两种疾病的早期诊断都比较困难，只有发生到实质的器官病变阶段才能确诊。其中，对于动脉粥样硬化来说，血脂检查，X线、超声及动脉造影等方法是最主要的检测手段。而在冠心病的检查中，最主要的是依靠心电图检测，如心电图负荷试验，动态心电图等。此外，冠心病的检查方法还有核素心肌显像，冠状动脉造影，心脏超声和血管内超声，心肌酶学检查等，其中冠状动脉造影检测是冠心病诊断的“金标准”。如何寻找表征动脉粥样硬化和冠心病发病可能性的指标就显得尤为重要。正如血脂检查作为代谢性疾病里面必查的指标一样，FGF21是否能够作为诊断动脉粥样硬化和冠心病的常用检查参数，对于这些疾病的预防具有重要的临床应用价值。

发明内容

[0007] 本发明的目的之一是提供一种用于预防由高脂饮食引起的动脉粥样硬化发病的方法。

[0008] 为了达到上述目的，本发明考察了重组人FGF21对高脂饮食引起的动脉粥样硬化的预防作用。

[0009] 为了模拟重组人FGF21对高脂饮食引起动脉粥样硬化的预防作用，本发明采用皮下注射100-400μg／kg重组人FGF21蛋白，再给予高脂饮食的方法。

[0010] 为了进一步表明体内注射重组人FGF21对高脂饮食引起动脉粥样硬化的预防作用，本专利从体重，血脂水平，肝脏代谢，胆固醇转运，血管病变等五方面比较分析了注射重组人FGF21蛋白与未注射重组人FGF21蛋白样本之间的差异。

[0011] 本发明的目的之一是提供一种可以用于预防动脉粥样硬化及冠心病的重组人FGF21。

[0012] 上述重组人FGF21为按照本申请人已经获得授权专利ZL200810223501.0中所述方法制备获得。

[0013] 上述专利所述重组人FGF21的制备方法为：采用基因工程体外重组的方法，构建SUMO分子伴侣与FGF-21融合表达的基因工程菌株，在37℃，1mM IPTG诱导4h，蛋白表达量>20％；Western blotting实验结果表明，体外重组所表达的FGF21能与FGF21单克隆抗体相互反应，这说明重组蛋白为FGF21。此外，结构分析，质谱鉴定和N-端分析结果均表明本课题组已经成功获得高纯度的目标蛋白；此外，脂肪细胞葡萄糖重吸收试验表明，重组FGF21能显著促进脂肪细胞对葡萄糖的吸收。同时建立了稳定可靠、易于放大的中试工艺体系，产品纯度达到95％以上，回收率超过60％，为药学及动物实验研究提供充足的样品，同时建立了包括原液和成品在内的全套质量控制指标，将人FGF21克隆至目标表达载体，并成功表达出相应的目标蛋白并具有相应的生物活性。

[0014] 本发明的目的之一是提供动脉粥样硬化及冠心病与FGF21之间存在密切相关性的证据。

[0015] 为了达到以上目的，发明人筛查了正常人和冠心病病人血清中FGF21的浓度。根据世界卫生组织(WHO)1999年发布的“缺血性心脏病的命名及诊断标准”及我国现行的CHD临床诊断标准将心绞痛或心肌梗死冠心病患者列为研究对象。135例CHD患者(男67例／女68例)被收入本项目的研究工作。与此同时，61例(男31例／女30例)年龄、性别相匹配的正常人群被收录为本项目研究的对照组。同时，发明人利用载脂蛋白E基因敲除小鼠模拟动脉粥样硬化，检测了动脉粥样硬化疾病模型老鼠血清与正常健康老鼠血清、肝脏、主动脉、肾以及脾中FGF21的浓度。

[0016] 本发明的目的之一是提供一种可以用于动脉粥样硬化及其继发病冠心病的临床辅助诊断指标。

[0017] 为了达到上述目的，结合本发明研究结果，建议：

[0018] 1.在FGF21作为冠心病发病辅助诊断指标时，采用以下标准：人血清中FGF21含量的正常值为167.9±15.6ng／L；如果血清中FGF21的含量达到或者超过513.5±47.5ng／L，表明其患有冠心病的可能，但不作为确诊的唯一依据。

[0019] 2.在FGF21作为动脉粥样硬化发病辅助诊断指标是，采用以下标准：在人体血清中FGF21含量异常升高时，判断其可能患有动脉粥样硬化，并建议其做进一步的确诊。

[0020] 为了进一步验证FGF21可以作为早期辅助诊断指标的可行性，发明人考察了FGF21含量和异常脂质代谢以及胰岛素耐受，甘油三酯，载脂蛋白A等生理指标的相关性。结果表明FGF21与上述指标都有显著相关性。

[0021] 本发明的益处：

[0022] 1.本发明提供了重组人FGF21蛋白在预防动脉粥样硬化及其继发病冠心病中的应用的可能性和方法。一方面为重组人FGF21蛋白的药物开发提供了依据和可行性；另一方面，也为从发病机制着手治疗动脉粥样硬化提供了方法。

[0023] 2.在目前对于肥胖症，高脂血症，糖尿病等代谢性疾病日益流行，动脉粥样硬化和冠心病缺乏早期诊断方法的大背景下，本发明将FGF21作为这两种疾病的辅助诊断指标，有利于早期诊断和病程干预。

附图说明

[0024] 图1重组人FGF21蛋白对apoE KO小鼠生长的影响

[0025] 图2重组人FGF21蛋白对apoE KO小鼠血脂的影响

[0026] 图3重组人FGF21蛋白对apoE KO小鼠肝脏脂肪堆积的影响。

[0027] 图4重组人FGF21蛋白对apoE KO心血管病变小鼠肝脏损伤的影响。

[0028] 图5重组人FGF21蛋白对apoE KO小鼠肝脏脂肪合成、氧化、代谢主要相关基因表达的影响。

[0029] 图6重组人FGF21蛋白对apoE KO肝组织胆固醇、胆汁酸代谢调节等相关基因表达的影响

[0030] 图7重组人FGF21蛋白对apoE小鼠肝脏糖原堆积及肝脏代谢基因信号通路的影响

[0031] 图8重组人FGF21蛋白对apoE KO小鼠小肠组织ABCA1、ABCG1的影响[0032] 图9重组人FGF21蛋白对apoE KO小鼠主动脉弓血管壁的影响

[0033] 图10重组人FGF21蛋白对apoE KO小鼠动脉粥样硬化病变的影响

[0034] 图11冠心病患者与对照组的血清FGF21浓度。

[0035] 图12血清FGF21水平与异常脂质代谢及胰岛素抵抗的相关性

[0036] 图13不同年龄apoE KO动脉粥样硬化小鼠病变状况及其血清FGF21水平的变化状况

[0037] 图14FGF21mRNA水平在24周apoE KO小鼠及WT小鼠相关组织器官中的表达差异[0038] 图15FGF21在24周龄apoE KO小鼠与WT小鼠动脉血管的表达差异

具体实施方式

[0039] 实施例1重组人成纤维细胞因子21预防动脉粥样硬化

[0040] 1.动物分组及药物处理安排

[0041] 取8周龄ApoE KO小鼠30只，分为A／B／C三组，每组10只，此外，再取10只遗传背景一致的C57BL／6j小鼠作为正常对照实验组(D组)，A／B／C三组均给予高脂饮食，同时A／B两组分别按100和400μg／kg剂量以皮下注射的方式注射重组FGF21蛋白，C／D两组注皮下注射生理盐水作为对照，两周后A／B／C／D四组小鼠统一给予正常饲料喂养，在给药过程中，每2周对小鼠体重进行检测一次，观察体重变化。

[0042] 2.动物处死及组织样品收集

[0043] 给药6周后处死老鼠，将小鼠禁食过夜，用乙醚麻醉，眼眶取血收集血样标本，分离血清，观察血脂相关指标的变化状况；小鼠处死后，依次打开腹胸腔，灭菌的PBS进行心脏灌流，除去血管中的残留血液，然后分离主动脉，在主动脉起始上0.2-0.4cm以及腹主动脉分叉处截取主动脉，将主动脉上的脂肪剥离干净，将主动脉冻存于液氮，用于分离提取RNA及蛋白样品。同时摘取心脏，去除心肌下半部分心肌组织后，包埋于OCT包埋液中，用于心脏组织冰冻切片制备；其它脏器：脾、肾、肝等，一部分冻存于液氮，用来做冰冻切片，提取RNA及蛋白；一部分固定于4％多聚甲醛，用来染色或做石蜡切片。

[0044] 3.主要研究内容的具体实验方法

[0045] (1)血清FGF21ELISA检测

[0046] 取上述所收集的小鼠血清，采用Biovendor提供的mouse FGF21ELISA试剂，检测FGF21血清浓度。

[0047] (2)主动脉弓油红染色

[0048] 将上述OCT包埋的主动脉弓心脏组织，采用冰冻切片机切成10μm厚度的组织心脏切片，室温条件下发至组织切片出现干燥状况为止，然后放置于-80℃冰箱保持备用；切片室温放置30min后，放置于ddH2O中2min，然后在油红染料工作液中放置30min；60％异丙醇冲洗至干净(约2min)，然后放置于流水冲洗3min；以水溶性苏木精30s；镜下控制染色结果；流水冲洗2min后，以饱和碳酸氢钠中蓝化2min，流水冲洗2min，Fast green冲洗30s，流水冲洗2min；用水溶性甘油树胶封片剂封片。

[0049] (3)肝糖原PAS检测

[0050] ①试液配置

[0051] Camoy固定液：无水乙醇60mL+冰醋酸10mL+氯仿30mL。

[0052] 过碘酸酒精溶液：过碘酸(HIO·2H2O)0.4g，加95％酒精35mL，醋酸钠溶液(2.72g+蒸馏水100ml)5mL，蒸馏水10mL，置棕色瓶中于4℃冰箱内。

[0053] Schiff氏液：0.5g碱性品红加入100mL蒸馏水中，摇晃5min使之充分溶解。冷却至50℃后过滤加入10mL1N盐酸。冷却至25℃，加入0.5-1g偏重硫酸钠，在室温中至少静置24h，然后密封冰箱保存。

[0054] Schiff氏酒精液配置：Schiff氏液11.5mL，1N HCI0.5mL，无水乙醇23mL。

[0055] 亚硫酸水：1％偏重亚硫酸钠10mL，1N HCl10mL，蒸馏水180mL的树胶溶解。

[0056] 苏木精：苏木素0.9g，95％乙醇10mL，铵(钾)明矾20g，H2O200mL。将苏木素溶于95％的乙醇，钾明矾溶于水(可加热)，然后将苏木素液加入明矾液中混合，用强火煮沸后加氧化汞0.5g，迅速搅拌，成深紫色，迅速移入冷水中，次日过滤，临用时取此液95mL加冰醋酸5mL，可使细胞着色清楚。

[0057] ②染色步骤

[0058] 石蜡切片脱蜡后，蒸馏水洗，过碘酸酒清夜10min，自来水冲洗10min，Schiff氏液10min，流水冲洗5min，苏木精3min(细胞核染色过深可用盐酸酒精分化)，流水冲洗5min，常规脱水、透明、封固。

[0059] (4)主动脉、肝脏等组织RNA提取及浓度测定

[0060] ①将存于液氮的各组小鼠肝脏组织取出，用高压灭菌手术剪刀剪取20-30mg肝组织于干净的1.5mL EP管中，加1mL Trizol，使用电动匀浆器高速匀浆组织，匀浆完组织放于冰上静置5min。对主动脉组织，先用高压灭菌眼科手术小剪刀剪切主动脉组织，然后参照上述提取方法进行。

[0061] ②RNA抽取：各管中加入0.2mL氯仿，盖紧EP管，上下颠倒混匀15s，室温静置2-3min；将组织于低温超速离心机上4℃12000g离心15min；取出EP管，此时EP管分三层，取上层液相于另备EP管中。

[0062] ③RNA沉淀：加0.5mL异丙醇，室温静置10min(异丙醇是上层液体积的0.6-1倍)，4℃12000g离心10min；弃上清，加1mL75％乙醇清洗沉淀。

[0063] ④RNA溶解：4℃7500g离心5min；弃上清，干燥RNA；根据RNA的量适当加入DEPC水溶解，备用。

[0064] ⑤RNA浓度测定：将提取的RNA在紫外分光光度计中测定260OD值、260／280比值，RNA浓度(μg／μL)=OD260×稀释倍数×40／1000。

[0065] (5)RNA逆转录合成cDNA

[0066] ①根据检测完的RNA浓度，以20μL的反应体系，每次逆转录20ng-5μg总RNA量。

[0067] ②RNA变性：将1μL oligo(dT)12-18(500μg／mL)，1μL10mM dNTP混合物(dATP，dTTP，dCTP，dGTP均为10mM，pH中性)，RNA加入到无核酸酶的0.2mL离心管中，加入DEPC水至13μL，混合物在65℃下加热5min，迅速置于冰上冷却。

[0068] ③RNA逆转录：向微量离心管中加入4μL5×第一链合成缓冲液，2μL0.1M DTT，将各成分离心混合，并在37℃下孵育2min；向体系中加入1μL M-MLV(逆转录酶)。

[0069] ④将体系置于PCR仪上37℃50min，70℃15min完成逆转，保存于-20℃冰箱备用。

[0070] (6)QPCR检测FGF21mRNA的表达状况

[0071] 根据实验的设计要求，通过美国国立图书馆基因库查询，设计小鼠FGF21的基因序列和相关基因mRNA表达扩增引物，序列如下所示：

[0072] mFGF21 F：5’-CTGGGGGTCTACCAAGCATA-3’

[0073] R：5’-CACCCAGGATTTGAATGACC-3’

[0074] 18s RNA F：5’-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3’，

[0075] R：5’-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3’

[0076] miNOS F：5’-ACGTTGGATTTGGAGCAGAA-3’

[0077] R：5’-TGGTAGGATTTGACTTTGAAGAG-3’

[0078] mTGF-β F：5’-GAGACGGAATACAGGGCTTT-3’

[0079] R：5’-ACGTGGAGTTTGTTATCTTTGC-3’

[0080] mTNF-α F：5’-TGGAACTGGCAGAAGAGG-3’

[0081] R：5’-AGACAGAAGAGCGTGGTG-3’

[0082] mACC1 F：5’-CCTCCGTCAGCTCAGATAC-3’

[0083] R：5’-CATGTGAAAGGCCAAACCAT-3’

[0084] mGPAT F：5’-TGGGTTCAAACCTACCTTC-3’

[0085] R：5’-GGCTCTCCTTCCATTTCAG-3’

[0086] mFAS F：5’-TTCTGGGCCAACCTCATT-3’

[0087] R：5’-AGCCTTCCATCTCCTGTCATC-3’

[0088] mSCDl F：5’-CCCTGCGGATCTTCCTTAT-3’

[0089] R：5’-CCATTCGTACACGTCATTC-3’

[0090] mHMGR F：5’-GTATTGCTGGCCTCTTCAC-3’

[0091] R：5’-AGCCTGTCAGTTCTTTGTCG-3’

[0092] mINSIG-1 F：5’-CCTTGGGCTTGGGATTAC-3’

[0093] R：5’-CACCATTATACACAAGAAACTGA-3’

[0094] 取上述所获得的逆转好的cDNA，采用SYBR-Green定量PCR法，根据下面的反应体系和进行QPCR扩增：

[0095] SYBR-Green QPCR反应体系：

[0096]

[0097] SYBR-Green QPCR扩增条件：

[0098] 95℃1min

[0099]

[0100] 同时做溶解曲线分析。

[0101] 4.案例结果

[0102] (1)重组人FGF21蛋白延缓apoE KO小鼠的体重增长

[0103] 在本项目中，申请人观察了重组人FGF21蛋白对apoE KO小鼠的影响，结果发现：重组人FGF21蛋白显著抑制apoE KO小鼠(动脉粥样模型动物)体重增长。如图1A所示，与对照组apoE KO小鼠(C组)相比较，给予100μg／kg和400μg／kg重组人FGF21蛋白处理小鼠(A／B两组)的体重增加显著减缓；通过比较体重增加量分析所示(图1B)，在给药2周至三周期间，100μg／kg和400μg／kg重组人FGF21蛋白处理组apoE KO小鼠的体重增加几乎停止，但随后又出缓慢增加的现象。

[0104] 此外，重组人FGF21蛋白处理能也显著降低apoE KO小鼠肝脏组织重量，如图1C所示，400μg／kg剂量组的肝脏重量显著低于对照组(C组)小鼠(0.99±0.05vs.1.4±0.05g；p=0.0004)，并且400μg／kg组和100μg／kg两个剂量组之间也存在显著差异(0.99±0.05vs.1.23±0.08g；p=0.0330)。此外，如图1D所示，400μg／kg剂量的重组人FGF21蛋白处理也显著降低apoE KO小鼠肝脏／体重的比值(p=0.0309)，但在100μg／kg和400μg／kg两组剂量之间，肝脏／体重比值不存在差异。

[0105] (2)重组人FGF21蛋白降低apoE KO小鼠异常血脂水平

[0106] 在本实验中，申请人通过全身性给药于apoE KO小鼠，结果发现：重组人FGF21蛋白能显著降低异常的apoE KO小鼠血脂状况，缓解高脂饮食和apoE基因缺失所带来的脂质代谢压力(表1)。如图2A所示，重组人FGF21蛋白处理能显著降低apoE KO小鼠的血清甘油三酯(以下简称为TG)水平，与对照组相比，100及400μg／kg剂量的重组人FGF21蛋白分别降低apoE KO小鼠血清甘油三酯水平18.8％(p=0.014)和28.3％(p=0.015)；同时，如图2B所示，重组人FGF21蛋白处理也能显著降低apoE KO小鼠血清游离脂肪酸(以下简称为NEFA)水平，100及400μg／kg剂量的重组人FGF21蛋白分别降低血清游离脂肪酸水平17.6％(p=0.0162)和33.7％(p=0.0004)，并且在两个剂量组之间，血清游离脂肪酸水平也存在显著差异(p=0.0319)；在低密度脂蛋白(以下简称为LDL)方面，如图2C所示，100及400μg／kg剂量的重组人FGF21蛋白也呈现剂量依赖地下调LDL(p=0.0275)，LDL血清水平分别下降23.3％(p=0.0427)和28.8％(p=0.0275)；在总胆固醇(以下简称为TC)方面，如图2D所示，100及400μg／kg剂量的FGF21也呈现剂量依赖地下调TC水平，TC血清水平分别下降13.7％(p=0.0015)和16.7％(p=0.0008)；此外，在高密度脂蛋白(以下简称为HDL)方面(图2E)，与对照组相比较，400μg／kg剂量组apoE KO小鼠HDL水平上调25.2％(p=0.0119)；100μg／kg剂量组的HDL也有上升的趋势，但没有显著的差异(p=0.096)。

[0107] 表1FGF21处理对apoE KO小鼠脂质代谢的影响

[0108]

[0109] *P<0.05VS control，#P<0.01VS control， P<0.0001VS control[0110] (3)重组人FGF21蛋白对apoE KO小鼠肝脏代谢的影响

[0111] ①重组人FGF21蛋白与肝脏脂肪堆积

[0112] 在本项目中，申请人发现重组人FGF21蛋白能显著减轻甘油三酯在apoE KO小鼠肝脏组织中的堆积。如表1和图3A所示，与对照组相比较，100和400μg／kg剂量的重组人FGF21蛋白分别降低肝脏组织中46.2％(p=0.0012)和65.6％(p<0.0001)的甘油三酯含量；此外，在100和400μg／kg两个剂量组之间，肝脏组织中的甘油三酯含量与重组人FGF21蛋白的剂量存在剂量依赖效应的关系，两者之间也存在显著的差异(p=0.0425)。此外，如图3B所示，400μg／kg剂量的重组人FGF21蛋白处理还显著下调apoE KO小鼠肝脏游离脂肪酸的含量。然而，油红O染色实验结果显示：肝脏组织总脂质含量在重组人FGF21蛋白处理的apoE KO小鼠中显著降低(图3C／D)。

[0113] ②重组人FGF21蛋白与肝脏损伤标记物的表达状况

[0114] 在本项目中，申请人进一步探索重组人FGF21蛋白与高脂饮食和apoE基因缺失所引发的代谢压力对肝脏的损失状况，结果表明，重组人FGF21蛋白能减轻高脂饮食及脂质代谢混乱对肝脏组织的损害作用。如图4A／B所示，尽管HE染色结果提示本实验的apoE KO小鼠肝组织在形态学方面并未出现显著的损伤状况，但在分子水平方面则已经开始出现了显著的改变。在apoE KO对照组中，肝脏损伤标记物TNF-α(图4C)、TIMP-1(图4D)、IL-1(图 4E)、TGF-β(图4F)、及iNOS(图4G)的mRNA表达水平显著上升，这表明高脂饮食和apoE基因缺失对小鼠的肝脏已经造成了一定程度的损伤；但是，在重组人FGF21蛋白处理的apoE KO小鼠肝脏组织中，这些肝脏损伤标记物的mRNA表达水平显著下降；此外，在100和400μg／kg两个剂量组之间，这些肝脏损伤标记物还呈现出剂量依赖的下调。这说明重组人FGF21蛋白能显著缓解高脂饮食及脂质代谢混乱对apoE KO小鼠肝脏组织所造成的损伤。

[0115] ③重组人FGF21蛋白调节apoE KO小鼠肝脏胆固醇、脂肪代谢

[0116] 在本项目中，申请人采用重组人FGF21蛋白处理apoE KO小鼠。结果表明，在对照组apoE KO小鼠中，包括乙酰酺酶A羧化酶(ACC1)、脂肪酸合成酶(FAS)、3-磷酸甘油酰基转移酶(GPAT)、十八烷酰酺酶A去饱和酶1(SCD1)等肝脏脂肪合成及代谢等主要调节基因的mRNA表达水平显著上升，这说明在apoE KO小鼠中，肝脏的胆固醇、脂肪代谢处于紊乱状况；然后，在重组人FGF21蛋白处理后，apoE KO小鼠肝脏中包括ACC1(图5A)、FAS(图5B)、GPAT(图5C)、SCD1(图5D)在内的几个参与脂肪合成、氧化调控相关基因的mRNA水平显著降低，但对FoxA2基因的表达无显著影响。

[0117] 在脂蛋白代谢调节方面，对照组apoE KO小鼠肝脏组织CD36的mRNA表达显著上升，而PON1则显著下调。在重组人FGF21蛋白处理后，CD36基因的表达水平显著下降(图5E)，而PON1的表达水平则出现上调(图5F)。这表明重组人FGF21蛋白处理将直接影响apoE KO小鼠脂蛋白代谢的调控过程。

[0118] 在胆固醇、胆汁酸代谢调节方面，对照组apoE KO小鼠肝脏组织HMGR(图6A)、INSIG-1(图6B)的mRNA表达显著上升，而INSIG-2(图6C)的基因表达则显著下调。在重组人FGF21蛋白处理后，HMGR和INSIG-1基因mRNA的表达则显著下调，而INSIG-2基因表达则出现显著上升的状况，但对胆固醇12a羟化酶B1(CYP8B1)则影响不大。

[0119] 在肝细胞核因子方面，重组人FGF21蛋白处理将显著上调HNF4α基因的表达(图6D)，而对PPAR-γ基因表达则表现出显著的抵制作用(图6E)。此外，与对照组相比，重组人FGF21蛋白处理后，apoE KO肝组织载脂蛋白apoD(图6F)、脂联素APN(图6G)基因的mRNA表达水平显著上升；有趣的是，与对照组相比较，重组人FGF21蛋白处理后，apoE KO小鼠血清adiponectin水平也显著显著上升(图6H)。

[0120] ④重组人FGF21蛋白对肝脏糖原的影响

[0121] 在本项目中，申请人的实验结果显示(图7A／B)，在高脂喂养的对照组apoE KO小鼠中，肝脏糖原含量处于较高的水平，这说明高脂饮食的apoE KO小鼠的肝糖原处于高度堆积状况；在给予重组人FGF21蛋白后，与对照组相比较，apoE KO小鼠肝脏糖原的含量显著降低。这说明重组人FGF21蛋白处理能减轻apoE KO小鼠肝糖原在肝脏组织细胞中的堆积。

[0122] ⑤重组人FGF21蛋白对肝脏代谢相关信号通路的调控作用

[0123] 本项目中，申请人还观察了apoE KO小鼠肝脏中相关的基因信号通路途径。WB实验结果显示(图7C)：在高脂饮食喂养的apoE KO小鼠肝脏组织中，JNK基因的磷酸化水平显著高于WT小鼠，而重组人FGF21蛋白处理后，JNK磷酸化水平则显著降低。这说明，高脂饮食及apoE基因缺陷激发JNK基因信号，重组人FGF21蛋白处理能抑制高脂饮食及apoE基因缺陷所引发JNK基因表达。

[0124] 此外，在高脂饮食喂养的apoE KO小鼠肝脏组织中，p-P38信号基因的磷酸化水平也显著高于WT小鼠，而在重组人FGF21蛋白处理小鼠中，p-P38磷酸化水平则显著降低(图7C)。这也说明，在高脂饮食及apoE基因缺陷将激发p-P38基因信号，而重组人FGF21蛋白处理能抑制高脂饮食及apoE基因缺陷所引发p-P38基因磷酸化信号通路。

[0125] (4)重组人FGF21蛋白促进胆固醇逆转运

[0126] 在本项目中，为了探索重组人FGF21蛋白对apoE KO小鼠胆固醇代谢的影响，申请人观察了各组apoE KO小鼠小肠组织中与胆固醇逆转运相关的ABCA1、ABCG1基因的表达状况。实验结果显示，与对照组poE KO小鼠相比，重组人FGF21蛋白处理组能显著上调小肠ABCA1、ABCG1的基因mRNA表达水平(图8)，表明重组人FGF21蛋白能够促进单胆固醇的逆转运。

[0127] (5)重组人FGF21蛋白对apoE KO小鼠血管病变的影响

[0128] ①重组人FGF21蛋白降低apoE KO小鼠主动脉血管中膜厚度

[0129] 在本项目中，申请人观察了重组人FGF21蛋白对apoE KO血管病变的影响，如图9所示，HE染色实验结果表明：在apoE KO对照小鼠中，升主动脉弓处的血管中膜厚度明显增厚，内膜中有大量巨噬细胞浸润，内有脂质沉积，形成泡沫细胞，管腔变窄；而在重组人FGF21蛋白处理6周后，apoE KO小鼠血管中膜厚度显著降低，内膜中细胞浸润及脂质堆积的情况减少。

[0130] ②重组人FGF21蛋白减轻apoE KO小鼠血管硬化斑块面积

[0131] 为了进一步探索重组人FGF21蛋白与动脉粥样硬化病变之间的关系，申请人观察了重组人FGF21蛋白处理后apoE KO小鼠血管斑块的形成的变化状况。在高脂饲养apoE KO对照组中，打开胸腔主动脉血管有明显的粥样斑块形成，肉眼观察呈灰白色颗粒状、息肉状、不规则或椭圆形，或互相融合成条索状与动脉纵轴平行。如图10A所示，血管内膜油红染色结果显示，对照组apoE KO小鼠的主动脉血管内膜红色的脂质斑块显著增加，而重组人FGF21蛋白处理组的apoE KO小鼠主动脉血管所出现的红色脂质斑块则显著减少。此外，在主动脉弓根部组织切片油红O染色结果也获得相似的结果(图10B)，在apoE KO对照组2
中，小鼠主动脉弓根部的病变斑块的面积为0.16±0.015mm，而在重组人FGF21蛋白处理组
2
apoE KO小鼠主动脉弓根部的病变斑块的面积为0.13±0.012mm(p=0.042)。

[0132] ③重组人FGF21蛋白降低ICAM-1在血管组织中的表达

[0133] 细胞间黏附分子-1(以下简称ICAM-1)血管内皮细胞受损的前炎症因子。申请人观察了重组人FGF21蛋白处理后apoE KO小鼠病变血管组织中细胞间黏附分子-1(以下简称为ICAM-1)的表达状况。如图10C的免疫组化结果所示，在apoE KO对照组中，ICAM-1的表达显著上升，而FGF21处理后，其表达量则显著下调。这说明重组人FGF21蛋白处理后，血管组织中的ICAM-1表达显著下调，即血管内皮细胞受损程度降低。

[0134] 实施例2FGF21在冠心病患者中的临床表现

[0135] 1.CHD临床病例收集和临床分析方法

[0136] (1)临床诊断标准

[0137] 根据世界卫生组织(WHO)1999年发布的“缺血性心脏病的命名及诊断标准”及我国现行的CHD临床诊断标准将心绞痛或心肌梗死冠心病患者列为研究对象。具体的诊断标准如下：①心肌梗死的临床诊断是根据患者心电图检测结果、血清学检测出现血清酶升高、以及临床表现为胸部不适等症状进行评判。②心绞痛则是根据下面的临床表现及检测指标作为诊断标准，即主要表现为在经常出现情绪兴奋或运动后长达15min的胸部不适(休息或用硝酸酯制剂后则出现症状消失)，并伴有以下的心肌缺血的检测证据，即在药物负荷试验诱发缺血实验心电图中出现≥1mm的ST波段下降或是T波≥2mm处倒置的现象。

[0138] (2)病例收集

[0139] 根据上述的临床诊断标准，135例CHD患者(男67例／女68例)被收入本项目的研究工作。与此同时，61例(男31例／女30例)年龄、性别相匹配的正常人群被收录为本项目研究的对照组。所有入选本项目研究的人群入选前均由同一心血管内科医生进行问卷调查以及临床生化检查，对有心血管疾病、高血压和糖尿病等相关疾病病史的人群，以及以前使用过降脂、抗高血压或是治疗糖尿病药物的CHD患者均不能入选为本项目的研究对象。此外，所有入选对象包括CHD患者和正常对照人群均签署了书面知情同意书，所有的程序均由温州医学院伦理委员会批准。

[0140] (3)临床资料收集及生化检测

[0141] 对所有受试者进行相关临床问卷调查评估后，过夜禁食10h，收集血样标本，分离血清标本，-80℃冷冻保持。机体指数检测(身高、体重、身体质量指数、腰围和血压)和生化指标参照前的研究报道的方式进行。胰岛素抵抗参考前期报道的机体平衡模式进行胰岛素抵抗系数(HOMA-IR)评估。血清中FGF21(ELISAkit，Biovendor，Modrice，Czech Republic)和C-反应蛋白水平(CRP ELISAkit，R&D，USA)根据商业试剂公司提供的说明书进行检测；采用双位化学发光酶联免疫吸附法检测血清胰岛素(Diagnostic Products，Los Angeles，CA)；在经过认证的临床检验实验室，对空腹血糖、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、载脂蛋白A1(ApoA1)、载脂蛋白B100(ApoB100)、低密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯进行检测。

[0142] (4)统计学分析

[0143] 本项目所有分析均采用统计学软件13-0版本(SPSS，Chicago，IL)根据以前报道的临床研究方式进行统计分析。简单来说，正态分布数据通常用mean±SD描述。非正态分布的数据用Kolmogorox-Smimov检验，分析前进行对数转换，用四分位距表示中位数。采用Student's成组t检验进行组间比较。用Pearson's相关性校正组间差异，并用Bonferroni校正多个检验结果。用多元回归分析方法分析血清中FGF21与其它临床指标、生化指标等参数之间的关联性。变量与血清FGF21呈显著性相关(用Bonferroni校正多个检验)的参数进入多元回归分析。在所有统计检验结果中，P<0.05被认为具有统计学意义。

[0144] 2.案例结果

[0145] (1)CHD患者血清中循环FGF21水平显著升高

[0146] CHD患者和健康对照组的生化指标及临床特征如表2所示。196例参与者的血清FGF21水平范围为11.63-2614.9ng／L，血清FGF21水平无性别差异。以身体质量指数(BMI)校正后的(表1和图11A)统计分析结果显示，与对照组FGF21水平(167.9±15.6ng/L)相比较，CHD患者血清FGF21水平(513.5±47.5ng／L)显著高出3倍(P<0.0001)；另一方面，伴有糖尿病的CHD患者血清FGF21水平(530.0ng／L，[75.6-1941.3]，n=61，P=0.034)明显高于未伴有糖尿病的CHD患者(317.2ng／L，[59.1-680.5]，n=74，图11B)，这与Chen等人的报道是一致的。虽然伴有高血压CHD患者的血清FGF21水平呈现升高趋势(图11C)，但是伴有高血压CHD患者者的血清FGF21水平(462.2ng／L，[59.1-2614.9]，n=97)与无高血压CHD患者的血清FGF21水平(428.2ng/L，[77.8-1069.2]n=38)之间的并无显著差异(P=0.0718)。此外，同时伴有糖尿病、高血压的CHD患者的血清FGF21水平(502.3ng／L，[157.6-2614.9]，n=45)明显高于未伴有这些并发症的CHD患者的血清FGF21水平(410.5ng／L，[77.8-1069.2]，n=21，p=0.026，图11D)。逻辑回归分析显示，血清FGF21水平与CHD的流行独立相关(p=0.004)。

[0147] 表2冠心病患者及对照组人群的临床及生化指标

[0148]

[0149] Data are means±SEM or median(interquartile range).NS，not significant.[0150] (2)血清FGF21水平与异常脂质代谢、胰岛素抵抗之间的关系

[0151] 如表3和图12所示，以BMI为校正参数校正后，血清FGF21水平显著与甘油三酯，载脂蛋白B100(r=0.365，P<0.001；r=0.227，P=0.002)呈正相关性，与HDL-C和载脂蛋白A(r=-0.313，P<0.001；r=-0.338，P<0.001)呈负相关性。然而，血清FGF21水平与血液总胆固醇(TC)、LDL-C之间在本本课题中未见有显著的相关性。此外，以BMI为校正参数校正后，血清FGF21水平与空腹血糖，空腹胰岛素以及胰岛素抵抗指数高度相关(p<0.05)，但与胰岛素分泌指数(HOMA-IS)无明显的相关性。

[0152] 表3血清FGF-21水平与人体测量参数及生化指标的相关性

[0153]

[0154] *Log transformed before analysis.NS，not significant.#adjusted by BMI，hypertension and diabetes.

[0155] (3)血清FGF21水平与载脂蛋白A1、甘油三酯及空腹血糖独立相关

[0156] 为了明确血清FGF21是否与人体机体参数和心血管危险因素是否存在独立的相关性，申请人对与血清FGF21显著相关的所有参数(图12)进行了多元回归分析。分析显示，以糖尿病、高血压以及BMI为校正参数调整后，载脂蛋白A1(beta coefficient-0.304，95 ％ CI-0.500to-0.173，P<0.001)、空腹血糖 (beta coefficient0.219，95 ％C10.013to0.087，P=0.008)和甘油三酯(beta coefficient0.213，95％C10.016-0.124，P=0.011)与血清FGF21独立相关。然而，所有其它参数包括总胆固醇，高密度脂蛋白胆固醇，低密度脂蛋白胆固醇，载脂蛋白B100，胰岛素和胰岛素抵抗指数在回归分析过程中均被排除。

[0157] 实施例3FGF21在动脉粥样硬化小鼠模型中的表现

[0158] 1.动物分组-／-

[0159] 将20只8周龄apoE 雄性小鼠随机分成A／B两组，每组10只，其中A组采用高脂饲料喂养，B组采用正常饲料饮食饲养。同时取10只C57／BL6j正常小鼠作为实验对照组(C组)，并以正常饲料饮食饲养。

[0160] 2.小鼠血样标本采集

[0161] 在动物实验开始之前，将上述A／B两组禁食过夜，从眼底静脉采血，分离血清，-80℃冰箱保存，作为8周龄小鼠血清FGF21检测标本；然后在分别在12、24周龄时收集血样标本，观察血清FGF21循环水平的变化状况。

[0162] 3.动物处死及组织样品收集

[0163] 当各组动物满24周龄后，将小鼠禁食过夜，用乙醚麻醉，眼眶取血收集血样标本；小鼠处死后，依次打开腹胸腔，灭菌的PBS进行心脏灌流，除去血管中的残留血液，然后分离主动脉，在主动脉起始上0.2-0.4cm以及腹主动脉分叉处截取主动脉，将主动脉上的脂肪剥离干净，将主动脉冻存于液氮，用于分离提取RNA及蛋白样品。同时摘取心脏，去除心肌下半部分心肌组织后，包埋于OCT包埋液中，用于心脏组织冰冻切片制备；其它脏器：脾、肾、肝等，一部分冻存于液氮，用来做冰冻切片，提取RNA及蛋白；一部分固定于4％多聚甲醛，用来染色或做石蜡切片。

[0164] 4.主要研究内容的具体实验方法

[0165] (1)血清FGF21ELISA检测

[0166] 取上述所收集的小鼠血清，采用Biovendor提供的mouse FGF21ELISA试剂，检测FGF21 血清浓度。

[0167] (2)主动脉弓油红染色

[0168] ①将上述OCT包埋的主动脉弓心脏组织，采用冰冻切片机切成10μm厚度的组织心脏切片，室温条件下放置至组织切片出现干燥状况为止，然后放置于-80℃冰箱备用；

[0169] ②切片室温放置30min后，放置于ddH2O中2min，然后在油红染料工作液中放置30min；60％异丙醇冲洗至干净(约2min)，然后放置于流水冲洗3min以水溶性苏木精染色
30s；镜下控制染色结果；

[0170] ③流水冲洗2min后，以饱和碳酸氢钠中蓝化2min，流水冲洗2min，Fast green冲洗30s，流水冲洗2min；用水溶性甘油树胶封片剂封片。

[0171] (3)主动脉、肝脏等组织RNA提取及浓度测定

[0172] ①将存于液氮的各组小鼠肝脏组织取出，用高压灭菌手术剪刀剪取20-30mg肝组织于干净的1.5mL EP管中，加1mL Trizol，使用电动匀浆器高速匀浆组织，匀浆完组织放于冰上静置5min。对主动脉组织，先用高压灭菌眼科手术小剪刀剪切主动脉组织，然后参照上述提取方法进行。

[0173] ②RNA抽取：各管中加入0.2mL氯仿，盖紧EP管，上下颠倒混匀15s，室温静置2-3min；将组织于低温超速离心机上4℃12000g离心15min；取出EP管，此时EP管分三层，取上层液相于另备EP管中。

[0174] ③RNA沉淀：加0.5mL异丙醇，室温静置10min(异丙醇是上层液体积的0.6-1倍)，4℃12000g离心10min；弃上清，加1mL75％乙醇清洗沉淀；

[0175] ④RNA溶解：4℃7500g离心5min；弃上清，干燥RNA；根据RNA的量适当加入DEPC水溶解，备用；

[0176] ⑤RNA浓度测定：将提取的RNA在紫外分光光度计中测定260OD值、260／280比值，RNA浓度(μg／μL)=OD260×稀释倍数×40／1000。

[0177] (4)RNA逆转录合成cDNA

[0178] ①根据检测完的RNA浓度，以20μL的反应体系，每次逆转录20ng-5μg总RNA量。

[0179] ②RNA变性：将1μLoligo(dT)12-18(500μg／mL)，1μL10mM dNTP混合物(Datp，dTTP，dCTP，dGTP均为10mM，pH中性)，RNA加入到无核酸酶的0.2mL离心管中，加入DEPC水至13μL，混合物在65℃加热5min，迅速置于冰上冷却；

[0180] ③RNA逆转录：向微量离心管中加入4μL5×第一链合成缓冲液，2μL0.1M DTT，将各成分离心混合，并在37℃孵育2min；向体系中加入1μL M-MLV(逆转录酶)；

[0181] ④将体系置于PCR仪上37℃50min，70℃15min完成逆转，然后保存于-20℃冰箱备用。

[0182] (5)QPCR检测FGF21mRNA的表达状况

[0183] 根据实验的设计要求，通过美国国立图书馆基因库查询，设计小鼠FGF21的基因序列，序列如下所示：

[0184] F：5’-CTGGGGGTCTACCAAGCATA-3’；

[0185] R：5’-CACCCAGGATTTGAATGACC-3’。

[0186] 同时根据基因组GAPDH基因序列，设计出小鼠Actin内参基因的mRNA表达扩增引物，序列如下示：

[0187] F：5’-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3’；

[0188] R：5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3’。

[0189] 取上述所获得的逆转好的cDNA，采用SYBR-Green定量PCR法，根据下面的反应体系和进行QPCR扩增：

[0190] SYBR-Green QPCR反应体系：

[0191]

[0192] SYBR-Green QPCR扩增条件：

[0193] 95℃1min

[0194]

[0195] 同时做溶解曲线分析。

[0196] (6)主动脉、肝脏等组织蛋白提取及浓度测定

[0197] ①将PMSF与RIPA裂解液按照1：100比例配制组织裂解液，加入0.5M磷酸酶抑制剂NaF,终浓度为15mM；

[0198] ②将存于液氮的各组小鼠肝脏组织取出，用手术剪剪取30-50mg肝组织于干净的1.5mLEP管中，加入500μL配制好的裂解液，先将组织用干净的手术剪刀剪碎再使用电动匀浆器高速匀浆组织，匀浆完毕的样品静置于碎冰中20min，使蛋白充分溶出。

[0199] ③将静置好的样品于漩涡混悬器上充分混悬，低温超速离心机中4℃，12000r／min，离心15min，吸取上清，备用。

[0200] ④将上述所提取的蛋白采用BCA试剂盒测定蛋白浓度测定，具体如下示：按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50：1)配制适量BCA工作液，充分混匀，备用；将0.5mg／mL标准样品按照0，2.5，5，10，15，20，25μL加到96孔板的标准品孔中，不足25μL的用超纯水补齐；将适当比例稀释好的蛋白样品加入96孔板中，每孔加入25μL；各孔加入200μLBCA工作液，37℃放置30min；测定A562，根据标准曲线计算出蛋白浓度。

[0201] (7)免疫印记(Western Blotting)检测

[0202] ①SDS-PAGE电泳

[0203] 将蛋白样品稀释为相同浓度，取蛋白样品10μL(40μg总蛋白)，与等体积的2×上样缓冲液(或5×上样缓冲液，视蛋白浓度而定，上样蛋白浓度为30-40μg)混均后，100℃煮沸5min，10000g离心5min，取上清液进行SDS-PAGE电泳。电压为80V／110V进行电泳，当染料到达凝胶底部边缘时即可停止电泳。

[0204] ②转膜

[0205] 将滤纸、海绵垫、放置于电转液中，浸泡30-60min，同时准备与大小为相同的PVDF膜。先将PVDF膜用甲醇泡30s，然后用ddH2O洗2min，然后放置于转移液中浸泡30min。SDS-PAGE完成后，取下胶，将浓缩胶去掉，然后将海绵垫，滤纸，胶，膜，滤纸，海绵垫按此顺序放到黑白板上，注意PVDF膜一定要放在白板一边，同时排尽其中的空气，然后将黑白板夹紧放到架子上，注意正负极对准。使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置(使用冰盒)，可以设定转膜电流为300mA，转膜时间为60min(根据目的蛋白分子量的大小，确定转膜时间，
60KD以下的分子转膜1h即可，60-100KD蛋白分子转膜90min)。

[0206] ③封闭

[0207] 转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的PBS中，漂洗1-2min，以洗去膜上的转膜液(从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景)。加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温封闭120min。对于一些背景较高的抗体，可以在4℃封闭过夜，用洗涤液洗3次，每次5min。

[0208] ④免疫检测

[0209] 一抗孵育：洗涤后，加入稀释好的一抗，摇床上缓慢摇动孵育1h(一抗孵育1h不佳，可以在4℃缓慢摇动孵育过夜)。回收一抗。洗涤：加入Westem洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10min。共洗涤3次。

[0210] 二抗孵育：滤纸吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温，在侧摆摇床上缓慢摇动孵育2h。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10min。共洗涤3次，第一次洗涤10min，第二次、第三次分别洗涤5min。

[0211] 检测：将膜用滤纸吸干，用ECL超敏发光液孵育5min。显影，定影，使用胶片曝光，或者直接使用凝胶成像系统拍照。

[0212] 5.统计学分析

[0213] 所有实验数据均输入GraphPad Prism5.0统计软件包进行统计分析，P<0.05为差异有显著性。主要实验数据来自三次重复实验，以mean±SD表示，P<0.05为差异有显著性。

[0214] 6.案例结果

[0215] (1)apoE KO小鼠血清FGF21的变化状况

[0216] 为探索FGF21在动脉粥样硬化小鼠中的表现，申请人初步探索apoE KO动脉粥样硬化小鼠的血清FGF21变化与年龄、饮食之间的状况。实验结果表明，当apoE KO小鼠年龄到达12周龄时，升主动脉弓根部油红O染色显示小鼠已经出现少量的硬化斑块(图13A)，而到24周龄时，血管硬化斑块的面积进一步扩大(图13B)，这说明随着年龄的发展，apoE KO小鼠心血管病变也进一步恶化。为了探索FGF21与动脉粥样硬化之间的关系，申请人观察了apoE KO小鼠血清循环水平的变化状况，研究实验结果表明：apoE KO小鼠血清FGF21循环随着年龄的增长，病情的恶化而显著增加；并且与高脂饮食密切相关。如图13C所示：8周龄apoE KO小鼠的血清FGF21循环水平处于较低的水平，FGF21血清水平均为175.9±46.78ng／mL；当apoE KO小鼠给予高脂饮食饲养或给予正常饮食饲养4周，即小鼠年龄到达12周时，高脂及正常饮食饲养的apoE KO小鼠血清FGF21水平均显著上升，并且在正常饮食和高脂喂养两组之间存在显著的差异(2.03±0.38vs.1.02±0.20ng／mL，p=0.0238)；此外，当年龄增长至24周时，高脂及正常饮食饲养的apoE KO小鼠血清FGF21的水平进一步上升，两组之间的FGF21血清循环水平存在显著差异(4.40±1.06vs.1.57±0.28ng／mL，p=0.0091)，同时两组之间的差异进一步增加。

[0217] (2)FGF21在apoE KO小鼠相关器官的表达差异

[0218] 为了探索FGF21在apoE KO动脉粥样硬化中小鼠模型中的表现，申请人采用QPCR方法，探索FGF21mRNA在apoE KO小鼠及与遗传背景和年龄相同的C57BL／6J小鼠中各器官的表达状况。FGF21是主要来源于肝脏组织的一个生长因子，为此，申请人首先观察了FGF21在肝脏组织中的表达状况。免疫组化检测结果显示：与遗传背景和年龄相同的C57BL／6J小鼠相比(图14A)，在24周龄的动脉粥样硬化小鼠模型中，FGF21蛋白在肝脏组织中显著升高(图14B)；此外，QPCR检测结果显示(图14C)，在WT及apoE KO小鼠肝脏组织中，apoEKO小鼠肝脏FGF21mRNA表达水平显著高于WT小鼠(p=0.047)。在动脉血管组织中，申请人发现apoE KO小鼠动脉组织中FGF21mRNA表达水平也显著也显著高于对照组WT小鼠(p=0.0002)，并具有较高的表达水平；此外，在肾脏组织中，FGF21mRNA表达也显著高于对照组WT小鼠(p=0.048)，但其表达量显著低于肝脏及主动脉血管组织；而在脾脏组织中，apoE KO小鼠的FGF21mRNA表达也有上升的趋势，但与对照组WT小鼠相比，两者并不存在显著差异，并且其表达量也显著低于肝脏及动脉组织(图14C)。

[0219] (3)apoE KO小鼠中FGF21在动脉粥样硬化板块中的表达

[0220] 为探索FGF21与动脉粥样硬化发生发展之间的关系，本研究进一步观察了FGF21在apoEKO小鼠粥样斑块中的表达状况。首先，申请人观察了24周龄apoE KO小鼠的病变状况，油红O染色显示(图15A)，与同年龄组对照组相比较，24周龄正常饮食apoE KO小鼠主动脉弓已处于严重的动脉粥样硬化病理状况，血管中膜的厚度显著增加，而在血管内膜组织中，大量的红色脂质斑块出现，并且斑块占据动脉血管内框的面积已显著增加；而在WT小鼠中未见有上述的病变状况。与此同时，申请人还观察了FGF21在动脉斑块中的表达状况，免疫组织化学实验结果显示(图15B)：在24周龄apoE KO小鼠的血管组织中，FGF21蛋白表达显著高于遗传背景及年龄相同的WT小鼠，这些FGF21主要出现于血管瓣膜边缘的相关细胞，并且，在中内膜组织中也出现有相应的FGF21蛋白表达。此外，在动脉血管组织中，apoE KO小鼠FGF21mRNA的表达水平也显著高于WT对照组(图14C)；此外，免疫印记(WB)检测结果还显示：FGF21在apoE KO动脉粥样硬化小鼠的主动脉组织中的表达水平显著高于遗传背景和年龄相同的野生型小鼠(图15C／D)。

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永生化鸡胚成纤维细胞-专利编号CN107002044A	2020-05-12	895
ETS2和MESP1由成纤维细胞生成心脏祖细胞-专利编号CN102844428A	2020-05-11	890
成纤维细胞生长因子11-专利编号CN1414101A	2020-05-13	875
ETS2和MESP1由成纤维细胞生成心脏祖细胞-专利编号CN102844428B	2020-05-11	367
防止成纤维细胞皱缩-专利编号CN104582683A	2020-05-12	966
成纤维细胞增殖剂-专利编号CN101795668B	2020-05-12	500
一种成纤维细胞培养液-专利编号CN102690782A	2020-05-13	506
成纤维细胞生长因子11-专利编号CN1181110A	2020-05-13	114
诱导成纤维细胞形成软骨细胞的方法-专利编号CN100482784C	2020-05-11	565
诱导成纤维细胞形成软骨细胞的方法-专利编号CN1661010A	2020-05-11	855

重组人成纤维细胞生长因子21在预防治疗动脉粥样硬化及相关疾病中的应用

重组人成纤维细胞生长因子21在预防治疗动脉粥样硬化

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