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用于治疗视网膜营养不良的病毒载体

阅读：1064发布：2020-09-05

IPRDB可以提供用于治疗视网膜营养不良的病毒载体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及能够递送异源基因至视网膜、特别是递送RLBP1至视网膜的RPE和米勒细胞的病毒载体。本发明还涉及可用于产生病毒载体的核酸、包含该病毒载体的组合物和该组合物和病毒载体的用途。本发明还涉及递送异源基因至视网膜和/或在其中表达异源基因、提高个体的暗适应速率和治疗RLBP1相关视网膜营养不良的方法。，下面是用于治疗视网膜营养不良的病毒载体专利的具体信息内容。

权利要求

1.具有包含视黄醛结合蛋白1(RLBP1)编码序列的载体基因组的病毒载体，其中所述载体适于引导RLBP1编码序列在视网膜的视网膜色素上皮(RPE)细胞和米勒细胞中表达。

2.权利要求1的病毒载体，其中所述载体包含腺相关病毒(AAV)血清型2或8衣壳。

3.权利要求2的病毒载体，所述载体基因组以5’至3’方向包含：(i)5’ITR；

(ii)包含RLBP1编码序列的重组核苷酸序列；和(iii)3’ITR。

4.权利要求3的病毒载体，其中在重组核苷酸序列中以5’至3’方向包含：(i)启动子；(ii)RLBP1编码序列；和(iii)SV40polyA序列。

5.权利要求4的病毒载体，其中所述启动子的核苷酸序列选自SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:10。

6.权利要求4的病毒载体，其中载体基因组以5’至3’方向包含选自由以下组成的组的核酸序列：a)SEQ ID NO:2、10、5、6、8和9；

b)SEQ ID NO:2、11、5、6、8、14、9；

c)SEQ ID NO:2、22、5、6、8、23和9；以及d)SEQ ID NO:2、3、4、5、6、8、23和9。

7.权利要求2的病毒载体，其中所述载体基因组以5’至3’方向包含：(i)5’ITR；

(ii)第一重组核苷酸序列；

(iii)不可解析ITR；

(iv)第二重组核苷酸序列；和

(v)3’ITR，

其中第一重组核苷酸序列和第二重组核苷酸序列为自身互补的。

8.权利要求7的病毒载体，其中在第二重组核苷酸序列中以5’至3’方向包含：(i)启动子；(ii)RLBP1编码序列；和(iii)SV40polyA序列。

9.权利要求8的病毒载体，其中所述启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO:3。

10.权利要求8的病毒载体，其中载体基因组以5’至3’方向包含：SEQ ID NO:36、62、

63、64、65、66、1、3、4、5、6、8和9的核酸序列。

11.包含能够在视网膜的RPE细胞和米勒细胞中表达异源基因的载体基因组的病毒载体，所述载体包含a)AAV8或AAV2衣壳，和b)包含有效连接到异源基因的RLBP1启动子的所述载体基因组，其中所述RLBP1启动子具有选自SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:10的序列。

12.权利要求11的病毒载体，其中载体基因组为自身互补的。

13.组合物，其包含前述权利要求中任一项的病毒载体。

14.权利要求13的组合物，其还包含可药用的赋形剂。

15.在视网膜细胞中表达异源基因的方法，所述方法包括使所述视网膜细胞与病毒载体接触，所述病毒载体包含：a)AAV2或AAV8衣壳，和b)包含有效连接到异源基因的SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:10的RLBP1启动子的载体基因组。

16.权利要求15的方法，其中视网膜细胞为RPE细胞和米勒细胞。

17.权利要求16的方法，其中载体基因组为自身互补基因组。

18.权利要求15-17中任一项的方法，其中异源基因为RLBP1。

19.包含基因盒的核酸，所述基因盒以5’至3’方向包含：(i)5’ITR或不可解析ITR；

(ii)包含RLBP1编码序列的重组核苷酸序列；和(iii)3’ITR。

20.权利要求19的核酸，其是质粒。

21.权利要求19的核酸，其中：

(i)所述5’ITR或所述不可解析ITR分别具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:1的核酸序列；

(ii)所述重组核酸序列包含具有选自SEQ ID NO:3、10、11、12和22的核酸序列的启动子，所述启动子有效连接到具有SEQ ID NO:3的核酸序列的所述RLBP1编码序列；或(ii)所述3’ITR具有SEQ ID NO:9的核酸序列。

22.权利要求19的核酸，其中基因盒包含选自SEQ ID NO:51、52、53、54和55的核酸序列。

23.权利要求19的核酸，还包含选自SEQ ID NO:26、27、28、29、30和50的核酸序列。

24.权利要求19的核酸，其中基因盒以5’至3’方向包含选自以下的序列：a)SEQ ID NO:2、10、5、6、8和9，b)SEQ ID NO:2、11、5、6、8、14和9，c)SEQ ID NO:2、22、5、6、8、23和9，d)SEQ ID NO:2、3、4、5、6、8、23和9，或e)SEQ ID NO:1、3、4、5、6、8和9。

25.治疗患有RLBP1相关视网膜营养不良的对象的方法，所述方法包括向对象施用权利要求13的组合物。

26.提高患有RLBP1相关视网膜营养不良的对象中的暗适应速率的方法，所述方法包括向对象施用权利要求13的组合物。

27.在患有RLBP1相关视网膜营养不良的对象的视网膜中的RPE细胞和米勒细胞中表达RLBP1编码序列的方法，所述方法包括将所述对象的视网膜与权利要求6或10的病毒载体接触的步骤。

28.权利要求13的组合物，其用于治疗患有RLBP1相关视网膜营养不良的对象。

29.权利要求13的组合物，其用于提高患有RLBP1相关视网膜营养不良的对象中的暗适应速率。

30.权利要求6或10的病毒载体，其用于在患有RLBP1相关视网膜营养不良的对象的视网膜中的RPE细胞和米勒细胞中表达RLBP1编码序列。

说明书全文

用于治疗视网膜营养不良的病毒载体

[0001] 相关申请

[0002] 本申请要求于2012年5月4日提交的美国临时申请第61/642,630号和2013年3月11日提交的美国临时申请第61/776,167号的优先权，其内容整体地并入本文以作参考。

[0003] 发明背景

[0004] 色素性视网膜炎(RP)是指导致视力损失和失明的视网膜感光细胞(视杆细胞和视锥细胞)的一组遗传变性。多种基因中任一者的突变可导致RP，这些基因包括编码在光转导(光的光子能量在感光细胞外区段中转换成神经元信号的过程)、视觉循环(视网膜中维生素A的产生和再循环)、光感受器结构以及转录因子中所涉及的蛋白质的基因(Phelan and Bok,2000)。

[0005] RLBP1相关的视网膜营养不良是由染色体15上的视黄醛结合蛋白1(RLBP1)基因中的突变而引起的罕见形式的RP。此基因的突变导致细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)缺失或功能障碍，该细胞视黄醛结合蛋白在视觉循环中很重要(He等人2009)。CRALBP在视网膜色素上皮(RPE)及米勒细胞(Miiller cell)、睫状上皮、虹膜、角膜、松果体及视神经和脑的少突胶质细胞的亚群中表达(Saari等人1997)。CRALBP接受来自异构酶RPE65的11-顺-视黄醇且充当此底物的载体，以便由11-顺-视黄醇脱氢酶(RDH5)将该底物转化成11-顺-视黄醛。在不存在功能性CRALBP的情况下，发色团再生速率急剧减小(Travis等人2007)。CRALBP在RPE外的功能并未得到充分了解，但已表明米勒细胞中的CRALBP支持视锥特异性的视通路，其允许视锥细胞迅速适应广泛范围的光强度(Wang和Kefalov
2011)。

[0006] RLBP1相关的视网膜营养不良的特征为早期严重夜盲和缓慢暗适应，随后是进行性损失视敏度、视野和色觉，通常大约在成年中期导致法定盲。眼底外观的特征为视网膜中的黄点或白点。视敏度和视野的降低显著影响患者的生活质量(Burstedt和2010)。

[0007] 导致RLBP1相关的视网膜营养不良的最常见RLBP1突变是隐性突变，命名为R234W和M226K(Golovleva I和Burstedt M 2012)。由这些隐性错义突变中之一或二者引起的RLBP1相关的视网膜营养不良也称为Bothnia营养不良。已报导RLBP1基因中的若干其他功能损失型突变导致RLBP1相关的视网膜营养不良。举例而言，在纽芬兰(Newfoundland)，RLBP1的剪接点突变导致视杆-视锥细胞营养不良。目前尚没有可用于RLBP1相关视网膜营养不良的治疗(Eichers等人2002)。

[0008] 本发明部分基于以下发现：具有所选的启动子、AAV基因组和衣壳血清型的组合的重组腺相关病毒载体(rAAV)的RLBP1的表达提供用于RLBP1相关视网膜营养不良的强力且有效的治疗。

[0009] 发明概述

[0010] 本发明大体上涉及重组病毒载体和使用重组病毒载体在罹患视网膜疾病和失明的对象的视网膜中表达蛋白质的方法。

[0011] 本发明涉及能够将异源基因递送至视网膜的病毒载体。本发明还涉及能够将异源基因引导至视网膜的RPE和米勒细胞的病毒载体。本发明进一步涉及是重组腺相关病毒载体(rAAV)的病毒载体。在某些实施方案中，rAAV病毒载体可选自本领域内已知的任何AAV血清型，包括但不限于AAV1-AAV12。在某些实施方案中，rAAV载体衣壳为AAV2血清型。在某些其他实施方案中，rAAV载体衣壳为AAV8血清型。

[0012] 本发明部分涉及携带单链载体基因组的病毒载体。在单链病毒载体中，载体基因组可包括5’ITR，包含RLBP1编码序列的重组核苷酸序列以及3’ITR。载体基因组的重组核酸序列也可包括如本文所述的启动子。在一个方面，启动子为RLBP1(长)启动子(SEQ ID NO:10)，在另一方面，启动子为RLBP1(短)启动子(SEQ ID NO:3)。在本发明的某些特定方面，载体基因组以5’至3’方向包含选自以下的核酸序列：a)SEQ ID NO:2、10、5、6、8和9；b)SEQ ID NO:2、11、5、6、8、14、9；c)SEQ ID NO:2、22、5、6、8、23和9；以及d)SEQ ID NO:2、
3、4、5、6、8、23和9。

[0013] 本发明还部分地涉及携带自身互补基因组的病毒载体。自身互补载体基因组自5’至3’可包括5’ITR、第一重组核苷酸序列、不可解析ITR(例如：ΔITR)、第二重组核苷酸序列以及3’ITR，其中该第一重组核苷酸序列和该第二重组核苷酸序列为自身互补的。第二重组核苷酸序列以5’至3’方向包含启动子、RLBP1编码序列及SV40polyA序列。启动子可以是RLBP1启动子且还可以是RLBP1(短)启动子(SEQ ID NO:3)。在本发明的某些方面，第二重组核苷酸序列以5’至3’方向包含SEQ ID NO:3、4、5、6和8的核酸序列，且第一重组核苷酸序列包含第二重组序列的自身互补或反向互补序列，例如SEQ ID NO:62、63、64、65和66。本发明还涉及包含自身互补载体基因组的病毒载体，其中基因组以5’至3’方向包含以下的核酸序列：SEQ ID NO:36、62、63、64、65、66、1、3、4、5、6、8和9。上述的自身互补载体基因组可包装于AAV衣壳中，该AAV衣壳选自领域内已知的任何AAV血清型，包括但不限于AAV1-12。在一个方面，自身互补基因组包装于AAV8衣壳中。在另一方面，自身互补基因组包装于AAV2衣壳中。

[0014] 本发明还涉及能够引导异源基因至视网膜的RPE和米勒细胞中表达的病毒载体。设想病毒载体衣壳为AAV2或AAV8血清型衣壳且病毒载体包含载体基因组，其中该异源基因与RLBP1启动子有效连接。还设想RLBP1启动子为RLBP1(短)启动子(SEQ ID NO:3)或RLBP1(长)启动子(SEQ ID NO:10)。在本发明的另一方面，设想要在RPE和米勒细胞中表达的异源基因是具有例如SEQ ID NO:6的序列的RLBP1编码序列。

[0015] 本发明还涉及能够引导异源基因至视网膜的RPE和米勒细胞中表达的病毒载体，其中病毒载体衣壳为AAV8血清型衣壳且病毒载体包含自身互补载体基因组，其中异源基因与RLBP1启动子有效连接。还设想RLBP1启动子为RLBP1(短)启动子(SEQ ID NO:3)。在本发明的另一方面，设想要在RPE和米勒细胞中表达的异源基因是具有例如SEQ ID NO:6的序列的RLBP1编码序列。

[0016] 本发明还涉及包含本文所述的病毒载体的组合物以及与可药用的载体组合的病毒载体组合物。具体而言，本发明还涉及包含如表4中所述的病毒载体的组合物。本发明还涉及包含病毒载体的组合物，所述病毒载体可结合领域内已知的以及本文所述的rAAV产生方法使用表2中所述的质粒来产生。本文所述的组合物可用于治疗患有RLBP1相关视网膜营养不良的对象和/或提高患有RLBP1相关视网膜营养不良的对象的暗适应速率。

[0017] 本发明还涉及通过领域内已知的以及本文所述的rAAV产生方法用于产生本文所述的病毒载体可使用的核酸。本发明涉及包含基因盒的核酸，其中该基因盒以5’至3’方向包含：(i)5’ITR或不可解析ITR，(ii)包含RLBP1编码序列的重组核苷酸序列，和(iii)3’ITR。设想核酸可包含基因盒，该基因盒包含选自SEQ ID NO:51、52、53、54和55的核酸序列。设想本发明的核酸可以是质粒。还设想核酸可以是包含选自SEQ ID NO:26、27、28、29、30和50的核酸序列的质粒。

[0018] 在本发明的某些特定方面，核酸可包含以5’至3’方向包含选自以下的序列的基因盒：a)SEQ ID NO:2、10、5、6、8和9，b)SEQ ID NO:2、11、5、6、8、14和9，c)SEQ ID NO:2、22、5、6、8、23和9，d)SEQ ID NO:2、3、4、5、6、8、23和9，或e)SEQ ID NO:1、3、4、5、6、8和9。

[0019] 本发明还涉及包含基因盒的核酸，其中该基因盒以5’至3’方向包含：(i)5’ITR，(ii)包含有效连接到报告基因的启动子的重组核苷酸序列，以及(iii)3’ITR。设想核酸可包含基因盒，该基因盒包含选自SEQ ID NO:56、57、59和60的核酸序列。还设想核酸可以是包含选自SEQ ID NO:31、32、34和35的核酸序列的质粒。

[0020] 本发明还涉及治疗患有RLBP1相关视网膜营养不良的对象的方法，其中该方法包含向有需要的对象施用包含如本文所述的病毒载体的组合物。

[0021] 本发明还涉及提高患有RLBP1相关视网膜营养不良的对象的暗适应速率的方法，其中该方法包含向有需要的对象施用包含如本文所述的病毒载体的组合物。

[0022] 本发明还涉及引导RLBP1编码序列至患有RLBP1相关视网膜营养不良的对象的视网膜中的RPE和米勒细胞中表达的方法，其中该方法包含使该对象的视网膜与病毒载体接触的步骤，该病毒载体包含AAV8或AAV2血清型衣壳以及包含有效连接到RLBP1启动子的RLBP1编码序列的载体基因组，该RLBP1启动子为例如本文所述的RLBP1(短)(SEQ ID NO:3)或RLBP1(长)(SEQ ID NO:10)启动子。

[0023] 本发明还涉及在患有RLBP1相关视网膜营养不良的对象的视网膜中的RPE和米勒细胞中递送RLBP1编码序列的方法，其中该方法包含使该对象的视网膜与病毒载体接触的步骤，该病毒载体包含AAV8或AAV2血清型衣壳以及包含有效连接到RLBP1启动子的RLBP1编码序列的载体基因组，该RLBP1启动子为例如本文所述的RLBP1(短)(SEQ ID NO:3)或RLBP1(长)(SEQ ID NO:10)启动子。

[0024] 本发明还包括如表1或表4中所述的病毒载体，以及表2中所述的质粒。

[0025] 定义

[0026] 除非另有规定，否则本文中所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。

[0027] 术语“衣壳”是指病毒或病毒载体的蛋白质包衣。术语“AAV衣壳”是指腺相关病毒(AAV)的蛋白质包衣，其由总共60个亚单位构成；各亚单位为氨基酸序列，其可以是病毒蛋白1(VP1)、VP2或VP3(Muzyczka N和Berns KI 2001)。

[0028] 术语“基因盒”是指携带和能够表达一组或多组限制性位点之间的一个或多个目的基因或编码序列的可操纵的DNA片段。可通过使用限制酶‘切’出片段并将该片段连接回新的环境中(例如新质粒骨架中)，使基因盒自一个DNA序列(常常在质粒载体中)转移至另一个DNA序列。

[0029] 术语“异源基因”或“异源核苷酸序列”通常指代并非病毒中天然存在的基因或核苷酸序列。备选地，异源基因或核苷酸序列可指代置于非天然存在的环境中(例如：通过与病毒中非天然相关的启动子相关联)的病毒序列。

[0030] 术语“ITR”或“反向末端重复”是指存在于腺相关病毒(AAV)和/或重组腺相关病毒载体(rAAV)中的核酸序列段，其可形成完成AAV溶解和潜伏生命周期所需的T形回文结构(Muzyczka N和Berns KI 2001)。术语“不可解析ITR”是指经修饰使得Rep蛋白质解析(resolution)降低的ITR。不可解析ITR可以是没有末端解析位点(terminal resolution site，TRS)的ITR序列，从而导致不可解析ITR的低解析或无解析、并将产生90-95％的自身互补AAV载体(McCarty等人2003)。不可解析ITR的具体实例为“ΔITR”，其具有SEQ ID NO:1的序列。

[0031] 术语“有效连接的”是指两个或更多个多核苷酸(例如DNA)区段之间的功能关系。通常，该术语是指转录调控序列与待转录序列的功能关系。举例而言，若启动子或增强子序列在合适的宿主细胞或其他表达系统中刺激或调节编码序列的转录，则该启动子或增强子序列有效连接到该编码序列。一般而言，有效连接到可转录序列的启动子转录调控序列与该可转录序列是连续的，即它们是顺式作用(cis-acting)。然而，一些转录调控序列(如增强子)无须物理邻接于或紧密接近于其增强转录的编码序列。

[0032] 术语“启动子”是指调控有效连接的基因或编码蛋白质的核苷酸序列等的转录的序列。启动子提供足以指导转录的序列，和RNA聚合酶及有效转录所需的其他转录因子的识别位点，并且可指导细胞特异性的表达。除了足以指导转录的序列以外，本发明的启动子序列还可包括调控转录中所涉及的其他调节元件(例如：增强子、kozak序列和内含子)的序列。领域内已知且可用于本文所述的病毒载体中的启动子的实例包括CMV启动子、CBA启动子、smCBA启动子以及来源于免疫球蛋白基因、SV40或其他组织特异性基因的其它启动子(例如RLBP1、RPE、VMD2)。具体启动子也可包括表1中所述的那些启动子，例如“RLBP1(短)”启动子(SEQ ID NO:3)、“RLBP1(长)”启动子(SEQ ID NO:10)、RPE65启动子(SEQ ID NO:11)、VMD2启动子(SEQ ID NO:12)和CMV增强子+CBA启动子(SEQ ID NO:22)。另外，领域内已知用于通过混合并匹配已知调节元件来产生功能性启动子的标准技术。“截短的启动子”也可从启动子片段产生或通过混合并匹配已知调节元件的片段而产生；例如，smCBA启动子为CBA启动子的截短形式。

[0033] 术语“RLBP1”是指“视黄醛结合蛋白1”。人RLBP1基因见于染色体15上且具有如表1中所列的核酸编码序列：SEQ ID NO:6。“RLBP1基因产物”也称为“细胞视黄醛结合蛋白”或“CRALBP”，其是由RLBP1基因编码的蛋白质。人RLBP1基因产物(hCRALBP)具有如表1中所列的氨基酸序列：SEQ ID NO:7。来自其他物种的RLBP1编码序列和RLBP1基因产物的实例可见于表1中(例如：SEQ ID NO:37-48)。术语“RLBP1编码序列”或“RLBP1基因CDS”或RLBP1CDS”是指编码RLBP1基因产物的核酸序列。本领域技术人员应了解，RLBP1编码序列可包括编码RLBP1基因产物的任何核酸序列。RLBP1编码序列可以包括或可以不包括间插调控元件(例如：内含子、增强子或其他非编码序列)。

[0034] 术语“对象”包括人和非人动物。非人动物包括所有脊椎动物(例如：哺乳动物和非哺乳动物)，诸如非人灵长类动物(例如：食蟹猴)、小鼠、大鼠、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物及爬行动物。除非有注释，否则术语“患者”或“对象”在本文中可互换使用。

[0035] 如本文中所用的术语“冶疗”任何疾病或病症(例如色素性视网膜炎、RBLP1相关视网膜营养不良)是指改善疾病或病症，诸如通过减缓或遏止或减少疾病或其至少一种临床症状的发展。“治疗”也可指代改良或改善至少一项身体参数，包括患者可能无法辨别的身体参数。“治疗”也可指代在身体上(例如使可辨别的症状稳定)、在生理上(例如使身体参数稳定)或在两方面调节疾病或病症。更具体而言，RLBP1相关视网膜营养不良的“治疗”意指导致患有RLBP1相关视网膜营养不良的对象的视觉功能和/或局部解剖学的改良或保持的任何作用。如本文中所用的“预防”是指预防或延缓疾病或病症的发作或发展或进程。“预防”在涉及RLBP1相关视网膜营养不良时意指预防或减缓患有RLBP1相关视网膜营养不良及处于所述恶化风险中的患者的如下文所述的视觉功能、视网膜解剖学和/或RLBP1相关视网膜营养不良疾病参数的恶化的任何作用。评估治疗和/或预防疾病的方法在领域内是已知的且描述于下文中。

[0036] 术语“病毒载体”或“病毒性载体”意在指代充当基因递送载体且包含包装于病毒(例如：AAV)衣壳内的重组病毒基因组的非野生型重组病毒颗粒(例如：细小病毒等)。具体类型的病毒载体可以是“重组腺相关病毒载体”或“rAAV载体”。包装于病毒载体中的重组病毒基因组在本文中也称为“载体基因组”。附图简介

[0037] 图1.在以每只眼睛(a)1x109和(b)1x108个载体基因组(vg)颗粒的剂量用多种病毒载体注射的眼睛中，载体介导的人RLBP1mRNA较之内源性小鼠RLBP1mRNA的相对表达。

[0038] 图2.RLBP1KO(-/-)和野生型(+/+)小鼠的暗适应。

[0039] 图3.用多种病毒载体处理的RLBP1KO小鼠的暗适应速率的测量。

[0040] 图4.用多种剂量的NVS2和NVS11处理的RLBP1KO小鼠的提高的暗适应速率的测6
量。水平轴剂量以科学计数法(例如3E6＝3x10)指示。

[0041] 图5.用多种剂量的NVS4和NVS11处理的RLBP1KO小鼠的提高的暗适应速率的测6
量。水平轴剂量以科学计数法(例如3E6＝3x10)指示。

[0042] 图6.经使用不同纯化方法制备的NVS2处理的RLBP1KO小鼠的提高的暗适应速率的测量。

[0043] 发明详述

[0044] 本发明部分基于发现在视网膜的RPE和米勒细胞中表达异源基因的病毒载体。本发明还涉及具有表达RLBP1基因产物(CRALBP)的异源基因的单链病毒载体和自身互补病毒载体两者。

[0045] 因此，本发明提供引导RLBP1编码序列至视网膜中表达的重组病毒载体、病毒载体组合物、可用于产生该病毒载体的质粒、将RLBP1编码序列递送至视网膜的方法、在视网膜的RPE和米勒细胞中表达RLBP1编码序列的方法，以及使用这样的病毒载体的方法。

[0046] 除非另外指明，否则可使用本领域技术人员已知的标准方法用于构建重组细小病毒和rAAV载体，使用携带病毒基因盒的重组质粒、表达细小病毒rep和/或cap序列的包装质粒，以及瞬时且稳定地转染的包装细胞。这些技术是本领域技术人员已知的(例如：SAMBROOK 等人 ,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL第 2 版 (Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)；Choi VW等人.CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(2007))。

[0047] 1.病毒载体

[0048] 本发明涉及引导异源基因至视网膜中表达的病毒载体。在本发明的某些方面，将表达引导至视网膜的RPE和米勒细胞中。领域内已知的多种病毒载体可由本领域技术人员调整而用于本发明中，例如重组腺相关病毒、重组腺病毒、重组反转录病毒、重组痘病毒、重组杆状病毒等。

[0049] 特别地，设想本发明的病毒载体可以是重组腺相关(rAAV)载体。AAV是需要辅助病毒以帮助有效复制的小型单链DNA病毒(Muzyczka N和Berns KI 2001)。病毒载体包含载体基因组和蛋白质衣壳。病毒载体衣壳可由领域内已知的任何AAV血清型提供，包括目前所鉴定的人和非人AAV血清型及有待鉴定的AAV血清型(参见：Choi VW等人2005，Schmidt等人2008)。病毒衣壳可与其他载体组分混合并匹配以形成杂交病毒载体，例如病毒载体的ITR和衣壳可来自不同的AAV血清型。在一个方面，ITR可来自AAV2血清型，而衣壳来自例如AAV2或AAV8血清型。另外，本领域技术人员应认识到，载体衣壳也可以是镶嵌型衣壳(例如：由来自不同血清型的衣壳蛋白质的混合物构成的衣壳)或甚至是嵌合衣壳(例如：含有用于产生标志物和/或改变组织向性的外来或不相关蛋白质序列的衣壳蛋白质)。设想本发明的病毒载体可包含AAV2衣壳。还设想本发明可包含AAV8衣壳。

[0050] 本发明部分涉及其中载体基因组为单链的病毒载体。在某些方面，本发明涉及单链载体基因组，其以5’至3’方向包含：(i)5’ITR，(ii)包含RLBP1编码序列的重组核苷酸序列，和(iii)3’ITR。在本发明的某些方面，重组核苷酸序列以5’至3’方向包含：(i)启动子，(ii)RLBP1编码序列，和(iii)SV40polyA序列。在某些方面，启动子可以是RLBP1(短)启动子、RLBP1(长)启动子或截短的RLBP1启动子。特别地，本发明涉及包含重组核苷酸序列的单链载体基因组，该重组核苷酸序列以5’至3’方向包含：RLBP1(长)启动子(SEQ ID NO:10)、RLBP1编码序列和SV40polyA序列。另外，本发明还涉及包含重组核苷酸序列的单链载体基因组，该重组核苷酸序列以5’至3’方向包含：RLBP1(短)启动子(SEQ ID NO:3)、RLBP1编码序列和SV40polyA序列。本发明的某些方面还涉及单链载体基因组，其包含包装于AAV2或AAV8衣壳中的重组核苷酸序列。

[0051] 在本发明的某些方面，病毒载体包含AAV2衣壳(由SEQ ID NO:18编码)和载体基因组，该载体基因组以5’至3’方向包含选自以下的核苷酸序列：a)SEQ ID NO:2、10、5、6、8和9；b)SEQ ID NO:2、11、5、6、8、14、9；c)SEQ ID NO:2、22、5、6、8、23和9；和d)SEQ ID NO:2、3、4、5、6、8、23和9。在某些方面，AAV2衣壳包含分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:19、
68和69的衣壳蛋白质VP1、VP2和VP3。在某些其他方面，AAV2衣壳可包含衣壳蛋白质VP1、VP2和/或VP3的子组合。

[0052] 在本发明的某些方面，病毒载体包含AAV8衣壳(由SEQ ID NO:20编码)和载体基因组，该载体基因组以5’至3’方向包含选自以下的核苷酸序列：a)SEQ ID NO:2、10、5、6、8和9；b)SEQ ID NO:2、11、5、6、8、14、9；c)SEQ ID NO:2、22、5、6、8、23和9；和d)SEQ ID NO:2、3、4、5、6、8、23和9。在某些方面，AAV8衣壳包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:21、70和
71的衣壳蛋白质VP1、VP2和VP3。在某些其他方面，AAV8衣壳可包含衣壳蛋白质VP1、VP2和/或VP3的子组合。

[0053] 病毒载体也可以是包含自身互补基因组的AAV载体。自身互补rAAV载体先前在领域内有过记载(US7465583和McCarty 2008)且可经调整以用于本发明中。自身互补基因组包含在该基因组任一端的5’ITR和3’ITR(即：可解析ITR或野生型ITR)以及间插在5’ITR与3’ITR之间的不可解析ITR(例如：ΔITR，如本文所述)。基因组的各部分(即在各个可解析ITR与不可解析ITR之间)包含重组核苷酸序列，其中每一半(即：第一重组核苷酸序列和第二重组核苷酸序列)与另一者互补或自身互补。换言之，自身互补载体基因组基本上为具有由不可解析ITR接合的两个半部分的反向重复序列。在某些方面，本发明涉及自身互补载体基因组，其以5’至3’方向包含，(i)5’ITR，(ii)第一重组核苷酸序列，(iii)不可解析ITR，(iv)第二重组核苷酸序列，和(v)3’ITR。在本发明的某一方面，载体基因组的第二重组核苷酸序列包含RLBP1启动子、RLBP1编码序列和SV40polyA序列，且第一重组核苷酸序列与第二核苷酸序列自身互补。在某些特定方面，RLBP1启动子具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列。在本发明的某些方面，第二重组核苷酸序列以5’至3’方向包含SEQ ID NO:3、4、5、6和8的核酸序列，且第一重组核苷酸序列包含与第二重组序列自身互补或反向互补的序列，例如SEQ ID NO:62、63、64、65和66。还设想本发明的病毒载体可包含自身互补基因组，其中载体基因组的第一重组核苷酸序列包含RLBP1启动子、RLBP1编码序列和SV40polyA序列，且第二重组核苷酸序列与第一重组核苷酸序列自身互补。

[0054] 在本发明的某些方面，自身互补病毒载体包含AAV2衣壳(由SEQ ID NO:18编码)和包含核苷酸序列的载体基因组，该核苷酸序列以5’至3’方向包含序列SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9。在某些方面，AAV2衣壳包含分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:19、68和69的衣壳蛋白质VP1、VP2和VP3。在某些其他方面，AAV2衣壳可包含衣壳蛋白质VP1、VP2和/或VP3的子组合。

[0055] 在本发明的某些方面，自身互补病毒载体包含AAV8衣壳(由SEQ ID NO:20编码)和包含核苷酸序列的载体基因组，该核苷酸序列以5’至3’方向包含序列SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9。在某些方面，AAV8衣壳包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:21、70和71的衣壳蛋白质VP1、VP2和VP3。在某些其他方面，AAV8衣壳可包含衣壳蛋白质VP1、VP2和/或VP3的子组合。

[0056] 因此，本发明还涉及如本文所述的包含截短的RLBP1启动子的病毒载体。

[0057] 本发明还涉及引导异源基因至视网膜的RPE和米勒细胞中表达的病毒载体，其中该病毒载体包含AAV8衣壳和载体基因组，该载体基因组包含有效连接到异源基因的RLBP1(短)启动子(SEQ ID NO:3)。在本发明的某些方面，载体基因组为自身互补基因组。

[0058] 本发明还涉及在视网膜的RPE细胞和米勒细胞中表达RLBP1的方法。在本发明的某些方面，该方法包含使视网膜细胞与包含AAV衣壳和载体基因组的病毒载体接触，该载体基因组包含有效连接到RLBP1启动子的RLBP1编码序列，该RLBP1启动子可以是RLBP1(短)启动子(SEQ ID NO:3)。在本发明的某些方面，AAV衣壳为AAV2。在某些其他方面，AAV衣壳为AAV8。在本发明的其他方面，该方法包含使视网膜细胞与包含AAV衣壳和载体基因组的病毒载体接触，该载体基因组包含有效连接到RLBP1启动子的RLBP1编码序列，该RLBP1启动子可以是RLBP1(长)启动子(SEQ ID NO:10)。在本发明的某些方面，AAV衣壳为AAV2。在某些其他方面，AAV衣壳为AAV8。

[0059] 产生病毒载体的方法在领域内是熟知的，且将使得技术人员可使用表2和实施例中所记载的质粒来产生本发明的病毒载体(参见例如美国专利第7,465,583号)，包括表4中所记载的病毒载体。

[0060] 一般而言，产生rAAV载体的方法可应用于产生本发明的病毒载体；这些方法间的主要差异在于待包装的遗传元件的结构。为产生本发明的病毒载体，如表2中所记载的遗传元件和质粒的序列可用于产生衣壳包裹的病毒基因组。

[0061] 如表2中所记载的遗传元件处于环形质粒的情形中，但本领域技术人员应了解DNA底物可以以领域内已知的任何形式提供，包括但不限于质粒、裸DNA载体、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)或病毒载体(例如腺病毒、疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr Virus)、AAV、杆状病毒、反转录病毒载体等等)。备选地，产生本文所述的病毒载体所必需的表2中的遗传元件可稳定地并入包装细胞的基因组中。

[0062] 本发明的病毒载体颗粒可通过领域内已知的任何方法产生，例如通过将要复制和包装的序列引入允许细胞或包装细胞中，这些术语为领域内所理解(例如“允许”细胞可由病毒感染或转导；“包装”细胞是提供辅助功能的稳定转化的细胞)。

[0063] 在一个实施方案中，提供产生RLBP1病毒载体的方法，其中该方法包含在足以在细胞中产生包含衣壳包裹于细小病毒衣壳内的载体基因组的病毒载体的条件下，向允许细小病毒复制的细胞提供：(a)含有用于产生本发明的载体基因组的遗传元件(如下文详述和表2中所记载)的核苷酸序列；(b)足以复制(a)的载体基因组序列以产生载体基因组的核苷酸序列；(c)足以将载体基因组包装于细小病毒衣壳中的核苷酸序列。优选地，细小病毒复制和/或衣壳编码序列为AAV序列。

[0064] 可采用将如下文所述的携带基因盒的核苷酸序列引入细胞宿主中以供复制和包装的任何方法，其包括但不限于电穿孔、磷酸钙沉淀、显微注射、阳离子或阴离子脂质体，以及与细胞核定位信号组合的脂质体。

[0065] 本文所述的病毒载体可使用领域内已知的方法产生，诸如三重转染或杆状病毒介导的病毒产生。可采用领域内已知的任何适合的允许细胞或包装细胞来产生载体。优选哺乳动物细胞。还优选提供复制缺陷型辅助病毒所缺失的功能的反式互补的包装细胞系，例如293细胞或其他E1a反式互补细胞。还优选领域内已知的DNA修复有缺陷的哺乳动物细胞或细胞系，因为这些细胞系在其修正引入本文所述的质粒中的突变的能力方面受损。

[0066] 基因盒可含有一些或所有的细小病毒(例如AAV)cap和rep基因。然而，优选一些或所有的cap和rep功能通过将编码衣壳和/或Rep蛋白质的(一个或多个)包装载体引入细胞中而以反式提供。最优选地，基因盒不编码衣壳或Rep蛋白质。备选地，使用稳定转化以表达cap和/或rep基因的包装细胞系(参见例如Gao等人，(1998)Human Gene Therapy9:2353；Inoue等人，(1998)J.Virol.72:7024；美国专利第5,837,484号；WO
98/27207；美国专利第5,658,785号；WO 96/17947)。

[0067] 另外，优选为病毒载体提供辅助病毒功能以使新病毒颗粒增殖。腺病毒与单纯疱疹病毒均可充当AAV的辅助病毒。参见例如BERNARD N.FIELDS等人,VIROLOGY,第2卷,第69章(第3版,Lippincott-Raven Publishers)。示例性辅助病毒包括但不限于，单纯疱疹(HSV)水痘带状疱疹、巨细胞病毒和爱泼斯坦-巴尔病毒。感染复数(MOI)和感染持续时间将取决于所用的病毒类型和所用的包装细胞系。可采用任何适合的辅助载体。优选辅助载体为质粒，例如Xiao等人，(1998)J.Virology 72:2224所述。如上文所述，载体可通过本领域中已知的任何适合方法引入包装细胞中。

[0068] 不含污染辅助病毒的载体储备物可通过领域内已知的任何方法获得。举例而言，重组单链或自身互补病毒与辅助病毒可容易地基于尺寸而区分。病毒也可基于对肝素底物的亲和力而与辅助病毒分开(Zolotukhin等人(1999)Gene Therapy 6:973)。优选地，使用缺失的复制缺陷型辅助病毒，以使得任何污染辅助病毒不具有复制能力。作为另一备选方案，可采用缺乏晚期基因表达的辅助腺病毒，因为介导双重病毒的包装仅需要腺病毒早期基因表达。晚期基因表达缺陷型腺病毒突变体在领域内为已知的(例如ts100K和ts149腺病毒突变体)。

[0069] 一种提供辅助功能的方法采用携带有效产生AAV所需的所有辅助基因的非感染性腺病毒小质粒(Ferrari等人,(1997)Nature Med.3:1295；Xiao等人,(1998)J.Virology72:2224)。以腺病毒小质粒获得的rAAV效价比以野生型腺病毒感染的常规方法获得的rAAV效价高四十倍(Xiao等人,(1998)J.Virology 72:2224)。此方法避免了进行与腺病毒的共转染的需要(Holscher等人,(1994),J.Virology 68:7169；Clark等人,(1995)Hum.Gene Ther.6:1329；Trempe 和 Yang,(1993), 于 ,Fifth Parvovirus Workshop,Crystal River,Fla.)。

[0070] 已描述产生rAAV储备物的其他方法，包括但不限于将rep基因和cap基因分开至单独的表达盒上以防止产生可复制型AAV的方法(参见例如Allen等人,(1997)J.Virol.71:6816)，采用包装细胞系的方法(Gao等人,(1998)Human Gene Therapy
9:2353；Inoue等人,(1998)J.Virol.72:7024；美国专利第5,837,484号；WO 98/27207；美国专利第5,658,785号；WO96/17947)，及其他无辅助病毒系统(参见例如Colosi的美国专利第5,945,335号)。

[0071] 疱疹病毒也可在AAV包装方法中用作辅助病毒。编码AAV Rep蛋白质的杂交疱疹病毒可有利地促进规模可调性更佳的AAV载体产生流程。已描述了表达AAV-2rep和cap基因的杂交I型单纯疱疹病毒(HSV-1)载体(Conway等人,(1999)Gene Therapy 6:986和WO 00/17377)。

[0072] 总而言之，向细胞(例如允许细胞或包装细胞)提供要复制和包装的基因盒、细小病毒cap基因、合适的细小病毒rep基因及(优选)辅助功能，以产生携带载体基因组的rAAV颗粒。由基因盒和/或(一个或多个)包装载体和/或稳定转化的包装细胞编码的rep和cap基因的组合表达导致产生其中病毒载体衣壳包装本发明的病毒载体基因组的病毒载体颗粒。单链或自身互补病毒载体允许在细胞内组装，且随后可通过本领域技术人员已知及实施例中所记载的任何方法回收。举例而言，病毒载体可通过标准CsCl离心法(Grieger JC等人2006)或通过技术人员已知的多种柱层析法纯化(参见：Lock M等人(2010)，Smith RH等人(2009)和Vadenberghe LH等人(2010))。

[0073] 可采用本文中所公开的试剂和方法来产生本发明病毒载体的高效价储备物，优选5
为基本上野生型的效价。还优选细小病毒储备物具有至少约10个转导单位(tu)/ml、更
6 7 8
优选至少约10tu/ml、更优选至少约10tu/ml、还更优选至少约10tu/ml、还更优选至少约
9 10 11
10tu/ml、再更优选至少约10 tu/ml、再更优选至少约10 tu/ml或更高的效价。

[0074] 此外，本发明的RLBP1病毒载体可具有超过常规AAV载体的提高的转导单位/颗粒比率。优选地，tu/颗粒比率小于约1:50、小于约1:20、小于约1:15、小于约1:10、小于约1:8、小于约1:7、小于约1:6、小于约1:5、小于约1:4或更低。通常tu/颗粒比率将大于约1:1、1:2、1:3或1:4。

[0075] 2.用于产生病毒载体的核酸

[0076] 本发明还涉及可用于产生病毒载体的核酸。在本发明的某些方面，可用于产生病毒载体的核酸可处于质粒形式。可用于产生病毒载体的质粒(也称为病毒载体质粒)可含有基因盒。最少地，病毒载体质粒的基因盒含有异源基因及其调控元件(例如：启动子、增强子和/或内含子等)，以及5’和3’AAV反向末端重复序列(ITR)。

[0077] 异源基因及其调控元件的组成应视所得载体将投入的用途而定。举例而言，一种类型的异源基因序列包括报告基因序列，其在表达时产生可检测的信号。这些报告基因序列包括但不限于编码以下物质的DNA序列：β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白质(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶、膜结合蛋白质，包括例如CD2、CD4、CD8、流感血球凝集素蛋白质，以及领域内已知的存在针对其的高亲和力抗体的或可通过常规手段产生的其他膜结合蛋白质，以及包含与来自尤其是血球凝集素或Myc的抗原标签结构域适当融合的膜结合蛋白质的融合蛋白质。举例而言，在报告基因序列为LacZ基因的情况下，由β-半乳糖苷酶活性测定法来检测携带信号的载体的存在。在报告基因序列为绿色荧光蛋白质或荧光素酶的情况下，可通过在光度计中产生颜色或光而在视觉上测量携带信号的载体。

[0078] 异源基因序列在与驱使其表达的调控序列相关联时提供通过常规方式可检测的信号，包括酶促测定法、放射照相测定法、比色测定法、荧光测定法或其他光谱测定法、荧光活化细胞分选测定法及免疫测定法，包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)及免疫组织化学。

[0079] 异源基因也可以是编码可用于生物学和医药学的产物(诸如蛋白质、肽、RNA、酶、显性失活突变体或催化性RNA)的非标志物序列。理想的RNA分子包括tRNA、dsRNA、核糖体RNA、催化性RNA、siRNA、小发夹RNA、反式剪接RNA和反义RNA。可用的RNA序列的一个实例为抑制或消除靶向的核酸序列在经处理的动物中的表达的序列。

[0080] 异源基因也可用于修正或改善基因缺陷，所述基因缺陷可包括其中正常基因以低于正常水平表达的缺陷或其中不表达功能性基因产物的缺陷。在本发明中设想，异源基因序列可以是RLBP1编码序列。RLBP1编码序列的实例提供于表1中：SEQ ID NO:6、37、39、41、43、45或47。

[0081] 除异源基因以外，基因盒可包括有效连接到异源基因的调控元件。这些调控元件可包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号，诸如剪接和聚腺苷酸化(polyA)信号；稳定细胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列；增强蛋白质稳定性的序列；以及需要时，增加所编码的产物的分泌的序列。领域内已知且可利用大量调控序列，包括天然启动子、组成型启动子、诱导型启动子和/或组织特异性启动子。本发明的调控元件序列包括表1中所记载的那些序列，例如SEQ ID NO:3、4、5、8、10、11、12和22。

[0082] 基因盒可包括有效连接到异源基因的具有SEQ ID NO:3或10的核酸序列的RLBP1启动子。特别地，RLBP1短启动子(SEQ ID NO:3)有效连接到RLBP1编码序列(SEQ ID NO:6、37、39、41、43、45或47)。备选地，RLBP1长启动子(SEQ ID NO:10)有效连接到RLBP1编码序列(SEQ ID NO:6、37、39、41、43、45或47)。

[0083] 设想可使用AAV血清型2的ITR(例如：SEQ ID NO:2、9、16、17、36)。然而，来自其他适合血清型的ITR可选自领域内已知的任何AAV血清型，如本文所述。使用本领域技术人员可用的技术可容易地自任何已知的AAV血清型或有待鉴别的血清型分离这些ITR或其他AAV组分，例如，AAV序列可通过参考诸如在文献或在数据库(如GenBank、PubMed等)中可得的公开序列，经合成方式或其他适合方式获得。备选地，这些AAV组分也可自学术、商业或公共来源(例如美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection),Manassas,Va.)分离或获得。

[0084] 设想在本发明的某些方面，基因盒的一个ITR可以是经修饰的ITR或不可解析ITR(无末端解析位点(TRS)的序列)。在包含不可解析ITR的基因盒的复制期间，Rep蛋白质不能解析不可解析ITR将产生二聚的反向重复序列(即自身互补的)，其在中间具有不可解析ITR(例如ΔITR)且在各端具有野生型ITR。所得序列为自身互补的病毒基因组序列，使得基因组能够在从衣壳释放出时形成发夹结构(还参见：US7465583和McCarty(2008))。不可解析ITR可通过领域内已知的任何方法产生。举例而言，对ITR的插入将使TRS移位并产生不可解析ITR。优选地，插入在TRS位点区域中。备选地，可通过使TRS位点缺失而促使ITR不可解析，具体实例包括ΔITR(SEQ ID NO:1)。

[0085] 本发明涉及包含基因盒的核酸，该基因盒以5’至3’方向包含选自以下的核酸序列：a)SEQ ID NO:2、10、5、6、8和9；b)SEQ ID NO:2、11、5、6、8、14和9；c)SEQ ID NO:2、22、5、6、8、23和9；d)SEQ ID NO:2、3、4、5、6、8、23和9；e)SEQ ID NO:2、10、5、24、8和9；f)SEQ ID NO:2、11、24、8、14和9；和g)SEQ ID NO:2、12、24、8、14和9。在某些方面，包含基因盒的核酸可以是质粒。特别地，质粒序列可具有选自SEQ ID NO:27、28、29、30、32、33、34和35的序列。

[0086] 本发明还涉及包含基因盒的核酸，该基因盒以5’至3’方向包含选自以下的核酸序列：a)SEQ ID NO:1、3、4、5、6、8和9；和b)SEQ ID NO:1、3、4、5、24、8和9。在某些方面，包含基因盒的核酸可以是质粒。特别地，质粒序列可具有选自SEQ ID NO:26、31和50的序列。

[0087] 并入表2中的元件的方法在领域内为熟知的且将允许技术人员使用表3和实施例中所概述的方法来产生本发明的核酸和质粒。

[0088] 3.药物组合物

[0089] 本发明提供药物组合物，其包含与可药用的载体一起配制的本发明的病毒载体。组合物可另外含有一种或多种适用于治疗或预防例如RLBP1相关视网膜营养不良和/或视网膜色素变性(RP)的其他治疗剂。可药用的载体增强或稳定组合物，或可用于促进组合物的制备。可药用的载体包括生理学上相容的溶剂、表面活性剂、分散介质、包衣、抗细菌剂及抗真菌剂、等张剂及吸收延迟剂等等。

[0090] 本发明的药物组合物可通过领域内已知的多种方法进行给药。给药的途径和/或模式视所需结果而变化。优选视网膜下给药。可药用的载体应适于视网膜下、玻璃体内、静脉内、皮下或局部给药。

[0091] 组合物应无菌且为流体。可以例如通过使用包衣(诸如卵磷脂)、在分散剂情况下通过维持所需粒径以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包括等张剂，例如糖、多元醇(例如甘露糖醇或山梨糖醇)和氯化钠。

[0092] 本发明的药物组合物可根据领域内所熟知且常规实施的方法进行制备。参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Mack Publishing Co.,第20 版 ,2000；和 Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,编辑,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。药物组合物优选在GMP条件下制造。本发明的药物组合物中通常采用治疗有效剂量或有效力剂量的病毒载体。病毒载体可通过本领域技术人员已知的常规方法配制成可药用的剂型。调整给药方案以提供最佳的期望反应(例如治疗反应)。举例而言，可单丸剂(single bolus)给药，可随时间推移施用若干分次剂量，或可以按治疗情况的紧急性所指示按比例减少或增加剂量。特别有利的是将肠胃外组合物配制成单位剂型以便于给药和剂量均匀性。如本文中所用的单位剂型是指适合作为单位剂量用于所治疗对象的物理离散单位；各单位含有预定量的计算为产生期望治疗作用的活性化合物与所需药物载体联合。

[0093] 可改变本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平，以便在对患者无毒的情况下获得对于特定患者、组合物和给药模式有效实现期望的治疗反应的活性成分的量。所选剂量水平视多种药物动力学因素而定，包括所采用的本发明特定组合物的活性，给药途径，给药时间，所用特定化合物的排泄速率，治疗持续时间，与所用特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料，待治疗患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康情况及前病史以及类似因素。

[0094] 医师或兽医可以以低于实现期望治疗效果所需水平的药物组合物中所用的本发明病毒载体的剂量开始、并逐渐增加剂量，直至实现期望效果。一般而言，用于治疗如本文所述的RLBP1相关视网膜营养不良的本发明组合物的有效剂量视许多不同因素而变化，包括给药方式、靶部位、患者生理状态、患者为人或是动物、所施用的其他药物以及治疗为预防性或是治疗性。需要滴定治疗剂量以优化安全性和功效。关于视网膜下施用病毒载体，8 12
剂量可以在从每只眼睛1x10个载体基因组(vg)至1x10 vg的范围内。举例而言，剂量
8 8 8 8 9 9
可以是1x10vg/眼、2.5x10vg/眼、5x10vg/眼、7.5x10vg/眼、1x10vg/眼、2.5x10vg/
9 9 10 10 10 10
眼、5x10vg/眼、7.5x10vg/眼、1x10 vg/眼、2.5x10 vg/眼、5x10 vg/眼、7.5x10 vg/眼、
11 11 11 11 12
1x10 vg/眼、2.5x10 vg/眼、5x10 vg/眼、7.5x10 vg/眼、1x10 vg/眼。

[0095] 本文所述的病毒载体主要以每只眼睛给药一次来使用，可能进行重复给药以治疗先前给药中未覆盖的视网膜区域。给药的剂量可视治疗为预防性或是治疗性而变化。

[0096] 上述单个章节和实施方案中所提及的本发明的多种特征和实施方案适当时适用于其他章节及实施方案，加以必要的变更。因此，一个章节或实施方案中指定的特征适当时可与其他章节或实施方案中指定的特征组合。

[0097] 4.治疗用途

[0098] 如本文所述的病毒载体可通过向有需要的对象施用有效量的本发明的病毒载体而以治疗有用的浓度用于治疗眼睛相关疾病。更具体地，本发明提供通过向有需要的对象施用有效量的包含RLBP1编码序列的病毒载体来治疗RLBP1相关视网膜营养不良的方法。

[0099] 本发明提供包含RLBP1编码序列的病毒载体，其用于治疗对象的RLBP1相关视网膜营养不良。

[0100] 表A：RLBP1相关视网膜营养不良的RLBP1突变和相关表现型。RLBP1相关视网膜营养不良的疾病表现型包括：常染色体隐性色素性视网膜炎(AARP)、Bothina营养不良(BD)、纽芬兰视杆-视锥营养不良(NFRCD)、白点状视网膜炎(retinitis punctata albescens，RPA)和白点状眼底(fundus albipunctatus，FA)。

[0101]

[0102] 使用重组AAV已显示对于治疗视网膜疾病是可行且安全的(参见例如Bainbridge等人2008，Houswirth等人2008，Maguire等人2008)。本发明的病毒载体可尤其用于治疗和预防RLBP1相关视网膜营养不良的进行和改善视力损失。本发明的病毒载体还可用于这样的患者，其中RLBP1基因中的其他功能损失突变引起其他视网膜营养不良，例如常染色体隐性色素性视网膜炎、白点状视网膜炎和白点状眼底。

[0103] 本发明还涉及通过向有需要的对象施用本发明的病毒载体而在视网膜的RPE和米勒细胞中表达RLBP1编码序列的方法。本发明还涉及用于在有需要的对象的视网膜的RPE和/或米勒细胞中表达RLBP1编码序列的本发明病毒载体。本发明还涵盖递送RLBP1编码序列至患有RLBP1相关视网膜营养不良的对象的视网膜，特别是递送至视网膜中的RPE和/或米勒细胞的方法。设想通过使对象的视网膜、RPE和/或米勒细胞与如本文所述的病毒载体接触而将RLBP1编码序列递送至有需要的对象。备选地，通过向对象施用如本文所述的病毒载体而将RLBP1编码序列递送至该对象。

[0104] 本发明还包括通过使对象的视网膜与本发明的病毒载体接触而在患有RLBP1相关视网膜营养不良的对象的视网膜中的RPE和/或米勒细胞中表达RLBP1编码序列的方法。在某些方面，使对象的视网膜的RPE和/或米勒细胞与本发明的病毒载体接触。

[0105] 还设想本文所述的方法中所用的病毒载体包含AAV2或AAV8衣壳，且载体基因组包含有效连接到具有选自SEQ ID NO:3或10的核苷酸序列的RLBP1启动子的RLBP1编码序列。还设想载体基因组可以是自身互补的。

[0106] 在一个方面，可使用本领域技术人员已知的方法在视网膜下或玻璃体内施用本文所述的病毒载体。

[0107] 可由眼科医师或健康护理专业人员使用视觉功能和/或视网膜解剖学的临床上相关的测量来确定眼病诸如RLBP1相关视网膜营养不良的治疗和/或预防。治疗RLBP1相关视网膜营养不良意指设想改善或维持视觉功能和/或视网膜解剖学的任何作用(例如，施用本文所述的病毒载体)。另外，预防在涉及RLBP1相关视网膜营养不良时意指在处于如本文中所定义的视觉功能、视网膜解剖学和/或RLBP1相关视网膜营养不良疾病表现型恶化的风险中的患者中预防或减缓该恶化的任何作用(例如施用本文所述的病毒载体)。

[0108] 视觉功能可包括例如视敏度、低亮度下的视敏度、视野、中心视野、周边视觉、对比敏感度、暗适应、光应力恢复、辨色能力、阅读速度、对辅助装置(例如大字体、放大装置、望远镜)的依赖性、面部识别、操作机动车的熟练程度、进行一项或多项日常活动的能力和/或患者报告的与视觉功能有关的满意度。因此，色素性视网膜炎(RP)特别是RLBP1相关视网膜营养不良的治疗，可被认为在对象达到预先规定的暗适应程度的时间减少至少10％或未增加10％或10％以上的情况下发生。另外，RLBP1相关视网膜营养不良的治疗可被认为在由合格健康护理专业人员(即眼科医师)所确定，对象在年轻时显示出早期严重夜盲症和缓慢暗适应，随后为进行性损失视敏度、视野和色觉，从而导致法定盲的情况下发生(Burstedt和 2010)。

[0109] 视觉功能的示例性测量包括斯内伦视敏度(Snellen visual acuity)、ETDRS视敏度、低亮度视敏度、阿姆斯勒方格表(Amsler grid)、Goldmann视野、标准自动视野检查、微视野检查、佩里-罗布森图表(Pelli-Robson chart)、SKILL卡片、石原颜色板(Ishihara color plate)、Farnsworth D15或D100颜色测试、标准视网膜电描记术、多焦点视网膜电描记术、阅读速度、面部识别、驾驶模拟和患者报告的满意度的验证测试。因此，RLBP1相关视网膜营养不良的治疗可被认为在ETDRS量表上视力增加或未损失2行(或10个字母)或2行以上时实现。另外，RLBP1相关视网膜营养不良的治疗可被认为在对象显示出阅读速度(每分钟字数)至少增加10％或未减少10％的情况下发生。另外，RLBP1相关视网膜营养不良的治疗可被认为在对象显示出在石原测试时正确鉴别的板或在Farnsworth测试时正确排序的圆盘的比例至少增加20％或未减少20％的情况下发生。因此，例如RLBP1相关视网膜营养不良的治疗可由例如暗适应速率的提高、或视敏度损失的改善、或视敏度损失速率的减缓来确定。

[0110] 可治疗或预防的视网膜解剖学的不合人意的方面包括例如视网膜萎缩、视网膜色素上皮萎缩、视网膜血管变窄、色素凝集、视网膜黄斑/白斑、视网膜下积液。

[0111] 评估视网膜解剖学的示例性手段包括眼底检查、眼底照相、荧光素血管造影术、吲哚菁绿血管造影术、光学相干断层成像术(OCT)、谱域光学相干断层造影术、扫描激光检眼镜检查、共焦显微术、自调光学、眼底自发荧光、活组织检查、尸检和免疫组织化学。因此，如由例如视网膜萎缩的发展速率减小所确定，对象的RLBP1相关视网膜营养不良可被认为得到治疗。

[0112] 也可向要用本发明的治疗剂治疗的对象施用已知对治疗视网膜营养不良具有功效的其他治疗剂或装置，诸如维生素和矿物制剂、低视力助视器(low-vision aid)、导盲犬，或已知辅助低视力患者的其他装置。

[0113] 目前还没有其他经核准用于治疗RLBP1相关视网膜营养不良的治疗剂。当出现其他新疗法时，可依临床指示按顺序依次施用或同时施用两者。实施例

[0114] 提供以下实施例以进一步说明本发明，但不限制其范围。本发明的其他变型将为本领域普通技术人员显而易知，并且由所附权利要求所涵盖。

[0115] 实施例1：构建AAV-ITR质粒：

[0116] 1.1克隆AAV-ITR质粒：

[0117] 单个质粒元件的核酸序列描述于表1中。序列是合成的或商购的。表2描述所构建的各质粒中存在的元件。使用标准分子生物学克隆技术产生如表3中所述的质粒。使用具有氨苄青霉素抗性的pAAV-MCS 质粒骨架或具有卡那霉素抗性的pUC57质粒骨架作为骨架和起始材料。在限制性酶位点处克隆或使用平端克隆法来克隆单个序列元件。

[0118] 由于质粒骨架中所含的抗生素抗性基因盒在AAV载体的产生中没有作用，故本领域技术人员可使用替代的质粒骨架和/或抗生素抗性基因盒并得到相同病毒载体。我们已证明，可使用具有不同骨架的质粒产生功能上等同的NVS2载体。举例而言，质粒序列SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:50产生功能上等同的NVS2载体。

[0119] 1.2三重质粒转染以产生rAAV载体:

[0120] 通过三重转染方法来产生重组AAV(rAAV)病毒载体。用于三重转染的方法是领域内已知的(Ferrari FK等人1997)。简言之，将含有AAV-ITR的质粒(描述于表2中)、含有AAV-RepCap的质粒(携带Rep2和Cap2或Cap8)和腺辅助质粒(携带辅助完成AAV复制周期的基因)共转染至293细胞中。培养细胞4天。在培养期结束时，溶解细胞并通过标准CsCl梯度离心法(基于Grieger JC等人2006的修改的方法)纯化培养物上清液和细胞溶解物中的载体。经纯化的病毒载体描述于表4中。

[0121] 备选地，通过上文所述的细胞转染和培养方法产生GMP样rAAV载体。接着，通过基于Lock M等人(2010)，Smith RH等人(2009)和Vadenberghe LH等人(2010)所述的方法进行柱层析来处理所收获的细胞培养物材料。

[0122] 1.35’ITR序列的变化

[0123] 如先前所述(Samulski等人，1983；Muzyczka等人，1984)，在产生功能性AAV载体时完全容许AAV质粒末端重复序列内的突变。即使质粒缺失两个ITR之一，只要构建体中所存在的ITR含有完整的AAV ITR序列，AAV序列即可得到挽救、复制且产生感染性病毒体(Samulski等人，1983；Muzyczka等人，1984)。因此，尽管SEQ ID NO:2用作本文件中所记载的所有单链AAV载体的5’ITR序列，但预期携带末端解析位点的任何5’ITR序列(即：SEQ ID NO:2、16和17)将产生具有相同功能性的载体。

[0124] 表1 病毒载体和质粒元件的序列

[0125]

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[0127]

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[0129]

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[0139]

[0140]

[0141]

[0142]

[0143]

[0144] 表2 质粒组成

[0145]

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[0150]

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[0197]

[0198]

[0199]

[0200] 表3.质粒构建

[0201]

[0202]

[0203]

[0204]

[0205] 表4.病毒载体组成：载体基因组和衣壳

[0206]

[0207]

[0208]

[0209]

[0210]

[0211]

[0212] 实施例2：在小鼠中视网膜下注射rAAV载体

[0213] 2.1.在小鼠中视网膜下注射rAAV载体

[0214] 视网膜下注射rAAV载体可实现RPE和其他视网膜细胞的有效转导，因为视网膜下注射诱导浓缩病毒疱与RPE细胞和神经视网膜紧密接触。另外，视网膜下腔具有相对较高程度的免疫特权(immunoprivilege)且通常在注射部位附近极少发现发炎迹象。因此，视网膜下注射是将rAAV载体递送至小鼠视网膜中的优选途径。然而，可使用其他递送途径，例如玻璃体内注射。

[0215] 供应物/试剂：

[0216] ·Leica M844F40眼科手术显微镜

[0217] ·1％环喷托酯(cyclopentolate)：Bausch&Lomb Cat#965911

[0218] ·2.5％-10％苯肾上腺素：Altaire Pharmaceuticals Cat#05626

[0219] ·0.5％丙美卡因：Bausch&Lomb Cat#NDC 54799-500-12

[0220] ·10μl Hamilton注射器：VWR Cat#89184-476

[0221] ·33G钝端针：Hamilton Cat#7803-05

[0222] ·荧光素钠盐：Sigma Cat#F6377

[0223] 此实施例中使用的测试物品：

[0224] ·scAAV8-pRLBP1(短)-eGFP病毒载体1x109vg/眼

[0225] ·AAV8-pRLBP1(长)-eGFP病毒载体1x109vg/眼

[0226] ·AAV8-pRPE-eGFP病毒载体1x109vg/眼

[0227] ·AAV8-VMD2-eGFP病毒载体1x109vg/眼

[0228] 方案：对两只眼睛或单侧右眼进行视网膜下注射。在无菌条件下使用无菌试剂、注射器和适当个人防护设备进行所有程序。

[0229] 视网膜下注射程序：

[0230] ·用1滴1％环喷托酯，接着用1滴2.5％-10％苯肾上腺素使小鼠瞳孔扩张

[0231] ·通过腹膜内使用阿佛丁(Avertin)(250mg/kg)以及在眼睛中局部使用一滴0.5％丙美卡因(局部麻醉剂)使小鼠麻醉

[0232] ·使用微解剖刀在角膜缘后方经鼻产生约0.5mm切口

[0233] ·将10μl Hamilton注射器上的钝端针沿切线方向经巩膜切口向颞侧视网膜插入。将针推进直至感受到阻力为止。然后将1μl稀释的rAAV载体(含有1:50浓度的荧光素)缓慢注射至视网膜下腔中，经切口抽出该针

[0234] ·检查眼睛，通过目测含有荧光素的疱来确认视网膜下注射的成功。对注射成功和视网膜损伤(出血)程度进行评分

[0235] ·在注射后即刻将抗生素软膏涂覆于眼睛上

[0236] 2.2.在小鼠视网膜中rAAV载体诱导的GFP表达及其细胞类型特异性

[0237] 为研究小鼠视网膜中rAAV载体诱导的基因转导和细胞类型特异性，检查了视网膜横截面和RPE/视网膜平铺片(retina flatmount)中的eGFP表达。用于鉴定表达eGFP的细胞类型的一种途径为通过在冷冻切片中进行免疫细胞化学染色用视网膜细胞标记物来共标记eGFP阳性细胞。

[0238] 供应物/试剂：

[0239] 用于免疫细胞化学染色的一抗：

[0240] ·抗CRALBP抗体：Thermo cat#MA1-813

[0241] ·抗GFAP抗体：Covance cat#SMI-21

[0242] ·抗视蛋白蓝色抗体：Millipore cat#AB 5407

[0243] ·抗视蛋白红色抗体：Millipore cat#AB5405

[0244] ·抗波形蛋白抗体：Santa Cruz cat#sc-7557

[0245] ·抗PKCα抗体：C-20Santa Cruz cat#sc-208

[0246] 用于免疫细胞化学染色的二抗：

[0247] ·山羊抗小鼠IgG：Invitrogen Cat#A11005

[0248] ·山羊抗大鼠IgG：Invitrogen Cat#A11007

[0249] ·驴抗兔IgG：Invitrogen Cat#A21207

[0250] 其他供应物/试剂:

[0251] · 具有 DAPI 的 Vectashield 封固剂：Vector Laboratories,Burlingame Cat#H-1200),

[0252] ·Zeiss成像系统，AxioVision软件

[0253] ·Zeiss LSM 510共焦显微镜，Zeiss软件的ZEN版本

[0254] 方案:

[0255] 将小鼠眼球移出，并在25℃下置于4％PFA(多聚甲醛)中2小时，接着在4℃置于PBS缓冲液中1-3天直至进行解剖。自眼球中移出角膜、晶状体和玻璃体，使用Vectashield封固剂将视网膜和RPE/脉络膜平铺片于玻片上。由Zeiss成像系统捕获平铺片中的GFP表达，并用AxioVision软件进行定量。成像之后，在25℃下将具有视网膜平铺片的玻片置于0.25％triton缓冲液中30分钟，然后从玻片移出视网膜平铺片。切出视网膜平铺片的eGFP阳性区域并嵌入OCT中，接着冷冻切片。在冷冻切片中应用使用视网膜细胞标记物的免疫细胞化学染色。由Zeiss LSM 510共焦显微镜和Zeiss软件的ZEN版本来捕获图像。

[0256] 免疫细胞化学染色程序:

[0257] 第1天

[0258] ·在室温下风干切片1小时

[0259] ·将玻片置于PBS+0.25％Triton中15分钟x 2

[0260] ·在1％BSA+PBS+0.25％Triton中阻断90分钟

[0261] ·在4℃下在1％BSA+PBS+0.25％Triton中将玻片与一抗过夜孵育

[0262] 第2天

[0263] ·在4℃下取出玻片，将其在25℃下放置30分钟

[0264] ·在PBS+0.25％Triton中洗涤玻片15分钟x 2

[0265] ·在25℃下将玻片与二抗1:800孵育90分钟

[0266] ·在PBS+0.25％Triton中洗涤玻片15分钟x 2

[0267] ·使用具有DAPI的Vectashield封固剂封固玻片

[0268] 表5.研究中所用的视网膜细胞标记物和稀释度

[0269]

[0270] 表6.描述细胞类型由测试病毒载体转导的免疫组化结果

[0271]

[0272]

[0273] +，指示GFP在给定细胞类型中表达

[0274] -，无GFP表达

[0275] ND，未测定

[0276] 结果：

[0277] ·所有测试的病毒载体在小鼠视网膜中均具有功能。

[0278] ·scAAV8-pRLBP1(短)-eGFP载体导致GFP在神经视网膜中的RPE和米勒细胞中的选择性表达。

[0279] ·AAV8-pRLBP1(长)-eGFP导致GFP在神经视网膜中的RPE、米勒细胞和感光细胞中的表达。

[0280] ·AAV8-pRPE65-eGFP和AAV8-pVMD2-eGFP导致GFP在神经视网膜中的RPE和感光细胞中的表达。

[0281] 结论

[0282] 这些结果显示启动子、AAV基因组构造和AAV衣壳序列的组合可在具体细胞类型中产生不同的转导性质，从而实现期望的效果。RLBP1基因产物在视网膜的RPE和米勒细胞中的表达代表着期望的目标(on-target)细胞类型表达。包装于自身互补基因组中的RLBP1短启动子联同AAV8血清型衣壳诱导基因在神经视网膜中的RPE和米勒细胞中的表达，而没有目标外(off-target)细胞表达。

[0283] 包装于单链基因组中的RLBP1长启动子联同AAV8血清型衣壳诱导基因在目标细胞类型RPE和米勒细胞中表达，并也在目标外的细胞类型感光细胞中表达。

[0284] 包装于单链基因组中的RPE65和VMD2启动子联同AAV8血清型衣壳诱导基因在RPE细胞中表达，但也在目标外的细胞类型感光细胞中表达。

[0285] 实施例3：测量载体介导的人RLBP1转基因的表达相对于内源性小鼠RLBP1mRNA表达的基于mRNA的测定法

[0286] rAAV转导的转基因的表达水平和组织特异性将视载体血清型、载体基因组、所用的组织特异性启动子和注射剂量而变化。基因替代疗法的目标在于达到足以补偿缺少的内源性基因表达但不会让基因过度表达至毒性水平的表达程度。

[0287] 已开发一种测定法，以在野生型小鼠中视网膜下注射不同剂量的多种AAV载体之后，测量载体介导的人RLBP1mRNA的表达相对于小鼠RLBP1mRNA的内源性水平。此测定法利用含有用于特异性检测人或小鼠RLBP1cDNA的引物和探针的基因表达测定法。在进行实验之前，使用含有人或小鼠RLBP1cDNA序列的质粒DNA，测试基因表
达测定法的物种特异性。简言之，使用试剂共扩增小鼠或人RLBP1cDNA与作为
内源性对照的小鼠GAPDH cDNA。针对内部GAPDH对照将小鼠或人RLBP1的水平归一化，然后将这些归一化的水平相互比较。

[0288] 供应物/试剂：

[0289] ·RNA提取

[0290] o Qiagen RNeasy微量试剂盒(Qiagen cat#74004)

[0291] o Qiagen RNase-Free DNase套组(Qiagen cat#79254)

[0292] o β-巯基乙醇(Sigma cat#63689)

[0293] o Qiagen不锈钢5mm珠(Qiagen cat#69989)

[0294] o 2.0ml Seal Rite微量离心管(USA Scientific cat#1620-2700)

[0295] o Qiagen TissueLyser II(cat#85300)

[0296] ·cDNA合成

[0297] o大容量cDNA反转录试剂盒(Applied Biosystems cat#4368814)

[0298] o RNase抑制剂(Applied Biosystems cat#N8080119)

[0299] o BioRad热循环仪

[0300] ·相对定量PCR

[0301] o 2X Universal PCR Master Mix(Applied Biosystemscat#4304437)

[0302] o用于人RLBP1的20X 基因表达测定物(Applied Biosystemscat#4331182:Hs00165632.m1)

[0303] o用于小鼠RLBP1的20X 基因表达测定物(Applied Biosystemscat#4331182:Mm00445129.m1)

[0304] o 20X Applied 小鼠GAPD(GAPDH)内源性对照(探针,Primer Limited)(Applied Biosystems cat#4352339E)

[0305] o Applied Biosystems实时PCR机器型号7900HT.

[0306] ·此实施例中所用的测试物品：

[0307] o NVS8病毒载体

[0308] o NVS10病毒载体

[0309] o NVS4病毒载体

[0310] o NVS2病毒载体

[0311] o NVS6病毒载体

[0312] 方案：

[0313] 在体内实验结束时，自眼睛中解剖出神经视网膜，将其置于2ml微量离心管中且在干冰上快速冷冻。在独立管中冷冻剩余眼杯(除去视网膜和晶状体)。将样品储存于-80℃下直至进行RNA分离。在DNase处理下使用Qiagen RNeasy微量试剂盒提取总RNA。为实现组织均质化和溶解，使用Qiagen TissueLyzer。特别地，将5mm不锈钢珠添加至各个含有组织的管中，同时置于干冰上。将样品转移至室温并添加350μl含有1％β-巯基乙醇的缓冲液RLT。在TissueLyzer上以30Hz的震荡频率处理样品，进行两个2分钟循环。
接着在DNase处理下进行标准Qiagen RNeasy微量试剂盒方案以便RNA提取，具有一处微小修改。在洗脱之前，使RNA柱风干>10分钟以确保除去残余乙醇。将总RNA储存于-80℃下直至准备用于cDNA合成。

[0314] 使用Nanodrop分光光度计确定总RNA浓度。将各样品调整至50ng/μl的最终浓度。使用Applied Biosystems大容量cDNA反转录酶试剂盒产生cDNA。制备大容量cDNA RT试剂盒的试剂的母体混合物(master mix)，使得每10μl含有2μl 10X大容量RT缓冲液、0.8μl 25X dNTP(100mM)、2μl反转录酶随机引物、0.4μl RNase抑制剂、1μl Multiscribe反转录酶和3.8μl不含RNAse的水。将10μl各总RNA的50ng/μl储液分配至96孔PCR扩增板的孔中，接着添加10μl RT母体混合物至各孔中。将该板置于Bio-Rad热循环仪中且使用以下参数操作：25℃下10分钟，37℃下120分钟，85℃下5分钟，接着保持于4℃下直至程序结束。在开始相对定量PCR反应之前，将cDNA储存于-20℃下。

[0315] 通过添加5μl不含RNAse的水至cDNA反应的各孔中而将cDNA浓度调整至20ng/μl的最终浓度(这基于初始总RNA浓度且假定100％转化成cDNA)。对各cDNA样品建立两个不同的多重qPCR反应；一者使用小鼠RLBP1Taqman表达测定法探针与小鼠GAPDH内源性对照，且另一者使用人RLBP1Taqman表达测定法探针与小鼠GAPDH内源性对照。对各样品一式两份进行这两个反应中的每一者。对于各样品，将5μl的20ng/μl cDNA样品分配至385孔板的孔中。制备两个单独的母体混合物，一种用于小鼠RLBP1Taqman测定法且一种用于人RLBP1测定法，使得各15μl混合物含有10μl 2X UniversalPCR母体混合物、1μl小鼠或人RLBP1的20X 基因表达测定物、1μl 20X
Applied 小鼠GAPD(GAPDH)内源性对照和3μl不含RNAse的水。将15μl
合适的母体混合物分配至含有cDNA的孔中。将该板置于ABI7900HT实时PCR机器中且使用具有以下参数的相对定量程序运作：在50℃下初始孵育2分钟，接着进行以下两步的40个循环：在95℃下15秒以及在60℃下1分钟。

[0316] 使用ABI RQ Manager 1.2将相对定量板结果输入至RQ研究文件中。使用自动阈值设置来分析数据，得到平均值和平均ΔCt，ΔCt为RLBP1cDNA(小鼠或人)的Ct读数减去内部内源性GAPDH的Ct的差值。将数据输出至Microsoft Excel中，并用于通过自各样-ΔΔCt品的人RLBP1ΔCt减去小鼠RLBP1 ΔCt值来计算ΔΔCt值。使用算式2 计算相对表达，这将人RLBP1的相对表达表示为小鼠内源性RLBP1表达的倍数变化。为将结果描述为人RLBP1表达作为小鼠内源性表达的百分比，将相对表达值乘以100。

[0317] 结果：mRNA表达

[0318] 图1A图示NVS8、NVS4、NVS2和NVS6成功转导神经视网膜细胞与后部眼杯(posterior eyecup)中的RPE细胞。载体NVS10转导神经视网膜中的RPE细胞，但仅在检测限水平。
8

[0319] 图1B图示NVS2是以1x10vg/眼的较低剂量在神经视网膜中显示出mRNA表达的唯一载体。

[0320] 结论

[0321] 这些令人惊讶的结果显示，启动子、AAV基因组构造和AAV衣壳序列的特定组合可在视网膜中的不同细胞类型中产生不同转导性质。总体而言，所有测试的载体成功地引9
起载体介导的人RLBP1mRNA表达。更具体地，NVS2是在两种测试剂量(每只眼睛1x10和
8
1x10vg)下在RPE细胞(在后部眼杯中)和神经视网膜中表达人RLBP1mRNA的最有效载体，
9
而NVS4和NVS6在每只眼睛1x10vg的剂量引起可检测的载体介导的人RLBP1mRNA表达，
8 9
且在每只眼睛1x10vg的剂量仅在RPE中引起表达。NVS8和NVS10在每只眼睛1x10vg的
8
剂量在RPE和神经视网膜中引起可检测的mRNA表达，但在每只眼睛1x10vg的剂量几乎处于检测限。

[0322] 实施例4：基于视网膜电图的暗适应测定法

[0323] 一种评估改进视觉循环的治疗的途径是在强光暴露后定量黑暗中视觉功能的恢复(即暗适应)。在大量光暴露后的暗适应主要由眼睛经由视觉循环再生光色素的能力驱动。经治疗实现的视觉循环的改进因此将引起暗适应动力学的变化。

[0324] 已开发基于使用视网膜电图(ERG)定量暗适应来监测小鼠视觉功能恢复的测定法。基于ERG的测定法通常进行两天，使用初始基线和后续追踪测量来评估在暴露于使一部分光色素褪色(光褪色)的光后的恢复。经开发用于测试本发明的此程序首先在ERG迹线的a波部分中测定闪光后5ms每只眼睛的最大电反应。该测试随后在光褪色后4小时比较5ms a波振幅以评估那时恢复的最大振幅分数。如果视觉循环通常发挥功能，则ERG振幅将在4小时内接近基线值。迟滞的视觉循环将导致在光褪色后较低的光色素恢复，且ERG a波振幅恢复相应降低。

[0325] 供应物/试剂：

[0326] ·ERG系统：Diagnosys，具有ColorDome全视野ganzfeld刺激器的Espion E2控制台

[0327] ·氯胺酮(Ketamine)

[0328] ·甲苯噻嗪(Xylazine)

[0329] ·2.5％苯肾上腺素

[0330] ·1％环喷托酯

[0331] ·0.5％丙美卡因

[0332] ·活性电极：金圈接触透镜电极(Mayo，部件号N30)

[0333] ·参考电极：鼻咽电极(Grass，部件号F-ERG-G)

[0334] ·接地电极：铂针电极(Grass，部件号F-E2)

[0335] ·保湿滴剂：Novartis，Genteal轻度至中度

[0336] ·注射泵：Harvard Apparatus，部件号泵11Plus

[0337] 方案：

[0338] 在记录基线ERG之前，将小鼠置于黑暗中过夜，持续约20小时。在即将记录之前，用1-2滴1％环喷托酯和1-2滴2.5％苯肾上腺素使眼睛扩张。还施用1-2滴0.5％丙美卡因(局部麻醉剂)。接着，腹膜内注射氯胺酮和甲苯噻嗪(分别为100-150mg/kg和5-10mg/kg)的混合物使小鼠麻醉。接着放置三个电极，从而能够记录每只小鼠一只眼睛的ERG。眼睛上的活性电极为金圈接触透镜，参考电极为置于口中的鼻咽电极，且接地电极为置于头部正后方的背部上的皮下铂针电极。使眼睛保持湿润且通过使用注射器泵连续施用保湿滴剂(300μl/小时)来维持电接触。通过对甘茨菲尔备氏圆顶(ganzfeld dome)中的氙气灯所递送的三个白色闪光(2.7log暗视坎德拉秒/平方米)的电反应求平均值来记录ERG振幅。如使用为此目的开发的软件分析规程(Mathworks，Matlab)所评估，所报导的a波振幅为氙闪光后5ms测量的电压。

[0339] 通过在光褪色后4小时定量ERG a波振幅来评估暗适应。这些实验通常在基线测定后48小时进行。如基线测量那样，首先将小鼠在黑暗中圈养过夜，以便在约20小时后进行ERG记录。在即将光褪色之前，用1-2滴2.5％苯肾上腺素和1-2滴1％环喷托酯使眼睛扩张。接着，将一系列16次闪光(3.7log暗视坎德拉秒/平方米)递送至眼睛，导致光色素褪色。将小鼠放回黑暗中4小时以恢复视觉功能。接着利用基线测定所用的相同方案记录ERG。每只眼睛的视觉功能恢复定义为：

[0340]

[0341] 图2说明当测定法应用于RLBP1-/-和RLBP1+/+小鼠时的结果。RLBP1+/+小鼠显示在褪色后4小时几乎完全恢复(高达96％)。相比之下，RLBP1-/-小鼠由于严重迟滞的视觉循环动力学而在同一时间点恢复最小视觉功能(11％)(Saari等人2001)。RLBP1+/+小鼠与RLBP1-/-小鼠之间的该8-9倍窗口为注射至RLBP1-/-小鼠中的测试载体可达到的测定法窗口。

[0342] 使用上述基于ERG的暗适应测定法，在视网膜下引入治疗性载体的RLBP1敲除(KO)小鼠中测试暗适应效率的提高。由于视网膜下注射涉及神经视网膜自RPE的移位，所以关键在于确定神经视网膜是否再附着于RPE以避免ERG测定法中测试物品的假阴性结果。在将病毒载体视网膜下注射至小鼠眼睛中之后一周，进行光学相干断层成像术(OCT)以将视网膜的情况可视化。从ERG测量中排除具有未解析的视网膜脱离的眼睛。

[0343] 在各时间点，使小鼠暗适应过夜(>12小时)并将每只眼睛的ERG a波振幅确立为对光的最大暗适应反应(100％)。接着使充分暗适应的眼睛暴露于一系列强闪光(如先前章节中所述)且4小时后对a波振幅进行定量。术语“正常的百分比”定义为第二a波恢复测量相对于从最大a波恢复测量获得的值的百分比。

[0344] 阳性效力或有效作用定义为在注射后的给定时间点，测试测量值与阴性(未处理)对照之间的差异为统计学上显著的。

[0345] 此实施例中所用的测试物品包括：

[0346] ·NVS1病毒载体

[0347] ·NVS2病毒载体

[0348] ·NVS3病毒载体

[0349] ·NVS4病毒载体

[0350] ·NVS5病毒载体

[0351] ·NVS11病毒载体

[0352] 图3A-D说明表达RLBP1的病毒载体提高RLBP1KO小鼠的暗适应速率。使用单向ANOVA和Newman-Keuls多重比较测试进行统计学计算，对各组相对于未处理对照进行效力9
评估。对于所有相关研究显示未处理(未注射)眼睛和接受1x10vg/眼的阴性对照AAV空载体(NVS11)的眼睛的平均值+3个标准差(SD)以指示效力的近似阈值(高于此线的a波恢复通常显示出统计学上显著的效力)。这种用于展示功效程度的方法与基因疗法出版物中所呈现的方法类似(Jacobson等人2006和Roman等人2007)。

[0353] 图3A显示在3x108vg/眼的剂量，NVS2早在处理后14天即有效提高暗适应速率，8
且功效持续至少350天。3x10vg/眼剂量的NVS4也在处理后至少持续30-204天有效。已
8
在3个独立实验中在RLBP1KO小鼠模型中测试约3x10vg/眼的剂量的NVS2。在各实验中，在多至注射后350天的测试的所有时间点，载体均显示有效。

[0354] 图3B显示相同剂量(3x108vg/眼)的NVS1在注射后84天开始显示功效，功效持续至少350天。相同剂量的NVS5和NVS3在药物施用后多至154天仍未显示功效。图3A和图3B中所呈现的数据表明，尽管病毒载体基因组等效，但当包装于不同的AAV衣壳血清型(NVS1对NVS2)中时载体也可具有不同效力。另外，载体血清型、启动子和载体基因组构造的特定组合能够影响载体的效力(NVS1携带自身互补基因组，而NVS3和NVS4携带单链基因组，它们均具有不同的启动子序列)。此结果进一步证实基因组构造和衣壳血清型的组合能够影响恢复结果的效率。

[0355] 图3C显示在1x109vg/眼的剂量，NVS2早在处理后18天即有效，且功效持续至少9
375天。在1x10vg/眼的剂量，阴性对照AAV空载体NVS11与未注射的对照相比未显示出暗适应速率提高的显著差异(单个数据点未示出，但展示了历史平均值+3SD线以供比较)。
9
1x10vg/眼的剂量的NVS4也在处理后至少30-204天有效。

[0356] 图3D显示在3x109vg/眼的剂量，NVS3和NVS5分别早在处理后第26天即有效提高暗适应速率，且功效持续至少371天。

[0357] 图4A显示多种剂量的NVS2在注射后至少94天有效提高暗适应速率。基于单方8 9
向ANOVA与Newman-Keuls多重比较测试，3x10vg/眼和1x10vg/眼两组与未处理对照相比均有效。图4B以不同形式展示图4A的数据。在这种情况下，绘图展示眼睛/组的百分比，其中a波恢复大于若干实验的未处理组的平均值+3SD所定义的恢复。结果指示，对于
7 8 9
NVS2，50％的经3x10vg/眼处理的眼睛和100％的经3x10vg/眼和1x10vg/眼处理的眼睛显示有效的a波恢复，且建立剂量-反应曲线。

[0358] 图5A显示多种剂量的NVS4在注射后至少93天有效提高暗适应速率。基于单方8 9
向ANOVA与Newman-Keuls多重比较测试，3x10vg/眼和1x10vg/眼两组与未处理对照相比均有效。图5B以不同形式展示图5A的数据。在这种情况下，绘图展示眼睛/组的百分比，其中a波恢复大于若干实验的未处理组的平均值+3SD所定义的恢复。结果表明，对于
8 9
NVS4，≥85％的经3x10vg/眼和1x10vg/眼处理的眼睛显示出暗适应速率增加。

[0359] 图6显示由多种产生方法产生的载体NVS2所实现的暗适应速率增加。使用两种不同CsCl梯度离心方法产生NVS2和NVS2a，而NVS2b使用柱层析来纯化。基于单方向ANOVA与Tukey检验无法区分使用全部三种纯化方法在注射后84天实现的功效。此结果指示在2个独立实验室中独立产生的3种NVS2得到在RLBP1KO小鼠中产生相似功效的功能性材料。

[0360] 实施例4结果的概述：

[0361] ·以范围从≥3x107vg/眼至1x109vg/眼的剂量用病毒载体NVS2注射的眼睛显示出增加的暗适应速率，其中在RLBP1KO小鼠模型中功效在注射后持续至少350天。

[0362] ·以范围从3x108vg/眼至1x109vg/眼的剂量用病毒载体NVS4注射的眼睛显示出增加的暗适应速率，且两种剂量的功效持续至少204天。

[0363] ·以3x108vg/眼的剂量用病毒载体NVS1注射的眼睛显示出增加的暗适应速率，且功效持续至少350天。

[0364] ·以3x109vg/眼的剂量用病毒载体NVS3和NVS5注射的眼睛显示出增加的暗适应8
速率，且功效持续至少371天。以3x10vg/眼在测试的任何时间点均未观察到NVS3和NVS5的功效。

[0365] 结论：

[0366] 病毒载体NVS2显示出比等效剂量的其他测试载体更高的最大恢复。另外，当使用CsCl或柱层析纯化进行制备时，NVS2载体介导的功效似乎无法区分。

[0367] 结果概述：

[0368] 结果显示，自身互补AAV8-pRLBP1(短)-eGFP载体，治疗性载体NVS2的报导基因替代形态，引起RPE和米勒细胞类型特异性表达，且没有可检测的靶外表达，其中治疗性载7 9
体NVS2在范围从≥3x10vg/眼至1x10vg/眼的剂量在RLBP1小鼠中引起由a波恢复所
测量的至少350天的视觉功能恢复。如mRNA表达水平的测量所显示，此特异性基因盒在包装于单链基因组中且用相同血清型衣壳8包装时，在小鼠中显示出显著较低的基因表达水
8
平。与NVS2相同且包装于AAV2衣壳中的自身互补基因组(NVS1)在3x10vg/眼的剂量显示有效的a波恢复(即增加的暗适应速率)至少350天。此结果表明NVS2是比NVS1更有效力的病毒载体，这可能归因于AAV8衣壳比AAV2衣壳更有效率地感染靶细胞类型。

[0369] 结果还显示，AAV8-pRLBP1(长)-eGFP载体，治疗性载体NVS4的报导基因替代形8
态，引起RPE和米勒细胞表达，但还引起感光细胞表达。治疗性载体NVS4在范围从3x10vg/
9
眼至1x10vg/眼的剂量产生至少204天的功效。与NVS4相同但包装于AAV2衣壳中的基
9 8
因组(NVS3)以3x10的剂量实现有效的a波恢复，但在较低的测试剂量(3x10 vg/眼)下无法实现。结果显示，AAV8-pRPE65-eGFP载体，治疗性载体NVS6的报导基因替代形态，导致RPE细胞类型表达以及大量的感光细胞靶外表达。当在RLBP1KO小鼠功效模型中测试携带与NVS6相同但包装于AAV2衣壳中的基因组的治疗性载体NVS5时，结果显示NVS5在
9 8
3x10vg/眼的剂量持续阳性a波恢复功效，但在较低的测试剂量(3x10vg/眼)无法实现。

[0370] 参考文献:

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