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用于治疗视网膜疾病的感光细胞

阅读：1073发布：2020-10-02

IPRDB可以提供用于治疗视网膜疾病的感光细胞专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且公开了一种产生感光细胞的方法。还公开了包含感光细胞的细胞群及其用途。，下面是用于治疗视网膜疾病的感光细胞专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种产生感光细胞的方法，其包括(a)在引起感光细胞的条件下，在含有烟酰胺的培养基中培养干细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养基包含至少0.5mM烟酰胺。

3.根据权利要求1所述的方法，其还包括(b)在包含选自以下的至少一种试剂或试剂的组合的培养基中培养步骤(a)中产生的细胞：GSK3抑制剂、Wnt抑制剂、bFGF、HSA或IGF。

4.根据权利要求3所述的方法，其还包括在步骤(b)的所述培养之后分离感光细胞。

5.根据权利要求3所述的方法，其还包括在步骤(b)的所述培养之后扩增所述细胞。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中步骤(a)的所述培养是在非贴壁条件下进行。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中步骤(b)的所述培养是在非贴壁条件下进行。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中步骤(b)的所述培养基包含以下中的一种或多种：(i)烟酰胺和Wnt抑制剂；

(ii)烟酰胺和bFGF；

(iii)烟酰胺和IGF；

(iv)烟酰胺、IGF和GSK3抑制剂；

(v)烟酰胺、bFGF和Wnt抑制剂；

(vi)烟酰胺、Wnt抑制剂和HSA；

(vii)烟酰胺、bFGF和HSA；

(viii)烟酰胺、bFGF、Wnt抑制剂和HSA；或(ix)烟酰胺和HSA。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中步骤(a)的所述培养至少进行3天。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中步骤(b)的所述培养至少进行1周。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中步骤(b)的所述培养基基本上不含激活素A。

12.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中步骤(b)的所述培养基基本上不含TGFβ超家族成员。

13.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，在不存在所述TGFβ超家族成员的情况下进行，其允许分化成所述感光细胞。

14.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中在步骤(a)的所述培养之前，将所述干细胞在饲养细胞条件培养基中培养。

15.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中在步骤(a)的所述培养之前，将所述干细胞在层粘连蛋白上的无饲养细胞系统中培养。

16.根据权利要求3所述的方法，其还包括在步骤(b)之后冻存所述感光细胞。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述冻存在选自以下的培养基中进行：90％人血清/10％DMSO、CryoStor 10％、CryoStor 5％、CryoStor 2％、Stem Cellbanker和Prime FreezIS。

18.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述干细胞包括人胚胎干细胞(ESC)或诱导的多能干细胞(iPSC)。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中步骤(a)的所述培养基基本上不含Wnt抑制剂、bFGF、HSA、IGF和/或GSK3抑制剂。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述GSK3抑制剂包括CHIR。

21.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述Wnt抑制剂包括endo-IWRl。

22.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述非贴壁条件包括非贴壁培养板。

23.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述非贴壁条件包括非贴壁基材。

24.根据权利要求14所述的方法，其中所述饲养细胞条件培养基包括人脐带成纤维细胞条件培养基。

25.根据权利要求1所述的方法，其还包括将所述感光细胞移植到眼的视网膜下腔中。

26.根据权利要求25所述的方法，其中在悬液中或作为固定在基质或基材上的单层细胞移植所述感光细胞。

27.一种产生感光细胞的方法，其包括：

(a)在包含至少0.5mM烟酰胺的培养基中培养人多能干细胞群，其中培养物不包含处于浓度下的任何TGFβ超家族成员，其允许分化成所述感光细胞；和(c)从视网膜色素上皮(RPE)细胞中分离所述感光细胞，从而产生所述感光细胞。

28.一种感光细胞群，其可根据权利要求1或27所述的方法获得。

29.根据权利要求1所述的方法，其中所述视网膜疾病或病症选自以下中的至少一种：视网膜色素变性，勒伯尔先天性黑蒙，遗传性或获得性黄斑变性，年龄相关性黄斑变性(AMD)，贝斯特氏症，视网膜脱落，回旋状萎缩，无脉络膜，图形样营养不良，RPE营养不良，斯特格氏病，由光、激光、炎症、感染、辐射、新生血管或外伤的任一种引起的损伤导致的RPE或视网膜损伤。

30.一种在有需要的受试者中治疗视网膜疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求28所述的感光细胞群，从而治疗所述视网膜疾病或病症。

31.一种治疗视网膜疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的通过以下方法获得的感光细胞或感光细胞制品，所述方法包括(a)在引起感光细胞的条件下，在含有烟酰胺的培养基中培养干细胞。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述培养基包含至少0.5mM烟酰胺。

33.根据权利要求31所述的方法，其还包括(b)在包含选自以下的至少一种试剂的培养基中培养步骤(a)中产生的细胞：GSK3抑制剂、Wnt抑制剂、bFGF、HSA和或IGF。

34.根据权利要求33所述的方法，其还包括在步骤(b)的所述培养之后分离感光细胞。

35.根据权利要求33所述的方法，其中步骤(a)或步骤(b)的所述培养是在非贴壁条件下进行。

36.根据权利要求33所述的方法，其中步骤(b)的所述培养基包含以下中的一种或多种：(i)烟酰胺和Wnt抑制剂；

(ii)烟酰胺和bFGF；

(iii)烟酰胺和IGF；

(iv)烟酰胺、IGF和GSK3抑制剂；

(v)烟酰胺、bFGF和Wnt抑制剂；

(vi)烟酰胺、Wnt抑制剂和HSA；

(vii)烟酰胺、bFGF和HSA；

(viii)烟酰胺、bFGF、Wnt抑制剂和HSA；或者(ix)烟酰胺和HSA。

37.根据权利要求31所述的方法，其中所述干细胞包括人胚胎干细胞(ESC)或诱导的多能干细胞(iPSC)。

38.根据权利要求33所述的方法，其中所述施用是在眼的视网膜下腔中进行。

39.根据权利要求33所述的方法，其中在悬液中或作为固定在基质或基材上的单层细胞施用所述感光细胞。

40.根据权利要求1所述的方法，其还包括从培养物中分离所述感光细胞。

41.根据权利要求33所述的方法，其中在施用之前将所述感光细胞冻存。

42.根据权利要求33所述的方法，其中所述感光细胞包括视锥细胞和视杆细胞。

说明书全文

用于治疗视网膜疾病的感光细胞

背景技术

[0001] 本公开内容涉及从多能干细胞生产感光细胞的方法。

[0002] 视网膜疾病通常由于有丝分裂后神经元细胞的丢失导致失明。视网膜疾病包括视杆细胞或视锥细胞营养不良、视网膜变性、色素性视网膜炎、糖尿病性视网膜病、黄斑变性、勒伯尔先天性黑蒙和斯特格氏病。在大多数视网膜变性中，细胞丢失主要发生在外核层，其中包含了视杆和视锥感光细胞。随着有丝分裂后神经元细胞群的丢失，需要外源性来源的新细胞替代感光细胞。

[0003] 感光细胞的潜在替代来源包括干细胞。早期的研究纳入了使用小鼠细胞、小鼠干细胞或异源性的视网膜祖细胞群作为替代丢失的感光细胞的可能细胞来源。这些早期研究描述了从出生后第1天小鼠的视网膜移植感光细胞前体细胞，在体外从小鼠胚胎干细胞产生视网膜前体细胞，从出生后第1天小鼠的视网膜产生视网膜祖细胞，在视网膜变性RCS大鼠模型中植入骨髓间充质干细胞，从HI人胚胎干细胞系生产视网膜祖细胞，包括神经节细胞、无长突细胞、其中所有细胞中的0.01％表达S-视蛋白或视紫红质的感光细胞、双极细胞和水平细胞(Lamba等Proc.Natl.Acad.Sci.10(34):12769-12774,2006)以及从人成纤维细胞诱导诱导的多能干细胞(iPS)以产生视网膜祖细胞(Lamba等PLoS ONE 5(l):e8763.doi:10.1371/journal.pone.0008763)。

[0004] 然而，需要更有效地产生可用于细胞疗法的可移植感光细胞的新方法。更具体地，需要能够产生能够有效地生产视杆和视锥感光细胞的感光细胞祖细胞的方法。

[0005] 本公开解决了在再生医学和感光细胞疗法领域的这些和其他缺点。

发明内容

[0006] 根据本发明的一个方面，提供了一种在有需要的受试者中治疗视网膜疾病的方法，所述方法包括：

[0007] (a)在包含至少0.5mM烟酰胺的培养基中培养人多能干细胞群以获得分化的细胞；

[0008] (b)在包含至少一种选自以下的试剂的培养基中培养所述分化的细胞以产生感光细胞：Wnt抑制剂、HSA、bFGF、IGF和GSK3抑制剂；和

[0009] (c)向所述受试者施用治疗有效量的所述感光细胞，从而治疗所述视网膜疾病。

[0010] 感光细胞可以是视杆细胞或视锥细胞或者视杆细胞和视锥细胞这两者。

[0011] 根据本发明的一个方面，提供了一种产生感光细胞的方法，所述方法包括：

[0012] (a)在包含至少0.5mM烟酰胺的培养基中培养人多能干细胞群以获得分化的细胞；和

[0013] (b)在包含至少一种选自以下的试剂的培养基中培养所述分化的细胞以产生感光细胞：GSK3抑制剂、Wnt抑制剂、bFGF、HSA、IGF；和

[0014] (c)分离所述感光细胞，从而产生所述感光细胞。

[0015] 根据本发明的实施方式，所述方法还包括在步骤(b)的所述培养之后和所述施用之前分离感光细胞。

[0016] 根据本发明的实施方式，所述方法还包括在步骤(b)的所述培养之后扩增所述感光细胞。

[0017] 根据本发明的实施方式，步骤(a)的所述培养是在非贴壁条件下进行。

[0018] 根据本发明的实施方式，步骤(b)的所述培养是在非贴壁条件下进行。

[0019] 根据本发明的实施方式，步骤(b)的所述培养基包含：

[0020] (i)烟酰胺和Wnt抑制剂；

[0021] (i)烟酰胺和bFGF；

[0022] (ii)烟酰胺和IGF；

[0023] (iii)烟酰胺、IGF和GSK3抑制剂；或

[0024] (v)烟酰胺、bFGF和Wnt抑制剂；

[0025] (vi)烟酰胺、Wnt抑制剂和HSA；

[0026] (vii)烟酰胺、bFGF和HSA；

[0027] (viii)烟酰胺、bFGF、Wnt抑制剂和HSA；

[0028] (ix)烟酰胺和HSA。

[0029] 根据本发明的实施方式，步骤(a)的所述培养至少进行3天。

[0030] 根据本发明的实施方式，步骤(b)的所述培养至少进行1周。

[0031] 根据本发明的实施方式，步骤(b)的所述培养基不含激活素A。

[0032] 根据本发明的实施方式，步骤(b)的所述培养基不含TGFβ超家族成员。

[0033] 根据本发明的实施方式，所述方法是在不存在所述TGFβ超家族成员的情况下进行，其允许分化成所述感光细胞。

[0034] 根据本发明的实施方式，在步骤(a)的所述培养之前，将人多能干细胞在饲养细胞条件培养基中培养。

[0035] 根据本发明的实施方式，在步骤(a)的所述培养之前，将人多能干细胞在层粘连蛋白上的无饲养细胞培养系统中培养。

[0036] 根据本发明的实施方式，所述方法还包括在步骤(b)之后和步骤(c)之前冻存所述感光细胞。

[0037] 根据本发明的实施方式，所述方法还包括在步骤(c)之后冻存所述感光细胞。

[0038] 根据本发明的实施方式，所述冻存在选自以下的培养基中进行：90％人血清/10％DMSO、CryoStor 10％、CryoStor 5％、CryoStor 2％、Stem Cell banker和PrimeFreezIS。

[0039] 根据本发明的实施方式，人多能干细胞包括人胚胎干细胞(ESC)或诱导的多能干细胞(iPSC)。

[0040] 根据本发明的实施方式，步骤(a)的所述培养基不含Wnt抑制剂、bFGF、HSA、IGF和/或GSK3抑制剂。

[0041] 根据本发明的实施方式，所述GSK3抑制剂包括CHIR。

[0042] 根据本发明的实施方式，所述Wnt抑制剂包括endo-IWR1。

[0043] 根据本发明的实施方式，所述非贴壁条件包括非贴壁培养板。

[0044] 根据本发明的实施方式，所述非贴壁条件包括非贴壁基材。

[0045] 根据本发明的实施方式，所述饲养细胞条件培养基包括人脐带成纤维细胞条件培养基。

[0046] 根据本发明的实施方式，所述移植在眼的视网膜下腔中进行。

[0047] 根据本发明的实施方式，在悬液中或作为固定在基质或基材上的单层细胞移植所述感光细胞。

[0048] 根据本发明的一个方面，提供了一种产生感光细胞的方法，所述方法包括：

[0049] (a)在包含至少0.5mM烟酰胺的培养基中培养人多能干细胞群，其中培养物不包含处于浓度下的任何TGFβ超家族成员，其允许分化成所述感光细胞；和

[0050] (b)从视网膜色素上皮(RPE)细胞中分离所述感光细胞，从而产生感光细胞。

[0051] 根据本发明的一个方面，提供了一种根据如本文所述的方法可获得的感光细胞群。

[0052] 根据本发明的实施方式，所述视网膜疾病或病症选自以下中的至少一种：视网膜色素变性，勒伯尔先天性黑蒙，遗传性或获得性黄斑变性，年龄相关性黄斑变性(AMD)，贝斯特氏症，视网膜脱落，回旋状萎缩，无脉络膜，图形样营养不良(pattern dystrophy)，RPE营养不良，斯特格氏病，由光、激光、炎症、感染、辐射、新生血管或外伤的任一种引起的损伤导致的RPE和视网膜损伤。

[0053] 根据本发明的一个方面，提供了一种在有需要的受试者中治疗视网膜疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如本文所述的感光细胞群，从而治疗所述视网膜疾病或病症。

[0054] 除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文所述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本发明实施方式的实践或测试中，下文描述了示例性的方法和/或材料。在有冲突的情况下，以专利说明书包括定义为准。此外，材料、方法和实例仅是说明性的，其并非旨在必要限制。

附图说明

[0055] 专利或申请文件包含至少一张彩色附图。基于请求并缴纳必要的费用，将由专利局提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。

[0056] 本文仅通过示例的方式参考附图描述了一些实施方式。现在具体地参考附图中的细节，但是要强调的是，所示出的细节是作为实例并且出于对本发明实施方式的说明性讨论的目的。就这一点而言，结合附图的描述使得可以如何实践不同的实施方式对于本领域技术人员是显而易见的。

[0057] 在附图中：

[0058] 图1是根据某些实施方式的一种产生球形体(spheroid body)(SB)的方法的示意图。

[0059] 图2是通过使用因子和时间轴的不同组合培养SB产生感光细胞祖细胞的方法的示意图。

[0060] 图3是说明使用NIC、bFGF、CHIR和IGF1的组合培养1个月的SB的眼区和视网膜祖细胞标志物Six3的表达的图。

[0061] 图4是说明使用NIC、bFGF、CHIR和IGF1的组合处理1个月的SB的眼区和视网膜祖细胞标志物Six6的表达的图。

[0062] 图5是说明使用NIC、bFGF、CHIR和IGF1的组合处理1个月的SB的视网膜祖细胞标志物Chx10的表达的图。

[0063] 图6是说明使用NIC、bFGF、CHIR和IGF1的组合处理1个月的SB的眼区和视网膜祖细胞标志物Rx的表达的图。

[0064] 图7是说明使用NIC、bFGF、CHIR和IGF1的组合处理1个月的SB的感光细胞祖细胞和感光细胞标志物CRX的表达的图。

[0065] 图8是说明使用NIC、bFGF、CHIR和IGF1的组合处理1个月的SB的感光细胞祖细胞和感光细胞标志物NRL的表达的图。

[0066] 图9是说明在NIC+bFGF或NIC+bFGF+CHIR中培养17天的SB，和对照HADC102(在用于人多能干细胞的 hPSC XF*无Xeno培养基(Biological Industries)中培养6-7天的未分化HAD-C102细胞)的Six3标志物的表达的图。

[0067] 图10是说明在NIC+bFGF或NIC+bFGF+CHIR中培养17天的SB，和对照HADC102(在hPSC XF*无Xeno培养基中培养的未分化HAD-C102细胞)的Six6标志物的表达的图。

[0068] 图11是说明在NIC+bFGF或NIC+bFGF+CHIR中培养17天的SB，和对照HADC102(在hPSC XF*无Xeno培养基中培养的未分化HAD-C102细胞)的Chx10标志物的表达的图。

[0069] 图12是说明在NIC+bFGF或NIC+bFGF+CHIR中培养17天的SB，和对照HADC102(在hPSC XF*无Xeno培养基中培养的未分化HAD-C102细胞)的Rx标志物的表达的图。

[0070] 图13是说明在NIC+bFGF或NIC+bFGF+CHIR中培养17天的SB，和对照HADC102(在hPSC XF*无Xeno培养基中培养的未分化HAD-C102细胞)的CRX标志物的表达的图。

[0071] 图14是说明在NIC+bFGF或NIC+bFGF+CHIR中培养17天的SB，和对照HADC102(在hPSC XF*无Xeno培养基中培养的未分化HAD-C102细胞)的NRL标志物的表达的图。

[0072] 图15是根据某些实施方式的培养SB的不同方法的示意图。

[0073] 图16是说明在NIC中培养20天的SB的标志物Pax6的表达的图。对照HAD102包含来自细胞系HAD-C102的未分化细胞，培养在用于人多能干细胞的 hPSC XF*无Xeno培养基(Cat#05-100-lA，Biological Industries)中。

[0074] 图17是说明在NIC中培养20天的SB和对照HAD102(在 hPSC XF*无Xeno培养基中培养的未分化HAD-C102细胞)的标志物Six3的表达的图。

[0075] 图18是说明在NIC中培养20天的SB和对照HAD102(在 hPSC XF*无Xeno培养基中培养的未分化HAD-C102细胞)的标志物Rx的表达的图。

[0076] 图19是说明在NIC中培养20天的SB和对照HAD102(在 hPSC XF*无Xeno培养基中培养的未分化HAD-C102细胞)的标志物Six6的表达的图。

[0077] 图20是说明在NIC中培养20天的SB和对照HAD102(在 hPSC XF*无Xeno培养基中培养的未分化HAD-C102细胞)的标志物Chx10的表达的图。

[0078] 图21是说明在NIC+IWRle或NIC+IWRle+bFGF或NIC+bFGF中培养20天的SB和对照HAD102(在 hPSC XF*无Xeno培养基中培养的未分化HAD-C102细胞)的标志物Pax6的表达的图。

[0079] 图22是说明在NIC+IWRle或NIC+IWRle+bFGF或NIC+bFGF中培养20天的SB和对照HAD102(在 hPSC XF*无Xeno培养基中培养的未分化HAD-C102细胞)的标志物Six3的表达的图。

[0080] 图23是说明在NIC+IWRle或NIC+IWRle+bFGF或NIC+bFGF中培养20天的SB和对照HAD102(在 hPSC XF*无Xeno培养基中培养的未分化HAD-C102细胞)的标志物Rx的表达的图。

[0081] 图24是说明在NIC+IWRle或NIC+IWRle+bFGF或NIC+bFGF中培养20天的SB和对照HAD102(在 hPSC XF*无Xeno培养基中培养的未分化HAD-C102细胞)的标志物Six6的表达的图。

[0082] 图25是说明在NIC+IWRle或NIC+IWRle+bFGF或NIC+bFGF中培养20天的SB和对照HAD102(在 hPSC XF*无Xeno培养基中培养的未分化HAD-C102细胞)的标志物Chx10的表达的图。

[0083] 图26是说明在NIC+IWRle或NIC或IWRle中培养的SB和对照HAD102(在hPSC XF*无Xeno培养基中培养的未分化HAD-C102细胞)的标志物Pax6
的表达的图。

[0084] 图27是说明在NIC+IWRle或NIC或IWRle中培养的SB和对照HAD102(在hPSC XF*无Xeno培养基中培养的未分化HAD-C102细胞)的标志物Six3
的表达的图。

[0085] 图28是说明在NIC+IWRle或NIC或IWRle中培养的SB和对照HAD102(在hPSC XF*无Xeno培养基中培养的未分化HAD-C102细胞)的标志物Rx的表
达的图。

[0086] 图29是说明在NIC+IWRle或NIC或IWRle中培养的SB和对照HAD102(在hPSC XF*无Xeno培养基中培养的未分化HAD-C102细胞)的标志物Six6
的表达的图。

[0087] 图30是说明在NIC+IWRle或NIC或IWRle中培养的SB和对照HAD102(在hPSC XF*无Xeno培养基中培养的未分化HAD-C102细胞)的标志物Chx10
的表达的图。

[0088] 图31是说明在NIC+IWRle或IWRle或IWRle+bFGF中培养的SB和对照HAD102(在hPSC XF*无Xeno培养基中培养的未分化HAD-C102细胞)的标志物Pax6的表达的图。

[0089] 图32是说明在NIC+IWRle或IWRle或IWRle+bFGF中培养的SB和对照HAD102(在hPSC XF*无Xeno培养基中培养的未分化HAD-C102细胞)的标志物Six3的表达的图。

[0090] 图33是说明在NIC+IWRle或IWRle或IWRle+bFGF中培养的SB和对照HAD102(在hPSC XF*无Xeno培养基中培养的未分化HAD-C102细胞)的标志物Rx的表达的图。

[0091] 图34是说明在NIC+IWRle或IWRle或IWRle+bFGF中培养的SB和对照HAD102(在hPSC XF*无Xeno培养基中培养的未分化HAD-C102细胞)的标志物Six6的表达的图。

[0092] 图35是说明在NIC+IWRle或IWRle或IWRle+bFGF中培养的SB和对照HAD102(在hPSC XF*无Xeno培养基中培养的未分化HAD-C102细胞)的标志物Chx10的表达的图。

[0093] 图36是使用包括人血清白蛋白(HSA)在内的多种试剂的组合培养SB的不同方法的示意图。

[0094] 图37A是使用NIC+IWR1e培养的衍生自hESC的SB的图像。

[0095] 图37B是使用NIC+IWR1e+HSA培养的衍生自hESC的SB的图像。

[0096] 图38是说明在NIC+IWRe+HSA或NIC+IWRe中培养4周后的SB和对照HAD102(在hPSC XF*无Xeno培养基中培养的未分化HAD-C102细胞)的标志物Chx10的表达的图。

[0097] 图39是说明在NIC+IWRe+HSA或NIC+IWRe中培养4周后的SB和对照HAD102(在hPSC XF*无Xeno培养基中培养的未分化HAD-C102细胞)的标志物Pax6的表达的图。

[0098] 图40是说明在NIC+IWRe+HSA或NIC+IWRe中培养4周后的SB和对照HAD102(在hPSC XF*无Xeno培养基中培养的未分化HAD-C102细胞)的标志物Rx的表达的图。

[0099] 图41是说明在NIC+IWRe+HSA或NIC+IWRe中培养4周后的SB和对照HAD102(在hPSC XF*无Xeno培养基中培养的未分化HAD-C102细胞)的标志物Six6的表达的图。

[0100] 图42是说明在NIC+bFGF或NIC+HSA或NIC+IWRe+HSA中培养4周的SB和对照HAD(在hPSC XF*无Xeno培养基中培养的未分化HAD-C102细胞)的标志物Chx10的表达的图。

[0101] 图43是说明在NIC+bFGF或NIC+HSA或NIC+IWRe+HSA中培养4周的SB和对照HAD(在hPSC XF*无Xeno培养基中培养的未分化HAD-C102细胞)的标志物Pax6的表达的图。

[0102] 图44是说明在NIC+bFGF或NIC+HSA或NIC+IWRe+HSA中培养4周的SB和对照HAD(在hPSC XF*无Xeno培养基中培养的未分化HAD-C102细胞)的标志物Rx的表达的图。

[0103] 图45是说明在NIC+bFGF或NIC+HSA或NIC+IWRe+HSA中培养4周的SB和对照HAD(在hPSC XF*无Xeno培养基中培养的未分化HAD-C102细胞)的标志物Six6的表达的图。

[0104] 图46是说明在NIH(NIC、IWRe和HSA)中培养4.5周或在NIH中培养5周或在NIH中培养6周或在NIH中培养7周的SB和对照HAD(在 hPSC XF*无Xeno培养基中培养的未分化HAD-C102细胞)的标志物Chx10的表达的图。

[0105] 图47是说明在NIH中培养4.5周或在NIH中培养5周或在NIH中培养6周或在NIH中培养7周的SB和对照HAD(在 hPSC XF*无Xeno培养基中培养的未分化HAD-C102细胞)的标志物Pax6的表达的图。

[0106] 图48是说明在NIH中培养4.5周或在NIH中培养5周或在NIH中培养6周或在NIH中培养7周的SB和对照HAD(在 hPSC XF*无Xeno培养基中培养的未分化HAD-C102细胞)的标志物Rx的表达的图。

[0107] 图49是说明在NIH中培养4.5周或在NIH中培养5周或在NIH中培养6周或在NIH中培养7周的SB和对照HAD(在 hPSC XF*无Xeno培养基中培养的未分化HAD-C102细胞)的标志物Six6的表达的图。

[0108] 图50是说明相比于在层粘连蛋白521上在 hPSC XF*无Xeno培养基中(在NIH(NIH Lam)中悬浮培养)培养的衍生自hESC的SB的表达，在明胶上在脐带饲养细胞条件化的 hPSC XF*无Xeno培养基中培养的衍生自hESC(HAD-C102)的
SB和在NIH(NIC、IWRe和HSA)(NIH脐带)中悬浮培养的SB的标志物Rx的表达的图。所使用的对照为在存在NIC(SB NIC)的情况下悬浮培养过夜的SB。

[0109] 图51是说明相比于在层粘连蛋白521上在 hPSC XF*无Xeno培养基中(在NIH(NIH Lam)中悬浮培养)培养的衍生自hESC的SB的表达，在明胶上在脐带饲养细胞条件化的 hPSC XF*无Xeno培养基中培养的衍生自hESC的SB和在NIH
(NIH脐带)中悬浮培养的SB的标志物Pax6的表达的图。对照为在存在NIC(SB NIC)的情况下悬浮培养过夜的SB。

[0110] 图52是说明相比于在层粘连蛋白521上在 hPSC XF*无Xeno培养基中(在NIH(NIH Lam)中悬浮培养)培养的衍生自hESC的SB的表达，在明胶上在脐带饲养细胞条件化的 hPSC XF*无Xeno培养基中培养的衍生自hESC的SB和在NIH
(NIH脐带)中悬浮培养的SB的标志物Six3的表达的图。对照为在存在NIC(SB NIC)的情况下悬浮培养过夜的SB。

[0111] 图53是说明相比于在层粘连蛋白521上在 hPSC XF*无Xeno培养基中(在NIH(NIH Lam)中悬浮培养)培养的衍生自hESC的SB的表达，在明胶上在脐带饲养细胞条件化的 hPSC XF*无Xeno培养基中培养的衍生自hESC的SB和在NIH
(NIH脐带)中悬浮培养的SB的标志物Six6的表达的图。对照为在存在NIC(SB NIC)的情况下悬浮培养过夜的SB。

[0112] 图54是说明相比于在层粘连蛋白521上在 hPSC XF*无Xeno培养基中(在NIH(NIH Lam)中悬浮培养)培养的衍生自hESC的SB的表达，在明胶上在脐带饲养细胞条件化的 hPSC XF*无Xeno培养基中培养的衍生自hESC的SB和在NIH
(NIH脐带)中悬浮培养的SB的标志物Chx10的表达的图。对照为在存在NIC(SB NIC)的情况下悬浮培养过夜的SB。

[0113] 图55是说明相比于在层粘连蛋白521上在 hPSC XF*无Xeno培养基中(在NIH(NIH Lam)中悬浮培养)培养的衍生自hESC的SB的表达，在明胶上在脐带饲养细胞条件化的 hPSC XF*无Xeno培养基中培养的衍生自hESC的SB和在NIH
(NIH脐带)中悬浮培养的SB的标志物Rx的表达的图。对照为在存在NIC(SB NIC)的情况下悬浮培养过夜的SB。

[0114] 图56是说明相比于在层粘连蛋白521上在 hPSC XF*无Xeno培养基中(在NIH(NIH Lam)中悬浮培养)培养的衍生自hESC的SB的表达，在明胶上在脐带饲养细胞条件化的 hPSC XF*无Xeno培养基中培养的衍生自hESC的SB和在
NIH(NIH脐带)中悬浮培养的SB的标志物Pax6的表达的图。对照为在存在NIC(SB NIC)的情况下悬浮培养过夜的SB。

[0115] 图57是说明相比于在层粘连蛋白521上在 hPSC XF*无Xeno培养基中(在NIH(NIH Lam)中悬浮培养)培养的衍生自hESC的SB的表达，在明胶上在脐带饲养细胞条件化的 hPSC XF*无Xeno培养基中培养的衍生自hESC的SB和在NIH
(NIH脐带)中悬浮培养的SB的标志物Six6的表达的图。对照为在存在NIC(SB NIC)的情况下悬浮培养过夜的SB。

[0116] 图58是说明相比于在层粘连蛋白521上在 hPSC XF*无Xeno培养基中(在NIH(NIH Lam)中悬浮培养)培养的衍生自hESC的SB的表达，在明胶上在脐带饲养细胞条件化的 hPSC XF*无Xeno培养基中培养的衍生自hESC的SB和在
NIH(NIH脐带)中悬浮培养的SB的标志物Chx10的表达的图。对照为在存在NIC(SB NIC)的情况下悬浮培养过夜的SB。

[0117] 图59A是在体外使用抗RAX抗体染色(红色)和使用DAPI核复染(蓝色)的衍生自hESC的感光细胞祖细胞的图像。

[0118] 图59B是在体外使用抗RAX抗体染色(红色)和细胞表达的GFP(绿色)的衍生自hESC的感光细胞祖细胞的图像。

[0119] 图60A是在体外使用抗Chx10抗体染色(红色)和使用DAPI核复染(蓝色)的衍生自hESC的感光细胞祖细胞的图像。

[0120] 图60B是在体外使用抗Chx10抗体染色(红色)和细胞表达的GFP(绿色)的衍生自hESC的感光细胞祖细胞的图像。

[0121] 图61A是在体外使用抗Crx抗体染色(红色)和使用DAPI核复染(蓝色)的衍生自hESC的感光细胞祖细胞的图像。

[0122] 图61B是在体外使用抗Crx抗体染色(红色)和细胞表达的GFP(绿色)的衍生自hESC的感光细胞祖细胞的图像。

[0123] 图62A和图62C是在体外使用抗恢复蛋白染色(红色)和使用DAPI核复染(蓝色)的衍生自hESC的感光细胞祖细胞的图像。

[0124] 图62B和图62D是在体外使用抗恢复蛋白染色(红色)的衍生自hESC的感光细胞祖细胞的图像。

[0125] 图63A和图63B是经工程化以表达GFP的衍生自hESC的SB的图像。

[0126] 图64是根据某些实施方式的视网膜下移植程序的图像。

[0127] 图65是根据某些实施方式在移植程序后形成的视网膜下小泡的图像(用黑色箭头标记小泡的边界)。

[0128] 图66是将细胞移植入视网膜下腔中后4周衍生自hESC的感光细胞祖细胞的图像。细胞经工程化以表达GFP并且使用抗GFP抗体染色(绿色)。在视网膜下腔中可见移植细胞的移植，并迁移至不同的视网膜层中。散在的GFP阳性细胞掺入外核(感光细胞)层(ONL，箭头)。使用DAPI对核进行复染(蓝色)。

[0129] 图67是将细胞移植入视网膜下腔中后7周衍生自hESC的感光细胞祖细胞的图像。细胞经工程化以表达GFP并且使用抗GFP抗体染色(绿色)。细胞还使用视紫红质染色，视紫红质是视杆感光细胞的特异性标志物(红色)。宿主视杆感光细胞也表达视紫红质，但不表达GFP(绿色)。使用DAPI对核进行复染(蓝色)。

[0130] 图68是在移植后7周在表达视锥感光细胞特异性标志物红色/绿色视蛋白(红色，箭头)的视网膜下移植物中的移植细胞(绿色)的图像。使用DAPI对核进行复染(蓝色)。

[0131] 图69是在视网膜下移植后4-6周表达GFP的衍生自hESC的感光细胞祖细胞的图像。使用抗GFP(绿色)和抗视紫红质(红色)免疫组化共染色鉴定感光细胞祖细胞。使用DAPI对核进行复染(蓝色)。移植前，在体外使用NIC+IWRle+HSA处理hESC，以诱导其分化成感光细胞祖细胞。放大倍数20x。

[0132] 图70是在视网膜下移植后4-6周表达GFP的衍生自hESC的感光细胞祖细胞的图像。使用抗GFP(绿色)和抗视紫红质(红色)免疫组化共染色鉴定感光细胞祖细胞。使用DAPI对核进行复染(蓝色)。移植前，在体外使用NIC+IWRle+HSA处理hESC，以诱导其分化成感光细胞祖细胞。放大倍数40x。

[0133] 图71是在视网膜下移植后4-6周表达GFP的衍生自hESC的感光细胞祖细胞的图像。使用抗GFP(绿色)和针对红色/绿色视蛋白(红色)的抗体免疫组化共染色鉴定感光细胞祖细胞。使用DAPI对核进行复染(蓝色)。移植前，在体外使用NIC+IWRle+HSA处理hESC，以诱导其分化成感光细胞祖细胞。放大倍数40x。

具体实施方式

[0134] 在其一些实施方式中，本发明涉及由多能干细胞制备感光细胞的方法。

[0135] 在解释至少一个实施方式之前，应当理解的是，本公开的应用并不一定限于在以下描述中阐述的或由实施例示例的细节。实施方式能够以各种方式实践或实施。

[0136] 已建议将人胚胎干细胞作为产生包括视网膜色素上皮(RPE)细胞和感光细胞在内的视网膜细胞的细胞来源。

[0137] 尽管减少了本发明实践的实施方式，但是本发明人发现烟酰胺单独或与IWRe、bFGF、IGF和/或CHIR的特定组合足以从人多能干细胞产生感光细胞，如通过感光细胞标志物的的表达所证明的(例如，RT-PCR)。已证实，即使在移植后7周，移植的感光细胞也能够在啮齿动物模型的视网膜下腔存活。移植物表达视锥感光细胞特异性标志物。

[0138] 如在本文中所使用的，术语“感光细胞”(简称为“感光细胞(photoreceptor)”)指能够进行光转导的生物细胞。该术语还指表达中等水平的CRX和NRL(参见例如图7、图8、图13和图14)，但能够在移植进入视网膜下腔后分化成感光细胞的感光细胞前体/祖细胞。本发明这一方面的感光细胞可以是视杆细胞和/或视锥细胞。优选地，眼内移植后，其显示出与天然感光细胞的那些类似的功能性活性。

[0139] 根据某些实施方式，感光细胞表达至少1种、2种、3种或4种感光细胞标志物。这样的标志物包括但不限于CHX10/VSX2(视觉系统同源盒2)、视紫红质、CRX、抑制蛋白、视蛋白、恢复蛋白和NRL(神经视网膜特异性亮氨酸拉链蛋白)。

[0140] 根据其他实施方式，感光细胞能够治疗疾病，如黄斑变性。

[0141] 在上下文允许时，“视网膜色素上皮细胞”、“RPE细胞”、“RPE”可以互换使用，指细胞类型在功能上与天然RPE细胞类似的细胞，天然RPE细胞形成视网膜的色素上皮细胞层(例如，在眼内移植后，其显示出与天然RPE细胞的那些类似的功能性活性)。

[0142] 根据一个实施方式，RPE细胞表达成熟RPE细胞的至少1种、2种、3种、4种或5种标志物。这样的标志物包括但不限于CRALBP、RPE65、PEDF、PMEL17、Bestrophin、ZO-l和酪氨酸酶。任选地，RPE细胞还可以表达RPE祖细胞的标志物，例如MITF。在另一个实施方式中，RPE细胞表达PAX-6。在另一个实施方式中，RPE细胞表达视网膜祖细胞的至少一种标志物，包括但不限于Rx、OTX2或SIX3。任选地，RPE细胞表达SIX6和/或LHX2。

[0143] 如在本文中所使用的，短语“成熟RPE细胞的标志物”指相对于非RPE细胞或未成熟RPE细胞，在成熟RPE细胞中升高(例如，至少2倍、至少5倍、至少10倍)的抗原(例如，蛋白)。

[0144] 如在本文中所使用的，短语“RPE祖细胞的标志物”指相对于非RPE细胞，在RPE祖细胞中升高(例如，至少2倍、至少5倍、至少10倍)的抗原(例如，蛋白)。

[0145] 根据另一个实施方式，RPE细胞具有与形成视网膜的色素上皮细胞层的天然RPE细胞类似的形态，即着色的并具有特征性的多边形形状。

[0146] 根据又一个实施方式，RPE细胞能够治疗疾病，例如黄斑变性。

[0147] 根据又一个实施方式，RPE细胞满足本文上文所列的至少1个、2个、3个、4个或全部要求。

[0148] 如在本文中所使用的，短语“干细胞”指能够在培养中长时间保持未分化状态(例如，多能或多能干细胞)，直至诱导以分化成具有特定的、专门的功能的其他细胞类型(例如，完全分化的细胞)。优选地，短语“干细胞”包括胚胎干细胞(ESC)、诱导的多能干细胞(iPSC)、成体干细胞、间充质干细胞和造血干细胞。

[0149] 根据一个特定的实施方式，感光细胞由多能干细胞(例如，ESC或iPSC)产生。

[0150] 诱导的多能干细胞(iPSC)可以通过对体细胞进行遗传操纵由体细胞产生，例如用转录因子例如Oct-3/4、Sox2、c-Myc和KLF4逆转录转导体细胞例如成纤维细胞、肝细胞、胃上皮细胞[Yamanaka S,Cell Stem Cell.2007,l(l):39-49；Aoi T,等,Generation of Pluripotent Stem Cells from Adult Mouse Liver and Stomach Cells.Science.2008Feb 14.(出版前电子公开)；IH Park,Zhao R,West JA,等,
Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined
factors.Nature2008；451:141-146；K Takahashi,Tanabe K,Ohnuki M,等,Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.Cell
2007；131:861-872]。如果使受体细胞停止在有丝分裂中，则可以通过核转移到卵母细胞、与胚胎干细胞融合或核转移到合子中来生成其他胚胎样干细胞。此外，可以使用非整合方法(例如，使用小分子或RNA)产生iPSC。

[0151] 短语“胚胎干细胞”指能够分化为所有三个胚胎胚层(即内胚层、外胚层和中胚层)的细胞或保持未分化状态的胚胎细胞。短语“胚胎干细胞”可以包括从胚胎植入前(即，植入前囊胚)和妊娠后(例如，囊胚)形成的胚胎组织获得的细胞，从植入后/妊娠前阶段的囊胚获得的扩展囊胚细胞(EBC)(见WO2006/040763)和从妊娠期间任何时间(优选妊娠的10周前)胎儿的生殖组织获得的胚胎生殖(EG)细胞。可以使用本领域熟知的细胞培养方法获得本发明一些实施方式的胚胎干细胞。例如，可以从人囊胚中分离人胚胎干细胞。人囊胚通常从人体内植入前胚胎或从体外受精(IVF)胚胎获得。或者，可以将单细胞人胚胎扩增至囊胚期。为了分离人ES细胞，将透明带从囊胚中取出，并通过下述程序分离内细胞团(ICM)，将滋养层细胞裂解并通过轻柔吸取将其从完整的ICM上除去。然后将ICM铺板在含有能够使其向外生长的适宜培养基的组织培养瓶中。9至15天后，通过机械解离或通过酶促降解将ICM衍生的向外生长解离成团块，然后将细胞重新铺板在新鲜的组织培养基上。通过微量移液器个体地选择显示出未分化形态的集落，将其机械解离成团块，并且重新铺板。然后，每4-7天将所得到的ES细胞常规分瓶(split)。人ES细胞制备方法的更多细节参见Reubinoff等,Nat Biotechnol 2000,May:18(5):559；Thomson等,[美国专利号5,843,780；Science 282:1145,1998；Curr.Top.Dev.Biol.38:133,1998；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7844,1995]；
Bongso等,[Hum Reprod 4:706,1989]；和Gardner等,[Fertil.Steril.69:84,1998]。

[0152] 应当意识到的是，根据本发明的一些实施方式也可以使用市售的干细胞。人ES细胞可以购自NIH人胚胎干细胞登记处[www(dot)grants(dot)nih(dot)gov/stem_cells/registry/current(dot)htm]或其他hESC登记处。市售胚胎干细胞系的非限制性实例为HAD-C102、HAD-C100、HAD-C106、HAD-C105、HAD-C104、HADC-C103、HAD-C107、ESI、BG01、BG02、BG03、BG04、CY12、CY30、CY92、CY10、TE03、TE32、CHB-4、CHB-5、CHB-6、CHB-8、CHB-9、CHB-10、CHB-11、CHB-12、HUES 1、HUES 2、HUES 3、HUES 4、HUES 5、HUES 6、HUES 7、HUES 8、HUES 9、HUES 10、HUES 11、HUES 12、HUES 13、HUES 14、HUES 15、HUES 16、HUES 17、HUES 18、HUES 19、HUES 20、HUES 21、HUES 22、HUES 23、HUES 24、HUES 25、HUES 26、HUES 27、HUES 28、CyT49、RUES 3、WA01、UCSF4、NYUES1、NYUES2、NYUES3、NYUES4、NYUES5、NYUES6、NYUES7、UCLA 1、UCLA 2、UCLA 3、WA077(H7)、WA09(H9)、WA13(H13)、WA14(H14)、HUES 62、HUES 63、HUES 64、CTl、CT2、CT3、CT4、MA135、Eneavour-2、WIBR1、WIBR2、WIBR3、WIBR4、WIBR5、WIBR6、HUES 45、Shef 3、Shef 6、BJNheml9、BJNhem20、SA001、SA001。

[0153] 根据一个特定的实施方式，胚胎干细胞是HAD-C102或ESI。

[0154] 此外，ES细胞还可以来自其他物种，包括小鼠(Mills and Bradley,2001)、黄金地鼠[Doetschman等,1988,Dev Biol.127:224-7]、大鼠[Iannaccone等,1994,Dev Biol.163:288-92]、兔子[Giles等,1993,Mol Reprod Dev.36:130-8；Graves&Moreadith,1993,Mol Reprod Dev.1993,36:424-33]、几种家畜[Notarianni等,1991,J Reprod Fertil Suppl.43:255-60；Wheeler 1994,Reprod Fertil Dev.6:563-8；Mitalipova等,2001,Cloning.3:59-67]和非人灵长类动物(恒河猴和绒猴)[Thomson等,1995,Proc Natl Acad Sci U S A.92:7844-8；Thomson等,1996,Biol Reprod.55:254-9]。

[0155] 扩展的囊胚细胞(EBC)可以获自原肠胚之前阶段受精后至少9天的囊胚。在培养囊胚之前，先消化透明带[例如使用Tyrode酸性溶液(Sigma Aldrich,St Louis,MO,USA)]，以暴露内细胞团。然后，使用标准胚胎干细胞培养方法，将囊胚作为完整胚胎培养至少9天且不超过受精后14天(即，在原肠胚形成事件之前)。

[0156] 在Chung等,Cell Stem Cell,Volume 2,Issue 2,113-117,7February 2008中描述了用于制备ES细胞的另一种方法。这种方法包括在体外受精过程中从胚胎中去除单个细胞。在该过程中不破坏胚胎。

[0157] 使用本领域技术人员公知的实验室技术，从妊娠约8-11周的胎儿(在人类胎儿的情况下)获得的原始生殖细胞制备EG细胞。将生殖嵴解离并切成小块，然后通过机械解离将其解聚成细胞。随后，在含有适宜的培养基的组织培养瓶中生长EG细胞。每天更换培养基培养细胞，直到观察到与EG细胞一致的细胞形态，通常是在7-30天或1-4代后。对于人EG细胞制备方法的其他细节，参见Shamblott等,[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:13726,1998]和美国专利号6,090,622。

[0158] 多能干细胞可以处于幼稚或始发多能状态。

[0159] 多能干细胞可以从衍生自卵裂球状态的全能干细胞获得。

[0160] 制备ES细胞的另一种方法是孤雌生殖。该过程中也不破坏胚胎。

[0161] 目前实行的ES培养方法主要是基于使用饲养细胞层，其分泌干细胞增殖所需的因子，同时抑制其分化。培养通常在固体表面上进行—例如包被有明胶或波形蛋白的表面。示例性的饲养细胞层包括人胚胎成纤维细胞、成人输卵管上皮细胞、原代小鼠胚胎成纤维细胞(PMEF)、小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、鼠胎儿成纤维细胞(MFF)、人胚胎成纤维细胞(HEF)、从人胚胎干细胞的分化获得的人成纤维细胞、人胎儿肌肉细胞(HFM)、人胎儿皮肤细胞(HFS)、人成年皮肤细胞、人包皮成纤维细胞(HFF)、人脐带成纤维细胞、从脐带或胎盘获得的人细胞以及人骨髓基质细胞(hMSC)。可以向培养基中加入生长因子以维持ESC处于未分化状态。这样的生长因子包括bFGF和/或TGFβ。在另一个实施方式中，可以向培养基中加入试剂以维持hESC处于幼稚的未分化状态——参见例如Kalkan等,2014,Phil.Trans.R.Soc.B,369:20130540。

[0162] 人脐带饲养细胞层-可以在补充了人血清(例如，20％)和谷氨酰胺的Dulbecco's Modified Eagle's Medium(例如，DMEM,SH30081.01,Hyclone)中扩增人脐带成纤维细胞。优选地，对人脐带细胞进行照射。可以使用本领域公知的方法进行(例如，γ细胞，220Exel,MDS Nordion 3,500rads)。一旦获得足够的细胞，可以将其冷冻(例如，冻存)。为了扩增ESC，通常将人脐带成纤维细胞接种在任选地使用贴壁基材如明胶(例如，重组人明胶(RHG100-001，纤维蛋白原))包被的固体表面(例如，T75或T175培养瓶)上，其浓度为在补充了约20％人血清(和谷氨酰胺)的DMEM(例如，SH30081.01,Hyclone)中25-40,000个细胞/cm2。通常将hESC在1-4天后在支持性培养基(例如，含人血清白蛋白的 )
中铺板在饲养细胞上面。可以向培养基中加入另外的因子，以防止ESC分化，例如bFGF和TGFβ。一旦获得足够量的hESC，可以将细胞机械破坏(例如，通过使用无菌吸头或一次性无菌干细胞工具；14602Swemed)。或者，可以通过酶处理(例如，胶原酶A或TrypLE Select)或化学处理(例如，EDTA)去除细胞。可以重复该过程几次，以达到必要的hESC量。根据一个特定的实施方式，在第一轮扩增之后，使用TrypLE Select去除hESC，并且在第二轮扩增之后，使用胶原酶A去除hESC。

[0163] 人胚胎成纤维细胞或成人输卵管上皮细胞作为饲养细胞层-可以使用人胚胎成纤维细胞或成人输卵管上皮细胞使人ES细胞生长和维持。当在这些人饲养细胞上生长时，人ES细胞显示出正常的核型，存在碱性磷酸酶活性，表达Oct-4和包括SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和GCTM-2在内的其他胚胎细胞表面标志物，在体内形成畸胎瘤并且保持所有关键的形态特征[Richards M,Fong CY,Chan WK,Wong PC,Bongso A.(2002).Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells.Nat.Biotechnol.20:933-6]。

[0164] 包皮饲养细胞层-如美国专利申请号10/368,045中所公开的可以在人包皮饲养细胞层上培养人ES细胞。衍生自包皮的饲养细胞层由完全无动物的环境构成，适于培养人ES细胞。此外，从获得其开始，包皮细胞可以在培养中保持长达42代，这为ES细胞提供了相对恒定的环境。发现在这些条件下培养的人ES细胞在功能上不同于使用替代方案(例如，MEF)培养的细胞。分化后，ES细胞在体外表达与全部三个胚胎胚层相关的基因，并且在体内形成由全部三个胚层产生的组织构成的畸胎瘤。

[0165] 在ES细胞培养中还使用了无饲养细胞系统，这样的系统利用补充了血清替代物、细胞因子和生长因子(包括IL6和可溶性IL6受体嵌合体)的基质作为饲养细胞层的替代。在存在培养基-例如Lonza L7系统、mTeSR、StemPro、XFKSR、E8、的情况下，干细胞可以在固体表面如细胞外基质(例如，MatrigelTM或层粘连蛋白)上生长。与需要饲养细胞与干细胞同时生长并且可能导致产生混合细胞群的基于饲养细胞的培养不同的是，在无饲养细胞系统上生长的干细胞易于从表面上分离。

[0166] 根据一个特定的实施方式，在分化步骤之前，可以在饲养细胞上扩增ESC。

[0167] 在定向分化的第一阶段之前，可以在条件培养基中培养人多能干细胞。饲养细胞条件培养基分离自(或收集自)用于产生所述饲养细胞条件培养基的饲养细胞。因此，人多能干细胞优选地在与用于产生细胞条件培养基的容器不同的容器中培养。尽管在条件培养基中可以包含微量的饲养细胞，但是优选地，该培养步骤通常在不存在饲养细胞的情况下进行。培养人多能干细胞通常进行至少1天、更优选地至少2天，例如2天、3天、4天、5天、6天或7天。优选地，在条件培养基中的培养进行不超过21天，例如不超过14天。根据一个特定的实施方式，在培养皿或培养瓶(例如，T75培养瓶或T175培养瓶)中进行培养。可以使用非贴壁基材如纤连蛋白、层粘连蛋白、polyD-赖氨酸或明胶包被固体表面。在适宜的时间长度后，可以使用适宜的试剂-例如使用胶原酶A、分散酶、TrypLE select或EDTA从固体表面上去除人多能干细胞集落。

[0168] 条件培养基

[0169] 条件培养基是单层细胞培养物(例如，饲养细胞)存在一定培养时间后的生长培养基。条件培养基包含由在培养中的单层细胞分泌的生长因子和细胞因子。

[0170] 可以从在培养中形成单层的多种人细胞中收集本发明的条件培养基。实例包括人包皮条件培养基、人胚胎成纤维细胞条件培养基、人输卵管上皮细胞条件培养基和人脐带成纤维细胞条件培养基。

[0171] 特别适宜的条件培养基是衍生自人细胞的条件培养基，例如人脐带成纤维细胞条件培养基，其是由在适于生产条件培养基的条件下在生长培养基中培养人脐带成纤维细胞生产的。

[0172] 根据一个特定的实施方式，通过照射将饲养细胞有丝分裂灭活。可以使用其他灭活的方法，例如丝裂霉素处理。

[0173] 这样的生长培养基可以是适于培养饲养细胞的任何培养基。生长培养基可以补充营养因子，例如氨基酸(例如，L-谷氨酰胺)、抗氧化剂(例如，β-巯基乙醇)和生长因子，其有利于干细胞在未分化状态下的生长。如其他地方所述(美国专利申请号10/368,045)，加入有效浓度范围的血清和血清替代物。

[0174] 将饲养细胞在生长培养基中培养足够长的时间，以允许分泌的因子充分累积，以支持干细胞在未分化状态下增殖。通常地，通过在37℃下培养4-48小时使培养基条件化。然而，可以通过评估条件培养基对干细胞生长和分化的影响来确定培养时间。

[0175] 根据一个特定的实施方式，通过将经过照射的人脐带细胞接种在存在人血清的培养基(例如，DMEM)中约5-24小时制备条件培养基。至多约7天的较长的培养时间也可能是有效的。然后，将细胞在不存在人血清的培养基(例如， )中再培养24小时。第二种培养基可以含有人血清白蛋白。此外，第二种培养基可以含有生长因子例如碱性FGF和来自TGFβ超家族的因子以防止分化。根据一个特定的实施方式，制备条件培养基的培养皿未包被明胶。根据另一个实施方式，用于制备条件培养基的培养基不包含成纤维细胞生长因子(FGF)或TGFβ超家族因子。

[0176] 用于条件化培养基的培养设备的选择基于条件培养基的规模和目的。大规模生产最好使用专用设备。根据一个特定的实施方式，在培养瓶中制备条件培养基。在Furey(2000)Genetic Eng.News 20:10中综述了连续细胞培养系统。

[0177] 在培养基中累积足量的因子之后，将生长培养基(即，条件培养基)与饲养细胞分离并收集。将意识到的是，可以重复使用饲养细胞以便在另外的培养时间内条件化更多批次的培养基，只要细胞保持其条件化培养基的能力即可。

[0178] 优选地，在使用前，条件培养基是无菌的(例如，使用20μΜ滤器过滤)。本发明一些实施方式的条件培养基可以直接应用于多能干细胞或进行提取以浓缩有效的因子例如通过盐过滤。优选将条件培养基在-80℃下冻存以供将来使用。

[0179] 将意识到的是，本发明在无饲养细胞条件培养基步骤之前，还包含有助于扩增多能干细胞的其他步骤。

[0180] 因而，根据一个特定的实施方式，在无饲养细胞条件培养基步骤之前，在饲养细胞上扩增ESC。在本文下文中描述了本发明涉及的基于饲养细胞层的示例性培养。扩增通常进行至少2天、3天、4天、5天、6天或7天。扩增进行至少1代或者至少2代、至少3代、至少4代、至少5代、至少6代、至少7代、至少8代、至少9代或至少10代。

[0181] 扩增后，可以使用分化试剂使多能干细胞(例如，ESC)定向分化。

[0182] 在另外的实施方式中，可以在无饲养细胞系统中培养或扩增ESC。无饲养细胞的系统能够提供更有效和可控的培养系统。例如，可以在层粘连蛋白上培养ESC。在另一个实例中，可以在层粘连蛋白521上，在 hPSC XF*无Xeno培养基中培养或扩增ESC以产生细胞聚集体或球形体(SB)。在一些实施方式中，可以使用分化试剂处理SB，如NIC。

[0183] 如所述，可以通过以下步骤产生感光细胞：

[0184] (a)在包含至少0.5mM烟酰胺的培养基中培养人多能干细胞群，其中所述培养物不包含处于浓度下的任何TGFβ超家族成员，其允许分化成所述感光细胞；和

[0185] (b)从视网膜色素上皮(RPE)细胞中分离所述感光细胞，从而产生感光细胞。

[0186] 或者，

[0187] (a)在包含至少0.5mM烟酰胺的培养基中培养人多能干细胞群，以获得分化细胞；和

[0188] (b)在包含选自以下的至少一种试剂的培养基中培养所述分化细胞以产生感光细胞：Wnt抑制剂、bFGF、IGF和GSK3抑制剂；和任选地

[0189] (c)分离所述感光细胞，从而产生所述感光细胞。

[0190] 因而，该方案可以包括在存在烟酰胺的情况下培养多能干细胞，使得形成感光细胞；或者随后是分化的进一步的阶段(不同的)，其涉及加入如本申请上文所述通常在使用烟酰胺的第一个分化步骤中不存在的因子。

[0191] 根据一个特定的实施方式，烟酰胺(NA，NIC)以至少0.5μΜ的浓度提供-例如在0.5-100μΜ、0.05-50μΜ、5-50μΜ、5-20μΜ之间，例如10μΜ。

[0192] 根据一个特定的实施方式，在第一分化步骤和第二分化步骤中以大致相同的浓度提供NA，如果涉及多个分化步骤(例如，至少2个，如上文所述)，其涉及加入因子，例如Wnt抑制剂、bFGF、HSA、IGF和/或GSK3抑制剂。

[0193] 在第二分化步骤中，示例性的实施方式可以包括下述组合：

[0194] (i)烟酰胺和Wnt抑制剂；

[0195] (i)烟酰胺和bFGF；

[0196] (ii)烟酰胺和IGF；

[0197] (iii)烟酰胺、IGF和GSK3抑制剂；或

[0198] (v)烟酰胺、bFGF和Wnt抑制剂；

[0199] (vi)烟酰胺、Wnt抑制剂和HSA；

[0200] (vii)烟酰胺、bFGF和HSA；

[0201] (viii)烟酰胺、bFGF、Wnt抑制剂和HSA；

[0202] (ix)烟酰胺和HSA。

[0203] 如在本文中所使用的，“Wnt抑制剂”指能够抑制由Wnt介导的信号转导的分子。Wnt信号抑制剂包括但不限于例如IWR-l-endo(4-[(3aR,4S,7R,7aS)-l,3,3a,4,7,7a-六氢-l,3-二氧代-4,7-甲桥-2H-异吲哚-2-基]-N-8-喹啉基-苯甲酰胺)、IWP-2、XAV939、Dkk1、Cerberus蛋白、Wnt受体抑制剂、可溶性Wnt受体、Wnt抗体、酪蛋白激酶抑制剂和显性阴性Wnt蛋白；特别优选IWR-l-endo。

[0204] 根据一个特定的实施方式，Wnt抑制剂以约0.1μΜ-20μΜ之间的浓度提供。示例性的范围包括但不限于0.1μΜ-15μΜ、0.1μΜ-10μΜ、0.5μΜ-20μΜ、1μΜ-20μΜ、1μΜ-10μΜ、1μΜ-5μΜ。

[0205] 如在本文中所使用的，“IGF1”或“胰岛素样生长因子1(IGF-1)”也称为生长抑素C，指在人中由IGF1基因编码的蛋白。也将IGF-1称为“硫化因子”。IGF1可以从多个供应商获得，如R&D Systems Inc.，目录编号291-G1。

[0206] 如在本文中所使用的，“GSK3抑制剂”指GSK3b抑制剂，即如GenBank登录号NP_002084.2(SEQ ID NO:121)和/或NP_001139628.1(SEQ ID NO:122)所示的糖原合酶激酶3β蛋白，其通过其激酶活性具有WNT信号传导调控活性。

[0207] 如在本文中所使用的，术语“GSK3b抑制剂”指能够抑制GSK3b活性的分子，其通过特异性抑制磷酸化的GSK3b(在细胞中存在的总GSK3b中的)水平来确定。

[0208] GSK3b抑制剂的非限制性实例包括CHIR99021(CHIR,PeproTech Inc.,Rocky Hill,NJ))、BIO(AXONMEDCHEM-Axon 1693)和Kenpaullone(TOCRIS–目录号1398)。

[0209] 根据一些实施方式，CHIR99021以约0.1μΜ-50μΜ、0.1μΜ-20μΜ-μΜ之间的浓度提供，例如，从约0.2μΜ至约20μΜ，例如在约0.5-20μΜ之间，例如在约1-10μΜ之间。

[0210] 短语“碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)”或“FGF2”可以在本申请中互换使用，指成纤维细胞生长因子(FGF)家族的多肽，其与肝素结合并且具有广泛的促有丝分裂和血管生成活性。BFGF基因的mRNA包含多个聚腺苷酸化位点，并且可以替代地从非AUG(CUG)和AUG起始密码子进行翻译，从而产生具有不同性质的五个不同亚型(isoform)。CUG-起始的亚型位于细胞核中，并且负责内分泌作用，而AUG-起始的形式主要在胞质中并且负责这种FGF的旁分泌和自分泌作用。根据本发明的一些实施方式，GenBank登录号NP_001997中提供了在本发明一些实施方式的培养基中使用的bFGF。bFGF能够从多个生产厂商获得，例如Peprotech,RnD systems(目录号：100-18B)。

[0211] 根据一些实施方式，bFGF以约1纳克/毫升(ng/ml)至约50ng/ml的浓度范围提供，例如约1-40ng/ml、例如约1-50ng/ml、例如约1-40ng/ml、例如约1-30ng/ml、例如约1-20ng/ml、例如约2-20ng/ml、例如约2-10ng/ml、例如约3-10ng/ml、例如约4-10ng/ml、例如约8ng/ml。

[0212] 根据一个特定的实施方式，本申请所述的分化条件不包含处于浓度下的TGFβ超家族成员(例如，激活素A)，其允许分化细胞分化(例如，在仅使用浓度至少0.5mM的NA的第一个分化步骤之后)成感光细胞。

[0213] 根据一个特定的实施方式，因子是人因子。

[0214] 任何这些因子可以是天然存在的(纯化的)、重组的或化学合成的。

[0215] NA，也称为“烟酰胺”，是维生素B3(烟酸)的酰胺衍生物形式，认为其可以保持和改善β细胞的功能。NA的化学式为C6H6N2O。NA对于生长和食物向能量的转化至关重要，并且已将其用于治疗关节炎以及治疗和预防糖尿病。

[0216]

[0217] 烟酰胺(NA)

[0218] 根据一个特定的实施方式，烟酰胺是烟酰胺衍生物或烟酰胺模拟物。如在本文中所使用的，术语“烟酰胺(NA)衍生物”指其是天然NA的化学修饰衍生物的化合物。在一个实施方式中，化学修饰可以是基本NA结构的吡啶环(经由环的碳或氮原子)经由酰胺部分的氮或氧原子的取代。当被取代时，一个或多个氢原子可以被取代基取代和/或取代基可以与N原子连接以形成四价带正电荷的氮。因而，本发明的烟酰胺包括取代的或非取代的烟酰胺。在另一个实施方式中，化学修饰可以是缺失或取代单个基团，例如以形成NA的硫代苯甲酰胺类似物，所有这些都是有机化学领域的技术人员能够预期的。在本发明背景下的衍生物还包括NA的核苷衍生物(例如，烟酰胺腺嘌呤)。已描述了多种NA衍生物，其中的一些还与PDE4酶的抑制活性相关(WO03/068233；WO02/060875；GB2327675A)，或者作为VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂(WO01/55114)。例如，在WO05/014549中公开了4-芳基-烟酰胺衍生物的制备方法。在WO01/55114和EP2128244中公开了其他示例性的烟酰胺衍生物。

[0219] 烟酰胺模拟物包括烟酰胺的修饰形式和烟酰胺的化学类似物，其概括了烟酰胺在RPE细胞从多能细胞分化和成熟中的作用。示例性的烟酰胺模拟物包括苯甲酸、3-氨基苯甲酸和6-氨基烟酰胺。可以作为烟酰胺模拟物的另一类化合物是聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂。示例性的PARP抑制剂包括3-氨基苯甲酰胺、Iniparib(BSI201)、Olaparib(AZD-2281)、Rucaparib(AG014699，PF-01367338)、Veliparib(ABT-888)、CEP 9722、MK 4827和BMN-673。

[0220] 当该方法仅涉及NA而不涉及加入其他因子(例如，TGFβ超家族成员)时，例如在单一分化阶段中使用，使用NA的培养进行至少7天，例如至多30天。

[0221] 在顺序分化过程中，即在至少两个分化培养阶段中，按照如下所述进行分化：

[0222] a)在含有烟酰胺(至少0.5mM)的培养基中培养ESC。该步骤可以进行最少1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、10天、2周、3周、4周、5周或甚至6周。根据一个特定的实施方式，仅使用NA(未加入所示因子)的培养进行3-6天。

[0223] b)在含有选自Wnt抑制剂、bFGF、IGF1和GSK3抑制剂的至少一种试剂(即，因子)和任选地与第一分化试剂(例如，烟酰胺)一起的培养基中培养从步骤a)获得的细胞。该步骤可以进行最少1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、10天、2周、17天、3周、30天、4周、5周或甚至6周。

[0224] 优选地，在不存在所示因子(即，Wnt抑制剂、bFGF、IGF1和GSK3抑制剂)的情况下进行步骤(a)。在一个实施方式中，在整个分化过程中的培养基不含处于浓度下的TGFβ超家族成员(例如，激活素A)，促进感光细胞的分化。在另一个实施方式中，在培养基中TGFβ超家族成员的水平低于20ng/ml、10ng/ml、1ng/ml或者甚至低于0.1ng/ml。

[0225] 将意识到的是，可以以顺序方式加入因子，例如NA(第0天-第30天)，随后为NA+bFGF(第3天-第60天)，随后为NA+bFGF+GSK3抑制剂(例如，CHIR)(第10天-第60天)或者NA+GSK3抑制剂(第10天-第60天)或者bFGF+GSK3抑制剂(第10天-第60天)。

[0226] 根据一些实施方式，培养或分化可以包括使用人血清白蛋白(HSA)。在一些实施方式中，HSA以约0.5％至约1％之间的浓度提供。在一些实施方式中，HSA以约0.01％至约10％之间的浓度提供。在其他实施方式中，HSA以约例如0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、
1.9％、2.0％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5.0％的浓度提供。

[0227] 根据一个特定的实施方式，步骤(a)的培养(即NA，但不含其他因子)在贴壁条件下进行，和步骤(b)的培养(即，NA+因子)在贴壁条件下进行。

[0228] 根据一个特定的实施方式，步骤(a)的培养(即NA，但不含其他因子)在非贴壁条件下进行，和步骤(b)的培养(即，NA+因子)在非贴壁条件下进行。

[0229] 根据一个特定的实施方式，步骤(a)的培养(即NA，但不含其他因子)在非贴壁条件下进行，和步骤(b)的培养(即，NA+因子)在贴壁条件下进行。

[0230] 根据一个特定的实施方式，步骤(a)的培养(即NA，但不含其他因子)在贴壁条件下进行，和步骤(b)的培养(即，NA+因子)在非贴壁条件下进行。

[0231] 在下述实施例章节中进一步详细描述了上述方案中的实施方式和另外的实施方式。

[0232] 当将多能干细胞铺板在非贴壁基材(例如，细胞培养板)上时，可以将细胞培养物称为细胞悬液或球形体(SB)，优选在悬浮培养中的游离漂浮簇，即来自人胚胎干细胞(hESC)的细胞聚集体。细胞簇不粘附于任何基材(例如，培养板，载体)。此前在WO 06/070370中描述了游离漂浮干细胞的来源，其全部内容通过引用并入本文。该阶段可以进行最少1天，更优选2天、3天、1周或甚至14天。根据一个特定的实施方式，该阶段进行3-6天(见图2)。根据一个实施方式，当在非贴壁基材(例如，细胞培养板)上培养细胞时，大气中氧的条件为20％。然而，还可以考虑对大气中氧的条件进行控制，以使得大气中的氧气百分比小于约20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％或者甚至小于约5％(例如，在1％-20％、1％-10％或0-5％之间)。

[0233] 根据一个特定的实施方式，首先在正常大气氧条件下，然后在低于正常的大气氧条件下在非贴壁基材上培养细胞。

[0234] 非贴壁细胞培养板的实例包括由Nunc生产的那些(例如，Hydrocell；目录号174912)。

[0235] 通常地，簇包含至少50-500,000、50-100,000、50-50,000、50-10,000、50-5000、50-1000个细胞。根据一个实施方式，在簇中的细胞没有被组织成层并且形成不规则形状。
在一个实施方式中，簇中不含多能胚胎干细胞。在另一个实施方式中，簇中包含少量的多能胚胎干细胞(例如，不超过5％，或不超过3％(例如，0.01-2.7％)的细胞，其在蛋白水平共表达OCT4和TRA 1-60)。通常地，簇中包含在烟酰胺影响下已部分分化的细胞。这样的细胞主要表达神经和视网膜前体标志物，如PAX6、Six6、Rx、Six3和/或CHX10。

[0236] 可以使用本领域公知的酶促或非酶促方法(例如，机械，化学)将簇解离。根据一个实施方式，将细胞解离，以使得其不再成簇-例如2-100,000个细胞、2-50,000个细胞、2-10,000个细胞、2-5,000个细胞、2-1,000个细胞、2-500个细胞、2-100个细胞、2-50个细胞的聚集体或团块。根据一个特定的实施方式，细胞处于单细胞悬液中。

[0237] ESC在其中分化的基础培养基是本领域公知的支持细胞在体外生长的任何已知的细胞培养基，通常地，培养基包含确定的基本溶液，其包含盐、糖、氨基酸和维持培养物中的细胞成活状态所需的任何其他营养物质。根据一个特定的实施方式，基础培养基是非条件培养基。根据本公开可用的市售基础培养基的非限制性实例包括 (用于ESC分化时不含TGFβ，用于ESC扩增时含有bFGF和TGFβ)、NeurobasalTM、KO-DMEM、DMEM、DMEM/F12、CellgroTM干细胞生长培养基或X-VivoTM。可以向基础培养基中补充本领域公知用于细胞培养的各种试剂。以下是对根据本公开所使用的培养系统中可能包括的各种补充剂的非限制性参考：

[0238] -含有血清或血清替代物的培养基，例如但不限于敲除血清替代物(KOSR)、Nutridoma-CS、TCHTM、N2、N2衍生物、或B27或者组合；

[0239] -细胞外基质(ECM)组分，例如但不限于纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白和明胶。然后，可以将ECM用于携带如本文所述的因子(即，bFGF、IGF1、Wnt抑制剂、GSK3抑制剂)；

[0240] -抗菌剂，例如但不限于青霉素和链霉素；

[0241] -非必需氨基酸(NEAA)、神经营养蛋白，已知其在促进培养中SC的存活中起作用，例如但不限于BDNF、NT3、NT4。

[0242] 根据一个优选的实施方式，用于ESC分化的培养基是培养基(例如，Biological Industries，06-5102-01-1A)。

[0243] 根据一个特定的实施方式，ESC的分化和扩增是在无异源物种成分条件下进行。

[0244] 根据一个实施方式，增殖/生长培养基不含异源物种污染物，即不含动物来源的组分，例如血清、动物衍生的生长因子和白蛋白。因而，根据该实施方式，培养在不含异源物种污染物的条件下进行。

[0245] 在美国专利申请公开号20130196369中提供了在不含异源物种成分的情况下培养ESC的其他方法，其全部内容通过引用并入本文。

[0246] 可以根据药品生产质量管理规范(GMP)(例如，制剂符合GMP)和/或现行的药品组织质量管理规范(GTP)(制剂可以符合GTP)制备含有感光细胞的制剂。

[0247] 在分化步骤期间，可以监测胚胎干细胞的分化状态。可以在检查已知指示分化的细胞的细胞或组织特异性标志物之后确定细胞的分化状态。可以使用本领域熟知的免疫学技术检测组织/细胞特异性标志物[Thomson JA等,(1998).Science 282:1145-7]。实例包括但不限于用于膜结合或胞内标志物的流式细胞术，用于胞外和胞内标志物的免疫组化和用于分泌的分子标志物的酶促免疫测定。

[0248] 一旦细胞分化成感光细胞，可以将其扩增。

[0249] 本发明人发现了在本文所述的分化过程之后从培养系统中去除的细胞表达感光细胞标志物。可以将这样的细胞用于治疗视网膜病症。

[0250] 任选地，可以培养感光细胞，以获得更大量的感光细胞(即，扩增)。在扩增阶段中应注意，其中的条件不应促进RPE细胞扩增，而非感光细胞扩增。在一个实施方式中，培养富集了感光细胞。因而，例如，在一个实施方式中，不超过约5％、10％、15％、20％扩增的细胞是RPE细胞。根据另一个实施方式，约5-90％之间的扩增的细胞是RPE细胞。根据另一个实施方式，约5-80％之间的扩增的细胞是RPE细胞。根据另一个实施方式，约5-70％之间的扩增的细胞是RPE细胞。根据另一个实施方式，约5-60％之间的扩增的细胞是RPE细胞。根据另一个实施方式，约5-50％之间的扩增的细胞是RPE细胞。根据另一个实施方式，10-50％之间的扩增的细胞是RPE细胞。根据另一个实施方式，20-50％之间的扩增的细胞是RPE细胞。根据另一个实施方式，30-50％之间的扩增的细胞是RPE细胞。根据另一个实施方式，10-40％之间的扩增的细胞是RPE细胞。根据另一个实施方式，10-30％之间的扩增的细胞是RPE细胞。根据另一个实施方式，10-20％之间的扩增的细胞是RPE细胞。

[0251] 可以在细胞外基质(例如明胶、胶原蛋白I、胶原蛋白IV、层粘连蛋白(例如，层粘连蛋白521)、纤连蛋白或聚-D-赖氨酸)上进行含有感光细胞的富集的细胞群的扩增。

[0252] 在一个实施方式中，在存在烟酰胺(例如，约0.5-100mM之间)的情况下进行扩增。

[0253] 可以在悬液(含有或不含微载体)中或在单层中扩增富集的感光细胞群。可以对在单层培养物或在悬液培养物中对富集的感光细胞群的扩增进行改良以便在生物反应器或multi/hyper stack培养室中采用本领域技术人员熟知的方法进行大规模扩增。

[0254] 根据一个实施方式，扩增阶段进行至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周或者甚至10周。优选地，扩增阶段进行1周-10周，更优选地进行2周-10周，更优选地进行3周-10周，更优选地进行4周-10周，或者4周-8周。

[0255] 根据又一个实施方式，将富集的感光细胞群在扩增阶段中传代至少1次，在扩增阶段中传代至少2次，在扩增阶段中传代至少3次，在扩增阶段中传代至少4次或在扩增阶段中传代至少5次或在扩增阶段中传代至少6次。

[0256] 可以根据多个不同的参数对根据本申请所述的方法产生的感光细胞群进行表征。

[0257] 因而，例如，获得的感光细胞可以具有细长的细胞体和胞质顶点。

[0258] 可以使用本领域公知的方法(例如，使用酶如胰酶，EDTA)收集扩增的感光细胞群。

[0259] 收集后，可以任选地使用本领域公知的方法冻存感光细胞群。适于冻存的培养基的实例包括但不限于90％人血清/10％DMSO，CryoStor 10％、5％和2％，Stem Cell banker和Prime FreezIS。

[0260] 将意识到的是，本文公开的细胞群不含未分化的人胚胎干细胞。根据一个实施方式，例如通过FACS所测量的，少于1:250,000的细胞是Oct4+TRA-1-60+细胞。如通过PCR所测量的，细胞还具有下调的(超过5,000倍)GDF3或TDGF的表达。

[0261] 本公开的这方面的感光细胞不表达胚胎干细胞标志物。所述一种或多种胚胎干细胞标志物可以是OCT-4、NANOG、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和/或TRA-1-81。

[0262] 相对于非感光细胞而言，感光细胞制剂可以基本上被富集，其含有至少约50％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的感光细胞。感光细胞制剂可以基本上不含RPE细胞或由感光细胞组成。例如，基本上富集的感光细胞制剂可以含有少于约50％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、
2％或1％的非感光细胞类型，例如RPE细胞。例如，感光细胞制剂可以含有少于约50％、
25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、
0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、
0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、
0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、
0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％的非感光细胞，例如RPE细胞。

[0263] 本文所述的制剂可以基本上不含细菌、病毒或真菌污染或感染，包括但不限于存在HIV I、HIV 2、HBV、HCV、HAV、CMV、HTLV 1、HTLV 2、细小病毒B19、爱泼斯坦-巴尔病毒、或疱疹病毒1和2、SV40、HHV5，6，7，8、CMV、多瘤病毒、HPV、肠病毒。本申请所述的制剂可以基本上不含支原体污染或感染。

[0264] 表征本文公开的细胞群的另一种方法是通过标志物表达。因而，例如，如通过免疫染色测量的，至少30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的细胞表达RAX。根据一个实施方式，约70-100％之间的细胞表达RAX。优选地，如通过RT-PCR测量的，细胞表达RAX的水平比在RPE细胞中或未分化的ESC中表达水平高至少2倍、高5倍或者甚至高10倍。

[0265] 根据另一个实施方式，如通过免疫染色测量的，至少30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％或100％的细胞表达CHX10。例如，约70-100％之间的细胞表达CHX10。优选地，如通过RT-PCR测量的，细胞表达CHX10的水平比在RPE细胞中或未分化的ESC中表达水平高至少2倍、高5倍或者甚至高10倍。

[0266] 根据另一个实施方式，如通过免疫染色测量的，至少30％、50％、70％、80％、85％、87％、89％、90％、95％、97％或100％的细胞表达视紫红质。优选地，如通过RT-PCR测量的，细胞表达视紫红质的水平比在RPE细胞中或未分化的ESC中表达水平高至少2倍、高5倍或者甚至高10倍。

[0267] 根据另一个实施方式，如通过免疫染色测量的，至少30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％或100％的细胞表达神经视网膜特异性亮氨酸拉链蛋白(NRL)。例如，通过免疫染色测量的约70-100％之间的细胞表达NRL。优选地，如通过RT-PCR测量的，细胞表达NRL的水平比在RPE细胞中或未分化的ESC中表达水平高至少2倍、高5倍或者甚至高10倍。

[0268] 优选地，本发明这方面的细胞不表达RPE细胞标志物。因此，在分化阶段(和任选地扩增)之后，可以从培养物中分离感光细胞。根据一个特定的实施方式，分离感光细胞制剂，使得在分离的制剂中不含RPE细胞，或者含有少于40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％的RPE细胞。因而，例如，优选地，细胞不表达(或者少于约40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的细胞表达)MITF、RPE65、bestrophin 1、前黑素体蛋白(PMEL17)或CRALBP。优选地，如通过RT-PCR测量的，细胞表达RPE标志物的水平比在RPE细胞中的表达水平低至少2倍、低5倍或者甚至低10倍。

[0269] 本领域技术人员将很好地意识到的是，感光细胞的衍生是非常有益的。可以将其作为研发促进其存活、再生和功能的新药的体外模型。可以将感光细胞用于对感光细胞有毒性或再生作用的化合物的高通量筛选。可以将其用于发现对感光细胞的发育、分化、维持、存活和功能具有重要作用的机制、新基因、可溶性或膜结合的因子。

[0270] 还可以将感光细胞作为用于在视网膜变性中功能障碍或退化的感光细胞的移植、补充和支持的感光细胞的无限来源。而且，可以将基因修饰的感光细胞作为载体，在移植后的眼和视网膜中携带和表达基因。

[0271] 可以将感光细胞作为治疗剂的眼部病况包括但不限于通常与视网膜功能障碍、视网膜损伤和/或感光细胞功能丧失相关的视网膜疾病或病症。可以治疗的病况的非限制性列表包括视网膜色素变性，勒伯尔先天性黑蒙，遗传性或获得性黄斑变性，年龄相关性黄斑变性(AMD)，干性AMD，贝斯特氏症，视网膜脱落，回旋状萎缩，无脉络膜，图形样营养不良以及其他RPE营养不良，斯特格氏病，由光、激光、炎症、感染、辐射、新生血管或外伤的任一种引起的损伤导致的RPE或视网膜损伤。

[0272] 本发明人还考虑将感光细胞用于治疗其他疾病，如神经退行性疾病，包括但不限于帕金森氏病、ALS、多发性硬化症、亨廷顿氏病、自身免疫性脑脊髓炎、糖尿病性神经病变、阿尔茨海默氏病和癫痫。

[0273] 可以治疗的受试者包括灵长类(包括人)、犬科、猫科、有蹄类动物(例如，马、牛、猪(例如，猪))、禽类和其他受试者。人和具有重要商业价值的非人动物(例如，家畜和家养动物)是特别关注的。可以治疗的示例性动物包括犬科动物；猫科动物；马；牛；绵羊；啮齿动物等和灵长类动物，特别是人。非人动物模型(特别是哺乳动物，例如灵长类、鼠类、兔形目等)可以用于实验研究。

[0274] 可以将如本文所述产生的感光细胞移植入受试者眼内的各种靶位点。根据一个实施方式，感光细胞的移植到达眼的视网膜下腔。此外，由于细胞的迁移能力和/或积极的旁分泌作用，可以将向其他眼部隔室中的移植视为包括玻璃体腔、视网膜的内部或外部、视网膜周围和脉络膜内。

[0275] 可以向受试者施用的感光细胞的数量通常在每剂至少约5,000至约5×l06个活细胞之间。在一些实施方式中，感光细胞组合物包含至少100,000个活细胞。在一些实施方式中，感光细胞组合物包含至少150,000个活细胞。在一些实施方式中，感光细胞组合物包含至少200,000个活细胞。在一些实施方式中，感光细胞组合物包含至少250,000个活细胞。在一些实施方式中，感光细胞组合物包含至少300,000个活细胞。在一些实施方式中，感光细胞组合物包含至少350,000个活细胞。在一些实施方式中，感光细胞组合物包含至少400,000个活细胞。在一些实施方式中，感光细胞组合物包含至少450,000个活细胞。在一些实施方式中，感光细胞组合物包含至少500,000个活细胞。在一些实施方式中，感光细胞组合物包含至少600,000、至少700,000、至少800,000、至少900,000、至少1,000,000、至少2,000,
000、至少3,000,000、至少4,000,000、至少5,000,000、至少6,000,000、至少7,000,000、至少8,000,000、至少9,000,000、至少10,000,000、至少11,000,000或者至少12,000,000个活细胞。

[0276] 可以将细胞在载体(例如，等渗溶液和/或盐水)(例如BSS PLUSTM)中制剂。所涉及的其他溶液包括冻存液，如Cryostor 5或Cryostor 2。载体可以任选地包含支持感光细胞和RPE植入、整合、存活和效力的另外的因子。

[0277] 可以使用本领域公知的各种技术进行移植。以下描述了进行视网膜细胞移植的方法，例如，美国专利号5,962,027、6,045,791和5,941,250以及Eye Graefes Arch Clin Exp Opthalmol March 1997；235(3):149-58；Biochem Biophys Res Commun Feb.24,2000；268(3):842-6；Opthalmic Surg February 1991；22(2):102-8。以下描述了进行角膜移植的方法，例如，美国专利号5,755,785以及Eye 1995；9(Pt 6Su):6-12；Curr Opin Opthalmol August 1992；3(4):473-81；Ophthalmic Surg Lasers April 1998；29(4):305-8；Ophthalmology April 2000；107(4):719-24；和Jpn J Ophthalmol November-December
1999；43(6):502-8。如果主要利用旁分泌作用，则也可以将细胞包封在半透性容器内在眼中递送和维持，这还将减少细胞对宿主免疫系统的暴露。

[0278] 施用步骤可以包括向有需要的眼中眼内施用感光细胞。眼内施用可以包括将感光细胞注射至视网膜下腔。

[0279] 根据一个实施方式，通过平面玻璃体切除术后利用小的视网膜开口将细胞递送至视网膜下腔或通过直接注射进行移植。

[0280] 可以以各种形式移植感光细胞。例如，感光细胞可以以单细胞悬液，使用基质或粘附于基质或膜、细胞外基质或基材(如可生物降解的聚合物)上或其组合形式引入靶位点。感光细胞还可以与其他视网膜细胞(如RPE细胞)一起移植(共移植)。

[0281] 可以通过不同的视力和眼功能以及结构指标评估治疗作用，除了其他以外，包括最佳矫正视敏度(BCVA)，在黑暗和光适应状态下通过视野仪或微视野仪测量的视网膜对光的敏感性，全视野、多焦点、聚焦或模式视网膜电图(ERG)，对比敏感度，阅读速度，色觉，临床生物显微镜检查，眼底照相，光学相干断层扫描(OCT)，眼底自发荧光(FAF)，红外和彩色成像，荧光素或ICG血管造影，自适应光学仪器以及用于评价视力功能和眼结构的其他方法。

[0282] 可以在施用感光细胞之前或同时向受试者施用糖皮质激素，如泼尼松龙或甲泼尼龙、百力特(Predforte)。

[0283] 根据另一个实施方式，在施用感光细胞之前或同时不向受试者施用糖皮质激素，例如泼尼松龙或甲泼尼龙、百力特。

[0284] 可以在治疗之前、同时和/或之后向受试者施用免疫抑制药物。

[0285] 免疫抑制药物可以属于下述类别：

[0286] 糖皮质激素、细胞抑制剂(例如，烷化剂或糠代谢药)、抗体(多克隆或单克隆)、作用于免疫亲和素的药物(例如，环孢菌素、他克莫司或西罗莫司)。其他药物包括干扰素、阿片类药物、TNF结合蛋白、霉酚酸酯和小型生物制剂。

[0287] 免疫抑制药物的实例包括：间充质干细胞、抗淋巴细胞球蛋白(ALG)多克隆抗体、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)多克隆抗体、硫唑嘌呤、 (抗-IL-2Ra受体抗体)、环孢菌素(环孢菌素A)、 (抗-IL-2Ra受体抗体)、依维莫司、霉酚
酸、 (抗-CD20抗体)、西罗莫司、他克莫司、他克莫司和或霉酚酸酯。

[0288] 可以在治疗之前、同时和/或之后向受试者施用抗生素。抗生素的实例包括Oflox、庆大霉素、氯霉素、Tobrex、Vigamox或已批准供眼用的任何其他局部抗生素制剂。

[0289] 在某些实施方式中，配制用于向受试者施用的感光细胞可以包含一种或多种免疫抑制化合物或抗生素，将其制剂以缓慢释放一种或多种免疫抑制化合物或抗生素。

[0290] 或者，可以在不使用免疫抑制药物的情况下施用感光细胞组合物。

[0291] 如在本文中所使用的，术语“方法”指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业人员公知的或者由已知的方式、手段、技术和程序易于开发的那些方式、手段、技术和程序。

[0292] 如在本文中所使用的，术语“治疗”包括消除、基本上抑制、延缓或逆转病况的进展，基本上改善病况的临床或美学症状或者基本上防止病况的临床或美学症状的出现。

[0293] 应当意识到的是，为清楚起见在单个实施方式的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方式以组合提供。相反地，为简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的本发明的各种特征，也可以单独地或以任何适宜的子组合形式或在本发明任何其他所述的实施方式中适宜地提供。在各种实施方式的上下文中描述的某些特征不应被认为是那些实施方式的必要特征，除非该实施方式没有那些要素就不能允许。

[0294] 上文描述的和在以下权利要求书中要求保护的本发明的各种实施方式和方面在下述实施例中得到了实验的支持。

[0295] 实施例

[0296] 现在参考以下实施例，其与上述说明书一起以非限制性的方式示出了一些实施方式。

[0297] 在通常情况下，本申请所使用的命名法和在本发明中利用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。在文献中对这样的技术做出了详细的解释。参见例如，"Molecular Cloning:A laboratory Manual"Sambrook等,(1989)；"Current Protocols in Molecular Biology"Volumes I-III Ausubel,R.M.,ed.(1994)；Ausubel等,"Current Protocols in Molecular Biology",John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"A Practical Guide to Molecular Cloning",John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson等,"Recombinant DNA",Scientific American Books,New York；Birren等,(eds)"Genome Analysis:A Laboratory Manual Series",Vols.1-4,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1998)；如在美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中给出的方法学；"Cell Biology:A Laboratory Handbook",Volumes I-III Cellis,J.E.,ed.(1994)；"Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique"by Freshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994),Third Edition；"Current Protocols in Immunology"Volumes I-III Coligan J.E.,ed.(1994)；Stites等,(eds),"Basic and Clinical Immunology"(8th Edition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell and Shiigi(eds),"Selected Methods in Cellular Immunology",W.H.Freeman and Co.,New York(1980)；专利和科学文献中广泛描述了可用的免疫测定，参见例如，美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,
517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,
879,219；5,011,771和5,281,521；"Oligonucleotide Synthesis"Gait,M.J.,ed.(1984)；"Nucleic Acid Hybridization"Hames,B.D.,and Higgins S.J.,eds.(1985)；"
Transcription and Translation"Hames,B.D.,and Higgins S.J.,eds.(1984)；"Animal Cell Culture"Freshney,R.I.,ed.(1986)；"Immobilized Cells and Enzymes"IRL Press,(1986)；"A Practical Guide to Molecular Cloning"Perbal,B.,(1984)和"Methods in Enzymology"Vol.1-317,Academic Press；"PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications",Academic Press,San Diego,CA(1990)；Marshak等,"Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual"CSHL Press(1996)；其均通过引用并入本文，就如同在本文中完全示出一样。在本文件通篇提供了其他一般性的参考文献。据信其中的程序是本领域技术人员熟知的，并且是为了方便读者才提供的。其中包含的所有信息均通过引用并入本文。

[0298] 实施例1

[0299] 感光细胞的产生

[0300] 在制备条件培养基时，将经照射(irradiated)的脐带细胞(2.3×106w/o明胶)接种在DMEM+20％人血清培养基的T75培养瓶中。5-24hr后，用 (用于人多能干细胞的 hPSC XF*无Xeno培养基，Biological Industries)替代培养基
用于条件化。条件化16至72小时后，收集培养基并替换成新鲜培养基。根据该方法，每周可以进行3至4次培养基连续条件化。

[0301] 通过使用胶原酶从四中心孔板收集细胞来扩增hESC并将其铺板在预先接种了脐带饲养细胞(feeder)(每个T25和T75培养瓶分别为0.66和2.3×106个饲养细胞)的T75或T25培养瓶中。在中培养一周后，使用TRYPLETM Select(在一些情况下，用PBS 1:1稀释)收集hESC并分瓶，每个预先接种了饲养细胞(每个培养瓶5×106个细胞)的T175培养瓶接种2×106个hESC。该方法的示意图如图1中所示。

[0302] 为转移至在条件培养基中进行无饲养细胞培养，在T175培养瓶中培养一周后，使用胶原酶A收集hESC，并将其四分之一接种在无饲养细胞T175培养瓶中并在条件培养基中培养。7天后，hESC集落充满培养瓶并使用胶原酶A收集。

[0303] 或者，使用TRYPLETM Select细胞解离试剂收集在脐带饲养细胞上生长的hESC并接种在预先包被了层粘连蛋白521(BioLamina)的T75培养瓶中。hESC的接种密度为每个培养6 TM
瓶2-4×10之间。5至6天后，使用胶原酶A收集hESC并在非贴壁条件下(HYDROCELL 培养皿或Nunclon Sphera培养皿；Thermo Scientific)铺板以形成球形体(SB)。

[0304] 如上文所述，在非贴壁条件下(第0天)，由脐带饲养细胞条件培养基培养系统，或由无饲养细胞层粘连蛋白521培养系统产生SB。在下述培养基中培养SB：添加了50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素(Gibco-BRL,Carlsbad,CA)的NUTRISTEM minus培养基(Biological industries,Beit Haemek,Israel)。在SB培养最初的0至6天中(在非贴壁条件下)，培养基中补充了10mM烟酰胺(Sigma,St.Louis,MO)。进一步补充了下述因子的不同组合的添加：10mM烟酰胺(Sigma,St.Louis,MO)，3μΜendo-IWR 1(IWRle；TOCRIS,生物技术品牌,Mineapolis,MN)，20ng/ml bFGF(PeproTech Inc.,Rocky Hill,NJ)，5ng/ml IGF1(R&D Systems Inc.,Minneapolis,MN)和3μΜ CHIR99021(CHIR；PeproTech Inc.,Rocky Hill,NJ)。还评估了下述补充剂的各种组合：0.5-1％HSA(白蛋白25％,Octapharma,Elersvagen,Sweden)，1％Matrigel(减少的生长因子；BD Biosciences)，1-10μg/ml层粘连蛋白511和/或521(BioLamina,Sundbyberg,Sweden)，3-10μg/ml人胶原蛋白(Sigma St.Louis MO)，持续2至8周。

[0305] 实施例2

[0306] 在hESC衍生的感光细胞祖细胞的SB中眼区标志物、视网膜祖细胞标志物和感光祖细胞标志物的表达

[0307] 使用实时PCR以确定眼区和视网膜祖细胞标志物以及感光细胞祖细胞标志物的的表达。使用Quick RNA Micro Prep,Zymo Research(Cat#R1051)提取mRNA并使用QSCRIPTTM逆转录酶(Quanta Bioscience Inc.,Gaithersburg,MD)完成RT反应。使用市售的TaqMan Assay-on-Demand Gene Expression Products(Applies Biosys terns,Foster City,CA)监测转录水平。于14天至8周时间点分析眼区和感光细胞前体标志物的表达。在零时间点(T0)时，开始将SB的衍生和它们在非贴壁培养皿中的培养。

[0308] Assays-on-Demand(Applied Biosystems,Foster City,CA)：在分析中使用Pax6，测定ID Hs00240871_ml；Six3，测定ID Hs00193667_ml；Rxl，测定ID Hs00429459_ml；Chx10，测定ID Hs01584047_ml；Crx，测定ID Hs00230899_ml；Nrl，测定ID Hs00172997_ml；Rho，测定ID Hs00892431_ml；Six6，测定ID Hs00201310_ml；GusB，测定ID Hs00939627_ml的引物。

[0309] 使用NIC、bFGF、CHIR和IGF1的组合处理SB 1个月。或者，在存在NIC、bFGF和CHIR组合的情况下培养SB 17天，如图2中所示。在这些培养期结束时，通过实时PCR分析眼区和视网膜祖细胞标志物(Rx、Six3、Six6、Chx10)以及感光细胞祖细胞标志物(NRL、CRX)的表达。如图3至图14所示，用NIC与bFGF或IGF1的组合的处理，诱导分化成表达眼区标志物以及感光细胞祖细胞标志物的细胞。图3至图8显示了说明将SB在NIC+bFGF或NIC+IGF或NIC+bFGF+CHIR中培养4周后，Six3、Six6、Chx10、Rx、CRX和NRL的标志物分别的表达的图。将基因表达的相对量对不同条件作图。图9至图14显示了说明将SB在NIC+bFGF或NIC+bFGF+CHIR中培养
17天后，Six3、Six6、Chx10、Rx、CRX和NRL的标志物分别的表达的图。对照HADC102由未分化HAD-C102细胞组成在用于人多能干细胞的 hPSC XF*无Xeno培养基
(Biological Industries)中培养6-7天。

[0310] NIC+bFGF+CHIR的组合诱导感光细胞祖细胞标志物的表达。在分化17天和1个月后，当将SB在存在NIC+bFGF的情况下培养，在该测定中，眼区和视网膜祖细胞标志物Rx、Six3、Six6和Chx10的表达最高。当将SB在存在NIC+bFGF的情况下培养1个月后，在该测定中感光细胞祖细胞标志物NRL的表达最高，当将SB在存在NIC和bFGF的情况下培养17天后，感光细胞祖细胞标志物Crx的表达最高。这些标志物(特别是Crx)的表达升高证实了向感光细胞命运的分化。在本公开内容中所述的结果表明用NIC+bFGF+CHIR或用NIC+IWRle+HSA在体外处理的SB在体内产生表达成熟感光细胞视紫红质和红色/绿色视蛋白的标志物的细胞。

[0311] 还使用NIC、IWRle和bFGF的不同组合处理SB 3周。图15提供了对所分析的时间轴和试剂的说明。在分化20天后，分析了眼区和视网膜祖细胞标志物的表达。图16至图20显示了说明将SB在NIC中培养20天后眼区和视网膜祖细胞标志物Pax6、Six3、Rx、Six6和Chx10的表达的图。对照HADC102由未分化HAD-C102细胞组成在用于人多能干细胞的hPSC XF*无Xeno培养基(Biological Industries)中培养6-7天。结果
证实使用NIC能够产生hESC衍生的感光细胞祖细胞。

[0312] 图21至图25显示了说明将SB在NIC+IWRle或NIC+IWRle+bFGF或NIC+bFGF中培养20天后眼区和视网膜祖细胞标志物Pax6、Six3、Rx、Six6和Chx10分别的表达的图。对照HADC102由未分化HAD-C102细胞组成在用于人多能干细胞的 hPSC XF*无Xeno培养基(Biological Industries)中培养6-7天。这些结果证实IWRle也诱导hESC衍生的感光细胞祖细胞的标志物的表达。图26至图35显示了说明将SB分别在NIC+IWRle或NIC或IWRle或IWRle+bFGF中培养后眼区和视网膜祖细胞标志物Pax6、Six3、Rx、Six6和Chx10的表达的图。对照HADC102由未分化HAD-C102细胞组成在用于人多能干细胞的
hPSC XF*无Xeno培养基(Biological Industries)中培养6-7天。如图
所示，当将SB在存在NIC与IWRle组合的情况下分化时，证实眼区和视网膜祖细胞标志物Pax6、Rx、Six3、Six6和Chx10的表达最高。当仅使用IWRle培养细胞时，这些标志物的表达水平降低很多。

[0313] 还分析了向SB的培养基中加入HSA。图36提供了对所分析的时间轴和试剂的说明。随着HSA的加入，所产生的SB的量增加。此外，当将HSA加入SB的培养基中时，如图37A和图
37B中所示，所获得的SB更大和更紧实。结果表明加入HSA改善了视网膜祖细胞的产量，还改善了分化效率。

[0314] 在分化4周后，分析了SB中眼区和视网膜祖细胞标志物的表达。图38至图41显示了说明将SB在NIC+IWRe+HSA或NIC+IWRe中培养4周后眼区和视网膜祖细胞标志物Chx10、Pax6、Rx和Six6分别的表达的图，将未分化的HAD-C102细胞作为对照。图42至图45显示了说明将SB在NIC+bFGF或NIC+HSA或NIC+IWRe+HSA中培养4周后眼区和视网膜祖细胞标志物Chx10、Pax6、Rx和Six6分别的表达的图，将未分化的HAD-C102细胞(HAD102)作为对照。当将SB在存在NIC与IWRle和HSA组合(NIH)的情况下分化时，证实眼区和视网膜祖细胞标志物Chx10、Pax6、Rx和Six6的表达最高。

[0315] 在NIH存在的情况下孵育4.5至7周的时间段后，进一步检测了NIH的作用。图46至图49显示了说明将SB在来自HAD-C102细胞系的未分化细胞和NIH中培养4.5周或在NIH中培养5周或在NIH中培养6周或在NIH中培养7周后眼区和视网膜祖细胞标志物Chx10、Pax6、Rx和Six6的表达的图。在存在NIH的情况下孵育7周后获得了标志物Rx、Chx10和Six6的最高水平的表达。

[0316] 为了分析不同培养系统对眼区和感光细胞祖细胞标志物表达的影响，对明胶上在由脐带饲养细胞条件化的用于人多能干细胞的 hPSC XF*无Xeno培养基(NIH(脐带))中培养的衍生自hESC的SB的表达水平与在层粘连蛋白521上在相同的培养基(用于人多能干细胞的 hPSC XF*无Xeno培养基，NIH(Lam))中培养的衍生
自hSEC的SB的表达水平进行了比较。使用在明胶上在由脐带饲养细胞条件化的用于人多能干细胞的 hPSC XF*无Xeno培养基中培养并在存在NIC(SB NIC)的情况
下悬浮培养过夜的衍生自hSEC的SB作为对照。

[0317] 图50至图54显示了说明将SB在NIH中培养5周后(NIH(脐带))眼区和视网膜祖细胞标志物Rx、Pax6、Six3、Six6和Chx10分别的表达的图。NIH(脐带)表示使用脐带饲养细胞条件培养基培养的衍生自hSEC的SB。NIH(Lam)表示在层粘连蛋白521上培养的衍生自hSEC的SB。SB NIC表示对照，其包含在使用脐带饲养细胞条件化的培养基中使用NIC悬浮培养过夜的衍生自hSEC的SB。

[0318] 图55至图58显示了来自另外的分析的一组图，其说明了将SB在NIH中培养5周后NIH(脐带)、NIH(Lam)和对照(SB NIC)，眼区和视网膜祖细胞标志物Rx、Pax6、Six6和Chx10分别的表达。与条件培养基相比，在层粘连蛋白521上培养HAD-C102细胞可能是优选的，因为培养过程是更加确定和可控。此外，当在层粘连蛋白521上培养由hSEC产生的SB时，所分析的所有标志物的表达均更高。在这些条件下(层粘连蛋白521)，生产过程也更加有效。出乎意料的是，与在饲养细胞条件化的培养基中在明胶上初始培养hSEC相比，在层粘连蛋白521上初始培养hSEC产生了更有效的分化结果。

[0319] 实施例3

[0320] 蛋白表达

[0321] 使用免疫荧光染色在蛋白水平分析了眼区和视网膜祖细胞标志物的表达。为了表征聚集体内细胞的免疫表型，通过机械方法将培养4至8周的球形体(SB)部分解聚，并将所得到的小块和单细胞铺板在聚-D-赖氨酸(30-70kDa,10μg/ml)和层粘连蛋白(4μg/ml)上与悬液相同的培养基中。在相同培养基中使细胞分化持续至多2周。然后，使用4％的多聚甲醛将细胞在室温下固定20分钟。使用PBS洗涤后，使用含有5％正常驴血清和0.2％triton的PBS溶液将标本在室温下封闭1小时，并使用下述一抗孵育1小时：抗-RAX(兔多克隆抗体，1:500；Abeam)，抗-Chx10(绵羊多克隆抗体，1:100；Exalpha Biologicals,Inc.)，抗-Crx(小鼠单克隆抗体，1:500；Abnova)和抗-恢复蛋白(兔多克隆抗体，1:1000；Millipore)。

[0322] 使用PBS洗涤后，使用下述二抗中的一种将标本在室温下孵育30分钟：罗丹明红-X-偶联的驴抗小鼠IgG；罗丹明红-X-偶联的驴抗兔IgG；Cy3-偶联的驴抗绵羊IgG(1:100；全部均来自Jackson ImmunoResearch)。使用含有4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)的封片基质(Vector Laboratories,USA)将细胞核复染。使用Olympus BX61荧光显微镜(Olympus,Hamburg,Germany)将标本可视化。对于本文呈现的图像，使用配有DP70数码照相机的Olympus BX61显微镜。

[0323] 图59A显示了在体外使用抗RAX抗体染色(红色)和使用DAPI核复染(蓝色)的衍生自hSEC的感光细胞祖细胞的图像。图59B显示了在体外使用抗RAX抗体染色(红色)和细胞表达的GFP(绿色)的衍生自hESC的感光细胞祖细胞的图像。图60A显示了在体外使用抗Chx10抗体染色(红色)和使用DAPI核复染(蓝色)的衍生自hESC的感光细胞祖细胞的图像。图60B显示了在体外使用抗Chx10抗体染色(红色)和细胞表达的GFP(绿色)的衍生自hESC的感光细胞祖细胞的图像。图61A显示了在体外使用抗Crx抗体染色(红色)和使用DAPI核复染(蓝色)的衍生自hESC的感光细胞祖细胞的图像。图61B显示了在体外使用抗Crx抗体染色(红色)和细胞表达的GFP(绿色)的衍生自hESC的感光细胞祖细胞的图像。图62A和图62C显示了在体外使用抗恢复蛋白(红色)染色和使用DAPI核复染(蓝色)的衍生自hESC的感光细胞祖细胞的图像。图62B和图62D显示了在体外使用抗恢复蛋白(红色)染色的衍生自hESC的感光细胞祖细胞的图像。如图像中所示，在很多细胞中证实了RAX、Chx10和Crx的表达。还可见显示出表达恢复蛋白的细胞，这是一种在感光细胞发育后期可见的标志物。恢复蛋白由未成熟的视杆细胞和视锥细胞表达。

[0324] 实施例3

[0325] 移植的衍生自hESC的感光细胞祖细胞的移植

[0326] 如图63A和进一步放大的图63B中所示，对衍生自hSEC的感光细胞祖细胞进行工程化以便于在宿主组织中鉴定移植的细胞。通过使用慢病毒载体对hSEC进行基因修饰以实现eGFP组成型表达。根据Gropp等,2003 Stable genetic modification of human embryonic stem cells by lentiviral vectors.Mol TherFeb；7(2):281-7PMID:
12597917，在脐带饲养细胞上扩增hESC的阶段，使用慢病毒载体感染细胞。在感染的hSEC中，由人EFla启动子驱动eGFP的组成型表达。

[0327] 对于眼内注射，使用盐酸氯胺酮(100mg/kg)麻醉成年啮齿类动物，将其与肌松剂赛拉嗪(2.0mg/kg)联合腹腔注射。在程序之前，向眼部施用局部麻醉滴液(0.4％盐酸奥卡因)。

[0328] 将麻醉的动物置于侧卧位，鼻子朝向手术者。所有步骤均在解剖显微镜的观察下进行。用剪刀在角膜缘后约2mm处平行剪开一个3-4mm的结膜切口。用30G针头刺入巩膜，并形成到达视网膜下腔的通道，避免穿透视网膜。为降低眼内压，用30G针头进行前房穿刺。随后，将与Hamilton注射器相连的33G钝针头通过此前建立的通道插入视网膜下腔，并注射1-3μl浓度为50,000-100,000个细胞/μl的感光细胞祖细胞悬液。将针头退出后，将结膜放回其原始位置覆盖进入点。视网膜下移植程序如图64中所示。通过直接观察确认视网膜下小泡的形成，如图65所示。

[0329] 在体外使用NIC、bFGF和CHIR诱导分化后，将细胞移植入视网膜下腔。如图66所示，使用抗GFP抗体(绿色)的免疫组化染色表明移植细胞移入了视网膜下腔(“视网膜下移植物”)，并且迁移到了视网膜的不同层中。散在的GFP阳性细胞掺入外核层(感光细胞)(ONL，箭头)。使用DAPI对核进行复染(蓝色)。图66中所示的图像来自移植后4周摘除的眼球。

[0330] 摘除后，将眼球固定在Davidson溶液中，使用塑化石蜡包埋并切成4μm的切片。将切片在二甲苯中脱蜡，并在梯度乙醇中脱水，使用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)洗涤，在10mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中在125℃下孵育10分钟。使用PBS洗涤后，使用含有1％牛血清白蛋、0.1％triton-x100和3％正常驴血清的PBS溶液将标本在室温下封闭1小时。随后，在湿盒中使用下述一抗中的一种将切片在4℃下孵育24小时：抗GFP(FITC或TRITC-偶联的，1:100；Santa Cruz Biotechnology,Inc)，抗视紫红质(小鼠单克隆抗体，1:100；Lab Vision Corporation)，抗蓝色敏感视蛋白(山羊多克隆抗体，1:75；Santa Cruz Biotechnology,Inc.)，抗红色/绿色视蛋白(兔多克隆抗体，1:100；Chemicon International)。在PBS中洗涤后，使用下述二抗中的一种将标本在室温下孵育1小时：DyLightTM 488(或549)亲和纯化驴抗小鼠IgG；DyLightTM 488(或549)亲和纯化驴抗兔IgG；罗丹明红-X-偶联的抗山羊IgG(1:250；全部均来自Jackson ImmunoResearch)。使用含有4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)的封片基质(Vector Laboratories,USA)将细胞核复染。为确定抗原-抗体反应的特异性，设置了相应的阴性对照。然后使用荧光显微镜和/或共聚焦显微镜将染色的切片成像。对于本文呈现的图像，使用配有DP70数码照相机的Olympus BX61显微镜。

[0331] 如图67中所示，移植后7周，在表达视杆感光细胞特异性标志物视紫红质(红色)的视网膜下移植物中可见大量的移植细胞(绿色)。宿主视杆感光细胞也表达视紫红质，但不表达GFP。使用DAPI对核进行复染(蓝色)。图68显示了移植7周后在表达视锥感光细胞特异性标志物红色/绿色视蛋白(红色，箭头)的视网膜下移植物中的移植细胞(绿色)。使用DAPI(蓝色)对核进行复染。

[0332] 图69、图70和图71是经染色的视网膜下移植物的图像，所述移植物中包含表达GFP的，在移植前使用NIH分化的衍生自hESC的感光细胞祖细胞。该图像是在移植后4至6周采集的。如图69和图70中所示，移植物内的大量细胞共表达视紫红质(红色)。在ONL内也可见移植的共表达GFP和视紫红质的细胞。图71显示了在视网膜下移植物内表达GFP的细胞和视锥细胞标志物红色/绿色视蛋白的共染色。这些图像表明在移植物内的大量细胞表达红色/绿色视蛋白。这些结果证实了移植的衍生自hESC的感光细胞祖细胞移植物能够存活、移入、迁移和分化成表达成熟视杆和视锥感光细胞标志物的细胞。视锥细胞是负责白天精细视觉功能的感光细胞，而视杆细胞是负责夜间视力的感光细胞。视锥细胞在视网膜的黄斑区非常丰富，其对于精细和高分辨率的视觉功能至关重要。

[0333] 根据本文的说明书，将意识到，本公开涵盖多个实施方式，其包括但不限于以下：

[0334] 一种产生感光细胞的方法，其包括(a)在引起感光细胞的条件下，在含有烟酰胺的培养基中培养干细胞。

[0335] 根据任何前述实施方式所述的方法，其中所述培养基包含至少0.5mM烟酰胺。

[0336] 根据任何前述实施方式所述的方法，其还包括(b)在包含选自以下的至少一种试剂或试剂的组合的培养基中培养步骤(a)中产生的细胞：GSK3抑制剂、Wnt抑制剂、bFGF、HSA或IGF。

[0337] 根据任何前述实施方式所述的方法，其还包括在步骤(b)的所述培养之后分离感光细胞。

[0338] 根据任何前述实施方式所述的方法，其还包括在步骤(b)的所述培养之后扩增所述细胞。

[0339] 根据任何前述实施方式所述的方法，其中步骤(a)的所述培养是在非贴壁条件下进行。

[0340] 根据任何前述实施方式所述的方法，其中步骤(b)的所述培养是在非贴壁条件下进行。

[0341] 根据前述实施方式任一项所述的方法，其中步骤(b)的所述培养基包含以下中的一种或多种：

[0342] (i)烟酰胺和Wnt抑制剂；

[0343] (ii)烟酰胺和bFGF；

[0344] (iii)烟酰胺和IGF；

[0345] (iv)烟酰胺、IGF和GSK3抑制剂；

[0346] (v)烟酰胺、bFGF和Wnt抑制剂；

[0347] (vi)烟酰胺、Wnt抑制剂和HSA；

[0348] (vii)烟酰胺、bFGF和HSA；

[0349] (viii)烟酰胺、bFGF、Wnt抑制剂和HSA；或

[0350] (ix)烟酰胺和HSA。

[0351] 根据任何前述实施方式所述的方法，其中步骤(a)的所述培养至少进行3天。

[0352] 根据任何前述实施方式所述的方法，其中步骤(b)的所述培养至少进行1周。

[0353] 根据任何前述实施方式所述的方法，其中步骤(b)的所述培养基基本上不含激活素A。

[0354] 根据任何前述实施方式所述的方法，其中步骤(b)的所述培养基基本上不含TGFβ超家族成员。

[0355] 根据任何前述实施方式所述的方法，在不存在所述TGFβ超家族成员的情况下进行，其允许分化成所述感光细胞。

[0356] 根据任何前述实施方式所述的方法，其中在步骤(a)的所述培养之前，将所述干细胞在饲养细胞条件培养基中培养。

[0357] 根据任何前述实施方式所述的方法，其中在步骤(a)的所述培养之前，将所述干细胞在层粘连蛋白上的无饲养细胞系统中培养。

[0358] 根据任何前述实施方式所述的方法，其还包括在步骤(b)之后冻存所述感光细胞。

[0359] 根据任何前述实施方式所述的方法，其中所述冻存在选自以下的培养基中进行：90％人血清/10％DMSO、CryoStor 10％、CryoStor 5％、CryoStor 2％、Stem Cell banker和Prime FreezIS。

[0360] 根据任何前述实施方式所述的方法，其中所述干细胞包括人胚胎干细胞(ESC)或诱导的多能干细胞(iPSC)。

[0361] 根据任何前述实施方式所述的方法，其中步骤(a)的所述培养基基本上不含Wnt抑制剂、bFGF、HSA、IGF和/或GSK3抑制剂。

[0362] 根据任何前述实施方式所述的方法，其中所述GSK3抑制剂包括CHIR。

[0363] 根据任何前述实施方式所述的方法，其中所述Wnt抑制剂包括endo-IWRl。

[0364] 根据任何前述实施方式所述的方法，其中所述非贴壁条件包括非贴壁培养板。

[0365] 根据任何前述实施方式所述的方法，其中所述非贴壁条件包括非贴壁基材(substrate)。

[0366] 根据任何前述实施方式所述的方法，其中所述饲养细胞条件培养基包括人脐带成纤维细胞条件培养基。

[0367] 根据任何前述实施方式所述的方法，其还包括将所述感光细胞移植到眼的视网膜下腔中。

[0368] 根据任何前述实施方式所述的方法，其中在悬液中或作为固定在基质或基材上的单层细胞移植所述感光细胞。

[0369] 一种产生感光细胞的方法，其包括：

[0370] (a)在包含至少0.5mM烟酰胺的培养基中培养人多能干细胞群，其中培养物不包含处于浓度下的任何TGFβ超家族成员，其允许分化成所述感光细胞；和

[0371] (c)从视网膜色素上皮(RPE)细胞中分离所述感光细胞，从而产生感光细胞。

[0372] 一种感光细胞群，其可根据任何前述实施方式所述的方法获得。

[0373] 根据任何前述实施方式所述的方法，其中所述视网膜疾病或病症选自以下中的至少一种：视网膜色素变性，勒伯尔先天性黑蒙，遗传性或获得性黄斑变性，年龄相关性黄斑变性(AMD)，贝斯特氏症，视网膜脱落，回旋状萎缩，无脉络膜，图形样营养不良(pattern dystrophy)，RPE营养不良，斯特格氏病，由光、激光、炎症、感染、辐射、新生血管或外伤的任一种引起的损伤导致的RPE或视网膜损伤。

[0374] 一种在有需要的受试者中治疗视网膜疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的任何前述实施方式所述的感光细胞群，从而治疗所述视网膜疾病或病症。

[0375] 一种治疗视网膜疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的通过以下方法获得的感光细胞或感光细胞制品，所述方法包括(a)在引起感光细胞的条件下，在含有烟酰胺的培养基中培养干细胞。

[0376] 根据任何前述实施方式所述的方法，其中所述培养基包含至少0.5mM烟酰胺。

[0377] 根据任何前述实施方式所述的方法，其还包括(b)在包含选自以下的至少一种试剂的培养基中培养步骤(a)中产生的细胞：GSK3抑制剂、Wnt抑制剂、bFGF、HSA和或IGF。

[0378] 根据任何前述实施方式所述的方法，其还包括在步骤(b)的所述培养之后分离感光细胞。

[0379] 根据任何前述实施方式所述的方法，其中步骤(a)或步骤(b)的所述培养是在非贴壁条件下进行。

[0380] 根据任何前述实施方式所述的方法，其中步骤(b)的所述培养基包含以下中的一种或多种：

[0381] (i)烟酰胺和Wnt抑制剂；

[0382] (ii)烟酰胺和bFGF；

[0383] (iii)烟酰胺和IGF；

[0384] (iv)烟酰胺、IGF和GSK3抑制剂；

[0385] (v)烟酰胺、bFGF和Wnt抑制剂；

[0386] (vi)烟酰胺、Wnt抑制剂和HSA；

[0387] (vii)烟酰胺、bFGF和HSA；

[0388] (viii)烟酰胺、bFGF、Wnt抑制剂和HSA；或者

[0389] (ix)烟酰胺和HSA。

[0390] 根据任何前述实施方式所述的方法，其中所述干细胞包括人胚胎干细胞(ESC)或诱导的多能干细胞(iPSC)。

[0391] 根据任何前述实施方式所述的方法，其中所述施用是在眼的视网膜下腔中进行。

[0392] 根据任何前述实施方式所述的方法，其中在悬液中或作为固定在基质或基材上的单层细胞施用所述感光细胞。

[0393] 根据任何前述实施方式所述的方法，其还包括从培养物中分离所述感光细胞。

[0394] 根据任何前述实施方式所述的方法，其中在施用之前将所述感光细胞冻存。

[0395] 根据任何前述实施方式所述的方法，其中所述感光细胞包括视锥细胞和视杆细胞。

[0396] 尽管已结合了其特定的实施方式对本发明进行了描述，但是显然，对于本领域技术人员而言，很多替代、修改和变化将是显而易见的。因此，旨在涵盖落入所附权利要求的精神和广泛范围内的所有这样的替代、修改和变化。

[0397] 本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请的全部内容都通过引用并入本文，其程度如同每个个体的出版物、专利或专利申请被具体地和个体地指出通过引用并入本文。此外，本申请中任何参考文献的引用或标识均不应解释为承认这样的参考文献可作为本发明的现有技术。对于所使用的章节标题而言，不应将其解释为是必要的限制。

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视网膜假体-专利编号CN106137531B	2020-05-13	1071
用于向视网膜假体提供能量的可佩戴装置-专利编号CN104739544B	2020-05-13	214
视网膜光治疗的系统及方法-专利编号CN104487031B	2020-05-12	902
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视网膜假体-专利编号CN106137531A	2020-05-13	368
用于向视网膜假体提供能量的可佩戴装置-专利编号CN104739544A	2020-05-12	1000
中心凹视网膜假体-专利编号CN105025982B	2020-05-11	232
中心凹视网膜假体-专利编号CN105025982A	2020-05-11	691
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用于治疗视网膜疾病的感光细胞

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