对乳癌的Herceptin(非专利文献1)、恶性B淋巴瘤的Rituxan(非 专利文献2)的成功，显示作为癌治疗法，抗体能够成为治疗药。某种 抗体与存在于细胞膜上的抗原分子形成复合体，这成为诱因而通过 ADCC作用(非专利文献3)和CDC作用(非专利文献4)，将表达抗 原的细胞杀死。有时形成抗原抗体复合体也成为细胞凋亡的诱因。抗体 导致的它们对于细胞的致死作用是不区分是否是癌细胞或是否是正常 细胞的固有功能。因此，对于癌的抗体治疗药能否开发成功与如下情况 相关：如何发现能够使对于正常细胞的影响(副作用)达到最小限度、 且能全部杀死对象癌细胞的抗体的标的抗原(癌抗原)。
由于确定了人基因组的全部碱基序列，因而能够推定在基因组上经 编码的全部蛋白质的氨基酸一级序列。因正常细胞中不使用的基因的异 常表达而引起癌化，只要其基因产物是膜蛋白质，则如HER2/Herceptin 的例子中所示，成为抗体的标的。基于这种想法，使用DNA微阵列， 来解析癌细胞与正常细胞的转录产物的质和量的差别的研究，在世界上 很多研究室中实施。

对于涉及癌细胞与正常细胞的不同的蛋白质水平的解析来说，以蛋 白质组学研究中使用的二维凝胶电泳为中心的各种手段来进行研究。 MS等解析机器飞跃性的性能提高和数据库的扩充大幅度地提高了这种 解析法的价值。然而，要分离作为癌治疗药的抗体时，以上两种方法在 实现目的之前都经过必需要庞大劳力和费用的很长的过程。之所以这 样，是因为在使用DNA微阵列来解析癌细胞与正常细胞的转录产物的 质和量的差别的研究中，除了明确知道其存在的转录产物以外，不能明 确区别选择性的剪接。此外，如果加上不能预测含有翻译后修饰的翻译 后的三级结构的方面等，则作为以抗体新药为目标的信息不能解决几个 致命缺点。另一方面，对于涉及癌细胞与正常细胞的不同的蛋白质水平 的解析来说，在以蛋白质组学研究中使用的二维凝胶电泳为中心的研究 中，存在如下重大的问题：虽然是膜蛋白但不知何故不能清晰地二维展 开，或者在使用多维LC的解析中，由于该LC中使用的溶剂等性质而 使物质不能在完整的状态下进行解析等。进而，作为实验方法，即使是 分类为同样癌症(例如肝癌)的病例，若详细比较个别癌症中的基因表 达方式也是千差万别的，关于如何能够判断其个体差别是否是来源于癌 特性的问题，即使上述的微列阵、蛋白质组学的两种途径也都不能明确 地解决。为了解决这些问题，本发明人等制作了含有1000亿个独立克 隆的巨大的人抗体文库，利用其进行各种技术开发(特愿2004-349783、 再表01/062907(专利文献1)、再表01/096401(专利文献2))。
在以上的背景下，本发明在目的在于，通过明确癌细胞特异性表达、 成为癌治疗或癌诊断标的的分子，从而实现该分子在医疗领域或研究领 域中的利用。特别是，本发明的目的在于提供利用该分子进行癌治疗的 有效手段。
作为用于达成上述目的的战略，本发明人等尝试利用独自开发出的 scFv-CL抗体噬菌体文库(再表01/096401)来获得肝癌细胞特异性抗 体。其结果，成功获取多个与肝癌细胞以高特异性结合的抗体。而且， 成功鉴定各抗体的可变区域(VH、VL)的序列，进一步阐明其CDR。 另外，所得抗体正确识别肝癌细胞的细胞膜上的完整蛋白质的多个表 位。
接着，研究所得抗体在诊断领域中的有效性。具体地说，明确了使 用该抗体实施肝癌细胞和肝癌组织的免疫染色之后，能够将肝癌细胞和 肝癌组织特异性地染色。即，通过该抗体，能够将肝癌细胞或肝癌组织 与正常组织从染色上进行区分。另一方面，研究对于分化程度(恶性程 度)不同的肝癌细胞的染色性后，确认了细胞的分化程度与染色性之间 有一定的关联性。由该结果认为，如果使用成功获取的抗体，则可以判 断肝癌细胞(组织)的恶性程度。如上可知，成功获取的抗体在肝癌的 诊断用途中非常有用。
接着，尝试鉴定所获取的抗体的抗原、即肝癌细胞特异性表达的蛋 白质。反复试验的最后，成功鉴定了目的蛋白质。检索公共的数据库之 后，可知成功鉴定的蛋白质被注册为IgSF4(也被称为BL2、ST17、 NECL2、TSLCl、IGSF4A、SYNCAM等)。认为IgSF4来源于人的11 号染色体的11q23.2上存在的ORF(可读框)。已知IgSF4主要作为肺 癌的抑制基因，还报道有与脑神经接合有关。此外，报道有在脑、睾丸 和甲状腺的正常细胞中有表达。在其他细胞中，未知IgSF4的显著表达， 本发明人等根据上述研究成果，明确了IgSF4也能够作为新的肝癌特异 性标记而利用。
进而，关于该IgSF4分子，报道有采用微阵列解析成人T细胞白血 病(Adult T cell Leukemia；ATL)可知IgSF4的表达差异是最显著的， 认为成功获取的、识别膜表面的IgSF4的抗体特异性识别ATL因而可 能对诊断、治疗这些疾病有帮助。
成人T细胞白血病(Adult T cell Leukemia；ATL)在日本西南地 方(冲绳、鹿儿岛、宫崎、长崎各县的发病率达到约5％)和加勒比海 沿岸集中发生，其是淋巴增殖性疾病中，治疗成果最差、预后极度不良 的辅助T细胞性的白血病。现今，已明确作为人反转录病毒(Human Retrovirus)的HTLV-1(Human T cell Leukemia Virus Type1)的感染 是ATL发病的重要因素。在幼儿时通过母乳从母亲感染，HTLV-1携带 者以5～10％的频率发病，且在2年内几乎都死亡。日本全国的HTLV-1 携带者数量为约100万人，ATL发病数量为每年约700例，现在尚未确 立有效的ATL治疗法。
Rituxan(anti-CD20)是现在最广为人知的癌治疗抗体，已知仅对 非霍奇金淋巴瘤没有治疗作用。根据流式细胞计量术(FCM)的结果， 认为本发明获得的抗体对于IgSF4表达型ATL具有非常特异的结合能 力，使用本抗体的IgSF4表达型ATL的诊断，或经毒素或RI接合的本 发明获取的抗体在治疗IgSF4表达型ATL方面有用。
另一方面，对成功获取的抗体对于癌细胞的作用、效果进行了研究， 结果明确，一部分抗体令人惊讶地发挥ADCC活性(Antibody- dependent Cell-mediated cytotoxicity)。即，可判明，对癌细胞的细胞 毒性增高，成功获得作为抗体医药而有效的抗体。此外，通过抗IgSF 抗体确认了ADCC带来的细胞毒性，所以可知IgSF4成为癌治疗中的 有效标的。即，明确了如果利用以IgSF4为标的的抗体，则可特异性伤 害癌细胞。
本发明基于以上的成果，提供具有对IgSF4特异结合性的分离得到 的抗体。
本发明的抗体的特征在于具有对IgSF4的特异结合性。在一种方式 中，本发明的抗体通过IgSF4发挥细胞毒活性。在优选的一种方式中， 本发明的抗体通过IgSF4而具有ADCC活性。此外，在优选的其他方 式中，本发明的抗体通过IgSF4发挥细胞增殖活性。
本发明的抗体的一种方式的特征在于，具有重链可变区域和轻链可变 区域；所述重链可变区具有含有序列号：2～4、10～12、18～20、26～28、 34～36、42～44、50～52、58～60、222～224、230～232和238～249中 的任一氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸序列的CDR；所述轻链可变 区域具有含有序列号：6～8、14～16、22～24、30～32、38～40、46～48、 54～56、62～64、226～228、234～236和242～244中的任一氨基酸序列 或与其实质上相同的氨基酸序列的CDR。
本发明的抗体的一种方式的特征在于，具备以下选自a～v中的组合 的重链可变区域和轻链可变区域：
(a)具有由序列号：2的CDR1、序列号：3的CDR2和序列号： 4的CDR3构成的CDR、或与其实质上相同的CDR的重链可变区域， 与具有由序列号：6的CDR1、序列号：7的CDR2和序列号：8的CDR3 构成的CDR、或与其实质上相同的CDR的轻链可变区域的组合；
(b)具有由序列号：10的CDR1、序列号：11的CDR2和序列号： 12的CDR3构成的CDR、或与其实质上相同的CDR的重链可变区域， 与具有由序列号：14的CDR1、序列号：15的CDR2和序列号：16的 CDR3构成的CDR、或与其实质上相同的CDR的轻链可变区域的组合；
(c)具有由序列号：18的CDR1、序列号：19的CDR2和序列号： 20的CDR3构成的CDR、或与其实质上相同的CDR的重链可变区域， 与具有由序列号：22的CDR1、序列号：23的CDR2和序列号：24的 CDR3构成的CDR、或与其实质上相同的CDR的轻链可变区域的组合；
(d)具有由序列号：26的CDR1、序列号：27的CDR2和序列号： 28的CDR3构成的CDR、或与其实质上相同的CDR的重链可变区域， 与具有由序列号：30的CDR1、序列号：31的CDR2和序列号：32的 CDR3构成的CDR、或与其实质上相同的CDR的轻链可变区域的组合；
(e)具有由序列号：34的CDR1、序列号：35的CDR2和序列号： 36的CDR3构成的CDR、或与其实质上相同的CDR的重链可变区域， 与具有由序列号：38的CDR1、序列号：39的CDR2和序列号：40的 CDR3构成的CDR、或与其实质上相同的CDR的轻链可变区域的组合；
(f)具有由序列号：42的CDR1、序列号：43的CDR2和序列号： 44的CDR3构成的CDR、或与其实质上相同的CDR的重链可变区域， 与具有由序列号：46的CDR1、序列号：47的CDR2和序列号：48的 CDR3构成的CDR、或与其实质上相同的CDR的轻链可变区域的组合；
(g)具有由序列号：50的CDR1、序列号：51的CDR2和序列号： 52的CDR3构成的CDR、或与其实质上相同的CDR的重链可变区域， 与具有由序列号：54的CDR1、序列号：55的CDR2和序列号：56的 CDR3构成的CDR、或与其实质上相同的CDR的轻链可变区域的组合；
(h)具有由序列号：58的CDR1、序列号：59的CDR2和序列号： 60的CDR3构成的CDR、或与其实质上相同的CDR的重链可变区域， 与具有由序列号：62的CDR1、序列号：63的CDR2和序列号：64的 CDR3构成的CDR、或与其实质上相同的CDR的轻链可变区域的组合；
(i)序列号：1的氨基酸序列或与其实质上相同的重链可变区域， 与序列号：5的氨基酸序列或与其实质上相同的轻链可变区域的组合；
(j)序列号：9的氨基酸序列或与其实质上相同的重链可变区域， 与序列号：13的氨基酸序列或与其实质上相同的轻链可变区域的组合；
(k)序列号：17的氨基酸序列或与其实质上相同的重链可变区域， 与序列号：21的氨基酸序列或与其实质上相同的轻链可变区域的组合；
(l)序列号：25的氨基酸序列或与其实质上相同的重链可变区域， 与序列号：29的氨基酸序列或与其实质上相同的轻链可变区域的组合；
(m)序列号：33的氨基酸序列或与其实质上相同的重链可变区域， 与序列号：37的氨基酸序列或与其实质上相同的轻链可变区域的组合；
(n)序列号：41的氨基酸序列或与其实质上相同的重链可变区域， 与序列号：45的氨基酸序列或与其实质上相同的轻链可变区域的组合；
(o)序列号：49的氨基酸序列或与其实质上相同的重链可变区域， 与序列号：53的氨基酸序列或与其实质上相同的轻链可变区域的组合；
(p)序列号：57的氨基酸序列或与其实质上相同的重链可变区域， 与序列号：61的氨基酸序列或与其实质上相同的轻链可变区域的组合；
(q)具有由序列号：222的CDR1、序列号：223的CDR2和序列 号：224的CDR3构成的CDR、或与其实质上相同的CDR的重链可变 区域，与具有由序列号：226的CDR1、序列号：227的CDR2和序列 号：228的CDR3构成的CDR、或与其实质上相同的CDR的轻链可变 区域的组合；
(r)具有由序列号：230的CDR1、序列号：231的CDR2和序列 号：232的CDR3构成的CDR、或与其实质上相同的CDR的重链可变 区域，与具有由序列号：234的CDR1、序列号：235的CDR2和序列 号：236的CDR3构成的CDR、或与其实质上相同的CDR的轻链可变 区域的组合；
(s)具有由序列号：238的CDR1、序列号：239的CDR2和序列 号：240的CDR3构成的CDR、或与其实质上相同的CDR的重链可变 区域，与具有由序列号：242的CDR1、序列号：243的CDR2和序列 号：244的CDR3构成的CDR、或与其实质上相同的CDR的轻链可变 区域的组合；
(t)序列号：221的氨基酸序列或与其实质上相同的重链可变区域， 与序列号：225的氨基酸序列或与其实质上相同的轻链可变区域的组合；
(u)序列号：229的氨基酸序列或与其实质上相同的重链可变区 域，与序列号：233的氨基酸序列或与其实质上相同的轻链可变区域的 组合；
(v)序列号：237的氨基酸序列或与其实质上相同的重链可变区域， 与序列号：241的氨基酸序列或与其实质上相同的轻链可变区域的组合。
在本发明的一种方式中，提供人抗体或人源化抗体。此外，本发明 的抗体作为各种形态被构建。例如，作为IgG、Fab、Fab’、F(ab’)2、 scFv或dsFv抗体被构建。
本发明进一步提供抗IgSF4抗体的CDR。本发明的CDR含有序列 号：2～4、6～8、10～12、14～16、18～20、22～24、26～28、30～32、 34～36、38～40、42～44、46～48、50～52、54～56、58～60、62～64、 222～224、226～228、230～232、234～236、238～240和242～244中 的任一氨基酸序列。
本发明还提供经分离得到的核酸分子，其编码本发明抗体的重链可 变区域或轻链可变区域、或者本发明的CDR。
本发明还涉及以能够表达的方式载有该分子的载体，导入有该核酸 分子的转化体。
本发明的其他方式提供含有上述本发明的抗体作为有效成分的癌 治疗剂。
本发明进一步的其他方式还提供含有抗IgSF4抗体而成的肝癌检查 用、成人T细胞白血病检查用、肝癌研究用或成人T细胞白血病研究 用的试药作为其他方式。进而，还提供含有该试药和使用说明书而成的 肝癌检查用、成人T细胞白血病检查用、肝癌研究用或成人T细胞白 血病研究用的试剂盒。
作为本发明进一步的方式，提供获取肝癌或成人T细胞白血病诊断 用的信息的方法，其包括如下步骤：
(1)准备从活体分离得到的受检细胞的步骤，以及
(2)以上述受检细胞为对象检测IgSF4的步骤。
进而，还提供判断肝癌细胞恶性程度的方法，其包括如下步骤：
(1)准备从活体分离得到的受检肝细胞的步骤，以及
(2)以上述受检肝细胞为对象检测IgSF4的步骤。
本发明还提供对肝癌细胞或成人T细胞白血病细胞特异性结合的 化合物的筛选方法，其包括如下步骤：
(1)使IgSF4与试验化合物接触的步骤，
(2)评价试验化合物对IgSF4的结合性的步骤。
此外，还提供对治疗肝癌有效的IgSF4结合性化合物的筛选方法， 其包括如下步骤：
(1)准备表达IgSF4基因的细胞的步骤，
(2)使试验化合物与上述细胞接触的步骤，
(3)评价癌细胞死亡或减少的步骤。
此外，还提供对治疗成人T细胞白血病有效的IgSF4结合性化合物 的筛选方法，其包括如下步骤：
(1)准备成人T细胞白血病细胞的步骤，
(2)使试验化合物与上述细胞接触的步骤，
(3)评价上述细胞死亡或减少的步骤。
本发明进一步提供IgSF4的作为抗原的用途。在该用途中，使用 IgSF4作为用于制作癌治疗用抗体的抗原。作为此处的IgSF4，可以使 用以下的任意一种：
(1)使用大肠杆菌的表达系而生产出的IgSF4，
(2)使用动物细胞的表达系而在培养基中分泌的IgSF4，
(3)使用动物细胞的表达系而在细胞表面上表达的IgSF4，
(4)使用作为表达T抗原而能够一过性表达的动物细胞的表达系， 在培养基中分泌的或在细胞表面上表达的IgSF4。
另一方面，可以使用IgSF4的细胞外区域作为抗原，来制作癌治疗 用抗体。
本发明还提供癌治疗法，其包括向携有癌细胞的对象给予抗IgSF4 抗体的步骤。作为抗IgSF4抗体，优选使用具有ADCC活性的抗体。 此外，还提供成人T细胞白血病治疗法，其包括向携有成人T细胞白 血病细胞的对象给予抗IgSF4抗体的步骤。

图1：是制作scFv抗体基因文库中使用的载体的模式图。
图2：是模式化地表示pscFvCA9-E8VHdVLd的结构的图。
图3-1：是显示pscFvCA9-E8VHdVLd的插入部的碱基序列(序 列号：171)及由其所编码的氨基酸序列(序列号：172)的图。
图3-2：图3-1的继续。
图4-1：是显示pscFvCA-E8VHd的插入部的碱基序列(序列号： 175)及限制性内切酶位点和由碱基序列所编码的氨基酸序列(序列号： 176)的图。
图4-2：图4-1的继续。
图5：是显示肝癌细胞特异性抗体克隆的筛选过程的图。
图6：是显示用选拔得到的抗体克隆进行组织染色的结果图。对来 源于三种类的患者的组织进行抗体染色，研究染色的癌特异性。
图7：是显示用抗体克隆035-273进行癌组织染色的结果图。
图8：是显示用抗体克隆035-273进行癌组织染色的结果图。上栏 是癌部的染色结果，下栏是非癌部的染色结果。
图9：是显示用抗体克隆051-129进行癌组织染色的结果图。上栏 是癌部的染色结果，下栏是非癌部的染色结果。
图10：是显示用抗体克隆035-169进行癌组织染色的结果图。上 栏是癌部的染色结果，下栏是非癌部的染色结果。
图11：是显示用抗体克隆035-273进行癌组织染色的结果图。所 使用的细胞从左上栏依次为HepG2细胞、Nuk-1细胞、HLF细胞，从 右上栏依次为HuH-7细胞、THLE-3细胞。
图12-1：是显示作为肝癌细胞特异性抗体克隆而得到的cp3型抗 体的序列的图。
图12-2：图12-1的继续。
图13：是将使用肝癌细胞特异性抗体克隆而得到免疫沉淀物用蛋白 质印迹法解析而得的结果。免疫沉淀后，进行SDS-PAGE，用035-283 抗体检测。泳道1：通过使用固相化的035-283抗体克隆与HLF(人 低分化型肝脏癌细胞株)的溶胞产物进行免疫沉淀(IP)而得的样品。 泳道2：035-283抗体克隆和HLF(泳道1的实验的再现试验)。泳道 3：035-283抗体和HepG2(人肝癌来源细胞株)。泳道4：035-283 抗体和HepG2(泳道3的实验的再现实验)。切除泳道1～4的带，通过 质量分析机确定蛋白质的氨基酸序列。
图14：是显示经鉴定的抗原的氨基酸序列的图。作为用MSMS得 到的片段的序列的斜体书写(cf：NLMIDIQK)部分是采用利用了 ESI-ionTRAP-MSMS的方法鉴定得到的序列。另一方面，带有下划线 (cf：QTIYFR)的部分是采用利用了MALDI-TOF-MS的PMF法鉴定 得到的片段。用斜体和下划线显示的部分(cf：GTYFTHEAK)是用 MS/MS法和PMF法两种鉴定方法鉴定得到的。该抗原被确认受到显著 的糖链修饰。其受到糖链修饰的候补氨基酸用N标示。
图15-1：分离得到的IgSF4cDNA克隆(IgSF4N：cDNA1)的序 列。
图15-2：图15-1的继续。
图16-1：分离得到的IgSF4cDNA克隆(IgSF4X：cDNA2)的序 列。
图16-2：图16-1的继续。
图17：显示IgSF4表达实验的结果(FCM解析结果)的图。紫： 没有导入基因，红：导入cDNA1，绿：导cDNA2。左图：对035- 273抗体的检测结果。右图：对抗流感抗体YA14的检测结果。
图18：显示IgSF4表达实验的结果(细胞染色结果)的图。从左 依次为导入有cDNA1的细胞，导入有cDNA2的细胞，没有导入基因的 细胞。
图19：使用HLF细胞的RNAi实验的结果。(A)：没有RNAi，(B)： IgSF4RNAi。基于(A)的峰位置，将荧光强度比其更强的细胞的比例 设为M1。
图20：使用HLF细胞的RNAi实验的结果(细胞染色结果)。左侧： 没有IgSF4RNAi处理，右侧：IgSF4RNAi处理。
图21：RNAi实验中的FCM解析结果。
图22：分离的抗体克隆对肝癌来源细胞株HEPG2的FCM反应性。
图23：分离的抗体克隆对肝癌来源细胞株HLF的FCM反应性。
图24：分离的抗体克隆对人胎儿肾上皮来源细胞株293T的FCM 反应性。
图25：分离的抗体克隆对人肾癌来源细胞株ACHN的FCM反应 性。
图26：分离的抗体克隆对人ATL来源细胞株KK1的FCM反应性。
图27：用FCM比较分离的抗体克隆035-212的反应性，与ATL 细胞表面标记(抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD25的各种抗体)的 反应性。
图28：分离的抗体克隆035-212对IgSF4的启动子经甲基化的人 ATL来源细胞株ED、Su9T、SO4和没有甲基化的人ATL来源细胞株 KKl、KOB和ST1的FCM反应性。
图29：分离的抗体克隆对人非ATL来源细胞株MOLT4(人T细 胞性白血病来源株)和Jurkat和人T细胞指向性病毒感染(HTLV感 染株)T细胞淋巴瘤来源的HUT102、MT-2的FCM反应性。
图30：用Northern Blot进行的IgSF4的mRNA表达解析的结果。 显示HTLV-1感染细胞或ATL来源细胞中的IgSF4的表达状态。
图31：对A431细胞株的IgG型抗体035-029的FCM反应性。
图32：评价抗体克隆035-029的ADCC活性的结果。以肺癌来源 细胞核VMRC-LCD为目标细胞。

(用语)
为了说明的方便，对于本说明书中所使用的用语的一部分，概括其 定义如下。
在本说明书中，用语“含有～”或“含有～而成的”作为也包括“由～ 构成”的意思的表述而使用。因此，例如，记载为“含有多个要素(构 件)构成的物质(或方法)”时，其自然也包括被认为是意味着“由该 多个要素(构件)构成的物质(或方法)”。
“分离得到的”是指从其原来的环境(例如天然物质的情况为天然 的环境)中取出的状态，即指通过人为操作以不同于原来存在状态的状 态而存在。
本说明书中，用语“分离得到的核酸”是指，为原本天然存在的核 酸(例如人活体内的核酸)时，典型地从以天然状态共存的其他核酸中 分离得到的状态的核酸。但是，可以含有在天然状态中邻接的核酸序列 等一部分的其他核酸成分。例如基因组DNA时“分离得到的核酸”的 优选方式中，实质上不含有在以天然状态共存的其他DNA成分(含有 天然状态中邻接的DNA序列)。
例如通过cDNA分子等基因重组技术产生的核酸时的“分离得到的 核酸”，优选是指实质上不含细胞成分或培养液等的状态的核酸。同样 地，通过化学合成产生的核酸时的“分离得到的核酸”，优选是指实质 上不含dNTP等前体(原材料)或在合成过程中使用的化学物质等的状 态的核酸。
核酸作为载体或组合物的一部分存在，或者在细胞内核酸作为外源 性分子存在，只要作为人为操作的结果存在，就可以称为“分离得到的 核酸”。另外，只要没有特别说明，在本说明书中只是记载为“核酸” 时意味着“分离得到的状态的核酸”。
另一方面，对于“分离得到的抗体”来说，不包括天然的且不进行 任何外部操作(人为操作)的抗体，即在某个体内产生、并停留在那里 的状态的抗体。另外，分离得到的抗体典型地是不与其他种类的抗体混 合存在的状态，即单独(作为同种抗体的集合)存在。对于CDR区域 时的“分离得到的”状态来说，除了单独存在的状态以外，还包括与抗 体的其他区域一起存在的状态。即，对于用语“分离得到的CDR”来 说，当然可以是单独存在的CDR，还包括作为分离得到的抗体的一部 分而存在的CDR。
关于氨基酸序列使用的用语“实质上相同”是指，被比较的两个氨 基酸序列间在序列上的不同较小且序列上的不同对IgSF4的特异结合 性实质上没有影响。对于成为基准的氨基酸序列，可以认为在对IgSF4 的特异结合性实质上没有影响的范围内含有一部分改变的氨基酸序列 是实质上相同的氨基酸序列。此处的“氨基酸序列的一部分的改变”是 指，构成氨基酸序列的1～多个氨基酸的缺失、取代、或1～多个氨基 酸的附加、插入、或通过它们的组合在氨基酸序列上产生变化。氨基酸 序列的变异位置没有特别限定，可以在多个位置上产生变异。此处的多 个是指相当于构成氨基酸序列的全部氨基酸的例如10％以内的数目，优 选为相当于全部氨基酸5％以内的数目。进一步优选的是相当于全部氨 基酸1％以内的数目。
两个氨基酸是否实质上相同可以通过比较含有各氨基酸序列的抗 体(其他区域的序列相同)对IgSF4的结合特异性(以下，只要没有特 别记载，“特异性”意味着“对IgSF4的特异性”)来进行判断。例如， 成为基准的抗体在生理盐水环境下关于IgSF4的解离常数(Kd)为A 时，比较对象的抗体的Kd只要在A×10-1～A×10的范围则可以确定 为实质上上相同。
本说明书中的用语“核酸”包括DNA(包括cDNA和基因组DNA)、 RNA(包括mRNA)、DNA类似物和RNA类似物。本发明的核酸的形 态没有限定，即可以是1条链和2条链中任一种。优选的是2条链DNA。 此外，还考虑密码子的简并。即，为编码蛋白质的核酸时，作为其表达 产物，只要可以得到该蛋白质，就可以具有任意的碱基序列。本说明书 中的“编码某蛋白质(例如抗体)的核酸”是指使其表达时可以得到该 蛋白质的核酸，自然包括具有对应于该蛋白质的氨基酸序列的碱基序列 的核酸，还包括在这样的核酸上附加没有编码氨基酸序列的序列而成的 核酸(例如含有一个或多个内含子的DNA)。
“IgSF4”是Immunoglobulin superfamily member4的简称，也被 称为BL2、ST17、NECL2、TSLC1、IGSF4A、SYNCAM、sTSLC-1。 IgSF4被认为由人11号染色体的11q23.2表达。目前有IgSF4作为抑制 基因在肺癌中特异性地表达，脑的神经接合与IgSF4相关等的报道 (Biederer T et al.Science.2002 Aug30；297(5586)：1525-31)。IgSF4的 序列信息或关联的目前的报告的详细情况可以参考NCBI的网页 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)(AccessionNo.NM01433、 Definition：Homo sapiens immunoglobulin superfamily，member 4(IGSF4)，mRNA)。另外，IgSF4的氨基酸序列和碱基序列分别示为序 列号：145和序列号：146。
本发明中的“恶性程度判断法”是指判定受检肝细胞的恶性程度的 方法。用语“恶性程度判断”作为包括良性恶性的鉴别的概念而使用。 通常，使用分化程度来评价癌的恶性程度。癌细胞一般被分类为高分化 癌、中分化癌、低分化癌和未分化癌，分化程度越低则其的恶性程度越 高，而且，作为测定恶性程度(分化程度)的指标，有时使用N/C比。 N/C比是指核(nucleus)与细胞质(cytoplasm)的比率。对于分化程 度高的癌细胞(高分化型癌细胞)来说，一般N/C比低，细胞尺寸较大。 另一方面，对于分化程度低的癌细胞(低分化型癌细胞)来说，一般 N/C比高。对于未分化型癌细胞来说，一般N/C比高，细胞尺寸小。
高分化型癌细胞保持很多原来的组织性质，浸润能力或转移能力没 有那么高。另一方面，随着分化程度降低，其的细胞起源难以把握，浸 润能力或转换能力增高。对于分化程度低的癌细胞来说，治疗困难，对 于未分化癌来说，其预后极为不良。
在本说明书中，根据需要，按照习惯使用以下省略符号(括号内)。
重链(H链)、轻链(L链)、重链可变区域(VH)、轻链可变区域 (VL)、互补性决定区域(CDR)、第1互补性决定区域(CDR1)、第 2互补性决定区域(CDR2)、第3互补性决定区域(CDR3)重链的第1 互补性决定区域(VH CDR1)、重链的第2互补性决定区域(VH CDR2)、 重链的第3互补性决定区域(VH CDR3)轻链的第1互补性决定区域 (VL CDR1)、轻链的第2互补性决定区域(VL CDR2)、轻链的第3 互补性决定区域(VL CDR3)
本发明的第1方面涉及具有对IgSF4的特异结合性的抗体，即抗 IgSF4抗体。在优选的一种方式中，本发明的抗体具有ADCC活性。如 后述的实施例所示，本发明人等通过利用噬菌体抗体文库的独特方法， 鉴定作为肝癌特异性细胞膜表面抗原分子的IgSF4，从而成功获得对其 特异性高的11种抗体(035-029抗体、035-212抗体、035-215抗体、 035-273抗体、035-283抗体、040-131抗体、051-054抗体、051 -181抗体、051-129抗体、035-130抗体和035-169抗体)。这些抗 体由于可识别能接近的IgSF4的细胞外结构域，所述IgSF4为在细胞膜 表面上表达的状态，所以可以用于细胞、组织染色。解析各抗体可变区 域的序列的结果可以获得以下的序列信息。另外，接着抗体名，顺序记 载：重链可变区域的氨基酸序列；重链CDR1的氨基酸序列；重链CDR2 的氨基酸序列；重链CDR3的氨基酸序列；轻链可变区域的氨基酸序列； 轻链CDR1的氨基酸序列；轻链CDR2的氨基酸序列；轻链CDR3的 氨基酸序列。
035-029抗体序列号：1(VH)；序列号：2(VH CDR1)；序列 号：3(VH CDR2)；序列号：4(VH CDR3)；序列号：5(VL)；序列 号：6(VL CDR1)；序列号：7(VL CDR2)；序列号：8(VL CDR3)
035-212抗体序列号：9(VH)；序列号：10(VH CDR1)；序 列号：11(VH CDR2)；序列号：12(VH CDR3)；序列号：13(VL)； 序列号：14(VL CDR1)；序列号：15(VL CDR2)；序列号：16(VL CDR3)
035-215抗体序列号：17(VH)；序列号：18(VH CDR1)；序 列号：19(VH CDR2)；序列号：20(VH CDR3)；序列号：21(VL)； 序列号：22(VL CDR1)；序列号：23(VL CDR2)；序列号：24(VL CDR3)
035-273抗体序列号：25(VH)；序列号：26(VH CDR1)；序 列号：27(VH CDR2)；序列号：28(VH CDR3)；序列号：29(VL)； 序列号：30(VL CDR1)；序列号：31(VL CDR2)；序列号：32(VL CDR3)
035-283抗体序列号：33(VH)；序列号：34(VH CDR1)；序 列号：35(VH CDR2)；序列号：36(VH CDR3)；序列号：37(VL)； 序列号：38(VL CDR1)；序列号：39(VL CDR2)；序列号：40(VL CDR3)
040-131抗体序列号：41(VH)；序列号：42(VH CDR1)；序 列号：43(VH CDR2)；序列号：44(VH CDR3)；序列号：45(VL)； 序列号：46(VL CDR1)；序列号：47(VL CDR2)；序列号：48(VL CDR3)
051-054抗体序列号：49(VH)；序列号：50(VH CDR1)；序 列号：51(VH CDR2)；序列号：52(VH CDR3)；序列号：53(VL)； 序列号：54(VL CDR1)；序列号：55(VL CDR2)；序列号：56(VL CDR3)
051-181抗体序列号：57(VH)；序列号：58(VH CDR1)；序 列号：59(VH CDR2)；序列号：60(VH CDR3)；序列号：61(VL)； 序列号：62(VL CDR1)；序列号：63(VL CDR2)；序列号：64(VL CDR3)
051-129抗体序列号：221(VH)；序列号：222(VH CDR1)； 序列号：223(VH CDR2)；序列号：224(VH CDR3)；序列号：225 (VL)；序列号：226(VL CDR1)；序列号：227(VL CDR2)；序列号： 228(VL CDR3)
035-130抗体序列号：229(VH)；序列号：230(VH CDR1)； 序列号：231(VH CDR2)；序列号：232(VH CDR3)；序列号：233 (VL)；序列号：234(VL CDR1)；序列号：235(VL CDR2)；序列号： 236(VL CDR3)
035-169抗体序列号：237(VH)；序列号：238(VH CDR1)； 序列号：239(VH CDR2)；序列号：240(VH CDR3)；序列号：241 (VL)；序列号：242(VL CDR1)；序列号：243(VL CDR2)；序列号： 244(VL CDR3)
本发明的抗体的可变区域包括本发明人等成功获得的抗IgSF4抗体 的CDR的至少一部分或与其实质上相同的氨基酸序列。另外，在以下 的说明中，记载特定的氨基酸序列时，除了可知表示其自身的情况外， 还意味着“该特定的氨基酸序列或与其实质上相同的氨基酸”。例如， 记载为序列号：1的氨基酸序列时，通常是指“序列号：1的氨基酸序 列或与其实质上相同的氨基酸”。
具体而言，例如，本发明的抗体的重链可变区域含有至少一个选自 以下的组中的氨基酸序列作为CDR的一部分或全部(例如作为CDR3 而含有)：(1)序列号：2的氨基酸序列、(2)序列号：3的氨基酸序列、 (3)序列号：4的氨基酸序列、(4)序列号：10的氨基酸序列、(5) 序列号：11的氨基酸序列、(6)序列号：12的氨基酸序列、(7)序列 号：18的氨基酸序列、(8)序列号：19的氨基酸序列、(9)序列号： 20的氨基酸序列、(10)序列号：26的氨基酸序列、(11)序列号：27 的氨基酸序列、(12)序列号：28的氨基酸序列、(13)序列号：34的 氨基酸序列、(14)序列号：35的氨基酸序列、(15)序列号：36的氨 基酸序列、(16)序列号：42的氨基酸序列、(17)序列号：43的氨基 酸序列、(18)序列号：44的氨基酸序列、(19)序列号：50的氨基酸 序列、(20)序列号：51的氨基酸序列、(21)序列号：52的氨基酸序 列、(22)序列号：58的氨基酸序列、(23)序列号：59的氨基酸序列、 (24)序列号：60的氨基酸序列、(49)序列号：222的氨基酸序列、(50) 序列号：223的氨基酸序列、(51)序列号：224的氨基酸序列、(52) 序列号：230的氨基酸序列、(53)序列号：231的氨基酸序列、(54) 序列号：232的氨基酸序列、(55)序列号：238的氨基酸序列、(56) 序列号：239的氨基酸序列和(57)序列号：240的氨基酸序列，优选 含有两个(例如作为CDR2和CDR3而含有)，进一步优选含有三个(即 作为CDR1～3而含有)。在此，对于上述(1)、(4)、(7)、(10)、(13)、 (16)、(19)、(22)、(49)、(52)和(55)来说，其作为可变区域的 CDR而被含有时，优选作为CDR1而被含有。同样地，上述(2)、(5)、 (8)、(11)、(14)、(17)、(20)、(23)、(50)、(53)和(56)优选作 为CDR2而被含有，上述(3)、(6)、(9)、(12)、(15)、(18)、(21)、 (24)、(51)、(54)和(57)优选作为CDR3而被含有。
另一方面，本发明的抗体的轻链可变区域含有至少一个选自以下的 组中的氨基酸序列作为CDR的一部分或全部(例如作为CDR3而含有)： (25)序列号：6的氨基酸序列、(26)序列号：7的氨基酸序列、(27) 序列号：8的氨基酸序列、(28)序列号：14的氨基酸序列、(29)序列 号：15的氨基酸序列、(30)序列号：16的氨基酸序列、(31)序列号： 22的氨基酸序列、(32)序列号：23的氨基酸序列、(33)序列号：24 的氨基酸序列、(34)序列号：30的氨基酸序列、(35)序列号：31的 氨基酸序列、(36)序列号：32的氨基酸序列、(37)序列号：38的氨 基酸序列、(38)序列号：39的氨基酸序列、(39)序列号：40的氨基 酸序列、(40)序列号：46的氨基酸序列、(41)序列号：47的氨基酸 序列、(42)序列号：48的氨基酸序列、(43)序列号：54的氨基酸序 列、(44)序列号：55的氨基酸序列、(45)序列号：56的氨基酸序列、 (46)序列号：62的氨基酸序列、(47)序列号：63的氨基酸序列、(48) 序列号：64的氨基酸序列、(58)序列号：的氨基酸序列、(59)序列号： 的氨基酸序列、(60)序列号：的氨基酸序列、(61)序列号：的氨基酸 序列、(62)序列号：的氨基酸序列、(63)序列号：的氨基酸序列、(64) 序列号：的氨基酸序列、(65)序列号：的氨基酸序列和(66)序列号： 的氨基酸序列，优选含有两个(例如作为CDR2和CDR3而含有)，进 一步优选含有三个(即作为CDR1～3而含有)。在此，对于上述(25)、 (28)、(31)、(34)、(37)、(40)、(43)、(46)、(58)、(61)和(64) 来说，其作为可变区域的CDR而被含有时，优选作为CDR1而被含有。 同样地，上述(26)、(29)、(32)、(35)、(38)、(41)、(44)、(47)、(59)、 (62)和(65)优选作为CDR2而被含有，上述(27)、(30)、(33)、 (36)、(39)、(42)、(45)、(48)、(60)、(63)和(66)优选作为CDR3 而被含有。
本发明优选的一种方式的抗体中，重链可变区域的CDR1具有上述 (1)、(4)、(7)、(10)、(13)、(16)、(19)、(22)、(49)、(52)和(55) 中的任一氨基酸序列，重链可变区域的CDR2具有上述(2)、(5)、(8)、 (11)、(14)、(17)、(20)、(23)、(50)、(53)和(56)中的任一氨基 酸序列，重链可变区域的CDR3具有上述(3)、(6)、(9)、(12)、(15)、 (18)、(21)、(24)、(51)、(54)和(57)中的任一氨基酸序列；轻链 可变区域的CDR1具有上述(25)、(28)、(31)、(34)、(37)、(40)、 (43)、(46)、(58)、(61)和(64)中的任一氨基酸序列，轻链可变区 域的CDR2具有上述(26)、(29)、(32)、(35)、(38)、(41)、(44)、 (47)、(59)、(62)和(65)中的任一氨基酸序列，轻链可变区域的 CDR3具有上述(27)、(30)、(33)、(36)、(39)、(42)、(45)、(48)、 (60)、(63)和(66)中的任一氨基酸序列。
本发明进一步优选的一种方式的抗体中，重链可变区域和轻链可变 区域的CDR3为以下(a)～(k)中的任一组合。
(a)重链CDR3：序列号：4的氨基酸序列，轻链CDR3：序列号： 8的氨基酸序列
(b)重链CDR3：序列号：12的氨基酸序列，轻链CDR3：序列 号：16的氨基酸序列
(c)重链CDR3：序列号：20的氨基酸序列，轻链CDR3：序列 号：24的氨基酸序列
(d)重链CDR3：序列号：28的氨基酸序列，轻链CDR3：序列 号：32的氨基酸序列
(e)重链CDR3：序列号：36的氨基酸序列，轻链CDR3：序列 号：40的氨基酸序列
(f)重链CDR3：序列号：44的氨基酸序列，轻链CDR3：序列 号：48的氨基酸序列
(g)重链CDR3：序列号：52的氨基酸序列，轻链CDR3：序列 号：56的氨基酸序列
(h)重链CDR3：序列号：60的氨基酸序列，轻链CDR3：序列 号：64的氨基酸序列
(i)重链CDR3：序列号：224的氨基酸序列，轻链CDR3：序列 号：228的氨基酸序列
(j)重链CDR3：序列号：232的氨基酸序列，轻链CDR3：序列 号：236的氨基酸序列
(k)重链CDR3：序列号：240的氨基酸序列，轻链CDR3：序列 号：244的氨基酸序列
这些组合从上依次为035-029抗体、035-212抗体、035-215抗 体、035-273抗体、035-283抗体、040-131抗体、051-054抗体、 051-181抗体、051-129抗体、035-130抗体和035-169抗体中的 CDR3的组合，可以期待对于IgSF4的高特异性。
本发明更加优选的一种方式的抗体中，重链可变区域和轻链可变区 域的CDR2和CDR3为以下(I)～(v)中的任一组合。
(l)重链CDR2：序列号：3的氨基酸序列，重链CDR3：序列号： 4的氨基酸序列；轻链CDR2：序列号：7的氨基酸序列，轻链CDR3： 序列号：8的氨基酸序列
(m)重链CDR2：序列号：11的氨基酸序列，重链CDR3：序列 号：12的氨基酸序列；轻链CDR2：序列号：15的氨基酸序列，轻链 CDR3：序列号：16的氨基酸序列
(n)重链CDR2：序列号：19的氨基酸序列，重链CDR3：序列 号：20的氨基酸序列；轻链CDR2：序列号：23的氨基酸序列，轻链 CDR3：序列号：24的氨基酸序列
(o)重链CDR2：序列号：27的氨基酸序列，重链CDR3：序列 号：28的氨基酸序列；轻链CDR2：序列号：31的氨基酸序列，轻链 CDR3：序列号：32的氨基酸序列
(p)重链CDR2：序列号：35的氨基酸序列，重链CDR3：序列 号：36的氨基酸序列；轻链CDR2：序列号：39的氨基酸序列，轻链 CDR3：序列号：40的氨基酸序列
(q)重链CDR2：序列号：43的氨基酸序列，重链CDR3：序列 号：44的氨基酸序列；轻链CDR2：序列号：47的氨基酸序列，轻链 CDR3：序列号：48的氨基酸序列
(r)重链CDR2：序列号：51的氨基酸序列，重链CDR3：序列 号：52的氨基酸序列；轻链CDR2：序列号：55的氨基酸序列，轻链 CDR3：序列号：56的氨基酸序列
(s)重链CDR2：序列号：59的氨基酸序列，重链CDR3：序列 号：60的氨基酸序列；轻链CDR2：序列号：63的氨基酸序列，轻链 CDR3：序列号：64的氨基酸序列
(t)重链CDR2：序列号：223的氨基酸序列，重链CDR3：序列 号：224的氨基酸序列；轻链CDR2：序列号：227的氨基酸序列，轻 链CDR3：序列号：228的氨基酸序列
(u)重链CDR2：序列号：231的氨基酸序列，重链CDR3：序列 号：232的氨基酸序列；轻链CDR2：序列号：235的氨基酸序列，轻 链CDR3：序列号：236的氨基酸序列
(v)重链CDR2：序列号：239的氨基酸序列，重链CDR3：序列 号：240的氨基酸序列；轻链CDR2：序列号：243的氨基酸序列，轻 链CDR3：序列号：244的氨基酸序列
这些组合从上依次为035-029抗体、035-212抗体、035-215抗 体、035-273抗体、035-283抗体、040-131抗体、051-054抗体、 051-181抗体、051-129抗体、035-130抗体和035-169抗体中的 CDR2和CDR3的组合，可以期待对于IgSF4的进一步高的特异性。
本发明最优选的一种方式的抗体中，重链可变区域和轻链可变区域 的CDR1～CDR3为以下(A)～(K)中的任一组合。
(A)重链CDR1：序列号：2的氨基酸序列，重链CDR2：序列 号：3的氨基酸序列，重链CDR3：序列号：4的氨基酸序列；轻链CDR1： 序列号：6的氨基酸序列，轻链CDR2：序列号：7的氨基酸序列，轻 链CDR3：序列号：8的氨基酸序列
(B)重链CDR1：序列号：10的氨基酸序列，重链CDR2：序列 号：11的氨基酸序列，重链CDR3：序列号：12的氨基酸序列；轻链 CDR1：序列号：14的氨基酸序列，轻链CDR2：序列号：15的氨基酸 序列，轻链CDR3：序列号：16的氨基酸序列
(C)重链CDR1：序列号：18的氨基酸序列，重链CDR2：序列 号：19的氨基酸序列，重链CDR3：序列号：20的氨基酸序列；轻链 CDR1：序列号：22的氨基酸序列，轻链CDR2：序列号：23的氨基酸 序列，轻链CDR3：序列号：24的氨基酸序列
(D)重链CDR1：序列号：26的氨基酸序列，重链CDR2：序列 号：27的氨基酸序列，重链CDR3：序列号：28的氨基酸序列；轻链 CDR1：序列号：30的氨基酸序列，轻链CDR2：序列号：31的氨基酸 序列，轻链CDR3：序列号：32的氨基酸序列
(E)重链CDR1：序列号：34的氨基酸序列，重链CDR2：序列 号：35的氨基酸序列，重链CDR3：序列号：36的氨基酸序列；轻链 CDR1：序列号：38的氨基酸序列，轻链CDR2：序列号：39的氨基酸 序列，轻链CDR3：序列号：40的氨基酸序列
(F)重链CDR1：序列号：42的氨基酸序列，重链CDR2：序列 号：43的氨基酸序列，重链CDR3：序列号：44的氨基酸序列；轻链 CDR1：序列号：46的氨基酸序列，轻链CDR2：序列号：47的氨基酸 序列，轻链CDR3：序列号：48的氨基酸序列
(G)重链CDR1：序列号：50的氨基酸序列，重链CDR2：序列 号：51的氨基酸序列，重链CDR3：序列号：52的氨基酸序列；轻链 CDR1：序列号：54的氨基酸序列，轻链CDR2：序列号：55的氨基酸 序列，轻链CDR3：序列号：56的氨基酸序列
(H)重链CDR1：序列号：58的氨基酸序列，重链CDR2：序列 号：59的氨基酸序列，重链CDR3：序列号：60的氨基酸序列；轻链 CDR1：序列号：62的氨基酸序列，轻链CDR2：序列号：63的氨基酸 序列，轻链CDR3：序列号：64的氨基酸序列
(I)重链CDR1：序列号：222的氨基酸序列，重链CDR2：序列 号：223的氨基酸序列，重链CDR3：序列号：224的氨基酸序列；轻 链CDR1：序列号：226的氨基酸序列，轻链CDR2：序列号：227的氨 基酸序列，轻链CDR3：序列号：228的氨基酸序列
(J)重链CDR1：序列号：230的氨基酸序列，重链CDR2：序列 号：231的氨基酸序列，重链CDR3：序列号：232的氨基酸序列；轻 链CDR1：序列号：234的氨基酸序列，轻链CDR2：序列号：235的氨 基酸序列，轻链CDR3：序列号：236的氨基酸序列
(K)重链CDR1：序列号：238的氨基酸序列，重链CDR2：序列 号：239的氨基酸序列，重链CDR3：序列号：240的氨基酸序列；轻 链CDRI：序列号：242的氨基酸序列，轻链CDR2：序列号：243的氨 基酸序列，轻链CDR3：序列号：244的氨基酸序列
这些组合从上依次为035-029抗体、035-212抗体、035-215抗 体、035-273抗体、035-283抗体、040-131抗体、051-054抗体、 051-181抗体、051-129抗体、035-130抗体和035-169抗体中的 CDR1～CDR3的组合，可以期待对于IgSF4的更加进一步高的特异性。
本发明的抗体的可变区域中的构架区域(FR区域)的序列只要对 IgSF4的特异结合性没有实质影响，则没有特别限定。例如，将本发明 的抗体作为人源化抗体进行构建时，可以使用公知的人抗体的FR区域。 此外，对作为检测用的试药使用的抗体或对人以外的动物种适用的抗体 进行构建时等，有即使不使用人抗体FR区域也发挥所期待的效果的情 况，或有使用人抗体FR区域反而不适当的情况。在这样的情况下，可 以使用人以外的动物种(例如小鼠或大鼠)的FR区域。
本发明的抗体在一种方式中，除了可变区域外，还包括恒定区域(例 如IgG型抗体的情况等)。该方式中的恒定区域的序列没有特别限定。 例如，如后所述，将本发明的抗体作为人源化抗体进行构建时，可以使 用公知的人抗体的恒定区域。此外，与上述FR区域相同，可以使用人 以外的动物种(例如小鼠或大鼠)的恒定区域。
本发明的抗体的一种形态是人源化抗体。此处的“人源化抗体”是 指使结构类似于人的抗体的抗体，包括只将抗体的恒定区域置换成人抗 体的人型嵌合抗体，以及将存在于恒定区域和可变区域的CDR(互补 性决定区域)以外的部分置换成人抗体的人型CDR移植(CDR-grafted) 抗体(P.T.Johons et al.，Nature321,522(1986))。为了提高人型CDR 移植抗体的抗原结合活性，已经开发出了如下方法的改良技术(参照美 国专利第5585089号、美国专利第5693761号、美国专利第5693762号、 美国专利第6180370号、欧洲专利第451216号、欧洲专利第682040号、 特许第2828340号等)：选择与小鼠抗体同源性高的人抗体FR的方法， 制作同源性高的人源化抗体的方法，将小鼠CDR移植到人抗体之后进 一步取代FR区域的氨基酸的方法，可以用于制作本发明的人型抗体。
人型嵌合抗体可以通过如下方式制作：将具有上述的H链可变区域 的结构和/或L链可变区域的结构的抗体的恒定区域置换成人抗体的恒 定区域。作为人抗体的恒定区域，可以采用公知的物质。以下，示出人 型嵌合抗体的一例制作方法。
首先，从产生小鼠IgSF4抗体的杂交瘤中提取mRNA，根据常规方 法合成cDNA。将合成的cDNA组入到载体中来构建cDNA文库。通过 将H链基因片段和L链基因片段作为探针来使用，从该cDNA文库中 选择含有H链基因和L链基因的载体。通过进行所选出的载体的插入 序列的筛选，确定H链可变区域和L链可变区域的基因序列。通过化 学合成、生物化学的切断/再结合等制作以如此得到的序列数据为基础 编码H链可变区域的DNA。将得到的编码H链可变区域的DNA和编 码人H链恒定区域的DNA连接而组入表达用载体，来制作H链表达载 体。作为表达载体，例如可以使用基于SV40病毒的载体、基于EB病 毒的载体、基于BPV(乳头状瘤病毒)的载体等，但不限于这些。另一 方面，通过同样的方法制作L链表达载体。通过这些H链表达载体和L 链表达载体对宿主细胞进行共转化。作为宿主细胞，优选使用CHO细 胞(中国仓鼠卵巢细胞)(A.Wright & S.L.Morris on，J.Immunol.160， 3393-3402(1998))、SP2/0细胞(小鼠骨髓瘤细胞)(K.Motmans et al.， Eur.J.Cancer Prev.5,512-519(1996)，R.P.Junghans et al.，Cancer Res.50，1495-1502(1990))等。此外，转化优选使用脂质转染法(R. W.Malone et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86，6077(1989)，P.L. Felgner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84，7413(1987)，电穿孔法，磷 酸钙法(F.L.Graham&A.J.Van der Eb，Virology52,456-467(1973))， DEAE-Dextran法等。
将转化体培养后，从转化体的细胞内或培养液中分离人型嵌合抗 体。抗体的分离、纯化可以将如下方法适当组合来使用：离心分离、硫 酸铵分级分离、盐析、超临界过滤、亲和色谱、离子交换色谱、凝胶过 滤色谱等的方法。
另一方面，人型CDR移植抗体例如可以通过以下方法来制作。首 先，通过在上述嵌合抗体的制造方法一项中叙述的方法，确定小鼠抗 IgSF4抗体的H链可变区域和L链可变区域的氨基酸序列和编码其的碱 基序列。并且确定各CDR区域的氨基酸序列和碱基序列。
作为具体的CDR的碱基序列，可以使用例如以下的碱基序列。
H链CDR1(VH CDR1)：序列号：66、74、82、90、98、106、114、 122、246、254和262中的任一碱基序列
H链CDR2(VH CDR2)：序列号：67、75、83、91、99、107、115、 123、247、255和263中的任一碱基序列
H链CDR3(VH CDR3)：序列号：68、76、84、92、100、108、 116、124、248、256和264中的任一碱基序列
L链CDR1(VL CDR1)：序列号：70、78、86、94、102、110、 118、126、250、258和266中的任一碱基序列
L链CDR2(VL CDR2)：序列号：71、79、87、95、103、111、119、 127、251、259和267中的任一碱基序列
L链CDR3(VL CDR3)：序列号：72、80、88、96、104、112、 120、128、252、260和268中的任一碱基序列
作为CDR的碱基序列，优选使用以下的任一组合。
(1)VH CDR1：序列号：66的碱基序列、VH CDR2：序列号： 67的碱基序列、VH CDR3：序列号：68的碱基序列、VL CDR1：序列 号：70的碱基序列、VL CDR2：序列号：71的碱基序列和VL CDR3： 序列号：72的碱基序列的组合
(2)VH CDR1：序列号：74的碱基序列、VH CDR2：序列号： 75的碱基序列、VH CDR3：序列号：76的碱基序列、VL CDR1：序列 号：78的碱基序列、VL CDR2：序列号：79的碱基序列和VL CDR3： 序列号：80的碱基序列的组合
(3)VH CDR1：序列号：82的碱基序列、VH CDR2：序列号： 83的碱基序列、VH CDR3：序列号：84的碱基序列、VL CDR1：序列 号：86的碱基序列、VL CDR2：序列号：87的碱基序列和VL CDR3： 序列号：88的碱基序列的组合
(4)VH CDR1：序列号：90的碱基序列、VH CDR2：序列号： 91的碱基序列、VH CDR3：序列号：92的碱基序列、VL CDR1：序列 号：94的碱基序列、VL CDR2：序列号：95的碱基序列和VL CDR3： 序列号：96的碱基序列的组合
(5)VH CDR1：序列号：98的碱基序列、VH CDR2：序列号： 99的碱基序列、VH CDR3：序列号：100的碱基序列、VL CDR1：序 列号：102的碱基序列、VL CDR2：序列号：103的碱基序列和VL CDR3： 序列号：104的碱基序列的组合
(6)VH CDR1：序列号：106的碱基序列、VH CDR2：序列号： 107的碱基序列、VH CDR3：序列号：108的碱基序列、VL CDR1：序 列号：110的碱基序列、VL CDR2：序列号：111的碱基序列和VL CDR3： 序列号：112的碱基序列的组合
(7)VH CDR1：序列号：114的碱基序列、VH CDR2：序列号： 115的碱基序列、VH CDR3：序列号：116的碱基序列、VL CDR1：序 列号：118的碱基序列、VL CDR2：序列号：119的碱基序列和VL CDR3： 序列号：120的碱基序列的组合
(8)VH CDR1：序列号：122的碱基序列、VH CDR2：序列号： 123的碱基序列、VH CDR3：序列号：124的碱基序列、VL CDR1：序 列号：126的碱基序列、VL CDR2：序列号：127的碱基序列和VL CDR3： 序列号：128的碱基序列的组合
(9)VH CDR1：序列号：246的碱基序列、VH CDR2：序列号： 247的碱基序列、VH CDR3：序列号：248的碱基序列、VL CDR1：序 列号：250的碱基序列、VL CDR2：序列号：251的碱基序列和VL CDR3： 序列号：252的碱基序列的组合
(10)VH CDR1：序列号：254的碱基序列、VH CDR2：序列号： 255的碱基序列、VH CDR3：序列号：256的碱基序列、VL CDR1：序 列号：258的碱基序列、VL CDR2：序列号：259的碱基序列和VL CDR3： 序列号：260的碱基序列的组合
(11)VH CDR1：序列号：262的碱基序列、VH CDR2：序列号： 263的碱基序列、VH CDR3：序列号：264的碱基序列、VL CDR1：序 列号：266的碱基序列、VL CDR2：序列号：267的碱基序列和VL CDR3： 序列号：268的碱基序列的组合
另外，这些组合从上依次相当于035-029抗体、035-212抗体、 035-215抗体、035-273抗体、035-283抗体、040-131抗体、051 -054抗体、051-181抗体、051-129抗体、035-130抗体和035-169 抗体中的各CDR的组合。
接着，选择夹持CDR区域而存在的FR(构架区域)。FR的选择可 以采用约三种方法。第1种方法是使用NEWM、REI等已经明确三维 结构的人抗体构架的方法(Riechmann L.et al.，Nature332,323-327 (1988)；Tempst，PR.et al.，Protein Engineering7，1501-1507(1994)； Ellis JH.et al.，J.Immunol155，925-937(1995))。第2种方法是从数据 库选择目的小鼠抗体可变区域和具有最高同源性的人抗体可变区域，使 用其的FR的方法(Queen C.et al.，Proc Natl Acad Sci USA86， 10029-10033(1989)；Rozak MJ.et al.，J Biol Chem271，22611-22618 (1996)；Shearm an CW.et al.，J.Immunol147，4366-4373(1991))。 第3种方法是在人抗体的FR中选择最通用的氨基酸的方法(Sato K.et al.，Mol Immunol31,371-381(1994)；Kobinger F.et al.，Protein Engineering6,971-980(1993)；Kettle borough CA.et al.，Protein Engineering4,773-783(1991))。在本发明中还可以使用这些任何的方 法。
另外，即使是将选出的人FR的氨基酸序列改变而得到的氨基酸序 列，只要最终得到的人型CDR移植抗体具有对IgSF4的特异结合性， 则可以用作FR的氨基酸序列。特别是，将选出的人FR的氨基酸序列 的一部分变更为成为CDR来源的抗体的FR的氨基酸序列时，维持抗 体特性的可能性高。被改变的氨基酸数目优选为FR整体的30％以下， 进一步优选为FR整体的20％以下，更加进一步优选为FR整体的10 ％以下。
接着，通过将采用这些任一种方法选出的FR与上述CDR组合， 来设计编码H链可变区域和L链可变区域的DNA。通过化学合成、生 物化学的切断/再结合等分别制作以该设计为基础编码H链可变区域的 DNA和编码L链可变区域的DNA。接着将编码H链可变区域的DNA 和编码人免疫球蛋白H链恒定区域的DNA一起组入表达载体中，来构 建H链表达载体。同样地，将编码L链可变区域的DNA和编码人免疫 球蛋白L链恒定区域的DNA一起组入表达载体中，来构建L链表达载 体。作为表达载体，例如可以使用基于SV40病毒的载体、基于EB病 毒的载体、基于BPV(乳头状瘤病毒)的载体等，但不限于这些。
通过采用以上方法制作的H链表达载体和L链表达载体对宿主细 胞进行共转化。作为宿主细胞，优选使用CHO细胞(中国仓鼠卵巢细 胞)(A.Wright&S.L.Morrison，J.Immunol.160，3393-3402(1998))、 SP2/0细胞(小鼠骨髓瘤细胞)(K.Motmans et al.Eur.J.Cancer Prev.5,512-519(1996)，R.P.Junghans et al.，Cancer Res.50，1495- 1502(1990))等。此外，转化优选使用脂质转染法(R.W.Malone et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA86，6077(1989)，P.L.Felgner et al.，Proc. Natl.Acad.Sci.USA84，7413(1987)，电穿孔法，磷酸钙法(F.L. Graham & A.J.Van der Eb，Virology 52,456-467(1973))， DEAE-Dextran法等。
将转化体培养后，从转化体的细胞内或培养液中分离人型CDR移 植抗体。抗体的分离、纯化可以将如下方法适当组合来使用：离心分离、 硫酸铵分级分离、盐析、超临界过滤、亲和色谱、离子交换色谱、凝胶 过滤色谱等的方法。
可以以本发明的抗体为基础或以编码本发明的抗体的基因的序列 信息为基础来制作抗体片段。作为抗体片段，可以举出Fab、Fab’、 F(ab’)2、scFv、dsFv抗体。
Fab是通过在半胱氨酸的存在下用木瓜蛋白酶消化IgG而得到的分 子量约5万的片段，其由L链和H链可变区域、以及含有CH1结构域 和铰合部的一部分的H链片段构成。在本发明中，可以通过用木瓜蛋白 酶消化上述抗体而得到。此外，还可以将编码上述抗体的H链的一部分 和L链的DNA组入适当的载体中，由使用该载体转化的转化体来调制 Fab。
Fab’是分子量约5万的片段，通过切断后述的F(ab’)2的H链之间 的二硫键来得到。本发明中，将上述抗体用胃蛋白酶消化，使用还原剂 切断二硫键来得到。此外，与Fab相同，还可以使用编码Fab’的DNA 以基因工程学的方式进行调制。
F(ab’)2是通过用胃蛋白酶消化IgG而得到的分子量约10万的片段， 其是由L链和含有H链可变区域、以及CH1结构域和铰合部的一部分 的H链片段构成的F(ab’)用二硫键结合的。本发明中，将上述抗体用胃 蛋白酶消化来得到。此外，与Fab相同，还可以使用编码F(ab’)2的DNA 来基因工程学地进行调制。
scFv是将由H链可变区域和L链可变区域构成的Fv用适当的肽连 接体连接一条链的C末端和另一条链的N末端而形成一条链的抗体片 段。作为肽连接体，可以使用例如柔软性高的(GGGGS)3等。例如， 可以如下调制scFv：使用编码上述抗体的H链可变区域和L链可变区 域的DNA和编码肽连接体的DNA来构建编码scFv抗体的DNA，将其 组入适当的载体中，使用该载体转化的转化体来调制scFv。
dsFv是将Cys残基导入H链可变区域和L链可变区域的适当位置， 通过二硫键使H链可变区域和L链可变区域稳定化的Fv片段。各链中 的Cys残基的导入位置根据通过分子模型预测的立体结构来决定。本发 明中，例如，可以如下调制dsFv：从上述抗体的H链可变区域和L链 可变区域的氨基酸序列预测立体结构，构建分别编码基于所述预测而导 入有变异的H链可变区域和L链可变区域的DNA，将其组入到适当的 载体中，接着使用该载体转化的转化体来调制dsFv。
另外，还可以使用适当的连接体来连接scFv抗体、dcFv抗体等， 或使链霉抗生物素融合来将抗体片段多聚体化。
通过使低分子化合物、蛋白质、标识物质等与本发明的抗体(包括 抗体片段)融合或结合，可以构成融合抗体或标识化抗体。作为标识物 质，可以使用125I等放射性物质、过氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶、 微过氧化物酶、辣根过氧化物酶(HRP)、异硫氰酸荧光素(FITC)、 异硫氰酸罗丹明(RITC)、碱性磷酸酶、生物素等。
由于本发明的抗体(包括抗体片段)具有对IgSF4的特异结合性， 所以对于特异性表达IgSF4的癌细胞(例如肺癌细胞及肝癌细胞)特异 性地结合。只要利用该特性，就可以进行癌细胞(或癌组织)的标识、 检测等。此外，还可期待发挥通过向癌细胞结合的细胞毒作用。实际上， 如后述的实施例所示，035-029抗体、035-273抗体和051-054抗体 被确认有ADCC活性，所以可以将其自身用于癌细胞的伤害(杀伤)。 在此，只要使用经人源化的本发明的抗体，则难以被免疫系统攻击、排 除，良好地发挥所期待的作用，同时可以避免产生严重的副作用。
进而，还可以将本发明的抗体作为用于将药物等特异性地送达肝癌 细胞的介质(输送体)来使用。即，作为本发明的抗体的用途，设想为 以肝癌细胞为目标的DDS(Drug delivery system)。
在此可知，在使用本发明人等成功获得的抗体的免疫染色实验中， 035-273抗体、051-054抗体特异性地识别分化程度低的肝癌细胞。 治疗分化程度低的肝癌一般是困难的，预后非常不好。035-273抗体等 可以特异性地识别这样的治疗困难的癌细胞，在治疗用途和诊断用途中 有很高的价值。例如，如果将035-273抗体作为药剂的输送体来使用， 则可以将药剂特异性地送达低分化型肝癌，可期望高的治疗效果。此外， 如果将该抗体作为免疫染色用的抗体使用，则可以得到反映分化程度的 染色结果。即，如果使用该抗体，则可以高精度地判定癌细胞的分化程 度。这样，该抗体在诊断用途中也是非常有用的。
另外，对于本发明的抗体的各用途在以下详细说明。
(诊断用途)
本发明的其他方面涉及：基于IgSF4在肝癌细胞特异性表达的认 识，作为IgSF4的诊断标记的利用。这种方面的一种方式涉及获得肝癌 或成人T细胞白血病诊断用的信息的方法，包括下面的步骤。
步骤(1)：准备从活体分离得到的受检细胞的步骤。
步骤(2)：以受检细胞为对象检测IgSF4的步骤。
用该方法得到的信息(检测结果)被用于判定受检细胞是否是肝癌 细胞，或者用于判定受检细胞是否是成人T细胞白血病细胞。
在此，如后述的实施例所示，使用抗IgSF4抗体将恶性程度(分化 程度)不同的多个肝癌细胞免疫染色后，看到染色性显著不同。即，可 知肝癌细胞的恶性程度和IgSF4的表达量之间存在强关联性，表明作为 用于判定肝癌细胞恶性程度的标记，IgSF4是有效的。基于该认识，本 发明的其他方式中，提供将上述步骤的检测结果用于判定受检肝细胞的 恶性程度的方法，即判定肝癌细胞的恶性程度的方法。
本发明方法的检测结果在肝癌的诊断或成人T细胞白血病的诊断方 面是有益的。例如，以肝癌患者为对象实施上述方法而得到的信息可以 用于该患者的病情评价或把握、治疗效果的评价等。例如，如果治疗肝 癌的同时实施本发明的方法，则可以基于结果得到的信息评价治疗效 果。具体地说，通过给予药剂后实施本发明的方法，可以研究肝细胞中 的IgSF4的表达量的变化，由表达量的增减来判定治疗效果。这样，可 以将本发明的方法用于治疗效果的监测。
另一方面，以患者以外的人、即不认定为肝癌的人为对象时得到的 信息可以用于是否患有肝癌的判定、患病风险的评价等。根据本发明的 方法可进行基于称为基因的表达量的客观性优异的指标的肝癌的诊断， 所以可以说其价值非常高。
以下，详细说明构成本发明的各步骤。
1.步骤(1)
在步骤(1)中，准备从活体(受检者、活体)分离得到的细胞。 不限于患者(肝癌患者或成人T细胞白血病患者)，还可以将健康者(包 括可能有肝癌或成人T细胞白血病的人)作为此处的对象。例如，可以 把用活组织检查采取的、对象的肝脏的一部分作为受检细胞，供于本发 明的方法。
本发明中的“受检细胞(受检肝细胞或受检T细胞)”是成为本发 明的方法中进行检测时的样品(对象)的细胞。受检细胞从活体中被分 离。即，从活体中分离得到的状态的受检细胞，适用本发明。“从活体 中分离得到的”是指，通过摘出有受检细胞存在的活体组织的一部分， 受检细胞与其来源的活体完全被隔离的状态。步骤(2)中，采用免疫 学的检测法时，受检细胞通常以在活体中存在的状态、即与周围细胞结 合的状态(制成组织片)被调制，而被用于本发明的方法。另外，可以 将受检细胞从周围的细胞中分离后用于本发明的方法。
作为受检细胞使用肝细胞，将检测结果用于判定受检细胞的恶性程 度时，作为受检细胞，优选采用通过其他诊断法判断为癌的肝细胞、判 断为肝癌的可能性高的肝细胞、或者具有肝癌可能性的肝细胞。优选使 用通过其他诊断法判断为肝癌的肝细胞、或判断为肝癌的可能性高的肝 细胞。作为此处的其他诊断法，是指例如X射线造影检查、内窥镜检查、 超声波检查、CT检查、MRI检查、PET检查、使用肿瘤标记的诊断法 等。通常从通过这些方法的一种以上疑为肝癌的组织中采取受检细胞 (受检肝细胞)。
本发明中的“肝癌”是广义解释，包括肝癌瘤和肝肉瘤。此外，本 发明中的用语“癌”与“肿瘤”可互换使用。此外，病理学确定诊断的 前阶段，即确定为作为肿瘤的良性、恶性的哪一种之前，有时概括地包 括良性肿瘤、良性恶性交界病变、恶性肿瘤。
2.步骤(2)
在步骤(2)中，以准备好的受检细胞为对象来检测IgSF4。“检测 IgSF4”是指调查IgSF4是否表达(有无表达)，或以IgSF4的表达量为 绝对量或相对量来把握。此处的相对量的基准可以设为例如根据恶性程 度准备的标准样品的IgSF4量。通常，研究IgSF4有无表达、和表达时 其的量。检测IgSF4时不必需严格地定量IgSF4的量。例如，使用肝细 胞为受检细胞，为了判定受检细胞(受检肝细胞)恶性程度而检测IgSF4 时，可以通过与成为恶性程度指标的对照的IgSF4量进行比较，以能够 判定受检细胞恶性程度的程度来测定IgSF4的量。
本发明的一种方式中，实施以作为IgSF4转录产物的mRNA为目 标的检测法。mRNA的检测(测定)可以采用RT-PCR法、使用特异 性探针的各种杂交法(例如Northern杂交、in situ杂交)等常规方法。 在本发明的其他方式中，实施以IgSF4表达产物(蛋白质)为目标的检 测法。
优选用免疫学方法(例如免疫组织化学染色法)检测IgSF4。在免 疫学方法中，使用抗IgSF4抗体，以该抗体的结合性(结合量)为指标 来检测IgSF4蛋白质。通过免疫学检测法可以进行迅速且高灵敏度的检 测。此外，操作也简便。另外，作为检测方法，可以举出例如ELISA 法、放射免疫测定、FCM、免疫沉淀法、免疫印迹法等方法。
通过免疫组织化学染色法，可以快速且高灵敏度地检测IgSF4。此 外，操作也简便。因此，伴随IgSF4的检测的对受检者(患者)的负担 变小。
在免疫组织化学染色法中，通常，首先实施使抗IgSF4抗体接触受 检细胞的步骤，然后，调查抗IgSF4的结合量。具体地说，可以根据以 下所示的免疫组织化学染色法实施本发明的方法。
活体组织的免疫组织化学染色一般以以下的顺序(1)～(9)来实 施。另外，对于活体组织的免疫组织化学染色法可以参照各种文献和书 籍(例如《酶抗体法、修订第3版》，渡边庆一、中根一穗编集，学际 企画)。
(1)固定-石蜡包埋
将从活体外科采取的组织通过福尔马林、多聚甲醛、无水乙醇等进 行固定。其后进行石蜡包埋。一般用醇进行脱水之后，用二甲苯进行处 理，最后用石蜡包埋。将用石蜡包埋的标本薄切成所希望的厚度(例如 3～5μm厚)，使其在载片玻璃上伸展。另外，有时取代石蜡包埋标本而 使用醇固定标本、干燥封入的标本、冻结标本等。
(2)脱石蜡
一般用二甲苯、醇和纯水依次进行处理。
(3)前处理(抗原赋活)
根据需要，为了抗原赋活，进行酶处理、加热处理和/或加压处理 等。
(4)除去内因性过氧化物酶
在使用过氧化物酶作为染色时的标识物质的情况下，预先用过氧化 氢水处理来将内因性过氧化物酶活性除去。
(5)抑制非特异性反应
将切片在牛血清白蛋白溶液(例如1％溶液)中处理数分钟到数十 分钟左右来抑制非特异性反应。另外，使用含有牛血清白蛋白的抗体溶 液来进行下面的一次抗体反应，也可以省略该工序。
(5)一次抗体反应
将稀释成适当浓度的抗体滴落在载片玻璃上的切片上，其后使其反 应数十分钟～数小时。反应结束后，用磷酸缓冲液等适当的缓冲液进行 洗净。
(6)标识试剂的添加
作为标识物质多使用过氧化物酶。将与过氧化物酶结合的2次抗体 滴落在载片玻璃上的切片上，其后使其反应数十分钟～数小时。反应结 束后，用磷酸缓冲液等适当的缓冲液进行洗净。
(7)显色反应
在Tris缓冲液中溶解DAB(3，3’-二氨基联苯胺)。接着添加过氧化 氢水。使如此制得的显色用溶液渗透到切片中数分钟(例如5分钟)， 使其显色。显色后，将切片用自来水充分洗净，将DAB除去。
(8)核染色
使迈氏苏木精反应数秒～数十秒来进行核染色。用流水洗净，显示 颜色(通常为数分钟)。
(9)脱水、渗透、封装
用醇进行脱水后，用二甲苯进行渗透处理，最后用合成树脂、甘油、 胶浆等进行封装。
免疫学染色法中使用的抗IgSF4抗体只要具有对IgSF4的特异结合 性，则其种类及来源等没有特别限定。抗IgSF4抗体可以是多克隆抗体、 寡克隆抗体(数种～数十种抗体的混合物)和单克隆抗体中的任一种。 作为多克隆抗体或寡克隆抗体，除了进行动物免疫而得到的抗血清来源 的IgG部分之外，还可以使用由抗原来亲和纯化的抗体。抗IgSF4抗体 可以是Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、dsFv抗体等抗体片段。
抗IgSF4抗体可以利用免疫学方法、噬菌体展示法、核糖体展示法 等来进行调制。
利用免疫学方法的多克隆抗体的调制可以按下面的顺序进行。调制 抗原(IgSF4或其一部分)，使用其对兔子等动物实施免疫。作为抗原， 除了人IgSF4以外，可以使用小鼠IgSF4等人以外物种的IgSF4。这些 IgSF4可以通过纯化活体样品而得到。此外，也可以使用重组IgSF4。 重组人IgSF4可以如下调制：例如，将编码IgSF4的基因(可以是基因 的一部分)使用载体导入到适当的宿主中，在得到重组细胞内使其表达 来调制。
为了增强免疫激发作用，可以使用结合有载体蛋白的抗原。作为载 体蛋白，使用KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin)、BSA(Bovine Serum Albumin)、OVA(Ovalbumin)等。载体蛋白的结合可以使用碳二酰亚 胺法、戊二醛法、重氮缩合法、MBS(马来酰亚胺苄基氧琥珀酰亚胺) 法等。另一方面，还可以使用使IgSF4(或其一部分)与GST、β-半 乳糖苷酶、麦芽糖结合蛋白、或组氨酸(His)标志(tag)等作为融合 蛋白质表达的抗原。这样的融合蛋白质可以通过通用的方法来简便地纯 化。
根据需要，反复免疫，在抗体效价充分上升的时刻进行采血，通过 离心处理等来得到血清。将得到的抗血清进行亲和纯化，制作多克隆抗 体。
另一方面，对于单克隆抗体可以按下面的顺序进行调制。首先，用 与上述相同的顺序实施免疫操作。根据需要反复免疫，在抗体效价充分 上升的时刻从免疫动物中摘出抗体产生细胞。接着，将得到的抗体产生 细胞与骨髓瘤细胞进行融合得到杂化体。接着，将该杂化体进行单克隆 化后，选择产生对目的蛋白质具有高特异性的抗体的克隆。通过纯化选 出的克隆的培养液，可以得到目的抗体。另一方面，可以使杂化体增殖 到所希望的数量以上之后，将其移植到动物(例如小鼠)的腹腔内，在 腹水内使其增殖，通过纯化腹水，来获得目的抗体。上述培养液的纯化 或腹水的纯化优选使用利用了蛋白G、蛋白A等的亲和色谱法。此外， 还可以使用将抗原固相化而进行的亲和色谱法。进而，还可以使用离子 交换色谱法、凝胶过滤色谱法、硫酸铵分级分离和离心分离等的方法。 这些方法可以单独或任意组合来使用。
以保持对IgSF4的特异结合性为条件，可以对所得抗体实施各种改 变。本发明中，可以利用这样的改变抗体。
如果使用标识化抗体作为抗IgSF4抗体，则可以直接检测以标识量 为指标的结合抗体量。因此，成为更简易的方法。其反面是，除了必需 准备结合有标识物质的抗IgSF4抗体之外，还有检测灵敏度通常变低的 问题。因此，优选利用结合有标识物质的二次抗体的方法，利用结合有 二次抗体和标识物质的聚合物的方法等间接的检测方法。此处的二次抗 体是指对抗IgSF4抗体具有特异结合性的抗体，例如调制作为兔子抗体 的抗IgSF4抗体时可以使用抗兔子IgG抗体。市售有能够对兔子、山羊、 小鼠等各种种类的抗体使用的标识二次抗体(例如FUNAKOSHI公司、 COSMO BIO公司等)，可以根据本发明中使用的抗IgSF4抗体适当选 择合适的物质使用。
标识物质优选使用选自过氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶、微过氧 化物酶、辣根过氧化物酶(HRP)、异硫氰酸荧光素(FITC)、异硫氰 酸罗丹明(RITC)、碱性磷酸酶、生物素和放射性物质中任意的物质。 特别是，根据将生物素作为标识物质使用来使抗生物素蛋白过氧化物酶 反应的方法可以进行高灵敏度的检测。
可以将上述本发明的抗体作为此处的IgSF4抗体来利用。具体地说， 可以利用例如本发明人等成功获得的抗体(035-029抗体、035-212 抗体、035-215抗体、035-273抗体、035-283抗体、040-131抗体、 051-054抗体、051-181抗体、051-129抗体、035-130抗体或035 -169抗体)。如后述的实施例所示，在成功获得的抗体中使用035-273 抗体等时，可以明确地染色区分恶性程度不同的癌。因此，在判定肝癌 细胞恶性程度的方法中该抗体的利用价值尤其高。
在本发明的恶性程度判定法中，可典型地判定受检细胞(受检肝细 胞)是否被分类为对应于IgSF4表达量的多个区分的任一种。此处的区 分数没有特别限定。例如可以设为3级区分(具体而言，例如恶性程度 1(高分化型)：未检出IgSF4，恶性程度2(中分化型)：IgSF4表达量 少，恶性程度3(低分化型或未分化型)：IgSF4表达量多)。
(治疗用途)
本发明进一步的方面涉及基于IgSF4在癌细胞中特异性表达，而利 用ADCC的成为细胞毒标的的认识，在癌治疗用途中利用IgSF4。此外， 涉及基于成人T细胞白血病与IgSF4之间存在关联性的认识，在成人T 细胞白血病治疗用途中利用IgSF4。另外，作为ADCC活性等的细胞毒 的标的，IgSF4是有效的，这在鉴定本发明人等成功获得的肝癌特异性 抗体的抗原的过程中首次明确。根据该成果，可判断抗IgSF4抗体是癌 细胞特异性伤害方面有效的药剂。
在该方面，首先，通过将IgSF4作为标的使用，提供能够特异性作 用于癌细胞而将其伤害的药物制剂(癌治疗剂)及使用其的治疗方法， 或能够作用于成人T细胞白血病细胞而将其伤害的药物制剂(成人T 细胞白血病治疗剂)及使用其的治疗方法。在本发明的药物制剂的一种 方式中，抗IgSF4抗体作为有效成分被含有。在本发明药物制剂优选的 一种方式中，具有ADCC活性的抗IgSF4抗体作为有效成分被含有。 在该方式的药物制剂中，通过利用ADCC活性的细胞毒作用可以获得 治疗效果。作为具有ADCC活性的抗IgSF4抗体，使用在后述实施例 中示出的035-029抗体、035-273抗体、051-054抗体等(只要维持 对IgSF4的特异结合性和ADCC活性，也可以是改变一部分而得的抗 体)，或者以其为基础构建的类型不同的抗体(例如IgG型)。这些抗体 兼具对IgSF4的特异结合性和ADCC活性。因此，特异性结合在表达 IgSF4的癌细胞上，然后发挥ADCC活性，能够给癌细胞带来伤害。成 为本发明的药物制剂的标的的癌细胞没有特别限定，例如可以以肝癌细 胞、肺癌细胞等为标的。
在本发明的药物制剂的其他方式中，将抗IgSF4抗体作为DDS用 的输送体使用。也就是该方式提供在抗IgSF4抗体上结合药物(细胞毒 等)或放射性同位素等(将它们统称为“活性成分”)而得的免疫复合 体。含有具有杀细胞活性或细胞毒活性的药物(细胞毒)的免疫复合体 一般被称为抗毒素。细胞毒的例子可以举出紫杉醇、细胞松弛素B、短 杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、表鬼臼毒、鬼臼噻吩苷、长 春花新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、二羟基蒽二酮、二羟蒽酮、四 卡因、普卡霉素、放线菌素D、1-脱氢睾丸激素、糖质肾上腺皮质激 素、普洛卡因、四卡因、利多卡因、心得安和嘌呤霉素及它们的类似物 或同族体。
作为本发明的免疫复合体中含有的活性成分，可以使用具有所希望 的生物活性的蛋白质或肽。作为在该目的下能够使用的蛋白质等的候 补，可以例示相思豆毒蛋白、蓖麻毒素A、假单胞菌-外毒素、白喉毒 素、肿瘤坏死因子、干扰素-γ、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素 -2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)淋巴因子。
使活性部分结合在抗体上的技术是公知的，可以参照例如 Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld et al.(eds.)，PP. 243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)、Controlled Drug Delivery(2nd edition.)，Robinson et al.(eds.)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)、 Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin et al.(eds.)，pp.303-16(Academic Press1985)、Thorpe et al.，“The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”， Immunol.Rev.，62：119-58(1982)。
本发明进而通过阻碍或抑制标的细胞(即肝癌细胞等癌细胞或成人 T细胞白血病细胞)中的IgSF4的表达，促进标的细胞的恶性程度降低 或正常化的方法。阻碍或抑制IgSF4的表达可以通过反义法或RNA干 涉、或者使用核酶来进行。
进行反义法的表达阻碍时，例如在标的细胞内转录时，使用生成与 编码本蛋白质的mRNA的固有部分互补的RNA的反义·构建。这样的 反义·构建以例如表达质粒的形态被导入到标的细胞内。另一方面，作 为反义·构建，导入到标的细胞内时，可以采用与编码本蛋白质的 mRNA/或基因组DNA序列杂交而阻碍其表达的寡核苷酸·探针。作为 这样的寡核苷酸·探针，优选使用对核酸外切酶和/或核酸内切酶等内因 性核酸酶具有抵抗性的物质。
使用DNA分子作为反义核酸时，优选来源于含有编码本蛋白质的 mRNA的翻译开始部位(例如-10～+10区域)的区域的寡脱氧核苷 酸。
优选反义核酸与标的核酸之间的互补性是严格的，但也可以存在少 量的错配。反义核酸对标的核酸的杂交能一般依赖于两种核酸的互补性 程度和长度这两者。通常，使用的反义核酸越长，则即使错配的数量多， 也能够与标的核酸之间形成稳定的双链(或三链)。只要是本领域技术 人员，可以使用标准的手法，来确认能够允许的错配的程度。
反义核酸可以是DNA、RNA、或它们的嵌合混合物、或它们的衍 生物或改变型。此外，可以是单链，也可以是双链。通过修饰碱基部分、 糖部分、或磷酸骨架部分，可以提高反义核酸的稳定性、杂交能等。此 外，还可以在反义核酸中附加促进细胞膜输送的物质(参照例如 Letsinger et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：6553-6556； Lemaitre et al.，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.84：648-652；PCT Publication No.W088/09810，published December15，1988)、提高对特 定细胞的亲和性的物质等。
反义核酸可以使用例如市售的自动DNA合成装置(例如Applied Biosystems公司等)等，用常规方法合成。核酸修饰体或衍生物的制作 可以参照例如Stein et al.(1988)，Nucl.Acids Res.16：3209或Sarin et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：7448-7451等。
为了提高标的细胞内的反义核酸的作用，可以利用pol II或pol III 之类的强启动子。即，如果把含有在这样的启动子的控制下配置的反义 核酸的构建导入到标的细胞中，则可以确保通过该启动子的作用产生足 够量的反义核酸的转录。
反义核酸的表达可以通过已知在哺乳动物细胞(优选人细胞)中发 挥作用的任意的启动子(衍生性启动子或构成性启动子)来进行。例如， 可以使用SV40初期启动子区域(Bernoist and Chambon，1981，Nature 290：304-310)、劳斯肉瘤病毒的3’末端区域来源的启动子(Yamamoto et al.，1980，Cell22：787-797)、疱疹胸腺嘧啶核苷激酶启动子(Wagner et al.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1441-1445)等启动子。
在本发明的一种方式中，通过RNA干涉(RNAi)进行本蛋白质的 表达抑制。RNAi是能够在真核细胞内产生的、序列特异性地抑制转录 后基因的过程。在RNA干涉中，使用具有对应于标的mRNA序列的序 列的双链RNA(dsRNA)。已知哺乳动物细胞具有抑制受到dsRNA影 响的2条路径(序列特异性路径和序列非特异性路径)。在序列特异性 路径中，较长的dsRNA被分割成短的干涉性RNA(siRNA)。该siRNA 分别具有约21个核苷酸的有义和反义链，其形成在3’末端具有突出部 的约19个核苷酸的siRNA。另一方面，认为序列非特异性路径只要在 规定的长度以上则与序列没有关系，可由任意的dsRNA引起。在该路 径中，dsRNA、两个酶被活化；上述两个酶是成为活性型、并通过将翻 译起始因子eIF2磷酸化而使全部蛋白质合成停止的PKR，和与RNAase L活化分子的合成相关的2’，5’寡腺苷酸合成酶。在本发明的方法中，为 了将该非特异性路径的进行停留在最小限度，优选使用短于约30个碱 基对的dsRNA(参见Hunter et al.(1975)J Biol Chem250：409-17； Manche et al.(1992)Mol Cell Biol12：5239-48；Minks et al.(1979)J Biol Chem254：10180-3；以及Elbashir et al.(2001)Nature411：494-8)。
另外，确认RNAi是在各种细胞种(例如HeLa细胞、NIH/3T3细 胞、COS细胞、293细胞等)中使基因表达减少的有效手段。此外，通 常通过反义法可有效地进行表达抑制。
RNAi中使用的dsRNA可以通过化学合成、或使用适当的表达载体 在体外或体内调制。后者的方法在调制较长的dsRNA方面特别有效。 dsRNA的设计通常利用标的核酸上固有的序列(连续序列)。另外，开 发出用于选择适当的标的序列的程序和计算式。
本发明的其他一种方式中，通过核酶进行IgSF4的表达抑制。也可 以使用在部位特异性识别序列中使mRNA开裂的核酶，来将编码本蛋 白质的mRNA破坏，优选使用锤头状核酶。对于锤头状核酶的构建方 法可以参考例如Haseloff and Gerlach，1988，Nature，334：585-591。
与反义法的情况相同，例如可以以提高稳定性和目标能为目的，使 用经修饰的寡核苷酸来构建核酶。为了使有效量的核酶在标的细胞内生 成，例如，优选在强启动子(例如pol II或pol III)的控制下，使用配 置有编码该核酶的DNA的核酸构建。
本发明的治疗方法(包括癌细胞等的恶性程度降低或促进正常化的 方法)中使用的药物制剂的制剂化可以根据常规方法来进行。制剂化时， 可以含有制剂上允许的其他成分(例如载体、赋形剂、崩解剂、缓冲剂、 乳化剂、悬浊剂、安慰剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等)。 作为赋形剂，可以使用乳糖、淀粉、山梨糖醇、D-甘露醇、白糖等。作 为崩解剂，可以使用淀粉、羧甲基纤维素、碳酸钙等。作为缓冲剂，可 以使用磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐等。作为乳化剂，可以使用阿拉伯胶、 藻酸钠、黄芪胶等。作为悬浊剂，可以使用单硬脂酸甘油酯、单硬脂酸 铝、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、十二烷基硫酸钠等。 作为安慰剂，可以使用苄醇、氯丁醇、山梨糖醇等。作为稳定剂，可以 使用丙二醇、二亚乙基亚硫酸盐、抗坏血酸等。作为保存剂，可以使用 酚、氯化苄烷铵、苄醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂， 可以使用氯化苄烷铵、对羟基苯甲酸酯、氯丁醇等。
制剂化时的剂型没有特别限定，可以作为例如片剂、散剂、粉剂、 颗粒剂、胶囊剂、糖浆剂、注射剂、外用剂和栓剂等进行调制。
在使用本发明的药物制剂的治疗中，对具有癌细胞或成人T细胞白 血病细胞的对象(患者)给予本发明的药物制剂。本发明的药物制剂可 以根据其形态通过口服给药或非口服给药(静脉内、动脉内、皮下、肌 肉、腹腔内注射、向标的细胞的直接导入等)应用于对象(患者)。
药物制剂的给药量根据症状、患者的年龄、性别和体重等而不同， 如果是本领域技术人员就可以适当设定合适的给药量。例如，可以设定 给药量，使得以成人(体重约60kg)为对象每一天的有效成分量达到 约0.001mg～约100mg。作为给药时间表，可以采用例如一天一次～数 次、两天一次或三天一次等。在给药时间表的设定中，可以考虑患者的 症状或药物制剂的效果持续时间等。
(筛选法)
本发明进一步提供对肝癌细胞或成人T细胞白血病细胞特异性结合 的化合物的筛选法。本发明的筛选法包括以下步骤。
(1)使IgSF4与试验化合物接触的步骤。
(2)评价试验化合物对IgSF4的结合性的步骤。
以下，对每个步骤进行详细说明。
1.步骤(1)
在步骤(1)中，使IgSF4与试验化合物接触。具体地说，例如在反 应用溶液内使试验化合物接触固定在板、膜、或珠子等不溶性支持体上的 IgSF4。经过规定时间之后，用适当的溶液进行洗净，从而将非特异性结 合成分除去。
反应用溶液没有特别限定，可以使用公知或市售的缓冲液、生理盐水 等。反应条件(反应用溶液的组成和pH等、以及反应温度、反应时间等) 可以以例如使用IgSF4和作为与其特异性结合分子之一的抗IgSF4抗体的 结合实验的结果为基础来容易地设定。作为反应用溶液，可以使用例如磷 酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、Tris盐酸缓冲液、Tris醋酸缓冲液等，其pH 设定为例如pH6.0～pH8.0，优选pH6.5～pH7.5。此外，反应温度可以设 定为例如4℃～45℃、优选4℃～40℃。对于反应时间，可以设定在例如1 分钟～24小时的范围(具体地说，例如使其反应过夜)。
可以使试验化合物与抗IgSF4抗体竞争性地和IgSF4接触。即，可以 采用在存在和不存在试验化合物的条件下，分别进行使IgSF4和抗IgSF4 抗体接触的实验体系。只要试验化合物具有对IgSF4的结合活性，由于试 验化合物的存在，而抑制抗IgSF4抗体对IgSF4的结合。因此，如果比较 如下两种情况下的结合于IgSF4的抗IgSF4抗体的量，则可以间接求出试 验化合物对IgSF4的结合活性；所述两种情况是在试验化合物存在的条件 下使其与抗IgSF4抗体接触的情况，和在试验化合物不存在的条件下使其 与抗IgSF4抗体接触的情况。
作为供于本发明的筛选法的试验化合物，可以使用各种分子尺寸的有 机化合物(核酸、肽、蛋白质、脂质(单纯脂质、复合脂质(磷酸甘油酯、 神经鞘脂质、糖基甘油酯、脑苷脂等)、前列腺素、类异戊二烯、萜烯、 类固醇等))或无机化合物。试验化合物可以是天然物来源，或者也可以 是合成的。后者的情况可以利用例如组合合成的方法来构建高效的筛选体 系。另外，可以将细胞提取液、培养上清等作为试验化合物使用。
2.步骤(2)
在步骤(2)中，评价试验化合物对IgSF4的结合性。即，测定试验 化合物对IgSF4的结合量，由测定结果求出结合活性。对IgSF4的结合量 的测定根据试验化合物的种类、性状等用适当的方法来实施。例如如果试 验化合物为蛋白质性分子，则回收结合于IgSF4的成分之后测定蛋白质质 量，通过使用对试验化合物具有特异结合性的抗体的免疫学方法等的利 用，可以算出结合于IgSF4的试验化合物量。这些方法是单独的一例，只 要能够测定向IgSF4的结合量，就可以采用任意的测定法。
如上所述，采用使用了抗IgSF4抗体的实验体系时，结合于IgSF4的 抗IgSF4抗体的量成为测定对象。接着，由测定结果(抗IgSF4抗体的结 合量)求出试验化合物的结合活性。
在本发明的筛选法中，将确认对IgSF4的高结合活性的试验化合物作 为有希望的化合物选出。用本发明的筛选法选出的化合物对IgSF4具有结 合活性。因此，可以用作以特异性表达IgSF4的癌细胞(即，肝癌细胞或 成人T细胞白血病细胞等)为标的的DDS用的输送体。另一方面，如果 确认化合物自身具有癌细胞毒活性，则其自身可以用作对癌细胞的治疗 药。这样，用本发明的筛选法选出的化合物对癌的医疗措施是有效的，成 为癌治疗药的有力候补、或开发癌治疗药时的有益材料。选出的化合物对 癌具有充分的药效时可以直接作为药物制剂的有效成分使用。另一方面， 没有足够药效时，通过施以化学修饰等的改变而提高其药效，可以供给用 作药物制剂的有效成分。自然，即使是具有充分的药效，为了进一步增加 药效，也可以施以同样的改变。
本发明进一步提供对治疗肝癌有效的IgSF4结合性化合物的筛选方 法。该筛选方法通过试验化合物的接触(给予、添加)研究癌细胞是否 死亡(或细胞数是否减少)。具体实施以下的各步骤。
(1)准备表达IgSF4基因的细胞的步骤。
(2)使试验化合物与上述细胞接触的步骤。
(3)评价癌细胞死亡或减少的步骤。
以下，对各步骤进行详细说明。
1.步骤(1)
在步骤(1)中，准备表达IgSF4基因(标准的人IgSF4基因的碱 基序列示为序列号：146)的细胞。优选使用表达人IgSF4基因的细胞， 也可以使用表达人以外的物种的IgSF4基因(例如小鼠或大鼠的IgSF4 基因)的细胞。
此处的“细胞”优选使用哺乳动物细胞。作为哺乳动物细胞的例子， 可以举出小鼠、大鼠、豚鼠等啮齿类的细胞，人、猴子、黑猩猩等灵长 类的细胞。细胞的来源没有特别限定，优选使用来源于肝脏的细胞。特 别优选使用肝癌细胞。作为肝癌细胞株，建立有HepG2细胞、Nuk-1 细胞、HLF细胞，可以将其中的任意一种供给本发明的方法。
以人以外的动物细胞(例如小鼠、大鼠、兔子、鸡等)为条件，可 以使用没有从活体分离的状态(即构成活体的状态)的细胞。
也可以在筛选中使用不是分散状态的细胞、而是确认在细胞间形成 网络的细胞群(例如形成特定组织的细胞)。此外，可以并用不同的两 种以上的细胞来实施本发明的筛选法。
除了原来表达IgSF4基因的细胞之外，还可以使用作为人为操作结 果而表达IgSF4基因的细胞。例如，可以使用在能够表达IgSF4基因的 状态下导入而得到的转化细胞。作为能够供给转化的细胞，可以例示 HeLa细胞、COS细胞、CHO细胞。这些细胞可以容易地从例如ATCC 等的细胞库中获得。
使用的细胞的数量没有特别限定，可以考虑检测灵敏度、实验设备 等来决定。例如，可以使用1～105个、优选10～104个、进一步优选102～ 103个细胞。
2.步骤(2)
在步骤(2)中，使试验化合物与准备好的细胞接触。试验化合物的接 触例如通过在培养液中存在试验化合物的条件下将细胞培养规定时间来 实施。或者，还可以使试验化合物或含有其的溶液等直接接触细胞。
给予量可以任意设定。例如，可以在没有细胞致死影响的范围下设定 为尽可能最大的给予量。
接触时间没有特别限定。例如，可以将接触时间设定在1分钟～10天 的范围内。还可以设置间隔连续接触。
作为供给本发明的筛选法的试验化合物，可以使用各种分子尺寸的 有机化合物(核酸、肽、蛋白质、脂质(单纯脂质、复合脂质(磷酸甘油 酯、神经鞘脂质、糖基甘油酯、脑苷脂等)、前列腺素、类异戊二烯、萜 烯、类固醇等))或无机化合物。试验化合物可以是天然物来源，或者也 可以是合成的。后者的情况可以利用例如组合合成的方法来构建高效的筛 选体系。另外，可以将细胞提取液、培养上清等作为试验化合物使用。
3.步骤(3)
在步骤(3)中，接触试验化合物后，评价癌细胞死亡或减少。例如， 准备接触试验化合物的细胞(试验组)和不接触试验化合物的细胞(对照 组)，分别对试验组、对照组计算、比较癌细胞数。与对照组比较试验组 的生存细胞数少时，即试验化合物确认有癌细胞杀死作用时，可以判定为 该试验化合物对肝癌有效。因此，将这样的化合物作为肝癌治疗药的候补 选出。在试验组中确认显著的细胞死亡时，可以判定该试验化合物是对肝 癌特别有效的化合物。因此，将这样的化合物作为肝癌治疗药特别有希望 的候补选出。
根据本发明的筛选法，可以将肝癌治疗药的候补化合物选出。选出 的化合物对肝癌具有充分的药效时，可以直接作为药物制剂的有效成分使 用。另一方面，没有足够药效时，在施以化学修饰等的改变而提高其药效 后，可以供给用作药物制剂的有效成分。自然，即使是具有充分的药效， 为了进一步增大药效，也可以施以同样的改变。
本发明进一步提供对治疗成人T细胞白血病有效的IgSF4结合性化合 物的筛选方法。该筛选方法通过试验化合物的接触(给予、添加)来研究 成人T细胞白血病细胞是否死亡(或细胞数是否减少)。具体实施以下的 各步骤。
(1)准备成人T细胞白血病细胞的步骤。
(2)使试验化合物与上述细胞接触的步骤。
(3)评价上述细胞死亡或减少的步骤。
以下，对每个步骤进行详细说明。另外，对于没有特别说明的事项， 适用上述的“对治疗肝癌有效的IgSF4结合性化合物的筛选方法”中对应 的说明。
1.步骤(1)
在步骤(1)中，准备成人T细胞白血病细胞。作为成人T细胞白血 病细胞株，建立有KKl、KOB、ST1，可以使用其中的任意一种供给本发 明的方法。还可以使用患者来源的细胞。
2.步骤(2)
在步骤(2)中，使试验化合物与准备好的细胞接触。试验化合物的 接触方法、给予量、接触时间、所使用的试验化合物等依照上述的说明。
3.步骤(3)
在步骤(3)中，接触试验化合物后，评价成人T细胞白血病细胞的 死亡或减少。例如，准备接触试验化合物的细胞(试验组)和不接触试验 化合物的细胞(对照组)，分别对试验组、对照组计算、比较成人T细胞 白血病细胞数。与对照组比较试验组的生存细胞数少时，即试验化合物确 认有成人T细胞白血病细胞杀死作用时，可以判定为该试验化合物对成人 T细胞白血病有效。因此，将这样的化合物作为成人T细胞白血病治疗药 的候补选出。在试验组中确认显著的细胞死亡时，可以判定该试验化合物 是对成人T细胞白血病特别有效的化合物。因此，将这样的化合物作为成 人T细胞白血病治疗药特别有希望的候补选出。
如上所述，根据本发明的筛选法，可以将成人T细胞白血病治疗药 的候补化合物选出。选出的化合物对成人T细胞白血病具有充分的药效时， 可以直接作为药物制剂的有效成分使用。另一方面，没有足够药效时，在 施以化学修饰等的改变而提高其的药效后，可以供给用作药物制剂的有效 成分。自然，即使是具有充分的药效，为了进一步增大药效，也可以施以 同样的改变。
(研究用途)
本发明进一步涉及已知在肝癌细胞中特异性表达的IgSF4基因的研究 用途。在该方面的一种方式中，提供具有序列号：146的碱基序列的分离 得到的核酸、或含有该相同核酸的肝癌研究用试药。本发明的其他方面中， 提供具有序列号：145的氨基酸序列的分离得到的蛋白质、或含有该相同 蛋白质的肝癌研究用试药。
本发明的试药可用作用于研究肝癌的发病机理或症状的进展机理等的 实验工具。此外，可以用作用于实施本发明的方法(获取肝癌诊断用的信 息的方法、肝癌的恶性程度判定法、筛选方法等)的试药，或者本发明的 药物制剂的构成成分。可以将本发明的试药用于作为肝癌模型动物的嵌合 小鼠或转基因小鼠的制作。
在本发明的试药中，核酸以例如插入到合适的载体(例如表达载体) 中的状态而含有。
此处的“相同核酸”是指与基准核酸(具有序列号：146的碱基序 列的核酸)比较时，编码其的蛋白质的功能与基准核酸的功能相同，但 部分的碱基序列不同的核酸。作为相同核酸的例子，可以举出编码具有 如下特征的蛋白质的DNA：以序列号：146的碱基序列为基准，由含有1 个或多个碱基的置换、缺失、插入、附加、或倒位的碱基序列构成，而且 表达量与肝癌的恶性程度关联地增加。碱基的置换或缺失等可以在多个部 位发生。此处的“多个”是指根据该核酸编码的蛋白质的立体结构中的氨 基酸残基的位置或种类而不同，例如2～40个碱基，优选2～20个碱基， 更优选2～10个碱基。以上那样的相同核酸可以用基因工程学方式以例如 使用部位特异性变异法在特定部位含有碱基的置换、缺失、插入、附加、 或倒位的方式改变具有序列号：146的序列的核酸而得到。此外，可以通 过紫外线照射等其他方法得到相同核酸。
作为相同核酸的其他例子，可以举出对于由序列号：146的任一碱基 序列构成的核酸的互补链在严格条件下杂交的核酸。此处的“严格条件” 是指形成所谓的特异性杂交物而不形成非特异性杂交物的条件。这样的严 格条件是本领域技术人员公知的，例如，可以参照Molecular Cloning (Third Edition，Cold Spring Harb or Laboratory Press，New York)或 Current protocols in molecular biology(edited by Frederick M.Ausubel et al.，1987)来设定。作为严格的条件，例如，可以举出如下条件：使用杂交 液(50％甲醛、10×SSC(0.15M NaCl，15mM sodium citrate，pH7.0)、5 ×Denhardt溶液、1％SDS、10％葡聚糖硫酸、10μg/ml的改性鲑鱼精子 DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5))，在约42℃～约50℃下孵育，其后使 用0.1×SSC、1％SDS在约65℃～约70℃下进行洗净。作为进一步优选的 严格的条件，可以举出例如使用50％甲醛、5×SSC(0.15M NaCl，15mM sodium citrate，pH7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％葡聚糖硫酸、 10μg/ml的改性鲑鱼精子DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5))作为杂交液 的条件。
作为相同核酸的其他例子，可以举出SNP所代表的起因于多态而认为 与如上所述碱基不同的核酸。
(本发明中使用的试剂盒)
可以使用经试剂盒化的试药等来实施本发明的各方法(筛选法、获 取诊断用的信息的方法等)。本发明的其他方面提供在这种目的中使用 的试剂盒。例如，可以在试剂盒中含有本发明方法的检测中使用的核酸 (探针或引物)、反应用试药、稀释液、反应容器等。另外，本发明的 试剂盒通常附有使用说明书。
通过使用试剂盒，可以更加简便且用更短的时间实施本发明的方 法。
关于试剂盒的构成，以利用免疫学手法来判定肝癌细胞的恶性程度 的方法中使用的情况为例进行详细说明。这种方式的试剂盒包括对 IgSF4具有特异结合性的试药。该试药优选的例子是抗IgSF4抗体，但 并不限于此。为直接检测抗IgSF4抗体的结合量的方法用的试剂盒时， 使用经标识化的抗IgSF4抗体。另一方面，为间接检测方法用的试剂盒 时，使用未标识的抗IgSF4抗体。这种情况下，可以在试剂盒中含有用 标识物质标识而得的二次抗体(标识二次抗体)。制成利用结合有二次 抗体和标识物质的聚合物的检测法用的试剂盒时，可以在试剂盒中含有 该聚合物。
另一方面，可以在试剂盒中进一步含有IgSF4(抗原)。只要能够识 别试剂盒中含有的抗IgSF4抗体，也可以不是完全长度的IgSF4。此外， 还可以是重组IgSF4。IgSF4用于确认使用试剂盒得到的染色性是基于 抗IgSF4抗体和IgSF4的特异性结合。具体而言，首先用该IgSF4处理 抗IgSF4抗体。使用处理后的抗IgSF4抗体进行免疫染色。将得到的染 色图像和使用未处理的抗IgSF4抗体而得到的染色图像进行比较。只要 在后者的染色图像中看到强染色性，则可以确认该染色性是基于抗 IgSF4抗体和IgSF4的特异性结合。
此外，另一方面，使用以标志或载体蛋白质(以下称为标志等)的 融合蛋白质为抗原而制作的抗IgSF4抗体时，可以在试剂盒中进一步含 有所用的标志等。构成试剂盒的抗IgSF4抗体中，可能混合有对该制作 过程中使用的标志等具有反应性的抗体时，该标志等是必需的。如下所 述，如果利用该标志等，可以确认使用试剂盒得到的染色性是基于抗 IgSF4抗体和IgSF4抗体的特异性结合。首先，用该标志等处理抗IgSF4 抗体。使用处理后的抗IgSF4抗体进行受检体的免疫染色。比较所得染 色图像和使用未处理的抗IgSF4抗体而得到的染色图像。只要两者之间 在染色性方面没有不同，则后者的染色图像中的染色性就可以确认是基 于抗IgSF4抗体和IgSF4的特异性结合。
本发明的试剂盒中，可以进一步含有抗原抗体反应、染色等、实施 免疫染色而必需的一种以上的试药(例如，组织固定·包埋用的福尔马 林或石蜡，用于抑制非特异性结合的BSA、DAB等显色试剂，核染色 用的苏木精溶液等)或器具等。此外，通常在本发明的试剂盒中附有操 作说明书。
(作为抗原的IgSF4的利用)
本发明的进一步的方面涉及将IgSF4作为抗原利用。也就是说，提 供通过将IgSF4作为抗原利用，来获得对IgSF4具有特异结合性的抗体 的方法。例如，使用IgSF4作为利用传统免疫学手法的免疫用抗原，或 者作为用噬菌体展示法等基因工程学手法的抗体制作法中的筛选用抗 原。
作为抗原的IgSF4可以使用以下的任一IgSF4。
(1)使用大肠杆菌的表达系而生产出的IgSF4，
(2)使用动物细胞的表达系而在培养基中分泌的IgSF4，
(3)使用动物细胞的表达系而在细胞表面上表达的IgSF4，
(4)使用作为表达T抗原而能够一过性表达的动物细胞的表达系， 在培养基中分泌或在细胞表面上表达的IgSF4。
此外，作为抗原使用时，由于IgSF4是膜蛋白，所以优选将细胞外 结构域的部分蛋白质作为抗原使用，进一步优选细胞中所表达的状态的 膜部分，最优选以IgSF4高表达细胞自身作为抗原来用于获得IgSF4抗 体。识别这些IgSF4细胞外结构域的抗体不仅用于免疫染色，还具有呈 现ADCC活性的潜能，以IgSF4为抗原而得到结合抗体的方法作为获 取治疗用抗体的方法是有效的。
实施例
1.用于制作scFv抗体基因文库的载体的制作
1-1用于制作scFv抗体基因文库的载体的制作
如图1中概念地显示，在pTZ19R噬菌粒载体(Pharmacia)中用 适当的限制性内切酶组入M13噬菌体的pelB(信号序列)、His6标志序 列、M13噬菌体的cp3蛋白质(Acp3(198aa-406aa)N端缺失壳体蛋 白质3)序列、proteinA蛋白质序列，制作载体pAALFab(参照Iba Y. et al.，Gene194：35-46，1997.)。由该pAALFab制作组入用载体 pFCAH9-E8d。
通过在该载体规定的位置插入重链和轻链的基因，从而实际上完 成抗体蛋白质表达载体。通过完成的载体表达的抗体的形状为scFv型， 轻链恒定区域CL基因与上述的cp3基因结合，结果表达蛋白质形成 scFv-CL-cp3的形状。具体进行以下那样的操作。
所用的引物：
527Reverse(序列号：147)：
5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′
599E8VHf-PstR：(序列号：148)
3′-CGGCTCCAAGTCGACGTCGTCA-5′
544E8VHf-PstF：(序列号：149)
5′-CAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGG
GCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATT
AA-3′
545E8VHf-XbaR：(序列号：150)
3′-AGACCGAAGTTGTAATTTCTGTGGATATACGTGACCCACTT
CGTCTCCGGACTTTTCCCAGATCTCACCTAACCTTCCTAA-5′
546E8VHf-XbaF：(序列号：151)
5′-AAGGGTCTAGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAGTG
GTAATACTAAATATGACCCGAAGGACAAGGCCACTATAACAG
CA-3′
547E8VHf-EcoR(序列号：152)
3′-TTCCTGTTCCGGTGATATTGTCGTCTGTGTAGGAGGTTGT
GTCGGATGGATGTCGACTTAAGGGAC-5′
548E8VHf-EcoF(序列号：153)
5′-CAGCTGAATTCCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATT
ACTGTGCTGGT-3′
549E8VHf-BstR(序列号：154)：
3′-CAGATAATGACACGACCAATACTAATGCCGTTGAAACTGAT
GACCCCGGTTCCGTGGTGCCAGTGGCACAAGG-5′
590His6-SmaR(序列号：155)：
3′-GGTTCTCTAACAGTAGTGGTAGTAGTGGTAATTATTCTCGA
TAGGGCCCTCGAA-5′
542E8VLf-SacF(序列号：156)：
5′-GACATCGAGCTCACCCAGTCTCCAGCCTCCCTTTCTGCGT
CTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGT-3′
539E8VLf-KpnR(序列号：157)：
3′-TGACAGTGGTAGTGTACAGCTCGTTCACCCTTATAAGTGTT
AATAAATCGTACCATGGTCGTC-5′
542E8VLf-KpnF(序列号：158)：
5′-GCATGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTCAGCTCC
TGGTCTAT-3′
543E8VLf-BamR(序列号：159)：
3′-GGAGTCGAGGACCAGATATTACGTTTTTGGAATCGTCTAC
CACACGGTAGTTCCAAGTCACCGTCACCTAGGCCTTGTGTT-5
′
562E8VLf-XhoR(序列号：160)：
3′-TCATGAGGCACCTGCAAGCCACCTCCGTGGTTCGAGCTCT
AGTTT-5′
563E8VLf-XhoF(序列号：161)：
5′-AGTACTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTCGAG
ATCAAA-3′
613NheR(序列号：162)：
3′-ATCGACAGCT-5′
600E8VLKpnXhoR(序列号：163)：
3′-AAGCCACCTCCATGGTTCGAGCTCTAGTTT-5′
LCP3ASC(序列号：164)：
3′-TCGAAGTTGTCCTTACTCACAAGCCGCGCGGTCAGCTGAG
GTAA-5′
hCHlBst(序列号：165)：
5′-ACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCAT
CGGTCTTCCCCCTGG-3′
hCHlmidAS(序列号：166)：
3′-GGGAGTCGTCGCAGCACTGGCACGGGAGGTCGTCGAA-5′
hCHlmidS(序列号：167)：
5′-GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTCGTGACCGTGCCC-3′
hCH1H6(序列号：168)：
3′-GGGTCGTTGTGGTTCCACCTGTTCTTTCAACTCGGGTTTA
GAACAGTAGTGGTAGTAGTGGTA-5′
hCHlH6Sma(序列号：169)：
3′-GGGTTTAGAACAGTAGTGGTAGTAGTGGTAATTATTCTCGA
TAGGGCCCTCGAACG-5′
702BstXhoF(序列号：170)：
5′-GGCACCACGGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACC-3′

1)以pAALFab为模板使用527-599进行PCR，使用547-590进行 PCR，来制作DNA片段。
2)用544-545,546-547,548-549进行PCR，来制作DNA片段。
3)将1)2)混合，进行使用527,590的PCR，将其克隆在pAALFab 的HindIII-SmaI位点。

4)使用542-562,561-613进行PCR，来制作DNA片段。
5)使用538-539,542-543进行PCR，来制作DNA片段。
6)将4)5)混合，进行使用538,562的PCR，将其克隆在pAALFab 的SacI-NheI位点。

7)VH填充部分的制作
将pFCAH3-E8T用XbaI，EcoRI消化，使其作用于克列诺片段而变成 平滑末端之后，使其自身连接来制作VH部分的填充。
8)VL填充部分的制作
以pFCAH3-E8T为模板，用527-600进行PCR。克隆在7)的HindIII- XhoI位点。
9)将其用KpnI消化，使其自身连接来制作VL部分的填充。
10)SfiI，NcoI，SpeI位点的导入
以pFCAH3-E8T为模板，用527-663进行PCR。克隆在1)的HindIII- SacI位点。
11)AscI位点的导入
以pFCAH3-E8T为模板，用527-LCP3ASC进行PCR，将其克隆于 用SacI完全消化、SalI部分消化后的2)中。
12)将γCH1部分转换为人基因
由于人γCH1部分存在BstPI位点，所以在消除其的设计下进行克 隆。以扁桃体cDNA为模板，用hCH1Bst-hCH1midS， hCH1midAS-hCH1H6进行PCR之后，将其混合，用hCH1Bst-hCH16Sma 进行PCR，将该DNA片段克隆在3)的BstPI-Sma位点。
13)Xho位点的导入
以12)为模板，用702-663进行PCR，将其克隆在12)的BstPI-SacI 位点。

将3μg(3μL)的pFCAH9-E8d(参照图1D)与3μL的BstPI(3U/μL)、 5μL的10×H缓冲液、39μL的DW混合，在37℃下进行限制性内切酶 处理2小时。处理后，将进行乙醇沉淀而得到的沉淀溶解在10μL的TE 缓冲液中。向其中混合SacI(10U/μL)1μL、10×L缓冲液5μL、DW34μL， 在37℃下进行限制性内切酶处理2小时后，进行琼脂凝胶电泳，回收4.7kb 片段。将回收物进行乙醇沉淀后制成10μL(pFCAH9-E8d BstPI-SacI片 段)。
另一方面，混合引物linF(100pmol/μL)5μL和引物linR (100pmol/μL)5μL，在94℃下加热5分钟后，通过在80℃放置5分钟、 在70℃放置5分钟、在室温放置30分钟来使其退火。将其中的2μL和在 上述中得到的pFCAH9-E8d BstPI-SacI片段1μL、10×连接缓冲液 1.5μL、DW9.5μL、T4DNA连接酶1μL混合，在16℃下使其反应16小时。 反应后，进行乙醇沉淀浓缩到3μL，使用其中的1.5μL，将大肠杆菌DH12S 感受态细胞20μL通过电穿孔进行转化。提取所得的克隆质粒，确认碱基 序列，命名为pscFvCA9-E8VHdVLd。在图2中模式地示出pscFvCA9- E8VHdVLd的结构。此外，在图3-1～图3-2中示出 pscFvCA9-E8VHdVLd的插入部的碱基序列(序列号：171)以及其编码 的氨基酸序列(序列号：172)。
引物linF(序列号：173)
GTCACCGTCTCGAGAGGCGGTGGCGGATCAGGTGGCGGTGGAA
GTGGCGGTGGTGGGTCCATGGCCGACATCGAGCT
引物linR(序列号：174)
CGATGTCGGCCATGGACCCACCACCGCCACTTCCACCGCCACCT
GATCCGCCACCGCCTCTCGAGACG
用于一时性克隆1-2重链可变区域(VH)的载体的制作
依照公知的手法(参照Iba Y.et al.，Gene194：35-46，1997.)，首先，制 作pAALFab载体(图1A)。使从pAALFab载体的XbaI到EcoRI之间 缺失，重新附加限制性内切酶切断部位Kpn I，Sfi I，Nco I，Spe I，经过 pFCAH3-E8T(图1B)，制作能够克隆VH(重链可变区域)的载体 pscFvCA-E8VHd(图1C)，制成用于一时性克隆重链可变区域的载体。 在图4-1～图4-2中，示出pscFvCA-E8VHd的插入的碱基序列(序列 号：175)以及根据限制性内切酶位点和碱基序列而编码的氨基酸序列(序 列号：176)。
具体而言，使引物610和引物611退火，将其克隆在pFCAH3-E8T 的BstPI-SacI位点，进行单链的制作。进而，用引物527和引物619进行 PCR，将其进一步克隆在HindIII-PstI位点，进行SfiI，NcoI位点的导入。 以下示出载体的制作中使用的引物序列。
610scBstSpeSacF(序列号：177)：
5′-CACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGCGGTGGCGGATCAGGTGG
CGGTGGAAGTGGCGGTGGTGGGTCTACTAGTGACATCGAGCTCA
CCCAG-3′
611scBstSpeSacR(序列号：178)：
3′-GTGGTGCCAGTGGCAGAGGAGTCCGCCACCGCCTAGTCCACC
GCCACCTTCACCGCCACCACCCAGATGATCACTGTAGCTCGAGT
GGGTC-5′
527Reverse(序列号：179)：
5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′
619E8VHf-SfiNcoPstR(序列号：180)：
3′-GACGCCGGGTCGGCCGGTACCGGCTCCAAGTCGACGTCGTCA
-5′
2.免疫球蛋白轻链文库的制作
2-1使用PCR的免疫球蛋白轻链基因的分离
使用市售的试剂盒(Pharmacia Biotech公司制QuickPrep Micro mRNA Purification Kit)，从骨髓细胞(检体No.59)4×107个细胞以及脐 带血和末梢血的淋巴细胞中得到2.6μg的mRNA。由该mRNA制作cDNA。 cDNA通过GibcoBRL公司制的SuperScript Preamplification System来 制作。引物使用寡dT。以所得的cDNA为模板，使用轻链基因的获取用5’ 引物(K1～K6、λ1～λ6)和3′引物(hCKASC引物或hCLASC引物)进 行PCR。PCR产物经酚处理后，进行乙醇沉淀，悬浊在10μL的TE缓冲 液中。所使用的引物的碱基序列和PCR的条件如下。轻链基因获取用引 物的碱基序列中，下划线部分表示NcoI位点、AscI位点。
5’-引物K1～K6
hVK1a(序列号：181)：
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGACATCC
AGATGACCCAGTCTCC
hVK2a(序列号：182)：
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGATGTTG
TGATGACTCAGTCTCC
hVK3a(序列号：183)：
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAAATTG
TGTTGACGCAGTCTCC
hVK4a(序列号：184)：
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGACATCG
TGATGACCCAGTCTCC
hVK5a(序列号：185)：
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAAACGA
CACTCACGCAGTCTCC
hVK6a(序列号：186)：
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAAATTG
TGCTGACTCAGTCTCC
5’-引物λ1～λ6
hVL1(序列号：187)：
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGTCTG
TGTTGACGCAGCCGCC
hVL2(序列号：188)：
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGTCTG
CCCTGACTCAGCCTGC
hVK3a(序列号：189)：
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCTCCTATGT
GCTGACTCAGCCACC
hVL3b(序列号：190)：
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCTCTTCTGA
GCTGACTCAGGACCC
hVL4(序列号：191)：
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCACGTTAT
ACTGACTCAACCGCC
hVL5(序列号：192)：
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGCTG
TGCTCACTCAGCCGCC
hVL6(序列号：193)：
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCAATTTTAT
GCTGACTCAGCCCCA
3’-引物hCKASC(序列号：194)：
TCGACTGGCGCGCCGAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTT
GTG
3’-引物HCLASC(序列号：195)：
TCGACTGGCGCGCCGAACATTCTGTAGGGGCCACTGTCTTC
TC
PCR的条件
cDNA                           2μL
10×缓冲液#1(添加到KOD中)      10μL
dNTP mix(2.0mM)                10μL
25mM MgCl2                     4μL
5′侧引物(100pmol/μL)         1μL
3′侧引物(100pmol/μL)         1μL
灭菌完的MilliQ                 71μL
KOD DNA聚合酶(东洋纺2.5U/μL)1μL
将94℃1分钟、55℃2分钟、74℃1分钟循环35次
2-2-1向轻链基因的噬菌粒的组入
在以下的条件下将1中得到的PCR产物进行限制性内切酶处理。
PCR产物                        10μL
10×NEB4(添加到AscI中)     5μL
灭菌完的MilliQ             33μL
AscI(NEB公司10U/μL)       1μL
NcoI(宝酒造公司10U/μL)    1μL
在37℃下反应1小时、在50℃下反应1小时后，将其中的10μL部 分进行琼脂凝胶电泳，切出600bp附近的带，用Gene Clean II试剂盒 (Funakoshi公司)进行纯化。将与PCR产物同样地进行限制性内切酶处 理而得的pscFvCA9-E8VHdVLd用Gene Clean II试剂盒进行纯化，在以 下的条件下于16℃反应4小时～一晚，从而与经限制性内切酶处理的PCR 产物连接。
经限制性内切酶处理的pscFvCA9-E8VHdVLd              2μL
经限制性内切酶处理的PCR产物                        1μL
10×连接缓冲液                                     1.5μL
(添加到T4DNA连接酶中)
10mM ATP                                           1.5μL
灭菌完的MilliQ                                     8μL
T4DNA连接酶(宝酒造10U/μL)                         1μL
2-2-2噬菌粒向大肠杆菌的导入
使用所得连接的DNA如下将大肠杆菌DH12S转化。即，先将连接的 DNA进行乙醇沉淀，溶解在1/5TE(用灭菌完的MilliQ将TE稀释5倍而 得的)3μL中。将其中的1.5μL悬浊在感受态细胞DH12S(GIBCO BRL 制)20μL中，在以下的条件下进行电穿孔。
电穿孔器具
BRL公司Cell-Porator(Cat.series1600)
设定条件：voltage booster         4kΩ
          capacitance             330μF
          DC volts                LowΩ
          charge rate             快
将转化后的上述大肠杆菌植到转化用培养基(SOB)2mL上，在37 ℃下振荡培养1小时之后，将一部分播种在琼脂培养基(Amp板)上，剩 余的用含有0.1％葡萄糖、100μg/mL氨苄青霉素的2×TY培养基进行培养， 进行甘油贮备。琼脂培养基在30℃下孵育，用牙签连续分离生出的菌落， 分别调制质粒，研究轻链基因的碱基序列。
SOB培养基：在950mL的纯水中加入下面的成分，振荡，完全溶 解后加250mM的KCl溶液10mL，用5N NaOH将pH调制到7.0。加 入纯水调整到1000mL之后，用高压灭菌器灭菌20分钟，在将要使用前加 入5mL灭菌的2M的MgCl2。
细胞用胰蛋白胨             20g
细胞用酵母提取物           5g
NaCl                       0.5g
2×YT培养基：在900mL的纯水中加入下面的成分，振荡，完全溶解 后用5N NaOH将pH调节到7.0，加入纯水制成1000mL。用高压灭菌器 灭菌20分钟后使用。
细胞用胰蛋白胨         16g
细胞用酵母提取物       10g
NaCI                   5g
其他试药从以下购入。
厂家                  品名
Sigma                 氨苄青霉素钠
和光纯药              酚
Sigma                 BSA
DIFCO                 2×YT培养基
和光纯药              卡那霉素硫酸盐
Nacalai tesque        聚乙二醇6000
Nacalai tesque        Tween20
片山化学              NaCl
和光纯药              IPTG
和光纯药              脱脂乳
和光纯药              叠氮化钠
和光纯药              三乙基胺
和光纯药              过氧化氢
和光纯药              OPD片
和光纯药              乙醇
对κ1、κ2、κ3、κ4、κ5和κ6、以及λ1、λ2、λ3a、λ3b、λ4、λ5、 λ6、λ7、λ8、λ9和λ10全部进行以上的操作，确认是否得到目的克隆。接 着，以将κ1、κ2等各组的克隆以接近体内的使用频率的比率的方式进行 混合。已知这些轻链的各组分别在实际的活体内以怎样的比例表达。用 PCR法扩增而组入到载体中得到基因克隆，将这些基因克隆以接近于体内 的使用频率的比率的方式进行混合，制成VL文库。VL文库中的各家族 的构成比率示于下面。
表1
Vκ
  家族   体内的   使用频率(％)＊   VL文库中的   构成比率(％)   KL200中的   构成比率(％)   Vκ1   39   37   30.7   Vκ2   12   12   19.8   Vκ3   36   35   33.7   Vκ4   12   12   10.9   Vκ5   1   2   5.0   Vκ6   -＊＊   2＊＊＊   0.0
＊Griffith AD et al.EMBO J.(1994)13，3245-60。
＊＊发表时没有记载。
＊＊＊将用引物VK6-2制作的cDNA和用引物VK6-3制作的cDNA等量混合。
表2
Vλ
  家族   体内的   使用频率(％)＊   VL文库中的   构成比率(％)   KL200中的   构成比率(％)   Vλ1   43   41   34.1   Vλ2   15   15＊3   15.2   Vλ3   34   32＊4   25.3   Vλ4   0   1.5＊5   0.0   Vλ5   0   1.0＊6   11.1   Vλ6   0   1.0   14.1   Vλ7   6   6   0.0   Vλ8   1   1   0.0   Vλ9   1   1   0.0   Vλ10   -＊2   1   0.0
＊Griffith AD et al.EMBO J.(1994)13，3245-60.
＊2发表时没有记载.
＊3将用引物VL2制作的cDNA5％和用引物VL2-2制作的cDNA10％混合.
＊4将用引物VL3a-2制作的cDNA17％和用引物VL3b制作的cDNA15％混合.
＊5将用引物VL4a制作的cDNA0.5％和用引物VL4b制作的cDNA0.5％ 和用引物VL4c制作的cDNA0.5％混合.
＊6将用引物VL5abde制作的cDNA0.5％和用引物VL5c制作的cDNA0.5％混合.
3.轻链基因文库和重链基因文库的组合文库(scFv抗体基因文库) 的制作
3-1-1使用PCR的免疫球蛋白重链基因的分离
用与2-1同样的顺序，使用从脐带血、骨髓液和末梢血的淋巴细胞以 及扁桃腺中获得的人μ引物(以下所示的引物634)或者random hexamer， 来调制cDNA，以该cDNA为模板，使用以下所示的人抗体重链基因的获 取用5’引物(VH1～VH7)和3’引物(将4种人JH引物等量混合而得的 物质，以下所示的引物697～700)、或者人μ引物(以下所示的引物634)， 进行PCR。表中，带有下划线的部分表示SfiI位点。由于hVH2a不对应 germ line VH2家族，所以重新设计VH2a-2。而且对于hVH4a来说，由 于不对应VH4家族整体，所以重新设计hVH4a-2。由于VH5a也不对应 germ line VH5亚家族，所以重新设计VH5a-2。还设计hVH7作为对应于 VH7的引物。对于它们，也进行基因扩增，组入到pscFvCA-E8VHd中， 碱基序列确定获取了什么样的基因。对于hVH5a-2来说，与hVH???a序列 很相似，所以预想会得到与用hVH???a扩增而得的物质相同的基因产物， 所以不使用它。PCR产物进行酚处理后，进行乙醇沉淀，悬浮在10μL的 TE缓冲液中。
634人μCH1R(序列号：196)：
ATGGAGTCGGGAAGGAAGTC
各VH家族的扩增中使用的引物
将人VH引物SfiI位点用下划线示出。
628hVH1a(序列号：197)：
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGC
AGCTGGTGCAGTCTGG
629hVH2a(序列号：198)：
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTCA
ACTTAAGGGAGTCTGG
630hVH3a(序列号：199)：
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGC
AGCTGGTGGAGTCTGG
631hVH4a(序列号：200)：
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGC
AGCTGCAGGAGTCGGG
632hVH5a(序列号：201)：
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGC
AGCTGTTGCAGTCTGC
633hVH6a(序列号：202)：
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTAC
AGCTGCAGCAGTCAGG
629-2hVH2a-2(序列号：203)：
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGRTCA
CCTTGAAGGAGTCTGGTCC
631-2hVH4a-2(序列号：204)：
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGC
AGCTACAGCAGTGGGG
632-2hVH5a-2(序列号：205)：
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGC
AGCTGGTGCAGTCTGG
712hVH7(序列号：206)：
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGC
AGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGT
将人JH引物BstPI，XhoI位点用下划线示出。
697hJH1-2(序列号：207)：
GGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCAGGGTGC
698hJH3(序列号：208)：
GGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCATTGTCC
699hJH4-5(序列号：209)：
GGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCAGGGTTC
700hJH6(序列号：210)：
GGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCGTGGTCC
cDNA                              2μL
10×缓冲液#1(添加到KOD中)         10μL
dNTP mix(2.0mM)                   10μL
25mM MgCl2                        4μL
5′侧引物(100pmol/μL)            1μL
3′侧引物(100pmol/μL)            1μL
灭菌完的MilliQ                    71μL
KOD DNA聚合酶(东洋纺2.5U/μL)     1μL
PCR条件：将94℃1分、55℃2分、74℃1分循环35次
3-1-2重链基因文库的制作
将3-1-1中得到的PCR产物在以下的条件下进行限制性内切酶处理。
PCR产物                        10μL
10×K缓冲液(宝酒造)            5μL
灭菌完的MilliQ                 33μL
SfiI(NEB公司10U/μL)           1μL
XhoI(宝酒造12U/μL)            1μL
在37℃下反应2小时后，将其中的10μL部分进行琼脂电泳，切出 400bp附近的带，用Gene Clean II试剂盒(Funakoshi公司)进行纯化。 将与PCR产物同样地进行限制性内切酶处理而得的pscFvCA-E8VHd用 Gene Clean II试剂盒进行纯化，在以下的条件下于16℃反应4小时～一晚， 从而与经限制性内切酶处理的PCR产物连接。
经限制性内切酶处理的pscFvCA-E8VHd            2μL
经限制性内切酶处理的PCR产物                  1μL
10×连接缓冲液                               1.5μL
(添加到T4DNA连接酶中)
10mM ATP                                     1.5μL
灭菌完的MilliQ                               8μL
T4DNA连接酶(宝酒造10U/μL)                   1μL
3-1-3噬菌粒向大肠杆菌的導入
将所得的DNA转化成大肠杆菌DH12S。具体地说，先将DNA进行 乙醇沉淀，溶解在1/5TE(将TE用灭菌完的MilliQ稀释5倍而得的物质) 3μL中。将其中的1.5μL悬浮在感受态细胞DH12S(GIBCO BRL制)20μL 中，通过电穿孔法进行转化。
电穿孔器具
BRL公司Cell-Porator(Cat.series1600)
设定条件：voltage booster       4kΩ
          capacitance           330μF
          DC volts              LowΩ
          charge rate           快
在转化用培养基(SOB)2mL上培植上述操作结束后的转化大肠杆 菌，在37℃下振荡培养1小时之后，将一部分播种在琼脂培养基(Amp 板)上，剩余的用含有0.1％葡萄糖、100μg/mL氨苄青霉素的2×YT培养 基进行培养，进行甘油贮备。琼脂培养基在30℃下孵育，将生出的菌落用 牙签连续分离，分别调制质粒，研究重链基因的碱基序列。对于VH1～VH7 全部进行这些操作，确认是否得到目的克隆。将这些各组(家族)的克隆 以接近体内的使用频率的比率的方式进行混合，制成VH文库。VH文库 中的各家族的构成比率示于以下。
表3
  家族   体内的使用   频率(％)*   VH文库中的   构成比率(％)   VH1   25   29**   VH2   6.6   7   VH3   40   40   VH4   19   19***   VH5   5   -**   VH6   3.8   4   VH7   1.2   2
＊GriffithAD et al.EMBO J.(1994)13，3245-60.
＊＊实际上VH1和VH5通过相同的引物被扩增，所以不能分离、合计.
＊＊＊将用VH4引物制作的cDNA和用VH4-2引物制作的cDNA混合并制成该比例.
3-2组合基因文库的制作
在下述条件下用HindIII和XhoI消化VH文库200μg，切出重链基因， 用Gene Clean II试剂盒进行纯化。
VH文库200μg                 100μL
10×K缓冲液(宝酒造)          40μL
灭菌完的MilliQ               205μL
HindIII(宝酒造40U/μL)       30μL
XhoI(宝酒造50U/μL)       25μL
对于VL文库所插入的载体pscFvCA9-E8VHdVLd，也在下述条件下 用HindIII和XhoI进行消化，将含有轻链基因的片段用Gene Clean II试 剂盒进行纯化。
插入VL文库的pscFvCA9-E8VHdVLd 100μg        100μL
10×K缓冲液(宝酒造)                         40μL
灭菌完的Milli-Q                             230μL
HindIII(宝酒造40U/μL)                      15μL
XhoI(宝酒造50U/μL)                         15μL
接着，将VH基因文库片段和插有轻链基因的pscFvCA9- E8VHdVLd载体在以下的条件下使其在16℃反应一晚来连接。
经限制性内切酶处理的VH文库
片段10μg      50μL 含有经限制性内切酶处理的VL文库的片段的pscFvCA9-E8VHdVLd40μg 50μL
10×连接缓冲液(添加到T4DNA连接酶中)  100μL
10mM ATP                             100μL
灭菌完的MilliQ                       670μL
T4DNA连接酶(宝酒造10U/μL)           30μL
使用反应结束后的DNA将大肠杆菌DH12S转化。具体地说，先将 DNA进行乙醇沉淀，溶解在1/5TE(将TE用灭菌完的MilliQ稀释5倍而 得的物质)30μL中。将其悬浮在感受态细胞DH12S(GIBCO BRL制) 500μL中，进行电穿孔。
电穿孔器具
BRL公司Cell-Porator(Cat.series1600)
设定条件：voltage booster         4kΩ
          capacitance             330μF
          DC volts                LowΩ
          charge rate             快
在转化用培养基(SOB)12mL上培植上述操作结束后的大肠杆菌， 在37℃下振荡培养1小时之后，将一部分播种在琼脂培养基(Amp板) 上，剩余的用含有0.1％葡萄糖、100μg/mL氨苄青霉素的2×YT培养基500 mL进行培养，进行甘油贮备。琼脂培养基在30℃下孵育，由生出的菌落 数推定所得的克隆的数量。得到8.5×1010个克隆。
4.由scFv-CL抗体基因文库制作scFv-CL抗体噬菌体文库
向16个装有加入1％葡萄糖和100μg/mL氨苄青霉素的2×YT培养基 300mL的5升烧瓶中添加AIMS-5悬浮液2.5mL，在37℃振荡培养，每隔 1小时测定波长600nm处的吸光度，同时使其增殖到吸光度达到1.0为止。 向培养液中添加辅助噬菌体液(M13KO7)每烧瓶12mL，使其感染辅助噬菌 体，在37℃培养2小时，制成辅助噬菌体感染后的DH12S。
向24个5升烧瓶中添加2×YT培养基600mL和100μg/mL的氨苄青 霉素0.6mL、50μg/mL的卡那霉素0.8mL、辅助噬菌体感染后的DH12S 200mL，在37℃振荡培养20小时。
菌体在4℃于8000rpm离心10分钟，收集上清。在上清中加入20 ％的聚乙二醇/2.5M NaCl 4L后平静搅拌约20分钟之后，在4℃以 8000rpm离心20分钟，将沉淀用1L的PBS溶解，加入20％的聚乙二醇 /2.5M NaCl200mL平静搅拌约20分钟之后，在4℃于8000rpm离心20 分钟。将上清丢弃后进一步在4℃以8000rpm离心3分钟，回收沉淀。沉 淀用加有0.05％NaN3的PBS溶解，在4℃以1000rpm离心15分钟，将 上清回收之后，在4℃以8000rpm进一步离心3分钟后将上清回收。
所回收的噬菌体溶液的效价如下确认。即，将噬菌体溶液用PBS稀释 106、107、108倍，使其10μL感染DH12S990μL，在37℃培养1小时。将 其100μL播种于LBGA板后在30℃培养18小时。通过计算菌落的数量算 出稀释前的原液的效价。将噬菌体溶液原液以2×1014/mL的方式悬浮在含 有0.05％NaN3的PBS中。
5.肝癌细胞特异性抗体克隆的获取
5-1使用肝癌细胞株HepG2、Nuk-1的筛选
首先，将HepG2细胞在15cm培养皿中培养，用2mg/ml胶原酶I(Gibco BRL)/细胞解离缓冲液(Gibco BRL)将其从培养皿中解离。用冷却后的PBS 洗涤它，使用4x107。向其中混合1x1013cfu的人抗体噬菌体文库，使得反 应液的最终浓度达到1％BSA-0.1％NaN3/MEM、容积达到1.6ml，以4℃ 使其缓慢地旋转反应4小时。反应结束后，将反应液分成两份，使各自在 0.6ml的有机溶液(邻苯二甲酸二丁酯环己酰亚胺9∶1)之上形成多层， 用微离心机使其以3000rpm的离心力作用2分钟，使细胞沈降在管底。对 于各个管，丢弃溶液，用0.7ml的1％BSA/MEM悬浮细胞，在0.7ml的有 机溶剂上形成多层，来进行离心。再次反复该操作后，丢弃溶液，用0.3ml 的PBS悬浮细胞，用液氮冻结，在37℃下溶解。
使其在OD0.5的大肠杆菌DH12S20ml中感染1小时，将其一部分 播种在氨苄青霉素板上，算出所回收的噬菌体的效价。噬菌体感染的大肠 杆菌用600ml的2xYTGA培养基(2xYT，200μg/ml氨苄青霉素硫酸盐，1％ 葡萄糖)在30℃彻夜培养。将该彻夜培养物10ml与2xYTA培养基(2xYT， 200μg/ml氨苄青霉素硫酸盐)200ml混合，以37℃培养1.5小时之后，加 入辅助噬菌体KO71×1011，在37℃培养1小时后，加入800ml的2xYTGAK (2xYT，200μg/ml氨苄青霉素硫酸盐，0.05％葡萄糖，50μg/ml卡那霉素)， 以30℃彻夜培养。将其以8000rpm离心10分钟来调制上清1l，向其中混 合200ml的PEG液(20％聚乙二醇6000，2.5M NaCl)进行充分搅拌之后， 进行8000rpm、10分钟的离心，使噬菌体沉淀。将其悬浮在10ml的PBS 中，使用其一部分来研究大肠杆菌感染数。这是第一次筛选的噬菌体。
第二次筛选中使用培养细胞2x107和第一次噬菌体1×1010，反应液的 容积为0.8ml。反应液是1％BSA-0.1％NaN3/MEM，整体范围进行到第一 次筛选的一半。
第三次筛选除了使用第二次噬菌体1×109以外，在与第二次筛选相同 的条件下进行。
对于C型肝炎患者来源的肝癌细胞株的筛选也与对HepG2的筛选同 样地进行。
5-2抗体克隆的选拔、使用所选抗体克隆的免疫染色
由于在对于HepG2的第三次筛选阶段回收率增加(图5)，所以判断 在该阶段HepG2细胞特异性的抗体克隆被浓缩，挑取480个克隆。对于 这些克隆，进行抗体表达确认，选出表达阳性的克隆225个。接着，对于 这些阳性的克隆，进行H链部分的碱基序列解析，可知被分类为130种。 对于这130个克隆，调制抗体样品，对于从3名患者中获得的手术材料， 进行肝癌部和肝非癌部的组织染色之后，观察到癌特异性染色的是33个。 其中，特别是将癌的膜部分染色的克隆是19个(图6)。同样地，筛选C 型肝炎患者来源的肝癌细胞株NUK-1(图5)，得到将肝癌部的细胞膜特 异性染色的抗体克隆8个(图6)。对于这些抗体克隆，进行对无限增殖化 肝细胞THLE-3、肝癌细胞株HepG2，HLF的细胞染色，选出显示癌细胞 膜特异性识别的抗体克隆。其结果示出，035-029、035-212、035-215、 035-273、035-283、040-131、051-054、051-181、051-129、035 -130和035-169的癌细胞特异性特别高。
图7、8显示抗体克隆035-273的肝癌组织的染色图像。同样地， 在图9中示出抗体克隆051-129的肝癌组织的染色图像，在图10中示 出抗体克隆035-169的肝癌组织的染色图像。由图7～10可知，这些 抗体特异性地染色癌部的细胞膜，非癌部的组织没有染色。此外，如图 11所示，抗体035-273将低分化型肝癌细胞株HepG2、未分化型肝癌 细胞株HLF、C型肝炎患者来源的细胞株Nuk-1染色，而高分化型肝癌 细胞株HuH-7和无限增殖化细胞THLE-3几乎没有染色。另外，通过抗 体克隆035-029、035-212、035-215、035-283、040-131、051- 054、051-181可以得到同样的染色结果(没有图示出结果)。
另外，细胞染色和组织染色分别按下面的顺序进行。
5-2-1细胞染色
细胞用2mg/ml胶原酶I(Gibco BRL)/细胞解离缓冲液(Gibco BRL)使 其从培养皿中解离之后，用10％FBS/D MEM进行回收，使用1×105。用 2.5％BSA、0.05％NaN3/PBS(BSA溶液)洗净其之后，悬浮在2.5％正常 羊血清/BSA溶液100μl中，在冰上静置30分钟之后，加入cp3型抗体到 5μg/ml，在冰上静置1小时。用BSA溶液将其洗净一次之后，用抗cp3 小鼠单克隆抗体(株式会社医学生物学研究所)5μg/ml的BSA溶液100μl 悬浮，在冰上静置1小时。用BSA溶液将其洗净一次之后，用Alexa488 结合抗小鼠IgG山羊抗体(Molecularprobe公司制)5μg/ml的BSA溶液 100μl悬浮，在冰上静置1小时。用BSA溶液将其洗净两次之后，丢弃上 清，向其中加入BECKMAN COULTER公司制的OptiLyse B50μl，以室 温静置10分钟，将细胞固定。向其中加入1ng DAPI/BSA溶液950μl，以 室温静置10分钟，离心后收集细胞，封装到ICN公司制的MULTITEST
SLIDE中进行显微镜观察。
5-2-2组织染色
(1)抗体样品的调制
将大肠杆菌彻夜培养液0.5ml在10ml的2xYTAI(2xYT，200μg/ml 氨苄青霉素硫酸盐，0.5mM IPTG)培植，以30℃彻夜培养，用微离心 机进行15000rpm、5分钟的离心，回收上清。向其中加入等量的饱和 硫酸铵在室温下静置30分钟之后，以室温进行10000rpm、5分钟的离 心，丢弃上清，将所得沉淀物用1ml的PBS-0.05％NaN3、蛋白酶抑制 剂溶液悬浮，以4℃进行15000rpm、5分钟的离心，回收上清。
(2)组织染色用切片的制作
摘出的组织切成5mm×5mm×10mm左右的大小，加入到4℃的4 ％PFA/0.01％戊二醛/0.1M二甲胂酸缓冲液中(PFA是和光纯药制，戊 二醛是关东化学制，二甲胂酸钠是SIGMA制)，使用微波炉(SHARP) 进行微波固定之后，用同样的固定液在4℃再固定1小时。然后转移到 10％蔗糖/PBS中，以4℃浸渍4小时后，置换成15％蔗糖/PBS后以4 ℃浸渍4小时，然后置换成20％蔗糖/PBS以4℃浸渍一晚，用OTC复 合物进行包埋，在干冰-己烷中急速冰冻。在低温控制器中 (Reichert-Jung2800FRIGCUT E)将其切成4μm的厚度，贴到硅烷 涂布载玻片(MATSUNAMI)上，用冷风干燥器风干30分钟。
(3)组织染色
贴有切片的载玻片在PBS中每5分钟浸渍3次来进行亲水化。接着， 滴落50μl的0.3％H2O2/0.1％NaN3，以室温使其反应10分钟来进行内 因性过氧化物酶的阻断，然后用PBS每5分钟洗净3次。接着在2％ BSA/PBS中于室温下使其反应10分钟，进行非特异反应的阻断。然后， 向落下多余溶液的地方滴落抗体样品50μl，以室温使其反应1小时之后， 用PBS每5分钟洗净3次。接着，滴落50μl的抗CP3兔子抗体5μg/ml， 以室温使其进行二次抗体反应45分钟之后，用PBS每5分钟洗净3次。 然后滴落50μl的过氧化物酶标识葡聚糖结合抗兔子免疫球蛋白-山羊 多克隆抗体(DAKO)，以室温进行三次抗体反应30分钟。用PBS每5 分钟洗净其3次之后，滴落50μl的DAB·H2O2显色液，显色成褐色 后，转移到盛满蒸馏水的托盘中使反应停止。然后进行10分钟水洗之 后，用苏木精进行核染色后，进行脱水、渗透，用marinol封装，进行 镜检。
6.确定抗体克隆的碱基序列、确认表达
稀释通过筛选得到的大肠杆菌，播种到加有100μg/ml氨苄青霉素 的普通琼脂培养基中，挑取所得菌落，用2xYTGA培养基在30℃彻夜 培养，用KURABO的PI-50提取DNA，用双脱氧法确定碱基序列。而 且，将该彻夜培养液0.05ml在1.2ml的2xYTAI(2xYT，200μg/ml氨 苄青霉素硫酸盐，0.5mM IPTG)中培植，在30℃彻夜培养，用微离心 机进行15000rpm、5分钟的离心，获得上清。
抗体作为cp3融合蛋白而表达，所以进行使用其的表达研究。即， 首先，使所得上清以37℃在Maxisorp(NUNC)中反应2小时之后， 丢弃溶液，使5％BSA以37℃反应2小时来进行阻断。丢弃溶液，使用 0.05％Tween/PBS稀释2000倍而得的兔子抗cp3抗体(株式会社医学 生物学研究所)在室温反应1小时之后用PBS洗净，使用0.05％ Tween/PBS稀释2000倍而得的HRP标识山羊抗兔子IgG抗体(株式 会社医学生物学研究所)在室温反应1小时之后用PBS洗净，使100μl 的OPD溶液在室温下反应15分钟，用2M硫酸铵来停止反应，用 SPECTRAmax 340PC(Molecular Devices)测得492nm的吸光度。
将具有相同碱基序列的抗体克隆或没有表达的抗体克隆在该阶段 除去，最终得到11个抗体克隆(035-029抗体、035-212抗体、035 -215抗体、035-273抗体、035-283抗体、040-131抗体、051-054 抗体、051-181抗体、051-129抗体、035-130抗体和035-169抗体)。 各抗体克隆的氨基酸序列如下。
(1)035-029抗体
VH：序列号：1、VH CDR1：序列号：2、VH CDR2：序列号：3、 VH CDR3：序列号：4
VL：序列号：5、VL CDR1：序列号：6、VL CDR2：序列号：7、 VL CDR3：序列号：8、VLCL：序列号：129
(2)035-212抗体
VH：序列号：9、VH CDR1：序列号：10、VH CDR2：序列号： 11、VH CDR3：序列号：12
VL：序列号：13、VL CDR1：序列号：14、VL CDR2：序列号： 15、VL CDR3：序列号：16、VLCL：序列号：131
(3)035-215抗体
VH：序列号：17、VH CDR1：序列号：18、VH CDR2：序列号： 19、VH CDR3：序列号：20
VL：序列号：21、VL CDR1：序列号：22、VL CDR2：序列号： 23、VL CDR3：序列号：24、VLCL：序列号：133
(4)035-273抗体
VH：序列号：25、VH CDR1：序列号：26、VH CDR2：序列号： 27、VH CDR3：序列号：28
VL：序列号：29、VL CDR1：序列号：30、VL CDR2：序列号： 31、VL CDR3：序列号：32、VLCL：序列号：135
(5)035-283抗体
VH：序列号：33、VH CDR1：序列号：34、VH CDR2：序列号： 35、VH CDR3：序列号：36
VL：序列号：37、VL CDR1：序列号：38、VL CDR2：序列号： 39、VL CDR3：序列号：40、VLCL：序列号：137
(6)040-131抗体
VH：序列号：41、VH CDR1：序列号：42、VH CDR2：序列号： 43、VH CDR3：序列号：44
VL：序列号：45、VL CDR1：序列号：46、VL CDR2：序列号： 47、VL CDR3：序列号：48、VLCL：序列号：139
(7)051-054抗体
VH：序列号：49、VH CDR1：序列号：50、VH CDR2：序列号： 51、VH CDR3：序列号：52
VL：序列号：53、VL CDR1：序列号：54、VL CDR2：序列号： 55、VL CDR3：序列号：56、VLCL：序列号：141
(8)051-181抗体
VH：序列号：57、VH CDR1：序列号：58、VH CDR2：序列号： 59、VH CDR3：序列号：60
VL：序列号：61、VL CDR1：序列号：62、VL CDR2：序列号： 63、VL CDR3：序列号：64、VLCL：序列号：143
另一方面，各抗体克隆的碱基序列如下。
(1)035-029抗体
VH：序列号：65、VH CDR1：序列号：66、VH CDR2：序列号： 67、VH CDR3：序列号：68
VL：序列号：69、VL CDR1：序列号：70、VL CDR2：序列号： 71、VL CDR3：序列号：72、VLCL：序列号：130
(2)035-212抗体
VH：序列号：73、VH CDR1：序列号：74、VH CDR2：序列号： 75、VH CDR3：序列号：76
VL：序列号：77、VL CDR1：序列号：78、VL CDR2：序列号： 79、VL CDR3：序列号：80、VLCL：序列号：132
(3)035-215抗体
VH：序列号：81、VH CDR1：序列号：82、VH CDR2：序列号： 83、VH CDR3：序列号：84
VL：序列号：85、VL CDR1：序列号：86、VL CDR2：序列号： 87、VL CDR3：序列号：88、VLCL：序列号：134
(4)035-273抗体
VH：序列号：89、VH CDR1：序列号：90、VH CDR2：序列号： 91、VH CDR3：序列号：92
VL：序列号：93、VL CDRI：序列号：94、VL CDR2：序列号： 95、VL CDR3：序列号：96、VLCL：序列号：136
(5)035-283抗体
VH：序列号：97、VH CDR1：序列号：98、VH CDR2：序列号： 99、VH CDR3：序列号：100
VL：序列号：101、VL CDR1：序列号：102、VL CDR2：序列号： 103、VL CDR3：序列号：104、VLCL：序列号：138
(6)040-131抗体
VH：序列号：105、VH CDR1：序列号：106、VH CDR2：序列号： 107、VH CDR3：序列号：108
VL：序列号：109、VL CDR1：序列号：110、VL CDR2：序列号： 111、VL CDR3：序列号：112、VLCL：序列号：140
(7)051-054抗体
VH：序列号：113、VH CDR1：序列号：114、VH CDR2：序列号： 115、VH CDR3：序列号：116
VL：序列号：117、VL CDR1：序列号：118、VL CDR2：序列号： 119、VL CDR3：序列号：120、VLCL：序列号：142
(8)051-181抗体
VH：序列号：121、VH CDR1：序列号：122、VH CDR2：序列号： 123、VH CDR3：序列号：124
VL：序列号：125、VL CDR1：序列号：126、VL CDR2：序列号： 127、VL CDR3：序列号：128、VLCL：序列号：144
(9)051-129抗体
VH：序列号：221、VH CDR1：序列号：222、VH CDR2：序列号： 223、VH CDR3：序列号：224
VL：序列号：225、VL CDR1：序列号：226、VL CDR2：序列号： 227、VL CDR3：序列号：228
(10)035-130抗体
VH：序列号：229、VH CDR1：序列号：230、VH CDR2：序列号： 231、VH CDR3：序列号：232
VL：序列号：233、VL CDR1：序列号：234、VL CDR2：序列号： 235、VL CDR3：序列号：236
(11)035-169抗体
VH：序列号：237、VH CDR1：序列号：238、VH CDR2：序列号： 239、VH CDR3：序列号：240
VL：序列号：241、VL CDR1：序列号：242、VL CDR2：序列号： 243、VL CDR3：序列号：244
7.抗体克隆识别的蛋白质(抗原)的鉴定
7-1pp型抗体表达大肠杆菌的制作
所得抗体克隆为cp3型，其构建如图12-1、12-2所示(在该图 中示出全部抗体克隆的共同结构)。VH区域、VLCL区域中分别插入图 12-1、12-2中示出的VH序列和VLCL序列。用KURABO PI-50提 取该DNA，用限制性内切酶SalI消化，使其自身再结合之后导入到大 肠杆菌DH12S中进行转化之后，播种到LBGA板，以30℃彻夜培养， 将所得大肠杆菌菌落用2xYTGA彻夜培养，得到pp型抗体表达大肠杆 菌溶液。
7-2免疫沉淀用抗体的调制
将组入有表达pp型抗体克隆的质粒的大肠杆菌10ml植菌在YTGA 上，以30℃彻夜振荡培养一昼夜(前培养液)。将其加入到4l的2xYT、 0.05％葡萄糖、100μg/ml氨苄青霉素中，以30℃进行培养。菌的O.D. 达到0.5时，加入4ml的1M IPTG，然后以30℃彻夜振荡培养一昼夜。 培养结束后，用冷却离心机进行10000g、4℃、10分钟的离心，在所得 培养上清中加入等量的饱和硫酸铵水溶液，以室温搅拌1小时。将该溶 液用冷却离心机进行10000g、4℃、15分钟的离心之后，丢弃上清，将 所得沉淀用PBS-NaN3溶液20ml悬浮之后，用冷却离心机进行10000g、 4℃、5分钟的离心，回收上清。用PBS将其透析一昼夜。向其中添加 用0.05％NaN3/PBS平衡化的IgG sepharose 6 Fast Flow(Amersham Biosciences公司)2ml，以4℃振荡一昼夜来使其反应。将该混合液通 过色谱柱中之后使其自然滴下，没有与珠反应的成分通过色谱柱。用 100ml的PBS将该色谱柱洗净2次之后，用30ml的0.1％Tween20/PBS 洗净4次，进一步用100ml的PBS洗净2次。向其中缓慢地添加4ml 的0.2M甘氨酸-盐酸pH3三次，回收洗脱成分之后，添加3M Tris80μl 进行中和(抗体溶液)。用MILLEX-GP0.22μm过滤器过滤其之后测定 O.D.，求出抗体用量。
7-3免疫沉淀用固相化抗体的调制
首先，用偶联缓冲溶液(0.1M NaHCO3-NaOH pH9)透析抗体溶 液。即，将抗体溶液封装到透析膜(Snake Skin Pleated Dialysis Tubing 10000MWCO)中，将其沉淀在偶联缓冲溶液(0.1M NaHCO3-NaOH pH9)1.5L中，在4℃下用搅拌器搅拌2～3小时之后，更换缓冲溶液进 一步透析2～3小时。然后再一次更换缓冲溶液透析一昼夜。
接着，调整固相化中使用的活性化CNBr-activated Sepharose4B。 即，将Amersham Biosciences公司制的CNBr-activated Sepharose4B 用1mM盐酸膨润之后，用吸气器吸引。向其中添加偶联缓冲溶液50ml， 搅拌后用吸气器吸引，吸引过程中，进而添加偶联缓冲溶液。
抗体的固相化如下进行。即，向5mg的抗体溶液10ml中添加活性 化凝胶1ml，以室温使其反应2小时。反应结束后，将凝胶转移到色谱 柱，用偶联缓冲溶液1ml洗净10次，通过O.D.测定确认有无未反应抗 体。固相化凝胶用0.2M甘氨酸-氢氧化钠pH8的溶液5ml置换2次， 进一步添加相同的溶液5ml，以室温静置2小时之后，自然滴下溶液， 向其中添加5ml的0.2M甘氨酸-盐酸pH3，进一步添加相同的溶液 5ml，静置5分钟之后自然滴下。最后，用20ml的PBS置换色谱柱之 后自然滴下，添加1％NP40蛋白酶抑制剂、0.05％NaN3/PBS，回收凝 胶。
7-4细胞膜上蛋白的生物素标识和细胞溶胞产物的制作
培养肝癌细胞株的生物素标识如下进行。即，将用5个15cm培养 皿培养而得的培养细胞HLF用PBS洗净2次之后，添加用细胞解离缓 冲液(GIBCO公司制)调整到5mg/ml浓度的胶原酶I(GIBCO公司 制)，用CO2孵育箱使其在37℃反应，使细胞游离之后，用培养基回收， 用PBS(-)将其洗净2次之后，用血球计算盘算出细胞数，用PBS (-)悬浮，使得达到5x107/ml左右。向其中等量加入用PBS调整到 1mg/ml的EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit(PIERCE公司)， 以室温静置30分钟之后，用PBS洗净2次。
对生物素标识细胞的细胞溶胞产物的调整如下。即，向上述的生物 素标识细胞中添加4ml的溶胞缓冲液(1％NP40/去垢剂碱性溶液，去垢 剂碱性溶液的组成为20mM HEPES pH8.0，140mM NaCl，蛋白酶抑制 剂)，将细胞悬浮，放到冷却好的DOUNCE均化器中进行均化之后，向 溶液中添加1/2量(2ml)的去垢剂混合溶液(1％NP40，triton X-100，b-D- 麦芽糖苷，正辛基b-D-葡萄糖苷，正辛基b-D-麦芽糖苷，正癸基b-D- 麦芽糖苷，脱氧胆酸各0.5％/去垢剂碱性溶液)，以4℃旋转混合4小时。 将该溶液以100000rpm离心30分钟之后用MILLEX-GP0.22μm过滤 器进行过滤。
7-5免疫沉淀反应
首先，将经固相化的抗体(以下记载为抗体珠)约60μl(溶液150μl 左右)加入2ml管中，向其中添加4mM生物素1/10体积(15μl左右)。 向其中添加混合有0.5个培养皿份的溶胞产物(600μl)和60μl的生物 素溶液而得的物质，以4℃边搅拌边使其反应数小时之后，将管离心 (5500g，1分钟，4℃)，将上清除去。向其中添加800μl洗净用生物素 /溶胞产物一T缓冲液(0.5mM生物素，0.1％Tween20/PBS)，进行2、 3次颠倒混合之后，将管离心(5500g，1分钟，4℃)，将上清除去。再 次进行该洗净操作之后，向抗体珠中加入洗脱用柠檬酸溶液(50mM柠 檬酸pH2.5)30μl，进行搅拌之后，将管离心(5500g，1分钟，4℃)， 回收上清。在剩余的抗体珠中再次加入洗脱用柠檬酸溶液30μl，进行搅 拌，将管离心(5500g，1分钟，4℃)，回收上清。将该洗脱操作进一步 反复3次来回收样品溶液，向其中加入3M Tris进行中和。用SDS-PAGE 泳动该样品，用银染色进行带的确认。对于该样品，同时进行使用抗链 霉生物素-HRP(Anti-Streptavidin，IgG Fraction，Conjugated to Peroxidase CORTEX biochem公司)的蛋白质印迹，从而检测经生物素 化的膜蛋白的带(图13)。
7-6对于切出的带的质谱解析
7-6-1凝胶内胰蛋白酶消化
将对应于所检出膜蛋白的部分在凝胶内进行胰蛋白酶消化，回收 肽。根据常规方法进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，切出通过用考马斯 亮蓝染色而得到的带。将其浸于200mM碳酸氢铵-50％乙腈溶液中， 在37℃振荡45分钟后，丢弃溶液，通过反复同样的操作2次来除去考 马斯亮蓝。将该凝胶减压干燥，向其中每凝胶切片的单位面积(mm2) 添加4μl溶解于40mM碳酸氢铵(pH8.1)-10％乙腈中的胰蛋白酶 (20μg/ml)，在室温下放置1小时使其充分浸润。向其中添加为先加量 的2.5倍量的胰蛋白酶溶液，在37℃静置18小时。用带有孔大小为 0.22μm的过滤器的管将其过滤，回收通过胰蛋白酶切断抗原而生成的 肽。
7-6-2利用质量分析进行的抗原鉴定
将凝胶内通过胰蛋白酶消化而得到的样品加到与电喷射离子化方 式离子阱四极杆型质量分析装置相连的HPLC中。HPLC的反相色谱柱 中，根据含有0.1％TFA的从0％到80％的乙腈的直线浓度梯度变化， 将因疏水性不同而依次洗脱的各肽用电喷射法离子化，来分析各肽的质 量。
同时，分析由于与在这些离子的飞行路径途中放置的氦原子冲突 而产生的各肽的限定分解产物的质量。通过限定分解如果一个氨基酸脱 落，则只有脱落的氨基酸的质量份观察到小离子，所以根据其的质量差 可以鉴定脱落的氨基酸的种类。进而，如果还有一个氨基酸脱落，则只 有脱落的氨基酸的质量份观察到小离子，所以根据其的质量差同样可以 鉴定脱落的氨基酸的种类。通过进行同样的实验数据解析，可以确定内 部氨基酸序列。通过使用所公开的氨基酸序列数据库来检索所得氨基酸 内部序列的匹配，从而进行抗原的鉴定。其结果可知，IgSF4(Accession No.NM01433、Definition：Homo sapiens immunoglobulin superfamily， member4(IGSF4)，mRNA)是抗原(图14)。另外，鉴定结果确认：由 所鉴定的蛋白质的氨基酸序列类推的总质量与由进行胰蛋白酶分解前 的抗原的SDS聚丙烯酰胺电泳的结果而得到的分子量的实验数据不矛 盾。
8.IgSF4表达实验
8-1IgSF4cDNA片段的分离
(1)RNA纯化
将HLF细胞用15cm的培养皿7个培养之后，用GIBCO公司制的 TRYSIN-EDTA(1X)使其游离之后，用培养基回收，用PBS(-)洗净2次 之后，用Amersham Pharmacia公司制的RNA提取试剂盒提取总RNA。 即，在细胞中加入提取缓冲液5ml之后，使其通过21G针10次，将其 装入日立公司制的13PA管中的5ml的CsTFA之上形成多层，使用日 立公司制的himac CP80beta进行15℃、36000rpm、20小时的离心， 将所得沉淀物用没有RNA酶的TE悬浮，得到822μg的总RNA。
(2)逆转录反应
逆转录反应使用Invitrogen公司制的Superscript First-Stand Synthesis System For RT-PCR。反应条件如下。
HLF总RNA                      10μg
200pmol/μl hIgSF4B           1.2μl
10mM dNTP                     2μl
QW                            20.8μl
hIgSF4B：5’-GTGTGCGGCCGCCTAGATGAAGTACTCTTTCTTTTC-3’(序列
号：211)
将这些物质充分混合之后以65℃处理5分钟，在冰上静置2分钟。 接着加入以下的试药以42℃静置2分钟。
5x First Strand buffer              8μl
1M DTT                              4μl
RNA酶抑制剂                         2μl
接着加入Superscript II2μl，以42℃使其反应50分钟之后，以70 ℃处理15分钟，停止逆转录反应。向其中加入2μl核糖核酸酶H，以 37℃处理15分钟后，进行酚/氯仿的提取和乙醇沉淀，最后悬浮在QW 80μl中。
8-2表达载体的构建
(1)载体
构建用于使IgSF4的cDNA表达的载体pCMVSalNot。载体构建中 使用Clontech公司制的pCMV-Script。将其用SacI和KpnI进行消化 之后，用0.7％琼脂凝胶进行电泳，切出4.3kb的带，用TAKARA公司 制的suprec01提取DNA片段，将其用酚/氯仿处理之后，进行乙醇沉淀， 用QW悬浮所得DNA。
(2)插入片段
将合成DNA CMKM-SacIF和CMKM-KpnIR在95℃处理5分钟 之后恢复到室温，然后用SacI和KpnI进行消化，将其用酚/氯仿提取 之后，进行乙醇沉淀，用QW悬浮所得DNA。
CMKM-SacIF：5’caaaagctggagctcgtcgactacccagaattcaagcttattcgcgcggccgcggtacca
ggtaagtg3’(序列号：212)
CMKM-KpnIR：5’cacttacctggtaccgcggccgcgcgaataatctttccttctgggtagtcgacgagctcca
gcttttg3’(序列号：213)
(3)结合反应
将上述载体和插入片段混合后进行结合反应，使用所得的反应液将 大肠杆菌DH12S转化后播种到LBGK板上，以30℃彻夜培养，得到大 肠杆菌菌落。将其用2ml的2xYTK于30℃彻夜培养，将所得菌液用 KURABO公司制的PI-50进行处理，得到DNA溶液。接着，将4μl的 该DNA在85℃下处理5分钟之后，加入2μl的3.2pmol/μl的T7引物 和4μl的DTCS QUICK START MIX，进行96℃20秒、50℃20秒、60 ℃4分钟的处理40次循环之后，用BECKMAN公司制的SEQ2000DNA 分析系统解析所得反应液，从而确定碱基序列。
8-3PCR反应、向表达载体的重组
为了分离IgSF4的cDNA克隆，使用东洋纺公司制的KOD来进行 PCR反应。反应条件如下。
200pmol/μl hIgSF4A 0.25μl
200pmol/μl hIgSF4B 0.25μl
cDNA                   1μl
10xKOD缓冲液           5μl
25mM MgSO4             2μl
2mM dNTP               1μl
KOD plus               1μl
QW                  35.5μl
hIgSF4A：5’-GAGAGTCGACGCCACCATGGCGAGTGTAGTGCTGCCGAGC-3’
(序列号：214)
hIgSF4B：5’-GTGTGCGGCCGCCTAGATGAAGTACTCTTTCTTTTC-3’(序列
号：211)
将这些物质在冰上混合后，使矿物油形成多层，以94℃处理3分钟， 接着进行以下的循环33次。
94℃    30秒
68℃    3分钟
将反应产物用0.8％琼脂凝胶进行电泳，切出约1.4kb的带。用 QIAGEN公司制的Gel Extration Kit将其回收之后，进行利用限制性内 切酶SalI和NotI的消化，将所得DNA片段组入到动物细胞用表达载 体pCMV-SalNot中。将使用其把大肠杆菌DH12S转化而得的物质播种 到LBGK板上，以30℃彻夜培养后，得到大肠杆菌菌落。将其用2ml 的2xYTK于30℃彻夜培养后，将所得菌液用KURABO公司制的PI-50 进行处理，得到DNA。DNA用BECKMAN公司制的SEQ DTCK-Quick Start Kit进行反应。反应如下。将4μl的DNA在85℃处理5分钟后， 加入以下的引物(T3或T7引物)3.2pmol/μl 2μl和DTSC Quick Start Mix4μl，进行96℃20秒、50℃20秒、60℃4分钟的处理40次循环。
引物
T3引物：AATTAACCCTCACTAAAGGG(序列号：215)
T7引物：TAATACGACTCACTATAGGG(序列号：216)
用BECKMAN公司制的SEQ2000DNA分析系统解析所得反应液， 从而确定碱基序列。其结果，分离出IgSF4N(cDNA1：图15-1、图 15-2：序列号217)和IgSF4X(cDNA2：图16-1、图16-2：序列 号218)这2种作为IgSF4 cDNA克隆。
8-4IgSF4表达载体向NIH3T3-13C7细胞的导入
首先，将导入DNA12μg和Opti-MEM(GIBCO公司制)0.75ml 混合，在室温下静置5分钟。向其中加入将Opti-MEM(GIBCO公司 制)0.75ml和lipofectamine 2000 30μl混合并在室温静置5分钟而得的 物质，充分搅拌后在室温静置20分钟。将其加入到在10cm培养皿中培 养的NIH3T3-13C7细胞，用CO2孵育器在37℃培养1天。
8-5FCM、细胞染色
细胞用2mg/ml胶原酶I(Gibco BRL)/细胞解离缓冲液(Gibco BRL)使 其从培养皿中解离之后，用10％FBS/D MEM进行回收。用2.5％BSA、 0.05％NaN3/PBS(BSA溶液)将其洗净之后，悬浮在2.5％正常羊血清/BSA 溶液100μl中，在冰上静置30分钟之后，加入cp3型抗体(035-029、 035-212、035-215、035-273、035-283、040-131、051-054、051 -181、YA14)到5μg/ml，在冰上静置1小时。用BSA溶液将其洗净一 次之后，用抗cp3小鼠单克隆抗体(株式会社医学生物学研究所)5μg/ml 的BSA溶液100μl进行悬浮，在冰上静置1小时。用BSA溶液将其洗净 一次之后，用Alexa488结合抗小鼠IgG山羊抗体(Molecularprobe公司 制)5μg/ml的BSA溶液100μl进行悬浮，在冰上静置1小时。用BSA溶 液将其洗净两次之后，用BSA溶液500μl进行悬浮，用Ceu Strainer(Becton Dickinson公司制)进行处理之后，用Becton Dickinson公司制的 FACScaliver(FCM)来解析细胞集团的荧光强度。
FCM的结果示于图17中。没有基因导入的NIH3T3-13C7几乎没有 被染色。另一方面，在强制表达IgSF4(cDNA1或cDNA2)的NIH3T3-13C7 中，观察到荧光强度达到约2倍。
将强制表达IgSF4的细胞免疫染色的结果示于图18中。在强制表达 IgSF4(cDNA1或cDNA2)的细胞集团中看到明显的染色，该结果与上述 的FCM的结果一致。
9.表达抑制实验(RNAi)
9-1 d-siRNA的制作
使用由Hep2G2的cDNA为模板，用hIGSF4C、hIGSF4D引物进 行扩增的880bp的DNA片段。
hIGSF4C(24mer)：5’-TTCAGGGACTTCAGGCCTTTGAAG-3’(序列号：219)
hIGSF4D(24mer)：5’一CACCGATCACGGCATGATCCACTG-3’(序列号：220)
siRNA的制作方法根据INVITROGEN公司的方案。即，使模板 DNA100ng结合T7连接体之后，分到2个管中，一个管用hIGSF4C 和T7引物进行PCR反应，来制作反义表达用DNA片段；另一个管用 hIGSF4D引物和T7引物进行PCR反应，来制作有义表达用DNA片段。 对于这些DNA片段，分别进行利用T7RNA聚合酶的反应之后，使用 RNAi纯化试剂盒来将合成RNA回收，分别得到约30μg的RNA产物。 将混合有这些物质的管放入沸水中进行退火，制作双链RNA。向其中 加入切酶，在37℃反应17小时后，用RNAi纯化试剂盒回收21μg的 d-siRNA。
9-2RNAi反应
细胞使用高分化型肝癌细胞株HLF。细胞使用在前一天用6孔板 (Falcon3516)进行传代而得的细胞。首先，将Invitrogen公司的 lipofectamine 2000 10μg与GIBCO公司制的Opti-MEM500μg混合后， 加入d-siRNA1μg，缓慢混合后，在室温静置15分钟，将其加入到细胞 中，用CO2孵育器培养2天。
9-3FCM、细胞染色
细胞用2mg/ml胶原酶I(Gibco BRL)/细胞解离缓冲液(Gibco BRL)使 其从培养皿中解离之后，用10％FBS/D MEM进行回收。用2.5％BSA、 0.05％NaN3/PBS(BSA溶液)将其洗净之后，悬浮在2.5％正常羊血清/BSA 溶液100μl中，在冰上静置30分钟之后，加入cp3型抗体(035-029、 035-212、035-215、035-273、035-283、040-131、051-054、051 -181)到5μg/ml，在冰上静置1小时。用BSA溶液将其洗净一次之后， 用抗cp3小鼠单克隆抗体(株式会社医学生物学研究所)5μg/ml的BSA 溶液100μl进行悬浮，在冰上静置1小时。用BSA溶液将其洗净一次之后， 用Alexa488结合抗小鼠IgG山羊抗体(Molecularprobe公司制)5μg/ml 的BSA溶液100μl进行悬浮，在冰上静置1小时。用BSA溶液将其洗净 两次之后，用BSA溶液500μl进行悬浮，用Cell Strainer(Becton Dickinson 公司制)进行处理之后，用Becton Dickinson公司制的FACScaliver(FCM) 来解析细胞集团的荧光强度。
通过离心将用荧光抗体标识的细胞收集之后，丢弃上清，向其中加 入BECKMAN COULTER公司制的OptiLyse B50μl，以室温静置10分钟， 将细胞固定。向其中加入10ng DAPI/ml PBS溶液950μl，以室温静置10 分钟，离心后收集细胞，封装到ICN公司制的MULTITEST SLIDE中进 行显微镜观察。
以上的RNAi实验结果示于图19、20中。在FCM解析中，进行 RNAi处理的物质荧光强度在整体上降到约1/1.6，看到明显的抗体识别 的降低(图19)。细胞染色的结果也显示出明显的膜染色降低(图20)， 这些结果强烈提示：样品抗体识别的抗原是IgSF4。
10.表达抑制实验2(RNAi)
10-1诱导型RNAi载体的构建
在细胞培养液中存在四环素(tetracyclin)的条件下使RNAi中的 干涉RNA表达，使用能够去除、控制对象基因表达的系统进行IgSF4 的RNAi实验。
把IgSF4翻译区域序列的一部分GGCCCAACCTGTTCATCAATA (序列号：269)作为RNAi标的。载体的构建根据Invitrogen的Block-iT Inducible Lentiviral RNAi System的操作指南。即，在1x退火缓冲液 的条件下分别混合DNA832(5’-CACCAGGCTCAACTTGTTCGTCAA TATTCAAGAGATATTGATGAACAGGTTGGGCC-3’：序列号270)和 833(5’-GGCCCAACCTGTTCATCAATATCTCTTGAATATTGACGAA C AAGTTGAGCCT-3’：序列号：271)，使得浓度达到50μM，以95℃ 进行4分钟热处理之后，以室温静置5分钟，用1x退火缓冲液将其稀 释1万倍。将该双链ds oligo 5μl和1μl的pENTR/H1/TO混合，用附属 的连接系统进行结合反应之后，用附属的One Shot TOP10 Competent E.coli进行转化，播种到50mM卡那霉素板上，得到转化体菌落。用加 有50mM卡那霉素的LB培养基将其培养后，用Qiagen的QIAprep Spin Miniprep kit调制DNA，使用H1正向引物和V5反向引物，用Beckman Coulter公司制的GenomeLab DTCS-Quick Start Kit进行序列反应，解 析所得序列，得到用pENTR/H1/TO的2138将合成DNA832序列组入 的目的克隆(Entryclone)。将100ng该Entryclone和 pLenti4/BLOCK-iT-DEST vector150ng混合，用TE缓冲液(pH8.0) 滴定到8μl后，混合附属的LR clonase II enzyme mix2μl，在25℃静置 1小时，将所得反应物用One Shot Stbl3 Competent E.coli进行转化， 播种到100mg/ml氨苄青霉素板上，得到转化体菌落。将其用加有 100mM氨苄青霉素的LB培养基进行培养之后，用Qiagen的QIAprep SpinMiniprepkit调制DNA，使用H1正向引物 (5’-TGTTCTGGGAAATCACCATA-3’：序列号：272)和V5反向引 物(5’-ACCGAGGAGAGGGTTAGGGAT-3’：序列号：273)，用Beckman Coulter公司制的GenomeLab DTCS-Quick Start Kit进行序列反应，解 析所得序列，得到与entry vector相同的序列，由此可判断下面所示的 序列部分(下划线部分是合成DNA导致的插入序列(序列号：274)) 被组入到pLenti4/BLOCK-iT-DEST中(pLenti4/BLOCK-iT-DEST表 达构建)。
2087-GAAATCCCTATCAGTGATAGAGACTTATAAGTTCCCTATCAGTGATA
GACACACCAGGCTCAACTTGTTCGTCAATATTCAAGAGATATTGATGAACA
GGTTGGGCCTTTTTTGTCGAGCTT
10-2 确认Entry clone的RNAi作用
用以下的方法确认在Entry clone阶段具有RNAi作用。在前一天 用2个10cm的培养皿进行传代，使得下述的表达阻抑物的HLF宿主 细胞株长满50％(培养基是3μg/ml杀稻瘟菌素，10％FBS，1％青霉素 /链霉素-D MEM)。当天细胞由于长满80～90％，所以将培养基置换成 10％FBS-D MEM培养基(没有抗生物质)。
在Entry clone的质粒10μg中加入Gibco BRL公司制的Opti-MEM 1.5ml，缓慢地混合。用别的管装Invitrogen公司的lipofectamine2000 36μl与Opti-MEM1.5ml，缓慢混合。将它们在室温下静置5分钟后， 混合，进一步在室温下静置20分钟。将其加入到表达阻抑物的HLF宿 主细胞株中，缓慢混合后，用CO2孵育器进行培养。6小时后，将培养 基更换成3μg/ml杀稻瘟菌素、10％FBS(四环素实验用)、1％青霉素/ 链霉素-D MEM。第二天，一个培养皿用1μg/ml四环素、3μg/ml杀稻 瘟菌素、10％FBS(四环素实验用)、1％青霉素/链霉素-D MEM(有四 环素)进行培养基更换，另一个培养皿用3μg/ml杀稻瘟菌素、10％FBS (四环素实验用)、1％青霉素/链霉素-D MEM(无四环素)进行培养基 更换。四环素作用后在48小时的时刻回收细胞，用FCM确认RNAi 作用。
10-3FCM解析
细胞用2mg/ml胶原酶I(Gibco BRL)/细胞解离缓冲液(Gibco BRL)使 其从培养皿中解离之后，用10％FBS/D MEM进行回收。用5％BSA、0.05 ％NaN3/PBS(BSA溶液)将其洗净之后，悬浮在2.5％正常羊血清/BSA 溶液100μl中，在冰上静置30分钟之后，加入35-273cp3到5μg/ml，在 冰上静置1小时。用BSA溶液将其洗净一次之后，用抗cp3兔多克隆抗体 (MBL公司特注)5μg/ml的BSA溶液100μμl进行悬浮，在冰上静置1小 时。用BSA溶液将其洗净一次之后，用Alexa488结合抗小鼠IgG山羊抗 体(Molecularprobe公司制)5μg/ml的BSA溶液100μμl进行悬浮，在冰 上静置1小时。用BSA溶液将其洗净两次之后，用PBS1ml进行悬浮， 用Cell Strainer(Becton Dickinson公司制)进行处理之后，用Becton Dickinson公司制的FACScaliver(FCM)来解析细胞集团的荧光强度。其 结果，观察到：使四环素作用的物质与不使四环素作用的物质相比，细胞 集团的荧光强度显著减少。
10-4Lentivirus的调制
关于四环素阻抑物表达用质粒pLenti6/TR和上述的pLenti4/ BLOCK-iT-DEST表达构建，进行Lentivirus的调制。方法如下。293FT 细胞以实验当天约90％长满的方式进行传代。当天DNA敏化实验前更 换成去除抗生物质的培养基。将质粒3μg和附属的ViraPower Packaging Mix9μg混合，向其中加入Gibco BRL公司的Opti-MEM1.5ml，缓慢 地混合。用别的管装Invitrogen公司的lipofectamine2000 36μl和 Opti-MEM 1.5ml，缓慢混合。将它们在室温下静置5分钟后，混合， 进一步在室温下静置20分钟。向其中加入经胰蛋白酶剥离的293FT细 胞1.2x106个，缓慢混合后，转移到10cm的培养皿中，用CO2孵育器 进行培养。第二天将培养基更换成加有10％FBS、2mM L-谷胺酰胺、 0.1mM MEM Non Essential氨基酸、1％青霉素/链霉素、1mM MEM 丙酮酸钠的D MEM，进一步培养2天。DNA敏化后在72小时的时刻 将培养基回收，用0.22μm的过滤器进行过滤灭菌。
10-5确认Lentivirus的效价
培养HLF细胞，用6孔板进行传代，使得在实验的前一天约25％ 长满，在实验当天约30～50％长满。当天制作用培养基(10％FBS、1％ 青霉素/链霉素-D MEM)稀释的病毒液1ml，使其作用于各孔之后， 加入Polyblene，使其最终浓度达到6μg/ml，用CO2孵育器培养1天。 第二天，进行培养基更换。再下一天将培养基更换为选择培养基。对于 pLenti6/TR病毒，使用3μg/ml杀稻瘟菌素、10％FBS、1％青霉素/链霉 素-D MEM。对于pLenti4/BLOCK-iT-DEST表达构建，首先用胰蛋白 酶将细胞剥离后，用10cm的培养皿在100μg/ml Zeocin、10％FBS、1％ 青霉素/链霉素-D MEM培养基中进行培养。计算培养基更换后2周时 间形成的菌落，由此算出病毒液的效价。其间，培养基更换每2天进行 一次。
10-6四环素阻抑物表达的宿主细胞株的构建
挑出10个通过上述的pLenti6/TR病毒的效价确认而得到的菌落， 分别用3μg/ml杀稻瘟菌素、10％FBS、1％青霉素/链霉素-D MEM培养 基进行培养后，用胰蛋白酶将细胞回收，用PBS洗净，用PBS悬浮。 用Sonifier对其进行超声波处理后，用Micro BCA测定蛋白量，用 SDS-PAGE泳动20μg的蛋白量，用Mo Bi Tec公司制的抗四环素阻抑 物兔子多克隆抗体进行蛋白质印迹，从而得到阻抑物表达良好的克隆。
10-7hsRNAi细胞株的选择
将上述的四环素阻抑物表达的宿主细胞株用3μg/ml杀稻瘟菌素、 10％FBS、1％青霉素/链霉素-D MEM培养基进行培养，用10cm的培 养皿进行传代，使得前一天达到25％长满。当天使其感染pLenti4/ BLOCK-iT-DEST表达构建病毒约200菌落，并使polybrane作用。第 二天更换培养基。再下一天用胰蛋白酶剥离后回收细胞，制作3阶段的 稀释系列，用15cm的培养皿进行传代。培养基为50mM HEPES、3μg/ml 杀稻瘟菌素、100μg/ml Zeocin、10％FBS、1％青霉素/链霉素-D MEM， 首先在4℃处理2小时后，用CO2孵育器进行37℃的培养。以后每2 天用100μg/ml Zeocin、10％FBS、1％青霉素/链霉素-D MEM培养基进 行培养基更换，14天后分离24个菌落。将它们分别培养，得到12个克 隆。
10-8四环素诱导实验
在前一天，分别将上述各细胞克隆每2孔地传代于6孔板上，使得 约25％长满。培养基是3μg/ml杀稻瘟菌素、100μg/ml Zeocin、10％FBS、 1％青霉素/链霉素-D MEM，FBS使用Invitrogen的四环素实验用的 FBS。当天，细胞达到50～60％长满。与此相对，用加有1μg/ml四环 素的培养基和无加入的培养基进行培养基更换。培养基更换48小时后， 回收细胞进行FCM解析。
10-9FCM解析
细胞用2mg/ml胶原酶I(Gibco BRL)/细胞解离缓冲液(Gibco BRL)使 其从培养皿中解离之后，用10％FBS/D MEM进行回收。用5％BSA、0.05 ％NaN3/PBS(BSA溶液)将其洗净之后，悬浮在2.5％正常羊血清/BSA 溶液100μl中，在冰上静置30分钟之后，加入35-273cp3到5μg/ml，在 冰上静置1小时。用BSA溶液将其洗净一次之后，用抗cp3兔多克隆抗体 (MBL公司特注)5μg/ml的BSA溶液100μl进行悬浮，在冰上静置1小 时。用BSA溶液将其洗净一次之后，用Alexa488结合抗兔IgG山羊抗体 (Molecularprobe公司制)5μg/ml的BSA溶液100μl进行悬浮，在冰上 静置1小时。用BSA溶液将其洗净两次之后，用PBS 1ml进行悬浮，用 Cell Strainer(Becton Dickinson公司制)进行处理之后，用Becton Dickinson公司制的FACScaliver(FCM)来解析细胞集团的荧光强度。如 图21所见，对于在加有四环素的培养基中培养的细胞，RNAi起作用，与 不使抗体作用的情况相同，没有看到FCM转变，可以确认035-273抗体 的识别对象分子是IgSF4。
11.抗体克隆对各种细胞株的反应性
分离得到的各种抗体克隆对各种细胞株的反应性如下通过FCM来 确认。
(1)研究对于肝癌来源细胞株HEPG2(图22)和HLF(图23)的 FCM反应性。
(2)研究对于人胎儿肾上皮来源细胞株293T(图24)的FCM反应 性。
(3)研究对于人肾癌来源株ACHN(图25)的FCM反应性。
(4)进行把KK1用作人ATL来源株的FCM解析(图26)。
(5)用FCM比较由上述结果认为反应性最佳的035-212抗体 的反应性和其他ATL细胞表面标记(抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗 CD25的各种抗体)的反应性(图27)。
(6)作为IgSF4的非表达性ATL细胞株和表达性ATL细胞株的 比较，在IgSF4的启动子被甲基化而得的人ATL来源细胞株ED、Su9T、 SO4和没有甲基化的人ATL来源细胞株KK1、KOB和ST1之间用FCM 比较(图28)。
(7)认为ATL是起因于HTLV感染而发病的特殊白血病。在此， 作为非HTLV感染T细胞株和HTLV感染T细胞株的比较，在人非ATL 来源细胞株MOLT4(人T细胞性白血病来源株)和Jurkat与人T细 胞指向性病毒感染(HTLV感染株)T细胞淋巴瘤来源的HUT102、MT-2 之间用FCM比较(图29)。
(1)～(7)的FCM实验操作如下进行。
首先，对于附着性细胞株来说，使用如下培养的物质：置于6孔板 (Falcon3516)上，ATL来源细胞株等浮游细胞株置于浮游培养烧瓶 (70ml(Slant Neck))中，使用培养基(RPMI-1640：Sigma-Aldrich 公司制，10％牛胎儿血清，1％青霉素链霉素溶液)，在CO2孵育器内于 37℃进行培养。
i)附着性细胞株用2mg/ml胶原酶I(Gibco BRL)/细胞解离缓冲液 (Gibco BRL)将其从培养皿中解离，用10％FBS/D MEM进行回收。另一 方面，为浮游系细胞时，为了一次除去培养基而以原来的状态进行离心分 离(400xg，4℃，2分钟)。这样的操作后，用2.5％BSA，0.05％NaN3/PBS (BSA溶液)洗净各细胞，悬浮在2.5％正常羊血清/BSA溶液100μl中， 在冰上静置30分钟之后，以106个/孔的方式进行分注，进行离心分离 (400xg，4℃，2分钟)，将上清除去。
ii-1)为cp3型抗体时，加到5μg/ml，在冰上静置1小时。用BSA 溶液将其洗净一次之后，用抗cp3小鼠单克隆抗体(株式会社医学生物学 研究所)5μg/ml的BSA溶液100μl进行悬浮，在冰上静置1小时。用BSA 溶液将其洗净一次之后，用Alexa488结合抗小鼠IgG山羊抗体 (Molecularprobe公司制)5μg/ml的BSA溶液100μl进行悬浮，在冰上 静置1小时。用BSA溶液将其洗净两次之后，用BSA溶液500μl进行悬 浮，添加50μl固定液(甲醛)，静置10分钟。然后添加PBS150μl，用Cell Strainer(Becton Dickinson公司制)进行处理之后，用Becton Dickinson 公司制的FACScaliver(FCM)来解析细胞集团的荧光强度((1)～(3))。
ii-2)为pp型(蛋白质A型)抗体时，加到5μg/ml，在冰上静置1 小时。用BSA溶液将其洗净一次之后，用Alexa488结合抗小鼠IgG山羊 抗体(Molecularprobe公司制)5μg/ml的BSA溶液100μl进行悬浮，在 冰上静置1小时。用BSA溶液将其洗净两次之后，用BSA溶液500μl进 行悬浮，添加50μl固定液(甲醛)，静置10分钟。然后添加PBS150μl， 用Cell Strainer(Becton Dickinson公司制)进行处理之后，用Becton Dickinson公司制的FACScaliver(FCM)来解析细胞集团的荧光强度 ((4)～(7))。
ii-3)此外，关于KK1细胞，使用其他ATL细胞表面标记抗体(抗 人CD3-小鼠抗体(Becton Dickinson公司制)、抗人CD4-小鼠抗体(Becton Dickinson公司制)、抗人CD8-小鼠抗体(Becton Dickinson公司制)、抗 人CD25-小鼠抗体(Becton Dickinson公司制))，为了与所获取的抗体比 较，按以下的顺序来作为对照。将上述抗体加到5μg/ml，在冰上静置1小 时。用BSA溶液将其洗净一次之后，用Alexa488结合抗小鼠IgG山羊抗 体(Molecularprobe公司制)5μg/ml的BSA溶液100μl进行悬浮，在冰 上静置1小时。用BSA溶液将其洗净两次之后，用BSA溶液500μl进行 悬浮，添加50μl固定液(甲醛)，静置10分钟。然后添加PBS150μl，用 Cell Strainer(Becton Dickinson公司制)进行处理之后，用Becton Dickinson公司制的FACScaliver(FCM)来解析细胞集团的荧光强度(使 用(5)的抗CD抗体的情况)。
本解析预先在受检抗体上标识荧光色素(Alexa488等)，使样品抗体 与细胞反应之后，使其与受检抗体反应。对应于在细胞表面存在的抗原量 的抗体量存在差别，其结果为荧光强度不同，所以可以推定与在该细胞表 面存在的抗原的亲和性和抗原量。进而，为了从测定值中除去死细胞和碎 片等，将前方散射光(Forward Scatter：FSC)设为X轴，将侧方散射光 (Side Scatter：SSC)设为Y轴，根据由斑点印迹展开得到的数据，对于 认为活细胞的集团(由于使用培养细胞因而几乎为相同集团)进行门控， 仅在该闸门内进行荧光强度的测定。
由以上(1)～(4)的实验结果(图22～图26)可知，由于各种抗 体一样地看到几乎相同的转变，所以可确认能够获取可以说捕获肾癌、肝 癌、ATL中所见的细胞膜表面上的IgSF4作为标记的大量抗体。此外，根 据(5)的实验结果(图27)，与作为对照的ATL细胞表面标记CD3、CD4、 CD8和CD25相比，IgSF4可以说是不弱或更好的ATL细胞表面标记。此 外，通过该实验，证明能够获取特异性识别为膜表面上的分子的、成为新 的ATL细胞表面标记的IgSF4。
(8)利用RNA印迹进行的IgSF4的mRNA表达解析(图30) 使用Fask Track2.0(Invitrogen，Carlsbad，CA)从各细胞中提取 mRNA。其后将得到的mRNA 3μg用1％琼脂凝胶在MOPS缓冲溶液中进 行电泳后，转录到尼龙膜(BIODYNE Pall BioSupport，East Hills，NY)上。 然后使用从IgSF4的411位到1371位的961bp的p32标识的探针来进行 RNA印迹。探针的标记使用Prime-It II Random Primer Labeling Kit (Stratagene，La Jolla，CA)。
综合考虑(6)和(7)的实验结果(图28、图29)和RNA印迹法的 结果(图30)，可知能够获取识别IgSF4分子在细胞表面上表达的、ATL 来源细胞株(KK1、KOB、ST1)和HTLV感染细胞(HUT102、MT-2) 的抗体(通过启动子的甲基化而看不到IgSF4表达的细胞，和HTLV非感 染细胞不能用该抗体识别)。
12.抗IgSF4抗体的FCM解析和ADCC活性测定
对于抗体依赖性细胞介导的细胞毒(Antibody-dependent Cell- mediated cytotoxicity、以下简称为ADCC活性)来说，是杀伤、攻击 病毒感染细胞等对人体有害的细胞的免疫反应，其机理是把在膜表面广 泛结合有抗体的细胞看作标的，而且以自然杀伤细胞或单核细胞为主的 “效应细胞”进行攻击。ADCC的细胞毒性的发生依赖于特异性结合在 细胞膜表面抗原的抗体和效应细胞的组合。
几个特异性结合在肿瘤表面抗原的抗体显示出抗肿瘤效果、癌治疗 效果，作为抗体医药被销售，但有报道这些抗体的主要作用机制为 ADCC。因此，对于本发明人等分离成功的癌抗原特异性抗体是否具有 抗肿瘤效果，即作为用于评价是否有希望作为癌治疗用抗体的方法，尝 试了ADCC的检测。在以下所示的实验中，使用使在标的细胞上识别 IgSF4的人IgG型抗体克隆反应而提示于效应细胞的方法。ADCC的检测 如下：使用通过试药的显色来检测从被效应细胞攻击的标的癌细胞向培养 基中漏出的乳酸脱氢酶的酶活性的原理的细胞毒性检测试剂盒，来算出伤 害的程度。
12-1IgG型抗体的FCM解析
i)A431细胞株用2mg/ml胶原酶I(Gibco BRL)/细胞解离缓冲液 (Gibco BRL)将其从培养皿中解离后，用10％FBS/D MEM进行回收。用 2.5％BSA，0.05％NaN3/PBS(BSA溶液)将其洗净后，悬浮在2.5％正常羊 血清/BSA溶液100μl中，在冰上静置30分钟之后，以106个/孔的方式进 行分注。
将调制好的IgG型抗体035-029加至5μg/ml，在冰上静置1小时。 用BSA溶液将其洗净一次之后，用Alexa488结合抗人IgG山羊抗体 (Molecularprobe公司制)5μg/ml的BSA溶液100μl进行悬浮，在冰上 静置1小时。用BSA溶液将其洗净两次之后，用BSA溶液500μl进行悬 浮，添加50μl固定液(甲醛)，静置10分钟。然后添加PBS 150μl，用Cell Strainer(Becton Dickinson公司制)进行处理之后，用Becton Dickinson 公司制的FACScaliver(FCM)来解析细胞集团的荧光强度(图31)。
12-2IgG型抗体的调制
将导入有编码ADCC活性测定实验中使用的IgG型抗体(克隆号035 -029、YA14(抗流感病毒抗体)、HR1-007(抗响尾蛇毒抗体))的基因 片段的中国仓鼠卵巢细胞株CHO-K1，在无血清培养基(CHO-S-SFM II：Invitrogen公司制、1％(v/v)青霉素-链霉素溶液：Sigma-Aldrich 公司制、700μg/ml G418：Sigma-Aldrich公司制)大量培养烧瓶(Becton Dickinson公司制的CELLine1000Flask)中培养两周后，回收上清，使 其在Protein G结合亲和柱中反应。用PBS洗净后，用甘氨酸盐酸缓冲 液(pH2.7)使其从柱中洗脱，用Tris盐酸缓冲液(pH8.9)中和。对 于纯化得到的抗体样品来说，在实验中使用透析浓缩用管(Millipore 公司制、Amicon Ultra-15)，用PBS进行置换，浓缩而得。
12-3标的细胞的调制
作为使用的标的细胞，使用在直径150mm的培养皿上用液体培养 基1(Minimum Essntial Medium Alpha Medium：Invitrogen公司制、 10％(v/v)牛胎儿血清：Equitic-Bio公司制、1％(v/v)青霉素-链霉 素溶液：Sigma-Aldrich公司制)育成肺癌来源培养细胞VMRC-LCD (是从Japanese Collection of Research Bioresources中分给的)。将液 体培养基除去，用PBS10ml将细胞洗净2次，将溶液除去后，添加4 ％(w/v)胶原酶IV型(Invitrogen公司制)5ml，在37℃保温10分钟， 从而使细胞从培养皿中剥离。进而加入5ml的液体培养基2 (RPMI-1640、10％牛胎儿血清、1％青霉素-链霉素溶液： Sigma-Aldrich公司制)(RPMI-1640：Sigma-Aldrich公司制，10％(v/v) 牛胎儿血清、1％(v/v)青霉素-链霉素溶液)，使胶原酶反应停止， 回收浮游的细胞6.7x106个。进行离心分离(200xg、4℃、3分钟)将上 清除去后，以细胞密度达到3x105细胞/ml的方式用细胞毒性试验培养 基(Cytotoxic Medium，以下简称为CTM。RPMI-1640培养基、1％(v/v) 牛胎儿血清、1％(v/v)青霉素-链霉素溶液、1％(v/v)1M HEPES 缓冲液(pH7.0)：Invitrogen公司制)进行悬浮，在实验中使用。
12-4 含有效应细胞的末梢血单核细胞的调制
将从志愿者采血而得的添加肝素的末梢血30ml用PBS稀释到 80ml，在4个离心管中分注10ml淋巴细胞分离试药Ficoll Paque Plus (Amersham Bioscience公司制)而得的物质上形成多层，进行离心分 离(400xg、20℃、40分钟)。将单核细胞部分(包括淋巴细胞和单核细 胞)回收后用冷PBS稀释到80ml，通过离心分离(200xg、4℃、15分 钟)使其沉淀。将沉淀物用CTM进行悬浮，使得细胞密度达到7.5x106 个细胞/ml。
12-5 ADCC反应
在U底96孔板(Becton Dickinson公司制)上每孔添加66μl的标的 细胞(2x104个细胞)，加入IgG型抗体(3μg/ml)66μl之后，加入66μl 的末梢血单核细胞悬浮液(7.5x105个细胞)。E/T比率(效应细胞和标 的细胞的比率)为20。为了促进细胞之间的会合，进行离心分离(60xg、 4℃、5分钟)，使细胞沉向底部之后，用设定为37℃、5％CO2条件的 培养装置进行240分钟保温，诱导ADCC反应。各抗体样品调制成CTM 溶液。此外，对于各个样品，使用CTM作为阴性对照，作为乳酸脱氢 酶的最大游离量，使用在标的细胞中加有100μl的2％Triton X-100-CTM 溶液的物质(用Triton X-100预先将细胞破坏)。此外，对于各个试验组分 别使用3个孔。
12-6 细胞毒性试验
ADCC反应后，根据细胞毒性检测试剂盒(Roche Diagnostics公司 制)的方法如下进行操作。进行离心分离(350xg、4℃、10分钟)，回 收上清100μl，转移到平底96孔板(TPP公司制)上。对于各样品加入 细胞毒性检测用试剂盒的反应液100μl后，在室温下静置，从而诱导色 素的显色。显色的程度与培养上清中游离的乳酸脱氢酶的浓度成比例， 成为标的细胞的伤害指标。显色开始30分钟后，利用分光光度计测定 吸光度(OD490-OD620(背景吸光度))，对于各实验组，将3个孔的 吸光度平均，算出细胞毒性指数。预先只算出培养基的吸光度，通过下 面的计算式进行。
[数学式1]
A)不加效应细胞的实验组

B)加有效应细胞的实验组

在特异性结合于膜分子IgSF4的IgG型抗体、即克隆035-029 的情况下，加有效应细胞的实验组中细胞毒性有意义地上升(图32)。 即，显示出：效应细胞识别出特异性结合于标的细胞VMRC-LCD的抗 体克隆，攻击标的。视为与VMRC-LCD的表面抗原不相关的抗响尾蛇 毒IgG型抗体、克隆HR1-007和抗流感抗体YA14(结果没有图示)以 及在不加抗体克隆的实验组中，没有看到细胞毒性的上升。另外，对于 其他抗体克隆(035-273、051-054)，使cp3型抗体进行一次反应之 后，使用抗cp3兔子多克隆抗体作为二次抗体进行同样的ADCC活性 测定实验后，确认与抗体克隆035-029同样地具有ADCC活性(未出 示数据)。
由以上结果可确认成功地取得了如下抗体：通过IgSF4特异性地识 别癌细胞，然后利用ADCC活性发挥伤害效果的抗体。因此，这些抗 体作为以癌细胞为标的的抗体医药是有效的。
产业上的可利用性
通过本发明，以发现癌特异性表达、成为癌治疗或癌诊断的标的 的分子为基础，提供癌的治疗或癌诊断、或癌的发病机制等研究中有效 的方法。本发明提供的抗IgSF4抗体可期待作为以特异性表达IgSF4的 癌细胞为标的的治疗用抗体、诊断用抗体、研究用抗体等使用。
本发明不限于任何上述发明的实施方式和实施例的说明。本发明 包括在不超出权利要求记载的范围下，在本领域技术人员能容易想到的 范围内的各种变形方式。
本说明书中明示的论文、公开特许公报和特许公报等的内容通过援 引其全部内容而引用。
专利文献1：再表01/062907
专利文献2：再表01/096401
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非专利文献2：Berinstein NL，Grillo-Lopez AJ，White CA，Bence-Bruckler l，Malon ey D，Czuczman M，et al.Association of serum Rituximab(IDEC-C2B8)concentrati on and anti-tumor response in the treatment of recurrent low-grade or follicular non -Hodgkin’s lymphoma.Annals of Oncology1998，9：995-1001.
非专利文献3：Bruggemann M.，Williams G.T.，Bindon C.I.，Clark M.R.，Walker M .R.，Jefferis R.，Waldmann H.，Neuberger M.S.(1987).Comparison of the effector f unctions of human immunoglobulins using a matched set of chimeric antibodies.J.E xp.Med.，166，1351-1361.
非专利文献4：Loos M.(1982).The classical complement pathway：mechanism of act ivation of the first component by antigen-antibody complexes.Prog.Allergy，30，13 5-192.Mol Immunol.1982May；19(5)：651-7.
序列表
<110>株式会社抗体研究所
赤崛泰
杉冈笃
林宣宏
高崎昭彦
铃木和宏
森田美和
黑泽仁
伊庭善孝
住友万里子
浜田进
江口惠子
松田一起
村松千惠
高桥信弘
藤山沙理
黑泽良和
东成见
鹈饲由范
森下和广
<120>抗IgSF4 抗体及其利用
<130>P05018P
<150>JP P2005-054624
<151>2005-02 28
<160>274
<170>Patentln version 3.2
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