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酶促抗体加工

阅读：1089发布：2021-02-12

IPRDB可以提供酶促抗体加工专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且当前发明包含生产具有确定的糖结构的免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段的方法，其包括以下步骤：a)提供含有免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段的亲和层析柱洗脱液，b)将亲和层析柱洗脱液与植物来源例如来自绿色咖啡豆的(α1，3)半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)温育，c)将温育的亲和层析柱洗脱液应用于A蛋白层析材料并且从A蛋白层析材料中回收免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段从而产生具有确定的糖结构的免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段。，下面是酶促抗体加工专利的具体信息内容。

权利要求

1.产生具有确定糖结构的免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段的方法，所述方法包括以下步骤：-提供含有免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段的亲和层析柱洗脱液，-将亲和层析柱洗脱液与植物来源的酶温育，所述酶裂解免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段CH2结构域中糖结构的非还原端的单糖残基，-将经温育的亲和层析柱洗脱液应用于A蛋白层析材料并且从A蛋白层析材料回收免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段，从而产生具有确定的糖结构的免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于所述酶是来自绿色咖啡豆的(α1，3)半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)，所述酶裂解免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段CH2结构域中糖结构的非还原端的单糖残基。

3.根据权利要求1或者2任一项的方法，其特征在于将亲和层析柱洗脱液与酶温育，所述酶裂解免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段CH2结构域中糖结构的非还原端的单糖残基，所述温育包括以下步骤：-将亲和层析柱洗脱液与(α1，3)糖苷酶温育，-从温育混合物中取样品，

-或者

0将样品应用于A蛋白包被的琼脂糖珠，然后洗涤该琼脂糖珠，

0从A蛋白琼脂糖珠回收免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段，

0调整用于糖苷酶/唾液酸酶消化的缓冲液条件，并且

0将免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段与糖苷酶/唾液酸酶温育来裂解全部N-聚糖，或者

0将样品应用于A蛋白包被的磁珠，然后洗涤该磁珠，

0将磁珠与糖苷酶温育，并且回收裂解的寡糖，并且，

0用阳离子交换层析纯化裂解的寡糖，

-通过质谱法确定裂解的寡糖中糖结构的非还原端的单糖残基的类型和量，-继续温育直到可被酶裂解的糖结构的非还原端的全部单糖残基被裂解。

4.根据前述权利要求任一项的方法，所述方法进一步包括作为首先步骤的以下步骤：-提供包含核酸的细胞，所述核酸编码免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段，-培养所述细胞，-从细胞或者培养基中回收所述免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段，-将所述免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段应用于A蛋白层析材料并且从A蛋白层析材料回收所述免疫球蛋白。

5.根据前述权利要求任一项的方法，所述方法进一步包括作为最终步骤的以下步骤：-用一至三个层析步骤纯化产生的具有确定糖结构的免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段。

6.根据权利要求1和权利要求3至5任一项的方法，其特征在于所述酶选自α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、甘露糖苷酶、岩藻糖苷酶、唾液酸酶，所述酶裂解所述免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段的CH2结构域中糖结构的非还原端的单糖残基。

7.根据权利要求4至6任一项的方法，其特征在于所述细胞是哺乳动物细胞。

8.根据权利要求7的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞是仓鼠细胞、小鼠细胞、兔细胞、绵羊细胞、或者所述细胞的杂交瘤细胞。

9.根据权利要求7或者8任一项的方法，其特征在于所述细胞是CHO细胞、NS0细胞、BHK细胞或者SP2/0细胞。

10.根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于所述免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段包含相应于SEQ ID NO：02的18至364位氨基酸残基的氨基酸序列。

11.来自绿色咖啡豆的(α1，3)半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)的用途，用于裂解来自附着到重组产生的免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段CH2结构域的氨基酸天冬酰胺上的糖结构的末端(α1，3)糖苷键结合的半乳糖残基

说明书全文

酶促抗体加工

[0001] 本发明涉及重组产生的免疫球蛋白的酶促下游加工的方法。更详细地，当前发明涉及在亲和层析之后，通过酶促处理改变全长的免疫球蛋白或者免疫球蛋白Fc部分的(α1，3)糖苷键结合的半乳糖含量的方法。

[0002] 发明背景

[0003] 从真核细胞得到的多肽以糖基化多肽产生。糖结构附着到氨基酸主链上作为翻译后酶促修饰。

[0004] 糖基转移酶被识别为大约250-300个不同的分子内的与膜结合的酶的功能家族，其参加包括糖蛋白、蛋白聚糖和糖脂类的多肽的糖结构的协同生物合成。基于它们的核苷酸单糖供体特异性将糖基转移酶分成组。例如，半乳糖基转移酶是糖基转移酶的亚类，其使用UDP-半乳糖作为激活的单糖供体，然而唾液酸转移酶使用CMP-唾液酸作为单糖供体并且岩藻糖基转移酶使用GDP-岩藻糖作为单糖供体(Shaper，N.L.，等人，J.Mamm.Gl和Biol.Neopl.3(1998)315-324)。

[0005] 对多种哺乳动物细胞上的α-半乳糖基表位的修饰是特别感兴趣的，因为人中多达1％的循环IgG抗体与寡糖残基相互作用。以前发现被称作“抗-Gal”的这种天然抗体与生物化学上定义的糖脂末端的Gal(α1，3)Gal(β1，4)GlcNAc-R结合(Galili，U.，等人，J.Exp.Med.162(1985)573-582；Galili，U.，等人，J.Exp.Med.165(1987)693-704)。放射性标记的Bandeiraea(Griffonia)simplicifolia IB4凝集素与多种具核细胞结合
6 7
的测定提示与抗-Gal结合的细胞表达10 至3.5x 10α-半乳糖基表位，基于抗-Gal的特异性，大部分所述细胞看起来具有Gal(α1，3)Gal(β1，4)GlcNAc-R的结构。人细胞中这些表位的缺失由(α1，3)半乳糖基转移酶降低的活性引起(Galili，U.，等人，J.Biol.Chem.263(1988)17755-17762)。

[0006] 已经证实在鼠源细胞 (Cummings，R.D. 和 Mattox，S.A.，J.Biol.Chem.263(1988)511-519 ；Blake，D.A.，和 Goldstein，I.J.，J.Biol.Chem.256(1981)5387-5393 ；Elices，M.J.，Blake，D.A.，和 Goldstein，I.J.J.Biol.Chem.261(1986)6064-6072)、兔源细胞 (Basu，M.，和 Basu，S.，J.Biol.Chem.248(1973)1700-1706；Betteridge，A.，和 Watkins，W.M.，Eur.J.Biochem.132(1983)29-35)、猪源细胞和牛源细胞(Blanken，W.M.，和Van den Eijnden，D.H.，J.Biol.Chem.260(1985)12927-12934)的高尔基体中Gal(α1，3)表位的合成由酶(α1，3)半乳糖基转移酶催化。

[0007] 预期应用于人的多肽中(α1，3)糖苷键结合的末端半乳糖残基的存在应该最少，因为这种糖结构将引起人免疫系统的应答。这可以例如通过用于重组生产治疗多肽的细胞系的耗时开发来实现，在所述治疗多肽的糖结构中不引入(α1，3)糖苷键结合的末端半乳糖残基。在粗制多肽的下游加工中通常使用的层析方法不能除去含有Gal(α1，3)的糖结构。

[0008] 在EP 0 255 153中报告了生产半乳糖苷酶的方法，所述半乳糖苷酶通过裂解附着在1，4连接的β-D-吡喃甘露糖基单位主链上的1，6连接的α-D-吡喃半乳糖基单位能降低半乳甘露聚糖中的半乳糖含量。在EP 0 698 793中报告了基于免疫球蛋白G连接的寡糖结构的临床检测方法。在EP 1 878 747中报告了糖工程抗体。在WO 2007/071347中报告了免疫球蛋白聚糖的选择标记。在WO 1997/016064中报告了用于减少异种移植排斥的方法和组合物。在2007/024743中报告了具有基本上同质和未唾液酸化的糖形如G0和G2的抗体制剂，所述抗体制剂通过酶促处理、在某些条件下表达、使用特定宿主细胞以及与血清接触来制备。

[0009] 在WO 2008/057634中报告了具有增强的抗炎和降低的细胞毒性性质的多肽以及相关的方法。在WO 2007/024743中报告了蛋白水解抗性的抗体制剂。

[0010] 发明概述

[0011] 已经发现植物来源例如来自绿色咖啡豆的(α1，3)半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)可用于选择性地除去与(α1，3)糖苷键结合的末端半乳糖残基，所述末端半乳糖残基来自免疫球蛋白CH2结构域的氨基酸Asn297处的寡糖。发现非植物来源的(α1，3)半乳糖苷酶具有(β1，4)半乳糖苷酶的副反应性并且/或者与三个或者四个触角的寡糖反应减少或者不反应。

[0012] 因此，本文报告了产生具有确定的糖结构的免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段的方法，其包括按照以下顺序的以下步骤：

[0013] -提供含有免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段的亲和层析柱洗脱液，[0014] -将亲和层析柱洗脱液与酶温育，所述酶裂解免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段CH2结构域中糖结构的末端单糖残基，

[0015] -在适合免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段与A蛋白层析材料结合的条件下将温育的亲和层析洗脱液应用于A蛋白层析材料并且从A蛋白层析材料中回收免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段，从而产生具有确定的糖结构的免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段。

[0016] 在一个实施方案中，酶是植物来源的，所述酶裂解免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段的CH2结构域中糖结构的非还原端的单糖残基。在一个实施方案中，酶选自α-D-半乳糖半乳糖水解酶(EC 3.2.1.22)或者蜜二糖酶，所述酶裂解免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段CH2结构域中糖结构的非还原端的单糖残基。在另一个实施方案中，酶是来自绿色咖啡豆的(α1，3)半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)。在另一个实施方案中，免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段CH2结构域中糖结构的末端单糖残基是(α1，3)糖苷键结合的半乳糖残基。

[0017] 在一个实施方案中，将亲和层析柱洗脱液与酶温育，所述酶裂解免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段CH2结构域中糖结构的非还原端单糖残基，所述温育包括以下步骤，：

[0018] -将亲和层析柱洗脱液与(α1，3)糖苷酶温育，

[0019] -从温育混合物中取样品，

[0020] -或者

[0021] 0将样品应用于A蛋白包被的琼脂糖珠，并且然后洗涤该琼脂糖珠，[0022] 0从A蛋白琼脂糖珠中回收免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段，

[0023] 0调整用于糖苷酶/唾液酸酶消化的缓冲液条件，

[0024] 0将免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段与糖苷酶/唾液酸酶温育来切除全部N-聚糖，并且

[0025] 0在MALDI分析之前取消化物的整分试样，

[0026] 或者

[0027] 0将样品应用于A蛋白包被的磁珠，并且然后洗涤该磁珠，

[0028] 0将磁珠与糖苷酶温育，同时回收裂解的寡糖，并且，

[0029] 0用阳离子交换层析纯化裂解的寡糖，

[0030] -通过质谱法确定裂解的寡糖中糖结构的非还原端的单糖残基的类型和量，[0031] -继续温育直到可被酶裂解的糖结构的非还原端的全部单糖残基被裂解。

[0032] 另一个实施方案包括将按照以下的顺序进行的以下步骤作为首先步骤的方法：

[0033] -提供包含核酸的细胞，所述核酸编码免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段，[0034] -在适合免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段表达的条件下培养该细胞，[0035] -从细胞或者培养基中回收免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段，

[0036] -在适合免疫球蛋白与A蛋白层析材料结合的条件下将免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段应用于A蛋白层析材料并且从A蛋白层析材料中回收免疫球蛋白。

[0037] 一个实施方案包括将以下的步骤作为最终步骤的方法：

[0038] -用一至三个层析步骤纯化产生的具有确定的糖结构的免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段。

[0039] 在一个实施方案中，酶是植物来源的，所述酶裂解免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段CH2结构域中糖结构的非还原端的单糖残基。在另一个实施方案中，酶选自α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、甘露糖苷酶、岩藻糖苷酶或者唾液酸酶，所述酶裂解免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段CH2结构域中糖结构的非还原端的单糖残基。在另一个实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，哺乳动物细胞是仓鼠细胞，或者鼠细胞，或者兔细胞，或者绵羊细胞，或者这些细胞的杂交瘤细胞。在另一个实施方案中，细胞是CHO细胞，NS0细胞，BHK细胞或者SP2/0细胞。

[0040] 本文报告的另一方面是来自绿色咖啡豆的(α1，3)半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)裂解末端的(α1，3)糖苷键结合的半乳糖残基的用途，所述末端的(α1，3)糖苷键结合的半乳糖残基来自重组产生的免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段CH2结构域中的糖结构。

[0041] 发明详述

[0042] 本文报告的是例如来自绿色咖啡豆的(α1，3)半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)可以用于选择性地从寡糖除去(α1，3)糖苷键结合的末端半乳糖残基，所述寡糖附着于免疫球蛋白CH2结构域的氨基酸残基Asn297。发现除植物以外其他来源的(α1，3)半乳糖苷酶具有(β1，4)半乳糖苷酶副反应性并且/或者与三个或者四个触角的寡糖反应减少或者不反应(见表1)。

[0043] 表1：不同来源的(α1，3)半乳糖苷酶的比较

[0044]

[0045] 因此，在一个实施方案中，本文报告的方法中的酶是植物来源的，所述酶裂解免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段CH2结构域中糖结构的末端的单糖残基。另一个实施方案中，在本文报告的方法中的酶是(i)裂解(α1，3)糖苷键结合的糖残基，并且(ii)不裂解(α1，4)糖苷键结合的糖残基，并且(iii)裂解来自两个、三个和四个触角寡糖的残基，所述酶裂解免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段CH2结构域中糖结构的末端的单糖残基。

[0046] 本文报告了产生具有确定的糖结构的免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段的方法，其包括以下步骤：

[0047] -提供含有免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段的亲和层析柱洗脱液，[0048] -将亲和层析柱洗脱液与来自绿色咖啡豆的(α1，3)半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)温育，

[0049] -任选地在适合免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段与A蛋白层析材料结合的条件下将经温育的亲和层析柱洗脱液应用于A蛋白层析材料，并且从A蛋白层析材料中回收免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段，从而产生具有确定的糖结构的免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段。

[0050] 人免疫球蛋白主要在重链CH2结构域297位的天冬酰胺残基(Asn297)处糖基化，所述重链CH2结构域具有核心岩藻糖基化的双触角复杂寡糖(根据Kabat编号免疫球蛋白氨基酸，见下面)。每支臂中多达两个连续的半乳糖(Gal)残基可以终止双触角糖结构。根据与中央的甘露糖残基的糖苷键将臂表示为(1，6)和(1，3)。表示为G0的糖结构不包含半乳糖残基。表示为G1的糖结构在一支臂上包含一个或者多个半乳糖残基。表示为G2的糖结构在每支臂中包含一个或者多个半乳糖残基(Raju，T.S.，Bioprocess Int.1(2003)44-53)。Kabat，E.A.，等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991)，和Brueggemann，M.，等人，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361；以及Love，T.W.，等人，Methods Enzymol.178(1989)515-527详细报告了人恒定重链区。例如Routier，F.H.，Glycoconjugate J.14(1997)201-207描述了免疫球蛋白Fc部分的CHO类型的糖基化。

[0051] 术语“免疫球蛋白”表示且包含多种形式的免疫球蛋白如人免疫球蛋白、人源化的免疫球蛋白、嵌合免疫球蛋白或者T-细胞抗原缺失的免疫球蛋白(见例如WO 98/33523，WO98/52976，和WO 00/34317)。在一个实施方案中，在本文报告的方法中抗体是人或者人源化的抗体。例如在Morrison，S.L.，等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA 81(1984)6851-6855；US
5,202,238和US 5,204,244；Riechmann，L.，等人，Nature 332(1988)323-327；Neuberger，M.S.，等人，Nature 314(1985)268-270；Lonberg，N.，Nat.Biotechnol.23(2005)1117-1125中描述了免疫球蛋白的基因工程。

[0052] 通常免疫球蛋白包含两个所称作的全长轻链多肽(轻链)和两个所称作的全长的重链多肽(重链)。每个全长重链多肽和轻链多肽包含可变结构域(可变区)(一般全长多肽链的氨基末端部分)，所述可变结构域包含与抗原相互作用的结合区。每个全长的重链多肽和轻链多肽包含恒定区(一般羧基末端部分)。全长重链的恒定区介导免疫球蛋白与i)具有Fcγ受体(FcγR)的细胞(FcγR)，如吞噬细胞的结合，或者ii)具有新生的Fc受体(FcRn)(也已知为Brambell受体)的细胞结合。它也介导与一些因子的结合，所述因子包括经典的补体系统因子如成分(C1q)。全长免疫球蛋白的轻链或重链的可变结构域依次包含不同的区段，即四个构架区(FR)和三个高变区(CDR)。“全长的免疫球蛋白重链”是由N-端至C-端方向的免疫球蛋白重链可变区(VH)、免疫球蛋白恒定区1(CH1)、免疫球蛋白铰链区、免疫球蛋白恒定区2(CH2)、免疫球蛋白恒定区3(CH3)以及在IgE亚类的免疫球蛋白的情况下任选地免疫球蛋白恒定区4(CH4)组成的多肽。“全长的免疫球蛋白轻链”是由N-端至C-端方向的免疫球蛋白轻链可变区(VL)、免疫球蛋白轻链恒定区(CL)组成的多肽。全长的免疫球蛋白链通过CL-结构域和CH1结构域之间以及全长的免疫球蛋白重链的铰链区之间的多肽间二硫键连接到一起。

[0053] 在本申请中，术语“免疫球蛋白片段”表示包含全长的免疫球蛋白重链的至少CH2结构域和CH3结构域的多肽。免疫球蛋白片段也可以包含额外的非免疫球蛋白来源的氨基酸序列。

[0054] 近些年已经报道免疫球蛋白的糖基化模式，即糖组成和多种附着的糖结构，对生物学性质具有强烈的影响(见例如Jefferis，R.，Biotechnol.Prog.21(2005)11-16)。哺乳动物细胞产生的免疫球蛋白包含以质量计2-3％的寡糖(Taniguchi，T.，等人，Biochem.24(1985)5551-5557)。这例如在G类(IgG)的免疫球蛋白中相当于在小鼠来源的IgG中有2.3个寡糖残基(Mizuochi，T.，等人，Arch.Biochem.Biophys.257(1987)387-394)并且在人源的IgG中有2.8个寡糖残基(Parekh，R.B.，等人，Nature 316(1985)452-457)，
297
其中一般两个寡糖残基位于Fc-区的Asn 上而剩下的位于可变区(Saba，J.A.，等人，Anal.Biochem.305(2002)16-31)。

[0055] 在本申请中使用的术语“糖结构”表示并且包含附着到免疫球蛋白特定的氨基酸残基上的全部寡糖。由于细胞的糖基化异质性，重组产生的免疫球蛋白不仅在特定的氨基酸残基上包含单一的、确定的N-或者O-连接的寡糖，还是多肽(免疫球蛋白分子)的混合物，所述多肽每种具有相同的氨基酸序列但是在特定的氨基酸位置上包含不同组成的寡糖。因此，该术语“糖结构”表示寡糖组，其附着到重组产生的免疫球蛋白的特定的氨基酸位置上，即附着的寡糖的异质性。在本申请中使用的术语“寡糖”表示多聚糖，其包含两个或者多个共价连接的单糖单位。

[0056] 为表示本发明中不同的N-或者O-连接的寡糖，列举了从寡糖分子的非还原端至还原端的单个糖残基。为了标记，选择最长的糖链作为基本链。N-或者O-连接的寡糖的还原端是单糖残基，其与免疫球蛋白的氨基酸主链的氨基酸直接结合，然而位于作为基本链的还原端的相反末端的N-或者O-连接的寡糖的末端被称为非还原端。

[0057] 在本申请中使用的术语“亲和层析”表示使用“亲和层析材料”的层析方法。在亲和层析中，多肽基于它们的生物学活性或者化学结构分离，取决于与层析材料的层析官能团间静电作用、疏水键和/或氢键的形成。为从亲和层析材料中回收特异性结合的多肽，可以加入竞争配体或者可以改变层析条件，如pH值，缓冲液的极性或者离子强度。示例性“亲和层析材料”是金属螯合层析材料如Ni(II)-NTA或Cu(II)-NTA，或者免疫球蛋白亲和层析材料如在本文报告的方法的一个实施方案中，包含共价连接的A蛋白或者G蛋白的层析材料，或者酶结合亲和层析材料如包含共价结合的酶底物类似物、酶辅因子或者酶抑制剂作为层析官能团的层析材料，或者凝集素结合层析材料如包含共价连接的多糖、细胞表面受体、糖蛋白或者完整细胞作为层析官能团的层析材料。

[0058] 术语“酶，其裂解免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段CH2结构域中糖结构的非还原端的单糖残基”表示选择性地裂解糖结构的非还原端的单糖残基的酶。此种酶是植物来源的。在一种实施方案中，酶是植物来源的并且选自α-半乳糖苷酶(裂解(α1，3)-，(α1，4)-，和/或(α1，6)糖苷键结合的半乳糖残基，β-半乳糖苷酶(裂解(β1，4)糖苷键结合的半乳糖残基)，甘露糖苷酶(裂解甘露糖残基)、岩藻糖苷酶(裂解岩藻糖残基)和唾液酸酶(裂解唾液酸残基)。示例性α-半乳糖苷酶是(α1，3)半乳糖苷酶如EC 3.2.1.22或者EC 2.4.1.151(见，例如，Dabkowski，P.L.，等人，Transplant Proc.25(1993)2921和Yamamoto，F.，等人，Nature 345(1990)229-233)。在一个实施方案中，酶是来自绿色咖啡豆的(α1，3)半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)。

[0059] 在本文申请中术语“确定的糖结构”表示糖结构，其中在所述糖结构的每一个非还原端的单糖残基是特定的种类并且与该糖结构的剩余部分以特定的糖苷键连接，即全部其他的单糖残基已经被裂解。在本申请中术语“确定的糖结构”表示糖结构，其中在特定的种类的糖结构的非还原端并且以特定的糖苷键连接该糖结构的全部单糖残基已经被裂解，即免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段的糖结构缺失或者缺少通过特定的糖苷键与糖结构的其余部分连接的特定的末端单糖残基。例如，在一个实施方案中，免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段与(α1，3)半乳糖苷酶温育，该免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段的全部糖结构在非还原端缺少(α1，3)糖苷键结合的半乳糖单糖残基，即免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段具有确定的糖结构，其缺少(α1，3)糖苷键结合的末端半乳糖残基。

[0060] 在本申请中使用的术语“应用于”和其语法等同词表示纯化方法的部分步骤，其中将包含目的物质的溶液与固定相接触。包含待纯化的目的物质的溶液穿过固定相，提供了固定相与溶液中物质的相互作用。取决于条件，例如pH、导电性、盐浓度、温度、和/或流速，溶液中的一些物质与固定相结合并且立即从溶液中除去。其他的物质保留在溶液中。在流通液中可以发现在溶液中保留的物质。“流通液”表示在通过层析装置后取得的溶液，其可以是包含目的物质或者缓冲液的被应用溶液，所述缓冲液用于冲洗柱体或者引起与固定相结合的一种或者多种物质的洗脱。在纯化步骤后可以通过本领域技术人员熟悉的方法从溶液中回收目的物质来得到基本上同质形式的物质，所述方法为例如沉淀、盐析、超滤、渗滤、冻干、亲和层析或者溶剂体积的减少。

[0061] 可以通过重组的方式产生免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段，其糖结构可以用本文报告的方法修饰。重组制备的方法在本领域是众所周知的，并且包括在真核细胞中表达蛋白质和随后分离免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段以及纯化到可药用纯度。为了免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段的表达，使用杂交瘤细胞或者真核细胞，在所述细胞中已经引入了编码免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段的一种或者多种核酸。在一个实施方案中，真核细胞选自CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK 293细胞、COS细胞、PER.C6细胞、BHK细胞、兔细胞或者绵羊细胞。在另一个实施方案中，真核细胞选自CHO细胞、HEK 293细胞、或者兔细胞。在表达后从细胞中回收免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段(从上清液中或者从裂解后的细胞中)。用于免疫球蛋白重组产生的一般方法在本领域是众所周知的并且例如在Makrides，S.C.，Protein Expr.Purif.17(1999)183-202；Geisse，S.，等人，Protein Expr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman，R.J.，Mol.Biotechnol.16(2000)151-160；Werner，R.G.，Drug Res.48(1998)870-880的综述文章中报导。

[0062] 可以用标准技术进行免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段的纯化从而除去细胞组分或者其他的污染物，例如其他的细胞核酸或者蛋白质，所述标准技术包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域公知的其他技术(见例如Ausubel，F.，等人(ed.)，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing和Wiley Interscience，New York(1987))。很好地建立和广泛地使用了用于蛋白纯化的不同方法，如用微生物蛋白的亲和层析(如A蛋白或者G蛋白亲和层析)、离子交换层析(如阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨乙基树脂)和混合方式交换、亲硫吸附(例如用β-巯基乙醇和其他的SH配体)、疏水相互作用或者芳香吸附层析(例如用苯基-琼脂糖、氮杂-喜砂树脂或者间-氨基苯基硼酸)、金属螯合物亲和层析(例如，用Ni(II)-和Cu(II)-亲和材料)、大小排阻层析和电泳方法(如凝胶电泳、毛细管电泳)、以及这些方法的组合、如用微生物蛋白的亲和层析、阳离子交换层析和阴离子交换层析(见例如Vijayalakshmi，M.A.，Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。

[0063] 通过使用的细胞系和使用的培养条件将确定重组产生的免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段的糖结构。不可能用常规的下游处理技术选择性的除去特定的糖结构。

[0064] 用本文报告的方法在下游处理中可以得到具有确定糖结构的免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段。已经发现只有植物来源、特别是来自绿色咖啡豆的(α1，3)半乳糖苷酶适合除去免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段的糖结构非还原端的(α1，3)糖苷键结合的半乳糖残基。

[0065] 在重组产生的免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段的下游处理过程中使用本文报告的方法除去(α1，3)糖苷键结合的半乳糖残基

[0066] -提供降低重组产生的免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段的免疫原性方法，[0067] -消除了得到/选择/使用细胞系的需要，所述细胞系不产生具有末端(α1，3)糖苷键结合的半乳糖残基的糖结构，

[0068] -与没有额外温育的方法相比较，由于免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段的额外温育步骤，不改变产品的质量，

[0069] -在下游处理中即在体外表达完成后，提供生产具有确定的糖结构的免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段的方法，

[0070] -提供具有确定的糖结构和改进产率的免疫球蛋白，因为没有除去具有不想要的糖结构的免疫球蛋白，而是所有的免疫球蛋白被酶促转化成确定的糖结构。

[0071] 因此，本文报告的一方面是产生具有确定的糖结构的免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段的方法，其包括以下步骤：

[0072] -将免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段与酶温育，所述酶特异性地裂解免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段CH2结构域中糖结构的末端单糖残基。

[0073] 在一个实施方案中，特异裂解免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段CH2结构域中糖结构的末端单糖残基的酶是来自绿色咖啡豆的(α1，3)半乳糖苷酶。在另一个实施方案中，末端单糖是(α1，3)糖苷键结合的半乳糖。

[0074] 因此，本文报告的一方面是生产具有确定的糖结构的免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段的方法，其包括以下步骤：

[0075] -提供含有免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段的亲和层析柱洗脱液，[0076] -将亲和层析柱洗脱液与酶温育，所述酶特异性地裂解免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段CH2结构域中糖结构的末端单糖残基，

[0077] -将酶促修饰的亲和层析柱洗脱液应用于A蛋白层析材料并且从A蛋白层析材料中回收免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段，从而产生具有确定的糖结构的免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段。

[0078] 为监测酶促反应的进程，可以进行免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段糖基化谱的在线确定。因此，本文报告的一方面是产生具有确定的糖结构的免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段的方法，其包括以下步骤：

[0079] -提供含有免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段的亲和层析柱洗脱液，[0080] -通过以下步骤修饰在亲和层析柱洗脱液中含有的免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段

[0081] a)将亲和层析柱洗脱液与酶温育，所述酶特异性地裂解免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段CH2结构域中糖结构的末端单糖残基，

[0082] b)从温育混合物中取样品，

[0083] c)将样品应用于A蛋白包被的磁珠，然后洗涤该磁珠，

[0084] d)将磁珠与糖苷酶温育，并回收裂解的寡糖，并且，

[0085] e)用阳离子交换层析纯化裂解的寡糖，

[0086] f)通过质谱分析例如MALDI-TOF MS确定裂解的寡糖非还原端的单糖残基的类型和量，

[0087] g)重复a)至f)步骤直到在可被酶裂解的免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段的糖结构的非还原端的全部单糖残基被裂解，

[0088] -任选地，在适合含有的免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段与所述A蛋白层析材料结合的条件下，将酶促修饰的亲和层析柱洗脱液应用于A蛋白层析材料，并且从A蛋白层析材料回收免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段从而产生具有确定的糖结构的免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段。

[0089] 已经发现来自绿色咖啡豆的(α1，3)半乳糖苷酶在本文报告的方法中令人惊奇地有用。在本文报告的方法中已经评估了细菌来源的(α1，3)半乳糖苷酶但是发现其不适合。尽管所有这些酶可以裂解寡糖中的(α1，3)糖苷键，但是只有来自绿色咖啡豆的(α1，3)半乳糖苷酶在合适的条件下以适合的特异性和适合的底物特异性裂解免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段糖结构中的这种键。

[0090] 本文报告的另一方面是生产具有确定的糖结构的免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段的方法，其包括以下步骤：

[0091] -提供包含核酸的细胞，所述核酸编码免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段，[0092] -在适合免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段表达的情况下培养该细胞，[0093] -从细胞或者培养基中回收免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段，

[0094] -将回收的免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段应用于A蛋白层析材料并且通过从A蛋白层析材料洗脱免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段从A蛋白层析材料中回收免疫球蛋白，[0095] -通过以下步骤修饰在亲和层析柱洗脱液中包含的免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段，

[0096] a)将亲和层析柱洗脱液与酶温育，所述酶特异性地裂解免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段CH2结构域中糖结构的末端单糖残基，

[0097] b)从温育混合物中取样品，

[0098] c)将样品应用于A蛋白包被的磁珠，并且然后洗涤该磁珠，

[0099] d)将磁珠与糖苷酶温育，并且回收裂解的寡糖，

[0100] e)用阳离子交换层析纯化裂解的寡糖，

[0101] f)通过质谱分析例如MALDI-TOF MS确定裂解的寡糖中非还原端的单糖残基的类型和量，

[0102] g)重复a)至f)步骤直到在可被该酶裂解的免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段的糖结构的非还原端的全部单糖残基被裂解，

[0103] -将酶促修饰的亲和层析柱洗脱液应用于A蛋白层析材料并且从A蛋白层析材料中回收免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段，从而产生具有确定的糖结构的免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段，

[0104] -任选地用一至三个额外的层析步骤纯化所产生的具有确定的糖结构的免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段。

[0105] 一般可以使用不同层析步骤的组合纯化免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段，所述免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段已经例如通过细胞培养方法产生。通常，A蛋白亲和层析之后可以跟随一个或者两个额外的分离步骤。在一个实施方案中，额外的层析步骤是阳离子和阴离子交换层析步骤，或者反之亦然。最终的纯化步骤是所称作的“精制步骤”，用于除去微量杂质和污染物像聚集的免疫球蛋白、残余的HCP(宿主细胞蛋白质)、DNA(宿主细胞核酸)、病毒或者内毒素。在一个实施方案中，最终的纯化步骤是流通方式的阴离子交换层析。

[0106] 本领域的技术人员已知一般的层析方法和它们的用途。例如见Chromatography，th5 edition，Part A：Fundamentals 和 Techniques，Heftmann，E.( 编辑 )，Elsevier Science Publishing Company，New York，(1992)；Advanced Chromatographic 和Electromigration Methods in Biosciences，Deyl，Z.(编辑)，Elsevier Science BV，Amsterdam，The Netherl和s，(1998)；Chromatography Today，Poole，C.F.，和Poole，S.K.，Elsevier Science Publishing Company，New York，(1991)；Scopes，Protein Purification：Principles和Practice(1982)；Sambrook，J.，等人，(编辑)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；或Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel，F.M.，等人，(编辑)，John Wiley & Sons，Inc.，New York。

[0107] 在做出本发明时，本我们实验室可以得到足够量的融合蛋白，其由N-端突变或者未突变的IL-15部分和C-端Fc部分组成。该融合蛋白已经被用作实施例，且不应该被理解为限制所附权利要求定义的本发明的范围。因此，在一个实施方案中，免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段是白细胞介素-15部分和SEQ ID NO：1或2的人源的Fc部分的融合蛋白。在实施例1和WO 2005/100394的SEQ ID NO：3和4(具有鼠源的Fc部分)中报告了此种分子。

[0108] 提供以下的实施例、附图和序列来帮助理解本发明，在所附权利要求中给出了本发明的真实范围。理解可以对给出的方法进行修改而不背离本发明的精神。

[0109] 序列表的描述

[0110] SEQ ID NO：1人突变的白细胞介素-15/Fc的核酸序列。

[0111] SEQ ID NO：2人突变的白细胞介素-15/Fc的氨基酸序列。

[0112] 附图描述

[0113] 图1突变的IL15FC-Fc融合多肽的参考样品(上面部分)和其与来自木薯黄单胞菌的(α1，3)半乳糖苷酶温育物(下面部分)的总离子层析图。可看出此种酶也具有(β1，4)半乳糖苷酶活性。

[0114] 图2突变的IL15FC-Fc融合多肽的参考样品(上面部分)和其与来自大肠杆菌的(α1，3)半乳糖苷酶温育物(下面部分)的总离子层析图。可看出只除去了双触角寡糖的(α1，3)糖苷键结合的半乳糖，并且此种酶也具有(β1，4)半乳糖苷酶活性。

[0115] 图3突变的IL15FC-Fc融合多肽的参考样品(上面部分)和其与来自绿色咖啡豆的(α1，3)半乳糖苷酶的温育物(下面部分)的总离子层析图。可看出完全除去了(α1，3)糖苷键结合的半乳糖，并且此种酶不具有(β1，4)半乳糖苷酶活性。

[0116] 实施例1

[0117] 纯化的白细胞介素-15/Fc融合蛋白的制备

[0118] 根据国际专利申请WO 1997/041232，WO 2005/100394和WO 2005/100395中报告的数据和方法已经制备了白细胞介素-15/Fc融合蛋白。

[0119] 实施例2

[0120] (α1，3)糖苷键结合的半乳糖残基的裂解

[0121] 用α-半乳糖苷酶消化

[0122] 通过透析将样品调整到相应的缓冲液条件(见表2)，然后将其与酶温育。

[0123] 例如：

[0124] 在25℃用1.5ml(α1，3)半乳糖苷酶(204U/ml)过夜(16小时)消化40ml浓度约1mg/ml的白细胞介素-15/Fc融合蛋白溶液。

[0125] 表2酶促消化条件

[0126]

[0127] *根据制造商的手册

[0128] 用A蛋白进行小规模纯化

[0129] 用25mM pH 7.2的Tris(羟甲基)氨基甲烷缓冲液平衡A蛋白柱体，该缓冲液含有25mM的氯化钠和5mM EDTA。将样品应用于柱子上，用平衡缓冲液洗涤柱体，最后用100mM pH 3.6的柠檬酸盐缓冲液洗脱融合蛋白。

[0130] 用于质谱分析的样品制备

[0131] 通过微量离心浓缩器(centricon)将含有100μg白细胞介素-15/Fc融合蛋白的缓冲液交换到pH 7.0的2mM TRIS-HCl。用1μl N-糖苷酶F和1μl唾液酸酶消化50μl的白细胞介素-15/Fc融合蛋白来裂解来自蛋白的聚糖并清除唾液酸部分。

[0132] 将离子交换树脂AG 50W-X8悬浮在水中并且摇动几次。在树脂沉降后丢弃水。将此种操作进行3次。将900μl的悬浮液转移至MICRO Bio-Spin层析柱上并且离心1分钟。

[0133] 将消化的样品应用到柱体上并且将柱体离心1分钟。在流通液中收集纯化的聚糖。用sDHB基质溶液(125μl乙醇中的sDHB和125μl溶于水的10mM氯化钠)按照1∶1稀释得到的溶液。

[0134] 备选地，1μl消化物的整分试样与1μl sDHB基质溶液(10mM氯化钠水溶液中10mg DHB)混合，并且使用高真空快速干燥来得到用于MALDI-TOF分析的同质性点。

[0135] 质谱分析

[0136] 用来自Applied Biosystems的MALDI-TOF Mass Spectrometer Voyager DE Pro以反射方式(Reflectron Mode)获得校准谱。将加速电压设定为20000V；栅极电压是76％并且镜像电压比例是1.12。将提取延迟时间设定为110ns。采集质量范围是从1000至5000Da，激光强度是2460并且激光重复率是20.0Hz。

标题	发布/更新时间	阅读量
双重靶定抗体及其用途-专利编号CN102428104B	2020-05-12	419
抗IgSF4抗体及其利用-专利编号CN101137671A	2020-05-12	581
针对人CD22抗体的抗独特型抗体及其应用-专利编号CN103588882A	2020-05-13	196
一种抗CTLA-4嵌合抗体-专利编号CN102134276A	2020-05-11	852
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新型EGFRVIII抗体和包含所述抗体的组合物-专利编号CN107108735A	2020-05-11	323
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