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全人TNFα-Fab抗体及其PEG化抗体

阅读：704发布：2020-05-11

IPRDB可以提供全人TNFα-Fab抗体及其PEG化抗体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种全人TNFα抗体的Fab抗体及其PEG化抗体。本发明的全人TNFα抗体的Fab抗体，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：7，重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：8。本发明还进一步公开了该全人TNFα抗体的Fab片段的编码基因，及其表达宿主细胞。本发明的全人TNFα抗体的Fab抗体可用于治疗与TNFα相关的炎症，与TNF有较好的亲和力，可在CHO细胞及大肠杆菌中大规模表达，生产成本低，且没有补体结合和ADCC等效应引发的副作用，经PEG化表面改性技术后，半衰期获得了延长，更适合体内应用。，下面是全人TNFα-Fab抗体及其PEG化抗体专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种全人TNFα抗体的Fab抗体，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:8。

2.如权利要求1所述全人TNFα抗体的Fab抗体，其特征在于，所述全人TNFα抗体的Fab抗体的轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO:12，重链的氨基酸序列为SEQ ID NO:13。

3.如权利要求1或2所述全人TNFα抗体的Fab抗体，其特征在于，所述全人TNFα抗体的Fab抗体经PEG化修饰。

4.一种表达全人TNFα抗体或其Fab抗体的遗传工程化的宿主细胞，它是用含有编码权利要求1或2所述全人TNFα抗体的多核苷酸的载体转化或转导的宿主细胞。

5.如权利要求4述的宿主细胞，其特征在于，编码所述全人TNFα抗体的Fab抗体轻链可变区的多核苷酸的核苷酸序列为SEQ ID NO:5，编码所述全人TNFα抗体的Fab抗体重链可变区的多核苷酸的核苷酸序列为SEQ ID NO:6，编码所述全人TNFα抗体的Fab抗体全长轻链的多核苷酸的核苷酸序列为SEQ ID NO:11，编码所述全人TNFα抗体的Fab抗体重链Fd段的多核苷酸的核苷酸序列为SEQ ID NO:14。

6.如权利要求5所述遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为真核细胞或原核细胞。

7.如权利要求6所述遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述真核细胞为中国仓鼠卵巢细胞，所述原核细胞为大肠杆菌。

8.如权利要求1-3中任一权利要求所述全人TNFα抗体的Fab抗体用于制备治疗类风湿性关节炎的药物的用途。

说明书全文

全人TNFα-Fab抗体及其PEG化抗体

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及TNFa抗体的Fab片段及其PEG化抗体。

背景技术

[0002] 自身免疫性疾病发病率高，全世界约有3.55亿人患有各种自身免疫性疾病，1999年世界卫生组织将风湿病与癌症和心血管疾病列为威胁人类健康的三大杀手。风湿病发病率高，致残率高，在我国，由风湿病导致的致残人群逾千万。这其中，以类风湿性关节炎(RA)和强直性脊柱炎(AS)危害性最大，未经治疗的RA和AS的致残率分别高达70％和30％。

[0003] 目前常用对抗自体免疫性疾病的方法，不是利用类固醇(steroids)来减缓因免疫系统攻击组织所造成的炎症反应(inflammation)外，就是使用免疫抑制药物(immuno-suppressant drugs)，抑制免疫系统的作用。不过，这两种方法都会造成严重的副作用，而且都只能减缓病情的发展速度，非根治疾病。在生物制剂抗TNF抗体问世之前，风湿病并无特效药物治疗，非甾体类抗炎止痛药及改善症状的免疫抑制剂只能改善病人的症状，改善生活质量，不能完全缓解病情。仅此类的药物的用量在我国每年都已超过200亿。因此，风湿病严重的影响了患者的身心健康，并且给患者带来了沉重的经济负担，同时也影响了社会的发展。

[0004] 目前的研究表明，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是RA和AS病变过程中起主要作用的细胞因子，实验和临床结果均证实TNF-α是治疗该病的适合靶点。据此，TNF-α的拮抗剂相继诞生了，包括Amgen公司的Enbrel(etanercept)，Centocor公司的Remicade (infliximab)，Abbott的Humira(adalimumab)。Enbre是人TNF-α受体和Fc的融合蛋白。Remicade是一种人-鼠嵌合的抗人TNF-α单克隆抗体，可特异性结合可溶性及膜结合型TNF-α。2002年12月Abbott公司的Humira成为第一个抗TNF-α的全人单克隆抗体，使单克隆抗体药物的研究开发进入了一个新的时代。由于是全人抗体，避免了Remicade会产生免疫反应的缺点。针对TNF-α的抑制剂成为迄今为止最为成功的RA治疗药物。

[0005] 完整的单克隆抗体分子量大，且Fc段可补充细胞毒效应分子功能，并可延长在血清中的半衰期。但是完整的单克隆抗体由于它具有一下的缺陷，使得他的应用受限：1、用量大，制备工艺复杂，目前国际上也只有少数生物企业掌握了大规模表达单克隆抗体的技术；2、Fc片段分子量大，不易穿透细胞；3、价格昂贵；4、有时Fc诱导的细胞因子失活、受体封闭或病毒中和等作用不希望出现。近年来，国内外研究证明在一定条件下，Fab片段可以取代完整的单克隆抗体发挥作用。Fab片段具有以下优势：1、可以在大肠杆菌大规模表达。中国是发酵大国，可以充分利用这种优势大力发展抗体技术；2、由于去除了Fc片段，在药代动力学上表现了更好的组织穿透能力；3、内效应子缺乏。同时因为去除了Fc片段，Fab片段具备了这些缺陷，包括：1、由于在大肠杆菌表达，增加了Fab片段的抗原性；2、由于去除了Fc片段，在体内代谢加快，半衰期减短。

[0006] PEG修饰技术的出现可以很好的改善Fab片段的上述缺陷。比利时UCB制药公司和Nektar公司合作开发将聚乙二醇与人源化抗TNF-α小型抗体Fab(肿瘤坏死因子)结合，实验证明二者结合后仍能保持与TNF-α的结合活性，并且显著延长半衰期，减少给药次数。聚乙二醇化抗TNF-α小型抗体Fab(CDD-870，Cimzia)在2008年获得FDA批准用于治疗类风湿性关节炎。1977年，Abuchowski利用与聚乙二醇(PEG)共价结合来改变BSA(牛血清白蛋白)的免疫原性，开启了现代聚乙二醇化技术。经过30多年的研究发展，PEG化修饰已经成为现代医药领域成熟的“黄金标准”技术，广泛应用于蛋白质(肽类)、酶、抗体及小分子药物的修饰。PEG可将干扰素之类的蛋白质药物分子包裹起来形成凝胶剂，因其分子量变大，不易通过肾脏排泄，故能大大延长蛋白质类药物在体内的作用时间。蛋白药物的PEG修饰已卓有成效，1991年第一种用PEG修饰的蛋白药物PEG-ADA被FDA批准上市，近几年上市的有PEG-干扰素、PEG-GSF、PEG-生长抑素。超氧化物歧化酶目前处于临床前研究的PEG修饰的蛋白药物有几十种.蛋白质多肽类经聚乙二醇修饰后具有以下优点：1、溶解度和稳定性增加；2、免疫原性和抗原性减少，毒副作用降低；3、血浆半衰期延长和体内系统暴露增加；4、体内生物活性和疗效增加。

[0007] 生物制剂抗TNF-α的问世及在风湿疾病中的使用，是风湿病治疗的一场革命，目前临床使用的结果表明，抗TNF-α抗体不仅可以有效地阻止中晚期RA和AS患者的炎症进程，且对早期病人有根治疗效。鉴于大量的RA和AS患者以及其抗TNF-α治疗的有效性，生物制剂有巨大的市场效益，因此，开发具有自主知识产权的抗TNF-α药物，对于我国的国计民生以及国际竞争战略均具有重要意义。

发明内容

[0008] 本发明的目的是公开一种全人TNFα抗体的Fab抗体及其编码基因。

[0009] 本发明的另一个目的是公开上述全人TNFα抗体的Fab抗体的PEG化的产物。

[0010] 本发明的第三个目的是公开上述全人TNFα抗体的Fab抗体的制药用途。

[0011] 本发明一方面公开了一种全人TNFα抗体的Fab抗体，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO：7，重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：8。

[0012] 进一步的，所述全人TNFα抗体的Fab抗体，其轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO：12，重链的氨基酸序列为SEQ ID NO：13。

[0013] 进一步的，上述全人TNFα抗体的Fab抗体经PEG化修饰。

[0014] 本发明第二方面，公开了一种多核苷酸，该多核苷酸编码上述全人TNFα抗体的Fab抗体重链可变区、轻链可变区、重链Fd段或全长轻链。

[0015] 所述编码全人TNFα抗体的Fab抗体轻链可变区的多核苷酸的核苷酸序列为SEQ IDNO：5，所述编码全人TNFα抗体的Fab抗体重链可变区的多核苷酸的核苷酸序列为SEQ IDNO：6，所述编码全人TNFα抗体的Fab抗体全长轻链的多核苷酸的核苷酸序列为SEQ IDNO：11，所述编码全人TNFα抗体的Fab抗体重链Fd段的多核苷酸的核苷酸序列为SEQ IDNO：14。

[0016] 上述多核苷酸可用于构建工程菌，表达全人TNFα抗体或其Fab抗体。

[0017] 本发明第三方面，公开了一种遗传工程化的宿主细胞，它是用含有前述多核苷酸的载体转化或转导的宿主细胞。优选的，所述宿主细胞为真核细胞或和原核细胞，分别为中国仓鼠卵巢细胞和大肠杆菌。

[0018] 上述宿主细胞可用于表达全人TNFα抗体或其Fab抗体。

[0019] 本发明第四方面，公开了上述全人TNFα抗体的Fab抗体及其PEG化抗体的制药用途。全人TNFα抗体的Fab抗体可用于制备治疗与TNFα相关的炎症的药物，如制备治疗类风湿性关节炎的药物。制备药物时，可将本发明的全人TNFα抗体的Fab抗体或其PEG化抗体与常规的药用载体混合配制。

[0020] 将本发明的Fab抗体或其PEG化抗体用于治疗类风湿性关节炎等与TNFα相关的炎症时的用法用量，可参照现有的TNFα抗体的常规用法用量。

[0021] 本发明有益效果：

[0022] 本发明的全人TNFα抗体与TNF有较好的亲和力，体外能有效中和TNF对L929细胞的杀伤；其次，本发明的Fab抗体可以在大肠杆菌大规模表达，使生产成本大大降低，并且没有补体结合和ADCC等效应引发的副作用；第三，采用PEG化表面改性技术，以减小其被内皮系统吞噬的概率，延长在血液循环系统中的时间，同时又实现在体内缓释的目的，避免了小分子抗体半衰期短的缺点，在保持其抗TNFα活性的同时，使之更适合体内应用。

具体实施方式

[0023] 本发明采用了下述试验思路：

[0024] 取活动性类风湿关节炎病人外周血分离白细胞获得阳性克隆。

[0025] 分离阳性克隆的总RNA，反转录获取cDNA。进行PCR扩增，克隆并测序获得抗人TNFa抗体的重链及轻链可变区的编码序列。

[0026] 1.构建全长的重链编码区和轻链编码区，克隆入表达载体pci-neo(Invitrogen公司产品)，将载体转染CHO细胞，表达全人TNFa-Fab抗体。通过MTX筛选，提高抗体的表达量。

[0027] 2.重链编码区和轻链编码区，按照常规方法克隆到pCOM3H载体，转化至大肠杆菌细胞，诱导表达TNFa-Fab抗体，通过加入葡萄糖，蔗糖等优化措施，提高抗体的表达量。

[0028] 3.将大量表达的TNFa-Fab抗体纯化后进行PEG化。

[0029] 下面结合实施例进一步阐述本发明。

[0030] 实施例1分泌抗人TNFa抗体的B细胞的获得

[0031] 取活动性类风湿关节炎病人外周血5毫升，用淋巴细胞分离液分离白细胞，进行培养，根据ELISA结果鉴定阳性克隆。

[0032] 1.选择血样

[0033] 为了获得分泌抗人TNFa的人B细胞，首先用人TNFa(购自深圳晶美公司)常规包被96孔板，每孔用该蛋白250ng，包被过夜。然后，用5％脱脂奶粉室温封闭2小时，奶粉用pH7.2PBS配制。洗涤后，加入不同病人血清100微升，室温温育1小时。然后加入过氧化物酶标记的羊抗人IgG，室温放置1小时。洗涤至少5遍后，加入含TMD或其他显色剂，室温或37度处理20分钟。最后，加入终止液。加入的过氧化物显色底物加入10分钟后，用50μl1N的硫酸终止反应，读取450nm光密度值。选取阳性且OD值高的血清作为获选血样。

[0034] 2.分离并富集分泌抗TNF抗体的人B-细胞

[0035] 3.在适当条件下对分泌抗TNF抗体的人B-细胞进行培养

[0036] 4.抗体-反应ELISA筛选

[0037] 用ELISA检测抗TNFa IgG的分泌。对经EBV永生法转化的人B细胞培养液上清的样品进行筛选。其中，选择具有最好的结合能力的阳性克隆，且为IgG1。

[0038] 实施例2全人TNFa-Fab抗体基因可变区的获得

[0039] 取阳性克隆细胞5000-10000个，用Trizol(GIBCO)分离总RNA，用Superscript IIIFirst-strand反转录酶(invitrogen公司产品)以获取cDNA。上述操作均按照厂家说明书进行。用下述引物和条件进行PCR，所用扩增酶为TOYOBO的KOD-plus以确保扩增过程中减少可能的突变。

[0040] 轻链上游引物：GCTAGCGCCGCCACCATGGACATGCGGG(SEQ ID NO：1)

[0041] 轻链下游引物：TTTGATCTCAAGCTTGGTCC(SEQ ID NO：2)

[0042] 重链上游引物：CCGGAATTCGCCGCCACCATGGAGTT(SEQ ID NO：3)

[0043] 重链下游引物：ACTCGAGACGGTGACCAGTGTA(SEQ ID NO：4)

[0044] PCR条件：

[0045] a)反应体系的组成：

[0046]

[0047] 反应条件：

[0048] 预变性：94度4分钟

[0049] 主循环：94度20秒，55度20秒，72度1分钟。

[0050] 循环数：30

[0051] 后延伸：72度10分钟

[0052] PCR过程在Applied Biosystems热循环仪上进行。

[0053] b)电泳鉴定与胶回收

[0054] 按照上述条件进行PCR。完毕后将产物在1％琼脂糖凝胶电泳上进行鉴定，两个PCR的产物分别为650bp和690bp左右，与理论大小相符。用华舜公司的胶回收试剂盒回收该片段，操作按照厂家的说明书进行，各得DNA约1.5微克。

[0055] 克隆与测序：

[0056] 上述产物按照T-克隆法常规克隆到PMD19-T vector，鉴定出正确克隆后进行测序。克隆方法采用Tkara公司试剂盒，操作按照说明书进行。对阳性克隆进行测序，结果显示，该两个克隆分别为人TNF-Fab抗体的轻链和重链的可变区编码基因。测序结果如下：

[0057]

[0058] 其编码的多肽氨基酸序列分别为：

[0059]

[0060] 实施例3全人TNFa-Fab抗体的制备

[0061] 1.人IgG1轻链恒定区和重链Fd片段编码序列的获得

[0062] 我们合成了人IgG1的轻链恒定区和重链CH1基因序列，以便构成完整的全人TNFa-Fab抗体基因。根据文献，人IgG1轻链恒定区的DNA编码序列如下：(5’→3’)(SEQ ID NO：9)

[0063] CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG

[0064] 人IgG1重链CH1基因编码序列如下：

[0065] (5’→3’)(SEQ ID NO：10)

[0066] GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCAC

[0067] 上述序列根据常规基因合成方法合成。

[0068] 2.全人TNFa-Fab抗体基因及表达产物的获得

[0069] 将上述IgG1轻链恒定区与轻链可变区，重链可变区与IgG1重链CH1，用Overlap PCR法拼接，拼接后轻链全长为726bp，Fd长为776bp，将轻链全长和重链Fd克隆入表达载体pci-neo，按照常规方法转染CHO细胞进行串联表达，完整的TNFa-Fab序列如下(2923bp)：轻链全长(SEQ ID NO：11)在实施例2公开了全人TNFa-Fab抗体基因重链及轻链可变区的情况下，本技术领域的技术人员还可以通过全合成的方式获得上述重链及轻链可变区的多核苷酸片段进而完成上述操作

[0070] GACATGCGGGTTCCAGCCCAGCTTCTCGGACTTCTGCTGTTGTGGCTGCGCGGAGCACGGTGCGAAATTGTGCTCACACAGTCACCAGACTTTCAGTCTGTCACCCCTAAGGAGAAAGTGACCATCACTTGCAGGGCCTCTCAGTTCGTCGGCTATAGTATCCACTGGTACCAGCAGAAACCCGATCAGTCCCCTAAACTGCTGATCAAGTACGCCTCTGAATCAAGGTCAGGTGTCCCCAGTCGATTTTCTGGATCAGGATCTGGTACCGACTTCACCCTCACCATCAATAGCTTGGAGGCCGAGGACGCTGCTACCTACTACTGCCAACAAAGCCACAGCTGGCACTTTACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTTGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG

[0071] 重链Fd段(SEQ ID NO：14)

[0072] GAAGTCCAGCTGGTCGAGAGCGGTGGCGGGCTGGTGCAACCCGGTGGATCACTGCGGCTCAGCTGCGCTGCTAGTGGCTTTCCCTTCTCTAACCACTGGATGAATTGGGTCCGGCAGGCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGGTGGGTGAGATCAGGAGTAAGTCTATGAACTCCGCCACACACTATGCTGAAAGCGTGAAAGGGCGCTTCACAATCTCTAGAGACGATTCAAAGAACTCTCTGTACCTGCAGATGAACAGTCTGAAAACAGAGGACACCGCTGTGTATTACTGTGCTCGGAACTACTACGGTTCAACTTACGACCACTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTCTCGAGTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCGCTGCCTGA

[0073] 轻链氨基酸序列(214)(SEQ ID NO：12)

[0074] EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQFVGYSIHWYQQKPDQSPKLLIKYASESRSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSHSWHFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.[0075] 重链氨基酸序列(232)(SEQ ID NO：13)

[0076] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFPFSNHWMNWVRQAPGKGLEWVGEIRSKSMNSATHYAESVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARNYYGSTYDHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCAA.

[0077] 实施例4CHO细胞的转染与筛选

[0078] 本研究采用脂质体法(lipofectamine 2000，Invitrogen)对CHO细胞进行转染，转染试剂盒购自Invitrogen公司，转染时分别取纯化的带有重链和轻链的质粒100微克作为DNA样品对CHO细胞进行转染，转染操作程序按照厂家的说明书进行。

[0079] 转染后的CHO细胞经连续3个月的氨甲喋呤(MTX)筛选，并逐步添加MTX 2nM、5nM、20nM、40nM、80nM、120nM、160nM、200nM、250nM、300nM进行筛选，每两周增加一次浓度，每次MTX的用量约为前一次的2倍，具体视细胞生长情况而定。细胞培养按照常规进行，培养基为：15％胎牛血清(Gibco)+RPM1640/DEME。于37度5％CO2培养箱中培养。在此过程中取细胞培养上清进行ELISA检测，经过三次ELISA检测，得到阳性的混合克隆并冻存部分细胞。

[0080] 然后按照常规极度稀释法进行单克隆化，对混合克隆用96孔板极限稀释法进行第一次单克隆培养，稀释细胞密度为2.5个细胞/ml，每孔加入200ul细胞悬液，挑选得到200个单克隆，经过ELISA检测挑选出89个阳性克隆。取ELISA结果中前35个单克隆进行放大培养，并分别冻存部分细胞。对单克隆进行第二次极限稀释法进行亚克隆培养，细胞培养上清经过两次的ELISA鉴定得到826个单克隆，取ELISA检测的前35个单克隆进行第三次亚克隆，细胞培养上清经过ELISA鉴定得到1026个单克隆，取ELISA结果中前30个进行放大培养，并冻存部分细胞。取单克隆细胞提取RNA，进行目的基因的检测，确认所得到的单克隆细胞的目的基因拷贝数，验证为抗人TNFa-Fab抗体。进行抗体蛋白N端测序，结果与设计氨基酸一致。

[0081] 实施例5全人TNFa-Fab的克隆与表达

[0082] 将实施例3获得的轻链全长和重链Fd片段按照常规方法克隆到pCOM3H载体上，为了利于克隆，将部分碱基进行同义突变，不改变氨基酸序列，突变后表达的氨基酸序列见(SEQ IDNO：13)。重链第354个碱基由原来的C突变为A，第650个碱基由G突变为A，在克隆转化感受态细胞Top10F’(来自New England Biolabs或者Takara)细胞后，产物在氨苄平板上进行初步筛选鉴定，取20个菌斑接种于含有氨苄青霉素的液体LB培养基上进行扩增，IPTG、蔗糖诱导后进行western-blot鉴定，进行小量Fab抗体制备，称之为PCOMB3H-9278-TNF-Fab。抗体采用Protein A亲和层析法进行纯化，获得纯度达97％以上的抗体蛋白，测序验证分泌的抗体序列符合前述重链与轻链aa序列。

[0083] 实施例6TNFa-Fab抗体PEG化

[0084] 实施例5获得的抗人TNFa-Fab抗体的第229位引入游离巯基，游离氨基酸C后添加两个保护性氨基酸AA，进行PEG化，TNFa-Fab的PEG化和纯化方法参照AP Champman等[参考文献：Therapeutic antibody fragments with prolonged in vivo half life.Nature Biotech.V171999August，Page 780-783]的方法进行，获得PEG化的抗人TNFa-Fab抗体。纯化的PEG化抗体经免疫学方法ELISA鉴定后，确证为抗TNFa-Fab抗体。

[0085] 实施例7TNFa-Fab抗体及PEG化抗体生物学活性检测

[0086] 1.ELISA测试方法：

[0087] 运用间接ELISA法测定TNFa-Fab的生物学活性，首先将检测用TNF抗原用包被缓冲液稀释至适合的浓度，在96孔板中，每孔加入100μl的包被液，4℃冰箱包被过夜。包被完成后，用洗涤液连续洗涤5次。准确称取0.5gBSA，溶于100ml PBS中，混匀，即为0.5％BSA。每孔加入300μl的封闭液，再次放入4℃封闭过夜。取出96孔板，在洗板机上连续洗5次。将系列稀释的样品依次加入酶标板中，同时做阴性和阳性对照，放于37℃孵育1h。取出96孔板，在洗板机上连续洗5次。每孔加入抗Fab二抗100μl，置于37℃孵育1h。取出96孔板，在洗板机上连续洗5次，每孔加入100μlTMB显色液，37℃10min。

[0088] 待显色后，加入50μl的终止液(2M的浓硫酸)，在450nm处测定OD值

[0089] 结果如下：间接ELISA检测到PEG化的TNFa-Fab最低浓度为0.135ug/mL；抗人TNFa-Fab抗体检测的最低浓度为0.125ug/mL。

[0090] 2.用Biacore T100分析PEG化TNFa-Fab抗体与抗原结合的亲和力

[0091] (1)芯片偶联

[0092] a、用pH5的Acetate buffer稀释样品(抗原TNFa)溶液，使样品浓度分别为2μg/ml。

[0093] b、按照Biacore X100control software的kinetics/affinity assay程序中immobilize方法将TNFa偶联至芯片上。设置偶联水平为3000RU。

[0094] 根据其自动运行的结果报告偶联水平，自动报告偶联结果。最终偶联为3847.5RU.[0095] (2)PEG化TNFa-Fab抗体检测方法以及步骤

[0096] a、将TNFa-Fab化抗体和TNFa-Fab抗体分别用HBS-EP缓冲液稀释，使抗体浓度分别为0、1，2，4，8，16，32，64，400nmol/L

[0097] b、进样：结合时间120s，解离900s.再生缓冲液为50nmNaOH。按照Biacore X100control software的kinetics/affinity程序运行kinetics/affinity assay。

[0098]抗体名称
Ka(M-1s-1) Kd(s-1) Kd(M)
PEG化抗人TNFa-Fab 7.2×106 0.89×10-6 0.15×10-12

[0099]Remicade 1.8×106 8.1×10-6 4.5×10-12
humira 1.1×106 2.2×10-6 2.0×10-12

[0100] c、结果显示，PEG化抗人TNFa-Fab抗体结合常数、解离常数和亲和力与对照相比，具有较强的优越性。

[0101] 实施例8抗人TNFa-Fab单克隆抗体效应功能-L929细胞保护试验

[0102] TNF-α对L929细胞有杀伤作用，而TNFa-Fab则特异性地与TNF-α结合，因而对细胞的杀伤有保护作用，所以可通过TNFa-Fab拮抗TNF-α对靶细胞L929细胞株的杀伤来检测TNFa-Fab的生物学活性。实验采用L929细胞作为TNF-α杀伤的靶细胞，并采用MTS/PMS染色法来检测TNFa-Fab对杀伤的保护作用。

[0103] 活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶可以将MTS还原为蓝黑色的甲化合物，并且这种化合物能够溶于组织培养基中。甲化合物可以在波长490nm处直接测定其吸光值OD490，间接反映了活细胞数量。吸光值OD490的大小间接反映了TNFa-Fab的加入量，通过引入一定浓度梯度的TNFa-Fab标准品来校准，从而计算测定样品生物活性。

[0104] 实验步骤如下：

[0105] 将L929细胞培养至对数生长期，用PBS清洗细胞后加入胰酶消化细胞层，吹打细胞使得细胞分散开，并进行细胞计数。将细胞悬液加入96孔板中，待细胞密度达到90％时，加入测试样品。为了确定最适细胞种板密度，分别于96孔细胞板中接种0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0×105cells/ml，100μl/孔，每个浓度重复2孔，种板后24小时终止培养，MTS/PMS染色，酶标仪490nm处测OD值。

[0106]

[0107] 结果表明：PEG化TNFa-Fab的IC50大约是humira的1/6，中和活性相当于对照humira的6倍，对L929细胞具有较强的保护作用。

[0108] 实施例9TNFa-Fab抗体及PEG化TNFa-Fab抗体半衰期检测

[0109] 将TNFa-Fab抗体及PEG化TNFa-Fab抗体分别对家兔进行静脉注射，分别于0、0.5、1、2、4、8、12、24、48h取血1ml，将血样离心30min后分离血清，-20℃保存待测。采集的血清用ELISA法测定浓度：待测血清用pbs稀释成1∶125，1∶250，1∶500，1∶1000，
1∶2000，1∶4000加到96孔培养板，每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml。用包被缓冲液将TNFa抗原进行包被。4℃过夜(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次3min。加封闭液0.1ml于上述已包被反应孔中，置37℃孵育1h。然后洗涤。于各反应孔中，加入稀释过的待检血清，37℃孵育1h。然后洗涤。于各反应孔中，加入酶标二抗0.1ml。37℃孵育1h，洗涤。于各反应孔中加入临时配制的opd底物溶液0.1ml，37℃避光反应10～30min，加入2mol/l硫酸0.05ml终止反应，在酶标仪上测定495nm吸光值。

[0110] 结果显示，PEG修饰后TNFa-Fab抗体血药浓度降低明显减缓，与未修饰的TNFa-Fab抗体相比，修饰后抗TNFa-Fab抗体半衰期从2.5h延长到7.5h，延长了3倍。

[0111] 实施例10PEG化抗人TNFa-Fab单克隆抗体一次给予动物后所产生的急性毒性反应和死亡情况

[0112] 取PEG化TNFa-Fab抗体以100倍临床剂量(50mg/ml)注射，未发现明显副作用。

[0113] -注射部位反应(ISRs)：瘙痒、红肿等均轻微。

[0114] -非注射部位反应：萎靡不振等，均轻微。

[0115] 试验材料：

[0116] 动物：17-22g的健康小鼠(同次试验体重相差不超过4g)，大鼠体重一般120-150g(同次试验体重相差不超过10g)

[0117] 受试物：液体或粉末剂(不溶于水的可用0.5％羧甲基纤素钠，10％阿拉伯胶制成的混悬剂)。

[0118] 试验方法：

[0119] 1.剂量选择：一般选用4-5个剂量组，各剂量组间间距应根据受试物毒性大小和预试结果而定，一般以0.65-0.85为宜。

[0120] 2.给受试物途径及体积：二种途径，其中一种必须是该受试物推荐临床研究的给药途径。小鼠口服灌胃(po)、静脉注射(iv)、腹腔注射(ip)和皮下注射(sc)的体积，应以0.5-0.8、0.5、0.5和0.5ml为宜。大鼠上述途径给受试物体积应小于或等于3、1、3和1ml为好。

[0121] 3.实验分组和观察：试验时，将动物按体重随机分成4-5组，每组至少10只动物(雌雄各半)，给受试物后即刻观察动物反应情况，继续观察7-14天，记录动物毒性反应情况和死亡动物分布，死亡动物应及时进行尸检，记录病变情况。若有肉眼可见变化时则需进行病理检查。

[0122] 结果处理：

[0123] 用Bliss统计法计算LD50值大于800mg/kg。

[0124] 实施例11PEG化抗人TNFa-Fab抗体保护人TNFa攻击小鼠试验

[0125] 1.初步摸索TNFα致死剂量：

[0126] 试剂、材料：人TNFα，Balb/c小鼠8只

[0127] 试验方法：alb/c小鼠8只随机分为四组(2只/组)，经尾静脉/腹腔给予人TNF α100ug/鼠、30ug/鼠、10ug/鼠、0ug/鼠，一周内观察小鼠情况：死亡，毛发光泽，便溺等，并记录死亡时间。

[0128] 2.细化摸索致死剂量人TNFα：

[0129] 试验方法：Balb/c小鼠15只随机分为3组，根据上次实验小鼠全部死亡的剂量，设计2个剂量组100/50，30/15、10/5ug/鼠，经静脉/腹腔给予特定剂量的人TNFα，一周内观察小鼠情况：死亡，毛发光泽，便溺等，记录死亡时间。

[0130] 3.PEG化抗人TNFa-Fab单克隆抗体保护小鼠致死剂量人TNFα攻击

[0131] 实验步骤

[0132] (1)、27ml 20mg/ml D-半乳糖胺致敏剂的制备：

[0133] 准确称取D-半乳糖胺粉末540mg，打开超净工作台，紫外照射30min，在超净工作台中量取27ml灭菌后PBS，将540mg粉末溶于无菌PBS中，用0.22μm过滤器精密过滤。

[0134] (2)、实验准备：

[0135] 实验设为对照组与实验组，随机抓取6只小鼠分为一笼，共10笼，其中⑩号为对照组，①～⑨号为实验组。

[0136] (3)、分别对①～⑩号的小鼠腹腔注射D-半乳糖胺致敏剂，10mg/只，即每只小鼠注射0.5ml。

[0137] (4)、24h后腹腔注射TNF-α

[0138] a、TNF-α总溶液：将1mg的TNF-α粉末用1ml无菌PBS溶解，配制成1mg/ml的溶液。

[0139] b、根据肿瘤坏死因子致死剂量的探索后所得结果，设定TNF-α浓度为80μg/0.5ml/只小鼠

[0140] (5)、注射PEG化抗人TNFa-Fab抗体

[0141] 注射TNF-α2小时后注射抗体。抗体剂量按照高中低剂量分为三组，设置阳性对照组。设置PBS为阴性对照组。每组小鼠6只，每只小鼠体重20±1g.

[0142] 4、结论

[0143] 初步实验结论得出PEG化抗人TNFa-Fab抗体保护剂量小于13ug/小鼠/1ugTNFa，PEG化抗人TNFa-Fab单克隆抗体可有效保护人TNFa的攻击，小鼠死亡率得到明显下降。

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双重靶定抗体及其用途-专利编号CN102428104B	2020-05-12	419
抗IgSF4抗体及其利用-专利编号CN101137671A	2020-05-12	580
针对人CD22抗体的抗独特型抗体及其应用-专利编号CN103588882A	2020-05-13	195
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针对人CD22抗体的抗独特型抗体及其应用-专利编号CN103588882B	2020-05-13	885
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全人TNFα-Fab抗体及其PEG化抗体-专利编号CN102336834B	2020-05-11	703

全人TNFα-Fab抗体及其PEG化抗体

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