烟草烟碱脱甲基酶基因组克隆及其应用

本发明涉及编码烟碱脱甲基酶的核酸序列和使用那些核酸序列来改 变植物表型的方法。

站旦 冃豕

细胞色素p450s催化广泛范围的在化学上不相似的底物的酶促反应， 其包括内源性和异生底物的氧化、过氧化和还原代谢。在植物中，p450s 参与生化途径，所述生化途径包括植物产物诸如phenylpropanoids，生物 碱，类萜，脂质，氰苷和芥子油苷的合成(Chappell， Annu. Rev. Plant Physiol. PlantMol. Biol. 46:521-547, 1995)。细胞色素p450s，也己知为p450血红素 -硫醇盐蛋白质，通常充当被称为包含p450的单氧化酶系统的多成分电子 传递链中的末端氧化酶。由这些酶系统催化的具体反应包括脱甲基作用， 羟基化作用，环氧化作用，N-氧化作用，硫代氧化作用，N-、 S-、和0-脱垸基化，脱硫作用，脱氨作用和偶氮、硝基和N-氧化物基团的还原作用。

烟草属(A^oft'朋a)植物p450酶的多样作用涉及对多种植物代谢物的 影响，所述植物代谢物诸如phenylpropanoids,生物碱，类萜，脂质，氰 苷，芥子油苷和许多其它的化学实体。 一些p450酶可以影响植物代谢物 的组成。例如，长期以来，理想的是通过育种来改变植物的选定脂肪酸的 模式从而改善某些植物的香味和香气;然而关于涉及控制这些叶组分的水 平的机制知道的很少。与脂肪酸改变相关的p450酶的下调或上调可以促 进理想的脂肪酸的积累，这提供了更为优选的叶表型的品质。

关于p450酶的功能和它们在植物组分中的更多作用仍旧在发现中。 例如，发现一类特殊的p450酶催化脂肪酸分解为挥发性C6-和C9-醛和P -醇，其是水果和蔬菜的"鲜绿"气味的主要起作用的因素。可以改变其 它新的目标p450s的水平，从而通过改变在烟草属叶中的脂质组成和相关 的分解代谢物来提高叶子组分的品质。这些叶组分中的一些受到刺激叶品

质成熟的衰老的影响。还有其它的报道显示p450s酶在改变脂肪酸中具有

功能性作用，所述脂肪酸涉及植物-病原体相互作用和疾病抗性。

在其它的情形中，已经显示p450酶涉及生物碱的生物合成。如通过 申请人的专利申请所提供，去甲烟碱， 一种在烟草(iWcoria"ato&CMm)中发 现的次要生物碱，通过p450-介导的烟碱的脱甲基作用随后在N位点进行 酰化作用和亚硝化作用由此产生一系列的N-酰基去甲烟碱和N-亚硝基去 甲烟碱而产生，本申请要求所述专利申请的优先权，并且将所述专利申请 并入本文作为参考。认为由p450脱甲基酶催化的N-脱甲基作用是烟草属 中去甲烟碱生物合成中的主要来源。

在本领域中存在对于改进植物表型的试剂和方法的需要。特别地，存 在对于改进烟碱脱甲基酶的试剂和方法的需要。本发明提供许多用于改进 烟碱脱甲基酶的表达的策略。

发明概述

本申请人己经鉴定和表征了来自烟草的烟碱脱甲基酶的基因组克隆。 包括在本文中的是，烟碱脱甲基酶蛋白质编码区的序列，3'非翻译序列 ("3'UTR")，单一内含子和烟碱脱甲基酶基因启动子及其转录调节序列(图 1)。另外描述的是将这些序列用于产生转基因植物的应用，所述转基因植 物相对于对照植物，具有去甲烟碱或N'-亚硝基去甲烟碱（"NNN")或两 者的改变的水平。

因此，在第一个方面，本发明的特征是分离的核酸分子，例如包含编 码烟碱脱甲基酶的核苷酸序列的DNA序列。在理想的实施方案中，第一 个方面的核苷酸序列基本上与编码烟草烟碱脱甲基酶的核苷酸序列相同， 所述烟草烟碱脱甲基酶诸如这样的烟草烟碱脱甲基酶，其包含与SEQ ID NO:l或SEQ ID NO:3的核苷酸序列至少70%相同的核苷酸序列，或包含 SEQ ID NO:l的核苷酸2010-2949和/或3947-4562，或包含SEQIDNO:l 或SEQIDNO:3的序列。本发明的第一个方面的分离的核酸分子，例如与 在植物细胞中有功能的启动子可操纵地连接并且理想地被包含在表达载 体中。在其它理想的实施方案中，表达载体被包含在细胞中，例如植物细 胞中。理想地，植物细胞，诸如烟草植物细胞被包括在植物中。在另一个

理想的实施方案中，本发明的特征是来自包含表达载体的植物的种子，例 如烟草种子，其中所述种子包括分离的核酸分子，所述分离的核酸分子在

严谨条件下杂交于SEQIDNO:3的序列，其与异源启动子序列可操纵地连 接。此外，本发明的特征是来自包含表达载体的萌发的种子的植物，来自 所述植物的绿色或加工处理(cured)的叶子，和由所述叶子制成的制品。

在另一个理想的实施方案中，核苷酸序列包含这样的序列，所述序列 在严谨条件下杂交于SEQ ID NO: 1和/或SEQIDNO:3的核苷酸序列的互 补体，或SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:3的片段。理想地，所述核苷酸序 列编码烟碱脱甲基酶，所述烟碱脱甲基酶与SEQIDNO:2的氨基酸序列基 本上相同。在本发明的第一个方面的另一个理想实施方案中，所述烟碱脱 甲基酶具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 2的烟碱 脱甲基酶氨基酸序列或烟碱脱甲基酶的片段具有至少70%同一性，所述烟 碱脱甲基酶的片段与全长多肽相比具有改变的(例如减少)的酶活性。理想 地，所述烟碱脱甲基酶包括SEQIDNO:2的氨基酸序列。

在另一个方面，本发明的特征是包含启动子或驱动转录的其片段的分 离的核酸分子，所述启动子在严谨条件下杂交于SEQIDNO:6的序列。理 想地，所述启动子(i)在用乙烯处理后或在衰老过程中被诱导；并且(ii)包括 (a) SEQ ID NO: 1的碱基对1-2009，或(b)至少200个连续的碱基对，其与 由SEQ ID NO: 1的碱基对1- 2009限定的200个连续的碱基对的序列相同， 或(c) 20个碱基对核苷酸部分，其在序列上与在SEQ ID NO:l的碱基对 1-2009中提出的20个连续碱基对部分的序列相同。

本发明的另一个方面的特征是分离的核酸启动子，其包含与SEQ ID NO:6的序列具有50%或更多的序列同一性的核苷酸序列。理想地，该分 离的核酸启动子在用乙烯处理后，或在衰老过程中被诱导，并且例如包含 SEQ ID NO: 6的序列。备选地，所述启动子可以包含可从SEQ ID NO:6 中获得的片段，其中所述片段驱动异源基因的转录或减少或改变烟碱脱甲 基酶活性(例如，使基因表达沉默)。在理想的实施方案中，所述启动子序 列与异源核酸序列可操纵地连接，并且可以例如被包含在表达载体中。在 其它理想的实施方案中，所述表达载体被包含在细胞，例如植物细胞中。 理想地，植物细胞，诸如烟草植物细胞，被包括在植物中。在另一个理想

的实施方案中，本发明的特征是来自包含表达载体的植物的种子，例如烟

草种子，其中所述种子包含分离的核酸分子，其在严谨条件下，杂交于SEQ IDNO:6的序列，其与异源核酸序列可操纵地连接。此外，本发明的特征 是来自包含本发明的该方面的启动子的萌发种子的植物，来自所述植物的 绿色或加工处理的叶子，或由所述叶子制成的制品。

本发明的另一个方面的特征是在植物中表达异源基因的方法。该方法 包括(i)将包含启动子序列的载体引入植物细胞，所述启动子序列与SEQID NO: 6的序列具有50%或更多的序列同一性，其与异源核酸序列可操纵地 连接；和(ii)从细胞中再生植物。此外，该方法可以包括将载体通过性手 段传递到子代，并且进一步可以包括收集从子代中产生的种子的步骤。

在另一个方面，本发明的特征是在烟草植物中减少烟碱脱甲基酶的表 达的方法。该方法包括下列步骤:（i)将包含与异源核酸序列可操纵地连接 的SEQIDNO:6的序列或可从SEQIDNO: 6获得的片段的载体引入烟草 植物中，和(ii)在烟草植物中表达所述载体。在该方法的理想实施方案中， 烟草脱甲基酶的表达被沉默。在其它理想的实施方案中，所述载体表达 RNA ，诸如反义RNA或能够诱导RNA千扰(RNAi)的RNA分子。

在另一个理想的方面中，本发明的特征是包含这样的内含子的分离的 核酸分子，所述内含子在严谨条件下杂交于SEQ ID NO:5的序列或其片 段，所述片段减少或改变烟碱脱甲基酶的酶活性(例如，沉默基因表达)或 可以充当分子标志物以鉴定烟碱脱甲基酶核酸序列。在理想的实施方案 中，内含子包括(a)SEQ ID NO: 1的碱基对2950-3946，或(b)至少200个连 续的碱基对，其与SEQIDNO:l的碱基对2950-3946所定义的200个连续 的碱基对的序列相同，或(c) 20个碱基对核苷酸部分，其在序列上与在SEQ ID NO:l的碱基对2950-3946中提出的20个连续的碱基对部分的序列相 同。

本发明的另一个理想的方面的特征是分离的核酸内含子，所述内含子 包括与SEQ ID NO: 5的序列或其片段具有50%或更多序列同一性的核苷 酸序列，其减少或改变烟碱脱甲基酶的酶活性(例如，沉默基因表达)或可 以充当分子标志物以鉴定烟碱脱甲基酶核酸序列。使基因表达沉默，可以 例如，包括导致不具有烟碱脱甲基酶活性的基因产物的同源重组或突变。

具体而言，所述内含子可以包括SEQ ID NO: 5的序列或可以从SEQ ID NO: 5获得的片段。理想地，包含内含子的分离的核酸分子与异源核酸序列可 操纵地连接并且该序列理想地被包含在表达载体中。在另一个实施方案 中，所述表达载体被包含在细胞，诸如植物细胞中。具体而言，所述细胞 可以是烟草细胞。包含这样的植物细胞的植物，例如烟草植物是本发明的 另一个理想的实施方案，所述植物细胞包含在表达载体中与异源核酸序列 可操纵地连接的SEQIDNO:5的序列或可从SEQIDNO:5获得的片段。另 外，来自植物的种子，例如烟草种子也是理想的，其中所述种子包含内含 子，所述内含子在严谨条件下杂交于SEQIDNO:5，其与异源核酸序列可 操纵地连接。此外，本发明的特征是来自包含本发明的该方面的内含子的 萌发的种子的植物，来自所述植物的绿色或加工处理的叶子，和从绿色或 加工处理的叶子制成的制品。

本发明的另一个方面的特征是在植物中表达内含子的方法。该方法包 括(i)将表达载体引入植物细胞，所述表达载体包含与异源核酸序列可操 纵地连接的SEQ ID NO: 5的序列或可从SEQ ID NO: 5获得的片段；禾叩i) 从细胞中再生植物。在理想的实施方案中，该方法还包括(iii)将载体通过 性手段传递到子代，并可以包括收集子代产生的种子的另外的步骤。所述 方法理想地包括，例如再生来自萌发的种子的植物，来自所述植物的绿色 或加工处理的叶子，和从所述叶子制备制品的方法。

在另一个方面中，本发明的特征是减少烟草植物中烟碱脱甲基酶的表 达的方法。该方法包括下列步骤(i)将载体引入烟草植物，所述载体包含 与异源核酸序列可操纵地连接的SEQ ID NO:5的序列或可从SEQ IDNO: 5 获得的片段，和(ii)在烟草植物中表达所述载体。在该方法的理想实施方 案中，使烟碱脱甲基酶的表达被沉默。在其它理想的实施方案中，所述载 体表达RNA，诸如反义RNA或能够诱导RNA干扰(RNAi)的RNA分子。

在另一个方面，本发明的特征是分离的核酸分子，所述核酸分子包含 非翻译区，所述非翻译区在严谨条件下杂交于SEQ ID NO:7的序列或其 片段，所述SEQIDNO:7的序列或其片段可以改变基因的表达模式，减 少或改变烟碱脱甲基酶酶活性(例如，使基因表达沉默)，或可以用作标志 物来鉴定烟碱脱甲基酶核酸序列。在本发明该方面的理想实施方案中，非

翻译区包括(a) SEQ ID NO:l的碱基对4563-6347，或(b)至少200个连续 的碱基对，其与SEQ ID NO: 1的碱基对4563-6347所限定的序列的200 个连续的碱基对相同，或(c) 20个碱基对核苷酸部分，其在序列上与SEQ ID NO: 1的碱基对4563-6347提出的序列的20个连续的碱基对部分相同。

本发明的另一个理想的方面的特征是分离的核酸非翻译区，所述核酸 非翻译区包含这样的核苷酸序列，其与SEQIDNO:7的序列具有50%或更 多的序列同一性。理想地，所述非翻译区包含SEQIDNO:7的序列或所述 非翻译区包括可从SEQ ID NO:7获得的片段，其可以改变基因的表达模 式，减少或改变烟碱脱甲基酶的酶活性(例如，使基因表达沉默)，或可以 用作标志物来鉴定烟碱脱甲基酶核酸序列。所述非翻译区理想地与异源核 酸序列可操纵地连接并且可以包含在表达载体中。此外，该表达载体理想 地包含在细胞，诸如植物细胞，例如烟草细胞中。本发明的另一个理想的 实施方案的特征是包括植物细胞的植物，诸如烟草植物，所述植物细胞包 含包括分离的核酸序列的载体，所述分离的核酸序列与SEQIDNO:7的序 列具有50%或更多的序列同一性并且与异源核酸序列可操纵地连接。

本发明的特征还在于来自植物的种子，例如烟草种子，其中所述种子 包括非翻译区，所述非翻译区在严谨条件下杂交于SEQIDNO:7，其与异 源核酸序列可操纵地连接。此外，本发明的特征是来自包含本发明的该方 面的非翻译区的萌发的种子的植物，来自所述植物的绿色或加工处理的叶 子，和由绿色或加工处理的叶子制成的制品。

在另一个方面，本发明的特征是在植物中表达非翻译区的方法。该方 法包括(i)将载体引入植物细胞，所述载体包含这样的分离的核酸序列， 所述核酸序列与SEQIDNO:7的序列具有50%或更多的序列同一性，并且 与异源核酸序列可操纵地连接；和(ii)从细胞中再生植物。此外，该方法 还可以包括(iii)将载体通过性手段传递到子代，并且理想地，包括收集由 子代产生的种子的另外的步骤。该方法理想地包括再生来自萌发的种子的 植物，来自所述植物的绿色或加工处理的叶子，和从绿色或加工处理的叶 子制备制品的方法。

此外，本发明的特征是在烟草植物中减少烟碱脱甲基酶的表达或改变 烟碱脱甲基酶的酶活性的方法。该方法包括下列步骤：（i)将载体引入烟草

植物中，所述载体包含这样的分离的核酸序列，所述分离的核酸序列与

SEQ ID NO:7的序列具有50%或更多的序列同一性并且与异源核酸序列可 操纵地连接和(ii)在烟草植物中表达所述载体。理想地，烟碱脱甲基酶的 表达被沉默。在其它理想的实施方案中，载体表达RNA，例如反义RNA 或能够诱导RNA干扰(RNAi)的RNA分子。

本发明的另一个方面的特征是表达载体，所述表达载体包括包含编码 烟碱脱甲基酶的核苷酸序列的核酸分子，其中所述载体能够定向由分离的 核酸分子编码的烟碱脱甲基酶的表达。理想地，所述载体包括SEQ ID NO: 1或SEQIDNO:3的序列。在其它理想的实施方案中，本发明的特征是植 物或植物组分，例如烟草植物或植物组分(例如，烟草叶子或茎)，其包括 核酸分子，所述核酸分子包含编码使烟碱脱甲基的多肽的核苷酸序列。

本发明的另一个方面的特征是包含分离的核酸分子的细胞，所述分离 的核酸分子包括编码烟碱脱甲基酶的核苷酸序列。理想地，该细胞是植物 细胞或细菌细胞，诸如土壤杆菌属(^gTO^cten'謂)。

本发明的另一个方面的特征是植物或植物组分(例如烟草叶子或茎)， 其包含分离的核酸分子，所述核酸分子编码烟碱脱甲基酶，其中所述核酸 分子在植物或植物组分中进行表达。理想地，所述植物或植物组分是被子 植物、双子叶植物、茄科植物或烟草属物种。该方面的其它理想的实施方 案是来自所述植物或植物组分的种子或细胞，以及来自所述植物的绿色或 加工处理的叶子和由其制备的制品。

在另外的方面中，本发明的特征是烟草植物，其具有编码多肽的核酸 序列的减少的表达，所述多肽是例如包括SEQIDNO:2的序列并且使烟碱 脱甲基的多肽，其中所述减少的表达(或酶活性的减少)减少植物中去甲烟 碱的水平。在理想的实施方案中，烟草植物是转基因植物，诸如包括转基 因的植物，当所述转基因在转基因植物中进行表达时，使内源烟草烟碱脱 甲基酶的基因表达沉默。

具体而言，所述转基因植物理想地包括下列各项中的一个或多个：表 达烟草烟碱脱甲基酶的反义分子或能够诱导RNA干扰(RNAi)的RNA分子 的转基因；当在转基因植物中表达时，共抑制烟草烟碱脱甲基酶的表达的 转基因；编码显性负调控（dominant negative)失活基因产物，例如SEQ ID

NO: 2的氨基酸序列的突变形式的转基因；在编码SEQIDNO: 2的氨基酸

序列的基因中的点突变；在编码烟草烟碱脱甲基酶的基因中的缺失；和在 编码烟草烟碱脱甲基酶的基因中的插入。

在其它理想的实施方案中，编码多肽的核酸序列的减少的表达在转录 水平、在翻译水平或在翻译后水平发生。

本发明的另一个方面的特征是烟草植物，所述烟草植物包含被稳定整 合到其基因组中的重组表达盒，其中所述表达盒能够实现烟碱脱甲基酶活 性中的减少。该烟草植物的种子是理想的实施方案中的特征。其它的理想 的实施方案包括来自该植物的绿色或加工处理的叶子和由其制备的制品。

本发明的另一个方面的特征是在植物中表达烟草烟碱脱甲基酶的方 法。该方法包括(i)将表达载体引入植物细胞中，所述表达载体包括包含 编码烟碱脱甲基酶的核苷酸序列的核酸分子；和(ii)从所述细胞中再生植 物。在理想的实施方案中，该方法的特征是将载体通过性手段传递到子代， 并且理想地还包括收集由子代产生的种子的另外的步骤。另外的理想的实 施方案包括来自萌发的种子的植物，来自所述植物的绿色或加工处理的叶 子，或由所述绿色或加工处理的叶子制备的制品。

本发明的另一个方面的特征是基本纯的烟草烟碱脱甲基酶。理想地， 该烟草烟碱脱甲基酶包括与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70%同 一性的氨基酸序列或包括SEQ IDNO:2的氨基酸序列。在理想的实施方案 中，所述烟草烟碱脱甲基酶，在植物细胞中表达后，将烟碱转化为去甲烟 碱。在其它理想的实施方案中，所述烟草烟碱脱甲基酶，在植物细胞中表 达后，被主要定位在叶子中，或所述烟草烟碱脱甲基酶由乙烯诱导或在植 物衰老的过程中进行表达。

在另一个方面，本发明的特征是基本纯的抗体，其特异性地识别并且 结合烟草烟碱脱甲基酶。理想地，所述抗体识别并且结合重组烟草烟碱脱 甲基酶，例如包含SEQ ID NO: 2的序列或其片段的重组烟草烟碱脱甲基 酶。

本发明的另一个方面的特征是产生烟草烟碱脱甲基酶的方法。该方法 包括下列步骤:（a)提供被用分离的核酸分子转化的细胞，所述分离的核酸 分子包含编码使烟碱脱甲基的多肽的核苷酸序列；（b)在表达所述分离的

核酸分子的条件下培养所述转化的细胞；和（c)回收所述烟草烟碱脱甲基 酶。本发明的特征还在于按照该方法产生的重组烟草烟碱脱甲基酶。

在另一个方面，本发明的特征是分离烟草烟碱脱甲基酶或其片段的方 法。该方法包括下列步骤：（a)使SEQIDNOS: 1， 3， 5， 6，或7的核酸

分子或其部分与来自植物细胞的核酸制品在这样的杂交条件下进行接触， 所述杂交条件提供核酸序列的检测，所述核酸序列与SEQIDNOS:l， 3， 5， 6，或7的核酸序列具有至少70%或更大的序列同一性；和(b)分离所 述杂交的核酸序列。

在另一个方面，本发明的特征是分离烟草烟碱脱甲基酶或其片段的另 一个方法。该方法包括下列步骤：（a)提供植物细胞DNA的样品；（b)提 供寡核苷酸对，其与具有SEQIDNOS:1,3,5,6,或7的序列的核酸分子的 区域具有序列同一性；（c)使所述寡核苷酸对与植物细胞DNA在这样的条 件下进行接触，所述条件适合于聚合酶链反应介导的DNA扩增；和(d)分 离所述扩增的烟草烟碱脱甲基酶或其片段。在该方面的理想的实施方案 中，使制备自植物细胞的cDNA的样品进行扩增步骤。在另一个理想的实 施方案中，所述烟草烟碱脱甲基酶编码多肽，所述多肽与SEQIDN0:2的 氨基酸序列具有至少70%的同一性。

本发明的另一个方面的特征是在植物或植物组分中减少烟草烟碱脱 甲基酶的表达的方法。该方法包括下列步骤:（a)将编码烟草烟碱脱甲基酶 的转基因引入植物细胞中以产生转化的植物细胞，所述转基因与在植物细 胞中有功能的启动子可操纵地连接；和(b)从转化的植物细胞中再生植物或 植物组分，其中所述烟草烟碱脱甲基酶在植物或植物组分的细胞中进行表 达，由此在植物或植物组分中减少烟草烟碱脱甲基酶的表达。在本发明的 该方面的具体实施方案中，将编码烟草烟碱脱甲基酶的转基因例如，以组 织特异性，细胞特异性或器官特异性方式，组成性地表达或诱导性地进行 表达。在本发明的该方面的另一个实施方案中，转基因的表达共抑制内源 烟草烟碱脱甲基酶的表达。

本发明的另一个方面的特征是在植物或植物组分中减少烟草烟碱脱 甲基酶的表达的另一种方法。该方法包括下列步骤：（a)将编码烟草烟碱脱 甲基酶的反义编码序列或能够诱导RNA千扰(RNAi)的RNA分子的转基因

引入植物细胞中以产生转化的植物细胞，所述转基因与在植物细胞中有功

能的启动子可操纵地连接；和(b)从转化的植物细胞中再生植物或植物组 分，其中烟草烟碱脱甲基酶的编码序列的反义编码序列或能够诱导RNA 干扰(RNAi)的RNA分子在植物或植物组分的细胞中进行表达，由此在植 物或植物组分中减少烟草烟碱脱甲基酶的表达。理想地，编码烟草烟碱脱 甲基酶的反义序列或能够诱导RNA干扰(RNAi)的RNA分子的转基因，例 如以组织特异性、细胞特异性或器官特异性方式组成性地表达或诱导性地 进行表达。

本发明的另一个方面的特征是在植物或植物组分中减少烟草烟碱脱 甲基酶的表达的另一种方法。该方法包括下列步骤:（a)将转基因引入植物 细胞中以产生转化的植物细胞，所述转基因编码烟草烟碱脱甲基酶的显性 负调控的基因产物，其与在植物细胞中有功能的启动子可操纵地连接；和 (b)从转化的植物细胞再生植物或植物组分，其中烟草烟碱脱甲基酶的显 性负调控基因产物在植物或植物组分的细胞中进行表达，由此在植物或植 物组分中减少烟草烟碱脱甲基酶的表达。在本发明的该方面的具体实施方 案中，编码显性负调控基因产物的转基因以例如组织4寺异性、细胞特异性 或器官特异性方式进行组成性表达或诱导性表达。

本发明的另一个方面的特征是在植物细胞中减少烟草烟碱脱甲基酶 的表达或酶活性的另一种方法。该方法包括在植物细胞中减少内源烟草烟 碱脱甲基酶的水平，或其酶活性。理想地，所述植物细胞来自双子叶植物、 茄科植物，或烟草植物种类。在该方面的理想实施方案中，减少内源烟草 烟碱脱甲基酶水平包括在植物细胞中表达编码烟草烟碱脱甲基酶的反义 核酸分子或能诱导RNA干扰(RNAi)的RNA分子的转基因，或包括在植物 细胞中表达编码烟草烟碱脱甲基酶的双链RNA分子的转基因。理想地， 所述双链RNA是对应于SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 3， SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 6,或SEQIDNO:7的序列的RNA序列，或其片段。在另一个实施 方案中，减少内源烟草烟碱脱甲基酶的水平包括在植物细胞中共抑制内源 烟草烟碱脱甲基酶或包括在植物细胞中表达显性负调控基因产物。具体而 言，所述显性负调控基因产物可以包括编码SEQ ID NO: 2的氨基酸序列 的突变形式的基因。

在本发明的该方面的其它理想实施方案中，内源烟草烟碱脱甲基酶包

括在编码SEQIDNO:2的氨基酸序列的基因中的点突变。在其它理想的实 施方案中，减少内源烟草烟碱脱甲基酶的表达的水平包括在编码烟草烟碱 脱甲基酶的基因中的缺失或包括在编码烟草烟碱脱甲基酶的基因中的插 入。减少的表达可以在转录水平，在翻译水平，或在翻译后水平发生。

在本发明的另一个方面的特征是鉴定在细胞中改变烟草烟碱脱甲基 酶的表达的化合物的方法。该方法包括下列步骤:（a)提供包含编码烟草烟 碱脱甲基酶的基因的细胞；（b)将候选化合物应用到细胞中；禾口(c)测量编 码烟草烟碱脱甲基酶的基因的表达，其中相对于未处理的对照样品在表达 中的增加或减少是化合物改变烟草烟碱脱甲基酶的表达的指示。

在该方法的理想实施方案中，部分(a)的基因编码这样的烟草烟碱脱甲 基酶，其与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少70。/。的同一性。理想地， 所述化合物减少或增加编码所述烟草烟碱脱甲基酶的基因的表达。

在另一个方面，本发明的特征是鉴定在细胞中改变烟草烟碱脱甲基酶 的活性的化合物的另一种方法。该方法包括下列步骤:（a)提供表达编码烟 草烟碱脱甲基酶的基因的细胞；（b)将候选化合物应用到细胞中；禾Q(c)测 量所述烟草烟碱脱甲基酶的活性，其中相对于未处理的对照样品的活性的 增加或减少是化合物改变所述烟草烟碱脱甲基酶的活性的指示。在本发明 的该方面的理想实施方案中，步骤(a)的基因编码这样的烟草烟碱脱甲基 酶，其与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少70。/。的同一性。理想地，所 述化合物减少或增加烟草烟碱脱甲基酶的活性。

本发明的另一个方面的特征是加工处理的烟草植物或植物组分，其包 含(i)减少的水平的烟碱脱甲基酶或(ii)具有改变的酶活性的烟碱脱甲基 酶和减少量的亚硝胺。理想地，所述植物组分是烟草叶子或烟草茎。在理 想的实施方案中，亚硝胺是去甲烟碱，并且所述去甲烟碱的含量理想地是 少于5 mg/g, 4.5 mg/g， 4.0 mg/g, 3.5 mg/g, 3.0 mg/g,更理想地少于2.5 mg/g, 2.0 mg/g， 1.5 mg/g， 1.0 mg/g，更理想地少于750 u g/g, 500 u g/g, 250 u g/g， 100 ix g/g，甚至更理想地少于75 P g/g， 50 U g/g， 25 u g/g, 10 P g/g， 7.0 yg/g,5.0 ug/g,4.0 ug/g，和甚至更理想地少于2.0 Ug/g, 1.0 ug/g, 0.5ug/g,0.4 ug/g,0.2 ug/g,0.1 yg/g,0.05 " g/g，或0.01 u g/g，或其中

次要生物碱相对于其中总的生物碱含量的百分比少于90%, 70%， 50%, 30%,10%，理想地少于5%, 4%， 3%, 2%,1.5%， 1%，并且更理想地少于0.75%， 0.5%，0.25%，或0.1%。在另一个理想的实施方案中，亚硝胺是N，-亚硝基 去甲烟碱(NNN)，并且N， - NNN的含量理想地是少于5 mg/g， 4.5 mg/g, 4.0 mg/g， 3.5 mg/g， 3.0 mg/g，更理想地少于2.5 mg/g， 2.0 mg/g， 1.5 mg/g， 1.0 mg/g，更理想地少于750 ug/g, 500 ug/g，250 " g/g, 100 P g/g，甚至更 理想地少于75 Pg/g， 50yg/g, 25 u g/g， 10 u g/g， 7.0 u g/g, 5.0 u g/g, 4.0ug/g，并且甚至更理想地少于2.0 ug/g, 1.0 ug/g，0.5 ug/g, 0.4 u g/g， 0.2 ug/g，0.1 ug/g，0.05 ug/g，或0.01ug/g，或其中次要生物碱相对于 其包含的总生物碱含量的百分比是少于90%，70%, 50%, 30%,10%，理想地 少于5%， 4%, 3%, 2%， 1.5%， 1%，并且更理想地少于0.75%， 0.5°/。， 0.25%， 或0.1%。在本发明的该方面的另一个理想的实施方案中，所述加工处理的 烟草植物或植物组分是深色烟草(dark tobacco)、白莱烟(Burley tobacco)、 烟熏烟（flue-cured tobacco)、深色晾烟（air-cured tobacco)或东方型烟草 (oriental tobacco)。

此外，本发明的加工处理的烟草植物或植物组分理想地包括重组烟碱 脱甲基酶基因，例如包含SEQIDNO:l或SEQIDNO:3的序列，或其片 段的基因。理想地，在加工处理的烟草植物或植物成分中，内源烟碱脱甲 基酶基因的表达被沉默。

本发明的另一个方面的特征是包含加工处理的烟草植物或植物组分 的烟草产品，其包括(i)烟碱脱甲基酶的减少的表达或(ii)具有改变活性的 烟碱脱甲基酶，和减少量的亚硝胺。理想地，所述烟草产品是无烟烟草、 湿或干鼻烟、嚼烟、巻烟、雪茄烟、小雪茄烟、pipe tobacco或bidis。具 体而言，本发明的该方面的烟草产品可以包含深色烟草、研磨过的烟草 (milled tobacco)，或包括加香成分。

本发明的特征还在于制备烟草产品，例如无烟烟草产品的方法，所述 产品包含(i)烟碱脱甲基酶的减少的表达或(ii)具有改变(例如减少的)酶活 性的烟碱脱甲基酶，和减少量的亚硝胺。该方法包括提供加工处理的烟草 植物或植物组分，和从所述加工处理的烟草植物或植物成分中制备烟草产 品，所述加工处理的烟草植物或植物组分包含(i)减少水平的烟碱脱甲基

酶或(ii)具有改变的酶活性的烟碱脱甲基酶和减少量的亚硝胺。 定义

"酶活性"指包括，但不限于脱甲基作用，羟基化作用，环氧化作用，

N-氧化作用，硫代氧化作用，N-、 S-、和O-脱垸基化，脱硫作用，脱氨作 用和偶氮、硝基和N-氧化物和其它这样的酶促反应性化学基团的还原作 用。改变的酶活性指相对于对照酶(例如，野生型烟草植物烟碱脱甲基酶) 的活性减少酶活性（例如，烟草烟碱脱甲基酶的减少酶活性）达至少 10-20%，优选地至少25-50%,和更优选地至少55-95%或更多。烟草烟碱 脱甲基酶的活性可以使用本领域标准方法，诸如本文所述的通过酵母表达 的微粒体测量放射性烟碱的脱甲基作用进行测定。

术语"核酸"指单链或双链形式存在的，或有义或反义的脱氧核糖核 苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限定，涵盖天然核苷酸的已知类 似物，其以类似于天然存在的核苷酸的方式与核酸杂交。除非另外指出， 特定的核酸序列包括其互补序列。术语"可操纵地连接"，"以可操纵的组 合"和"以可操纵的顺序"指在核酸表达控制序列(诸如启动子、信号序列 或转录因子结合位点的阵列)和第二核酸序列之间的功能连接，其中所述表 达控制序列影响对应于第二序列的核酸的转录和/或翻译。

当关于细胞使用时，术语"重组"指出细胞复制异源核酸，表达所述 核酸或表达肽，异源肽，或由异源核酸编码的蛋白质。重组细胞可以表达 在细胞的天然(native)(非重组)形式中未发现的有义或反义形式的基因或基 因片段或能够诱导RNA干扰(RNAi)的RNA分子。重组细胞也可以表达在 细胞的天然形式中发现的基因，但是其中所述基因被以人工方式进行修饰 并再次引入细胞中。

"结构基因"是包括编码蛋白质、多肽或其部分的DNA片段的基因 的部分，并且不包括，例如，驱动转录起始的5'序列或3'UTR。所述结构 基因可以备选地编码不可翻译的产物。所述结构基因可以是通常在细胞中 发现的基因或在细胞或其被引入的细胞定位中通常未发现的基因，在该种 情况下其被称为"异源基因"。异源基因可以完全或部分来自本领域已知 的任何来源，包括细菌基因组或游离基因(episome)，真核生物的核或质粒

DNA， cDNA，病毒DNA或化学合成的DNA。结构基因可以包含可以影 响生物学活性或其特征、表达产物的生物学活性或化学结构，表达的速率 或表达控制的方式的一个或多个修饰。这些修饰包括，但不限于， 一个或 多个核苷酸的突变、插入、缺失和置换。

结构基因可以由不间断的编码序列构成或其可以包括一个或多个由 适合的剪接点结合的内含子。所述结构基因可以是可翻译或不可翻译的， 包括反义或能够诱导RNA干扰(RNAi)的RNA分子。结构基因可以是来自 多个来源和来自多个基因序列(天然存在或合成的，其中合成的指化学合成 的DNA)的片段的组合物。

关于核酸序列用于本文时，"外显子"指基因的核酸序列的部分，其 中外显子的核酸序列编码基因产物的至少一个氨基酸。外显子典型地邻近 于非编码DNA片段诸如内含子。理想地，外显子编码SEQIDNO:2的烟 草烟碱脱甲基酶氨基酸序列的部分，诸如SEQ ID NO:2序列的氨基酸 1-313和/或314-517。

关于核酸序列用于本文时，"内含子"指位于编码区侧翼的基因的非 编码区。内含子典型地是基因的非编码区，其被转录为RNA分子，但是 接着在产生信使RNA或其它功能性结构RNA的过程中通过RNA剪接被 切除。理想地，内含子包括SEQIDNO:5的序列，或其片段。

关于核酸序列用于本文时，"3'UTR"指邻近于外显子的终止密码子的 非编码核酸序列。理想地，3'UTR包括SEQIDNO:7的序列，或其片段。 "衍生自"用于指取自、获自、接受自、发现自、复制自或遗传自某 一来源(化学和/或生物的)。衍生物可以通过原始来源的化学或生物操作(包 括，但不限于，置换、添加、插入、缺失、提取、分离、突变和复制)而进 行制备。

与DNA序列相关的"化学合成"指将组成核苷酸的部分在体外装配。 DNA的手动化学合成可以使用公知的方法来完成(Caruthers, Methodology of DNA and RNA Sequencing, (1983)， Weissman (ed.), Praeger Publishers,纽 约，第一章)；自动化学合成可以使用许多商购机械之一来进行。

进行比较的序列的优化排比可以，例如通过Smith和Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)的局部同源性算法，Needleman和Wunsch， J, Mol,

Biol. 48: 443 (1970)的同源性排比算法，通过Pearson和Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 (1988)的进行相似性方法的搜索，通过这些算法 的计算机执行(在Wisconsin遗传软件包中的GAP, BESTFIT, FASTA,和 TFASTA ， Genetics Computer Group, 575 Science Dr" Madison， Wis.》或

通过目测进行。

NCBI基本局部排比搜索工具(BLAST)(Altschul等，1990)获自几种来 源，包括生物信息国家中心(National Center for Biological Information) (NCBI， Bethesda, Md.)和在互联网上，与序列分析程序blastp, blastn， blastx, tblastn,和tblastx组合使用。其可以在http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

上进行评估。关于怎样使用该程序确定序列同一性的描述在http: 〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast help.html可获f寻。

用于氨基酸序列并且用于本文时，术语"基本的氨基酸同一性"或"基 本的氨基酸序列同一性"指多肽的特征，其中所述肽包括与SEQIDNOS: 2和/或4的蛋白质序列比较，具有至少70%序列同一性，优选地80%氨 基酸序列同一性，更优选地90%氨基酸序列同一性，和最优选地至少99到 100%的序列同一性。理想地，对于烟碱脱甲基酶而言，序列比较理想地 用于细胞色素p450基序(GXRXCX(G/A); SEQ ID NO: 29)到翻译肽的终止 密码子的区域的比较。

用于核酸序列和用于本文时，术语"基本的核酸同一性"或"基本的 核酸序列同一性"指多核苷酸序列的特征，其中所述多核苷酸包含这样的 序列，其与SEQIDNOS:1，3,5，6,禾Q/或7比较，具有至少50%，优选地60%, 65%， 70%，或75%的序列同一性，更优选地81%或91%的核酸序列同一性， 和最优选地至少95%， 99%或甚至100%的序列同一性。理想地，对于烟 碱脱甲基酶核酸序列而言，比较理想地用于编码从细胞色素p450基序 (GXRXCX(G/A); SEQ ID NO: 29)到翻译肽的终止密码子的区域的比较。

核苷酸序列是基本上相同的另一个指示是两个分子是否在严谨条件 下彼此杂交。严谨条件是序列依赖型的并且将在不同的情况下是不同的。 一般而言，在限定的离子强度和pH上，对于具体序列选择的严谨条件是 低于热熔点(Tm)约5i:到约2(rC，通常是约l(TC到约15°C。 Tm是这样的 温度(在限定的离子强度和pH)，其中靶序列的50%与匹配的探针杂交。

典型地，严谨条件将是其中盐浓度在pH 7是约0.02摩尔并且温度是至少 约60"C的那些。例如，在标准的DNA杂交方法中，严谨条件将包括于42 。C在6xSSC中的开始的洗涤，随后在至少约55。C、典型地约60。C，通常 约65"C的温度上在0.2xSSC中进行的一次或多次另外的洗涤。

出于本发明的目的，当所述核苷酸序列编码基本上相同的多肽和/或蛋 白质时，核苷酸序列也是基本上相同的。因此，当一个核酸序列编码基本 上与第二个核酸序列相同的多肽时，所述两个核酸序列是基本上相同的，

即使它们由于遗传密码所容许的简并性在严谨条件下不杂交(见，Darnell 等.(1990) Molecular Cell Biology, Second Edition Scientific American Books W, H. Freeman and Company New York for an explanation of codon degeneracy and the genetic code)。蛋白质纯度或均一'性可以通过许多本领域 众所周知的方式来指示，所述方式诸如蛋白质样品的聚丙烯酰胺凝胶电 泳，随后通过染色进行观察。对于某些目的而言，可能需要高分辨率，并 且可以使用HPLC或类似的用于纯化的方式。

所谓"特异性结合"或"特异性识别"烟草烟碱脱甲基酶的抗体意 为相对于等量的任何其它蛋白质，增加亲和性的烟草烟碱脱甲基酶的抗 体。例如，特异性结合包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的烟草烟碱脱甲基 酶的抗体理想地对于其抗原具有这样的亲和性，所述亲和性与等量的任何 其它抗原，包括相关抗原相比，大于至少2倍、5倍、10倍、30倍或100 倍。抗体与抗原，例如烟草烟碱脱甲基酶的结合可以通过许多本领域标准 的方法例如，蛋白质印迹分析、ELISA或共免疫沉淀进行确定。

用于本文时，术语"载体"指将DNA片段传递给细胞的核酸分子使 用。载体可以作用于复制DNA并且可以独立地在宿主细胞中增殖。术语 "媒介物"有时与"载体"交互使用。用于本文时，术语"表达载体"指 这样的重组DNA分子，其包含需要的编码序列和在具体宿主生物中表达 可操纵连接的编码序列所必需的适合的核酸序列。在原核生物中用于表达 必需的核酸序列通常包括启动子、操纵子(任选)和核糖体结合位点，经常 还伴随其它序列。理想地，所述启动子包括驱动转录的SEQ ID NO: 6的 序列，或其片段。此外，理想的是与SEQ ID NO:6的序列具有至少50%， 60% 75%, 80%, 90%, 95%,或甚至99%序列同一性并且驱动转录的启动子序

列。己知真核生物细胞使用启动子、增强子和终止子以及多腺苷酸化信号，

诸如SEQ ID NO:7的3'UTR序列。在某些情形中，己经观察到植物表达载 体需要植物来源的内含子，诸如具有SEQIDNO:5的序列的内含子的存在 以具有稳定的表达。同样，SEQIDNO:5的序列，或具有适合的RNA剪

接点的任何其它内含子可以如本文进一步描述进行使用。

出于再生具有根的全遗传改造的植物的目的，可以将核酸插入植物细

胞中，例如通过任何技术诸如体内接种或通过任何已知的体外组织培养技 术以产生可以再生为全植物的转化的植物细胞。因此，例如，插入植物细 胞可以通过由致病性或非致病性的A」"me/ac&m的体外接种来进行。还 可以使用其它这样的组织培养技术。

"植物组织"，"植物组分"或"植物细胞"包括植物的分化和未分化 的组织，包括，但不限于，培养的根、茎、叶、花粉、种子、肿瘤组织和 各种形式的细胞，诸如单细胞、原生质体、胚和胼胝体组织。所述植物组 织可以是在植物中或以器官、组织或细胞培养物存在。

用于本文时，"植物细胞"包括在植物中的植物细胞和培养的植物细 胞和原生质体。"cDNA"或"互补的DNA"通常指具有这样的核苷酸序 列的单链DNA分子，所述核苷酸序列互补于包含内含子的未加工的RNA 分子，或缺乏内含子的加工的mRNA。通过在RNA模板上的酶逆转录酶 的作用来形成cDNA。

用于本文时，"烟草"包括烟熏烟、弗吉尼亚烟(Virginia)、白莱烟、 深色烟、东方型烟和在烟草属中的其它类型的植物。烟草属的种子容易以 烟草的形式商购获得。

"制品"或"烟草产品"包括产品诸如湿和干鼻烟、嚼烟、巻烟、雪 茄烟、小雪茄烟、pipetobacco、 bidis和类似的烟草来源的产品。

至于"基因沉默"指相对于对照植物(例如，野生型烟草植物)的水平， 在基因表达(例如，编码烟草烟碱脱甲基酶的基因的表达)水平中的减少达 至少30-50%,优选地至少50-80%，和更优选地至少80-95%或更大。这种 表达水平的减少可以通过使用本领域已知的标准方法或通过使用标准突 变发生技术，诸如本文描述的那些进行突变基因的产生来完成，所述标准 方法包括，但不限于，RNA干扰、三链干扰、核酶、同源重组、病毒诱

导的基因沉默、反义和共抑制技术、显性失活基因产物的表达。按照任何 标准技术监测烟草烟碱脱甲基酶多肽或转录物，或两者的水平，所述标准

技术包括，但不限于，RNA印迹、核糖核酸酶保护或免疫印迹。

用于本文时，"烟草烟碱脱甲基酶"或"烟碱脱甲基酶"指，基本上

与SEQIDNO:2的序列相同的多肽。理想地，烟草烟碱脱甲基酶能够将烟 碱(doHwN2，还称为3-(l-甲基-2-吡咯垸基）吡啶）转化为去甲烟碱 (C9HI2N2)。如本文所述，可以使用本领域标准的方法来评估烟草烟碱脱甲 基酶的活性，所述本领域标准方法诸如通过测量酵母表达的微粒体进行的 对放射性烟碱的脱甲基作用来进行。

至于烟草烟碱脱甲基酶氨基酸序列的"片段"或"部分"指SEQ ID NO:2 的氨基酸序列的至少例如20, 15， 30， 50,75， 100, 250, 300， 400，或500个连 续氨基酸。示范性的理想的片段是SEQIDNO:2的序列的氨基酸1-313和 SEQIDNO:2的序列的氨基酸314-517。此外，关于烟草烟碱脱甲基酶核 酸序列的片段或部分，理想的片段包括SEQ ID NO: 1的核酸序列的至少 100， 250, 500, 750, 1000,或1500个连续的核酸。示范性的理想的片段是 SEQ ID NO:l 的序列的核酸 1-2009， 2010-2949， 2950-3946, 3947-4562,4563-6347,和4731-6347。其它理想的片段包括SEQ ID NO: 5, 的核酸1-100, 101-250,251-500,501-750,和751-998， SEQ ID NO: 6的核酸 1-398, 1-1400， 1401-2009， 1840-2009， 1940-2009,399-1240，禾P 1241-2009， 和SEQ ID NO:7的核酸1-100, 101-250, 251-500， 501-750， 751-1000, 1001-1250, 1251-1500，禾B 1501-1786。

至于"基本纯的多肽"指已经从夭然伴随其的大多数成分中分离的烟 草烟碱脱甲基酶；然而，也将这样的其它蛋白质认为是基本纯的多肽，所 述其它蛋白质见于与制备物相关的微粒体部分中，具有至少8.3pKat/mg 蛋白质，9pKat/mg蛋白质，9.5pKat/mg蛋白质，10pKat/mg蛋白质，10. 5pKat/mg,或10.8pKat/mg蛋白质的烟碱脱甲基酶活性。典型地，当去除 了至少60重量％的与其天然相关的蛋白质和天然存在的有机分子时，所述 多肽是基本纯的。优选地，所述制备物是至少75重量％，更优选地至少 90重量％和最优选地至少99重量％的烟草烟碱脱甲基酶。可以通过，例 如从天然来源(例如，烟草植物细胞)中提取；通过编码烟草烟碱脱甲基酶

的重组核酸的表达；或通过蛋白质的化学合成来获得基本纯的烟草烟碱脱

甲基酶。可以通过任何适合的方法，例如柱色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳，

或通过HPLC分析来测量纯度。

至于"分离的核酸分子"指去除了天然位于生物的基因组的核酸分子 序列侧翼的核酸序列的核酸序列。

至于"转化的细胞"指其中(或其祖先中）已经通过重组DNA技术引入 DNA分子，例如编码烟草烟碱脱甲基酶的DNA分子的细胞。

如本文提供的，术语"细胞色素p450"和"p450"交替使用。

附图简述

图1是烟草烟碱脱甲基酶基因的基因组结构的示意图。

图2-l到2-3是基因组烟草烟碱脱甲基酶核酸序列(SEQIDNO: l)和其

翻译产物(SEQ ID NO: 2)。

图3是烟草烟碱脱甲基酶编码区的核酸序列(SEQ ID NO:3)(也称为

D121-AA8)和其翻译产物(SEQ ID NO:4)。

图4是在烟草烟碱脱甲基酶基因组序列中存在的内含子的核酸序列

(SEQ ID NO: 5)。

图5是烟草烟碱脱甲基酶启动子区的核酸序列(SEQ ID NO: 6)。

图6是烟草烟碱脱甲基酶基因的3'UTR的核酸序列(SEQIDNO: 7)。

详细描述

编码烟草烟碱脱甲基酶的基因组克隆的鉴定

按照本发明，从转化体(corwerter)和非转化体烟草属品系的烟草属组 织中提取RNA。接着，将提取的RNA用于产生cDNA。接着，使用两种 策略来产生本发明的核酸序列。

在第一个策略中，从植物组织中提取富聚腺苷酸的RNA，并且通过 反转录PCR来制备cDNA。接着，使用简并引物加寡d (T)反向引物，将 单链cDNA用于产生p450特异性PCR群。引物设计基于其它植物细胞色 素p450基因序列的高度保守基序进行。特异性简并引物的实例在US 2004/0103449 Al和US 2004/0111759 Al专利申请出版物中的图1中提出，

将它们并入本文作为参考。将来自包含适合大小的插入片段的质粒的片段 的序列进行进一步分析。根据所用的引物，这些大小的插入片段典型地在

从约300到约800核苷酸。

在第二个策略中，开始构建cDNA文库。使用简并引物加在质粒上的 T7引物作为反向引物将质粒中的cDNA用于产生p450特异性PCR群。 如在第一个策略中，对来自包含适合大小的插入片段的质粒的片段的序列 进行进一步分析。

可以将已知产生高水平的去甲烟碱的烟草属植物品系(转化体)和具有 低水平去甲烟碱的植物品系用作原材料。接着可以从植物中去除叶子，并 且用乙烯进行处理以激活本文定义的p450酶活性。使用本领域已知的技 术来提取总的RNA。接着，可以使用以寡d(T)引物进行的PCR(RT-PCR) 来产生cDNA片段。接着，可以如在本文实施例中所更充分的描述来构建 cDNA文库。

将p450型酶保守区用作简并引物的模板。使用简并引物，通过PCR 来扩增p450特异性条带。通过DNA测序来鉴定指示p450样酶的带。使 用BLAST搜索，排比或其它工具来对PCR片段进行特征以鉴定适合的候 选物。

将来自鉴定的片段的序列信息用于开发PCR引物。将这些引物与 cDNA文库中的质粒引物组合以用于克隆全长p450基因。进行大规模 Southern反向分析来检查获得的所有的片段克隆和在某些情形中的全长克 隆的差异表达。在本发明的该方面中，可以使用来自不同组织的标记的总 cDNAs作为探针与克隆的DNA片段进行杂交来进行这些大规模的反向 Southern测定从而筛选所有的克隆的插入片段。还将非放射性和放射性 (P32)RNA印迹法用于表征克隆的p45Q片段和全长克隆。

通过衍生它们的氨基酸序列和选择具备抗原性且相对于其它克隆是 独特的肽区域来制备肽特异性抗体。制备兔抗体以合成与载体蛋白缀合的 肽。使用这些抗体，在植物组织上进行蛋白质印迹分析或其它免疫方法。 此外，通过衍生它们的氨基酸序列和选择具有潜在抗原性并且相对于其它 克隆是独特的肽区域来制备针对数种全长克隆的肽特异性抗体。制备兔抗 体以合成与载体蛋白缀合的肽。使用这些抗体，进行蛋白质印迹分析。

烟草烟碱脱甲基酶的下调

按照标准基因沉默方法来产生具有减少的烟草烟碱脱甲基酶的表达

的植物。（至于综述，见Arndt和Rank, Ge"owe40:785-797, 1997; Turner和 Schuch， Jowma/ o/C7zemz,ca/ rec/z"o/ogy 5/他c/zwo/ogy 75:869-882， 2000; 禾口 Klink禾卩Wolniak, Jowtw/ o/ P/awf /?egw/a^ow 19(4):371-384,

2000.)具体而言，可以将烟草烟碱脱甲基酶基因启动子(例如，SEQ ID NO:6),结构基因(SEQIDNO:3)，内含子(SEQ IDNO:5)，或3'UTR(SEQID NO:7)或整个基因组克隆(SEQIDNO:l)用于改变烟草表型或烟草代谢物， 例如在任何烟草属物种中的去甲烟碱。烟草烟碱脱甲基酶基因的减少的表 达可以使用，例如RNA干扰(RNAi) (Smith et al., A^"〜407:319-320， 2000; Fire et al" 7Va/, 391:306-311, 1998; Waterhouse et al.， 授AS 95:13959-13964, 1998; Stalberg et al"尸ta M?/固/ar B油gy 23: 671- 683, 1993; Brignetti et al.， EMSO J 17:6739-6746， 1998; Allen et al. , A^we 说'ofec/z"o/ogy 22: 1559-1566, 2004);病毒诱导的基因沉默 ("VIGS")(Baulcombe, Cwm^ (9—'画P/，f 5油gy, 2:109-113, 1999; Cogoni禾口 Macino， Ge腦Z)ev 10: 638-643， 2000; Ngelbrecht et al" 91:10502-10506, 1994);通过在有义方向传递植物内源基因来使目标基因 沉默(Jorgensen et al., Plant Mol Biol 31: 957-973, 1996);反义基因的表达； 同源重组(Ohl et al" Homologous Recombination and Gene Silencing in Plants (Kluwer, Dordrecht, The Netherlands, 1994); Cre/lox系统(Qin et al" 91: 1706-1710, 1994;Koshinsky et al., 772e他"/Jow簡/ 23: 715-722, 2000; Ghou， et al"尸/a/^ 爿wz'ma/ GewoweF// C"o"/erewce爿6sfrad Sa" D/ego, C4， 17-21 1999年1月）；基因捕获和T-DNA标记(Burns et al. ， GWzm Dev. 8:1087-1105, 1994; Spradling， et al., iWAS 92:10824-10830, 1995; Skames et al,, Bio/Technology 8, 827-831, 1990; Sundaresan, et al.，Gewes Dev. 9: 1797-1810, 1995);和任何其它可能的基因沉默系统进行，所述基因沉默 系统可在沉默区获得，其导致烟草烟碱脱甲基酶的表达的下调或在其酶活 性中的减少。在下面更详细地描述示例性方法。

RNA干扰

RNA干扰("RNAi")是通常在许多生物包括植物中用于诱导有效的和 特异性的翻译后基因沉默的可应用的方法(见，例如，Bosheretal. ,Ato. Ce〃 所o/. 2:E31-36， 2000;和Tavernarakis et al.， A^. 24:180-183, 2000)。

RNAi包括将具有部分或全长双链特征的RNA引入细胞或引入细胞外环 境中。抑制是特异性的，因为选择来自目标基因(例如烟草烟碱脱甲基酶) 的部分的核苷酸序列来产生抑制RNA。选择的部分通常包括目标基因的 外显子，但是选择的部分还可以包括非翻译区(UTRs)，以及内含子(例如 SEQ IDNO:5或7的序列）。

例如，为了构建产生能够形成双链体的RNAs的转化载体，可以将一 个在有义方向，另一个在反义方向的两个烟草烟碱脱甲基酶核酸序列可操 纵地进行连接，并且将其置于强病毒启动子的控制下，所述强病毒启动子 诸如CaMV35S，或从木薯棕色条纹病毒(CBSV)中分离的启动子。然而， 使用内源启动子，诸如具有SEQIDNO:6的序列的烟草烟碱脱甲基酶启动 子，或驱动转录的其片段也可以是理想的。包括在这种构建体中的烟草烟 碱脱甲基酶核酸序列的长度理想地是至少25个核苷酸，但是可以包括这 样的序列，其包括直到全长烟草烟碱脱甲基酶基因。

可以通过土壤杆菌介导的转化(C7zw朋g " a/.,尸rac. Jcad /7&4 97: 4985-4990, 2000)将产生能够形成双链体的RNAs的构建体引入植 物诸如烟草植物的基因组，导致烟草烟碱脱甲基酶中的特异性和可遗传的 遗传干扰。还可以将双链RNA直接引入细胞(g卩，细胞内地)或细胞外地引 入，例如通过将种子、幼苗或植物浸浴在包含双链RNA的溶液中来进行。

根据递送的双链RNA物质的剂量，所述RNAi可以提供目标基因的 功能的部分或完全的损失。可以在至少99%的目标细胞中获得基因表达的 减少或损失。通常，被注射物质的更低的剂量和在施用dsRNA后的更长 时间导致更少部分的细胞的抑制。

在RNAi中所用的RNA可以包括聚合的核糖核苷酸的一条或多条链； 其可以包括对磷酸-糖主链或核苷的改变。双链结构可以通过单一自我互补 的RNA链或通过两条互补的RNA链来形成，并且RNA双链体形成可以 起始于细胞的内部或外部。可以以容许每个细胞递送至少一个拷贝的量来

引入RNA。然而，更高的剂量(例如，每个细胞至少5， 10, 100，500或1000

个拷贝)的双链物质可以产生更有效的抑制。抑制是序列特异性的，因为遗 传抑制针对对应于RNA的双链体区的核苷酸序列。对于抑制，优选包含 与目标基因的部分相同的核苷酸序列的RNA。相对于目标序列具有插入、 缺失和单点突变的RNA序列对于抑制也可以是有效的。因此，可以通过 本领域已知的排比算法和在核苷酸序列之间计算百分比差异来优化序列 同一性。备选地，可以将RNA的双链体区在功能上定义为能够与目标基 因转录物的部分杂交的核苷酸序列。

此外，用于RNAi的RNA可以在体内或体外进行合成。例如，在细 胞中的内源RNA聚合酶可以介导体内转录，或可以将克隆的RNA聚合酶 用于体内或体外转录。对于从体内的转基因或表达的构建体中进行转录， 可以将调节区用于翻译RNA —条链(或多条链)。

三链干扰

内源烟草烟碱脱甲基酶基因表达还可以通过靶向互补于烟草烟碱脱 甲基酶基因的调节区(例如，启动子或增强子区)的脱氧核糖核苷酸序列以 形成三股螺旋结构来进行下调，所述三股螺旋结构阻止耙细胞中的烟草烟 碱脱甲基酶基因的转录(通常见，Helene, Anticancer Drag Des 6:569-584, 1991; Helene et al,. Ann. N.Y. Acdd, Sci.660:27-36, 1992; 和 Maher, Bioassays，14:807-815, 1992.)。

用于转录的抑制的在三股螺旋形成中所用的核酸分子优选地是单链 的并且由脱氧核糖核苷酸组成。这些寡核苷酸的碱基组成应该以 Hoogsteen碱基配对法则来促进三股螺旋形成，其通常需要相当大的嘌呤 或嘧啶的一段序列存在于双链体的一条链上。核苷酸序列可以是基于嘧啶 的，其将导致穿过得到的三股螺旋的三条相关链的TAT和CGC三联体。 富含嘧啶的分子以与该链平行的方向提供对于所述双链体的单链的富含 嘌呤区的碱基互补性。此外，可以选择富含嘌呤的核酸分子，例如包含G 残基的一段序列。这些分子将与富含GC对的DNA双链体形成三股螺旋， 其中大部分的嘌呤残基位于目标双链体的单链上，导致穿过在三股螺旋中 的三条链的CGC三联体。 或者，对于三股螺旋形成可以被耙向的可能序列可以通过产生"转向"

核酸分子得以增加。转向分子以交替的5'-3',3'-5'方式进行合成，从而使得 它们与双链体的第一条链碱基配对，接着与另一条链碱基配对，消除了存 在于双链体的一条链上的嘌呤或嘧啶的相当大的一段序列的必要性。

核糖核酸酶

核糖核酸酶是这样的RNA分子，其充当酶起作用并且可以被改造以 裂解其它的RNA分子。可以对核糖核酸酶进行设计以特异性地与实际上 任何目标RNA配对并且裂解在特定位点的磷酸二酯主链，由此在功能上 使目标RNA失活。在此过程中，核糖核酸酶本身没有消耗，并且可以在 催化上起作用来裂解多拷贝的mRNA目标分子。因此，还可以将核糖核 酸酶用作下调烟草烟碱脱甲基酶的表达的工具。目标RNA—特异性核糖 核酸酶的设计和使用描述在Haseloff et al.(胸,334:585-591， 1988)中。 优选地，核糖核酸酶在核糖核酸酶的活性位点的每一侧上包括互补于目标 序列(例如，烟草烟碱脱甲基酶)的至少约20个连续的核苷酸。

此外，核糖核酸酶序列还可以被包括在反义RNA中以赋予在反义 RNA上的RNA-裂解活性并且因此增加反义构建体的有效性。

同源重组

基因替代技术是下调给定基因，例如烟草烟碱脱甲基酶的表达的另一 种理想的方法。基因替代技术基于同源重组（见，Schnable et al. ， Cwn: C^m'ora尸/aW所o/.l:123-129， 1998)。可以通过突变发生(例如，插入、缺 失、复制或替代)来操纵目标酶诸如烟草烟碱脱甲基酶的核酸序列以减少酶 的功能。接着，可以将改变的序列引入基因组中通过同源重组以替代现存 的，例如野生型的基因(Puchta et al.,尸rac. Wa//. Sc/. t75L4 93:5055-5060:

1996;禾d Kempin et al., A^we 389: 802-803, 1997)。

共抑制

使基因表达沉默的另一种理想的方法是共抑制(还称为有义抑制)。包括 引入以有义方向构造的核酸的该技术已经显示对目标基因的转录的有效

的阻碍(见，例如，Napolietal.，尸/"wCW/，2:279-289， 1990和Jorgensen et al.，美国专利号5,034,323)。

一般而言，有义抑制包括被引入序列的转录。然而，共抑制还可以发 生在被引入的序列本身包含非编码序列的时候，但是仅有内含子(例如SEQ ID N0:5的序列)或非翻译序列诸如SEQ ID N0:7或基本上与存在于内源 基因的初级转录物中的序列相同的其它这样的序列将被抑制。被引入的序 列通常基本上与被靶向抑制的内源基因相同。这样的同一性典型地大于约 50%，但是优选更高的同一性(例如，80%或甚至95%)因为它们导致更有 效的抑制。共抑制的效果还可以被应用于在显示同源性或基本的同源性的 基因的类似家族中的其它蛋白质。可以将来自一种植物的基因的片段直接 使用，例如，以抑制在不同植物种类中的同源基因的表达。

在有义抑制中，要求更少绝对同一性的被引入序列，相对于初级转录 产物或充分加工的mRNA，不需要是全长的。在短于全长的序列中的更高 程度的序列同一性弥补更少同一性的更长序列。此外，被引入的序列不需 要具有相同的内含子或外显子模式，并且非编码片段的同一性可以是一样 有效的。优选至少50个碱基对的序列，其中更优选更长长度的被引入序 列(见，例如，描述在Jorgensen et al.,美国专利号5,034,323中的方法)。

反义抑制

在反义技术中，克隆来自需要的植物的基因的核酸片段，诸如在SEQ IDNOS:l,3，5,6,或7中发现的片段，并且将其与表达控制区可操纵地连接 从而合成RNA的反义链。接着，将构建体转化到植物中并且产生RNA的 反义链。在植物细胞中，已经显示反义RNA抑制基因表达。

在反义抑制中被引入的核酸片段通常基本上与被抑制的内源一个或 多个基因的至少一部分相同，但是不需要是相同的。本文公开的烟草烟碱 脱甲基酶的核酸序列可以被包括在设计的载体中从而使抑制作用应用于 显示与目标基因同源或基本同源的基因的家族中的其它蛋白质。可以将来 自一种植物的基因的片段直接使用，例如，以抑制在不同烟草属物种中的 同源基因的表达。

相对于初级转录产物或充分加工的mRNA，被引入的序列也不需要是

全长的。 一般而言，可以将更高的同源性用于弥补更短序列的使用。而且， 被引入的序列不需要具有相同的内含子或外显子模式，并且非编码片段的 同源性将是一样的有效。通常，这样的反义序列在长度上将通常是至少15

个碱基对，优选地是约15-200个碱基对，并且更优选地是200-2,000个碱 基对或更长。反义序列可以互补于待抑制基因的全部或部分(例如，烟草烟 碱脱甲基酶启动子（SEQIDNO:6)，外显子，内含子(SEQ ID N0:5)，或 UTR(SEQIDNO:7)，并且如本领域技术那些技术人员所理解，根据需要 抑制的程度和反义序列的独性状，反义序列结合的特定一个或多个位点以 及反义序列的长度将会变化。表达植物负调节物反义核苷酸序列的转录构 建体在转录的方向上包括，启动子，编码有义链上的反义RNA的序列， 和转录终止区。可以构建反义序列并且将其如例如在van der Krol et al. (Gene 72: 45-50， 1988); Rodermel et al. (CW/ 55: 673-681, 1988); Mol et al.

268:427-430, 1990); Weigel和Nilsson (Atow^ 377: 495-500， 1995); Cheung et al., (Ce〃 82:383-393, 1995);和Shewmaker et al.(美国专利 号5,107,065)中所述进行表达。

显性负调控

可以在人工环境或在田间来测定转基因植物，从而证实所述转基因在 转基因植物中赋予下调烟草烟碱脱甲基酶，所述转基因植物表达编码烟草 烟碱脱甲基酶的显性负调控基因产物的转基因。按照本领域已知的方法来 构建显性负调控转基因。典型地，显性负调控基因编码烟草烟碱脱甲基酶 的突变的负调节物多肽，其当过量表达时，干扰野生型酶的活性。

突变体

还可以使用标准的突变发生的方法来产生具有减少的烟草烟碱脱甲 基酶的表达或酶活性的植物。这些突变发生的方法包括，但不限于，用甲 基硫酸乙酉旨处理种子(Hildering禾口 Verkerk, In, The use of induced mutations in plant breeding. Pergamon press, pp 317-320, 196"或UV-福身寸，X—射线， 和快中子辐射(见，例如，Verkerk, T^gn'c. Scz'. 19:197-203, 1971;和 Poehlman, Breeding Field Crops, Van Nostrand Reinhold, New York (3.sup.rd

ed), 1987)，使用转座子(Fedoroffetal., 1984;美国专利号4,732,856和美 国专利号5,013,658)，以及T-DNA插入方法(Hoekemaetal.， 1983;美国专 利号5,149,645)。可以存在于烟草烟碱脱甲基酶基因中的突变的类型，包 括，例如点突变、缺失、插入、复制和倒位。这些突变理想地存在于烟草 烟碱脱甲基酶基因的编码区中；然而，在烟草烟碱脱甲基酶基因的启动子 区，和内含子，或非翻译区中的突变也可以是理想的。

例如，可以将T-DNA插入突变发生用于在烟草烟碱脱甲基酶基因中 产生插入突变以下调所述基因的表达。在理论上，对于在任何给定基因中 获得插入片段的95%的可能性，需要约100,000个独立的T-DNA插入片 段(McKi皿et，尸to 8:613-622， 1995;和Forsthoefel et al., J地w/ P/zw/o/. 19:353-366， 1992)。可以使用聚合酶链式反应(PCR)分析来筛选植 物的T-DNA标记的品系。例如，可以设计用于T-DNA的一端的引物，并 且可以设计用于目标基因的另一种引物，两种引物都可以用在PCR分析 中。如果没有获得PCR产物，那么在目标基因中没有插入片段。相反， 如果获得PCR产物，那么在目标基因中有插入片段。

可以按照标准方法(例如，在本文中所述的那些)来评估突变的烟草烟 碱脱甲基酶的表达，并且任选地可以与未突变酶的表达进行比较。当与未 突变植物进行比较时，具有减少的编码烟草烟碱脱甲基酶的基因的表达的 突变植物是本发明的理想实施方案。

澄欽后动f

按照本发明的有用植物启动子的实例是具有SEQ ID NO: 6的序列的 烟碱脱甲基酶启动子，或驱动转录的其片段。另一种理想的启动子是花椰 菜花叶病毒启动子，例如花椰菜花叶病毒(CaMV)启动子或木薯叶脉花叶 病毒(CsVMV)启动子。这些启动子在大多数植物组织中赋予高水平的表 达，并且这些启动子的活性不依赖于病毒编码的蛋白质。CaMV是35S 和19S启动子两者的来源。使用这些启动子的植物表达构建体的实例是本 领域已知的。在转基因植物的大多数组织中，所述CaMV35S启动子是强 启动子。所述CaMV启动子在单子叶植物中也是具有高度活性的。而且， 该启动子的活性可以通过CaMV35S启动子的复制进一步增加（即，在2

一10倍之间）。

其它有用的植物启动子包括，但不限于，胭脂氨酸合成酶(NOS)启动子， 章鱼碱合酶启动子，玄参(figwort)花叶病毒(FMV)启动子，稻肌动蛋白启 动子，和遍在蛋白启动子系统。

示例性的单子叶植物启动子包括，但不限于，鸭跖草黄斑驳病毒 (commelina yellow mottle virus)启动子，甘蔗badna病毒启动子，水禾舀 timgro杆状病毒启动子，玉米条纹病毒元件，和小麦矮縮病毒启动子。

对于某些应用而言，可能理想的是以适合的水平，或在适合的发育时 间，在适合的组织中产生烟草烟碱脱甲基酶，诸如显性负调控突变的烟草 烟碱脱甲基酶。对此目的，存在各类基因启动子，每种具有体现在其调节 序列中的本身的独特的性状，响应于可诱导的信号诸如环境、激素和/或发 育信息时显示被调节。这些包括，但不限于，负责热调节的基因表达，光 调节的基因表达的基因启动子(例如，豌豆Ao9-3A玉米Ac5"启动子；发 现于豌豆中的叶绿素a/b结合蛋白质基因；或Arabssu启动子)，激素调节 的基因表达(例如，来自小麦五m基因的脱落酸(ABA)反应序列；ABA诱导 的HVA1禾卩HVA22，和大麦和拟南芥(v4ra6Wo;w/"的rd29A启动子；和创 伤诱导的基因表达(例如，HW7/的)，器官特异性基因表达(例如，块茎特异 性的贮存蛋白质基因的器官特异性基因表达；来自所述的玉米的23-kDa 玉米蛋白基因的器官特异性基因表达;或法国菜豆e-菜豆蛋白基因的器官 特异性基因表达)，或病原体诱导的启动子(例如，7/7-7,或P-1，3-葡聚糖酶启动子，小麦的真菌诱导的wHa启动子，和线虫诱导的启动子， 分别为烟草和芹菜的7b6朋7-W和/^g:))。

微表这载沐

典型地，植物表达载体包括(l)在5'和3'调节序列(例如烟草烟碱脱甲 基酶启动子(SEQ ID NO: 6)和3'UTR区(SEQ ID NO:7))的转录控制下克隆 的植物基因（例如，烟草烟碱脱甲基酶基因）和(2)显性可选择的标志物。 如果需要，这样的植物表达载体还可以包含，启动子调节区(例如赋予可诱 导的或组成性的，病原体或创伤诱导的，环境或发育调节的，或细胞或组 织特异性的表达的启动子调节区)，转录开始起始位点，核糖体结合位点，

RNA加工信号，转录终止位点和/或多腺苷酸化信号。

植物表达载体还可以任选地包含RNA加工信号，例如内含子，其已 经显示对于有效的RNA合成和累积是重要的。RNA剪接序列的定位可以 大大影响植物中转基因表达的水平。鉴于该事实，内含子可以位于转基因 中的烟草烟碱脱甲基酶编码序列的上游或下游以改变基因表达的水平。

除了上述5'调节控制序列之外，表达载体还可以包含调节控制区，其 通常存在于植物基因的3'区中。例如，3'终止子区(例如，SEQIDNO:7的 序列)可以被包括在表达载体中以增加mRNA的稳定性。 一个这样的终止 子区可以来自马铃薯的PI-II终止子区。此外，其它常用的终止子来自章 鱼氨酸或胭脂氨酸合成酶信号。

植物表达载体也典型地包含显性可选择的标志物基因，所述标志物基 因用于鉴定己经被转化的那些细胞。用于植物系统的有用的可选择的基因 包括转座子Tn5 (Aph II)的氨基糖苷磷酸转移酶基因，编码抗生素抗性基 因的基因，例如编码对于潮霉素、卡那霉素、博来霉素、新霉素G418、 链霉素或大观霉素的抗性的那些。光合作用所需的基因还可以用作光合作 用缺陷型品系的可选择的标志物。最后，编码除草剂抗性的基因可以用作 可选择的标志物；有用的除草剂抗性基因包括编码酶膦丝菌素乙酰转移酶 且赋予X寸广谱除草剂Basta⑧(Bayer Cropscience Deutschland GmbH, Langenfdd，德国)的抗性的6ar基因。其它的可选择的标志物包括提供对 于其它这样的除草剂诸如草甘膦等，和咪唑啉酮，磺酰脲，三唑并嘧啶除 草剂，诸如chlorosulfron， bromoxynil， dalapon等的抗性的基因。此外， 编码二氢叶酸还原酶的基因可以与分子诸如methatrexate组合使用。

通过确定植物细胞对特定可选择试剂的敏感性和确定有效杀死大多 数，如果不是全部的，被转化细胞的该试剂的浓度来促进可选择标志物的 有效使用。用于烟草转化的一些有用的抗生素浓度包括，例如20-100l^g/ml (卡那霉素),20-50l^g/ml (潮霉素),或5-lCmg/ml (博来霉素)。用于选择除草剂 抗性的转化体的有用策略由，例如Vasil描述(Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plans，Vol I, II， III Laboratory Procedures and Their Applications Academic Press, New York, 1984)。

除了可选择的标志物之外，可能理想的是使用报道基因。在某些情形

中，可以使用报道基因，而不用可选择的标志物。报道基因是这样的基因， 其典型地在受体生物或组织中不存在或表达。报道基因典型地编码提供一

些表型变化或酶性质的蛋白质。这些基因的实例在Weising等(Ann. Rev. Genetics 22:421, 1988)中进行提供，将其并入本文作为参考。优选的报道 基因包括，但不限于葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因和GFP基因。

在构建植物表达载体后，可以使用一些标准的方法将载体引入植物宿 主中，由此产生转基因植物。这些方法包括(l) 土壤杆菌介导的转化 (」.^mey^"'era或J.Wzizoge"as)(见，例如，Lichtenstein禾口 Fuller In: Ge"e"c 五"g/"em'"g, vol 6， PWJ Rigby, ed， London, Academic Press, 1987;和 Lichtenstein, C.P.,禾B Draper, J,. In: Z)A^ C7o"/"g， Vol II, D. M. Glover, ed， Oxford, IRI Press, 1985;美国专利号4,693,976, 4,762,785， 4,940,838, 5,004,863， 5,104,310， 5,149,645， 5,159,135， 5,177,010， 5,231,019， 5,463,174， 5,469,976，和5,464,763;和欧洲专利申请号0131624B1, 0159418B1, 0120516， 0176112， 0116718， 0267159， 0290799， 0292435， 0320500， 0604622,和0627752)， （2)颗粒递送系统（见，例如美国专利号4,945,050 和5,141,131)， （3)微注射方法，（4)聚乙二醇(PEG)方法，（5)脂质体介导 的DNA吸收，（6)电穿孔方法(见，例如WO87/06614, WO 92/09696,和 WO 93/21335;和美国专利号5,384,253和5,472,869， （7)涡旋方法，或(8) 所谓的whiskers方法(见，例如，Coffee et al.，美国专利号5,302,523禾口 5,464,765)。可以用表达载体转化的植物组织的类型包括胚胎组织，I型和 II型胼胝体组织，下胚轴，分生组织等。

一旦被引入植物组织中，结构基因的表达可以通过任何本领域已知方 式进行测定，并且表达可以测量为转录的mRNA，合成的蛋白质，或基因 沉默的量，其通过对烟草中的次级生物碱进行化学分析的代谢物监测进行 测定（如本文所述;还见美国专利号5,583,021，将其并入本文作为参考)。 已知用于植物组织的体外培养的技术，并且在许多情形中，已知用于再生 为完整植物的技术(见，例如美国专利号5，595，733和5,766,900)。将引入 的表达复合体传递到商用栽培品种中的方法是本领域那些技术人员已知 的。

一旦获得了表达需要水平的烟碱脱甲基酶(或去甲烟碱或NNN或两者)

的植物细胞，可以使用本领域众所周知的方法和技术从其中再生植物组织 和完整植物。接着，通过常规方式来繁殖再生的植物并且通过常规植物育 种技术可以将被引入的基因递送到其它品系和栽培品种中。

转基因烟草植物可以以不同的方向结合基因组基因的任何部分的核 酸，所述方向或者用于下调，例如以反义方向结合或以某种形式来诱导

RNAi，或用于过量表达，例如以有义方向结合。对于在烟草属品系中增 加烟碱脱甲基酶的表达，编码全长烟草烟碱脱甲基酶基因的氨基酸序列的 完整或功能部分的核酸序列的过量表达是理想的。

鹏細凝伊纖游録或激译辨游據定

烟草烟碱脱甲基酶的表达可以例如，使用烟草烟碱脱甲基酶(或cDNA 片段)作为杂交探针，通过标准RNA印迹分析来进行测量(Ausubel et al., CwreW Pratoco/s Mo/ecw/ar John Wiley & Sons, New York, NY,

(2001),禾口 Sambrook et al., Afo/ecw/ar C7o"/"g.. 丄aZ?oratory Afawwa/， Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.， （1989))。 RNA表达水平的确定还可以通过 反转录PCR(rtPCR)来协助，所述反转录PCR(rtPCR)包括定量rtPCR (见， 例如Kawasaki et al.， in PCR Technology: Principles and Applications of DNA Amplification (H.A. Erlich， Ed.) Stockton Press (1989); Wang et al. in PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (M.A. Innis， et al.， Eds.) Academic Press (1990);禾卩Freeman et al., ^6/ofec/zm々we51 26:112-122禾口 124-125, 1999)。用于确定烟草烟碱脱甲基酶基因的表达的另外的众所周知 的技术包括原位杂交，和荧光原位杂交(见，例如，Ausubel et al.， CWwW /Votoco/s Mo/ecw/ar飾/ogy， John Wiley & Sons, New York, NY, (2001》。 上述标准技术还可以用于比较植物之间，例如在烟草烟碱脱甲基酶基因中 具有突变的植物和对照植物之间来比较表达水平。

如果需要，烟草烟碱脱甲基酶基因的表达可以在烟草烟碱脱甲基酶蛋 白质制备的水平上，使用相同的通用方法和标准蛋白质分析技术包括 Bradford测定、分光光度测定和免疫检测技术，诸如蛋白质印迹或用烟草 烟碱脱甲基酶-特异性抗体进行的免疫沉淀来测量（Ausubel et al., Q^reW 尸ratoco/s Mo/ecw/ar 5/o/ogy， John Wiley & Sons, New York, NY， (2001),禾口 Sambrook et al.， ^Mo/ecw/ar C7o"/"gv ^丄aZ?orator;; AfowMfl/， Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y"(1989))。

烟草烟碱脱甲基酶调节剂的鉴定

烟草烟碱脱甲基酶cDNA的分离还有利于增加或减少烟草烟碱脱甲 基酶的表达的分子的鉴定。按照一种方法，将候选分子以不同的浓度加入 表达烟草烟碱脱甲基酶mRNA的细胞(例如，原核生物细胞诸如大肠杆菌 或真核生物细胞诸如酵母、哺乳动物、昆虫或植物细胞)的培养基中。接着， 使用标准方法诸如在本文中提到的那些，在存在和缺乏候选分子的情况下 测量烟草烟碱脱甲基酶的表达。

候选的调节剂可以是纯化(或基本纯)的分子或可以是化合物的混合物 的一种成分。在混合的化合物测定中，针对越来越小的候选化合物库的子 集(例如，通过标准纯化技术，例如HPLC而产生)来测试烟草烟碱脱甲基 酶的表达直到证实单一化合物或最少化合物混合物改变烟草烟碱脱甲基 酶基因的表达。认为促进烟草烟碱脱甲基酶的表达的减少的分子在本发明 中是特别有用的。可以认定发现在烟草烟碱脱甲基酶的表达或活性水平上 有效的调节剂在植物中有效的。

对于农业应用，使用本文公幵的方法鉴定的分子、化合物或试剂可以 用作化学品，所述化学品被用作在植物的叶子上的喷雾剂或粉剂。所述分 子、化合物或试剂还可以与另一种分子组合应用于植物，所述另一种分子 对植物提供某种益处。

烟碱脱甲基酶基因启动子和非翻译区的使用

本文所述的烟碱脱甲基酶基因的启动子区是可乙烯诱导的或与植物 衰老相关的。因此，该启动子可以用于驱动任何理想的基因产物的表达以 改善农作物质量或增加具体的性状。因为烟草烟碱脱甲基酶启动子（例如 SEQIDNO:6)是可诱导并且在植物生活周期的特定时期表达，包含该启 动子的构建体可以被引入植物以表达独特的基因，所述基因涉及香味和由 次级代谢物导致的芳香产物的生物合成。这些化合物的实例是在类萜途径 中的化合物，其它生物碱，植物激素，黄酮类化合物或含糖的部分。烟草

烟碱脱甲基酶启动子还可以用于增加或改变结构性糖或蛋白质的表达，其 影响最终使用性质。此外，烟草烟碱脱甲基酶启动子还可以与异源基因组 合，所述异源基因包括涉及营养产物、药剂或工业物质的生物合成的基因。 所述启动子可以用于驱动烟草内源的基因的下调，所述基因包括烟碱脱甲 基酶或其它涉及生物碱生物合成和或在其它途径中的基因。

而且，烟草烟碱脱甲基酶基因的启动子区(例如，SEQIDNO:6)或烟 草烟碱脱甲基酶基因的3'UTR(例如，SEQIDNO:7)还可以用在任何定点 基因沉默方法诸如T-DNA标记，基因捕获和同源重组中以改变目标基因 的表达模式，如本文所述。还可以将启动子基序，用于鉴定与烟草烟碱脱 甲基酶相关或调节其表达的因子，所述启动子基序可以使用本领域标准方 法，容易地在启动子序列，诸如SEQIDNO:6的序列中进行鉴定。理想地， 将烟草烟碱脱甲基酶启动子区或其它转录调节区用于改变化学性质诸如 植物中的去甲烟碱含量和亚硝胺水平。

此外，可以将烟草烟碱脱甲基酶基因的任何部分用作遗传标志物以分 离相关基因、启动子或调节区，或用于在其它烟草或烟碱物种中筛选脱甲 基酶基因。

产激

按照本领域已知的标准方法，使用本文所述的任何烟草植物材料，制 备具有减少量的亚硝胺含量的烟草产品。在一个实施方案中，使用获自遗 传修饰的加工处理的烟草的植物材料来制备烟草产品，所述加工处理的烟 草植物具有少于约5 mg/g， 4.5 mg/g， 4.0 mg/g, 3.5mg/g, 3.0 mg/g, 2.5 mg/g， 2.0 mg/g， 1.5 mg/g, 1.0 mg/g, 750 Pg/g, 500 Pg/g， 250 Mg/g,麵Pg/g, 75 Mg/g, 50 Pg/g， 25 Pg/g, 10 Pg/g, 7.0 Mg/g， 5.0 Mg/g， 4.0 Pg/g， 2.0 Pg/g, 1.0 Pg/g， 0.5 Pg/g， 0.4 Pg/g, 0.2 4g/g, 0.1 Pg/g, 0.05 Mg/g，或0.01 Mg/g的减少量的去甲烟 碱或NNN，或其中相对于包含在其中的总生物碱含量，次级生物碱的百 分比少于90%， 70%, 50%， 30%, 10%, 5%， 4%， 3%, 2%, 1.5%, 1%， 0.75%, 0.5%, 0.25%,或0.1%。即，所述加工处理的烟草制备自遗传修饰的烟草植 物。短语"减少的量"倾向于指与在天然存在的烟草植物、烟草或以相同 方式处理的来自相同种类的烟草的烟草产品中发现的相比，在转基因烟草

植物、烟草或烟草产品中存在的去甲烟碱或NNN或两者的量较少，所述 天然存在的烟草植物、烟草或以相同方式处理的来自相同种类的烟草的烟 草产品没有被制成具有减少的去甲烟碱或NNN的转基因材料。因此，在 某些情形中，以相同方式加工的相同种类的天然存在的烟草被用作对照， 通过其测量是否己经通过本文所述的方法获得去甲烟碱或NNN的减少。 按照烟草领域众所周知的方法来测量去甲烟碱和NNN的水平。

下列实施例举例说明了实施本发明的方法并且应当被理解为对于本 发明范围的例证而非限制，所述范围在后附的权利要求书中进行限定。

实施例1

植物组织的发育和乙烯处理 植物的生长

将植物种在盆中并于温室中生长4周。将4周龄的幼苗移植入单个盆 中并于温室中生长2个月。在生长过程中将植物用含有150ppmNPK肥料 的水一天浇水2次。将展开的绿叶从植物上分离进行下述的乙烯处理。

细胞系78379

将烟草品系78379用作植物材料来源，所述烟草品系78379是由肯塔 基大学给出的白莱烟烟草品系。按照为生长烟草领域的标准培养一百株植 物，移植，并用不同数字（l-100)进行标记。根据推荐地那样进行受精和 田间管理。

所述100株植物中的四分之三将20和100%之间的烟碱转化为去甲烟 碱。所述IOO株植物中的四分之一将少于5%的烟碱转化为去甲烟碱。87 号植物具有最少的转化(2%)而21号植物具有100%的转化。将转化少于 3%的植物归类为非转化体。制备87号植物和21号植物的自花传粉种子， 以及杂交(21 x 87和87 x 21)种子来研究遗传和表型差异。来自自交21 的植物为转化体，而99%的来自87的自交株为非转化体。来自87的植物 的另外1%显示低转化(5-15%)。来自反交的植物全部为转化体。

细胞系4407

将烟草属品系4407用作植物材料的来源，所述烟草品系4407为白 莱烟品系。选择一致和代表性的植物(100)并进行标记。100株植物的97 株为非转化体而三株为转化体。56号植物具有最少的转化量(1.2%)而58 号植物具有最高的转化水平(96%)。用这两种植物制备自花传粉种子和杂 交种子。

来自自交58的植物以3: 1转化体对非转化体的比例分离。植物58-33 和58-25分别被鉴定为纯合的转化体和非转化体植物品系。通过其后代的 分析确认了 58-33的稳定转化。

细胞系PBLB01

PBLB01是由ProfiGen， Inc.开发的白莱烟品系并被用作植物材料的来 源。转化体植物选自PBLB01的起始种子。

乙烯处理方法

将绿叶从2-3个月温室培养的植物上取下并喷以0.3%乙烯溶液 (Prep brand Ethephon (Rhone-Poulenc))。将每片喷过的叶子悬挂于处理架 上，所述处理架装备了增湿器并覆以塑料。在处理过程中，用乙烯溶液周 期性地喷样品叶子。在乙烯处理后的大约24-48个小时,收集叶子进行RNA 抽提。取另一份小样进行代谢组分分析以测定叶代谢物和更加具体的目标 组分如多种生物碱的浓度。

作为实例，可以如下进行生物碱分析。将样品(O.l g)于150 rpm与 0.5 ml 2N NaOH和5 ml抽提溶液一起进行摇动，所述抽提溶液包含作为 内标的喹啉和甲基叔丁醚。在配备了FID检测器的HP6890GC上分析样 品。对于检测器和注射器使用25(TC的温度。在以每分钟l(TC的110-185 。C的温度梯度上使用由熔融的硅石组成的HP柱（30m-0.32nm-lmm)，所 述熔融的硅石交联了5%的苯酚和95。/。的聚甲基硅氧烷(methyl silicon)。 于IO(TC以1.7cm3 min—1的流速，以40: 1的裂解比率，以2: 1的注射体 积利用氦作为载气来操作所述柱。

实施例2

RNA分离

为了进行RNA提取，如上述用乙烯处理来自两个月龄的温室生长植 物的中叶。将0和24-48小时的样品用于RNA抽提。在一些情况下，从 除去花头后10天的植物上取处于衰老过程的叶子样品。也将这些样品用 于抽提。根据生产商的方案利用Rneasy Plant Mini Kit® (Qiagen, Inc., Valencia, California)分离总RNA。

利用DEPC处理的研体和研杵将组织样品在液氮下研磨成精细粉末。 将大约100亳克的研磨组织转移入无菌的1.5 ml Eppendorf管中。将此样 品管置于液氮中直到收集了所有样品。随后，将如试剂盒中提供的450 u 1缓冲液RLT(加入巯基乙醇)加入到每只单个管中。剧烈涡旋样品并于 56。C温育3分钟。随后将裂解物应用到置于2 ml收集管中的QIAshredder® 离心柱上，并以最大速度离心2分钟。收集流过物并将0.5体积的乙醇加 入到清除的裂解物中。充分混合样品并转移到置于2 ml收集管中的 111^357@微型离心柱上。于10,000rpm将样品离心1分钟。接下来，将700 |il的缓冲液RW1吸移到11116387@柱上并于10,000rpm离心1分钟。将缓 冲液RPE吸移到在新收集管中的1^6&37@柱上并于10,000rpm离心1分 钟。再次将缓冲液RPE加入到Rneasy⑧离心柱上并以最大速度离心2分钟 以干燥所述膜。为了除去任何残余的乙醇，将膜置于单独的收集管中并以 最大速度再离心1分钟。将化^^@柱转移入新的1.5 ml收集管中，并将 40iU不含RNA酶的水直接吸移到1111^^@膜上。将此最终洗脱管于 10,000rpm离心1分钟。通过变性甲醛凝胶和分光光度计分析总RNA的质

遵照生产商的方案使用Oligotex®聚A+ RNA纯化试剂盒(Qiagen Inc.)分离聚(A)RNA。使用250(il最大体积中的大约200吗总RNA。将250 |il体积的缓冲液OBB和15|il的Oligotex®混悬液加入到250|il的总RNA 中。通过吸移将组分充分混合并在加热模块上于7(TC温育3分钟。随后将 样品置于室温大约20分钟。通过以最大速度离心2分钟将Oligotex®: mRNA复合物沉淀。除了 50|il上清液之外将全部物质从微量离心管中除 去。用OBB缓冲液进一步处理样品。通过涡旋将Oligotex®: mRNA沉淀 重悬于400^1的缓冲液OW2中。将此混合物转移到置于新管中的小离

心柱上并以最大速度离心1分钟。将离心柱转移到新的管中并向柱中加入

另外400pl的缓冲液OW2。随后以最大速度将所述管离心1分钟。将所 述离心柱转移到最终的1.5ml微量离心管中。用60W的热(70 °C)缓冲液 OEB洗脱样品。通过变性甲醛凝胶和分光光度分析来分析聚腺苷酸产物。

实施例3 反转录PCR

按照生产商的方案使用Superscript反转录酶(Invi加gen， Carlsbad, California)制备第一链cDNA。富含聚A+的RNA/寡dT引物混合物由少 于5)ig的总RNA， lpl的10mMdNTP混合物，lpl的寡d (T)12.18(0.5 |_ig/>l), 和多达lOpl的DEPC处理的水组成。将每个样品于65'C温育5分钟，随 后置于冰上至少1分钟。反应混合物通过顺序加入每种下列组分进行制备： 2^1 10X RT缓冲液，4^1的25 mM MgCl2, 2[il的0.1 M DTT,和的RNA 酶OUT重组RNA酶抑制剂。将另外9pl的反应混合物吸移到每种RNA/ 引物混合物中并轻轻混合。将其于42i:温育2分钟并将lfal的Super Script IIRT加入到每管中。将所述管于42匸温育50分钟。于7(TC终止反应15 分钟并于冰上冷却。通过离心收集样品并将lpl的RNA酶H加入到每管 中并于37"温育20分钟。用200pmoles的正向引物和100pmoles反向引 物（后带1个随机碱基的18nt寡d(T)的混合物)进行第二次PCR。

反应条件为94°C 2分钟和随后在94°C 1分钟，45°C-60°C 2分钟， 72°C3分钟的40个PCR循环，于72。C再延伸10min。利用1%的琼脂糖 凝胶通过电泳分析10微升的扩增样品。将正确大小的片段从琼脂糖凝胶 上纯化出来。

实施例4

PCR片段群的生成

按照生产商的说明书将来自实施例3的PCR片段连接入pGEM-T Easy载体（Promega, Madison, Wisconsin)。将连接产物转化入JM109感 受态细胞中并接种于LB培养基板上进行蓝/白筛选。选择菌落并于37。C过 夜生长于具有1.2 ml LB培养基的96孔板中。对于所有选择的菌落都制成

冷冻的贮存母液。以Wizard SV Miniprep试剂盒（Promega)利用 Beckman's Biomeck 2000小量制备机器人由板中纯化质粒DNA。用lOOpl 水洗脱质粒DNA并保存于96孔板中。通过EcoRl消化质粒并利用1%的 琼脂糖凝胶进行分析以确定DNA量和插入片段的大小。利用CEQ 2000 测序仪(Beckman， Fullerton， California)对包含400-600 bp插入片段的质粒 进行测序。通过BLAST搜索将序列与GenBank数据库进行比对。鉴定 P450相关片段并进一步进行分析。或者，将p450片段从消减式文库中分 离。也如上所述对这些片段进行分析。

实施例5 cDNA文库构建

如下通过由乙烯处理的叶子制备总RNA来构建cDNA文库。首先， 利用改进的酸苯酚和氯仿抽提方法由乙烯处理的烟草品系58-33叶子中抽 提总RNA。改进所述方法以使用一克组织，所述组织进行过研磨并随后 在5 ml抽提缓冲液（100 mM Tris-HCl, pH 8.5; 200 mM NaCl; 10mM EDTA; 0.5。/。SDS)中进行涡旋，向其中加入5ml苯酚（pH5.5)禾n 5 ml氯仿。将 抽提样品离心并保留上清液。将此抽提步骤重复2-3次直到上清液看起来 清亮。加入大约5 ml的氯仿以去除痕量的苯酚。通过加入3倍体积的乙醇 和1/10体积的3M NaOAc (pH5.2)将RNA由合并的上清液级分中沉淀并 于-2(TC保存1小时。在转移到Corex玻璃容器中后将RNA级分于9,000 RPM于4。C离心45分钟。用70%乙醇洗涤沉淀物并于9,000 RPM于4°C 离心5分钟。干燥沉淀后，将沉淀的RNA溶解于0.5 ml不含RNA酶的 水中。分别通过变性甲醛凝胶和分光光度计分析总RNA的质与量。

通过下列方案利用寡（dT)纤维素方法（Invitrogen)和微量离心柱 (Invitrogen)将得到的总RNA用于分离聚A+ RNA 。将大约20mg的总 RNA进行两次纯化以获得高质量的聚A+ RNA。通过进行变性甲醛凝胶和 随后的已知全长基因的RT-PCR来分析聚A+RNA产物以确保高质量的 mRNA。

接下来，采用cDNA合成试剂盒，ZAP-cDNA合成试剂盒，和 ZAP-cDNA Gigapack III gold克隆试剂盒(Stmtagene, La Jolla， Califomia)将 聚A+ RNA用作模板来产生cDNA文库。所述方法包括遵循指定的生产 商方案。将大约8l^g的聚A+RNA用来构建cDNA文库。初级文库的分 析揭示了大约2.5 x106 - 1 x 107 pfu。利用IPTG禾H X-gal通过互补测定完 成文库质量背景测试，其中重组斑以高于背景反应的超过100倍进行表达。

通过随机PCR进行的更加定量的文库分析显示插入cDNA的平均大 小为大约1.2kb。该方法使用两步PCR法。对于第一步，基于获自p450片 段的初步序列信息设计反向引物。利用设计的反向引物和T3 (正向）引物 由cDNA文库扩增相应的基因。将PCR反应进行琼脂糖电泳并切除相应 的高分子量条带，纯化，克隆和测序。在第二步中，由5'UTR或p450的 起始编码区设计作为正向引物的新引物与反向引物（由p450的3'UTR设 计） 一起用于随后的PCR中来获得全长p450克隆。

除了反向引物之外，如实施例3中所述，通过PCR扩增由构建的cDNA 文库生成p450片段。将位于cDNA插入片段质粒下游的T7引物用作反 向引物。如实施例4中所述对PCR片段进行分离，克隆和测序。

通过这种PCR方法由构建的的cDNA文库分离全长p450基因。使 用基因特异性反向引物（由p450片段下游序列设计）和正向引物（在文 库质粒上的T3)克隆全长基因。对PCR片段进行分离，克隆和测序。如 果必要的话，应用第二个PCR步骤。在第二个步骤中，由克隆的p450s的 5'UTR设计的新的正向引物与由p450克隆的3'UTR设计的反向引物一起 用于随后的PCR反应中来获得全长p450克隆。随后对克隆进行测序。

实施例6

克隆片段的特征鉴定-反向DNA印迹分析

对于在以上实施例中鉴定的所有p450克隆进行非放射性大规模反向 DNA印迹测定以检测差异表达。观察到在不同p450簇之间表达水平非常 不同。对于具有高度表达的那些进行进一步的实时检测。

如下进行非放射性DNA印迹操作。

1) 如实施例2中所述使用Qiagen Rnaeasy试剂盒由乙烯处理的和未 处理的转化体(58-33)和非转化体(58-25)叶子抽提总RNA。

2) 通过生物素尾端标记单链cDNA产生探针，所述单链cDNA衍生

自以上步骤中生成的富含聚A+的RNA。如实施例3中所述通过转化体 和非转化体总RNA(Invitrogen)的RT-PCR生成这种经标记的单链cDNA ， 除了使用生物素化的寡dT作为引物(Promega)。这些被用作与克隆DNA 杂交的探针。

3) 用限制性酶EcoRl消化质粒DNA并在琼脂糖凝胶上进行电泳。同 时将凝胶干燥并转移到两个尼龙膜上(Biodyne B)。将一个膜与转化体探针 杂交而另一个与非转化体探针杂交。杂交前将膜进行UV-交联(自动交联装 置,254 nm， Stratagene， Stratalinker)。

或者，利用位于p-GEM质粒两条臂上的序列T3和SP6作为引物, 由每个质粒PCR扩增插入片段。通过在96孔预运行(Ready-to-nm)琼脂糖 凝胶上进行电泳来分析PCR产物。将确认的插入片段点在两个尼龙膜上。

将一个膜与转化体探针杂交而另一个与非转化体探针杂交。

4) 根据生产商的说明书（Enzo MaxSence kit, Enzo Diagnostics, Inc， Farmingdale，NY)，对洗涤严谨性进行改进，对膜进行杂交和洗涤。将膜于 42'C与杂交缓冲液（2x SSC缓冲的甲酰胺，含有去污剂和杂交增强剂)预 杂交30min并与10pl变性探针于42"C过夜杂交。随后将膜在室温于IX杂 交洗涤缓冲液中洗涤1次持续10 min并于68。C洗涤4次持续15 min。所 述膜可以用于检测操作。

5) 如生产商的检测方法(Enzo Diagnostics, Inc.)中所述通过碱性磷酸 酶标记随后进行NBT/BCIPcolometric检测对经洗涤的膜进行检测。用lx 封闭溶液于室温将膜封闭1小时，用IX检测试剂洗涤3次达10min，用 IX预显色反应缓冲液洗涤2次达5min，并且随后在显色溶液中将斑点显 色30-45 min直到斑点显现。所有试剂都由生产商提供(Enzo Diagnostics, Inc)。此外，还利用KPLDNA杂交和检测试剂盒根据生产商的说明书(KPL， Ga他ersburg， Maryland)进行大规模反向DNA测定。

实施例7

克隆的特征鉴定-RNA印迹分析

作为DNA印迹分析的备选，如在RNA印迹测定的实施例中所述对一 些膜进行杂交和检测。如下利用RNA杂交来检测在烟草属中差异表达的

mRNA 。

利用一种随机引导方法来由克隆的p450制备探针(Megaprime DNA Labelling Systems, Amersham Biosciences)。混合下歹U组分：25ng变性的 DNA模板；4|al每种未标记的dTTP, dGTP禾Q dCTP; 5^1的反应缓冲液; P32 -标记的dATP和2|al的Klenow I;和H20，使反应达到50^1。将混合物 于37"C温育1-4小时，并以2pl的0.5MEDTA终止。使用前通过于95'C 温育5分钟将探针变性。

由乙烯处理和未处理的数对烟草品系的新鲜叶制备RNA样品。在一 些情况下使用富含聚A+的RNA。用DEPC H2O(5-10 pl)将大约15 pg总 RNA或1.8 mRNA (如实施例5中所述的RNA和mRNA抽提方法）达 到等同体积。加入相同体积的加样缓冲液（1 xMOPS; 18.5 %甲醛；50% 甲酰胺；4。/。Ficoll400;溴酚蓝）和0.5^1 EtBr (0.5 ng/pl)。随后将样品在制 备中变性用来通过电泳分离RNA。

用IX MOP缓冲液（0.4 M吗啉代丙烷磺酸；0.1 M醋酸钠-3 xH20; 10 mM EDTA;用NaOH调节至pH 7.2 )将样品在甲醛凝胶(l %琼脂糖，1 xMOPS,0.6M甲醛)上进行电泳。通过毛细管法在10XSSC缓冲液（1.5 M NaCl; 0.15 M柠檬酸钠）中将RNA转移到Hybond-N+膜上（Nylon， Amersham Pharmacia Biotech) 24小时。在杂交前将具有RNA样品的膜进 行UV交联（自动交联装置，254 nm, Stratagene， Stratalinker)。

将膜在42。C与5-10 ml预杂交缓冲液（5 x SSC; 50 %甲酰胺；5 x Denhardt's-溶液；1 % SDS; 100(ig/ml热变性剪切的非同源性DNA)预杂交 1-4小时。弃去旧的预杂交缓冲液，加入新的预杂交缓冲液和探针。于42°C 过夜进行杂交。用2xSSC于室温洗涤膜达15分钟，随后用2xSSC洗涤。

在获自转化体和非转化体白莱烟品系的烟草属组织上利用全长克隆 进行RNA印迹分析，所述转化体和非转化体白莱烟品系都通过乙烯处理 进行诱导。目的是鉴定那些相对于乙烯诱导的转化体品系相对于乙烯诱导 的非转化体白莱烟品系在乙烯诱导的转化体品系中显示表达升高的全长 克隆。通过这样做，全长克隆的功能性关系可以通过比较转化体和非转化 体品系之间叶组分的生化差异进行确定。

实施例8

由克隆的基因编码的p450s的免疫检测

由三个p450克隆选择对应于20-22个氨基酸长的肽区，其l)与其它 克隆具有较低的或没有同源性和2)具有良好的亲水性和抗原性。下面列出 选自各个p450克隆的肽区的氨基酸序列。将合成的肽与KHL缀合并随后 注射入兔体内。第4次注射后2和4周收集抗血清(Alpha Diagnostic Intl. Inc. San Antonio, TX)。

D234-AD1 DIDGSKSKLVKAHRKIDEILG (SEQ ID NO:8) D90a-BB3 RDAFREKETFDENDVEELNY (SEQ ID NO: 9) D89-AB1 FK丽GDEDRHFSQKLGDLADKY (SEQ ID NO: 10)

通过蛋白质印迹分析对抗血清检査与来自烟草植物组织的目标蛋白 的交叉反应性。粗制蛋白提取物获自乙烯处理的（0 - 40小时）转化体和 非转化体品系的中叶。根据生产商的方案使用RC DC蛋白质测定试剂盒 (BIO-RAD)测定提取物的蛋白质浓度。

将两毫克蛋白质加载到每个泳道上并利用Laemmli SDS-PAGE系统在 10% - 20%的梯度凝胶上分离蛋白质。用Trans-Blot Semi-Dry细胞 (BIO-RAD)将蛋白质由凝胶转移到PROTRAN硝化纤维素转移膜 (Schleicher & Schuell)上。用ECL Advance Western Blotting检测试剂盒 (Amersham Biosciences)检测并显现目标p450蛋白。在兔体内制备抗合成 性KLH缀合物的一抗。与过氧化物酶偶联的抗兔IgG的二抗购自Sigma。 一抗和二抗都以1:1000稀释使用。抗体显示对于蛋白质印迹上单一条带的 强烈反应性，提示抗血清对于目标耙肽是单特异性的。抗血清还与缀合到 KLH上的合成肽具有交叉反应性。

实施例9

分离的核酸片段的核酸同一性和结构相关性

结合RNA印迹分析对超过100个克隆的p450片段进行测序以确定 它们的结构关系。该方法使用基于位于p450基因羧基末端附近的两个共 同p450基序中任一个的正向引物。所述正向引物对应于细胞色素p450基

序FXPERF (SEQ ID NO: 11)或GRRXCP (A/G) (SEQ ID NO: 12)。反向引 物使用来自质粒的标准引物，位于pGEM质粒两臂上的SP6或T7，或 者来自聚腺苷酸尾巴的标准引物。下面描述所用的方法。

根据生产商的方案(Beckman Coulter)利用分光光度法评估起始双链 DNA的浓度。将模板用水稀释到合适的浓度，通过于95'C加热2分钟进 行变性，随后置于冰上。利用0.5-1(^1的变性DNA模板，2|il的1.6 pmol 的正向引物，8^1的DTCS Quick Start Master Mix在冰上制备测序反应物， 并用水使总体积达到20^1。热循环程序由30个循环的下列循环组成:96°C 20秒，50°C 20秒,和60°C 4分钟，随后保持于4°C。

通过加入5|al的终止缓冲液（等体积的3M NaOAc和lOOmM EDTA 和的20 mg/ml糖原)终止测序反应。用60^1的冷95%乙醇沉淀样品 并于6000 xg离心6分钟。弃去乙醇。用200^1的冷70%乙醇洗涤沉淀 物两次。在沉淀干燥后，加入40W的SLS溶液并重悬沉淀。覆盖一层矿 物油。随后将样品置于CEQ 8000自动测序仪上作进一步分析。

为了确证核酸序列，使用p450基因的FXPERF (SEQ ID NO:ll)或 GRRXCP (A/G)(SEQ IDNO: 12)区的正向引物或质粒或聚腺苷酸尾巴的反 向引物在两个方向上对核酸序列进行重新测序。所有的测序都在两个方向 上至少进行两次。

将细胞色素p450片段的核酸序列彼此相比较，从对应于编码 GRRXCP(A/G) (SEQ ID NO: 12)基序区之后的第一个核酸的编码区一直到 终止密码子。将此区选作p450蛋白之间遗传多样性的指征。在70个过量 基因中，观察到大量遗传上不同的p450基因，类似于其它植物物种的情 况。在比较核酸序列之后，发现基于它们的序列同一性可以将基因插入不 同的序列组。发现p450成员的最佳独特组被确定为具有75%或更大核酸 同一性的那些序列。（见例如，US 2004/0162420专利申请出版物中的表1, 将其并入本文作为参考)。减少百分比同一性导致明显更大的组。观察到优 选的组为具有81%或更大核酸同一性的那些序列，更加优选的组为具有 91%或更大核酸同一性，和最优选的组为具有99%或更大核酸同一性的那 些序列。大多数组包含至少两个成员并经常包含三个或更多的成员。未反 复发现其它的，提示所采用的方法能够在所用的组织中分离低和高表达的 mRNA。

利用基因芯片技术鉴定在转化体对非转化体烟草品系中差异表达的 基因，测定D121-AA8具有在乙烯处理的转化体品系中的可复制的诱导。 基于这些结果，D121-AA8基因（其cDNA序列是SEQ ID NO:3的序列； 图3)被鉴定为烟草烟碱脱甲基酶目标基因。

考虑到p450命名规则，烟草烟碱脱甲基酶基因是新的并属于CYP82E 對The Arabidopsis Genome Initiative (AGI) and The Arabidopsis Information Resource (TAIR); Frank,尸/a"f 110:1035-1046， 1996; Whitbred et al.，

尸/aW尸/7j^0/. 124:47-58, 2000); Schopfer禾卩 Ebel, Mo/.Ge". 258:315-322, 1998;禾Q Takemoto等，P/aW CW/ P/^/o/. 40:1232-1242， 1999)。

实施例10

烟草烟碱脱甲基酶的生化分析

生化分析，例如，如并入本文作为参考的先前提交的申请中所述，确 定了SEQIDNO:3的序列编码烟草烟碱脱甲基酶（SEQIDNO:4;图3)。

特别地，通过如下测定酵母细胞中异源表达的p450的酶活性，确定 候选克隆(D121-AA8)的功能为烟碱脱甲基酶的编码基因。

1.酵母表达载体的构建

将烟草烟碱脱甲基酶编码cDNA(D121-AA8)的推定蛋白质编码序列 克隆入酵母表达载体pYeDP60。通过包含这些序列的PCR引物在翻译起 始密码子(ATG)的上游或终止密码子(TAA)的下游导入合适的BamHI和 Mfel位点（下面下划线的)。扩增的PCR产物上的Mfel与载体上的EcoRI 位点相容。用来扩增 cDNA 的引物 是 5'-TAGCTACGCGGATCCATGCTTTCTCCCATAGAAGCC-3' (SEQ ID NO:27)禾口 5'-CTGGATCACAATTGTTAGTGATGGTGATGGTGATGCG ATCCTCTATAAAGCTCAGGTGCCAGGC-3' (SEQ ID NO:28)。将编码蛋白 质C末端九个额外氨基酸，包括六个组氨酸的序列片段，并入反向引物中 以利于诱导后6-His标记的p450的表达。酶消化后在参照GAL10-CYC1

启动子的有义方向上将PCR产物连接入pYeDP60载体中。通过限制性酶 切分析和DNA测序确认酵母表达载体的正确构建。

2. 酵母转化

将改进来表达拟南芥NADPH-细胞色素p450还原酶ATR1的WAT11 酵母品系用pYeDP60-p450cDNA质粒进行转化。将50微升的WAT11酵 母细胞混悬液与〜m g质粒DNA在具有0.2cm电极隙的比色杯中混合。 Eppendorf电穿孔仪(Model 2510)应用2.0 kV的脉冲。将细胞铺到SGI板 上(5 g/L bactocasamino acids， 6.7 g/L无氨基酸的酵母氮石咸(nitrogen base), 20g/L葡萄糖,40mg/LDL-色氨酸，20g/L琼脂)。通过直接在随机选择的 集落上进行的PCR分析确认转化体。

3. 在转化的酵母细胞中的p450表达

利用单一酵母菌落接种30 mL SGI培养基(5g/L bactocasamino acids, 6.7 g/L无氨基酸的酵母氮碱，20 g/L葡萄糖，40 mg/L DL-色氨酸）并于 30'C生长大约24小时。将等分试样的这种培养物以l:50稀释到1000mL 的YPGE培养基中（10 g/L酵母提取物，20 g/L细菌培养用蛋白胨，5 g/L 葡萄糖,30ml/L乙醇)并培养直到葡萄糖被完全耗尽，如通过Diastix尿分 析试剂条(Bayer, Elkhart, IN)的比色变化所示。通过加入DL-半乳糖到终浓 度2c/。来起始克隆P450的诱导。在使用前将培养物再培养20小时进行体 内活性测定或进行微粒体制备。'

使用表达pYeDP60-CYP71D20 (催化烟草中5-印z'-aristolochene和 l画deoxycapsidiol的羟基化作用的p450)的WATll酵母细胞作为p450表 达和酶活性测定的对照。

为了更加详细地评估p450的酵母表达的有效性，进行简化的CO差 异光谱分析。简化的CO光谱在450 nm上显现来自所有四种p450转化的 酵母品系的蛋白质的峰。在对照酵母或载体对照酵母的微粒体中没有观察 到类似的峰。所述结果显示p450蛋白在具有pYeDP60-CYP450的酵母品 系中得以有效表达。酵母微粒体中表达的p450蛋白的浓度为从45到68 nmole/mg总蛋白。4. 体内酶测定

通过对酵母培养物饲以DL-烟碱(吡咯烷-2-"C)来测定转化酵母细胞 中烟碱脱甲基酶的活性。将"C标记的烟碱(54mCi/mmo1)加入到75jal的 半乳糖诱导的培养物中达到最终浓度55pM。在14ml聚丙烯试管中以摇 动将测定培养物温育6小时，并以900|il甲醇进行抽提。离心后，以 rp-HPLC分离20|il的甲醇提取物并通过LSC对去甲烟碱级分进行量化。

WATll(pYeDP60-CYP71D20)的对照培养物并未将烟碱转变成去甲 烟碱，显示WATU酵母株并不包含能够催化烟碱生物转化成去甲烟碱的 步骤的内源酶活性。相反，表达烟草烟碱脱甲基酶基因的酵母生产出可检 测量的去甲烟碱，显示SEQIDNO:3翻译产物的烟碱脱甲基酶活性。

5. 酵母微粒体制备

半乳糖诱导20小时后，通过离心收集酵母细胞并用TES-M缓冲液 (50 mM Tris-HCl, pH 7.5， 1 mM EDTA， 0.6 M山梨糖醇，10 mM 2-巯基乙 醇)洗涤两次。将沉淀物重悬于抽提缓冲液中（50 mM Tris-HCl, pH 7.5， 1 mM EDTA, 0.6 M山梨糖醇，2 mM 2-巯基乙醇，1 %牛血清白蛋白，1片 /50 ml的蛋白酶抑制剂混合物（Roche))。随后用玻璃珠（直径0.5 mm ， Sigma)破裂细胞并将细胞提取物以20,000 x g离心20 min以除去细胞碎 片。将上清液于100,000 xg进行超速离心60 min ，得到的沉淀物包含微 粒体级分。将所述微粒体级分以1 mg/mL的蛋白质浓度悬浮于TEG-M缓 冲液中（50 mM Tris-HCl， pH 7.5， 1 mM EDTA， 20%甘油和1.5 mM 2-巯基 乙醇）。将微粒体制备物保存于液氮冷冻库中待用。

6. 酵母微粒体制备物中的酶活性测定

用酵母微粒体制备物进行烟碱脱甲基酶活性的测定。特别地，DL-烟

碱(吡咯烷-2-"C)获自Moravek Biochemicals并具有54 mCi/mmo1的特异 性活性。氯丙嗪(CPZ)和氧化的细胞色素C(cyt. C), 二者都是P450抑制 剂，购自Sigma。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH)是细胞色 素P450通过NADPH:细胞色素P450还原酶的典型电子供体。在对照温

育中不存在NADPH。常规酶测定包括微粒体蛋白（约1 mg/ml), 6 mM NADPH,和55uM"C标记的烟碱。在使用时，CPZ禾卩Cyt. C的浓度分 别为1 mM和100 PM。反应在25'C进行1小时并通过加入300W甲醇 到每个25^1反应混合物中进行终止。离心后，使用来自Varian的Inertsil ODS-33p (150 x 4.6 mm)色谱柱以反相高效液相色谱(HPLC)系统(Agilent) 分离20pl的甲醇提取物。恒溶剂(isocratic)流动相是甲醇和50 mM磷酸钾 缓冲液，pH 6.25的混合物，比率是60: 40 (v/v)并且流速是1 ml/min。收集 去甲烟碱峰并以2900 tri-carb液体闪烁计数器（LSC) (Perkin Elmer)进行量 化，所述去甲烟碱峰是通过与真实可信的未标记去甲烟碱相比较而确定 的。在1小时温育后基于14C标记的去甲烟碱的产生来计算烟碱脱甲基酶 的活性。

来自表达CYP71D20的对照酵母细胞的微粒体制备物并不具有任何 可检测的微粒体烟碱脱甲基酶活性。相反，获自表达烟草烟碱脱甲基酶基 因的酵母细胞的微粒体样品显示显著水平的烟碱脱甲基酶活性。烟碱脱甲 基酶活性需要NADPH并显示被p450特异性抑制剂所抑制，这与作为 p450的烟草烟碱脱甲基酶相一致。如由放射性强度和蛋白质浓度所计算 的，烟草烟碱脱甲基斷D121-AA8)的酶活性大约为10.8pkat/mg蛋白质。 对于酵母细胞所获得的一组典型酶测定结果显示于表1中。

表l:在表达D121-AA8和对照P450的酵母细胞的微粒体中的脱甲基 酶活性

*3次重复的平均结果

这些实验在一起证明克隆的全长烟草烟碱脱甲基酶（SEQIDNO: 3;

D121-AA8)编码细胞色素p450蛋白，当在酵母中表达时其催化烟碱向去 甲烟碱的转化。

实施例11

分离的核酸片段的相关氨基酸序列同一性

推断由实施例8获得的细胞色素p450片段的核酸序列的氨基酸序 列。推断区对应于紧接GXRXCP(A/G)(SEQIDN0:13)序列基序之后的氨

基酸到羧基末端的结尾，或终止密码子。在比较片段的序列同一性之后，

观察到具有70%或更大氨基酸同一性的那些序列的独特组。观察到优选的

组为具有80%或更大氨基酸同一性的那些序列，更加优选的组为具有90%

或更大氨基酸同一性，和最优选的组为具有99%或更大氨基酸同一性的那

些序列。发现几个独特的核酸序列与其它片段具有完全的氨基酸同一性，

所以只报道了具有相同氨基酸的一个成员。

对于使用植物的基因克隆和功能性研究选择了每个氨基酸同一性组 的至少一个成员。此外，对于基因克隆和功能性研究选择了组成员，所述

成员通过如RNA和DNA分析评估，受乙烯处理或其它生物学差异的不同 影响。为了有助于基因克隆，表达研究和整体植物评估，可以基于序列同 一性和不同序列制备肽特异性抗体。

实施例12

全长克隆的相关氨基酸序列同一性

对实施例5中克隆的全长烟草属基因的核酸序列推断它们完整的氨基 酸序列。通过三个保守的p450结构域基序的存在鉴定细胞色素p450基 因，所述三个保守的p450结构域基序对应于羧基末端上的UXXRXXZ (SEQ ID NO: 14)， PXRFXF (SEQ ID NO: 15)或GXRXC (SEQ ID NO: 16)，其中U是E或K,X是任何氨基酸，Z是P,T，S或M。利用BLAST 程序将它们的全长序列彼此和与已知的烟草基因相比较来对所有的p450 基因氨基酸同一性进行表征。所述程序使用NCBI特别的BLAST工具 (比对两种序列(bl2s叫)，http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html)。 在没有对于核酸序列的滤器的BLASTN和对于氨基酸序列的BLASTP之

下比对两种序列。基于它们的百分比氨基酸同一性，将每种序列归类到同

一性组中，其中所述组包含与另一成员共有至少85%同一性的成员。观察 到优选的组为具有90%或更大氨基酸同一性的那些序列，更加优选的组为 具有95%或更大氨基酸同一性，和最优选的组为具有99%或更大氨基酸同 一性的那些序列。推断全长烟碱脱甲基酶基因的氨基酸序列具有SEQ ID NO:4中提供的序歹U(图3)。

实施例13

缺乏一种或多种烟草P450特异性结构域的烟草属细胞色素P450克隆

四个克隆具有高度核酸同源性，范围从90%到99%的核酸同源性。 不过，由于核苷酸移码，这些基因并不包含三个C-末端细胞色素p450结

构域的其中一个或多个并且被排除在同一性组之外。

实施例14

烟草属细胞色素P450片段和克隆在烟草质量的变化调控中的应用

烟草p450核酸片段或完整基因的应用在鉴定和选择那些具有变化的 烟草表型或烟草组分，更重要的是，变化的代谢物的植物中是有用的。通 过多种转化系统生成转基因烟草植物，所述转化系统在下调方向，例如反 义方向，或过量表达例如有义方向上等结合了选自本文所报告的那些的核 酸片段或全长基因。对于全长基因的过量表达，任何编码本发明中所述全 长基因的完整或功能性部分或氨基酸序列的核酸序列都是有利的。这些核 酸序列理想地对于提高某种酶的表达是有效的并且因此导致烟草属内的 表型效应。通过一系列回交获得纯合的烟草属品系并评估表型变化，包括 但不限于，利用本领域普通技术人员常规可获得的技术进行内源性p450 RNA，转录物，p450表达肽和植物代谢物浓度的分析。烟草植物中呈现的 变化提供了对于目标选定基因的功能性作用信息或者用作优选烟草属植 物物种的信息。

实施例15

来自转化体白莱烟烟草的基因组烟草烟碱脱甲基酶的克隆

如以上实施例中所述（还见生产商的方法）利用QiagenPlant Easy试 剂盒由转化体白莱烟烟草植物品系4407-33 (烟草品种4407品系)提取基 因组DNA。

基于在前实施例中克隆的5'启动子和3'UTR区设计引物。正向引物 为5'國GGC TCT AGA TAA ATC TCT TAA GTT ACT AGG TTC TAA-3' (SEQ ID NO: 17)禾卩5'-TCT CTA AAG TCC CCT TCC-3'(SEQ ID NO:25)而反 向引物为5'画GGC TCT AGA AGT CAA TTA TCT TCT ACA AAC CTT TAT ATA TTA GC-3' (SEQ ID NO: 18),禾口 5'- CCA GCA TTC CTC AAT TTC-3' (SEQ ID NO: 26)。用lOOpl反应混合物将PCR应用于4407-33基因组 DNA。使用Pfe高保真酶进行PCR扩增。在电泳后将PCR产物在1%琼 脂糖凝胶上进行观察。观察到分子量大约为3.5 kb的单一条带并从凝胶上 将其切下。利用凝胶纯化试剂盒(Qiagen;基于生产商的方法)纯化得到的条 带。通过酶XbaI(NEB;根据生产商的说明书使用)消化纯化的DNA。利 用相同方法通过XbaI消化pBluescript质粒。将片段进行凝胶纯化并连接 入pBluescript质粒中。将连接混合物转化入感受态细胞GM109中并接种 到包含100mg/l氨苄青霉素的LB平板上，伴随以蓝/白筛选。挑取白色菌 落并培养在包含氨苄青霉素的10mlLB液体培养基中。通过小量制备提 取DNA。利用CEQ2000测序仪（Beckman, Fullerton, California)基于生产 商的方法对包含插入片段的质粒DNA进行测序。使用T3和T7弓l物以及 8种其它内部引物进行测序。对序列进行组合和分析，由此提供基因组序 列（SEQIDNO:l;图2-1到2-3)。

将SEQ ID NO: 1的序列与SEQ ID NO: 3的序列相比较能够确定基因 编码部分内的单一内含子(鉴定为SEQ ID NO: 5的序列；图4)。如图1 中所示，烟草烟碱脱甲基酶的基因组结构包括在单一内含子侧面的两个外 显子。第一个外显子跨越SEQ ID NO: 1的核苷酸2010-2949 ,其编码SEQ ID NO:2的氨基酸1-313,第二个外显子跨越SEQ ID NO:l的核苷酸 3947-4562,其编码SEQ ID NO: 2的氨基酸314-517。因此，所述内含子跨 越SEQ ID NO: 1的核苷酸2950-3946。内含子序列提供在图4中并且是 SEQIDNO:5的序列。基因组DNA序列的翻译产物作为SEQIDNO:2的 序列提供在图2-1中。烟草烟碱脱甲基酶氨基酸序列包含内质网膜锚定基

序。

实施例16

由转化体烟草克隆5'侧翼序列(SEO ID NO:6)和3 'UTR (SEO ID NO:7)

&来自转化体烟草叶组织的总DNA的分离

从转化体烟草4407-33的叶中分离基因组DNA。根据生产商的方案使 用来自Qiagen， Inc. (Valencia, Ca)公司的DNeasy Plant Mini试剂盒进行 DNA的分离。在此将生产商的手册Dneasy' Plant Mini and DNeasy Plant Maxi Handbook, Qiagen January 2004并入作为参考。DNA制备方法包括下 列步骤：在液氮下，将烟草叶组织(大约20 mg干重）研磨成精细粉末， 进行1分钟。将组织粉末转移入1.5 ml管中。将缓冲液API (400(il)和4^1 的RNA酶贮存溶液（100 mg/ml)加入到最大100 mg的研磨叶组织中并进 行剧烈涡旋。将混合物于65。C温育10 min并在温育期间通过倒转试管将 其混合2-3次。随后将缓冲液AP2(130(il)加入到裂解物中。将混合物混 合并在冰上温育5 min。将裂解物应用到QIAshredder Mini离心柱上并离 心2 min (14,000 rpm)。将流过物级分转移到新的管中，不扰动细胞碎片沉 淀。随后将缓冲液AP3/E(1.5体积）加入到澄清的裂解物中并通过抽吸进 行混合。将来自在前步骤的包括任何沉淀物的混合物(650 ial)应用到 DNeasy Mini离心柱上。将混合物于>6000 x g (>8000 rpm)离心1 min并 弃去流过物。用剩余样品对此进行重复并弃去流过物和收集管。将DNeasy Mini离心柱置于新的2ml收集管中。随后将缓冲液AW (500^1)加入到 DNeasy柱上并离心1 min (>8000 rpm)。弃去流过物。在接下来的步骤中 重新使用该收集管。随后将缓冲液AW(500 pl)加到DNeasy柱上并离心2 min (〉14,000 rpm)以便千燥膜。将DNeasy柱转移到1.5 ml管中。随后 将缓冲液AE (100 pi)吸取到DNeasy膜上。将混合物于室温(15-25。C)温 育5 min并随后离心1 min (>8000 rpm)来洗脱。

通过在琼脂糖凝胶上将样品进行电泳来评估DNA的质与量。

L结构基因5'侧翼序列的克隆

使用改进的反向PCR方法克隆来自SEQ ID NO:l的结构基因的5'侧

翼序列的750个核苷酸。首先，基于已知序列片段中的限制性位点和5' 侧翼序列下游的限制性位点间距来选择合适的限制性酶。基于这种已知的 片段设计两条引物。正向引物位于反向引物的下游。反向引物位于已知片 段的3'部分。

克隆方法包括下列步骤：

用20-40个单位的合适的限制性酶(EcoRI和SpeI)在50|il反应混合 物中消化纯化的基因组DNA(5昭）。用1/10体积的反应混合物进行琼脂 糖凝胶电泳以确定DNA是否消化完全。在完全消化后通过于4'C过夜连 接进行直接连接。将200pl包含1(^1消化DNA和0.2pl T4 DNA连接酶 (NEB)的反应混合物于4"C过夜连接。在获得人工小环状基因组之后进行 连接反应物的PCR。用1(^1连接反应物和来自己知片段的2条引物在两 个不同方向上于50pl反应混合物中进行PCR。应用梯度PCR程序，退火 温度为45-56°C。

进行琼脂糖凝胶电泳以检査PCR反应。从凝胶上切下的所需的条带 并使用来自QIAGEN的QIAquick凝胶纯化试剂盒来纯化所述条带。按照 生产商的说明书将纯化的PCR片段连接入pGEM-TEasy载体（Promega, Madison，WI)中。按照生产商的说明书利用SV小量制备试剂盒(Promega， Madison,WI)通过小量制备来抽提转化的DNA质粒。利用CEQ2000测序 仪（Beckman， Fullerton, CA)对包含插入片段的质粒DNA进行测序。通过 上述方法克隆大约758 nt的5'侧翼序列（SEQ ID N0:1的核苷酸 1241-2009)。

^结构基因的较长5'侧翼序列(SEQIDN0:6;图5)的克隆

根据生产商的用户手册，使用BD基因组步移(genomewalker)通用试 剂盒(Clontech laboratories, Inc., PaloAlto， CA)来克隆结构基因，D121-AA8 另外的5'侧翼序列。在此将生产商的手册BDGenomeWalker August, 2004 并入作为参考。通过将样品在0.5%琼脂糖凝胶上进行电泳来测试烟草基因 组DNA的大小和纯度。对烟草33文库基因组步移构建设立总共4次平 端反应(DRA I, STU I， ECOR V, PVU II)。在被消化DNAs的纯化之后，将 消化的基因组DNAs连接到基因组步移接头上。通过利用接头引物API

和来 自 D121-AA8 的基 因特异性引 物 (CTCTATTGATACTAGCTGGTTTTGGAC; SEQ ID NO: 19)对四种消化的 DNAs进行初步PCR反应。将初步PCR产物直接用作模板进行嵌套PCR。 在PCR反应中使用试剂盒提供的接头嵌套引物和来自已知克隆 D121-AA8 (SEQ ID NO:3) 的 嵌 套 引 物 (GGAGGGAGAGTATAACTTACGGATTC; SEQIDNO:20)。通过进行凝胶 电泳检测PCR产物。从凝胶上切下所需的条带，利用来自QIAGEN的 QIAquick凝胶纯化试剂盒纯化PCR片段。根据生产商的说明书将纯化的 PCR片段连接入pGEM-TEasy载体（Promega, Madison, WI)中。利用SV 小量制备试剂盒(Promega， Madison, WI)并按照生产商的说明书通过小量 制备抽提转化的DNA质粒。利用CEQ 2000测序仪（Beckman, Fullerton, CA)对包含插入片段的质粒DNA进行测序。通过上述方法克隆另一种大 约853 nt的5'侧翼序列,包括SEQ ID NO: 1的核苷酸399-1240。

按照相同的方法进行第二轮的基因组步移，其中不同在于使用下列引 物GWR1A (5'- AGTAACCGATTGCTCACGTTATCCTC -3') (SEQ ID NO:21) 和GWR2A (5'-CTCTATTCAACCCCACACGTAACTG -3，） （SEQ ID NO: 22)。通过该方法克隆另外的约398 nt的侧翼序列，包括SEQ ID NO: 1 的核苷酸1-398。

对调节元件的搜索揭示，除了"TATA"盒，"CAAT"盒，禾卩"GAGA" 盒之外，数种MYB-样识别位点和器官特异性元件存在于烟草烟碱脱甲基 酶启动子区。使用相同的方法鉴定的推定导出(elicitor)反应性元件和氮调 节的元件也出现在启动子区中。

a结构基因的3'侧翼序列的克隆

按照生产商的使用手册，将BD基因组步移通用试剂盒(Ckmtech laboratories, Inc., PaloAlto, CA)用于克隆结构基因D121-AA8的3'侧翼序 列。克隆的方法与本实施例前述部分C所述相同，除了所用的基因特异性 引物之外。设计的第一条引物接近D121-AA8结构基因的末端(5'- CTA

的嵌套引物在D121-AA8结构基因的引物1的下游(CTA TAC GTA AGG

TAA ATC CTG TGG AAC) (SEQ ID NO: 24)。通过凝胶电泳来检査最终 PCR产物。从凝胶上切除需要的带。使用来自QIAGEN的QIAquick凝胶 纯化试剂盒来纯化PCR片段。按照生产商的说明书，将纯化的PCR片段 连接到pGEM-T Easy载体(Promega, Madison,WI)中。按照生产商的说明书， 使用SV小量制备试剂盒(Promega, Madison, WI)通过小量制备来提取转化 的DNA质粒。使用CEQ 2000测序仪(Beckman， Fullerton， CA)来对包含插 入片段的质粒DNA进行测序。通过上述方法来克隆约1617个核苷酸的另 外的3'侧翼序列(SEQ ID NO: 1的核苷酸4731-6347)。将3'UTR区的核酸 序列显示于图6中。

WO 03/078577 ， WO 2004/035745 ， PCT/US/2004/034218 ， 和 PCT/US/2004/034065和所有本文参考的其它参考文献、专利、专利申请出 版物、和专利申请结合入本文作为参考，其程度如同这些参考文献、专利、 专利申请出版物和专利申请的每一个被单独并入本文作为参考。

预期本领域那些技术人员在考虑本发明的前述详细的描述后，在本发 明的实践上作出各种修改和改进。因此，意欲将这些修改和改进包括在下 列权利要求的范围内。