本发明涉及在烟草(Nicotiana)植物中编码细胞色素P450酶(下文称为P450 和P450酶)的核酸序列和使用那些核酸序列来改变植物表型的方法。

                          背景技术

细胞色素P450催化各种化学上不同的底物的酶反应，包括内源性和异源 底物的氧化、过氧化和还原性代谢。在植物中，p450参与包括植物产物合成在 内的生化途径，所述产物例如是苯丙素(phenylpropanoids)、生物碱、萜类、 脂质、生氰糖苷(cyanogenic glycoside)和葡糖异硫氰酸盐 (glucosinolates)(Chappel，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.198， 49：311-343)。细胞色素p450也称为血红素-硫醇盐蛋白(heme-thiolate protein)，通常用作多组分电子转移链(称为含p450的单加氧酶系统)中的末 端氧化酶。所催化的特定反应包括脱甲基化、羟基化、环氧化、N-氧化、 磺基氧化(sulfooxidation)、N-、S-和O-脱烷基化、脱硫作用、脱氨基作用和 偶氮基、硝基和N-氧化物基团的还原。

烟草植物p450酶的各种作用涉及产生各种植物代谢物，例如苯丙素、生 物碱、萜类、脂质、生氰糖苷、葡糖异硫氰酸盐和其它化学物质的宿主。近 年来，人们开始了解一些p450酶影响植物中植物代谢物的组成。例如，长期 以来人们希望通过育种改变植物的所选脂肪酸的特性来改善特定植物的风味 和香味；然而涉及控制这些叶子组成的水平的机理知之甚少。下调与改变脂肪 酸有关的p450酶可有助于积累提供更适宜的叶子表型质量的所需脂肪酸。p450 酶的功能及其在植物组成中广泛的作用仍有待发现。例如，特定类型的p450 酶发现可催化脂肪酸分解为挥发性C6-和C9-醛和醇，而主要是这些物质导致 水果和蔬菜具有“新鲜翠绿”的气味。可改变其它作为新目标的p450酶的水 平，通过改变烟草叶子中的脂质组成和相关的降解代谢物来提高叶子组成的质 量。叶子中的几种这些成分受老化的影响，而老化刺激叶子质量特性的成熟。 其它人也报道p450酶在改变涉及植物病原体相互作用和疾病抗性的脂肪酸中 起作用。

在其它例子中，已提示p450酶涉及生物碱的生物合成。降烟碱是在烟草 (Nicotiana tabaceum)中发现的少量生物碱。推测它是这样产生的：p450介 导的尼古丁脱甲基化，然后在N位酰化和亚硝基化，从而产生一系列N- 酰基降烟碱(N-acylnonicotine)和N-亚硝基降烟碱。推测的p450脱甲基酶催 化的N-脱甲基化被认为是烟草中降烟碱生物合成的主要来源。尽管认为该 酶是微粒体酶，但是迄今为止未能成功地纯化尼古丁脱甲基化酶，也未能 分离到有关基因。

此外，有假说认为(但未证实)p450酶的活性受遗传控制并且也强烈地受环 境因素的影响。例如，当植物达到成熟阶段后，认为烟草中尼古丁的脱甲基化 作用大大增加。另外，有假说认为(还未证实)脱甲基化基因含有当存在时能抑 制RNA翻译的转座元件。

在本发明之前，p450酶形式的多样性、其结构和功能的不同使得对烟草 p450酶的研究十分困难。此外，对p450酶的克隆至少部分由于这些膜定位的 蛋白通常存在量低且经常在纯化中不稳定而受阻。因此，需要在植物中鉴定 p450酶和与那些p450酶相关的核酸序列。特别是，在烟草中仅有少许细胞色 素p450蛋白已见报道。本文所述的发明发现了许多细胞色素p450片段，这些 片段基于它们的序列同一性而对应于几组p450种类。

                             概述

本发明针对植物p450酶。本发明还涉及来自烟草的植物p450酶。本发明 也涉及其表达由乙烯和/和植物老化诱导的植物中的p450酶。本发明还涉及植 物中具有酶活性的核酸序列，例如可分类为氧化酶、脱甲基酶等和其它酶，以 及使用那些序列来使这些酶的表达降低和沉默和过度表达。本发明也涉及在含 有较高降烟碱水平的植物而非显示较低降烟碱水平的植物中发现的p450酶。

本发明一方面涉及以下所示的核酸序列：SEQ.ID.NO.1、3、5、7、9、 11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、 43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、 75、77、79、81、83、85、87、89、91、95、97、99、101、103、105、107、 109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、 135、137、139、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、 163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、 189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、 215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、 241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、 267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、 293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313和315。

在第2个相关的方面，根据它们在细胞色素p450基序GXRXCX(G/A)后 的第一核酸到终止密码子的对应区域的同一性，对那些含有大于75％的核酸序 列同一性的片段进行分组。代表性的核酸组和各自的种类示于表I。

在第3方面，本发明涉及如以下所示的氨基酸序列：SEQ.ID.NO.2、4、 6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、 40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、 72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、96、98、100、102、104、 106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、 132、134、136、138、140、144、146、148、150、152、154、156、158、 160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、 186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、 212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、 238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、 264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、 290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314 和316。

在第4个相关的方面，根据它们在细胞色素p450基序GXRXCX(G/A)后 的第一核酸到终止密码子的对应区域的同一性，对那些含有大于71％的核酸序 列同一性的片段进行分组。代表性的氨基酸组和各自的种类示于表II。

在第5个方面，本发明涉及如以下所示全长基因的氨基酸序列： SEQ.ID.NO.150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、 172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、 198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、 224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、 250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、 276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、 302、304、306、308、310、312、314和316。

在第6个相关的方面，根据彼此的同一性对那些含有大于85％和更高的氨 基酸序列同一性的全长基因进行分组。代表性的氨基酸组和各自的种类示于表 III。

在第7个方面，本发明涉及如SEQ.ID.NO.299-357所示片段的氨基酸序列。

在第8个相关的方面，根据它们在第一细胞色素p450结构域UXXRXXZ 到第3细胞色素结构域GXRXO的对应区域的互相同一性，对那些含有大于 90％和更高的氨基酸序列同一性的片段进行分组，其中U是E或K，X是任 何氨基酸，Z是R、T、S或M。代表性的氨基酸组和各自的种类示于表IV。

在第9个相关的方面，p450酶在烟草植物中的减少或消除或过度表达可 使用RNA病毒系统瞬时实现。

评价得到的转化或感染的植物的表型改变，包括(但不限于)使用本领域普 通技术人员常规可用的技术来分析内源性p450RNA转录物、p450表达肽和植 物代谢物的浓度。

在第10个方面，本发明也涉及产生具有改变的p450酶活性水平的转基因 烟草谱系。根据本发明，这些转基因谱系含有有效地特定酶表达减少、沉默或 增加，从而在烟草中导致表型效应的核酸序列。这种核酸序列包括SEQ.ID.NO. 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、 37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、 69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、95、97、99、101、 103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、 129、131、133、135、137、139、143、145、147、149、151、153、155、 157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、 183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、 209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、 235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、 261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、 287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、 313和315。

在本发明非常重要的第11方面，与对照植物相比，含有本发明核酸的植 物栽培品系在使用全长基因或其片段的下调能力或使用全长基因或其片段的 过度表达能力上具有改变的代谢物特性。

在本发明的第12方面，含有本发明核酸的植物栽培品系具有对特定外源 性化学物质或植物害虫耐受的用途，所述植物使用全长基因或其片段以更改 来源于植物或植物以外的代谢物的生物合成或降解。这种核酸序列包括 SEQ.ID.NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、 31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、 63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、95、 97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、 125、127、129、131、133、135、137、139、143、145、147、149、151、 153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、 179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、 205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、 231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、 257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、 283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、 309、311、313和315。

在第13个方面，本发明涉及筛选含有与所述核酸序列具有实质性核酸同 一性的基因的植物，优选烟草。使用本发明有利于鉴定和选择含有精确的或实 质性同一性的核酸序列的植物，其中这种植物是传统或转基因品种的育种程 序、诱变程序或天然存在的不同植物种群的一部分。可使用核酸探针结合核酸 检测方法，包括(但不限于)核酸杂交和PCR分析，通过评价植物的核酸物质来 筛选实质性核酸同一性的植物。核酸探针可由对应于以下SEQ ID的所述核酸 序列或其片段构成：SEQ ID 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、 25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、 57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、 89、91、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、 119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、143、145、 147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、 173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、 199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、 225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、 251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、 277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、 303、305、307、309、311、313和315。

在第14个方面，本发明涉及鉴定与所述核酸序列具有实质性氨基酸同一 性的植物基因，优选烟草。可使用核酸探针结合核酸检测方法，包括(但不限 于)核酸杂交和PCR分析，通过筛选植物cDNA文库来鉴定植物基因，包括 cDNA和基因组克隆，优选烟草的cDNA和基因组克隆。核酸探针可由对应于 以下SEQ ID的核酸序列或其片段构成：1、3、5、7、9、11、13、15、17、 19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、 51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、 83、85、87、89、91、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、 115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、 143、145和147。

在其它第15个方面，可使用针对部分或全部所述氨基酸序列的抗体来筛 选表达肽的cDNA表达文库。这种氨基酸序列包括SEQ ID 2、4、8、9、10、 12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、 44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、 76、78、80、82、84、86、88、90、92、96、98、100、102、104、106、 108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、 134、136、138、140、144、146、148。

在第16个重要的方面，本发明也涉及产生过度表达p450酶活性水平的转 基因烟草谱系。根据本发明，这些转基因谱系包括编码全长基因的氨基酸序列 的所有核酸序列，所述基因有效地增加特定酶的表达从而导致烟草中的表型效 应。这种氨基酸序列包括SEQ.ID.150、152、154、156、158、160、162、 164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、 190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、 216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、 242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、 268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、 294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314和316。

也提供了含有降烟碱含量降低的烟叶(叶片和/或茎)的烟草产品。该烟草产 品包括烟草(含有叶片和/或茎的烟叶)，该烟草来自含有本文所述序列或消除或 抑制了编码烟草特异性亚硝基胺的基因的植物。与用未消除或抑制编码烟草特 异性亚硝基胺的基因的烟草植物制备的烟草产品相比，消除或抑制编码烟草特 异性亚硝基胺的基因有效地降低了烟草产品中约5-10％、或者约10-20％、或 者约20-30％、或者30％以上的烟草特异性亚硝基胺。本文使用的烟草产品可 包括香烟、雪茄、烟丝、鼻烟、口嚼烟(chewing tobacco)、混合了烟草产品的 产品和它们的混合物。

                          附图简述

图1显示核酸SEQ.ID.No.：1和氨基酸SEQ.ID.No.：2。

图2显示核酸SEQ.ID.No.：3和氨基酸SEQ.ID.No.：4。

图3显示核酸SEQ.ID.No.：5和氨基酸SEQ.ID.No.：6。

图4显示核酸SEQ.ID.No.：7和氨基酸SEQ.ID.No.：8。

图5显示核酸SEQ.ID.No.：9和氨基酸SEQ.ID.No.：10。

图6显示核酸SEQ.ID.No.：11和氨基酸SEQ.ID.No.：12。

图7显示核酸SEQ.ID.No.：13和氨基酸SEQ.ID.No.：14。

图8显示核酸SEQ.ID.No.：15和氨基酸SEQ.ID.No.：16。

图9显示核酸SEQ.ID.No.：17和氨基酸SEQ.ID.No.：18。

图10显示核酸SEQ.ID.No.：19和氨基酸SEQ.ID.No.：20。

图11显示核酸SEQ.ID.No.：21和氨基酸SEQ.ID.No.：22。

图12显示核酸SEQ.ID.No.：23和氨基酸SEQ.ID.No.：24。

图13显示核酸SEQ.ID.No.：25和氨基酸SEQ.ID.No.：26。

图14显示核酸SEQ.ID.No.：27和氨基酸SEQ.ID.No.：28。

图15显示核酸SEQ.ID.No.：29和氨基酸SEQ.ID.No.30。

图16显示核酸SEQ.ID.No.：31和氨基酸SEQ.ID.No.：32。

图17显示核酸SEQ.ID.No.：33和氨基酸SEQ.ID.No.：34。

图18显示核酸SEQ.ID.No.：35和氨基酸SEQ.ID.No.：36。

图19显示核酸SEQ.ID.No.：37和氨基酸SEQ.ID.No.：38。

图20显示核酸SEQ.ID.No.：39和氨基酸SEQ.ID.No.：40。

图21显示核酸SEQ.ID.No.：41和氨基酸SEQ.ID.No.：42。

图22显示核酸SEQ.ID.No.：43和氨基酸SEQ.ID.No.：44。

图23显示核酸SEQ.ID.No.：45和氨基酸SEQ.ID.No.：46。

图24显示核酸SEQ.ID.No.：47和氨基酸SEQ.ID.No.：48。

图25显示核酸SEQ.ID.No.：49和氨基酸SEQ.ID.No.：50。

图26显示核酸SEQ.ID.No.：51和氨基酸SEQ.ID.No.：52。

图27显示核酸SEQ.ID.No.：53和氨基酸SEQ.ID.No.：54。

图28显示核酸SEQ.ID.No.：55和氨基酸SEQ.ID.No.：56。

图29显示核酸SEQ.ID.No.：57和氨基酸SEQ.ID.No.：58。

图30显示核酸SEQ.ID.No.：59和氨基酸SEQ.ID.No.：60。

图31显示核酸SEQ.ID.No.：61和氨基酸SEQ.ID.No.：62。

图32显示核酸SEQ.ID.No.：63和氨基酸SEQ.ID.No.：64。

图33显示核酸SEQ.ID.No.：65和氨基酸SEQ.ID.No.：66。

图34显示核酸SEQ.ID.No.：67和氨基酸SEQ.ID.No.：68。

图35显示核酸SEQ.ID.No.：69和氨基酸SEQ.ID.No.：70。

图36显示核酸SEQ.ID.No.：71和氨基酸SEQ.ID.No.：72。

图37显示核酸SEQ.ID.No.：73和氨基酸SEQ.ID.No.：74。

图38显示核酸SEQ.ID.No.：75和氨基酸SEQ.ID.No.：76。

图39显示核酸SEQ.ID.No.：77和氨基酸SEQ.ID.No.：78。

图40显示核酸SEQ.ID.No.：79和氨基酸SEQ.ID.No.：80。

图41显示核酸SEQ.ID.No.：81和氨基酸SEQ.ID.No.：82。

图42显示核酸SEQ.ID.No.：83和氨基酸SEQ.ID.No.：84。

图43显示核酸SEQ.ID.No.：85和氨基酸SEQ.ID.No.：86。

图44显示核酸SEQ.ID.No.：87和氨基酸SEQ.ID.No.：88。

图45显示核酸SEQ.ID.No.：89和氨基酸SEQ.ID.No.：90。

图46显示核酸SEQ.ID.No.：91和氨基酸SEQ.ID.No.：92。

图48显示核酸SEQ.ID.No.：95和氨基酸SEQ.ID.No.：96。

图49显示核酸SEQ.ID.No.：97和氨基酸SEQ.ID.No.：98。

图50显示核酸SEQ.ID.No.：99和氨基酸SEQ.ID.No.：100。

图51显示核酸SEQ.ID.No.：101和氨基酸SEQ.ID.No.：102。

图52显示核酸SEQ.ID.No.：103和氨基酸SEQ.ID.No.：104。

图53显示核酸SEQ.ID.No.：105和氨基酸SEQ.ID.No.：106。

图54显示核酸SEQ.ID.No.：107和氨基酸SEQ.ID.No.：108。

图55显示核酸SEQ.ID.No.：109和氨基酸SEQ.ID.No.：110。

图56显示核酸SEQ.ID.No.：111和氨基酸SEQ.ID.No.：112。

图57显示核酸SEQ.ID.No.：113和氨基酸SEQ.ID.No.：114。

图58显示核酸SEQ.ID.No.：115和氨基酸SEQ.ID.No.：116。

图59显示核酸SEQ.ID.No.：117和氨基酸SEQ.ID.No.：118。

图60显示核酸SEQ.ID.No.：119和氨基酸SEQ.ID.No.：120。

图61显示核酸SEQ.ID.No.：121和氨基酸SEQ.ID.No.：122。

图62显示核酸SEQ.ID.No.：123和氨基酸SEQ.ID.No.：124。

图63显示核酸SEQ.ID.No.：125和氨基酸SEQ.ID.No.：126。

图64显示核酸SEQ.ID.No.：127和氨基酸SEQ.ID.No.：128。

图65显示核酸SEQ.ID.No.：129和氨基酸SEQ.ID.No.：130。

图66显示核酸SEQ.ID.No.：131和氨基酸SEQ.ID.No.：132。

图67显示核酸SEQ.ID.No.：133和氨基酸SEQ.ID.No.：134。

图68显示核酸SEQ.ID.No.：135和氨基酸SEQ.ID.No.：136。

图69显示核酸SEQ.ID.No.：137和氨基酸SEQ.ID.No.：138。

图70显示核酸SEQ.ID.No.：139和氨基酸SEQ.ID.No.：140。

图72显示核酸SEQ.ID.No.：143和氨基酸SEQ.ID.No.：144。

图73显示核酸SEQ.ID.No.：145和氨基酸SEQ.ID.No.：146。

图74显示核酸SEQ.ID.No.：147和氨基酸SEQ.ID.No.：148。

图75显示核酸SEQ.ID.No.：149和氨基酸SEQ.ID.No.：150。

图76显示核酸SEQ.ID.No.：151和氨基酸SEQ.ID.No.：152。

图77显示核酸SEQ.ID.No.：153和氨基酸SEQ.ID.No.：154。

图78显示核酸SEQ.ID.No.：155和氨基酸SEQ.ID.No.：156。

图79显示核酸SEQ.ID.No.：157和氨基酸SEQ.ID.No.：158。

图80显示核酸SEQ.ID.No.：159和氨基酸SEQ.ID.No.：160。

图81显示核酸SEQ.ID.No.：161和氨基酸SEQ.ID.No.：162。

图82显示核酸SEQ.ID.No.：163和氨基酸SEQ.ID.No.：164。

图83显示核酸SEQ.ID.No.：165和氨基酸SEQ.ID.No.：166。

图84显示核酸SEQ.ID.No.：167和氨基酸SEQ.ID.No.：168。

图85显示核酸SEQ.ID.No.：169和氨基酸SEQ.ID.No.：170。

图86显示核酸SEQ.ID.No.：171和氨基酸SEQ.ID.No.：172。

图87显示核酸SEQ.ID.No.：173和氨基酸SEQ.ID.No.：174。

图88显示核酸SEQ.ID.No.：175和氨基酸SEQ.ID.No.：176。

图89显示核酸SEQ.ID.No.：177和氨基酸SEQ.ID.No.：178。

图90显示核酸SEQ.ID.No.：179和氨基酸SEQ.ID.No.：180。

图91显示核酸SEQ.ID.No.：181和氨基酸SEQ.ID.No.：182。

图92显示核酸SEQ.ID.No.：183和氨基酸SEQ.ID.No.：184。

图93显示核酸SEQ.ID.No.：185和氨基酸SEQ.ID.No.：186。

图94显示核酸SEQ.ID.No.：187和氨基酸SEQ.ID.No.：188。

图95显示核酸SEQ.ID.No.：189和氨基酸SEQ.ID.No.：190。

图96显示核酸SEQ.ID.No.：191和氨基酸SEQ.ID.No.：192。

图97显示核酸SEQ.ID.No.：193和氨基酸SEQ.ID.No.：194。

图98显示核酸SEQ.ID.No.：195和氨基酸SEQ.ID.No.：196。

图99显示核酸SEQ.ID.No.：197和氨基酸SEQ.ID.No.：198。

图100显示核酸SEQ.ID.No.：199和氨基酸SEQ.ID.No.：200。

图101显示核酸SEQ.ID.No.：201和氨基酸SEQ.ID.No.：202。

图102显示核酸SEQ.ID.No.：203和氨基酸SEQ.ID.No.：204。

图103显示核酸SEQ.ID.No.：205和氨基酸SEQ.ID.No.：206。

图104显示核酸SEQ.ID.No.：207和氨基酸SEQ.ID.No.：208。

图105显示核酸SEQ.ID.No.：209和氨基酸SEQ.ID.No.：210。

图106显示核酸SEQ.ID.No.：211和氨基酸SEQ.ID.No.：212。

图107显示核酸SEQ.ID.No.：213和氨基酸SEQ.ID.No.：214。

图108显示核酸SEQ.ID.No.：215和氨基酸SEQ.ID.No.：216。

图109显示核酸SEQ.ID.No.：217和氨基酸SEQ.ID.No.：218。

图110显示核酸SEQ.ID.No.：219和氨基酸SEQ.ID.No.：220。

图111显示核酸SEQ.ID.No.：221和氨基酸SEQ.ID.No.：222。

图112显示核酸SEQ.ID.No.：223和氨基酸SEQ.ID.No.：224。

图113显示核酸SEQ.ID.No.：225和氨基酸SEQ.ID.No.：226。

图114显示核酸SEQ.ID.No.：227和氨基酸SEQ.ID.No.：228。

图115显示核酸SEQ.ID.No.：229和氨基酸SEQ.ID.No.：230。

图116显示核酸SEQ.ID.No.：231和氨基酸SEQ.ID.No.：232。

图117显示核酸SEQ.ID.No.：233和氨基酸SEQ.ID.No.：234。

图118显示核酸SEQ.ID.No.：235和氨基酸SEQ.ID.No.：236。

图119显示核酸SEQ.ID.No.：237和氨基酸SEQ.ID.No.：238。

图120显示核酸SEQ.ID.No.：239和氨基酸SEQ.ID.No.：240。

图121显示核酸SEQ.ID.No.：241和氨基酸SEQ.ID.No.：242。

图122显示核酸SEQ.ID.No.：243和氨基酸SEQ.ID.No.：244。

图123显示核酸SEQ.ID.No.：245和氨基酸SEQ.ID.No.：246。

图124显示核酸SEQ.ID.No.：247和氨基酸SEQ.ID.No.：248。

图125显示核酸SEQ.ID.No.：249和氨基酸SEQ.ID.No.：250。

图126显示核酸SEQ.ID.No.：251和氨基酸SEQ.ID.No.：252。

图127显示核酸SEQ.ID.No.：253和氨基酸SEQ.ID.No.：254。

图128显示核酸SEQ.ID.No.：255和氨基酸SEQ.ID.No.：256。

图129显示核酸SEQ.ID.No.：257和氨基酸SEQ.ID.No.：258。

图130显示核酸SEQ.ID.No.：259和氨基酸SEQ.ID.No.：260。

图131显示核酸SEQ.ID.No.：261和氨基酸SEQ.ID.No.：262。

图132显示核酸SEQ.ID.No.：263和氨基酸SEQ.ID.No.：264。

图133显示核酸SEQ.ID.No.：265和氨基酸SEQ.ID.No.：266。

图134显示核酸SEQ.ID.No.：267和氨基酸SEQ.ID.No.：268。

图135显示核酸SEQ.ID.No.：269和氨基酸SEQ.ID.No.：270。

图136显示核酸SEQ.ID.No.：271和氨基酸SEQ.ID.No.：272。

图137显示核酸SEQ.ID.No.：273和氨基酸SEQ.ID.No.：274。

图138显示核酸SEQ.ID.No.：275和氨基酸SEQ.ID.No.：276。

图139显示核酸SEQ.ID.No.：277和氨基酸SEQ.ID.No.：278。

图140显示核酸SEQ.ID.No.：279和氨基酸SEQ.ID.No.：280。

图141显示核酸SEQ.ID.No.：281和氨基酸SEQ.ID.No.：282。

图142显示核酸SEQ.ID.No.：283和氨基酸SEQ.ID.No.：284。

图143显示核酸SEQ.ID.No.：285和氨基酸SEQ.ID.No.：286。

图144显示核酸SEQ.ID.No.：287和氨基酸SEQ.ID.No.：288。

图145显示核酸SEQ.ID.No.：289和氨基酸SEQ.ID.No.：290。

图146显示核酸SEQ.ID.No.：291和氨基酸SEQ.ID.No.：292。

图147显示核酸SEQ.ID.No.：293和氨基酸SEQ.ID.No.：294。

图148显示核酸SEQ.ID.No.：295和氨基酸SEQ.ID.No.：296。

图149显示核酸SEQ.ID.No.：297和氨基酸SEQ.ID.No.：298。

图151显示序列组的比较。

图152显示了全长克隆的对比。

图153显示通过PCR克隆细胞色素p450cDNA片段的方法。

图154显示核酸SEQ.ID No.：299和氨基酸SEQ.ID.No.：300。

图155显示核酸SEQ.ID No.：301和氨基酸SEQ.ID.No.：302。

图156显示核酸SEQ.ID No.：303和氨基酸SEQ.ID.No.：304。

图157显示核酸SEQ.ID No.：305和氨基酸SEQ.ID.No.：306。

图158显示核酸SEQ.ID No.：307和氨基酸SEQ.ID.No.：308。

图159显示核酸SEQ.ID No.：309和氨基酸SEQ.ID.No.：310。

图160显示核酸SEQ.ID No.：311和氨基酸SEQ.ID.No.：312。

图161显示核酸SEQ.ID No.：313和氨基酸SEQ.ID.No.：314。

图162显示核酸SEQ.ID No.：315和氨基酸SEQ.ID.No.：316。

图163显示了基因芯片上所有克隆的探针组序列。

                          发明详述

定义

除非另有定义，本文使用的所有技术和科技术语均与本发明所属领域的普 通技术人员通常理解的具有相同的意义。Singleton等，(1994)《微生物和分 子生物学字典》(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology)，第二版， John Wiley and Sons(纽约)为技术人员提供了许多关于本发明所用术语的通 用字典。本文所提及的所有专利和出版物均纳入本文作为参考。出于本发明的 目的，下列术语如下定义。

“酶活性”包括脱甲基化、羟基化、环氧化、N-氧化、磺基氧化、N-、 S-和O-脱烷基化、脱硫作用、脱氨基作用和偶氮基、硝基和N-氧化物基团 的还原。术语“核酸”指单链或双链形式的，或有义或反义的脱氧核糖核 酸或核糖核酸聚合物，并且除非另有限制，该术语包括能以类似于天然存 在核苷酸的方式与核酸杂交的天然核苷酸的已知类似物。除非另有指出， 特定的核酸序列包括其互补序列。

术语“可操作性连接”、“可操作性结合”和“以可操作性顺序”指 核酸表达控制序列(例如启动子、信号序列或转录因子结合位点的阵列)和第 二核酸序列之间的功能性连接，其中表达控制序列影响对应于第二序列的 核酸的转录和/或翻译。

当术语“重组体”用于指细胞时，它指该细胞复制异源核酸，表达所述核 酸或表达异源核酸编码的肽、异源肽或蛋白质。重组细胞可以有义或反义形式 表达在细胞的天然形式(非重组)中未发现的基因或基因片段。重组细胞也可表 达在细胞的天然形式中发现的基因，但其中该基因通过人工方式被改变并重新 引入细胞。

“结构基因”是含有编码蛋白质、多肽或其部分的DNA片段的基因的一 部分，并且不包括启动转录的5’序列。或者结构基因可编码不可翻译的产物。 结构基因可是在细胞中正常发现的基因，或者它是引入的而非在细胞或细胞位 置中正常发现的基因，在这种情况下称为“异源基因”。异源基因可全部或部 分来源于本领域已知的任何来源，包括细菌基因组或附加体、真核生物的、核 的或质粒DNA、cDNA、病毒DNA或化学合成的DNA。结构基因可含有一种 或多种修饰，这些修饰可影响生物活性或其特性、表达产物的生物活性或化学 结构、表达速率或表达控制的方式。这种修饰包括(但不限于)一个或多个核苷 酸的突变、插入、删除和取代。结构基因可构成不间断的编码序列或可包括一 个或多个与合适的剪接接头结合的内含子。结构基因可以是可翻译或不可翻译 的，包括反义方向(antisense orientation)。结构基因可以是来源于多种来源和多 种基因序列的复合物(天然存在的或合成的，其中合成的指化学合成的DNA)。

“来源于”用来指从某种来源(化学和/或生物的)取得、获得、接受得、追 溯、复制或传下的。可通过对原始来源的化学或生物学操作(包括，但不限于 取代、添加、插入、删除、提取、分离、突变和复制)产生衍生物。

涉及DNA序列的术语“化学合成的”指部分核苷酸组分在体外装配。可 使用已良好建立的方法(Caruthers，《 DNA和RNA测序的方法》(Methodology of DNA and RNA Secquencing)，(1983)，Weissman编，Praeger Publishers， New York，第1章)实现DNA的手工化学合成；可使用许多市售可得的机器 的一种进行自动化学合成。

可通过以下方法进行序列的最佳对比：Smith和 Waterman(Adv.Appl.Math.2：482(1981))的局部同源性算法、Needleman和 Wunsch(J.Mol.Biol.48：443(1970))的同源性算法、Pearson和 Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85：2444(1988))的相似性检索方法、这 些算法的计算机化的工具(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、 FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison， Wis.)或通过检验。

可从几种来源(包括生物信息国家中心(NCBI，Bethesda，Md.)和因特网) 获得NCBI基础局部序列比对检索工具(BLAST)(Altschul等，1990)与序列分 析程序blast、blastn、blastx、tblastn和tblastx联合使用。该工具可在 htp：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/获得。如何使用该程序检测序列同一性 描述于http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast help.html。

本文使用并应用于氨基酸序列的术语“实质性氨基酸同一性”或“实质性 氨基酸序列同一性”表示多肽的一种特性，其中与参考组在所翻译肽的细胞色 素p450基序GXRXCX(G/A)后的第一氨基酸到终止密码子的对应区域相比， 所述肽含有至少70％的序列同一性、优选80％氨基酸序列同一性、更优选90％ 氨基酸序列同一性、最优选至少99-100％序列同一性的序列。

本文使用并应用于核酸序列的术语“实质性核酸同一性”或“实质性核酸 序列同一性”表示多核苷酸序列的一种特性，其中与参考组在所翻译肽的细胞 色素p450基序GXRXCX(G/A)后的第一核酸到终止密码子的对应区域相比， 所述多核苷酸含有至少75％的序列同一性、优选81％序列同一性、更优选91％ 序列同一性、最优选至少99-100％序列同一性的序列。

核苷酸序列实质相同的另一个指标是两个分子在严格条件下是否可杂交。 严格条件视序列而定，在不同情况下是不同的。严格条件一般选择比给定离子 强度和pH时特定序列的热解链温度(Tm)低约5-20℃，通常是约10-15℃。Tm 是在给定离子强度和pH时50％靶序列与匹配的探针杂交的温度。严格条件通 常是盐浓度为约0.02摩尔，pH是7，温度是至少约60℃。例如，在标准的 Southern杂交方法中，严格条件包括于42℃在6×SSC中初次洗涤，然后于至 少约55℃(通常是约60℃，更常见是约65℃)在0.2×SSC进行一次或多次额外 洗涤。

出于本发明的目的，当核苷酸序列编码的多肽和/或蛋白质实质性相同时， 核苷酸序列也实质性相同。因此，当一条核酸序列与第二条核酸序列编码的多 肽实质性相同时，这两条核酸序列是实质性相同的，即使由于遗传密码所允许 的简并性造成它们在严格条件下不会杂交(对密码子简并性和遗传密码的解 释参见Darnell等，(1990)《分子生物学》(Molecular Cell Biology)，第二 版，Scientific American Books W.H.Freeman and Company，New York)。可 通过许多本领域熟知的方式，例如蛋白质样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后基 于染色通过目测来表征蛋白质纯度或均一性。出于特定的目的，可能需要高分 辨率并可利用HPLC或类似的装置。

本文使用的术语“载体”指将DNA片段转移入细胞的核酸分子。载体可 由于复制DNA并可在宿主细胞中独立地复制。术语“运载体”有时可与“载 体”互换使用。本文使用的术语“表达载体”指重组DNA分子，该分子含有 所需的编码序列和用于在特定宿主生物体中表达操作性相连的编码序列所需 合适的核酸序列。通常，原核生物中表达所需的核酸序列通常含有启动子、操 纵子(任选)与核糖体结合位点，以及其它序列。已知真核细胞可利用启动子、 增强子以及终止和聚腺苷酸化信号。

为再生完全经遗传工程改造的具有根的植物，可在植物细胞中插入核酸， 例如通过诸如体内接种的任何技术或通过任何已知的体外组织培养技术来产 生可再生为完整植物的转化植物细胞。因此，例如可通过病原性或非病原性根 瘤土壤杆菌(A.tumefacien)的体外接种来插入植物细胞。也可使用其它这样的 组织培养技术。

“植物组织”包括分化或未分化的植物组织，包括，但不限于根、芽、叶、 花粉、种子、肿瘤组织以及培养物中细胞的各种形式，例如单细胞、原生质体、 胚和愈伤组织。植物组织可在植物中(in planta)或器官中，组织或细胞培养物中。

本文使用的“植物细胞”包括植物中的植物细胞和培养物中的植物细胞和 原生质体。

“cDNA”或“互补DNA”一般指核苷酸序列与RNA分子互补的单链DNA 分子。cDNA是通过逆转录酶在RNA模板作用形成的。

获得核酸序列的方案

根据本发明，从转化体和非转化体烟草谱系的烟草组织中提取RNA。提 取的RNA然后用于产生cDNA。然后使用两种方案产生本发明的核酸序列。

在第一方案中，从植物组织中提取富含polyA的RNA并通过逆转录PCR 制备cDNA。然后使用简并引物加上寡聚d(T)反向引物，用单链cDNA产生p450 特异性PCR群。以高度保守的p450基序为基础设计引物。特定的简并引物的 例子示于图1。进一步分析含有合适大小插入物的质粒的序列片段。这些插入 物的大小一般是约300-800个核苷酸，视采用何种引物而定。

在第二方案中，首先构建cDNA文库。使用简并引物加上在质粒上作为反 向引物的T7引物，使用质粒中的cDNA产生p450特异的PCR群。如第一方 案中一样，进一步分析含有合适大小插入物的质粒的序列片段。

已知产生高水平降烟碱的烟草植物谱系(转化体)和降烟碱水平检测不到 的植物谱系可用作起始材料。

然后可从植物上取下叶子并用乙烯处理以激活本文所定义的p450酶活 性。示于本领域已知的技术提取总RNA。然后使用如图153所述的寡聚d(T) 引物经PCR(RT-PCR)产生cDNA片段。然后可完全地构建本文实施例所述的 cDNA文库。

p450型酶的保守区域可用作简并引物(图75)的模板。可通过PCR使用简 并引物扩增p450特异性条带。表示p450样酶的区带可通过DNA测序鉴定。 可使用鉴定合适的候选对象的BLAST检索、算法或其它工具来表征PCR片 段的特性。

已鉴定片段的序列信息可用于开发PCR引物。这些引物与cDNA文库中 的质粒引物联合用于克隆全长p450基因。进行大规模Sourthern反向分析来检 测所有获得的片段克隆以及在一些情况中全长克隆的差别表达。在本发明的这 个方面，为筛选所有克隆的插入物，可用不同组织的标记的总cDNA作为探针 来与克隆的DNA片段杂交，进行大规模反向Sourthern测定。

也用非放射性和放射性(P32)Northern印迹测定来鉴定克隆p450片段和全 长克隆。

通过衍生它们的氨基酸序列与选择抗原性和对其它克隆独特的肽区域来 制造针对几种全长克隆的肽特异性抗体。制造了针对偶联于运载体蛋白的合成 肽的家兔抗体。使用这些抗体对植物组织进行Western印迹分析或其它免疫学 方法。

可使用病毒诱导的基因沉默技术(VIGS，Baulcombe，Current Opinions in Plant Biology，1999，2：109-113)检测以上鉴定的核酸序列。

通过衍生它们的氨基酸序列与选择可能的抗原性和对其它克隆独特的肽 区域来制造针对几种全长克隆的肽特异性抗体。制造了针对偶联于运载体蛋白 的合成肽的家兔抗体。使用这些抗体进行Western印迹分析。

在本发明的另一方面，使用干扰RNA(RNAi)技术在本发明的烟草植物中 进一步鉴定细胞色素p450酶活性。描述该技术的以下参考文献纳入本文作为 参考，Smith等，Nature，2000，407：319-320；Fire等，Nature，1998， 391：306-311；Waterhouse等，PNAS，1998，95：13959-13964；Stalberg等， Plant Molecular Biology，1993，23：671-683；Baulcombe，Current Opinions in Plant Biology，1999，2：109-113和Brigneti等，EMBO Journal，1998， 17(22)：6739-6746。可使用RNAi技术、反义技术或所述的各种其它方法来 转化植物。

有几种技术将外来遗传物质引入植物细胞并获得稳定地维持和表达所引 入基因的植物。这种技术包括加速包裹在微粒上的遗传物质进入细胞(授予 Cornell的美国专利4,945,050和授予DowElanco的美国专利5,141,131)。可 使用土壤杆菌技术来转化植物，参见授予University of Toledo的美国专利 5,177,010；授予Texas A & M的5,104,310；Schilperoot的欧洲专利申请 0131624B1、欧洲专利申请120516、159418B1、欧洲专利申请120516、 159418B1和176,112；授予Schilperoot美国专利5,149,645；5,469,976； 5,464,763；4,940,838和4,693,976；MaxPlanck的欧洲专利申请116718、 290799、320500；Japan Nicotiana的欧洲专利申请604662和627752；Ciba Geigy的欧洲专利申请0267159、0292435和美国专利5,231,019；授予 Calgene的美国专利5,463,174和4,762,785；授予Agracetus的美国专利 5,004,863和5,159,135。其它转化技术包括whiskers技术，参见，例如授予 Zeneca的美国专利5,302,523和5,464,765。电穿孔技术也用于转化植物， 参见，Boyce Thompson Institute的WO 87/06614、Dekalb的5,472,869和 5,384,253；PGS的WO9209696和WO9321335。所有这些转化专利和出版 物引作参考。除了许多转化植物的技术以外，与外来基因接触的组织的类 型也可变。这种组织包括，但不限于胚胎发生组织、I和II型愈伤组织、下 胚轴、分生组织等。使用技术人员已知的合适的技术几乎可转化所有分化 过程中的植物组织。

引入植物的外来遗传物质可包含选择标记。具体的标记可由技术人员判 断，但以下选择标记可与任何其它可用作选择标记的本文未列出的基因一起使 用。这种选择标记包括，但不限于：编码抗生素卡那霉素、新霉素和G418抗 性的转座子Tn5(Aph II)的氨基糖苷磷酸转移酶基因，以及编码对N-膦酰甲基 甘氨酸、潮霉素、氨甲喋呤、草铵膦(phosphinothricin)(bar)、咪唑啉酮、磺酰 脲和三唑并嘧啶除草剂，例如chlorosulfuron、溴苯腈、茅草枯等具抗性或 耐受性的那些基因。

除了选择标记以外，可能需要使用报道基因。在一些例子中，可使用报道 基因而无需选择标记。报道基因是通常不存在于或不表达于受者生物体或组织 中的基因。报道基因通常编码提供一些表型改变或酶性能的蛋白质。这种基因 的例子见纳入本文作为参考的K.Weising等，Ann.Rev.Genetics，22， 421(1988)。优选的报道基因包括，但不限于葡糖醛酸酶(GUS)基因和GFP 基因。

一旦引入植物组织后，可通过任何本领域已知的方法来评价结构基因的表 达，可以mRNA转录、蛋白质合成或发生沉默基因的量来检测表达(参见纳入 本文作为参考的美国专利号5,583,021)。用于体外培养植物细胞和在许多情 况中，用于再生完整植物的技术是已知的(欧洲申请号88810309.0)。本领域的 技术人员已知将引入的表达复合物变为商业有用品种的方法。

一旦获得表达所需水平的p450酶的植物细胞，可使用本领域熟知的方法 和技术再生植物组织和完整的植物。再生的植物可通过常规方法繁殖，引入的 基因可通过常规植物育种技术转入其它品系或品种。

以下实施例描述了实施本发明的方法并且应理解为是说明性的，而非基于 此来限制本发明在权利要求中所定义的范围。

                           实施例

            实施例1植物组织的发育和乙烯处理

植物生长

将植物种在盆中，在温室中生长4周。将4周龄的幼苗移到单独的盆 中，温室中生长2个月。生长过程中，每天给植物浇水2次，水中含有150ppm 的NPK肥料。将展开的绿叶与植物分离，以进行下面所述的乙烯处理。

细胞系78379

由肯塔基大学发放的烟草品系78379用作植物材料的来源，它是一种 白肋(burley)烟草品系。用本领域种植烟草的标准方法培养100株植物， 移植，并且用不同的数字(1-100)给它们贴注标签。用推荐的方法施肥和 进行田间管理。

100株植物中的3/4将20-100％的烟碱转化为降烟碱。100株中的1/4 将小于5％的烟碱转化为降烟碱。植株87转化率最低(2％)，而植株21 的转化率为100％。将转化率小于3％的植株分类为非转化株。对植株87 和21自花授粉的种子以及杂交(21×87和87×21)的种子进行遗传差异和表 型差异的研究。来自植株21自花授粉种子的植物是转化株，99％的来自植 株87自花授粉种子的植物是非转化株。剩余1％的来自植株87自花授粉种 子的植物有较低的转化率(5-15％)。杂交种均为转化株。

细胞系4407

烟草品系4407用作植物材料来源，它是一种白肋品系。选择均一的并 且具代表性的植物(100)并贴上标签。在这100株植物中，97株是非转化 株，3株是转化株。植株56的转化率最低(1.2％)，植株58的转化水平最高 (96％)。将这两株植物进行自花授粉和杂交。

来自植株58自花授粉种子的植株产生3∶1的分离比(转化株∶非转 化株＝3∶1)。植株58-33和58-25分别被鉴定为纯合转化株和非转化株植 物品系。植株58-33下一代后裔中的分析确证了该植株的稳定转化率。

细胞系PBLB01

PBLB01是由ProfiGen，Inc.研究开发的一种白肋品系，用作植物材料 的来源。从PBLB01的第一代(foundation)种子中选择转化株植株。

乙烯处理方法

将绿色叶片从温室生长2-3个月的植物分离，喷施0.3％的乙烯溶液(商 品名Ethephon(Rhone-Poulenc))。将每片经喷施的叶子悬挂在配有加湿器 的养护架(curing rack)上，覆盖塑料膜。在处理期间，用乙烯溶液定期喷 施样品叶片。乙烯处理后约24-48小时，收集叶子提取RNA。取同一组样 品的另外一份(sup-sample)用于代谢成分分析以测定叶片代谢物的浓度以 及感兴趣的更具体的成分如多种生物碱的分析。

例如，可如下进行生物碱分析。样品(0.1克)和0.5毫升2N NaOH 以及含有喹啉(作为内标)和甲基叔丁基乙醚的5毫升提取液在150rpm振 荡。在配有FID检测器的HP 6890GC上分析样品。250℃的温度用于检测 器和上样器(injector)。使用含有与5％苯酚和95％甲基硅酮(methyl silicon) 交联的熔融硅石的HP柱(30m-0.32nm-1m)，温度梯度为每分钟10℃， 110-185℃。该柱在100℃工作，用氦气作为运载气体，流速为1.7cm3min-1， 分流比为40∶1，上样体积为2·1。

实施例2：分离RNA

对于RNA的提取，如上所述用乙烯处理2月龄温室植物的中等大小的 叶片。0和24-48小时的样品用于RNA提取。在有些情况下，从打顶 (flower-head removal)后10天的植物取处于衰老过程的叶片样品。这些 样品也用于提取。用Rneasy Plant Mini Kit(Qiagen，Inc.，Valencia， California)按照生产商的方法分离总RNA。

用DEPC处理过的研钵和杵在液氮中将组织样品研磨为细粉。将约100 毫克磨碎的组织转移到灭菌的1.5毫升eppendorf管中。将样品管置于液氮 中，直到收集完所有样品。然后，将试剂盒中提供的450μl RLT缓冲液加 入各管中。剧烈振荡样品，然后在56℃温育3分钟。将裂解物加在放于2 毫升收集管中的QIAshredderTM旋转柱上，最大速度离心2分钟。收集流出 液，加0.5体积的乙醇到澄清的裂解液中。充分混合样品，转移到放在2 毫升收集管中的小旋转柱中。10,000rpm离心样品1分钟。然后，吸取700 μl RW1缓冲液到Rneasy柱上，10,000rpm离心1分钟。吸取RPE缓冲液 到置于新收集管中的Rneasy柱上，10,000rpm离心1分钟。再将RPE缓 冲液加到Rneasy旋转柱上，以最大速度离心2分钟以使膜干燥。为了除 掉残留的乙醇，将膜置于一空收集管上，再以最大速度离心1分钟。将 Rneasy柱转移到一个新的1.5毫升收集管中，将40μl不含RNA酶的水 直接吸到Rneasy膜上。该最终洗脱物在10,000rpm离心1分钟。用变性 甲醛凝胶和分光光度计分析总RNA的质量和数量。

按照生产商的方法用OligotexTM poly A+RNA纯化试剂盒(Qiagen Inc.) 分离Poly(A)RNA。使用溶于最大为250μl体积的约200μg总RNA。将 250μl OBB缓冲液和15μl OligotexTM悬浮液加到250μl总RNA中。通 过吸打使这些物质彻底混合，在加热器(heating block)上70℃保温3分钟。 然后，将样品置于室温约20分钟。最大速度离心2分钟得到oligotex：mRNA 复合物团块。从微离心管中除去全部上清液，仅剩约50μl。再用OBB缓 冲液处理样品。通过涡旋将oligotex：mRNA团块重新悬浮在400μl OW2 缓冲液中。将该混合物转移到置于新管中的小旋转柱上，以最大速度离心1 分钟。将旋转柱移到新管中，再往该柱中加入400μl OW2缓冲液。然后， 以最大速度离心该管。将旋转柱转移到最终的1.5毫升微量离心管中。用 60μl热的(70℃)OEB缓冲液洗脱样品。用变性甲醛凝胶和分光光度计分 析Poly A产物。

实施例3：反转录-PCR

按照生产商的方法用SuperScript反转录酶(Invitrogen，Carlsbad， California)制备第一链cDNA。富集了poly A+RNA的寡聚dT引物混合物由 少于5μg的总RNA、1μl 10mM dNTP混合物、1μl Oligo d(T)12-18(0.5 μg/μl)和至多10μl的经DEPC处理的水组成。各样品在65℃温育5分 钟，然后置于冰上至少1分钟。按顺序加入下列各组分，以制备反应混合 物：2μl 10X RT缓冲液、4μl 25mM MgCl2、2μl 0.1M DTT和1μl去 除RNA酶的重组RNA酶抑制剂(Rnase OUT Recombinant RNase Inhibitor)。吸取9μl反应混合物到各RNA/引物混合物，轻柔混合。42℃ 温育2分钟，在各管中加入1μl Super Script IITMRT，42℃温育50分钟。 在70℃终止反应15分钟，冰上冷却。离心收集样品，在各管中加入1μl RNase H，37℃温育20分钟。用200pmoles正向引物(如图75所示的变性 引物，SEQ ID NO.149-156)和100pmoles反向引物(18碱基的寡聚d(T)， 接一个随机碱基)进行第二次PCR。

反应条件是94℃ 2分钟；然后进行40个循环的PCR：94℃ 1分钟， 45-60℃ 2分钟，72℃ 3分钟；最后72℃再延伸额外的10分钟。

用1％的琼脂糖凝胶电泳分析10微升的扩增样品。将大小正确的条带 从琼脂糖凝胶上纯化出来。

实施例4：PCR片段群体的产生

按照生产商的方法将实施例3得到的PCR片段连接到pGEM-T Easy Vector(Promega，Madison，Wisconsin)中。用连接产物转化JM109感受态细 胞，涂在LB培养基平板上，进行蓝/白选择。选择克隆，置于96孔板上在 1.2毫升LB培养基中37℃生长过夜。对于所有选出的集落保留冻存管。用 Beckman′s Biomeck 2000小制备机器人技术(miniprep robotics)以Wizard SVMiniprep试剂盒(Promega)从平板上纯化质粒。用100μl水洗脱质粒 DNA，存贮于96孔板中。用EcoR1消化质粒，并用1％琼脂糖凝胶分析以 确证DNA的量和插入片段的大小。用CEQ 2000测序仪(Beckman，Fullerton， California)测序含有400-600bp插入片段的质粒。用BLAST搜索将测得的 序列与Genbank数据库进行比对。鉴定与p450相关的片段并进一步分析。 或者，将p450片段从差减文库中分离出来。如上所述分析这些片段。

实施例5：CDNA文库的构建

如下所述从乙烯处理的叶片中制备总RNA以构建cDNA文库。首先， 用改良的酸酚和氯仿提取方法从乙烯处理的烟草品系58-33叶片中提取总 RNA。改良的方法是用1克组织进行研磨，随后在5毫升加入了5毫升苯 酚(pH5.5)和5毫升氯仿的提取缓冲液(100mM Tris-HCl，pH8.5；200mM NaCl；10mM EDTA；0.5％ SDS)中涡旋。将提取的样品离心，保留上清。 该提取步骤再重复2-3次直到上清变得澄清。加入约5毫升氯仿以除去痕 量的苯酚。加入3倍体积的ETOH和1/10体积的3M NaOAc(pH5.2)以从混 合的上清组分中沉淀RNA，在-20℃存贮1小时。转移到Corex玻璃容器中 以后，在4℃ 9,000RPM离心RNA组分45分钟。离心下来的团块用70％ 乙醇洗涤，4℃ 9,000RPM离心5分钟。团块干燥以后，将RNA团块溶解 在0.5毫升不含Rnase的水中。RNA团块溶解在0.5毫升不含Rnase的水中。 分别用变性甲醛和分光光度计分析总RNA的质量和数量。

以下述步骤用Oligo(dT)纤维素方法(Invitrogen)和微离心旋转柱 (Invitrogen)从得到的总RNA中分离poly A+RNA。约20mg总RNA进行两 次纯化以获得高质量的poly A+RNA。用变性甲醛和随后的已知全长基因 的RT-PCR(确保高质量的mRNA)来分析PolyA+RNA产物。

接着，以poly A+RNA作模板用cDNA合成试剂盒、ZAP-cDNA合 成试剂盒和ZAP-cDNAGigapackIII金克隆试剂盒(gold cloning kit) (Stratagene，La Jolla，California)来产生cDNA文库。其中的方法按照生产商 规定的步骤来进行。用约8μg polyA+RNA来构建cDNA文库。初级文库 的分析显示约有2.5×106-1×107pfu。用IPTG和X-gal进行了互补分析， 以检测文库的质量背景，其中重组噬菌斑的表达高出背景反应100倍以上。

用随机PCR对文库进行的更为定量的分析表明，插入的cDNA的平均 大小约为1.2kb。该方法采用了如下所述的两步法PCR。对于第一步，反向 引物的设计是基于从p450片段获得的初级序列信息。设计的反向引物和 T3(正向)引物用于从cDNA文库中扩增相应的基因。PCR反应物进行琼 脂糖凝胶电泳，切割高分子量的相应条带，纯化、克隆并测序。在第二步 中，用根据p450的5′UTR或翻译起始区域设计的新引物作为正向引物，和 反向引物一起(根据p450的3′UTR设计)用于下一步的PCR以获得全长 p450克隆。

如实施例3所述(反向引物除外)从构建的cDNA文库中用PCR扩增 获得p450片段。用位于质粒上cDNA插入片段下游(见图75)的T7引物 作为反向引物。如实施例4所述分离、克隆和测序PCR片段。

从构建的cDNA文库中用PCR方法分离全长p450基因。用基因特异 性反向引物(根据p450片段的下游序列设计)和正向引物(位于文库质粒 上的T3)来克隆全长基因。分离、克隆并测序PCR片段。如果需要，可进 行第二步PCR。在第二步PCR中，用根据克隆的p450的5′UTR设计的新 正向引物和根据p450的3′UTR设计的反向引物来进行下一步的PCR反应， 以获得全长p450克隆。然后对克隆测序。

实施例6：克隆片段的鉴定-反向SOUTHERN印迹分析

在以上实施例中鉴定的所有p450克隆上进行非放射性大规模反向 southern印迹试验以检测差异性表达。观察到不同p450基因簇之间的表达 水平非常不同。在高水平表达的克隆上又进行了实时检测。

非放射性southern印迹方法按如下所述进行。

1)如实施例2所述用Qiagen Rnaeasy试剂盒从乙烯处理和未处理的转 化株(58-33)和非转化株(58-25)叶片提取总RNA。

2)用生物素加尾标记从上述步骤产生的富含poly A+的RNA中衍生的 单链cDNA来制备探针。该标记的单链cDNA是如实施例3所述用转化株 和非转化株的总RNA(Invitrogen)进行RT-PCR产生的，但用了生物素化的 寡聚dT作为引物(Promega)。这些用作探针与克隆的DNA杂交。

3)用限制性内切酶EcoR1消化质粒DNA，进行琼脂糖凝胶电泳。将 这些凝胶同时干燥并转到两个尼龙膜上(BiodyneB)。一个膜与转化株探针 杂交，另一个膜与非转化株探针杂交。在杂交之前将膜进行紫外线交联(自 动交联设备，254nm，Stratagene，Stratalinker)。

或者，用位于p-GEM两臂上的序列，T3和SP6作为引物从各质粒中 PCR扩增插入片段。PCR产物在96孔的即时(Ready-to-run)琼脂糖凝胶 上电泳以进行分析。经确证的插入片段点到两个尼龙膜上。一个膜与转化 株探针杂交，另一个膜与非转化株探针杂交。

4)按生产商的说明书将这些膜杂交并洗涤，其中对洗涤的严格性进行 了改变(Enzo MaxSenceTM试剂盒，Enzo Diagnostics，Inc，Farmingdale，NY)。 膜与杂交缓冲液(2×SSC缓冲的甲酰胺，含有去垢剂和杂交增强剂)在42℃ 预杂交30分钟，与10μl变性的探针42℃杂交过夜。然后室温用1X杂交 洗涤缓冲液洗涤杂交膜一次，10分钟；68℃洗涤15分钟，4次。然后可以 对杂交膜进行检测。

5)按生产商提供的检测方法(Enzo Diagnostics，Inc.)，经洗涤的膜用碱 性磷酸酶标记，然后用NBT/BCIP颜色检测方法进行检测。用1X封闭液室 温封闭杂交膜1小时，用1X检测试剂洗涤10分钟(3次)，用1X预显影 反应缓冲液洗涤5分钟(2次)，然后在显影液中显影直到出现点状印迹。 所有的试剂都由生产商提供(Enzo Diagnostics，Inc)。此外，还用KPL southern 杂交和检测试剂盒TM按生产商的方法(KPL，Gaithersburg，Maryland)进行 了大规模反向Southern试验。

实施例7：克隆的鉴定-NORTHERN印迹分析

除Southern印迹分析之外，如Northern印迹分析的实施例所述，一些 膜进行了Northern杂交和检测。如下所述，采用Northern杂交检测烟草中 差异表达的mRNA。

采用随机引发方法从克隆的p450制备探针(MegaprimeTM DNA标记系 统，Amersham Biosciences)。

混合下述组分：25ng变性的DNA模板；未标记的dTTP、dGTP和dCTP 各4μl；5μl反应缓冲液；P32标记的dATP和2ul Klenow I；以及水，使 反应体系达到50μl。该混合物在37℃温育1-4小时，然后以2μl 0.5M的 EDTA终止。使用前，95℃温育5分钟使探针变性。

从几对烟草品系经乙烯处理和未经处理的新鲜叶片中制备RNA样品。 在有些情况下，使用了富含poly A+的RNA。用DEPC水(5-10μl)使约 15μg总RNA或1.8μg mRNA(RNA或mRNA提取方法如实施例5所述) 的体积相同。加入等体积的上样缓冲液(1×MOPS；18.5％甲醛；50％甲酰胺； 4％ Ficoll 400；溴酚蓝)和0.55μl EtBr(0.5μg/μl)。将样品变性，准备用 电泳分离RNA。

将样品用1XMOP缓冲液(0.4M吗啉苯磺酸；0.1M乙酸钠-3×H2O； 10mM EDTA；用NaOH调pH至7.2)在甲醛凝胶(1％琼脂糖，1×MOPS，0.6 M甲醛)上电泳。用毛细方法在10×SSC缓冲液(1.5M NaCl；0.15M柠 檬酸钠)中将RNA转移到Hybond-N+上(Nylon，Amersham PharmaciaBiotech)24小时。在杂交前，将有RNA样品的膜紫外交联(自动 交联设备，254nm，Stratagene，Stratalinker)。

膜和5-10毫升预杂交缓冲液(5×SSC；50％甲酰胺；5×Denhardt′s-溶 液；1％ SDS；100g/ml热变性的平端非同源DNA)在42℃预杂交1-4小时。 将旧的预杂交缓冲液弃去，加入新的预杂交缓冲液和探针。杂交在42℃过 夜进行。用2×SSC室温洗涤膜15分钟，然后用2×SSC洗涤一次。

本发明的一个主要焦点是发现了可被乙烯处理诱导的新基因或者在烟 草叶片的质量和成分中起主要作用的新基因。如下表所示，Northern印迹 和反向Southern印迹可用于测定哪些基因受乙烯处理的诱导(相对于不受 诱导的植株)。令人感兴趣的是，在转化株和非转化株植株中并非所有的 片段都受到相似的影响。对感兴趣的细胞色素p450片段部分测序以确定它 们的结构相关性。该信息被用于后续分离和鉴定感兴趣的全长基因克隆。   片段   诱导的mRNA表达   乙烯处理   转化株   D56-AC7(SEQ ID NO：35)   +   D56-AG11(SEQ ID NO：31)   +   D56-AC12(SEQ ID NO：45)   +   D70A-AB5(SEQ ID NO：95)   +   D73-AC9(SEQ ID NO：43)   +   D70A-AA12(SEQ ID NO：131)   +   D73A-AG3(SEQ ID NO：129)   +   D34-52(SEQ ID NO：61)   +   D56-AG6(SEQ ID NO：51)   +

用全长克隆在从乙烯处理诱导的转化株和非转化株白肋品系获得的烟 草组织上进行Northern分析。目的是鉴定在乙烯诱导的转化株植株中(相 对于乙烯诱导的转化株品系相对于乙烯诱导的非转化株白肋品系)表达有 所提高的那些全长基因克隆。用这种Northern分析方法，可以通过比较转 化株和非转化株品系之间叶片组成的生化差异来确定全长克隆的功能关 系。如下表所示，6个克隆在乙烯处理的转化株植物组织中(标记为++和 +++)显示出比在乙烯处理的非转化株植物组织中(标记为+)表达显著升 高。在未经乙烯处理的转化株和非转化株品系中所有这些克隆显示出很少 的表达或不表达。

  全长克隆   转化株   非转化株   D101-BA2   ++   +   D207-AA5   ++   +   D208-AC8   +++   +   D237-AD1   ++   +   D89-AB1   ++   +   D90A-BB3   ++   +

实施例8：由克隆的基因编码的p450S的免疫检测

选择来自3个p450克隆的长度相应于20-22个氨基酸的肽区域，这些 肽区域：1)与其它克隆具有很低的同源性或没有同源性，和2)具有很好 的亲水性和抗原性。下面列出了选自各个p450克隆的肽区域的氨基酸序列。 将合成的肽与KHL偶联，然后注射到家兔中。

第4次注射后2周和4周收集抗血清(Alpha Diagnostic Intl.Inc.San Antonio，TX)。

D234-AD1  DIDGSKSKLVKAHRKIDEILG

D90a-BB3  RDAFREKETFDENDVEELNY

D89-AB1   FKNNGDEDRHFSQKLGDLADKY

用Western印迹分析来检测抗血清对烟草植物组织靶蛋白的交叉活性。

从乙烯处理的(0-40小时)转化株和非转化株品系的中等大小的叶片 获得蛋白粗提物。按生产商的方法用RC DC蛋白检测试剂盒(BIO-RAD)测 定该提取物的蛋白浓度。

将2微克蛋白加到各泳道中，用Laemmli SDS-PAGE体系在10％-20％ 梯度凝胶上分离蛋白。用Trans-Blot半干槽(Semi-Dry cell)(BIO-RAD) 将蛋白从凝胶转移到PROTRAN硝化纤维转移膜(Schleicher & Schuell) 上。用ECL AdvanceTM Western印迹检测试剂盒(Amersham Biosciences)检 测和显影p450蛋白。在家兔中制备针对合成的KLH耦合物的一抗。针对 兔IgG的二抗(与过氧化物酶偶联)购自Sigma。一抗和二抗都以1∶1000 稀释液使用。抗体对Western印迹上的一条单一条带显示出很强的反应性， 说明该抗血清对感兴趣的靶肽是单一特异性的。抗血清对与KLH耦合的合 成肽也具有交叉反应性。

实施例9：分离的核酸片段的核酸同一性和结构相关性

超过100个克隆的p450片段结合Northern印迹分析来测序，以确定它 们的结构相关性。所用方法中使用的正向引物基于两个共有的p450基序， 这两个基序邻近p450基因的羧基末端。该正向引物对应于如图1所示的细 胞色素p450基序FXPERF或GRRXCP(A/G)。反向引物使用来自质粒的标 准引物(位于pGEMTM质粒的两臂)SP6或T7，或使用多聚A尾巴。所用 方法如下所述。

按生产商(Beckman Coulter)的方法用分光光度法评价起始双链DNA的 浓度。将模板用水稀释到合适的浓度，95℃ 2分钟加热变性，然后置于冰 上。测序反应液在冰上制备，其包括0.5-10μl变性DNA模板，2μl 1.6pmole 正向引物，8μl DTCS Quick Start Master Mix，用水调节总体积到20μl。 温度循环程序包括以下30个循环：96℃20秒，50℃20秒，60℃4分钟， 然后4℃保温。

加入5μl终止缓冲液(等体积的3M NaOAc、100mM EDTA和1μl 20mg/ml肝糖)使测序终止。用60μl 95％的冷乙醇沉淀样品，6000g离心 6分钟。弃去乙醇。团块用200μl冷的70％乙醇洗涤2次。团块干燥以后， 加入40μl SLS溶液，使团块重悬。在表面上加入一层矿物油。然后，将样 品置于CEQ 8000自动测序仪中进行进一步分析。

为了验证核酸序列，用基于p450基因的FXPERF或GRRXCP(A/G)区 域的正向引物或基于质粒或多聚A尾巴的反向引物对核酸序列在两个方向 进行重新测序。在两个方向上所有的测序至少进行两次。

将细胞色素p450片段的核酸序列彼此比较，从编码区(与编码 GRRXCP(A/G)的区域之后的第一个核酸相对应)一直到终止子。选择该区 域作为p450蛋白遗传多态性的一个指示参数。观察到大量的(超过70种) 遗传上不同的p450基因，类似于其它植物物种中所观察到的。在比较核酸 序列时发现，这些基因根据其序列同一性可置于不同的序列组群中。发现 p450成员的最好的唯一的(unique)分组确定为那些具有75％或更大核酸 同一性的序列(见表1)。降低同一性百分数导致组群明显变大。观察到优 选的分组是那些具有81％或更大核酸同一性的序列，更优选的分组是具有 91％或更大核酸同一性的序列，最优选的分组是具有99％或更大核酸同一 性的序列。大多数组群包括至少2个成员，经常为3个或更多个成员。没 有重复观察到其它情况，说明所采用的方法既能够在所用组织中分离低表 达的mRNA又能够分离高表达的mRNA。

基于75％或更大核酸同一性，发现两个细胞色素p450组群与之前(发 现)的遗传上与这两个组群不同的烟草细胞色素基因具有核酸序列同一性。 第23组在表I所用的指数范围内，显示出与之前分别由Czernic等和Ralston 等提交的GenBank序列GI：1171579(CAA64635)和GI：14423327(或 AAK62346)具有核酸同一性。GI：1171579与第23组成员的核酸同一性为 96.9％-99.5％，而GI：14423327与第23组成员的核酸同一性为95.4％ -96.9％。第31组的成员与Ralston等提交的GenBank序列GI：14423319 (AAK62342)有76.7％-97.8％的核酸同一性。表1中没有其它p450同一性组 群在表1所用的参数范围内与Ralston等、Czernic等、Wang等或LaRosa 和Smigocki报道的烟草p450基因具有同一性。

如图76所示，对于各组，可衍生合适的核酸变性探针的共有序列，以 优先从烟草植物中鉴定和分离各组的其它成员。

表I：烟草p450核酸序列同一性组群

组群  片段

1 D58-BG7(SEQ ID No.：1)，D58-AB1(SEQ ID No.：3)；D58-BE4(SEQ ID No.：7)

2 D56-AH7(SEQ ID No.：9)；D13a-5(SEQ ID No.：11)

3 D56-AG10(SEQ ID No.：13)；D35-33(SEQ ID No.：15)；D34-62(SEQ ID No.：17)

4 D56-AA7(SEQ ID No.：19)；D56-AE1(SEQ ID No.：21)；185-BD3 (SEQ ID No.：143)

5 D35-BB7(SEQ ID No.：23)；D177-BA7(SEQ ID No.：25)；D56A-AB6 (SEQ ID No.：27)；D144-AE2(SEQ ID No.：29)

6 D56-AG11(SEQ ID No.：31)；D179-AA1(SEQ ID No.：33)

7 D56-AC7(SEQ ID No.：35)；D144-AD1(SEQ ID No.：37)

8 D144-AB5(SEQ ID No.：39)

9 D181-AB5(SEQ ID No.：41)；D73-Ac9(SEQ ID No.：43)

10 D56-AC12(SEQ ID No.：45)

11 D58-AB9(SEQ ID No.：47)；D56-AG9(SEQ ID No.：49)；D56-AG6(SEQ ID No.：51)；D35-BG11(SEQ ID No.：53)；D35-42(SEQ ID No.：55)； D35-BA3(SEQ ID No.：57)；D34-57(SEQ ID No.：59)；D34-52(SEQ ID No.：61)；D34-25(SEQ ID No.：63)

12 D56-AD10(SEQ ID No.：65)

13 56-AA11(SEQ ID No.：67)

14 D177-BD5(SEQ ID No.：69)；D177-BD7(SEQ ID No.：83)

15 D56A-AG10(SEQ ID No.：71)；D58-BC5(SEQ ID No.：73)；D58-AD12 (SEQ ID No.：75)

16 D56-AC11(SEQ ID No.：77)；D35-39(SEQ ID No.：79)；D58-BH4(SEQ ID No.：81)；D56-AD6(SEQ ID No.：87)

17 D73A-AD6(SEQ ID No.：89)；D70A-BA11(SEQ ID No.：91)

18 D70A-AB5(SEQ ID No.：95)；D70A-AA8(SEQ ID No.：97)

19 D70A-AB8(SEQ ID No.：99)；D70A-BH2(SEQ ID No.：101)； D70A-AA4(SEQ ID No.：103)

20 D70A-BA1(SEQ ID No.：105)；D70A-BA9(SEQ ID No.：107)

21 D70A-BD4(SEQ ID No.：109)

22 D181-AC5(SEQ ID No.：111)；D144-AH1(SEQ ID No.：113)；D34-65 (SEQ ID No.：115)

23 D35-BG2(SEQ ID No.：117)

24 D73A-AH7(SEQ ID No.：119)

25 D58-AA1(SEQ ID No.：121)；D185-BC1(SEQ ID No.：133)；D185-BG2 (SEQ ID No.：135)

26 D73-AE10(SEQ ID No.：123)

27 D56-AC12(SEQ ID No.：125)

28 D177-BF7(SEQ ID No.：127)；D185-BE1(SEQ ID No.：137)；D185-BD2 (SEQ ID No.：139)

29 D73A-AG3(SEQ ID No.：129)

30 D70A-AA12(SEQ ID No.：131)；D176-BF2(SEQ ID No.：85)

31 D176-BC3(SEQ ID No.：145)

32 D176-BB3(SEQ ID No.：147)

33 D186-AH4(SEQ ID No.：5)

实施例10：分离的核酸片段的相关氨基酸序列同一性

推测实施例8中获得的细胞色素p450片段的核酸序列的氨基酸序列。 被推测的区域对应于紧跟在GXRXCP(A/G)序列基序之后的氨基酸到羧基 末端，或终止子。在比较片段的序列同一性时，氨基酸同一性为70％或更 大的那些序列观察到唯一的分组(unique grouping)。氨基酸同一性为80 ％或更大的那些序列观察到优选的分组，更优选为90％氨基酸同一性或更 大，最优选的分组是氨基酸同一性为99％或更大的那些序列。组群和组群 成员的相应氨基酸序列示于图2。发现这些唯一的(unique)氨基酸序列中 的几个与其它序列具有完全的序列同一性，因此只报道了具有相同氨基酸 的一个成员。

根据它们的核苷酸序列，表II第19组的氨基酸同一性对应于3个不同 的组群。各组成员的氨基酸序列和它们的同一性示于图77。相应标示了氨 基酸差异。

选择了各氨基酸同一性组群中的至少一个成员用植物进行基因克隆和 功能性研究。此外，经Northern和Southern分析评定为受乙烯处理的影响 不同或具有其它生物学差异的组群成员也被选择作基因克隆和功能研究。 为有助于基因克隆，将基于序列同一性和差异序列进行表达研究和完整植 物评价以及肽特异性抗体的制备。

表II：烟草p450氨基酸序列同一性分组

组群                片段

1 D58-BG7(SEQ ID No.：2)，D58-AB1(SEQ ID No.：4)

2 D58-BE4(SEQ ID No.：8)

3 D56-AH7(SEQ ID No.：10)；D13a-5(SEQ ID No.：12)

4 D56-AG10(SEQ ID No.：14)；D34-62(SEQ ID No.：18)

5 D56-AA7(SEQ ID No.：20)；D56-AE1(SEQ ID No.：22)；185-BD3(SEQ ID No.：144)

6 D35-BB7(SEQ ID No.：24)；D177-BA7(SEQ ID No.：26)；D56A-AB6 (SEQ ID No.：28)；D144-AE2(SEQ ID No.：30)

7 D56-AG11(SEQ ID No.：32)；D179-AA1(SEQ ID No.：34)

8 D56-AC7(SEQ ID No.：36)；D144-AD1(SEQ ID No.：38)

9 D144-AB5(SEQ ID No.：40)

10 D181-AB5(SEQ ID No.：42)；D73-Ac9(SEQ ID No.：44)

11 D56-AC12(SEQ ID No.：46)

12 D58-AB9(SEQ ID No.：48)；D56-AG9(SEQ ID No.：50)；D56-AG6 (SEQ ID No.：52)；D35-BG11(SEQ ID No.：54)；D35-42(SEQ ID No.： 56)；D35-BA3(SEQ ID No.：58)；D34-57(SEQ ID No.：60)；D34-52 (SEQ ID No.：62)

13 D56AD10(SEQ ID No.：66)

14 56-AA11(SEQ ID No.：68)

15 D177-BD5(SEQ ID No.：70)；D177-BD7(SEQ ID No.：84)

16 D56A-AG10(SEQ ID No.：72)；D58-BC5(SEQ ID No.：74)；D58-AD12 (SEQ ID No.：76)

17 D56-AC11(SEQ ID No.：78)；D56-AD6(SEQ ID No.：88)

18 D73A-AD6(SEQ ID No.90：)

19 D70A-AB5(SEQ ID No.：96)；D70A-AB8(SEQ ID No.：100)； D70A-BH2(SEQ ID No.：102)；D70A-AA4(SEQ ID No.：104)；D70A- BA1(SEQ ID No.：106)；D70A-BA9(SEQ ID No.：108)

20 D70A-BD4(SEQ ID No.：110)

21 D181-AC5(SEQ ID No.：112)；D144-AH1(SEQ ID No.：114)；D34-65 (SEQ ID No.：116)

22 D35-BG2(SEQ ID No.：118)

23 D73A-AH7(SEQ ID No.：120)

24 D58-AA1(SEQ ID No.：122)；D185-BC1(SEQ ID No.：134)；D185-BG2 (SEQ ID No.：136)

25 D73-AE10(SEQ ID No.：124)

26 D56-AC12(SEQ ID No.：126)

27 D177-BF7(SEQ ID No.：128)；185-BD2(SEQ ID No.：140)

28 D73A-AG3(SEQ ID No.：130)

29 D70A-AA12(SEQ ID No.：132)；D176-BF2(SEQ ID No.：86)

30 D176-BC3(SEQ ID No.：146)

31 D176-BB3(SEQ ID No.：148)

32 D186-AH4(SEQ ID No.：6)

实施例11：全长克隆的相关氨基酸序列同一性

推测实施例5中克隆的烟草全长基因核酸序列的完整氨基酸序列。通 过3个保守p450结构域基序的存在来鉴定细胞色素p450基因，所述3个 保守p450结构域基序对应于羧基末端的UXXRXXZ、PXRFXF或GXRXC， 其中U是E或K，X是任何氨基酸，Z是P、T、S或M。还注意到这些克 隆中的两个，D130-AA1和D101-BA2几乎是完整的但缺少合适的终止子， 然而它们都含有上述的3个p450细胞色素结构域。用BLAST程序鉴定所 有p450具有的氨基酸同一性，把它们的全长序列彼此比较并且和已知的烟 草基因比较。该程序使用了NCBI特定的BLAST工具(两序列比对(Align two sequences，b12seq)，http：//www.ncbi.nlm.nih.oov/blast/b12sea7b12. html)。在没有过滤器的情况下用BLASTN比对两个核酸序列，用BLASTP 比对氨基酸序列。基于它们的氨基酸同一性百分比，将各序列分到同一性 组群中，其中各组群中包括的成员与另一个成员至少具有85％同一性。氨 基酸同一性为90％或更大的那些序列观察到优选的分组，更优选的分组具 有95％氨基酸同一性或更大，最优选的分组具有氨基酸同一性为99％或更 大的那些序列。采用这些标准，鉴定出25个不同的组群，示于表III。

在表III用于氨基酸同一性的参数范围内，发现3个组群与已知烟草基 因具有大于85％或更大的同一性。第5组的成员与先前Ralston等提交的 GenBank序列GI：14423327(或AAK62346)具有高达96％的全长序列氨基 酸同一性。第23组与Ralston等提交的GI：14423328(或AAK62347)有高达 93％的氨基酸同一性。第24组与Ralston等提交的GI：14423318(或 AAK62343)有92％的氨基酸同一性。

表III：烟草全长p450基因的氨基酸序列同一性组群

1 D208-AD9(SEQ.ID.No.224)；D120-AH4(SEQ.ID.No. 180)；D121-AA8(SEQ.ID.No.182)，D122-AF10(SEQ.ID.No.184)； D103-AH3(SEQ.ID.No.222)；D208-AC8(SEQ.ID.No.218)；D-235-ABI (SEQ.ID.No.246)

2 D244-AD4(SEQ.ID.No.250)；D244-AB6(SEQ.ID.No.274)； D285-AA8；D285-AB9；D268-AE2(SEQ.ID.No.270)

3 D100A-AC3(SEQ.ID.No.168)；D100A-BE2

4 D205-BE9(SEQ.ID.No.276)；D205-BG9(SEQ.ID.No.202)； D205-AH4(SEQ.ID.No.294)

5 D259-AB9(SEQ.ID.No.260)；D257-AE4(SEQ.ID.No.268)； D147-AD3(SEQ.ID.No.194)

6 D249-AE8(SEQ.ID.No.256)；D-248-AA6(SEQ.ID.No.254)

7 D233-AG7(SEQ.ID.No.266；D224-BD11(SEQ.ID.No.240)；DAF10

8 D105-AD6(SEQ.ID.No.172)；D215-AB5(SEQ.ID.No.220)；D135-AE1 (SEQ.ID.No.190)

9 D87A-AF3(SEQ.ID.No.216)，D210-BD4(SEQ.ID.No.262)

10 D89-AB1(SEQ.ID.No.150)；D89-AD2(SEQ.ID.No.152)；163-AG11 (SEQ.ID.No.198)；163-AF12(SEQ.ID.No.196)

11 D267-AF10(SEQ.ID.No.296)；D96-AC2(SEQ.ID.No.160)；D96-AB6 (SEQ.ID.No.158)；D207-AA5(SEQ.ID.No.204)；D207-AB4(SEQ.ID. No.206)；D207-AC4(SEQ.ID.No.208)

12 D98-AG1(SEQ.ID.No.164)；D98-AA1(SEQ.ID.No.162)

13 D209-AA12(SEQ.ID.No.212)；D209-AA11；D209-AH10(SEQ.ID.No. 214)；D209-AH12(SEQ.ID.No.232)；D90a-BB3(SEQ.ID.No.154)

14 D129-AD10(SEQ.ID.No.188)；D104A-AE8(SEQ.ID.No.170)

15 D228-AH8(SEQ.ID.No.244)；D228-AD7(SEQ.ID.No. 241)，D250-AC11(SEQ.ID.No.258)；D247-AH1(SEQ.ID.No.252)

16 D128-AB7(SEQ.ID.No.186)；D243-AA2(SEQ.ID.No. 248)；D125-AF11(SEQ.ID.No.228)

17 D284-AH5(SEQ.ID.No.298)；D110-AF12(SEQ.ID.No.176)

18 D221-BB8(SEQ.ID.No.234)

19 D222-BH4(SEQ.ID.No.236)

20 D134-AE11(SEQ.ID.No.230)

21 D109-AH8(SEQ.ID.No.174)

22 D136-AF4(SEQ.ID.No.278)

23 D237-AD1(SEQ.ID.No.226)

24 D112-AA5(SEQ.ID.No.178)

25 D283-AC1(SEQ.ID.No.272)

根据靠近羧基末端的UXXRXXZ p450结构域和GXRXC p450结构域 之间高度保守的氨基酸同源性进一步将这些全长基因分组。如图3所示， 比对各克隆保守结构域彼此之间的序列同源性，并将这些克隆分到不同的 同源性组群中。在几种情况下，虽然某克隆的核酸序列是不同的，但该区 域的氨基酸序列是相同的。氨基酸同一性为90％或更大的那些序列观察到 优选的分组，更优选的分组具有95％氨基酸同一性或更大，最优选的分组 具有氨基酸同一性为99％或更大的那些序列。最终的分组类似于根据这些 克隆的完整氨基酸序列的同一性百分比而做的分组，第17组除外(表III)， 它被分为2个不同的组。

在表IV用于氨基酸同一性的参数范围内，发现3个组群与已知烟草基 因具有90％或更大的同一性。第5组的成员与先前Ralston等提交的 GenBank序列GI：14423326(或AAK62346)具有高达93.4％的全长序列氨基 酸同一性。第23组与Ralston等提交的GI：14423328(或AAK62347)有高达 91.8％的氨基酸同一性。第24组与Ralston等提交的GI：14423318(或 AAK62342)有98.8％的同一性。

表IV：烟草p450基因保守结构域之间区域的氨基酸序列同一性组群

11 D208-AD9(SEQ.ID.No.224)；D120-AH4(SEQ.ID.No.180)； D121-AA8(SEQ.ID.No.182)，D122-AF10(SEQ.ID.No.184)； D103-AH3(SEQ.ID.No.222)；D208-AC8(SEQ.ID.No.218)； D-235-ABI(SEQ.ID.No.246)

2 D244-AD4(SEQ.ID.No.250)；D244-AB6(SEQ.ID.No.274)； D285-AA8；D285-AB9；D268-AE2(SEQ.ID.No.270)

3 D100A-AC3(SEQ.ID.No.168)；D100A-BE2

4 D205-BE9(SEQ.ID.No.276)；D205-BG9(SEQ.ID.No.202)； D205-AH4(SEQ.ID.No.294)

5 D259-AB9(SEQ.ID.No.260)；D257-AE4(SEQ.ID.No.268)； D147-AD3(SEQ.ID.No.194)

6 D249-AE8(SEQ.ID.No.256)；D-248-AA6(SEQ.ID.No.254)

7 D233-AG7(SEQ.ID.No.266；D224-BD11(SEQ.ID.No.240)；DAF10

8 D105-AD6(SEQ.ID.No.172)；D215-AB5(SEQ.ID.No. 220)；D135-AE1(SEQ.ID.No.190)

9 D87A-AF3(SEQ.ID.No.216)，D210-BD4(SEQ.ID.No.262)

10 D89-AB1(SEQ.ID.No.150)；D89-AD2(SEQ.ID.No.152)；163-AG11 (SEQ.ID.No.198)；163-AF12(SEQ.ID.No.196)

11 D267-AF10(SEQ.ID.No.296)；D96-AC2(SEQ.ID.No.160)； D96-AB6(SEQ.ID.No.158)；D207-AA5(SEQ.ID.No.204)； D207-AB4(SEQ.ID.No.206)；D207-AC4(SEQ.ID.No.208)

12 D98-AG1(SEQ.ID.No.164)；D98-AA1(SEQ.ID.No.162)

13 D209-AA12(SEQ.ID.No.212)；D209-AA11；D209-AH10(SEQ.ID. No.214)；D209-AH12(SEQ.ID.No.232)；D90a-BB3(SEQ.ID.No. 154)

14 D129-AD10(SEQ.ID.No.188)；D104A-AE8(SEQ.ID.No.170)

15 D228-AH8(SEQ.ID.No.244)；D228-AD7(SEQ.ID.No.241)， D250-AC11(SEQ.ID.No.258)；D247-AH1(SEQ.ID.No.252)

16 D128-AB7(SEQ.ID.No.186)；D243-AA2(SEQ.ID.No.248)；D125-AF11 (SEQ.ID.No.228)

17 D284-AH5(SEQ.ID.No.298)；D110-AF12(SEQ.ID.No.176)

18 D221-BB8(SEQ.ID.No.234)

19 D222-BH4(SEQ.ID.No.236)

20 D134-AE11(SEQ.ID.No.230)

21 D109-AH8(SEQ.ID.No.174)

22 D136-AF4(SEQ.ID.No.278)

23 D237-AD1(SEQ.ID.No.226)

24 D112-AA5(SEQ.ID.No.178)

25 D283-AC1(SEQ.ID.No.272)

26 D110-AF12(SEQ.ID.No.176)

实施例12：缺少一个或多个烟草细胞色素p450特异性结构域的烟草细胞色 素p450克隆

4个克隆与表III报道的其它烟草细胞色素基因具有高度的核酸同源 性，核酸同源性介于90％至99％之间。这4个克隆包括D136-AD5、 D138-AD12、D243-AB3和D250-AC11。然而，因为核苷酸移码框的原因， 这些基因不含有细胞色素p450C-末端的3个结构域中的一个或多个，因此 排除在表III和IV所示的同一性组群之外。

有一个克隆，D95-AG1的氨基酸同一性不含有第3个结构域GXRXC， 该结构域用来对表III或表IV中的p450烟草基因分组。该克隆的核酸同源 性与其它烟草细胞色素基因的同源性低。该克隆代表了烟草中细胞色素 p450基因的一个新的、不同的组群。

实施例13：烟草细胞色素p450片段和克隆在改变烟草性质调控方面的应用

烟草p450核酸片段或整个基因可用于鉴定和选择烟草表型或组成有所 改变的植株，更重要的是，可用于鉴定和选择代谢物发生了变化的植株。 用例如以反义方向(用于下调)或有义方向(用于上调)将掺入选自本文 所述的核酸片段或全长基因的多种转化系统来产生转基因烟草植物。对于 全长基因的过量表达，编码本文所述全长基因的完整或功能性部分或氨基 酸序列的任何核酸序列都是理想的，它们可有效增加某个酶的表达并因此 在烟草中产生表型效果。通过一系列的回交获得纯合烟草品系，并评价其 表型变化，包括但不限于，用本领域一般技术人员可获得的常用技术来分 析内源性p450RNA、转录物、p450表达的肽和植物代谢物的浓度。

烟草植物中表现出来的变化提供了感兴趣的所选基因的功能性作用的 信息，或者可用作优选的烟草植物品种。

实施例14：鉴定乙烯处理的转化株品系中诱导的基因

采用高密度寡核苷酸阵列技术，Affymetrix基因芯片(GeneChip) (Affymetrix Inc.，Santa Clara，CA)阵列来进行基因表达的定量和高度平行性 检测。在使用该技术时，通过在固体表面上直接合成寡核苷酸来制作核酸 阵列。这种固相化学能够产生含有数十万个寡核苷酸探针的阵列，这些寡 核苷酸探针以极高的密度压缩在芯片上，这种芯片称为GeneChip。可由 一个杂交同时筛选几千个基因。每个基因通常由一组的11-25对探针来代 表，这取决于基因的大小。设计探针以使其具有最大的敏感性、特异性和 可重复性，从而使其总是可以分辨出特异性和背景信号以及密切相关的靶 序列。

Affymetrix基因芯片杂交试验包括下列步骤：设计和制备阵列，从分离 自生物样品的RNA中制备荧光标记的靶，标记的靶与基因芯片杂交，筛选 芯片，分析扫描的图像，产生基因表达谱。

A.Affymetrix基因芯片的设计和定制

定制Affymetrix Inc.(Santa Clara，CA)生产的GeneChip CustomExpress Advantage Array。芯片的大小是18微米，芯片的格式是100-2187，可容纳 528组探针(11,628个探针)。除了来自GenBank的核酸序列之外，所有 序列都选自我们之前鉴定出的烟草克隆，所有探针都是定制设计的。共选 择了400个烟草基因或片段包括在基因芯片中。所选择的寡核苷酸的序列 是基于基因3’末端的独特区域。所选择的核酸序列由如(本专利申请)所 述从烟草中克隆的56个全长p450基因和71个p450片段组成。其它烟草 序列包括270个烟草EST，用Clontech SSH试剂盒(BD Biosciences，Palo Alto，CA)从抑制差减文库产生了这些EST。在这些基因中，一些寡核苷酸 序列选自GenBank所列的细胞色素p450基因。多达25个探针用于每个全 长基因，11个探针用于每个片段。因为缺乏独特的、高质量的探针，有些 克隆所用的探针数目要少。GeneChip中也包括了合适的对照序列。

探针阵列是25聚寡核苷酸，用基于半导体的光刻蚀法结合固相化学合 成技术将这些寡核苷酸直接合成到玻璃片上。各阵列含有多达100,000个不 同的寡核苷酸探针。因为寡核苷酸探针合成在阵列中已知的位置上，所以 可用Affymetrix Microarray Suite软件将杂交模式和信号强度解释为基因 同一性和相对表达水平。各探针对由一个完全配对的寡核苷酸和一个错配 的寡核苷酸组成。完全配对的探针具有与特定基因准确互补的序列，因此 可检测该基因的表达。错配探针在其碱基的中心位置有一个碱基置换，因 此区别于完全配对的探针，所述的一个碱基置换干扰了靶基因转录物的结 合。错配产生非特异性的杂交信号或背景信号，将该信号与完全配对的寡 核苷酸检测到的信号比较。

B.样品制备

杂交试验由Genome Explorations，Inc.(Memphis，TN)进行，杂交中所用 的RNA样品由6对受乙烯诱导的非转化株/转化株等基因系组成。

这些样品包括1对4407-25/4407-33未处理的白肋烟草样品，3对乙烯 处理的4407-25/4407-33样品，1对乙烯处理的深色烟草NL Madole/181和 1对乙烯处理的白肋变种PBLB01/178。乙烯处理如实施例1所述。

用改良的酸酚和氯仿方法从上述乙烯处理和未处理的叶片中提取总 RNA。改良的方法是用1克组织进行研磨，随后在5毫升加入了5毫升苯 酚(pH5.5)和5毫升氯仿的提取缓冲液(100mM Tris-HCl，pH8.5；200mM NaCl；10mM EDTA；0.5％SDS)中涡旋。将提取的样品离心，保留上清。 该提取步骤再重复2-3次直到上清变得澄清。加入约5毫升氯仿以除去痕 量的苯酚。加入3倍体积的ETOH和1/10体积的3M NaOAc(pH5.2)以从混 合的上清组分中沉淀RNA，在-20℃存贮1小时。转移到Corex玻璃容器中 以后，在4℃9,000RPM离心RNA组分45分钟。离心下来的团块用70％ 乙醇洗涤，4℃9,000RPM离心5分钟。团块干燥以后，将RNA团块溶解 在0.5毫升不含Rnase的水中。RNA团块溶解在0.5毫升不含Rnase的水中。 分别用变性甲醛凝胶和分光光度计分析总RNA的质量和数量。3-5μg/μl 的总RNA样品送至Genome explorations，inc.进行杂交试验。

C.杂交、检测和数据输出

如下所述制备标记的RNA材料。按生产商的方法用SuperScript双链 cDNA合成试剂盒(Gibco Life Technologies)和寡-dT24-T7(5′-GGC CAG TGA ATT GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGG CGG-3′)引物从5-15 μg总RNA中合成第一链和第二链cDNA。

T7启动子连接的双链cDNA作为模板，用T7RNA转录物标记试剂盒 (ENZO Diagnostics Inc.)通过体外转录同时合成并用生物素化的UTP和CTP 来标记cRNA。简言之，用70％乙醇洗涤前述步骤中合成的双链cDNA， 重新悬浮在22μl不含RNA酶的水中。cDNA与下列物质一起37℃温育5 小时：10X的反应缓冲液、生物素标记的核糖核苷酸、DTT、RNA酶抑制 剂混合物各4μl，以及2μl 20×T7 RNA多聚酶。经过CHROMA SPIN-100 柱(Clontech)并在-20℃沉淀1小时至过夜，将标记上的RNA与未掺入的核 糖核苷酸分离。

如下所述进行寡核苷酸阵列杂交和分析。将RNA团块重新悬浮在10 μl不含RNA酶的水中，10.0μg在200mM Tris-乙酸，pH8.1，500mM KOAc，150mM MgOAc中95℃下用热和离子介导的水解片段化35分钟。 片段化的cRNA与HG U95Av2寡核苷酸阵列(Affymetrix)45℃杂交16小 时，该寡核苷酸阵列上含有约12,500个经注释的全长基因以及设计用于代 表EST序列的其它探针组。用6×SSPE(0.9M NaCl，60mM NaH2PO4，6mM EDTA+0.01％ Tween 20)25℃下洗涤阵列，然后50℃下用100mM MES、 0.1M[Na+]、0.01％ Tween 20进行严格条件下的洗涤。以藻红素 (phycoerythrein)偶联的链霉亲和素(Molecular Probes)对阵列染色，用激光 共聚焦扫描仪(Hewlett-Packard)来测定荧光强度。用Microarray软件 (Affymetrix)分析扫描的图像。对于所用的所有阵列，通过将某阵列上所有 基因的平均荧光强度校正(scaling)到恒定的目标强度(250)来使上样和 染色中的差异标准化。按用户指南用Microarray Suite 5.0(Affymetrix)进行 数据分析。各基因的信号强度计算为平均强度差异，以[∑(PM-MM)/(探针 对的数目)]代表，其中PM和MM标示完全配对和错配的探针。

D.数据分析和结果

Genome Explorations的检测仪器产生的表达报告证实，12组杂交是成 功的。该报告上主要的参数包括噪音、校正因子、背景、总探针组、存在 和不存在的探针组的数目和百分比、管家基因对照的信号强度。然后，用 GCOS结合其它Microsoft的软件来分析和表示数据。分析了处理的各对之 间的信号对比。经过不同处理的基因和片段所对应的各探针的总体数据被 编译，分析编译的表达数据，如变化呼叫(call of the changes)和信号LOG 2比例变化。

基因芯片技术的一个常规用途是发现在不同组织中有差异性表达的基 因。在本发明中，通过成对的转化株和非转化株烟草品系，包括4407- 25/4407-33白肋变种、PBLB0l/178白肋变种和NL Madole/181深色烟草变 种，测定了乙烯处理引起的遗传表达变化。这些分析只检测由于生物学变 化而使其表达发生了显著改变的那些基因。这些分析采用了倍数(Fold) 变化(信号比率)作为鉴定受诱导基因的重要标准。还考虑了其它参数， 如信号密度、存在/不存在呼叫。

在分析了转化株和非转化株样品对中约400个基因表达差异的数据之 后，基于信号强度的结果说明，与非转化株品系相比，只有两个基因 D121-AA8和D120-AH4在转化株品系中可重复地被乙烯处理所诱导。如下 所述表示这些数据，以说明这些基因的差异性表达。如表V所示，在转化 株品系，例如白肋烟草变种4407-33中，某基因的信号测定为与相关的非 转化株等基因品系4407-25的比率。在没有乙烯诱导时，对于所有基因， 转化株与非转化株信号的比率都接近于1.00。用3种独立的分析方法对等 基因白肋品系的分析证明，受乙烯诱导时，相对于非转化株品系，两个基 因D121-AA8和D120-AH4在转化株品系中受到诱导。这些基因是彼此高 度同源的，约有99.8％或更大的核酸序列同源性。如表V所示，它们在转 化株品系中的相对杂交信号约比相应的非转化株品系中高2-12倍。相比较 的，根据两个肌动蛋白样对照克隆(内部对照)标准化的比例，没有发现 它们在转化株品系中受诱导。此外，片段D35-BG11(其编码区的序列完全 包含在D121-AA8和D120-AH4基因中)在成对的等基因转化株和非转化 株品系的相同样品中被高水平诱导。白肋烟草变种的另一个等基因对， PBLB01和178被显示具有相同的基因D121-AA8和D120-AH4，乙烯处理 时在转化株中受诱导。此外，D121-AA8和D120-AH4基因优先在等基因深 色烟草对NL Madole和181的转化株品系中受诱导，证明这些基因在转化 株品系中的乙烯诱导不限于白肋烟草变种。在所有情况下，相对于相应的 非转化株品系，D35-BG11片段在转化株品系中都是受诱导最高的一个。

表V：乙烯处理的转化株和非转化株品系中克隆诱导的比较  克隆   未处理   乙烯处理的白   肋试验1   乙烯处理的白   肋试验2   乙烯处理的白   肋试验3   乙烯处理的   深色烟草  受诱导   33∶25   比率   33∶25 乙烯无   比率   比率   33∶25  乙烯无   比率    比率   33∶25 乙烯无   比率   比率   33∶25 乙烯无   比率   比率  D121-AA8  D120-AH4   1.03   1.44   2.20   2.14   2.74   1.90   13.25   12.90   18.33   12.74   5.31   5.15   4.13   2.87   17.06  16.60   11.76  8.17  对照  肌动蛋白样I  肌动蛋白样I   1.18   1.09   1.17   0.99   1.23   1.12   0.88    0.74   0.89    0.81   0.86   0.73   1.18   0.11   1.20   1.02   1.02   0.93

实施例15：克隆相关的D35-BG11全长基因

基因芯片杂交基于3′反转录(cRNA)。选自基因3′端(在下游1000个核 苷酸的区域中)的探针在基因芯片上合成。因此，为了获得D121-AA8和 D120-AH4克隆的所有可能的变化形式，用5′序列从烟草cDNA文库中进行 了另外的克隆。

全长基因克隆自如实施例5所述从乙烯处理的4407-33组织中构建的 cDNA文库。采用如下所述的聚合酶链式反应法。基于D121-AA8基因的 3′序列(包括非翻译区部分)设计反向引物。D121-P2引物5′-AGC AAG ATG ATC TTA GGT TTTAA-3′和D121-R-2引物5′-CAA GCA AGA TGA TCT TAG GTT TTA ATA AAG CTC AGGT-3′。T3引物(5′CAA TTA ACC CTC ACTAAA GGG 3′)位于质粒上插入片段的上游，用作正向引物。产生的PCR 产物进行琼脂糖电泳，切下高分子量的相应条带，纯化、克隆并测序。用 于克隆和测序的方法如实施例4所述。测序和鉴定了9个新的克隆，它们 是D425-AB10、D425-AB11、D425-AC9、D425-AC10、D425-AC11、 D425-AG11、D425-AH7、D425-AH11和D427-AA5。观察到这些克隆中的 每一个都与克隆D121-AA8和D120-AH4具有99％或更大的核酸序列同一 性。

实施例16：烟草转化株品系中微粒体烟碱去甲基酶的乙烯诱导

如下所述，对乙烯处理和非处理的成对的转化株和非转化株中富含微 粒体的组分中去甲基酶的酶活进行生化分析。

A.微粒体的制备

在4℃分离微粒体。在由50mM N-(2-羟基乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸) (HEPES)，pH7.5，3mM DL-二硫苏糖醇(DTT)和蛋白酶抑制剂Cocktail (Roche)(1片/50毫升)组成的缓冲液中提取烟草叶片。粗提物通过4层 粗棉布(cheesecloth)过滤以除去未打碎的组织，滤出液20,000xg离心20 分钟以除去细胞碎片。将上清以100,000xg超离心60分钟，得到的上清即 含有微粒体。将微粒体组分悬浮在提取缓冲液中，进行超离心步骤，其中 提取缓冲液中采用0.5M的不连续蔗糖梯度。将纯化的微粒体重新悬浮在添 加了10％(w/v)甘油作为低温保护剂的提取缓冲液中。将此微粒体制品存贮 在液氮冷藏罐中直到使用。

B.蛋白浓度测定

用溶解在丙酮中的10％三氯乙酸(TCA)(w/v)沉淀微粒体蛋白，用RC DC蛋白检测试剂盒(BIO-RAD)按生产商的方法测定微粒体的蛋白浓度。

3.烟碱去甲基酶活性试验

DL-烟碱(吡咯烷-2-14C)获得自Moravek Biochemicals，比活为54 mCi/mmol。氯丙嗪(CPZ)和氧化的细胞色素(Cyt.C)(二者均为P450抑 制剂)购自Sigma。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐(NADPH)是细胞 色素P450的典型电子供体，它通过NADPH：细胞色素P450还原酶供应电 子。在对照组的温育中去掉了NADPH。常规的酶活试验由微粒体蛋白(约 2mg/ml)、6mM NADPH、55μM14C标记的烟碱组成。CPZ和Cyt.C的 使用浓度分别是1mM和100μM。反应在25℃进行1小时，加入300μl 甲醇到各25μl反应混合物中终止反应。离心后，用Inertsil ODS-33p(150× 4.6mm)柱(Varian)以反相高效液相色谱(HPLC)系统(Agilent)分离20μl 的甲醇提取物。等梯度(isocratic)流动相是甲醇、50mM磷酸钾缓冲液(pH6. 25)的混合物，其中二者的比例为60∶40(v/v)，流速为1毫升/分钟。通过 与真正的未标记的降烟碱的峰进行比较，收集降烟碱的峰，用2900tri-carb Liquid Scintillation Counter(LSC)(Perkin Elmer)进行定量。基于1小时温育 中产生的14C标记的降烟碱来计算烟碱去甲基酶的活性。

从乙烯处理和未处理的成对的白肋转化株(4407-33品系)和非转化株 (4407-25品系)烟草品系获得样品。所有未处理的样品都没有任何可检测 到的微粒体烟碱去甲基酶活性。相反，发现从乙烯处理的转化株品系获得 的微粒体样品中含有大量的烟碱去甲基酶活性。已显示，烟碱去甲基酶受 P450特异性抑制剂的抑制，证明该去甲基酶活性与P450微粒体来源的酶 一致。

表VI显示了从白肋转化株烟草品系中获得的一组典型的酶活结果。相 反的是，从乙烯处理的非转化株烟草中获得的样品不含有任何烟碱去甲基 酶活性。这些结果证明，在转化株品系中烟碱去甲基酶受乙烯处理的诱导， 但在相应的等基因非转化株品系中不受诱导。对于成对的等基因深色烟草 品系获得了类似的结果，其中在转化株品系中微粒体烟碱去甲基酶活性被 诱导，但在相应的非转化株品系中未检测到该酶被诱导。这些结果都证明 了，微粒体烟碱去甲基酶在转化株品系中受乙烯处理的诱导，但在相应的 等基因非转化株品系中不受诱导。那些衍生自P450基因并且优先在转化株 品系(相对于相应的非转化株品系)中被诱导的基因是编码烟碱去甲基酶 的候选基因。

表VI：乙烯诱导的白肋转化株和非转化株品系中的去甲基酶活性   样品   微粒体   微粒体+   1mM氯丙   嗪   微粒体+   100μM细   胞色素C   微粒体+   NADPH   转化株   0.6±0.05   pkat/mg   0.01±0.01   pkat/mg   0.03±0.05   pkat/mg   0.03±0.04   pkat/mg   非转化株   未检测到   未检测到   未检测到   未检测到

考虑到本发明前面的详细描述，预期在本发明的实施中本领域技术人 员可进行很多改进和变化。因此，这些改进和变化都包括在下面权利要求 的范围内。