植物致病病毒导致全球农业鲜产品的重大损失。现代农业实践，包括 大地区种植单一植物和常年对鲜产品的需求导致的温室面积的增大，使病 毒传播和总损失增加的问题加重了。
过去人们成功的运用传统育种程序生产了抗病毒感染的植株。然而， 这些育种程序都依赖于抗病的自然资源，这些资源并非总能得到。比如， 全世界每年葫芦科植物都因小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)而受严重损害。 这种病毒通过叶蚜虫从一棵植物传到另一棵，杀虫剂不能有效地阻止这种 病毒的传播。而且，已经发现的抗病资源有限。
Powell-Abel等(Powell-Abel等，1986.Science 232：738-743)首次说明 转化并表达烟草花叶病毒(TMV)外壳蛋白(CP)基因的植株对TMV有 抗性。其后，指示用15种分类群中至少25种病毒获得了病毒外壳蛋白介 导的抗性，包括苜蓿花叶病毒，烟草脆裂病毒、马铃薯病毒X、黄瓜花叶 病毒(CMV)、马铃薯Y病毒及用马铃薯病毒X和马铃薯病毒Y两种病 毒外壳蛋白转化的植株。
通常，CP-介导的抗性与RNA-介导的抗性相比，对较大范围的病毒 菌株有效，但一般效果要差些，即，病毒RNA片段的在前者中的表达不 能翻译为具抗性的蛋白。举例说来，美国专利No.6,649,813揭示病毒诱 导的抗性会从植株的一代传到下一代，这种转基因植株包含取自病毒基因 组的复制酶部分的通读部分的编码序列，对病毒造成的随后的病害有抗 性。特别的描述了来自烟草花叶病毒(TMV)的54kDa编码序列的作用。 复制酶介导的抗性局限于具有高度序列同源性的菌株，不受这种具挑战性 的病毒的滴度的影响，和转基因表达水平不相关。
转录后基因沉默(PTGS)是一种序列特异保护机制，能同时靶向细 胞和病毒的mRNA，作为使基因表达失活的工具被广泛运用。已知PTGS 在植物中发生，然而一个接近的相关的现象，RNA干扰(RNAi)，已知 它在大范围的其他的有机体中发生(Baulcombe，D.2000.Science， 290：1108-1109)。已有结果指示RNA干扰发生在，例如线虫、粗糙脉孢 菌、黑腹果蝇和哺乳动物中。此外，转基因和病毒被揭示在植物中诱导基 因沉默，现在人们相信PTGS是一种抵抗病毒积累的天然防御机制 (Hamilton A.and Baulcombe，D.1999.Science 286：950-952；Matzke等， 2001.Curr.Opin.Genet.Dev.11：221-227)。
对于许多的植物RNA病毒来说，病毒诱导基因沉默(VIGS)被很好 的证实了。这个过程开始于双链的RNA(dsRNA)分子。dsRNA分子可 能由病毒RNA复制中间产物或者异常的转基因编码的RNA通过RNA- 依赖的RNA聚合酶活性变成dsRNA。一种属于核糖核酸酶III家族的酶将 dsRNA裂解成通常大小范围在21到26个核苷酸的短的干扰RNA (siRNA)。人们相信siRNA接着通过形成一个多成分的破坏同源mRNA 的多成分核酸酶复合体RISC(RNA诱导的沉默复合体)促进mRNA的降 解。自从发现了siRNA，基于这一机制的方法被用于使特殊靶基因沉默， 作为一个研究工具去揭示基因的功能和用于阻止不希望要的基因的表达。
WO 99/61631运用有义和反义RNA的基因片段揭露了改变植物靶基 因表达的方法。这些有义和反义的RNA片段能够配对并形成RNA双链 分子，因此改变基因的表达。
WO 99/53050揭示了在真核细胞中，特别是在植物细胞中减少感兴趣 的核酸的表型表达的方法和手段，其通过引入编码导向靶核酸的有义和反 义RNA分子的融合基因，能够通过区域与有义和反义核酸序列间的碱基 配对或者通过引入RNA分子本身形成双链RNA区域。
WO 00/68374涉及运用有义和反义RNA基因片段改变病毒基因在细 胞中的表达的方法。这些有义和反义RNA片段能够配对并形成双链RNA 分子，因此改变基因的表达。该发明还涉及运用该发明的方法获得的细胞、 植物或者动物，其优选地抵抗或者耐受病毒。
WO 2004/009779揭示包含前体RNA的构建体是为了RNA前体的表 达的组成。这种前体RNA构建体包括一个在植物细胞中表达的驱动一种 具微小RNA的前体RNA的表达的启动子。这种微小RNA是一部分靶基 因或者核苷酸序列的互补或者部分的互补，具调节靶序列或基因的表达的 功能。如此，这种RNA前体构建体可被设计去调节感兴趣的基因的任何 核苷酸序列的表达，任一内源植物基因或者可选择的一种转基因。
嫁接是一种农民和园丁们使用的将砧木和幼芽的想得到的品质结合 的古老的技术。在过去，嫁接主要用于多年生的植物，特别是草本植物和 树木。现在，这一技术也用于一年生植物，并且由砧木和幼芽组成的嫁接 的植物苗的百分率不断地增加。Smirnov等(Smirnov等，1997.Plant Physiol. 114：1113-1121)运用嫁接技术将野生型烟草植株和表达美洲商陆抗病毒蛋 白的转基因烟草植株嫁接。他们证明了抗病毒蛋白在嫁接植株的转基因砧 木中的表达诱导野生型幼芽对病毒感染的抗性。然而，抗性是依赖于美洲 商陆抗病毒蛋白的酶活性。
至今，生产抗病菌感染的植株的企图主要集中在使用转化方法来合并 抗性相关性状到植物基因组。然而，通过转基因植株获得的农产品在许多 国家不受欢迎。二者择一地，嫁接技术被运用。虽然已表明有抗某种疾病 的砧木的运用，这些嫁接幼芽易因病菌的传播而感病。
这样，存在一个公认的需要，而且高度有利的是具有对病菌，特别是 对病毒的抗性的植株，其中农产品由植株未受遗传修饰的部分生产。
发明概要
本发明提供包括转基因抗病毒砧木和易感病幼芽的嫁接植株，其中整 个植株对病毒病有抗性。本发明的植株可为多年生或一年生。本发明还提 供生产嫁接抗病植株的组成和方法。病毒抗性的特性依赖于用于生产这种 特别的植株的组成的特殊的特征。根据某些方面，本发明提供受保护不受 土传病毒侵害的嫁接植株。根据其他方面，本发明的植株抗由病毒导致的 叶的感染。
本发明的植株可以通过各种嫁接类型产生；当幼芽生产想得到的农产 品的时候，代表性地应用嫁接的方法。有利地，因为砧木只是植株的转基 因的部分，由本发明的植株生产的农产品没有被遗传修饰。
不希望受任何特别的理论或者机制的约束，本发明的植株对病毒病的 抗性可能归功于给予转基因砧木的RNA-介导的抗病毒性，这种砧木将抗 性授予嫁接的易感病幼芽。
这样，根据一方面，本发明提供一种植株，其包括抗病毒病的而不同 于表达抗病毒蛋白的手段的转基因砧木和对病毒病易感的幼芽，其中嫁接 植株抗所述的病毒病。
根据各种实施方案，本发明提供通过转基因砧木授予给嫁接幼芽的病 毒抗性，这种砧木表达选自编码病毒蛋白或者其部分和siRNA的序列的 一种核酸序列转录产物。这样，根据某些实施方案，抗病毒的转基因砧木 包含核酸序列，其至少90％相同于病毒基因组的至少一个片段。根据另外 的实施方案，抗病毒感染的转基因砧木包含DNA构建体，其被设计成产 生靶向病毒基因组的至少一个片段的siRNA。
就如在这里用到的，术语“片段”指的是从由病毒基因组编码区、非编 码区、其部分和其组合物组成的组中挑选出的核酸序列。
根据一个实施方案，具有与至少一个病毒基因组片段至少90％相同性 的核酸序列编码一种蛋白或者其部分。根据另一个实施方案，核酸序列编 码一种蛋白，其从由外壳蛋白、重复蛋白、运动蛋白或者其部分组成的组 中选出。根据一个实施方案，转基因砧木含核酸序列，其为病毒基因组复 制酶部分的片段。
根据另一个实施方案，转基因砧木含核酸序列，其编码一个推定的为 黄瓜果实斑驳花叶病毒(CFMMV)的复制蛋白的54kDa的蛋白质。根据 一个现在优选的实施方案，转基因砧木包括具有在序列ID NO：1中提出的 序列的核酸序列。
还根据另一个实施方案，被设计以产生靶向病毒基因组的至少一个片 段的siRNA的DNA构建体包括：
(a)可操作地连接的至少一种植物的可表达启动子；
(b)编码形成至少一个双链RNA的RNA序列的核酸序列，其中双 链RNA分子包含：具有与病毒基因组的靶片段的有义核苷酸序列至少 90％序列相同性的至少20个邻近的核苷酸的第一核苷酸序列；具有与所 述的病毒基因组的所述靶片段的有义核苷酸序列的互补序列至少90％相 同性的至少20个邻近的核苷酸的第二核苷酸序列；并且视需要
(c)转录终止信号。
根据一个优选的实施方案，被设计以产生靶向病毒基因组的至少一 个片段的siRNA的DNA构建体包括：
(a)可操作地连接的至少一种植物的可表达启动子；
(b)编码形成茎环形式的至少一个RNA双链的RNA序列的核酸序 列，其中双链RNA分子包括：具有与病毒基因组的靶片段的有义核苷酸 序列至少90％相同性的至少20个邻近核苷酸的第一核苷酸序列；具有与 所述病毒基因组的所述靶片段的有义核苷酸序列互补序列至少90％相同 性的至少20个邻近核苷酸的第二核苷酸序列；间隔序列；并且视需要，
(c)转录终止信号。
应了解的是本发明的实施不受任何特殊的DNA构建体的限制，倘若 构建体被设计以引导植物细胞内siRNA的发生，其中siRNA靶向到病毒 基因组的至少一个片段。根据某些实施方案，构建体包括编码形成至少一 个双链RNA分子的RNA序列的核酸序列，其中双链RNA分子介导病毒 靶序列的裂解。DNA构建体可能被设计以各种方式形成双链RNA分子。 而且应了解，虽然本发明用产生siRNA的构建体来实施，而且以产生植 物细胞中siRNA的技术的任何已知的方法也被包含在本发明的范围。
已揭示以前已经有将siRNA作为一种手段来裂解植物细胞中病毒基 因组的片段的运用。也已表明当染色体基因(无论内源还是异源基因)在 砧木中沉默时，沉默的砧木转移沉默到表达相应染色体基因的靶幼芽上。 然而，本发明令人惊讶地揭示转化具产生靶向致病病毒的至少一个片段的 siRNA的构建体的砧木，将抗性授予嫁接幼芽，其对病毒造成的感染敏感。
根据一些实施方案，第一和第二核苷酸序列可操作地连接到相同的启 动子。在其他的实施方案中，第一和第二核苷酸序列各自可操作地连接到 单独的启动子，其中这些单独的启动子可能相同或者不同。
根据一个实施方案，第一核苷酸序列包括与病毒基因组的至少一个片 段的有义核苷酸序列至少95％，优选地100％地相同的至少20个邻近核苷 酸的序列。根据另外的实施方案，第二核苷酸序列包括与病毒基因组至少 一个片段的有义核苷酸序列的互补序列至少95％，优选地100％地相同的 至少20个邻近核苷酸的序列。
没有对可运用的第一和第二核苷酸序列长度的上限，因而本发明的构 建体可包括不同长度的核苷酸序列，包括从大约20个核苷酸到靶RNA的 全长。更优选地，根据本发明，第一和第二核苷的长度为大约1,000个核 苷酸的长度。根据另一个实施方案，第一和第二核苷酸的长度为约22个 核苷酸的长度。
根据一个优选的实施方案，第一核苷酸序列包括具有与序列ID NO：2 中阐明的核苷酸序列或其片段90％，优选地95％，更优选100％地相同的 核苷酸序列。根据另一个现在优选的实施方案，第二核苷酸序列包括具有 与序列ID NO：2中阐明的核苷酸序列或其片段的互补序列90％，优选地 95％，更优选100％地相同的核苷酸序列。
根据一个实施方案，抑制性RNA分子的结构包括相对于第一和第二 核苷酸序列更多的结构：间隔序列，这样双链RNA以茎环RNA的形式 存在(发夹RNA，hpRNA)。在一个优选的实施方案中，间隔序列的长 度是第一和第二核苷酸长度的1/5到1/10。
根据某些实施方案，间隔序列包括源于增强siRNA产量的基因内含 子的核苷酸序列。根据一个实施方案，间隔序列包括包含来自蓖麻子过氧 化氢酶基因的内含子的核苷酸序列，具有序列ID NO：3中阐明的序列。
视需要，编码siRNA的构建体可包含转录终止信号。根据一个实施 方案，转录终止信号是NOS终止子。
根据某些实施方案，将抗性授予嫁接幼芽的核苷酸序列，更进一步地 包括植物细胞中核酸序列表达的调控因子。表达控制因子选自包括启动 子、增强子、转录因子、剪切信号和终止序列的组。根据一个实施方案， 启动子是组成型启动子。根据一个现在优选的实施方案，组成型启动子是 草莓镶脉病毒的启动子。根据另一个实施方案，启动子是组织特异性的启 动子。
根据其他的实施方案，用具有与病毒基因组至少片段90％相同性的核 酸序列转化的转基因砧木对由土传病害导致的病害有抗性。根据一个实施 方案，包含这样的转基因砧木的转基因植株被保护而不受选自包含线虫传 播的病毒、真菌传播的病毒、通过根部伤口传播的病毒和通过不明载体传 播的病毒的组的一种土传病害的侵害。
根据一种实施方案，线虫传播的病毒选自但不限于线虫传多面体病毒 属病毒(nepoviruse)：南芥菜花叶病毒、葡萄扇叶病毒、番茄黑环斑病毒、 树莓环斑病毒、番茄环斑病毒和烟草环斑病毒；烟草脆裂病毒属病毒：豌 豆早褐病毒、烟草脆裂病毒、辣椒环斑病毒。
根据另一种方案，真菌传播病毒选自一组病毒，包括但不限于：黄瓜 叶斑病毒、黄瓜坏死病毒、甜瓜坏死斑点病毒、红三叶草坏死花叶病毒、 南瓜坏死病毒、烟草坏死卫星病毒、莴苣巨脉病毒、辣椒黄脉病毒、甜菜 坏死黄脉病毒、甜菜土传病毒、燕麦金色条纹病毒、花生丛簇病毒、马铃 薯帚顶病毒、水稻条纹坏死病毒、土传小麦花叶病毒、大麦和性花叶病毒、 大麦黄花叶病毒、燕麦花叶病毒、水稻坏死花叶病毒、小麦梭条斑花叶病 毒和小麦黄花叶病毒。
根据另一个实施方案，通过根部伤口传播的病毒选自一组由烟草花叶 属病毒组成但不限于其的病毒：烟草花叶病毒、番茄花叶病毒、黄瓜绿斑 驳花叶病毒、黄瓜果实斑驳花叶病毒、Kyuri绿斑驳花叶病毒、齿兰环斑 病毒、红辣椒轻斑驳病毒、辣椒轻斑驳病毒、长叶车前花叶病毒和烟草轻 绿花叶病毒。
仍根据另一个实施方案，通过不明途径传播的病毒选自一组病毒，其 包括但不局限于：豆瓣菜黄斑病毒、蚕豆坏死萎蔫病毒、桃纵簇病毒和甘 蔗褪绿条纹病毒。
根据一个实施方案，嫁接植株受保护而不被由一种烟草花叶病毒属的 土传病毒引起的一种病害的侵害。根据另一个实施方案，嫁接植株被保护 而不被烟草花叶病毒属病毒CFMMV引起的病害的侵害。还根据另一个 实施方案，嫁接植株选自葫芦科。
本发明首次表明利用嫁接技术将对土传病毒病菌抗性传给易感的植 株是可能的。将易感病幼芽嫁接到抗病砧木，其中抗病砧木包括具有与土 传病毒基因组至少一个片段至少90％相同性的核酸序列，将易感病的幼芽 变为受保护而不被土传病菌侵害。
根据其它的实施方案，包括包含被设计以产生靶向病毒基因组的至少 一个片段的siRNA的DNA构建体的转基因的抗病毒砧木和幼芽的嫁接植 株，可为植物的任何一个种。此外，可生产出对任何挑选出的病毒的表现 抗性的植株，其中对多种植物病毒的抗性也能得到。根据某些实施方案， 植株对从所述在此描述的组中挑选的土传病毒具抗性。根据其它的实施方 案，植株对一种通过侵害植株地上部分的载体传播的病毒有抗性。根据一 种实施方案，侵害植株地上部分的病毒属于一个病毒科，其选自以下组：
花椰菜花叶病毒科、双生病毒科、圆环病毒科、呼肠孤病毒科、 Tartitiviridae、雀麦花叶病毒科、豇豆花叶病毒科、马铃薯Y病毒科、番 茄丛矮病毒科、伴生病毒科、Clostroviridae和黄症病毒科。根据另一个实 施方案，病毒选自一组病毒，包括：烟草花叶病毒组、烟草脆裂病毒组、 马铃薯X病毒组、香石竹潜病毒属、葱X病毒属、线形病毒属、凹陷病 毒属、发状病毒属、葡萄病毒属、真菌传杆状病毒组、花生丛簇病毒属、 马铃薯帚顶病毒属、甜菜坏死黄脉病毒属、大麦条纹花叶病毒组、南方菜 豆花叶病毒组、玉米雷亚朵非纳病毒属、芜苓黄花叶病毒组、悬钩子病毒 属、Ourmivirus和幽影病毒属。
根据某些实施方案，包括包含被设计以产生siRNA的DNA构建体的 砧木的嫁接植株对来自马铃薯Y病毒科的植物病毒有抗性。在下面的描 述中，使用靶向包括外壳蛋白基因和3’端非编码区的小西葫芦黄花叶病毒 (ZYMV)基因组的3’端的siRNA将抗病毒性授予转基因烟草(Nicotiana benthamiana)砧木，进而授予烟草幼芽，被描述为根据本发明的更广泛的 技术的一个特殊的例子。
本发明中转化给砧木的核酸序列优选地进一步包括可选择的标记，因 而只有转基因植株可以萌芽和生长。此外或者另一选择为，报告基因可以 被整合到构建体中以便能够挑选表达报告基因的转基因植株。根据一个实 施方案，选择标记是包括植株体内抗生素抗性的基因。
近来制定的与大田的转基因植物生长相关的规定排除包括含诱导抗 生素抗性的基因的转基因植物的使用。这样，转基因植物的挑选可通过共 转化根据本发明被设计以授予病毒抗性的第一构建体和包括报告基因的 第二构建体来进行。授予病毒抗性的构建体的成功的转化于是通过本领域 的技术人员所知的方法，仅在表达报告基因和因此指示其为成功的转化的 植株中，被证实，比如通过PCR。
如本领域中已知的，本发明的核酸序列可能被整合到用于转化植物的 植物转化载体中。
根据另一方面，本发明提供一种方法用于产生抗病毒感染的植物，包 括以下步骤(a)提供抗病毒感染的转基因砧木而非通过抗病毒蛋白的表 达手段；(b)提供对所述病毒感染敏感的幼芽；并(c)将幼芽嫁接到 砧木上以便获得对抗所述病毒侵染的嫁接植物。
根据一个实施方案，砧木用具有与病毒基因组至少一个片段至少90 ％同样性的核酸序列转化，以便产生抗病毒侵染的转基因砧木。根据另一 个实施方案，砧木用DNA构建体转化，其被设计以产生靶向病毒基因组 的至少一个片段的siRNA，以产生抗病毒侵染的转基因砧木。根据本发明 的优选实施方案，病毒基因组受影响的片段对病毒侵染植物和/或复制是 必需的，所以其裂解阻止病毒侵染和/或复制，因此产生了抗性植物。
用多聚核苷酸或者DNA构建体转化植株可通过所属领域的技术人员 已知的不同方法产生抗性砧木。常用的方法的例子(但不受限于)有：土 壤杆菌介导的转化、基因枪法、花粉介导的转移、脂质体介导的转化、直 接基因转移(例如微注射)和胚性愈伤组织电穿孔法。根据一个实施方案， 抗性植株可通过土壤杆菌介导的转化产生。
包括本发明的核苷酸序列的转基因植株，可运用所属领域的普通技术 人员已知的分子遗传学标准方法挑选。根据一个实施方案，转基因植株根 据它们对抗生素的抗性来挑选。根据某些实施方案，作为可选择标记的抗 生素是包括巴龙霉素和卡那霉素的氨基糖甙类抗生素。
根据另一实施方案，转基因植株的挑选根据它们对病毒感染的抗性。 根据一个实施方案，转基因植株的挑选根据它们对土传病毒的抗性，土传 病毒选自一组病毒包括(但不限于)：线虫传播病毒：线虫传多面体病毒 属病毒：南芥菜花叶病毒、葡萄扇叶病毒、番茄黑环斑病毒、树莓环斑病 毒、番茄环斑病毒和烟草环斑病毒；烟草脆裂病毒属病毒：豌豆早褐病毒、 烟草脆裂病毒和辣椒环斑病毒；真菌传播的病毒：黄瓜叶斑病毒、黄瓜坏 死病毒、甜瓜坏死斑病毒、红三叶草坏死花叶病毒、南瓜坏死病毒、烟草 坏死卫星病毒、莴苣巨脉病毒、辣椒黄脉病毒、甜菜坏死黄脉病毒、甜菜 土传病毒、燕麦金色条纹病毒、花生丛簇病毒、马铃薯帚顶病毒、水稻条 纹坏死病毒、土传小麦花叶病毒、大麦和性花叶病毒、大麦黄花叶病毒、 燕麦花叶病毒、水稻坏死花叶病毒、小麦梭条斑花叶病毒和小麦黄花叶病 毒；通过根部伤口传播的病毒：烟草花叶病毒属病毒：烟草花叶病毒、番 茄花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、黄瓜果实斑驳花叶病毒、Kyuri绿斑 驳花叶病毒、齿兰环斑病毒、红辣椒轻斑驳病毒、辣椒轻斑驳病毒、长叶 车前花叶病毒和烟草轻绿花叶病毒；通过不明途径传播的病毒：豆瓣菜黄 斑病毒、蚕豆坏死萎蔫病毒、桃纵簇病毒和甘蔗褪绿条纹病毒。
根据另一实施方案，转基因植物的挑选根据它们对病毒的抗性，病毒 通过感染植物的地上部分的载体传送，选自一个科，所述科包括以下组： 椰菜花叶病毒科、双生病毒科、圆环病毒科、呼肠孤病毒科、Tartitiviridae、 雀麦花叶病毒科、豇豆花叶病毒科、马铃薯Y病毒科、番茄丛矮病毒科、 伴生病毒科、Clostroviridae和黄症病毒科；烟草花叶病毒组、烟草脆裂病 毒组、马铃薯X病毒组、香石竹潜病毒属、葱X病毒属、线形病毒属、 凹陷病毒属、发状病毒属、葡萄病毒属、真菌传杆状病毒组、花生丛簇病 毒属、马铃薯帚顶病毒属、甜菜坏死黄脉病毒属、大麦条纹花叶病毒组、 南方菜豆花叶病毒组、玉米雷亚朵非纳病毒属、芜苓黄花叶病毒组、悬钩 子病毒属、Ourmivirus和幽影病毒属。
根据另一方面，本发明涉及通过本发明的方法产生的嫁接植株。植株 包括幼芽，其原本对病毒感染敏感，嫁接到转基因的抗病毒的砧木后对病 毒感染有抗性。嫁接的植株将对砧木有抗性的同一病毒种有抗性。砧木包 括根据本发明稳定地整合到其基因组的核酸序列，其中DNA构建体的特 性决定了其对哪一病毒种有抗性。
本发明的这些或者另外的特征在下面的图、描述和权利要求中有更详 细的解释。
附图概述
图1显示CFMMV基因组结构和54kDa DNA构建体的示意图。A. CFMMV基因组的结构。核苷酸数指假定基因的位置。编码假定的54kDa (RNA-I1)、运动蛋白(MP)和外壳蛋白(CP)基因的三个亚基因组 RNA都被标记了。B.用于植物转化的构建体的组成，在左边(LB)和右 边(RB)T-DNA边界之间的部分。CFMMV的54kDa基因与ZYMV的在 截短的SVBV(SV)启动子和NOS多聚A终止子(T)之间的5’端非编码 区(NCR)融合。选择的NPTII基因在全长SVBV启动子的控制下插入。
图2显示产生siRNA的DNA构建体的示意图，pCddCP-ZY在左边 (LB)和右边(RB)T-DNA边界之间。包括病毒的ZYMV基因外壳蛋 白(CP)和3’端非编码区(NOR)的多聚核苷酸的反向重复在每一端融 合内含子，在SVBV(SV)启动子和NOS多聚A终止子(Ter)之间。选择 的NPTII基因和GUS基因在35S启动子控制下插入。
图3显示了I44抗性植株和对照植株对感染不同的侵染葫芦的烟草花 叶病毒属病毒的反应；CFMMV(CF)、CGMMV(CG)、KGMMV(KG) 和ZGMMV(ZG)感染的反应，根据病毒粒体的积累(a)和RT-PCR(b) 来评定。
图4显示了RT-PCR产物，指示被CFMMV侵染。株系I44和未转化 的“Ilan”植株(未接种(H)或者用CFMMV(inocul.)接种后三个星期) 的总RNA作为PT-PCR(a)和(b)的模板和PCR(c)作为阴性对照 分析。(a)54kDa基因的引物。(b)C P基因的引物。MW：分子量为 100b p阶梯。
图5显示黄瓜植株接种CFMMV后的反应。A和C：转基因的株系 I44。B和D：未转化的品种‘Ilan’。叶子和果实分别在接种后三和七个星 期后表现出病症。
图6显示在转化的I44植株中存在54kDa的转录产物。提取了转化的 (I44)和未转化的植株(‘Ilan’)的第二和第三片真叶的总RNA，未接种 或者是接种18dpi的CFMMV(CF)或ZYMV(ZY)。用变性琼脂糖凝 胶电泳和Northern点杂交分析了RNA。RNA上样量为或每孔3μg(从未 转化的用CFMMV感染了的‘Ilan’植株)，或30μg(其它孔)。运用32P 标记的与54kDa的编码序列互补的RNA探针来探测病毒RNA和转基因。 在平板附近指示了CFMMV RNA和亚基因组RNA-I1的电泳位置。标记 了转基因的转录产物(54kDa的转录产物)。Ilan+CF孔(用CFMMV侵 染的未转化植株)被暴露了4小时，而其它孔暴露了3天。底板：用溴化 乙锭染色转膜前的胶而确定18S RNA水平。
发明详述
本发明涉及抗病毒的嫁接植物，其包括砧木和幼芽。以DNA构建体 转化的植株，授予对一种植物病毒的抗性而不是通过抗病毒蛋白的表达， 作为砧木来源，而对病毒病易感染的植株作为幼芽来源。通过将幼芽嫁接 到砧木，整个植株被保护而不被病毒侵染。
在详细解释至少一个本发明实施方案之前，应了解本发明的应用不限 于在下面的描述中阐明的或者在制图中解释的构建的细节和成分的排列。 本发明可以有其它的实施方案，可按不同方法操作或者实行。而且，应了 解在此的措辞和术语是为了达到描述的目的而不应该认为是限制。
定义
在这里用到的术语“植物”是其最广义的意思。它包括(但不限于)任 何一种木本植物，草本的，多年生或一年生的植物。它还指多个植物细胞， 其大量的分化成一个结构，处于植株生长的任何阶段。这些结构包括(但 不限于)根、茎、芽、叶、花、花瓣、果实等。
在此用到的术语“嫁接植株”指包括砧木和幼芽的植株，其中，幼芽通 过所属领域已知的任何方法被嫁接到砧木上。
在此用到的术语“砧木”指用于嫁接的包括植物的根部的树干。术语 “幼芽”指从植株分离的被设计或准备以在嫁接中与树干接合的活体部分， 通常单独地或者最具优势地提供给嫁接株地上部分。
在此用到的术语“病毒”指一种植物病毒，即一种可以侵染植物细胞和 在植物细胞中繁殖的病毒。典型地病毒是致病的，所以实质性的病毒侵染 导致农作物的产量减少。
在此用到的术语“土传”病毒指通过土壤载体传播的病毒，土壤载体包 括线虫、真菌或者不明土壤载体，和残留在植物残体中的病毒，且通过根 部伤口在土壤中传播。
术语“抗性植株”和“抗病毒病的植株”指植株与非抗(易感病)植株相 比具有增强的对病毒的耐受性。增强的耐受性通过用供试病毒故意侵染植 株而检查到。根据每种病毒的特殊的症状等级，与易感病植株相比表现出 较轻的症状程度的植株被定义为抗此病毒的植株。植株可或者抗侵染(抗 性于是指免疫能力)或者经历一个侵染的初步阶段而恢复(抗性于是指恢 复能力)。抗性可为一稳定的性状，其可被遗传到后代群体。或者，只要 嫁接植株包括砧木和幼芽就存在抗性。在后者的情况中，抗病毒病的植株 也可指植株被保护而不受病毒病侵害。
术语“基因”指核酸(例如DNA或者RNA)序列，其包括产生RNA 或多聚肽必需的编码序列。多聚肽可被全长的编码序列或者其部分所编 码。术语“其部分”，当其用于指一基因，指此基因的片段。片段的大小范 围可从几个核苷酸到整个基因序列减去一个核苷酸。这样，“包括至少一 个基因的一部分的核酸序列”可包括基因的片段或者整个基因。
术语“基因”也包含结构基因的编码区和包括位于靠近编码区的具每 端约1kb距离的5’和3’端的序列，所以基因对应于全长mRNA的长度。 位于编码区5’端和出现在mRNA上的序列指5’端非翻译的序列。位于编 码区3’端或下游和出现在mRNA上的序列指3’端非翻译序列。在此用到 的术语“内含子”指非编码区，其打断了基因的编码区。内含子被移出或者 从核或初转录产物中“剪除”，这样就不在信使RNA(mRNA)转录产物中了。
在此用到的术语“核酸”指RNA或者DNA，其为线性或分枝的，单链 或者双链或者为其杂合体。此术语也包含RNA/DNA杂合体。
在此用到的术语“启动因子”、“启动子”、或“启动序列”指DNA序列， 其位于DNA聚合体的编码蛋白的区域的5’末端(即先行(precedes))。已 知大多数启动子的位置实际上在转录区域之前。启动子的作用像一个开 关，激活基因的表达。如果基因被激活，其被称为转录或参与转录。转录 包括由基因合成mRNA。因此，启动子作为转录调节因子，也提供基因转 录为mRNA开始的位点。
术语“外源基因”或“融合基因”指编码一个因子的基因，其不处于它的 自然的环境中(即被人为的改变了)。例如，从一个物种导入到另一物种 的基因的外源基因。外源基因也包括通过某些方法(如突变、加入了多个 拷贝、与非自身的启动子或增强子序列连接等)改变了的有机体的自身基 因。外源基因可能包括植物基因序列，其包括植物基因的cDNA形式； cDNA序列可能正(以产生mRNA)或反向(以产生与mRNA转录产物 互补的反义RNA转录产物)地表达。因为外源基因的序列典型地与包括 调节因子例如启动子的核苷酸序列有关，其通常在自然下未发现与外源基 因编码的蛋白的基因有关或者与染色体的植物基因序列有关，或者与在自 然状态下没有的染色体部分有关(例如，在通常不表达的位点表达的基 因)，外源植物基因和内源植物基因可相区别。一特殊的植物物种的植物 内源基因是一个在此物种中自然能找到，或者其通过常规的杂交可被导入 此物种的基因。
当术语“转基因”用于指植株或者果实或者种子(即“转基因植株”或 “转基因果实”或“转基因种子”)指在其一个或多个细胞中包含至少一个外 源基因的植株或者果实或者种子。术语“转基因植物材料”泛指植株、植物 结构、植物组织、植物种子或者植物细胞，在其至少一个细胞中至少包括 一个外源基因。
术语“转化株”或者“转化细胞”包括初转化细胞和由不考虑转移数量 的细胞而来的培养物。由于有意的或者无意的突变，不可能所有的后代在 DNA含量上都精确的相同。从初转化的细胞中筛选出的具有相同功能性 的突变后代包括在转化体的定义中。
本发明揭示了一个利用嫁接技术来生产抗病毒侵染的转基因植物的 体系，其中砧木是植株唯一的遗传修饰了的部分。这样，因转化方法可以 用于授予对病毒侵染的抗性，本发明的植株优于迄今已知的抗性植株，而 且由此植株生产的农产品未被遗传修饰。
幼芽嫁接到砧木是一个普通的园艺实践，其被用于繁殖木本植物多 年。一旦嫁接了，砧木的水分和营养被运输到幼芽以支持幼芽的生长。如 今，嫁接广泛用于多种植物物种以改善嫁接后的植株的园艺性状。用于大 田作物的嫁接苗包括砧木和幼芽，其比例在现代农业实践中不断的增加。 例如，在希腊、意大利和西班牙，约60％的黄瓜和西瓜苗是嫁接苗。为了 满足对嫁接苗日益增长的需要，多种方法得以发展以得到高的嫁接产量。 在所有实施的方法中，幼苗和砧木的互补端被连在一起以形成一个嫁接联 合体。作为植株正常的愈合过程的一部分，愈伤组织在嫁接联合体上形成， 并作为幼芽和砧木之间水分和营养的管道。
根据一方面，本发明提供包括抗病毒的转基因砧木(不是通过表达抗 病毒蛋白)和对病毒病敏感的幼芽的植株，其中嫁接植株对所述病毒病有 抗性。
抗病毒病的转基因植株可用多种方法来生产，其可作为砧木。本发明 特别地涉及转基因砧木，其表达与靶病毒基因组片段同源的转录产物。
不希望受特定的机制束缚，抗性可与RNA沉默有关。RNA沉默的命 名，在植物中为转录后基因沉默(PTGS)、真菌中为基因压制和动物中 为RNA干涉，指在相关RNA存在的情况下特殊的基因转录产物的水平 藉以减少的现象。沉默的基因可是有机体内源的或者外源的，整合到染色 体而存在或者短暂的存在，例如未整合到基因组的转染载体或者病毒。基 因的表达或完整或部分被抑制。PTGS也可被认为完全地或部分地阻止目 标RNA的功能。
根据某些实施方案，抗病毒侵染转基因砧木包括一核酸序列，其具有 与病毒基因组至少一个片段至少90％的相同性。
已显示导入一转基因组成型地表达病毒基因组的一部分，导致植物对 病毒侵染的抗性(Marathe等，2000.Plant Mol.Biol.43：295-306)。本发明 现在显示将易感病幼芽嫁接到如上面描述的那样转化的转基因砧木，导致 砧木将抗病毒性授予幼芽。特别地，本发明显示这样的嫁接植株被保护而 不被土传病毒导致的疾病侵害。
作为一个非限制性的例子，本发明揭示通过嫁接到转基因有抗性的黄 瓜砧木，一易感病黄瓜品种受保护而不被土传黄瓜果实花叶烟草花叶病毒 属病毒(CFMMV)侵害。
CFMMV是一种新报道的侵染葫芦的烟草花叶病毒属病毒，其在以色 列(Antignus等，2001.Phytopathology 91：565-571)从生长于温室的黄瓜 (Cucumis sativus L.)上分离。黄瓜品种对四种截然不同的属于两个亚组的 烟草花叶病毒属病毒敏感。CFMMV在生物上、序列相似性上与Kyuri绿 斑驳花叶病毒(KGMMV)、小西葫芦绿斑驳花叶病毒(ZGMMV)紧密 相关，但是与黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV-W)相比表现出更弱的血清亲 和力和更低的外壳蛋白(CP)同源性。
CFMMV RNA基因组包括6,562个核苷酸(基因库编号no.AF321057， 序列ID NO：4)，具三个亚基因组RNA，编码四个开放阅读框(图1)。 CFMMV的5’近端区域编码对复制必需的两个共起始(co-initiated)蛋白： 132-kDa和189-kDa的蛋白。189-kDa的蛋白通过渗漏UAG终止密码子 的通读产生，其在132-kDa蛋白的3’端的3629位置处(Antigus等，2001， 同上)。在烟草花叶病毒(TMV)一个名为I1-RNA的亚基因组RNA从 短的复制酶基因(132-kDa)开始，并编码复制酶框架的通读部分，产生 假定的54kDa的蛋白，其还未在被烟草花叶病毒属病毒侵染的植物上发 现(Zaitlin，M.1999.Phil Trans R Soc Lond B 354：587-591)。
在商业温室环境，CFMMV的症状首次在处于一个相当高级的生长阶 段的果实和顶端的叶子上发现。叶子的症状包括花叶严重、沿脉变色和黄 斑驳。在很多情形下，发育完全的植株表现出严重的萎蔫症状，以致植株 病死。病毒在温室迅速的蔓延可能导致经济作物严重的损失。此病毒通过 接种源机械接触植物器官而易于传播。此病毒可在植物残体或者受侵染的 温室土壤中残留很长时间。由于缺乏有效的天然的黄瓜抗性资源，使得不 可能通过传统的育种程序来使抗性基因渗入到商业品种。
这样，根据一实施方案，转基因砧木包括一核酸序列，其编码一假定 的为黄瓜果实斑驳花叶病毒(CFMMV)的复制蛋白的一部分的54kDa的 蛋白。根据一现在优选的实施方案，转基因砧木包括一核酸序列，其具序 列ID NO：1中阐明的序列。
就如下面的在此例证的，用CFMMV假定的非结构的54-kDa的基因 转化的单性结实的黄瓜表现出对CFMMV侵染的高水平的抗性(免疫力)， 而且通过生物的或者分子的方法不能在接种的植株上发现病毒踪迹。
检测了许多有关抗性反应的参数。在重复试验中，尽管被组成型强启 动子驱动，转基因株系的54-kDa位点的转录产物的积累水平一直低(图 6)。不希望受特殊的机制的束缚，抗性可与转基因转录产物的特殊的降 解有关，如以前报道的为对植物病毒的沉默介导的抗性。
有意思的是，用CFMMV或者ZYMV接种转基因植物不能影响此 54-kDa的编码序列的RNA表达水平(图6)。相反，在许多研究中，在 抗性机制中意味着沉默时，用同源病毒接种转基因抗性植株减少了病毒 RNA的水平(Savenkov，E.I.和Valkonen，J.P.2002.J Gen Virol 83：2325-2335)。用已知存在沉默抑制基因的病毒提前侵染，不能削弱转 基因植物对具挑战性的CFMMV的侵染的抗性。这一观察与转基因的N. benthamiana(烟草)对马铃薯A病毒或李痘病毒的沉默介导的抗性的报告 不一样，其中转基因烟草通过用马铃薯Y病毒分别提前侵染而克服了抗 性。
本发明揭示易感病黄瓜通过嫁接到转基因的抗性砧木上受保护而不 被CFMMV土壤接种侵害。这样，本发明首次证明，通过嫁接到表达与 病毒基因组一片段同源的转录产物的转基因砧木，易感病幼芽可被保护而 不被土传病毒侵害。在此揭示的转基因砧木介导的保护具重要的农业应用 价值，使非基因修饰的(非-GMO)农产品可生长并被充分的保护不被土 传病菌侵害。
根据另一实施方案，抗病毒侵染的转基因砧木包括一DNA构建体， 其被设计以产生靶向病毒基因组的至少一个片段的siRNA。
转录后基因沉默这一现象可被两类转基因位点引发。第一种类型相当 于高度转录单基因，如上述的。第二种有效地引发PTGS的转基因位点的 类型是那些含两个转基因重复的位点，其排列成通过通读转录产生dsRNA 的反向重复(IR)。双链RNA(dsRNA)在许多有机体(包括植物)中 对抑制特殊基因表达非常有效。病毒诱导的基因沉默(VIGS)，例如， 已在许多植物RNA病毒中被证实(Vance和Vaucheret，2001.Science 292：2277-2280)。双链RNA(dsRNA)分子发动这个过程。dsRNA分子可 能由病毒RNA或者异常的转基因编码的RNA的复制中间产物产生，其 通过RNA依赖的RNA聚合酶活性作用变成dsRNA(Dalmay等.2000.Cell 101：543-553；Waterhouse等.2001.Nature 411：834-842)。这样的dsRNA 分子已被合成到植物细胞，且显示在抑制或者阻止病毒基因表达方面有用 (见，例如，美国申请No.20020169298)。
在植物细胞中，dsRNA被一核糖核酸酶III家族的酶剪切成短干扰 RNA(siRNA)，其大小范围一般在21到26个核苷酸。人们相信siRNA 然后通过形成多成分的核酸酶复合物RISC(RNA诱导的沉默复合物)促 进RNA降解，其破坏同源mRNA(Elbashir等.2001.EMBO J 20：6877-6888； Zanore等.2000.Cell 101：25-33)。近来，已显示这样的大小范围在21到26 个核苷酸的siRNA是RNAi通路的中间产物，其抑制动物和哺乳系统中的 基因表达同样有效。siRNA的运用于是已成为一个下调基因表达的有力工 具。
转录后基因沉默以一种非常典型的与病毒传播相像的方式系统地在 单个植株中传播。这导致系统沉默信号的假说，其在组织中产生并发动沉 默，然后转移到植物远端部分，在那里其可以序列特异的方式发动沉默。 沉默的这一序列特异性暗示信号是核酸，但是信号实体未知(Kalantidis，K. 2004.PloS Biology 2：1059-1061)。沉默主要以从碳源到碳库的方向传播， 即如叶子这样的运输出光合作用糖类产物的组织到如根这样的运输入这 些产物的组织，而且其可能需要几周的时间直到其在整个植株中建立。沉 默信号的存在已在嫁接植株中被显示，从而沉默从沉默了的砧木转移到了 靶幼芽。然而，这样的信号转移依赖于幼芽的相应的转基因的表达。而且， 被证实染色体的相应的基因，无论是内源基因或者幼芽的稳定、完整的外 源基因，其过表达是由从砧木到幼芽的信号转移来介导的引发RNA降解 的一个必需的首要事件。
本发明证实转基因砧木，其表达靶向使病毒基因组序列沉默的 dsRNA，通过嫁接将抗病毒性授予易感病幼芽。幼芽被授予病毒抗性暗示 从砧木转移到幼芽的信号有效地剪切病毒基因组序列。这样，本发明首次 表明从砧木转移到幼芽的信号以一种序列特异的方式干预植物基因组中 不表达的核酸序列的功能性表达。这些发现说明转移了的信号是RNA。 Smirnov等(如前)揭示了转基因植物中的美洲商陆抗病毒蛋白(PAP) 诱导嫁接植物的病毒抗性。作者们进一步证实幼芽获得的抗性不依赖于水 杨酸的积累和发病机理相关的蛋白的合成。然而，这些结果与本发明描述 的现象非常不同，因为产生使幼芽抗病毒侵染的信号需要PAP酶活性。 另外，与授予给本发明的转基因植物的序列特异抗性不同，PAP活性授予 非特异的病毒抗性。
根据一实施方案，本发明揭示通过嫁接到转基因抗性烟草砧木，易感 病烟草幼芽(Nicotiana benthamiana)受保护而抗小西葫芦黄花叶病毒 (ZYMV)，其中，抗性砧木包括被设计以产生靶向ZYMV基因组的片 段的siRNA的DNA构建体，其包括为一外壳蛋白编码的基因和病毒基因 组3’非翻译区。这一实施方案为一非限定例，展示本发明在此上文描述的 更广的范围。
本发明的组成和方法可能被使用到授予抗性给任何对病毒侵染敏感 的植物。非限制性的例子包括葫芦科植物、大豆、小麦、燕麦、高粱、棉 花、番茄、马铃薯、烟草、辣椒、水稻、玉米、大麦、芸苔和拟南芥。根 据一实施方案，嫁接的抗病毒的植物属葫芦科。根据一优选实施方案，转 基因的抗病毒植物选自一组植物包括：西瓜、甜瓜、西葫芦、南瓜、小西 葫芦和黄瓜。病毒特异性可能通过转化到植物中的核酸序列的类型和设计 来决定。核酸序列可编码一靶向以使病毒基因组一个或者更多的相应片段 沉默的转录产物，而且多于一个核酸序列可被转化到植物中。
根据某些实施方案，本发明提供一植株包括一转基因砧木，其包括一 具有与土传病毒基因组至少一个片段至少90％相同性的核酸序列以致抗 由土传病毒引起的疾病，和对疾病易感病的幼芽，其中嫁接的植株受保护 而不被由所述的土传病毒导致的所述疾病侵害。
根据一实施方案，植物抗由土传病毒导致的疾病，病毒选自以下组包 括(但不受限于)：线虫传播的病毒：线虫传多面体病毒属病毒：南芥菜 花叶病毒、葡萄扇叶病毒、番茄黑环斑病毒、树莓环斑病毒、番茄环斑病 毒和烟草环斑病毒；烟草脆裂病毒属病毒：豌豆早褐病毒、烟草脆裂病毒 和辣椒环斑病毒；真菌传播的病毒：黄瓜叶斑病毒、黄瓜坏死病毒、甜瓜 坏死斑病毒、红三叶草坏死花叶病毒、南瓜坏死病毒、烟草坏死卫星病毒、 莴苣巨脉病毒、辣椒黄脉病毒、甜菜坏死黄脉病毒、甜菜土传病毒、燕麦 金色条纹病毒、花生丛簇病毒、马铃薯帚顶病毒、水稻条纹坏死病毒、土 传小麦花叶病毒、大麦和性花叶病毒、大麦黄花叶病毒、燕麦花叶病毒、 水稻坏死花叶病毒、小麦梭条斑花叶病毒和小麦黄花叶病毒；通过根部伤 口传播的病毒：烟草花叶病毒属病毒：烟草花叶病毒、番茄花叶病毒、黄 瓜绿斑驳花叶病毒、黄瓜果实斑驳花叶病毒、Kyuri绿斑驳花叶病毒、齿 兰环斑病毒、红辣椒轻斑驳病毒、辣椒轻斑驳病毒、长叶车前花叶病毒和 烟草轻绿花叶病毒；通过不明途径传播的病毒：豆瓣菜黄斑病毒、蚕豆坏 死萎蔫病毒、桃纵簇病毒和甘蔗褪绿条纹病毒。
根据一实施方案，转基因砧木包括一核酸序列，其编码为黄瓜果实斑 驳花叶病毒(CFMMV)的复制蛋白的一部分的假定54kDa蛋白。根据一 现在优选的实施方案，转基因砧木包括一核酸序列，其具有在序列ID NO：1 中阐明的序列。
根据另外的实施方案，本发明提供一植株，其包括一包括被设计以产 生靶向一病毒基因组至少一个片段的siRNA的DNA构建体的转基因砧木 以致抗由病毒导致的疾病，和一易感所述病毒导致的疾病的幼芽，其中嫁 接的植株抗所述病毒的所述侵染。
依赖于病毒基因组的靶片段，植物可被设计以抗任何病毒。根据某些 实施方案，如在此上文描述的，植株抗由可感染植株的地上部分的载体传 播的病毒，也抗土传病毒。
根据一实施方案，被设计以产生靶向一病毒基因组的至少一个片段的 siRNA的DNA构建体包括：
(a)可操作地连接的至少一种植物的可表达启动子；
(b)核酸序列，其编码形成至少一个RNA双链的RNA序列，其中双 链RNA分子包括：具有与病毒基因组的靶片段的有义核苷酸序列至少 90％相同性的至少20个邻近核苷酸的第一核苷酸序列；具有与所述病毒 基因组的所述靶片段的有义核苷酸序列互补序列至少90％相同性的至少 20个邻近核苷酸的第二核苷酸序列；间隔序列；并且视需要，
(c)转录终止信号。
根据一些实施方案，根据本发明DNA构建体被设计以表达茎环RNA， 其除包括第一(有义)和第二(反义)核苷酸序列外还包括位于第一和第 二核苷酸序列的DNA编码区之间的间隔多聚核苷酸序列。间隔多聚核苷 酸序列的长度可根据茎环RNA特殊的结构变化。典型地，间隔序列的长 度与第一和第二核苷酸长度的比率为1∶5到1∶10。
根据一优选实施方案，被设计以产生靶向病毒基因组的至少一个片段 的siRNA的DNA构建体包括：
(a)可操作地连接的至少一种植物的可表达启动子；
(b)编码形成至少一个茎环形式的RNA双链的RNA序列的核酸序列， 其中双链RNA分子包括：具有与病毒基因组的靶片段的有义核苷酸序列 至少90％相同性的至少20个邻近核苷酸的第一核苷酸序列；具有与所述 病毒基因组的所述靶片段的有义核苷酸序列互补序列至少90％相同性的 至少20个邻近核苷酸的第二核苷酸序列；间隔序列；并且视需要，
(c)转录终止信号。
根据一实施方案，间隔序列包括来自基因内含子的核苷酸序列，已知 其在此项技术中增加siRNA的产量。根据一实施方案，间隔序列包括包 含来自蓖麻过氧化氢酶基因的内含子的核苷酸序列，其具有在序列ID NO：3中阐明的序列。
在此用到的术语“DNA构建体”和“核酸序列”指多聚核苷酸分子，其包 括至少一个在宿主细胞或者有机体表达的多聚核苷酸。典型地，这种表达 在某些顺式作用调节元件控制下，包括组成型的、可诱导的或者组织特异 的启动子、以及增强元件。在本领域中普遍的，这样的多聚核苷酸序列被 述为“可操作的连接到”调节元件。典型地转化到真核细胞的核酸序列也包 括源于真核的或者细菌的可选择的标记，用于包括此核酸序列的真核细胞 的选择。在本领域中已为我们充分地熟知的这些序列可包括(但不限于)， 各种授予抗生素抗性的基因和各种报告基因。视情况，此核酸序列可进一 步包括克隆位点、一个或多个复制的原核起源、一个或多个翻译开始位点、 一个或多个多聚腺苷信号和相似的。
在此用到的术语“核酸序列的表达”，或“多聚核苷酸的表达”指一个过 程，其中与合适的调节区，特别是启动子区，可操作地连接的DNA区被 转录成具生理活性的RNA，即，其能与另一核酸相互作用或其可被翻译 成多肽或蛋白。应理解根据本发明的教导，为了获得病毒基因或其部分的 沉默，蛋白的翻译不是必要的。
术语“基因的表达”指通过此基因的“转录”(即通过RNA多聚酶的酶 作用)到RNA(例如mRNA、rRNA、tRNA、或snRNA)和通过mRNA 的“翻译”到蛋白质的传递基因中的遗传信息的过程。基因的表达可在此过 程的许多阶段被调节。“上调”或“激活”指增加基因表达产物(即RNA或 蛋白质)产量的调节，“下调”或“抑制”指减少产量的调节。参与上调或下 调的分子(例如转录因子)通常被分别称为“激活子”和“抑制子”。
本发明的为病毒基因组的一个部分的核苷酸序列可为全长基因、其部 分、非编码区或其部分或其组合。当在此用到的术语“同源性”用于与核酸 序列有关时，指至少两个核苷酸序列间的相似性或相同性的程度。可能有 部分的同源性或者完全的同源性(即相同性)。“序列相同性”指两个或者 更多的核苷酸序列间的关联度的测量，以对于总的对照长度的百分率表 示。相同性的计算考虑那些相同的、在其各自的序列中处于相同相对位置 的核苷酸残基。一个间隙，即在一列中的一个位置，残基在一个序列中此 处出现但在另一个中不出现，被认为是具不同残基的位置。同源性用如基 于Gapped BLAST的搜索(Altschul等.1997Nucleic Acids Res.25：3389-3402)和“BESTFIT”测定.
在此用到的“核苷酸序列的互补序列”是指能与核苷酸序列形成双链 DNA分子的核苷酸序列，而且其根据夏格夫法则(AT；GC)通过它们的 互补核苷酸代替此核苷酸和从5’到3’方向阅读，即按核苷酸序列的相反方 向，能由此核苷酸序列得到。
在此用到的RNA分子的核苷酸序列可通过与序列列表中的DNA核 苷酸的相关性来鉴别。然而，所属领域的技术人员会根据其内容了解RNA 或者DNA是否为想要的。而且，除了在RNA分子中T-碱基被尿嘧啶(U) 所代换了，核苷酸序列是相同的。
应理解的是，与病毒基因组的片段同源的核酸序列总长越长，对与病 毒基因组的片段的序列相同的序列的需要就越不严格。总的核酸序列可具 有与病毒基因组的相应片段至少约90％的序列相同性，也可具有更高的约 95％或100％的序列相同性。
根据某些实施方案，其中砧木包括DNA构建体，其被设计以产生靶 向病毒基因组的至少一个片段的siRNA，DNA构建体的第二(反义)核 苷酸序列的长度很大程度上决定于第一(有义)核苷酸序列的长度，而且， 可能与后者序列的长度相关。然而，可以用在长度上约10％不同的反义序 列。相似地，反义区域的核苷酸序列在很大程度上决定于有义区域的核苷 酸序列，而且可能具有与有义区域的互补序列大约90％的序列相同性，也 可具有更高的约95％或100％的序列相同性。
被设计以产生siRNA的DNA构建体的第一和第二核苷酸序列可为任 何长度，其提供包括至少20个邻近核苷酸的序列。这样，第一和第二核 苷酸可包括靶序列的一部分或者此靶序列的全长。根据一些实施方案，核 苷酸序列的长度为从20个核苷酸到1,200个核苷酸。
根据一个实施方案，由本发明的DNA构建体产生的siRNA，其目的 是使ZYMV基因组的包括病毒外壳蛋白的编码区域的片段沉默。
根据一优选实施方案，第一核苷酸序列包括核苷酸序列，其具有与在 序列ID NO：2中阐明的核苷酸序列或者其片段90％、优选地95％，更优 选地100％的相同性。
根据另一优选实施方案，第二核苷酸序列包括一核苷酸序列，其具有 与在序列ID NO：2中阐明的核苷酸序列或其片段的互补序列90％、优选 地95％，更优选地100％的相同性。
根据一些实施方案，第一和第二核苷酸序列可操作地连接到同一启动 子。转录了的链，其至少部分互补，可形成dsRNA。根据其他的实施方 案，第一和第二核苷酸序列被转录成两个单独的链。当dsRNA这样产生 后，应转录的DNA序列被两个启动子从侧面相连，一个控制第一核苷酸 序列的转录，另一个控制第二互补的核苷酸序列的转录。这两个启动子可 相同或者不同。根据一个实施方案，第一和第二核苷酸序列可操作地连接 到同一启动子。
植物可表达的启动子在本领域中已为我们所知。合适的启动子的选择 将受想要运用本发明的DNA构建体的植物物种、可用性和所要求的作用 方式的指示。根据本发明的教导，优选的启动子是组成型的启动子，或普 通的或组织特异的。当术语“组成型的”用于指启动子时，其意思为在没有 刺激物(例如热激、化学药品、光等)存在的条件下启动子可指导可操作 地连接的核酸序列的转录。典型地，组成型启动子可指导转基因在实质上 地任何细胞和组织的转录。启动子经常被用于组成型基因在植物中的表 达，其包括CaMV 35S启动子、增强的CaMV 35S启动子、玄参花叶病毒 (FMV)启动子、甘露碱合酶(mas)启动子、胭脂碱合酶(nos)启动子 和章鱼碱合酶启动子。优选地运用本发明的发明人和合作者从草莓镶脉病 毒(SVBV)分离出来的组成型启动子(Wang等，2001.Virus Genes 20：11-17)。
抑制特殊基因的转录后基因调节的潜在作用导致各种新方法的发展 以获得细胞中活性siRNA。例如，美国申请No.20040262249揭示了siRNA 的直接诱导以在植物细胞中沉默靶基因，特别是病毒基因。本发明的教导 可通过任何本领域中已知的方法实践以在植物细胞中产生siRNA，或者直 接诱导siRNA到植物细胞中。
与在此上面描述的核酸序列杂交，特别是与(i)具有选自序列ID NO： 1和序列ID NO：2的核苷酸序列的核酸或(ii)选自序列ID NO：1和序 列ID NO：2的核苷酸序列的互补序列或其片段杂交的核酸序列也包括在 本发明的范围。
成功的杂交很大程度上依赖于杂交条件。在此用到的术语“严格的条 件”或“严格性”指杂交的条件，决定于核酸、盐和温度。在本领域中这些 条件都已为我们所熟知，而且可能被改变以便鉴别或者检测相同的或相关 的多聚核苷酸序列。许多等效的条件包括或高或低的严格性，其依赖于像 长度和序列(DNA、RNA和碱基组成)的特性、目标序列(DNA、RNA 和碱基组成)的特性、环境(在溶液中或固定在固体基质)、盐和其他成 分(例如甲酰胺、硫酸葡聚糖和/或聚乙二醇)的浓度和反应(在低于探 针融化温度的从约5℃到约25℃的范围)的温度等因素。一个或者多个因 素可被改变以产生或高或低的严格性的条件。杂交和洗脱条件已被熟知而 且在Sambrook等Molecular cloning：A laboratorymanual，Second Edition， Cold Spring Harbor，NY.1989，尤其是chapter 11中有例证。根据一实施方 案，杂交在适中的严格性(在65℃、1.0-2.0X SSC)下进行。
为了含有本发明的构建体的植物细胞的选择，典型地被设计的以将核 苷酸序列转化到植物细胞中的构建体也包括可选择标记。术语“可选择标 记”指基因，其编码一种具有一种使细胞具有一种抗生素或者药物抗性的 活性的酶，在细胞中选择性标记被表达，或者指使一种可被检测到的性状 (例如发光或荧光)表达的基因。
典型地，授予抗生素抗性和在本领域中已为我们所熟知的基因用作选 择性标记。然而，即使最终产物不含有此外来遗传物质，大田中授予抗生 素抗性的遗传修饰了的植物，特别是农作物，在西方国家不允许大批生长。 这样，根据某些实施方案，本发明利用共转移的方法挑选具此DNA构建 体的转化植株。
根据一个实施方案，共转移的实施是用根据本发明的授予病毒基因沉 默的DNA构建体和包括至少一个选择性标记的DNA构建体。共转移的 方法在本领域中已为我们所知，而且部分基于高百分率的转化细胞具有两 个DNA构建体的发现。表达选择性标记的植物被检查到授予病毒基因沉 默的DNA构建体的存在，例如通过PCR反应。被选择的植物长到成熟并 自花授粉。在产生的后代中，两个DNA构建体各自分离，允许选择包括 想要的DNA构建体的植株。
可选择地，使病毒基因裂解的核酸序列包括转录终止信号。可用于本 发明的构建体的多种终止子被所属领域技术人员所熟知。这些终止子可来 自启动子序列的相同的基因或者来自不同的基因。根据一个实施方案，转 录终止信号是NOS终止子。
根据另一方面，本发明提供一种生产抗病毒侵染的嫁接植株的方法， 其包括以下步骤：(a)提供抗病毒侵染的转基因砧木而不是通过表达抗 病毒蛋白的方法；(b)提供对所述病毒易感的幼芽；(c)将幼芽嫁接到 砧木上以获得抗所述病毒侵染的嫁接植株。
嫁接包括将两个独立的植株部分结合成一株植物。这样的结合可通过 各种方法实施，包括(但不限于)枝接和舌接、合接、劈接、侧接、鞍接 和芽接(需要更多的细节见Garner R.J.，The Grafter’s Handbook，5th ED edition(March 1993)Cassell Academic：ISBN：0304342742)。
根据一个实施方案，用具有与病毒基因组的至少一个片段至少90％的 相同性的核苷酸序列转化砧木以产生抗病毒侵染的转基因砧木。
根据另一实施方案，砧木用被设计以产生靶向病毒基因组的至少一个 片段的siRNA的DNA构建体转化，以产生抗病毒侵染的转基因砧木。
根据本发明的优选实施方案，此病毒基因组受影响的部分对病毒侵染 植物和/或复制是必需的，因此它的裂解阻止了病毒侵染和/或复制，这样 产生了抗性植物。
根据本发明用核酸序列转化砧木以使砧木抗病毒侵染的方法在本领 域中已为我们所知。在此用到的术语“转化”或“转化中”描述一个过程，外 来的DNA如DNA构建体通过其进入和改变受体细胞，使其成为转化了 的、遗传修饰了的或者转基因细胞。转化可能是稳定的，其中核酸序列被 整合到植物基因组，而且同样地表现稳定的遗传性状；或者是瞬时的，其 中核苷酸序列在转化细胞中表达但是未被整合到基因组，而且同样地表现 出瞬时的性状。根据优选实施方案，本发明的核酸序列被稳定地转化到植 物细胞。
将外来的基因导入单子叶或双子叶植物有多种方法(Potrykus，I.1991. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 42，205-225；Shimamoto，K.等1989. Nature(1989)338，274-276)。
稳定整合外源DNA到植物基因组DNA的基本方法包括两种方式：
土壤杆菌介导的基因转移：土壤杆菌介导的系统包括包含整合到植物 基因组DNA中的固定DNA片段的质粒载体的运用。接种植物组织的方 法根据植物物种和土壤杆菌运输系统而改变。一个广泛地运用的方法是叶 盘法，其可用任何组织的外植体实施，外植体提供一个好的开始整个植株 分化的来源(Horsch，R.B.等.1988.Plant Molecular Biology Manual A5，1-9，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht)。辅助的方法使用土壤杆 菌运输系统结合真空渗透。土壤杆菌系统在创造转基因双子叶植物时特别 有用。
直接DNA获取。有各种直接DNA转移到植物细胞的方法。在电穿 孔法中，原生质体暂时地暴露在强电场中，打开了小孔允许DNA进入。 在微注射中，用微量移液器DNA被机械地直接地注射到细胞中。在微粒 轰击法中，DNA被吸收到微弹，例如硫酸镁晶体或钨粒，微弹被物理地 加速到细胞或者植物组织中。
转化稳定后，接着进行植物的繁殖。最普遍的植物繁殖的方法是通过 种子。然而，既然种子由植物根据孟德尔规则控制的遗传变异产生，通过 种子繁殖的再生的缺点是由于杂合性，作物缺乏一致性。换句话说，每粒 种子遗传上是不同的，每粒会长有其自身特殊的性状。于是，优选的是影 响再生使得再生植株与转基因亲本植株具有相同的性状和特征。优选的再 生转化植株的方法是微繁殖，其提供一个迅速的、连续的繁殖转化植株的 方法。
微繁殖是从一个选择出来的亲本植株或者品种中的单个组织样本生 长第二代植物的方法。此方法允许具有优选组织和表达融合蛋白的植株的 批量繁殖。这些新生产出来的植株与源植株遗传上一致且具有所有的源植 株的特征。微繁殖允许在短的时间内批量生产具质量的植物材料，并且提 供在保留源转基因或转化植株的特征的情况下快速的繁殖选择出来的品 种。此植物克隆方法的优点包括植物繁殖的速度和生产出的植物的质量和 一致性。
微繁殖是一个多阶段的过程，其需要在两个阶段间更换培养基或者生 长环境。微繁殖的过程包括四个基本的阶段：第一阶段，原始组织的培养； 第二阶段，组织培养物的增殖；第三阶段，分化和植株形成；第四纪段， 温室培养和锻炼。在第一阶段期间，建立组织培养并保证无菌。在第二阶 段期间，原始组织培养物增殖直到足够的组织样品产生出来以满足生产目 标。在第三阶段期间，新生长的组织样品被分开，种植成单独的小苗。在 第四阶段，转化了的小苗转移到温室接受锻炼，在温室植物对光的忍耐力 逐渐升高以至于它们可以在自然环境下继续生长。
所属领域的技术人员希望核酸序列的各种成分和在本发明中描述的 转化载体可操作地连接，这样可以引起所述核酸或核酸片段的表达。可操 作地连接构建体和本发明的载体的成分的技术已为所属领域技术人员所 熟知。这些技术包括运用接头，例如人工接头，例如包括一个或多个限制 性酶位点。
就如在此下面的范例，本发明的转基因砧木表达外源的RNA分子， 特别是同源于靶病毒的基因组的至少一个片段的RNA序列。表达可通过 所属领域的技术人员已知的方法监控，例如通过分离转基因植物叶片的 RNA和通过使用特殊的引物用多聚酶链式反应(PCR)测试病毒RNA的 存在。
本发明也涉及一个植物细胞或者其它部分，其根据本发明用核酸序列 转化作为砧木。而且，本发明也包含由此转基因植物生产出的种子，其中 种子也包括转化到植物中的核酸序列。
通过常规的育种程序，转基因抗性植物可为了砧木的大批量生产被繁 殖。而且，育种可用于引导DNA构建体到其他各种相同的或者相关的植 物物种，或者到杂交植物中。从转基因植物获得的种子包含作为一个稳定 的基因组插入的核酸序列，这样，本发明也包含在此描述的转基因植物的 转基因后代，其由转基因植物的种子长成。任何一种上面描述到的转基因 植物可作为砧木，根据本发明的教导，幼芽被嫁接到其上。
用本发明的核酸序列转化以提供转基因抗性砧木的植株，其挑选的实 施是用已为所属领域的普通技术人员所知的分子遗传学的标准方法。根据 一个实施方案，核酸序列也包括一个核酸序列，其编码授予抗生素抗性的 产物，而且这样转基因植物根据它们对抗生素的抗性来选择。根据某些实 施方案，作为选择性标记的此抗生素属于由巴雷霉素和卡那霉素组成的氨 基糖苷组。根据其他的实施方案，核酸序列还包括一个编码可检测产物的 报告基因，而且这样产物在其中被检测到的转基因植物被挑选出来。根据 某些实施方案，报告基因选自GUS、GFP和类似物组成的组。
根据另一实施方案，根据其对病毒侵染的抗性，转化以提供抗性砧木 的植株被挑选出来。被选择以挑战植物的病毒在其基因组中包括此转化到 植物中的核酸序列。根据一个实施方案，转基因植株根据其对一种土传病 毒的抗性被挑选出来，病毒选自此组病毒包括(但不受限于)，线虫传播 病毒：线虫传多面体病毒属病毒：南芥菜花叶病毒、葡萄扇叶病毒、番茄 黑环斑病毒、树莓环斑病毒、番茄环斑病毒和烟草环斑病毒；烟草脆裂病 毒属病毒：豌豆早褐病毒、烟草脆裂病毒和辣椒环斑病毒；真菌传播的病 毒：黄瓜叶斑病毒、黄瓜坏死病毒、甜瓜坏死斑病毒、红三叶草坏死花叶 病毒、南瓜坏死病毒、烟草坏死卫星病毒、莴苣巨脉病毒、辣椒黄脉病毒、 甜菜坏死黄脉病毒、甜菜土传病毒、燕麦金色条纹病毒、花生丛簇病毒、 马铃薯帚顶病毒、水稻条纹坏死病毒、土传小麦花叶病毒、大麦和性花叶 病毒、大麦黄花叶病毒、燕麦花叶病毒、水稻坏死花叶病毒、小麦梭条斑 花叶病毒和小麦黄花叶病毒；通过根部伤口传播的病毒：烟草花叶病毒属 病毒：烟草花叶病毒、番茄花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、黄瓜果实斑 驳花叶病毒、Kyuri绿斑驳花叶病毒、齿兰环斑病毒、红辣椒轻斑驳病毒、 辣椒轻斑驳病毒、长叶车前花叶病毒和烟草轻绿花叶病毒；通过不明途径 传播的病毒：豆瓣菜黄斑病毒、蚕豆坏死萎蔫病毒、桃纵簇病毒和甘蔗褪 绿条纹病毒。
根据另一实施方案，根据其对由感染植株地上部分的载体传播的病毒 的抗性挑选转基因植物，病毒选自一个科，所述科包括(但不受限于)： 花椰菜花叶病毒科、双生病毒科、圆环病毒科、呼肠孤病毒科、 Tartitiviridae、雀麦花叶病毒科、豇豆花叶病毒科、马铃薯Y病毒科、番 茄丛矮病毒科、伴生病毒科、Clostroviridae和黄症病毒科；烟草花叶病毒 组、烟草脆裂病毒组、马铃薯X病毒组、香石竹潜病毒属、葱X病毒属、 线形病毒属、凹陷病毒属、发状病毒属、葡萄病毒属、真菌传杆状病毒组、 花生丛簇病毒属、马铃薯帚顶病毒属、甜菜坏死黄脉病毒属、大麦条纹花 叶病毒组、南方菜豆花叶病毒组、玉米雷亚朵非纳病毒属、芜苓黄花叶病 毒组、悬钩子病毒属、Ourmivirus和幽影病毒属。
根据另一方面，本发明涉及用本发明的方法产生的抗病毒嫁接植株。 本来易感病毒病的幼芽被嫁接到一转基因的抗性砧木，包括此幼芽的植株 抗病毒病。此砧木包括根据本发明稳定地整合到其基因组的核酸序列。核 酸序列或者是高度地被转录的单个转基因，或者是如在此上面描述的产生 siRNA的转基因，其性质决定授予嫁接植株的抗性特征。根据某些实施方 案，砧木授予保护而不被土传病毒导致的疾病的侵害。根据其他实施方案， 砧木授予对一种由侵染植株的地上部分的载体传播的病毒导致的疾病的 抗性。
接下来的在此下面的非限制性的实施例描述抗性植株，根据本发明其 包括砧木和幼芽。除非在实施例中另外陈述，所有园艺方法和重组DNA 与RNA技术一样，根据已为所属领域的普通技术人员熟知的标准的步骤 实施。
实施例
实验流程
构建双元载体pCAMSV54-kDa
利用前述Antignus等的全长克隆技术，将位于3629位点(图1A)的 带有AUG上游22个核苷酸的假定为54-kDa的编码序列克隆到 pCambia2301双元载体中(注册号AF234316；Hajdukiewicz等，1994.Plant Mol Biol 25：989-994)。54kDa编码序列的5’端与ZYMV的非编码区(NCR) 融合，3’端(T)与NOS多聚A终止子融合(图1B)。所克隆基因与N PTII 标记基因分别克隆于截短的草莓镶脉病毒(SVBV)启动子(下文称为SV) 和全长的SVBV启动子下游(Wang等，2000.Virus Genes 20：11-17，图 1B)。此DNA构建体克隆于T-DNA左端(LB)和右端(RB)之间(图1B)。 与ZYMV5’NCR相接的SV启动子是利用SV的正向引物(序列ID NO：5： 5’CGCTAGCTATCACTGAAAAGACAGC3’)和带有NcoI酶切位点(标有 下划线)的反向引物(序列ID NO：6：5’GGCCATGGTTATGTC TGAAGTAAACG 3’)以ΔSVBVpr-ZYMV-FLC克隆(Wang等，见上文) 为模板PCR扩增的。将PCR片段(470bp)克隆到pGEM-T载体(Promega， Madison，WI，USA)中，定名为pΔSVBV-NCRzy。
54-kDa编码序列是利用以下引物从pUC3’-3.3kb PCR扩增的： 5’CGGCCATGGCATCGAAGGCGGGTTTTTGGACG3’(54-kDa正向，携带 的NcoI酶切位点以下划线标记，序列ID NO：7)， 5’GAGGTGACCTAGACACTAGGCTTAATGAATAG3’(54-kDa反向，携 带的BstEII酶切位点以下划线标记，序列ID NO：8)。由PCR扩增的推测 的54-kDa片段(1461bp)经NcoI/BstEII酶切后克隆到经NcoI/BstEII酶 切的pΔSVBV-NCRzy中。将得到的克隆pΔSVBV-NCR54-kDa用 EcoRI/BstEII双切，将得到的插入片段克隆到经EcoRI/BstEII双切的双元 载体pCAMBIA2301中。经以下流程，将pCAM35S-SV54-kDa中的35S 启动子(位于NPTII基因上游)替换为完整的SVBV启动子：之前已将 SVBV启动子克隆到pGEM-T中，定名为SVBVpr(Wang等，见上文)， 从该克隆的EcoRI/BglII位点将SVBV启动子双切下来，然后克隆到双元 载体的相同位置并定名为pCAMSV54-kDa。将构建的最终载体(图1B) 导入农杆菌EHAl05菌株中，用于目的植株的转化。
用于产生siRNA的DNA构建体pCddCP-ZY的构建
利用PCR方法，将包括编码病毒外壳蛋白的完整基因和3’非编码区 (NCR)(序列ID NO：2，注册No.M35095)在内的ZYMV基因组3’端扩增 出来，所用引物为含BamHI和KpnI酶切位点的正向引物 (5’ATGGATCCCTGCAGTCAGGCACTCAGCCAACTGTGGC3’序列ID NO：10)和含NarI和PstI酶切位点的反向引物 (5’ATGGCGCCGGTACCAGGCTTGCAAACGGAGTC3’序列ID NO：11)。 该片段是从一种ZYMV的以色列种中分离的，与注册号为NC 0033224 (序列ID NO：9)的ZYMV基因组核酸序列的8538到9588位点同源。
首先，将一个过氧化氢酶内含子克隆到KS Bluescript载体的多克隆位 点。克隆的过氧化氢酶内含子5’端含BamHI和PstI酶切位点，3’端含NarI 和KpnI酶切位点。将ZYMV基因组3’端的PCR产物(1050bp)用KpnI 和NarI双切，将酶切后的片段克隆到KS质粒中过氧化氢酶内含子的下游 (3’端)。然后将PCR产物用BamHI和PstI双切，将酶切产物克隆到KS质 粒中过氧化氢酶内含子的5’端。这将在KS质粒中产生一个由过氧化氢酶 内含子分隔的ZYMV基因组3’端的反向重复序列。将此克隆定名为 pKSddCP-ZY。来自一个pCambia双元载体2301的35S CaMV启动子被 SVBV启动子取代。前面描述的构建体pKSddCP-ZY，被BamHI和KpnI 剪切，而且克隆到合适的位点BamHI和KpnI(SVBV启动子的下游和NOS 终止子的上游)。将此新克隆命名为pCddCP-ZY(图2)。
农杆菌介导的转化
农杆菌培养物在含有合适的选择性的抗生素和100μM乙酰丁香酮的 LB培养基中于28℃生长一夜，然后在相同的环境下在没有抗生素的培养 基中亚培养4h。细菌沉降下来并在包含3％蔗糖最终密度为0.5OD的液体 MS培养基中重新悬浮(Murashige，T.和Skoog，F.1962.Physiology Plantarum 15：473-497)。转化的方法如前面描述的(Tabei等，1998Plant Cell report 17：159-164)，作了一些修改。
黄瓜的转化
‘Ilan’品种(Zeraim Gedera Co.，以色列)去皮的黄瓜种子通过在70％ 乙醇中温育1min，然后在2％的次氯酸盐溶液中温育20min表面灭菌。粗 洗后，这些种子在包括3％的蔗糖和0.8％的Oxiod琼脂的MS培养基中于 25℃在黑暗中温育1-2d。种胚被切除了，而且单个的子叶在具200μM的 乙酰丁香酮的再生培养基中(MS培养基、3％蔗糖、2mg/l苄基腺嘌呤 (BAP)、1mg/l脱落酸(ABA)、0.8％Oxoid琼脂)于25℃在黑暗中温 育1-2天。子叶在农杆菌悬浮液中浸泡5min，在滤纸上吸干后转到相同的 平板上在黑暗中共培养2天。接着外值体被转移到选择培养基(补充了 500mg/l的Cefatoxim和100mg/l的卡那霉素的再生培养基)并在一个 16/8-h的光周期下温育亚培养两周。再生的芽被剪切并转移到继代培养基 (MS、3％的蔗糖、1mg/l的赤霉酸、0.1mg/l的BAP、0.1mg/l的ABA、 0.8％的Oxoid琼脂、500mg/lCefatoxim和100mg/l的卡那霉素)。芽的生 根的诱导是在MS、3％的蔗糖、0.5mg/l的吲哚丁酸、0.8％的Oxoid琼脂、 500mg/lCefatoxim和100mg/l的卡那霉素中。在转移到温室中继续生长前， 生根的小苗移植到Jiffy7泥炭球中锻炼。
烟草的转化
来自无菌植株的叶子外植体在补充了200μM的乙酰丁香酮的再生培 养基(MS培养基、3％的蔗糖、1mg/l的苄基腺嘌呤(BAP)、0.1mg/l的 萘乙酸(NAA)、0.8％的Oxoid琼脂)中于25℃在黑暗中温育1-2天。 外植体在农杆菌悬浮液中浸泡5min，在滤纸上吸干后转到相同的平板上 在黑暗中共培养两天。外植体接着被转移到选择培养基(补充了500mg/l 的Cefattoxim和100mg/l的卡那霉素的再生培养基)并在一个16/8-h的光 周期下温育亚培养两周。再生的芽被剪切并转移到生根培养基(MS、3％ 的蔗糖、0.8％的Oxoid琼脂、500mg/lCefatoxim和250mg/l的卡那霉素)。 在转移到温室中继续生长前，生根的小苗移植到Jiffy7泥炭球中锻炼。 R1苗的分离(segregation)分析
单独的转化植株的后代被筛选以分离DNA构建体，如下：R1种子被 表面灭菌并在100mg/l的卡那霉素存在的条件下于如上面描述的条件下发 育。转基因种子(具NPT II基因)显示出正常的根的生长，然而非转基因 后代植株容易被检测到根据其的萎缩的未分支的根。记录了抗卡那霉素/ 易受卡那霉素影响的比率，而且转基因苗被用于更进一步的试验中。
抗性反应的评估
在温室环境下筛选了抗卡那霉素的具病毒抗性的R1苗。
对CFMMV的抗性
用纯化的CFMMV以1mg/ml在50mM的磷酸缓冲液(pH7.4)，或 者用病毒RNA以400μg/ml在50mM的磷酸缓冲液(pH8.0)机械地接种 抗卡那霉素的黄瓜植株。对于大多数转基因后代，通过接种初始筛选了多 于10的小苗。接种苗在温室条件下放置数周。通过肉眼观察症状，并且 通过DAS-ELISA用浓度稀释到1∶1000的一种特殊的抗血清检查CFMMV 的存在(Antignus等.如前)测定了小苗对接种的反应。进一步的抗性分 析在接种后三个星期通过机械的回接烟草(N.benthamiana)和曼陀罗 (Datura stramonium)来实施。
对ZYMV的抗性
抗卡那霉素的表达GUS的烟草植株被机械地接种是用稀释到1∶5的 比率的来自用ZYMV和一种烟草花叶病毒属病毒(暂时地鉴别是黄瓜绿 斑驳花叶病毒(CGMMV))共侵染的烟草植株的汁液，CGMMV被作为 使得ZYMV系统传播的工具。对于大多数转基因后代，通过接种多于10 个小苗被初始筛选出来。接种的小苗在温室条件下放置数周。用一种稀释 到1∶2,000的特殊的ZYMV-CP抗血清通过ELISA测定了它们对接种的 反应。
在子叶阶段的黄瓜苗被用来嫁接。使用顶接的方法，在子叶节下的茎 处斜切后，未转化的幼芽被嫁接并安置到转基因或者未转化的砧木苗的上 端，砧木以保留一个子叶的方式也在子叶节处斜切(这样嫁接苗保留三个 子叶)。三周大的烟草幼苗通过对砧木茎的斜切和安置上一个类似地斜切 的幼芽而顶接。幼芽/砧木的结合用小的塑料别针而固定在原处。在第一 周嫁接植株维持在高的湿度。
植株的接种
黄瓜幼苗用作维持CFMMV、KGMMV、ZGMMV、CGMMV和黄瓜 脉黄病毒(CVYV)培养物的植株源。南瓜植株用作ZYMV和CMV-Fny的 接种源。在蒸馏水中研磨源植株的幼叶准备接种体。
用金刚砂喷洒后，机械地接种子叶(萌芽后3天)。通过把已试植株 从聚苯乙烯盘移植到含有病毒侵染了的珍珠岩基质的塑料罐(直径10cm) 中而接种根。在0.01M的pH为7的磷酸缓冲液以1∶100的比率研磨病 毒侵染了的黄瓜叶准备粗接种体。在四片真叶阶段，通过在病毒侵染的植 株的茎上斜切而嫁接接种。剪掉了将要被接种的植株的顶端部分并在插入 受侵染的砧木的斜切部分之前将植株茎的下面部分修剪成楔形。幼芽和砧 木连接的位置用封口膜带绑住以使它们更好的融合。在第一周嫁接植株放 置在塑料袋中以维持高的湿度。
病毒如文中描述的从受侵染的植株中部分地纯化(Chapman S.N.1998. in Plant Virology Protocols.G.D.Foster和S.C.Taylor，Eds.Humana Press， New Jersey：123-129)。部分纯化的病毒粒子1∶1与2X SDS-PAGE上样 缓冲液混合并煮沸5分钟。(Sambrook等1989.Molecular cloning-A LABORATORY MANUAL，Second Edition)。煮沸的材料(10μl)在12.5％ 的聚丙烯酰胺凝胶上用SDS-PAGE分离。
提取和分离RNA、Northern点杂交和RT-PCR
病毒RNA的转录通过Northern点杂交和RT-PCR分析从萌芽后三个 星期的幼苗中提取的总RNA来测定。将嫩叶组织(300mg)在液氮中研 碎成细粉且根据厂家的说明用TRI-REAGENT试剂盒提取RNA(Molecular Research Center，Inc.，Cincinnati，OH，USA)。用GeneQuant(Pharmacia Biotech)测定了RNA的浓度，来自不同来源的量相当的RNA在胶上点 样。每个样品约30μg在含有甲醛的变性1.5％琼脂糖凝胶上跑胶。在胶上 分离的RNA接着与Hybond-NX膜(Amersham，NJ，美国)杂交并暴露在 80W的UV灯(Vilber Lourmat BLX-254，法国)下两分钟而固定。与 Rapid-hyb缓冲液(American Pharmacia)的预杂交进行了两小时。通过与 32P标记的CFMMV(核苷酸3824-4693)的54kDa的基因的cDNA探针杂交 检测转化植株中的CFMMV RNA，CFMMV具一个随机引物的32P标记的 DNA探针(随机引物DNA标记混合试剂盒；以色列Bei HaEmek生物公 司)。用RT-PCR检测接种植株中的CFMMV RNA的操作是用2-5μg的 总RNA在一个试管中以单步法，根据Arazi等(2001.J Biotechnol 87：67-82) 用54kDa的基因的特殊引物(有义：5’GCTACGGAGCGTCCGCGG3’，序 列ID NO：12和反义：5’CGCGGTCGACTGTATGTCAT3’，序列ID NO： 13)进行。RT-PCR循环如下：46℃30分钟；94℃2分钟，接着是在94℃、 58℃和72℃下循环35次，每次30秒，且最后的循环是在72℃5分钟。 用于化验各种烟草花叶病毒属病毒(图3)的传染性的RT-PCR的操作为 两步，用下列病毒的CP基因组的特殊的引物：
CGMMV(5’TCTGACCAGACTACCGAAAA3’，序列ID NO：14和 5’ATGGCTTACAATCCGATCAC3’，序列ID NO：15)；
KGMMV(5’GAGAGGATCCATGTTTCTAAGTCAGGTCCT3’，序列ID NO：16和5’GAGAGAATTCTCACTTTGAGGAAGTAGCGCT3’，序列ID NO：17)；
ZGMMV(5’TCTATCGTTAACGCAGC3’，序列ID NO：18和 5’ATGTCTTACTCTACTTCTGG3’，序列ID NO：19)；和
CFMMV(5’CAAGACGAGGTAGACGAAC 3’，序列ID NO：20和 5’ATGCCTACTCTACCAGCG3’，序列ID NO：21)。RT-PCR的操作是在 i-cyler(Bio-Rad)中用RT-PCR AmpTaq试剂盒(Perkin Elmer)，且循环步 骤是在37℃1hr和在94℃中1min，退火40s温度在53℃(KGMMV)、 52℃(ZGMMV、CGMMV)或44℃(CFMMV)，在72℃1min循环30个周期， 最后在72℃10min。
DNA提取和PCR分析
用CTAB方法(Chen，D.H.和Ronald，P.C.1999.Plant Mol Biol Reporter 17：53-57)从幼叶(萌芽后3周)中提取总的基因组DNA。DNA溶液(1μl) 在25μl的PCR反应混合液中稀释，其包括根据CFMMV 54kDa的基因(注 册号AF321057，序列ID NO：4)的序列而得的引物。用两套引物检测此 54kDa的基因：第一套引物位于3824和4693(序列ID NO：12和序列ID NO：13，图4)和第二套引物位于3785和4479 (5’GAAAAAGGAGTTTTTGATCCCGCT3’，序列ID NO：22和 5’ACTGATATGCGTCTTCTTATGCCC3’，序列ID NO：23；图3)。PCR条 件为：在94℃下2min循环一次，在94、58和72℃每个温度下30秒循环 35次，最后在72℃下5分钟。
实施例1：抗性黄瓜株系的鉴别和鉴定
在用pCAMSV 54kDa的构建体进行农杆菌介导的转化后，单个R0转 化株生长至成熟，并自交得到R1种子。植物基因组中CFMMV 54kDa基 因的存在用PCR分析证实，对表1所示的所有的抗卡那霉素的R1株系。 在筛选了抗性株系后，14个R1株系中的8个表现出完全的抗性反应(表 1)。剩余的株系中的一些是完全易感的；其他的具部分抗性的特征。没 有试图去估计接种的子叶中CFMMV RNA的积累。然而，在八个抗性复 制酶株系的上部叶片中没有发现病毒的积累，就如大多数的株系用ELISA 和回接的方法分析显示的。相同地，当植株生长在更高的温度下(30-35℃) 抗性反应保持不变。
表1：筛选抗CFMMV的包含54kDa基因的R1转基因黄瓜株系

a每一编号的株系代表单个R0转基因植株的后代。‘Ilan’是亲本未转化 品种。
b通过机械地用纯化的1mg/l的病毒接种，估计了抗卡那霉素的R1幼 苗对CFMMV的抗性。显示总的接种苗中易感幼苗的数目(侵染了的/接 种了的)。完全抗性株系用黑体字显示。
c通过回接到烟草(N.benthamiana)分析了未显示症状的幼苗中 CFMMV的积累情况。记录了接种三个星期后在烟草(N.benthamiana)上 系统的症状(+)或缺乏症状(-)。n.t.未检测
实施例2：在同源I44株系中抗性的鉴定
进行的对R44株系的抗性特征的进一步的研究(表1)表明因单个 NPT II内含子可表现出假定的分离。因为遗传一致性，R44株系的十个不 同R1植株的种子如在此上面描述的那样在具卡那霉素的条件下萌发，一 个转基因位点未分离的R2纯合基因系(这样命名为I44株系)被发现了， 并用于进一步的研究。I44植株表现出正常的表型和正常的果实生长，不 能与源品种‘Ilan’区分开来。
亲本株系‘Ilan’对接种CFMMV高度敏感(表1)且在接种14天后具 有明显的花叶症状，接着是叶子变形、植株萎蔫和具黄斑的畸形果(图5)。 相比之下，I44植株对用植株提取物(表2，图5)和纯化的RNA机械接 种具完全的抗性(数据未显示)。在温室中土壤介导的CFMMV的接种 是病毒流行开始的触发因子(Antignus，未发表)。于是，检查了在故意 用CFMMV接种病土中种植的I44幼苗的反应。而且，也用最多的侵略性 的接种方法挑战了I44株系，即，嫁接到一侵染了的易感砧木(品种‘Ilan’) 顶端。I44植株保持着没有症状，并且不论用何接种方法，无论用ELISA 或者通过回接到易感宿主(烟草(N.benthamiana)和黄瓜)的方法都不 能检测到病毒的积累。
表2：I44株系对机械的、土壤或者嫁接接种CFMMV的反应

a嫁接接种是通过嫁接I44或者‘Ilan’幼芽到受感染的‘Ilan’砧木顶端。
b在I44和未转化的‘Ilan’植株感染率是在接种4周后计数，为总的接 种植株中表现症状的植株的数目。
c回接是通过用来自接种4周后的接种植株的提取汁液机械地接种烟 草来实施。n.t.＝未检测
实施例3：I44抗性株系的分子鉴定
在I44株系的基因组中病毒核酸序列的存在通过PCR(图4C)和 Southern点杂交(数据未显示)来证实。接种或未接种的I44植株中，54kDa 的编码序列的转录通过RT-PCR来检测(图4A)。相反地，来自I44植 株的总RNA制品的PCR反应是阴性(图4C)，说明图4A中RT-PCR扩 增的带不是因为在RNA准备时污染了DNA片段。RT-PCR分析方法被用 来评定CFMMV接种了的I44株系中无症状是否是由于缺乏病毒的积累。 用CFMMV外壳蛋白(CP)的特殊的引物在I44株系中没有发现扩增带，与 在接种了的‘Ilan’植株中存在确定的CP带形成对比(图4B)。这些结果 进一步证明了在I44植株中不能检测到病毒积累迹象的观察。
实施例4：筛选对其他烟草花叶病毒属病毒的抗性
以前已显示复制酶介导的抗性表现出高的序列特异性。这样，检查了 I44株系对各种侵染葫芦的烟草花叶病毒属病毒的侵染的反应。株系I44 和未转化‘Ilan’品种用三种另外的烟草花叶病毒属病毒接种：KGMMV、 ZGMMV和CGMMV。未转化的品种‘Ilan’，用KGMMV和ZGMMV接种 的，在接种8天后(dpi)，并且用CFMMV和CGMMV的在其后2天开 始出现症状(表3)。观察到在株系I44中症状的出现很明显的推迟了： 用CGMMV和ZGMMV接种的症状在14dpi可见，用KGMMV接种的在 20dpi可见。此外，在用CGMMV感染的I44植株上观察到在整个试验过 程中(30dpi)症状显著地变轻，与未转化植株上表现的严重的症状形成 对比(表3)。通过SDS-PAGE检测纯化的病毒体和RT-PCR测定病毒 RNA(图3)确定了I44对烟草花叶病毒属病毒的侵染的反应。ZGMMV、 CGMMV和KGMMV病毒体的积累在I44和对照‘Ilan’植株中清楚地检测 到；然而，CFMMV病毒体仅在后者中检测到(图3A)。此外，虽然和 在未转化对照植株中一样，在I44植株中用RT-PCR检测到了CGMMV、 KGMMV和ZGMMV的病毒RNA，但是CFMMV RNA仅在对照‘Ilan’植 株中发现(图3B)。
表3.I44植株对用各种葫芦烟草花叶病毒属病毒感染的反应

a黄瓜植株在子叶阶段被接种，在接种后30天(30dpi)的时期症状 的严重性(花叶扩散和萎蔫)被计为1+到5+。(-)无症状。数据是每一 处理10株苗的两个独立试验的综合。
实施例5：病毒接种了的植株中转化了的核酸序列的转录
株系I44对CFMMV侵染显示的特异性和显著的抗性可能预示着 RNA介导的抗性机制的流行，可能与RNA沉默有关。为了检测这一假说， 在用CFMMV接种前或后从株系I44和‘Ilan’植株中提取了总的RNA。用 一个标记了的54kDa的探针通过Northern点杂交分析了相同量的总的 RNA样品。探针与CFMMV基因组RNA(上面的条带)杂交，假定的亚 基因组RNA I1具此54-kDa基因，并具此54-kDa的转基因转录产物。就 和所期待的一样，I44植株中的转录产物比在受侵染的对照植株中检测到 的I 1亚基因组RNA短(图6)。此54-kDa的转录产物仅在株系I44植 株中发现，且预先用CFMMV或ZYMV接种I44植株，转录产物的积累 水平未大致地受影响(图6)。已显示，通过在用此病毒挑战植株之前接 种马铃薯Y病毒属病毒或者改变温度条件(Szittya等.2003.EMBO J 22：663-640)，沉默介导的病毒抗性可被抑制(Savenkov，E.I.和Valkonen， J.P.2002.J Gen Virol 83：2325-2335)。在用下面的马铃薯Y病毒属病毒预 接种后，评价了株系I44的植株对CFMMV的抗性：ZYMV、小西葫芦斑 花叶病毒(ZFMV)和黄瓜脉黄化病毒(CVYV，番薯属病毒属，马铃薯 Y病毒科)、或者用黄瓜花叶病毒(CMV)(表4)。I44植株表现出了 单独的马铃薯Y病毒属病毒或CMV感染的典型的症状，但是在连续的感 染中保留了对CFMMV的抗性，这通过ELISA和回接曼陀罗证实。此外， 在接种了的植株生长在生长室不同的温度下(20、28或35℃)，株系I44 对CFMMV侵染的抗性未受影响。
表4：I44在用其他病毒接种后对CFMMV的抗性

实施例6：通过I44砧木保护易感病幼芽
烟草花叶病毒属病毒颗粒在土壤中存活很长时间，且CFMMV通过处 于病土的根侵染是一个普遍的现象。既然株系I44显示出对土壤接种 CFMMV的抗性(表2)，我们检测了用作保护未转化的幼芽的砧木的此 株系的适应性。
对照Ilan植株嫁接到株系I44或者Ilan砧木，并种在CFMMV侵染的 土壤中。大多数(12/16)嫁接到未转化的Ilan砧木的植株表现出明显的 CFMMV症状，且用ELISA检测为阳性。然而，嫁接到I44上的幼芽没有 一株(0/16)在整个试验期间(5周)为受感染了的，这可通过肉眼可见 的症状、ELISA检测和回接到烟草来评定。在平行试验中，嫁接到I44砧 木上的‘Ilan’幼芽对用CFMMV直接机械的接种敏感。
实施例7：抗性烟草砧木保护易感病幼芽
如在此前面所描述的那样，烟草叶盘被具pCddCP-ZY构建体的根癌 农杆菌转化了。在再生基质上挑选后，单个的假定转化体通过GUS鉴别。 证实的转化体自交产生R1代。筛选了来自单独的转化植株的后代以分离 DNA构建体，如下：R1种子表面灭菌且在250mg/l卡那霉素的存在下萌 发。转基因种子(具NPT II基因)表现了正常的根的生长，然而根据其 萎缩的和未分支的根，非转基因后代植株很容易被发现。记录了抗/感卡 那霉素的比率，且转基因幼苗被用于接种试验。
抗卡那霉素表达GUS的烟草R1幼苗用来自烟草植株(用ZYMV和 一种暂时地被认为是黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)的烟草花叶病毒共 感染，CGMMV作为帮助ZYMV系统传播的工具)的稀释到1∶5的比率 的汁液机械地接种。对大多数转基因后代，多于10株的幼苗由接种被初 始筛选出来。接种的幼苗在温室条件下放置数周。用准备成1∶2,000的 特定ZYMV外壳蛋白的抗血清的稀释液通过ELISA测定对接种的反应。
在下面的嫁接试验中，选出来的转基因株系用作砧木。通过在砧木茎 上斜切和安上一个相似地斜切了的幼芽，3周大的烟草幼苗被顶接。用小 的塑料带包扎幼芽/砧木接合处以固定在原处。在第一周嫁接的植株保持 在高湿度。对幼芽机械的接种用稀释到1∶5比率的汁液(如在此上面描 述的那样，来自用ZYMV和一种烟草花叶病毒属病毒共侵染的烟草植株) 在嫁接后3到4周进行。接种的嫁接植株在温室环境下放置数周。用一种 准备成1∶2,000的特殊的ZYMV-CP抗血清的稀释液通过ELISA测定对 接种的反应。在某些试验中，在接种了的幼芽中ZYMV的存在通过回接 种到易感南瓜植株上测定。这些结果总结在下面的表5中。
表5：通过转基因砧木授予幼芽的对ZYMV的抗性

未嫁接的对照烟草或者嫁接到非转基因砧木的幼芽分别表现出89％ 和70％的高的感病率。嫁接到转基因株系的幼芽的反应可被分成两组：嫁 接到砧木株系Z89、Z99和Z102的那些植株被完全保护而不受ZYMV的 系统侵染；嫁接到砧木株系Z97、Z100和Z101的那些植株很少显示疾病 的症状。在少数受保护的砧木中，接种的幼芽中不含ZYMV是通过回接 到南瓜植株而证实。
前述的对特定实施方案的描述将充分地揭示本发明的一般性质以至 于其他人能通过应用现有的知识，在无不适当的试验和不偏离普通概念的 条件下为了各种应用易于去修改和/或改变这些特殊的实施方案，并且， 因而这样的改变或者修改应该而且意为包括在所公开的实施方案的同等 物的意思和范围中。应理解在此用到的措辞和术语是为了描述的目的而不 是为了限制。这些得到各种公开的化学结构和功能的方法、材料和步骤可 采用许多可选择的形式而不偏离本发明。
序列表
<110>以色列国农业部，农业研究所，沃尔卡尼中心，
Gal-On，Amit
Zelcer，Aaron
Wolf，Dalia
Gaba，Victor P
Antignus，Yehezkel
<120>抗病毒病的嫁接植株和产生相同植株的方法
<130>KIDUM/010/PCT
<160>21
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1461
<212>DNA
<213>黄瓜果实斑驳花叶病毒
<400>1
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<210>2
<211>1050
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<213>小西葫芦黄化花叶病毒
<400>2
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<213>蓖麻
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<400>4
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<212>DNA
<213>小西葫芦黄化花叶病毒
<400>9
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<220>
<223>单链DNA寡核苷酸
<400>20
caagacgagg tagacgaac                                        19
<210>21
<211>19
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>单链DNA寡核苷酸
<400>21
atgccttact ctaccagcg                                       19