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一种豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测用简并引物、检测方法及其应用

阅读：776发布：2020-05-16

IPRDB可以提供一种豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测用简并引物、检测方法及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测用简并引物、检测方法及其应用，由正向和反向引物组成，其正向引物的核苷酸序列见SEQIDNo.1：5′-TGTGAYTAYWVNVVNTTYGATGG-3′；反向引物的核苷酸序列见SEQIDNo.2：5′-YTTRTCHBTVCCATCVGTAAT-3′；其中，Y=C/T，W=A/T，V=G/A/C，N=A/G/C/T，R=A/G，B=G/T/C，H=A/T/C。本发明引物通用性好，检测方法快速准确，为进出口安全提供了保证。，下面是一种豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测用简并引物、检测方法及其应用专利的具体信息内容。

1.一种豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测用简并引物，其特征

在于由正向和反向引物组成，其正向引物的核苷酸序列见SEQ ID No.1：

5′-TGTGAYTAYWVNVVNTTYGATGG-3′；反向引 物的核苷 酸序列见SEQ ID No.2：

5′-YTTRTCHBTVCCATCVGTAAT-3′；其中，Y=C/T，W=A/T，V=G/A/C，N=A/G/C/T，R=A/G，B=G/T/C，H=A/T/C；所述的豇豆花叶病毒亚科病毒是指南芥菜花叶病毒ArMV、烟草环斑病毒TRSV、番茄环斑病毒ToRSV、樱桃卷叶病毒CLRV、烟草黑环病毒TBRV、桃丛簇花叶病毒PRMV、葡萄扇叶病毒GFLV、悬钩子环斑病毒RpRSV、乌饭树叶斑驳病毒BLMoV、菜豆荚斑驳病毒BPMV、豇豆花叶病毒CPMV、豇豆重花叶病毒CPSMV、蚕豆染色病毒BBSV、南瓜花叶病毒SqMV、红三叶草斑驳病毒RCMV、萝卜花叶病毒RaMV及蚕豆萎蔫病毒1 BBWV1。

2.一种豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测的检测方法，其特征在于包括如下步骤：以样品总RNA为模板，利用如权利要求1所述的引物进行RT-PCR扩增，反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，根据扩增DNA片段的位置判定结果，病症叶片中均能检出407~451 bp的DNA片段；所述的豇豆花叶病毒亚科病毒是指南芥菜花叶病毒ArMV、烟草环斑病毒TRSV、番茄环斑病毒ToRSV、樱桃卷叶病毒CLRV、烟草黑环病毒TBRV、桃丛簇花叶病毒PRMV、葡萄扇叶病毒GFLV、悬钩子环斑病毒RpRSV、乌饭树叶斑驳病毒BLMoV、菜豆荚斑驳病毒BPMV、豇豆花叶病毒CPMV、豇豆重花叶病毒CPSMV、蚕豆染色病毒BBSV、南瓜花叶病毒SqMV、红三叶草斑驳病毒RCMV、萝卜花叶病毒RaMV及蚕豆萎蔫病毒1 BBWV1。

3.如权利要求2所述的一种豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测的检测方法，其特征在于：所述的RT-PCR反应包括反转录和PCR扩增两个过程。

4.如权利要求3所述的一种豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测的检测方法，其特征在于：所述的RT-PCR的反应过程中反转录反应的温度为42℃，PCR扩增时先用退火温度

42℃进行5个循环，然后用退火温度50℃进行30个循环，延伸温度为72℃。

5.一种如权利要求1所述豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测用简并引物的应用，其特征在于：所述的引物对样品总RNA进行RT-PCR扩增后对所扩增的DNA片段进一步序列测定后，能快速鉴定豇豆花叶病毒亚科病毒的种类,所述豇豆花叶病毒亚科病毒为南芥菜花叶病毒ArMV、烟草环斑病毒TRSV、番茄环斑病毒ToRSV、樱桃卷叶病毒CLRV、烟草黑环病毒TBRV、桃丛簇花叶病毒PRMV、葡萄扇叶病毒GFLV、悬钩子环斑病毒RpRSV、乌饭树叶斑驳病毒BLMoV、菜豆荚斑驳病毒BPMV、豇豆花叶病毒CPMV、豇豆重花叶病毒CPSMV、蚕豆染色病毒BBSV、南瓜花叶病毒SqMV、红三叶草斑驳病毒RCMV、萝卜花叶病毒RaMV及蚕豆萎蔫病毒

1 BBWV1。

6.一种如权利要求1所述豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测用简并引物的应用，其特征在于：所述豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测用简并引物用于制备豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测试剂盒，所述豇豆花叶病毒亚科病毒为南芥菜花叶病毒ArMV、烟草环斑病毒TRSV、番茄环斑病毒ToRSV、樱桃卷叶病毒CLRV、烟草黑环病毒TBRV、桃丛簇花叶病毒PRMV、葡萄扇叶病毒GFLV、悬钩子环斑病毒RpRSV、乌饭树叶斑驳病毒BLMoV、菜豆荚斑驳病毒BPMV、豇豆花叶病毒CPMV、豇豆重花叶病毒CPSMV、蚕豆染色病毒BBSV、南瓜花叶病毒SqMV、红三叶草斑驳病毒RCMV、萝卜花叶病毒RaMV及蚕豆萎蔫病毒1 BBWV1。

说明书全文

一种豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测用简并引物、

检测方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测用简并引物、检测方法及其应用。

背景技术

[0002] 豇豆花叶病毒亚科（Comovirinae）属于类小RNA病毒目（Picornavirales）、伴生豇豆病毒科（Secoviridae）中的一个亚科，包含豇豆花叶病毒属（Comovirus）、蚕豆病毒属（Fabavirus）和线虫传多面体病毒属（Nepovirus）等3个病毒属，共有53种病毒。豇豆花叶病毒亚科病毒是一类对农业生产安全造成重要威胁的病毒，多种病毒具有十分广泛的寄主范围，并可造成多种作物严重损失。根据2007年公布的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，该病毒亚科中被列为检疫性病毒的种类有：南芥菜花叶病毒（Arabis mosaic virus, ArMV）、蚕豆染色病毒（Broad bean stain virus, BBSV）、菜豆荚斑驳病毒（Bean pod mottle virus, BPMV）、豇豆重花叶病毒（Cowpea severe mosaic virus, CPSMV）、桃丛簇花叶病毒(Peach rosette mosaic virus, PRMV)、烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus，TRSV)、番茄黑环病毒(Tomato black ring virus, TBRV)、番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus, ToRSV)，共8种。2004年Maliogka等建立了豇豆花叶病毒科（Comoviridae）（即现在的豇豆花叶病毒亚科）病毒通用检测的巢式RT-PCR，但还未见常规的通用RT-PCR检测方法。本申请发明人重新寻找豇豆花叶病毒亚科的RNA1基因组上的保守区域，根据保守区域序列重新设计一对简并引物，通过反转录（reverse transcription, RT）和聚合酶链式反应技术（polymerase chain reaction, PCR）建立了豇豆花叶病毒亚科的通用RT-PCR检测方法，反应结束后根据特异性扩增DNA片段的位置判定结果，并根据序列测定结果进行病毒种类鉴定。

发明内容

[0003] 本发明的目的在于提供了一种豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测用简并引物、检测方法及其应用。本发明引物通用性好，检测方法快速准确，为进出口安全提供了保证。
[0004] 为了达成上述目的，本发明的解决方案是：
[0005] 一种豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测用简并引物，由正向和反向引物组成，其正向引物的核苷酸序列见SEQ ID No.1：5′-TGTGAYTAYWVNVVNTTYGATGG-3′；反向引物的核苷酸序列见SEQ ID No.2：5′-YTTRTCHBTVCCATCVGTAAT-3′；其中，Y=C/T，W=A/T，V=G/A/C，N=A/G/C/T，R=A/G，B=G/T/C，H=A/T/C。
[0006] 一种豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测的检测方法，包括如下步骤：以样品总RNA为模板，利用上述的引物进行RT-PCR扩增，反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，根据扩增DNA片段的位置判定结果，病症叶片中均能检出407~451 bp的DNA片段。
[0007] 所述的RT-PCR反应包括反转录和PCR扩增两个过程。
[0008] 所述的RT-PCR的反应过程中反转录反应的温度为42℃，PCR扩增的先用退火温度42℃进行5个循环，然后用退火温度50℃进行30个循环，延伸温度为72℃。
[0009] 本发明的有益效果为：本发明根据豇豆花叶病毒亚科病毒RNA1基因组序列设计引物，该引物可用于豇豆花叶病毒亚科病毒的通用RT-PCR检测。本发明检测方法能够快速准确地判断样品是否有豇豆花叶病毒亚科病毒，引物通用性好，检测方法快速准确，为进出口安全提供了保证。

附图说明

[0010] 图1是豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR方法对各种亚科病毒的特异性试验结果，包括9种线虫传多面体病毒属（Nepovirus）病毒、7种豇豆花叶病毒属（Comovirus）病毒、和1种蚕豆萎蔫病毒属（Fabavirus）病毒。即，1为南芥菜花叶病毒（ArMV）分离物1病叶、2为烟草环斑病毒（TRSV）病叶、3为番茄环斑病毒（ToRSV）分离物1病叶、4为樱桃卷叶病毒（CLRV）病叶、5为烟草黑环病毒（TBRV）病叶、6为桃丛簇花叶病毒（PRMV）病叶、7为葡萄扇叶病毒（GFLV）病叶、8为乌饭树叶斑驳病毒（BLMoV）病叶、9为悬钩子环斑病毒（RpRSV）病叶、10为菜豆荚斑驳病毒（BPMV）病叶、11为豇豆花叶病毒（CPMV）分离物1病叶、12为豇豆重花叶病毒（CPSMV）分离物1病叶、13为蚕豆染色病毒（BBSV）病叶、14为南瓜花叶病毒（SqMV）病叶、15为红三叶草斑驳病毒（RCMV）病叶、16为蚕豆萎蔫病毒1号（BBWV1）病叶、17为萝卜花叶病毒（RaMV）病叶、18为番茄环斑病毒（ToRSV）分离物2病叶、19为番茄环斑病毒（ToRSV）分离物3病叶、20为豇豆花叶病毒（CPMV）分离物2病叶、21为豇豆重花叶病毒（CPSMV）分离物2病叶、22为南芥菜花叶病毒（ArMV）分离物2病叶、23为南芥菜花叶病毒（ArMV）分离物3病叶，M为100 bp的DNA Mark。
[0011] 图2是应用豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR方法检测健康寄主植物的结果。1-10分别为蒲瓜、普通烟、番茄、黄瓜、南瓜、鹊豆、蚕豆、豇豆、西瓜、百合的健康叶片。 [0012] 图3是应用豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR方法检测百合病叶的结果。1为健康百合叶片的检测结果，2－6为发病百合叶片的检测结果，7为空白对照，M为100 bp的DNA Mark。

具体实施方式

[0013] 下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。 [0014] 实施例1
[0015] 1.引物设计与合成
[0016] 根据豇豆花叶病毒亚科中苏铁坏死矮化病毒（CNSV）、葡萄铬黄花叶病毒（GCMV）、GFLV、黑醋栗退化病毒（BRV）、RaMV、SqMV、BPMV、RCMV、CPMV、CPSMV、BBWV1、蚕豆萎蔫病毒2号（BBWV2）、ArMV、TRSV、GFLV、RpRSV、TBRV、甜菜环斑病毒（BRSV）、PRMV、ToRSV病毒的RNA1基因组序列设计引物，引物序列为：
[0017] SEQ ID No.1（上游）： 5′-TGTGAYTAYWVNVVNTTYGATGG-3′ ；
[0018] SEQ ID No.2（下游）： 5′-YTTRTCHBTVCCATCVGTAAT-3′。
[0019] 为便于测序，在引物中分别引入通用测序引物BCABESTTM Sequencing Primer RV-M和M13-47（下划线），引物序列为：
[0020] SEQ ID No.1（Comov-sf-F2）：5 ′ -GAGCGGATAACAATTTCACACAGGTGTGAYTAYWVNVVNTTYGATGG-3′
[0021] SEQ ID No.2（Comov-sf-R2）：5 ′ -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACYTTRTCHBTVCCATCVGTAAT-3′
[0022] 2.总RNA的提取
[0023] 1）取0.1 g植物发病叶片，加入1 ml的TRIzol（美国Invitrogen公司）试剂，移入灭菌的1.5 ml离心管中，室温下保持5 min；
[0024] 2）加0.2 ml氯仿，剧烈振荡15 s，然后在室温下保持2-15 min后，4℃，12000 g离心15 min；
[0025] 3）将上层水相转移到新的1.5 ml离心管中，加0.5 ml异丙醇，颠倒混匀，室温下保持15 min；
[0026] 4）4 ℃，12000 g离心10 min，RNA就会在管的侧壁和底部形成沉淀；
[0027] 5）倒掉上清液，加入75%的乙醇洗涤沉淀，然后4 ℃，7500 g离心5 min（如沉淀悬浮起来，则用12000 g离心），弃去乙醇；
[0028] 6）沉淀于室温下充分干燥后，溶于40 μl dH2O（DEPC处理）中，-20℃保存备用。
[0029] 3.RT-PCR扩增方法的建立
[0030] 以总RNA为模板，进行RT-PCR反应。20 μL反应体系进行反转录反应，即在0.2 mL的反应管中加入6.75 μL DEPC处理水，4 μL 总RNA，1 μL 的oligo (d T)15引物（10 μmol/L）（宝生物工程（大连）有限公司），1 μL dNTP混合物（10 mmol/L）（具体为dATP、dGTP、dTTP和dCTP四种混合物，宝生物工程（大连）有限公司），混匀后于65 ℃ 保持5 min，迅速转移到冰上骤冷5min；然后向反应管中加入2 μL DTT（二硫苏糖醇，美国普洛麦格公司）（0.1 mmol/L），4 μL 5×反转录缓冲液（美国普洛麦格公司），1 μL RNA酶抑制剂（40 U/μL）（宝生物工程（大连）有限公司），0.25 μL 反转录酶（200 U/μL）（美国普洛麦格公司），42℃反应50 min；72 ℃ 15 min灭活反转录酶后获得反转录产物cDNA。
[0031] PCR反应体系为25 μL，即在0.2 mL的PCR反应管中加入13.25 μL DEPC处理水，3 μL cDNA，2 μL 正向引物SEQ ID No.1（10 μmol/L）、2 μL 反向引物SEQ ID No.2（10 μmol/L），10×PCR缓冲液2.5 μL（宝生物工程（大连）有限公司），2μL dNTP混合物（2.5 mmol/L），0.25 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL）宝生物工程（大连）有限公司）。反应条件为：95℃预变性3 min；94℃变性50 s、42℃退火50 s、72℃延伸50 s，5个循环；接着94℃变性50 s、50℃退火50 s、72℃延伸50 s，30个循环；最后72℃延伸7 min。在PCR仪上完成。
[0032] PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据是否扩增到407~451 bp的DNA片段判定样品中是否含有豇豆花叶病毒亚科病毒。本实施例检测方法能够快速准确地判断样品是否有豇豆花叶病毒亚科病毒，根据序列进行种类鉴定，为进出口安全提供了保证。豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测用简并引物进一步可做成豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测试剂盒。
[0033] 实施例2
[0034] 豇豆花叶病毒亚科通用 RT-PCR方法的通用性检测
[0035] 取南芥菜花叶病毒（ArMV）、烟草环斑病毒（TRSV）、番茄环斑病毒（ToRSV）、樱桃卷叶病毒（CLRV）、烟草黑环病毒（TBRV）、桃丛簇花叶病毒（PRMV）、葡萄扇叶病毒（GFLV）、悬钩子环斑病毒（RpRSV）、乌饭树叶斑驳病毒（BLMoV）、菜豆荚斑驳病毒（BPMV）、豇豆花叶病毒（CPMV）、豇豆重花叶病毒（CPSMV）、蚕豆染色病毒（BBSV）、南瓜花叶病毒（SqMV）、红三叶草斑驳病毒（RCMV）、萝卜花叶病毒（RaMV）、蚕豆萎蔫病毒1（BBWV1）等17种病毒、24个分离物病叶，按实施例1方法分别提取总RNA，再按实施例1的方法进行RT-PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测结果。结果感染病毒的叶片中均检出407~451 bp的DNA片段。检测结果如图1所示。表明建立的RT-PCR方法可用于该亚科中不同病毒种类的检测，具有良好的通用性，可用于豇豆花叶病毒亚科病毒的通用检测。
[0036] 实施例3
[0037] 豇豆花叶病毒亚科通用 RT-PCR方法的的特异性检测
[0038] 取蒲瓜、普通烟叶、番茄、黄瓜、南瓜、鹊豆、蚕豆、豇豆、西瓜、百合等植物的健康叶片，按实施例1方法分别提取总RNA，再按实施例1的方法进行RT-PCR扩增，进行特异性检测。检测结果如图2所示。表明建立的通用RT-PCR方法并不会与病毒的寄主植物产生交叉反应，具有良好的特异性，符合检测的要求。
[0039] 实施例4
[0040] 豇豆花叶病毒亚科通用 RT-PCR方法的的在百合病毒检测中的应用
[0041] 取具有类似病毒症状的百合叶片，按实施例1方法分别提取总RNA，使用引物Comov-sf-F2和Comov-sf-R2，按实施例1的方法进行RT-PCR扩增，进行检测应用。检测结果如图3所示。对扩增的DNA片段进行直接测序，序列分析表明为南芥菜花叶病毒（ArMV）。表明建立的通用RT-PCR方法可用于百合等样品中豇豆花叶病毒亚科病毒的快速检测鉴定。
[0042] [0021]
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