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植物CO2传感器、编码它们的核酸以及制造和使用它们的方法

阅读：858发布：2020-05-27

IPRDB可以提供植物CO2传感器、编码它们的核酸以及制造和使用它们的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供用于通过控制CO2传感器基因来操纵经植物气孔的水和/或二氧化碳(CO2)交换的组合物和方法。本发明提供用于增强或优化植物内生物量积累的组合物和方法。本发明提供用于打开或关闭植物表皮保卫细胞上气孔口的组合物和方法。本发明提供用于通过操纵核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶表达来提高或降低植物表皮保卫细胞中氧合作用效率和/或碳固定的组合物和方法。本发明提供用于调节核酸在植物保卫细胞中表达的启动子。，下面是植物CO2传感器、编码它们的核酸以及制造和使用它们的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.包含由以下序列组成的保卫细胞特异性启动子的核酸分子：SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11，或SEQ ID NO：10中的第833位到1716位核苷酸的核苷酸序列，或SEQ ID NO：

10中的第1251位到1716位核苷酸的核苷酸序列。

2.权利要求1的核酸分子，其中所述保卫细胞特异性启动子可操作地连接至异源序列。

3.权利要求2的核酸分子，其中所述异源序列是：

(a)表达CO2Sen蛋白质的核酸；

(b)CO2Sen基因或转录物；或

(c)编码碳酸酐酶多肽的核酸。

4.权利要求3的核酸分子，其中所述CO2Sen基因或转录物由以下的核酸序列组成：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34和/或SEQ ID NO：35。

5.权利要求3的核酸分子，其中所述碳酸酐酶多肽由氨基酸序列SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：9组成。

6.权利要求3的核酸分子，其中所述编码碳酸酐酶多肽的核酸由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7的核酸序列组成。

7.权利要求1至6任一项的核酸分子在用于在植物保卫细胞中提供表达可操作连接的异源序列中的用途。

8.权利要求7的用途，其中所述核酸可操作地插入到表达盒或载体中。

9.权利要求8的用途，其中所述载体是质粒、重组病毒、粘粒或人工染色体。

10.权利要求7-9任一项的用途，其中所述植物是双子叶植物或单子叶植物，或者保卫细胞或植物器官衍生自双子叶植物或单子叶植物。

11.权利要求10的用途，其中双子叶或单子叶植物是小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱、玉米、烟草、马铃薯、糖用甜菜、豌豆、菜豆、大豆、花椰菜、芜菁或卡诺拉油菜、甘蔗、亚麻、棉花、棕榈、花生、杨树、羽扇豆、丝绵树、沙柳、石炭酸灌木、北美驼绒藜、轻木、苎麻、洋麻、大麻、洛神葵、黄麻、剑麻或蕉麻。

12.权利要求10的用途，其中双子叶或单子叶植物是羽扇豆类或油菜。

13.权利要求10的用途，其中双子叶或单子叶植物是豆科植物、十字花科植物或树。

14.权利要求10的用途，其中双子叶或单子叶植物是来自腰果属、落花生属、天门冬属、颠茄属、燕麦属、芸苔属、柑桔属、西瓜属、辣椒属、红花属、椰子属、咖啡属、黄瓜属、南瓜属、胡萝卜属、油棕属、草莓属、大豆属、棉属、向日葵属、萱草属、大麦属、莨菪属、莴苣属、亚麻属、黑麦草属、羽扇豆属、番茄属、苹果属、木薯属、马约兰属、苜蓿属、烟草属、木犀榄属、稻属、黍属、狼尾草属、鳄梨属、菜豆属、黄连木属、豌豆属、梨属、李属、萝卜属、蓖麻属、黑麦属、千里光属、芥属、茄属、高粱属、可可属、葫芦巴属、小麦属、野豌豆属、葡萄属、豇豆属或玉蜀黍属的物种。

说明书全文

植物CO2传感器、编码它们的核酸以及制造和使用它们的方

法

[0001] 本申请是申请日为2008年4月25日，发明名称为“植物CO2传感器、编码它们的核酸以及制造和使用它们的方法”的中国专利申请号200880022556.3的分案申请。

技术领域

[0002] 本发明一般涉及植物分子生物学和细胞生物学。具体而言，本发明提供通过表达和控制CO2传感器基因，包括本发明的新CO2传感器基因来操纵水和/或二氧化碳(CO2)经植物气孔交换的组合物和方法。本发明还提供抗旱植物；以及工程改造成水利用率提高的植物和抗旱植物的方法。

背景技术

[0003] 植物叶表皮中的气孔能够控制植物的水损失以及CO2从环境向植物内的流入量。二氧化碳被吸收用于光合碳固定，并且水通过气孔的蒸腾作用损失掉。每一气孔由一对称作保卫细胞的特化细胞构成，其可以通过控制保卫细胞膨胀状况改变气孔口大小。在农业、生物技术应用以及生物燃料生产中的一个重要形状是植物的水利用率。水利用率定义为植物平衡经气孔的水损失与用于光合作用的叶内净CO2摄取以及此后的生物量积累的情况如何。若干生物和非生物因子影响气孔开口状态，由此优化植物在特定条件下的水利用率。
CO2浓度调节气孔运动，其中高水平的CO2会导致气孔关闭并且低水平的CO2会诱导气孔张开。因此CO2调节植物的CO2流入量和总体范围的植物水损失。然而，目前还没有鉴定出CO2传感器。调节CO2响应的CO2受体方面的知识可以用于操纵CO2响应，使得可以通过工程改造使得植物生长过程中水利用率增加。

[0004] 植物如何感应二氧化碳(CO2)水平仍然未知。CO2如何被植物感知的知识将用于操纵CO2响应，使得在植物生长过程中碳和水利用率会增强。

[0005] 磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧化酶(PEPC；EC 4.1.1.31)在CO2固定表现为C4或CAM途径的那些植物物种中是光合作用的关键酶。PEPC的主要底物是游离形式的PEP。PEPC催化PEP和碳酸氢盐转化成草酰乙酸无机磷酸盐(Pi)。该反应是称作C4二羧酸途径的代谢途径的第一步，其使得通过光呼吸生产的能量损失最小化。PEPC存在于植物、藻类、蓝细菌和细菌中。

[0006] 碳固定或者CO2顺应细胞生物化学向还原形式的转化存在于不同生物体内的几种代谢途径中。它们当中最熟悉的当属卡尔文循环(“卡尔文-本森”循环)，其存在于蓝细菌及其质体衍生物如叶绿体和变形菌中。卡尔文循环利用酶“rubisco”或“核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶”。Rubisco存在至少两种形式：形式I rubisco存在于变形菌、蓝细菌和质体中，例如作为由八个大亚基和八个小亚基构成的辛二聚体；形式II rubisco是酶的二聚体形式，例如存在于变形菌中的酶。Rubisco包含两个竞争性酶活性：加氧酶和羧化酶活性。Rubisco催化的氧合反应是个“不经济”的过程，因为其竞争并显著降低所固定碳的净总量。不同光合生物中编码的Rubisco酶种类已经通过自然进化进行了选择，以向高等植物提供在大气氧存在下基本上更有效羧化的Rubisco酶。

发明内容

[0007] 本发明提供通过控制CO2传感器基因，包括称作“CO2Sen基因”的本发明的新CO2传感器基因，来操纵水和/或二氧化碳(CO2)经植物气孔交换的组合物和方法。通过控制CO2如何被植物感知的本发明方法可以用于操纵CO2响应，使得碳和水在植物生长过程中更加(或更少)有效地利用。因此，本发明方法可以用于通过操纵CO2传感器基因，包括任何本发明的新CO2传感器基因或其任意组合的表达和/或活性来改变植物中的净CO2摄取和水利用率。这些发现证明了CO2传感器基因，包括任何本发明的新CO2传感器基因在植物中感应和/或CO2感知信号转导中的潜在重要作用。

[0008] 本发明提供通过控制CO2传感器基因，包括任何本发明的新CO2传感器基因来操纵水和CO2经气孔交换的组合物和方法，所述操纵包括上调或下调表达，这可以通过上调或者下调或抑制CO2传感器基因和/或转录物，包括本发明的序列来实现。本发明提供改变植物中净CO2摄取和水利用率的组合物和方法。本发明提供表现出在有限水条件下增进生长的植物，例如转基因植物；因此本发明提供耐干旱植物(例如农作物)。本发明提供用于工程改造增强植物(例如农作物)水利用率或者增强植物(例如农作物)干旱耐受的方法。本发明提供用于通过控制任意一个、两个或者三个本发明新公开CO2传感器基因和/或转录物来操纵植物中生物量积累和/或生物燃料生产的组合物和方法。

[0009] 本发明提供用于操纵植物叶表皮中保卫细胞上气孔打开或关闭的组合物和方法，由此能够控制植物水损失和从环境向植物内的CO2流入量。本发明提供操纵经气孔的二氧化碳摄取、光合碳固定和/或经蒸腾过程的水损失的组合物和方法；每一气孔由一对特化的称作保卫细胞的细胞构成，其可以通过控制保卫细胞膨胀状态改变气孔口大小。本发明提供用于操纵保卫细胞膨胀状态的组合物和方法。

[0010] 本发明提供用于通过操纵植物水利用率来增强用于生物燃料生产的生物量生产的组合物和方法；水利用率定义为植物经气孔的水损失与用于光合作用的叶内净CO2摄取的平衡以及由此的生物量积累的情况如何。

[0011] 发明人已经鉴定出了拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的双突变体和三突变体，根据细胞特异性微阵列分析，其缺乏在野生型保卫细胞中高表达的同源基因的全长表达。CO2Sen双突变体和三突变体表现出受损的对通过实时气体交换分析所测定的二氧化碳浓度([CO2])改变的气孔响应；该测定涉及从环境中365ppm CO2升高至800ppm CO2和从800ppm CO2降低至100ppm CO2的改变。已知CO2Sens所编码的蛋白质结合CO2。这些发现证明了本发明核酸，即所谓的“CO2Sen基因”在感应和/或信号转导CO2感知中的作用。本发明提供控制植物如何感应CO2的方法，从而还提供生产带有改变的碳和水利用率的农作物的方法。因此，本发明提供改善提高的大气[CO2]对不同植物物种效应的组合物(例如转基因植物)和方法。

[0012] 本发明提供用于操纵植物如何感应CO2的组合物和方法，以及用于控制带有改变的水利用率(WUE)的农作物生产的组合物和方法。许多植物表现出对不同的CO2浓度具有弱的气孔运动响应。来自本发明双突变体(CA1/CA4基因)的数据表明对于改变的[CO2]气孔响应受损，并且在保卫细胞中过表达任一基因极大地提高植物的水利用率。这些数据表明，过表达所有或者任意一个这些基因(例如本发明的CO2Sens)引起改善的CO2响应。因此，本发明核酸的过表达(导致CO2Sens所编码蛋白质的过表达)随不断提高的大气CO2浓度而增强WUE。本发明的转基因植物或者遗传操作的植物(例如农作物)将比野生型植物更大的程度关闭它们的气孔，由此保存了它们的水；本发明提供用于通过例如用编码CO2Sens的核酸，例如作为质粒、病毒等等插入或感染植物，来过表达CO2Sens所编码蛋白质的方法。结果，本发明的植物(例如农作物)将具有更高的水利用率并将具有提高的抗旱性。

[0013] 本发明还提供用于通过例如对保卫细胞中CO2传感器的反义和/或RNAi阻抑来抑制CO2Sens基因、转录物和CO2Sens蛋白质表达的组合物和方法。农作物可以表现出对提高的大气CO2具有强响应，使得它们相对强地关闭它们的气孔，这对于农业生产和产量而言具有几个缺点，例如强的CO2诱导的气孔关闭响应会限制这些农作物固定碳以便最大化生长的能力。本发明的CO2Sens欠表达的转基因植物或者CO2Sens欠表达的植物通过比野生型植物更大程度的开启它们的气孔来解决该问题，从而避免了在可以得到充足水的时候产量有限。

[0014] 本发明还提供解决农作物不能够抵抗增加的温度时所出现的主要问题的组合物和方法，所述主要问题即因为温度的增加导致代谢、光合作用和生长“崩溃”：提高的CO2导致气孔关闭；并且这会因为水从叶子蒸发(蒸腾)的降低而增加叶温度。因此，本发明的组合物和方法，通过抑制CO2Sens核酸和/或CO2Sens蛋白质的表达，帮助对提高的温度敏感的农作物应对提高的大气CO2浓度，还降低或改善加速增加的叶温度。本发明提供包含反义和RNAi阻抑保卫细胞中CO2传感器的组合物和方法。在一个方面，保卫细胞启动子提供了经增强这些农作物中蒸腾作用而降低叶温度的方法，还提供了最大化农作物产量的方法。

[0015] 本发明的组合物和方法可用于操纵植物如何感应CO2，因此实施本发明可助于带有改变的且改良的碳和水利用率的农作物的产量。实施本发明也改善了我们关于增加的大气CO2浓度对不同植物物种影响的预测。本发明也证明了所鉴定的CO2Sen基因在感应和/或信号转导CO2感知中的至关重要的作用。本发明的组合物和方法可用于操纵植物生长，例如通过操纵CO2如何被植物感知。本发明的组合物和方法可用于操纵植物CO2响应，使得在植物生长过程中碳和水利用率增强了。

[0016] 本发明还提供了包含本发明核酸和/或蛋白质的试剂盒，和用于制造和/或使用它们的说明书，以及用于实施其中所提供方法的说明书。

[0017] 本发明提供分离的、合成的或重组的核酸(多核苷酸)，包含

[0018] (a)编码SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：9，或其功能片段的核酸(多核苷酸)序列，

[0019] 其中功能片段具有CO2Sen(CO2传感器)蛋白质活性、碳酸酐酶(碳酸脱水酶)活性或β-碳酸酐酶活性；

[0020] (b)与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34和/或SEQ ID NO：35，在覆盖至少约50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150或者更多残基的区域，或者编码蛋白质的序列(转录物)或基因的全长范围内，具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％或更高或完全序列同一性的核酸(多核苷酸)序列，

[0021] 其中核酸编码：

[0022] (i)具有CO2Sen(CO2传感器)蛋白质活性的CO2Sen(CO2传感器)蛋白质，

[0023] (ii)具有碳酸酐酶(碳酸脱水酶)活性或β-碳酸酐酶活性的多肽；或者

[0024] (iii)能够产生抗体的多肽或肽，所述抗体特异性结合至具有SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6和/或SEQ ID NO：9序列的多肽；

[0025] (c)编码由核酸(b)所编码蛋白质的功能片段的核酸(多核苷酸)，其中功能片段具有CO2Sen(CO2传感器)蛋白质活性或碳酸酐酶(碳酸脱水酶)活性或β-碳酸酐酶活性；

[0026] (d)与SEQ ID NO：10和/或SEQ ID NO：11，在覆盖至少约50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800或更多个残基的区域，或者具有保卫细胞特异性活性的启动子或具有保卫细胞特异性活性的转录调节区全长范围内，具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、
84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％或更高或完全序列同一性的核酸(多核苷酸)序列，

[0027] 其中核酸包含保卫细胞特异性启动子或保卫细胞特异性转录调节区或由其组成；

[0028] (e)(b)或(d)的核酸(多核苷酸)，其中序列同一性使用由BLAST 2.2.2版本算法构成的序列比较算法计算，其中过滤设置设成blastall-p blastp-d″nr pataa″-F F，并且所有其他选项均设成默认值；

[0029] (f)在严格条件下与包含下列的核酸杂交的核酸(多核苷酸)序列：

[0030] (i)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34和/或SEQ ID NO：35，其中核酸编码

[0031] (A)具有CO2Sen(CO2传感器)蛋白质活性的CO2Sen(CO2传感器)蛋白质，或者[0032] (B)具有碳酸酐酶(碳酸脱水酶)活性或β-碳酸酐酶活性的多肽；

[0033] (ii)SEQ ID NO：10和/或SEQ ID NO：11，其中核酸具有保卫细胞特异性启动子活性或保卫细胞特异性转录调节活性；

[0034] 并且严格条件包括洗涤步骤，所述洗涤步骤包括在0.2X SSC中于约65℃的温度下洗涤约15分钟；

[0035] (g)核酸(f)，其中核酸长度为蛋白质编码区或者基因或者启动子或转录调节区的至少约20、30、40、50、60、75、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多个残基或者全长；或者

[0036] (h)与(a)至(g)中任何一个全部(完全)互补的核酸(多核苷酸)。

[0037] 本发明提供反义寡核苷酸，包含

[0038] (a)与本发明的序列或者其亚序列互补或者能够与之在严格条件下杂交的核酸序列；或者，

[0039] (b)(a)的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸长度在约10至50、约20至60、约30至70、约40至80或约60至100个碱基之间。

[0040] 本发明提供抑制或降低细胞或植物或者植物或植物部分中编码CO2Sen(CO2传感器)蛋白质的信使翻译的方法，包括向细胞或植物或植物部分施用，或者在细胞或植物或植物部分中表达反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸包含(a)本发明的核酸，或者(b)与本发明的核酸序列互补或者能够在严格条件下与之杂交的核酸序列。

[0041] 本发明提供双链抑制性RNA(RNAi)分子，包含

[0042] (a)本发明核酸序列的亚序列；

[0043] (b)(a)的双链抑制性RNA(RNAi)分子，其中双链抑制性RNA是siRNA或miRNA分子，或者

[0044] (c)具有约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个双链体核苷酸长度的(a)或(b)的双链抑制性RNA(RNAi)分子。

[0045] 本发明提供抑制或降低细胞或植物或植物部分中CO2Sen(CO2传感器)蛋白质和/或CO2Sen信使表达的方法，包括向细胞或植物或植物部分施用，或者在细胞或植物或植物部分中表达：(a)权利要求4的双链抑制性RNA(RNAi)分子，或(b)双链抑制性RNA(iRNA)，其中RNA包含本发明核酸序列的亚序列，其中在一个方面，RNAi是siRNA或miRNA分子。

[0046] 本发明提供表达盒、质粒、重组病毒、载体、粘粒或人工染色体，包含：

[0047] (a)本发明的核酸(序列)；

[0048] (b)(a)的表达盒、质粒、病毒、载体、粘粒或人工染色体，其中本发明的核酸包含CO2Sen(CO2传感器)蛋白质编码序列或由其组成，并且蛋白质编码序列可操作地连接至启动子或转录调节区；

[0049] (c)(b)的表达盒、质粒、重组病毒、载体、粘粒或人工染色体，其中启动子是保卫细胞特异性启动子或者保卫细胞特异性转录调节区；

[0050] (d)(c)的表达盒、质粒、重组病毒、载体、粘粒或人工染色体，其中本发明的核酸包含保卫细胞特异性启动子或者保卫细胞特异性转录调节区或由其组成，并且启动子可操作地连接至蛋白质编码序列；

[0051] (e)(d)的表达盒、质粒、重组病毒、载体、粘粒或人工染色体，其中蛋白质编码序列编码具有碳酸酐酶(碳酸脱水酶)活性或β-碳酸酐酶活性的多肽；

[0052] (f)(b)的表达盒、质粒、重组病毒、载体、粘粒或人工染色体，其中启动子或转录调节区包含组成型启动子或转录调节区、组织特异性启动子或转录调节区、可诱导的启动子或转录调节区、沉默启动子、CO2感应启动子；

[0053] (g)(a)至(f)中任意一个的表达盒、质粒、重组病毒、载体、粘粒或人工染色体，其中重组病毒是植物病毒或者载体是植物载体；或者

[0054] (h)(a)至(g)中任何一个的表达盒、质粒、重组病毒、载体、粘粒或人工染色体，其中启动子包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的启动子序列或转录调节区，或其功能性(转录调节性)亚序列。

[0055] 本发明提供转导的或转化的细胞，包含

[0056] (a)本发明的表达盒、质粒、重组病毒、载体、粘粒或人工染色体，或本发明的核酸(序列)；

[0057] (b)(a)的转导或转化细胞，其中细胞是细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞；

[0058] (c)(a)的转导或转化细胞，其中细胞是植物保卫细胞。

[0059] 本发明提供植物、植物细胞、植物器官、植物叶、植物果实或种子，包含

[0060] (a)本发明的表达盒、质粒、重组病毒、载体、粘粒或人工染色体，或本发明的核酸(序列)；

[0061] (b)(a)的植物、植物细胞、植物器官、植物叶、植物果实或种子，其中植物是、或者植物细胞、植物器官、植物叶、植物果实或种子衍生自：(i)双子叶或单子叶植物；(ii)小麦(wheat)、燕麦(oat)、黑麦(rye)、大麦(barley)、稻(rice)、高粱(sorghum)、玉米(maize)(玉黍蜀(corn))、烟草(tobacco)、豆科植物(legume)、羽扇豆类(lupins)、马铃薯(potato)、甜菜(sugar beet)、豌豆(pea)、菜豆(bean)、大豆(soybean)(黄豆(soy))、十字花科植物(cruciferous plant)、花椰菜(cauliflower)、油菜(rape)(或芜菁(rapa)或卡诺拉油菜(canola))、蔗(cane)(甘蔗(sugarcane))、亚麻(flax)、棉花(cotton)、棕榈(palm)、甜菜(sugar beet)、花生(peanut)、树(tree)、杨树(poplar)、羽扇豆(lupin)、丝绵树(silk cotton tree)、沙柳(desert willow)、石炭酸灌木(creosote bush)、北美驼绒藜(winterfat)、轻木(balsa)、苎麻(ramie)、洋麻(kenaf)、大麻(hemp)、洛神葵(roselle)、黄麻(jute)、剑麻(sisal)或蕉麻(abaca)；或者，(c)来自腰果属(Anacardium)、落花生属(Arachis)、天门冬属(Asparagus)、颠茄属(Atropa)、燕麦属(Avena)、芸苔属(Brassica)、柑桔属(Citrus)、西瓜属(Citrullus)、辣椒属(Capsicum)、红花属(Carthamus)、椰子属(Cocos)、咖啡属(Coffea)、黄瓜属(Cucumis)、南瓜属(Cucurbita)、胡萝卜属(Daucus)、油棕属(Elaeis)、草莓属(Fragaria)、大豆属(Glycine)、棉属(Gossypium)、向日葵属(Helianthus)、萱草属(Heterocallis)、大麦属(Hordeum)、莨菪属(Hyoscyamus)、莴苣属(Lactuca)、亚麻属(Linum)、黑麦草属(Lolium)、羽扇豆属(Lupinus)、番茄属(Lycopersicon)、苹果属(Malus)、木薯属(Manihot)、马约兰属(Majorana)、苜蓿属(Medicago)、烟草属(Nicotiana)、木犀榄属(Olea)、稻属(Oryza)、黍属(Panieum)、狼尾草属(Pannisetum)、鳄梨属(Persea)、菜豆属(Phaseolus)、黄连木属(Pistachia)、豌豆属(Pisum)、梨属(Pyrus)、李属(Prunus)、萝卜属(Raphanus)、蓖麻属(Ricinus)、黑麦属(Secale)、千里光属(Senecio)、芥属(Sinapis)、茄属(Solanum)、高粱属(Sorghum)、可可属(Theobromus)、葫芦巴属(Trigonella)、小麦属(Triticum)、野豌豆属(Vicia)、葡萄属(Vitis)、豇豆属(Vigna)或玉蜀黍属(Zea)的物种。

[0062] 本发明提供转基因植物、植物细胞、植物部分、植物叶、植物器官、植物果实或种子，包含

[0063] (a)异源核酸，其中异源核酸包含本发明的核酸(序列)，或本发明的表达盒、质粒、病毒、载体、粘粒或人工染色体，

[0064] (b)(a)的转基因植物、植物细胞、植物部分、植物叶、植物器官、植物果实或种子，其中植物细胞是植物保卫细胞；或者

[0065] (c)(a)的转基因植物、植物细胞、植物部分、植物叶、植物器官、植物果实或种子，其中植物是、或植物细胞、植物器官、植物果实或种子衍生自：(i)双子叶或单子叶植物；(ii)小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱、玉米(玉黍蜀)、烟草、豆科植物、羽扇豆类、马铃薯、甜菜、豌豆、菜豆、大豆(黄豆)、十字花科植物、花椰菜、油菜(或芜菁或卡诺拉油菜)、甘蔗、亚麻、棉花、棕榈、甜菜、花生、树、杨树、羽扇豆、丝绵树、沙柳、石炭酸灌木、北美驼绒藜、轻木、苎麻、洋麻、大麻、洛神葵、黄麻、剑麻或蕉麻；或者，(c)来自腰果属、落花生属、天门冬属、颠茄属、燕麦属、芸苔属、柑桔属、西瓜属、辣椒属、红花属、椰子属、咖啡属、黄瓜属、南瓜属、胡萝卜属、油棕属、草莓属、大豆属、棉属、向日葵属、萱草属、大麦属、莨菪属、莴苣属、亚麻属、黑麦草属、羽扇豆属、番茄属、苹果属、木薯属、马约兰属、苜蓿属、烟草属、木犀榄属、稻属、黍属、狼尾草属、鳄梨属、菜豆属、黄连木属、豌豆属、梨属、李属、萝卜属、蓖麻属、黑麦属、千里光属、芥属、茄属、高粱属、可可属、葫芦巴属、小麦属、野豌豆属、葡萄属、豇豆属或玉蜀黍属的物种。

[0066] 本发明提供分离的、合成的或者重组的多肽，包含：

[0067] (a)包含序列SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：9或其功能片段的氨基酸序列，

[0068] 其中功能片段具有CO2Sen(CO2传感器)蛋白质活性或碳酸酐酶(碳酸脱水酶)活性或β-碳酸酐酶活性；

[0069] (b)与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6和/或SEQ ID NO：9，在覆盖多肽的至少约20、30、40、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700或更多个残基范围或全长范围内，具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％或更高或者完全(氨基酸)序列同一性的氨基酸序列，[0070] 其中多肽具有CO2Sen(CO2传感器)蛋白质活性或碳酸酐酶(碳酸脱水酶)活性或β-碳酸酐酶活性，或多肽能够产生抗体，所述抗体特异性结合至具有序列SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6和/或SEQ ID NO：9的多肽；

[0071] (c)(b)的多肽的功能性片段，其中功能片段具有CO2Sen(CO2传感器)蛋白质活性或碳酸酐酶(碳酸脱水酶)活性或β-碳酸酐酶活性；

[0072] (d)(b)的多肽，其中序列同一性使用由BLAST 2.2.2版本算法构成的序列比较算法计算，其中过滤设置被设成blastall-p blastp-d″nr pataa″-F F，并且所有其他选项均设成默认值；

[0073] (e)(a)至(d)任意一个的多肽，具有至少一个保守氨基酸替换并且保留了其CO2Sen(CO2传感器)蛋白质活性或碳酸酐酶(碳酸脱水酶)活性或β-碳酸酐酶活性；

[0074] (f)(e)的多肽，其中至少一个保守氨基酸替换包含用相似特性的另一个氨基酸替换氨基酸；或者，保守替换包含：用另一个脂肪族氨基酸替换脂肪族氨基酸；用苏氨酸替换丝氨酸，反之亦然；用另一个酸性残基替换酸性残基；用另一个具有酰胺基的残基替换具有酰胺基的残基；用另一个碱性残基替换碱性残基；或者用另一个芳香族残基替换芳香族残基；

[0075] (g)(a)至(f)任意一个的多肽，还包含异源氨基酸序列。

[0076] 本发明提供转基因植物、植物细胞、植物部分、植物叶、植物器官、植物果实或种子，包含

[0077] (a)包含本发明多肽的异源或合成的多肽；

[0078] (b)(a)的转基因植物、植物细胞、植物部分、植物叶、植物器官、植物果实或种子，其中植物细胞是植物保卫细胞；或者

[0079] (c)(a)的转基因植物、植物细胞、植物部分、植物叶、植物器官、植物果实或种子，其中植物是、或植物细胞、植物器官、植物果实或种子分离自和/或衍生自：(i)双子叶或单子叶植物；(ii)小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱、玉米(玉黍蜀)、烟草、豆科植物、羽扇豆类、马铃薯、甜菜、豌豆、菜豆、大豆(黄豆)、十字花科植物、花椰菜、油菜(或芜菁或卡诺拉油菜)、甘蔗、亚麻、棉花、棕榈、甜菜、花生、树、杨树、羽扇豆、丝绵树、沙柳、石炭酸灌木、北美驼绒藜、轻木、苎麻、洋麻、大麻、洛神葵、黄麻、剑麻或蕉麻；或者，(c)来自腰果属、落花生属、天门冬属、颠茄属、燕麦属、芸苔属、柑桔属、西瓜属、辣椒属、红花属、椰子属、咖啡属、黄瓜属、南瓜属、胡萝卜属、油棕属、草莓属、大豆属、棉属、向日葵属、萱草属、大麦属、莨菪属、莴苣属、亚麻属、黑麦草属、羽扇豆属、番茄属、苹果属、木薯属、马约兰属、苜蓿属、烟草属、木犀榄属、稻属、黍属、狼尾草属、鳄梨属、菜豆属、黄连木属、豌豆属、梨属、李属、萝卜属、蓖麻属、黑麦属、千里光属、芥属、茄属、高粱属、可可属、葫芦巴属、小麦属、野豌豆属、葡萄属、豇豆属或玉蜀黍属的物种。

[0080] 本发明提供包含本发明多肽的蛋白质制剂，其中蛋白质制剂包含液体、固体或凝胶。

[0081] 本发明提供固定化蛋白质或固定化多核苷酸，其中蛋白质包含本发明多肽，并且多核苷酸包含本发明核酸，其中在一个方面，蛋白质或多核苷酸被固定化至木片、纸、池、金属、树脂、聚合物、陶瓷、玻璃、微电极、石墨颗粒、小珠、凝胶、板、阵列或毛细管。

[0082] 本发明提供特异性结合本发明多肽的分离的、合成的或重组的抗体，其中在一个方面，抗体是单克隆或多克隆抗体，或是单链的抗体。

[0083] 本发明提供包含本发明抗体的杂交瘤。

[0084] 本发明提供包含本发明固定化蛋白质或固定化多核苷酸、或本发明抗体、或其组合的阵列。

[0085] 本发明提供产生重组多肽的方法，包括步骤：(a)提供可操作地连接至启动子的核酸，其中核酸包含本发明的核酸序列；和(b)在允许多肽表达的条件下表达步骤(a)的核酸，由此产生重组多肽，并且在一个方面，方法还包括用步骤(a)的核酸转化宿主细胞，之后表达步骤(a)的核酸，由此在转化细胞内产生重组多肽。

[0086] 本发明提供用于酶性催化二氧化碳转化至碳酸氢盐和质子的方法，包括在允许酶性催化二氧化碳转化至碳酸氢盐和质子的条件下，将本发明多肽或者本发明核酸所编码多肽与二氧化碳接触。

[0087] 本发明提供用于下调或降低植物保卫细胞、植物细胞、植物叶、植物器官或植物部分内二氧化碳(CO2)和/或水交换的方法，包括

[0088] (A)(a)提供：

[0089] (i)表达CO2Sen(CO2传感器)蛋白质的核酸和/或CO2Sen基因或转录物(信使)；

[0090] (ii)(i)的CO2Sen核酸或基因，其中表达蛋白质的核酸或CO2Sen基因或转录物(信使)包含本发明的序列，和/或表达蛋白质的核酸或CO2Sen蛋白质包含本发明的氨基酸序列；

[0091] (iii)具有碳酸酐酶(CA)活性或β-碳酸酐酶活性的多肽或编码CA多肽的核酸；

[0092] (iv)编码CA多肽的核酸，其中核酸包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：
22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34和/或SEQ ID NO：35；

[0093] (v)抑制编码PEPC多肽的核酸表达的反义核酸或核酸；和/或

[0094] (vi)(v)的方法，其中反义或抑制性核酸靶向包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和/或SEQ ID NO：15的、编码磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧化酶(或PEP羧化酶，或PEPC)多肽的核酸；和

[0095] (b)(i)在保卫细胞中表达或过表达(a)的核酸或基因，或表达CO2Sen(CO2传感器)蛋白质的核酸和/或CO2Sen基因或转录物(信使)，和/或表达碳酸酐酶或β-碳酸酐酶或碳酸酐酶的核酸，或者(ii)在保卫细胞中表达抑制编码PEPC多肽的核酸表达的反义核酸或核酸，或者(iii)将保卫细胞与具有碳酸酐酶活性的多肽接触，

[0096] 由此下调或降低保卫细胞中的二氧化碳(CO2)和/或水交换；

[0097] (B)(A)的方法，其中植物是本发明的转基因植物，或者用本发明的表达盒、质粒、病毒或载体转导、转化或感染的植物，或植物细胞是本发明的转导的细胞；

[0098] (C)(A)或(B)的方法，其中植物表征为在环境365ppm CO2、提高的ppm CO2或降低的ppm CO2下可控的CO2交换，或植物表征为在环境365ppm CO2、提高的ppm CO2或降低的ppm CO2下可控的水交换；或者

[0099] (D)(A)至(C)任意一个的方法，其中抑制编码PEPC多肽的核酸表达的反义核酸或核酸包括miRNA或siRNA，或反义寡核苷酸。

[0100] 本发明提供用于上调或提高植物保卫细胞、植物细胞、植物叶、植物器官或植物部分中二氧化碳(CO2)和/或水交换的方法，包括

[0101] (A)(a)提供：

[0102] (i)CO2Sen基因或转录物(信使)的反义核酸或者抑制CO2Sen基因或转录物(信使)表达的抑制性核酸，其中CO2Sen基因或转录物(信使)包含本发明的序列，和/或编码本发明CO2Sen蛋白质的序列；

[0103] (ii)编码植物碳酸酐酶(CA)或植物β-碳酸酐酶的核酸的反义核酸或抑制性核酸；

[0104] (iii)表达磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧化酶(或PEP羧化酶，或PEPC)蛋白质的核酸和/或PEPC基因或转录物(信使)；和/或

[0105] (iv)磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧化酶(或PEP羧化酶，或PEPC)多肽；和

[0106] (b)(i)在保卫细胞中表达反义或抑制性核酸，或者(ii)在保卫细胞中表达表达PEPC蛋白质的核酸和/或PEPC基因或转录物(信使)，或者(iii)使保卫细胞与具有PEPC活性的多肽接触，

[0107] 由此上调或增加保卫细胞中二氧化碳(CO2)和/或水交换；

[0108] (B)(A)的方法，其中植物是本发明的转基因植物，或用本发明的表达盒、质粒、病毒或载体转导的、转化的或感染的植物，或植物细胞是本发明的转导的细胞；

[0109] (C)(A)或(B)的方法，其中植物表征为在环境365ppm CO2、提高的ppm CO2或降低的ppm CO2下可控的CO2交换，或植物表征为在环境365ppm CO2、提高的ppm CO2或降低的ppm CO2下可控的水交换；或者

[0110] (D)(A)、(B)或(C)的方法，其中CO2Sen基因或转录物(信使)的反义核酸或抑制CO2Sen基因或转录物(信使)表达的抑制性核酸，或碳酸酐酶(CA)或β-碳酸酐酶的反义核酸或者抑制碳酸酐酶(CA)或β-碳酸酐酶表达的抑制性核酸，包括权利要求2的反义寡核苷酸，或权利要求4的双链抑制性RNA(RNAi)分子，或miRNA或siRNA。

[0111] 本发明提供用于调节植物的细胞、植物细胞、植物叶、植物器官或植物部分中水交换的方法，包括：

[0112] (A)在植物、植物细胞、植物叶、植物器官或植物部分中过表达或欠表达：

[0113] (i)CO2Sen(CO2传感器)蛋白质和/或CO2Sen基因或转录物(信使)，其中CO2Sen基因或转录物(信使)包含本发明的序列，和/或CO2Sen蛋白质包含本发明的氨基酸序列，或者

[0114] (ii)具有碳酸酐酶(CA)活性或β-碳酸酐酶活性的多肽，或编码碳酸酐酶多肽的核酸；或者

[0115] (iii)具有磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧化酶(或PEP羧化酶，或PEPC)活性的多肽，或编码PEPC多肽的核酸；或者

[0116] (iv)具有核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶，或“Rubisco”活性的多肽，或编码Rubisco多肽的核酸，

[0117] 由此调节植物、植物细胞、植物叶、植物器官或植物部分中的水交换(通过过表达CO2Sen或CA蛋白质下调或降低水交换，或通过欠表达CO2Sen或CA蛋白质上调或提高水交换)；

[0118] (B)(A)的方法，其中植物是本发明的转基因植物，或用本发明的表达盒、质粒、病毒或载体转导的、转化的或感染的植物，或植物细胞是本发明的转导的细胞；或者

[0119] (C)(A)或(B)的方法，其中植物表征为在环境365ppm CO2、提高的ppm CO2或降低的ppm CO2下可控的CO2交换，或植物表征为在环境365ppm CO2、提高的ppm CO2或降低的ppm CO2下可控的水交换；或者

[0120] (D)(A)至(C)任意一个的方法，其中过表达或提高的表达，或欠表达或抑制，存在于植物保卫细胞中；或者

[0121] (E)(A)至(D)任意一个的方法，其中过表达CO2Sen(CO2传感器)或碳酸酐酶蛋白质和/或CO2Sen或碳酸酐酶基因或转录物(信使)降低水交换，并且欠表达或抑制表达CO2Sen(CO2传感器)或碳酸酐酶蛋白质和/或CO2Sen或碳酸酐酶基因或转录物(信使)提高水交换；或者

[0122] (F)(A)至(D)任意一个的方法，其中欠表达或抑制表达PEPC蛋白质和/或PEPC基因或转录物(信使)降低水交换，或过表达PEPC蛋白质和/或PEPC基因或转录物(信使)提高水交换。

[0123] 本发明提供用于调节植物、植物细胞、植物叶、植物器官或植物部分中水摄取或水损失的方法，包括在植物、植物细胞、植物叶、植物器官或植物部分中过表达或欠表达：

[0124] (A)(i)CO2Sen(CO2传感器)蛋白质和/或CO2Sen基因或转录物(信使)，其中CO2Sen基因或转录物(信使)包含本发明的序列，和/或CO2Sen蛋白质包含本发明的氨基酸序列，或者

[0125] (ii)具有碳酸酐酶(CA)活性或β-碳酸酐酶活性的多肽，或编码多肽的核酸；或者

[0126] (iii)具有磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧化酶(或PEP羧化酶，或PEPC)活性的多肽，或编码PEPC多肽的核酸；或者

[0127] (iv)具有核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶，或“Rubisco”活性的多肽，或编码Rubisco多肽的核酸，

[0128] 由此调节植物、植物细胞、植物叶、植物器官或植物部分中的水摄取或水损失(通过过表达CO2Sen或CA蛋白质下调水摄取，或导致水保留，或通过欠表达CO2Sen或CA蛋白质上调水交换或增加水损失)；

[0129] (B)(A)的方法，其中植物是本发明的转基因植物，或用本发明的表达盒、质粒、病毒或载体转导的、转化的或感染的植物，或植物细胞是本发明的转导的细胞；

[0130] (C)(A)或(B)的方法，其中植物表征为在环境365ppm CO2、提高的ppm CO2或降低的ppm CO2下可控的CO2交换，或植物表征为在环境365ppm CO2、提高的ppm CO2或降低的ppm CO2下可控的水交换；或者

[0131] (D)(A)至(C)任意一个的方法，其中过表达或提高的表达存在于植物保卫细胞中；或者

[0132] (E)(A)至(D)任意一个的方法，其中过表达CO2Sen(CO2传感器)或碳酸酐酶蛋白质和/或CO2Sen或碳酸酐酶基因或转录物(信使)降低水损失，并且欠表达或抑制表达CO2Sen(CO2传感器)或碳酸酐酶蛋白质和/或CO2Sen或碳酸酐酶基因或转录物(信使)提高水损失；或者

[0133] (F)(A)至(D)任意一个的方法，其中欠表达或抑制表达PEPC蛋白质和/或PEPC基因或转录物(信使)降低水损失，或过表达PEPC蛋白质和/或PEPC基因或转录物(信使)提高水损失。

[0134] 本发明提供用于产生水利用率(WUE)提高的或抗旱的植物的方法，包括：

[0135] (A)过表达或提高表达：

[0136] (i)CO2Sen(CO2传感器)蛋白质和/或CO2Sen基因或转录物(信使)，其中CO2Sen基因或转录物(信使)包含本发明的序列，和/或CO2Sen蛋白质包含本发明的氨基酸序列，或者

[0137] (ii)具有碳酸酐酶(CA)活性或β-碳酸酐酶活性的多肽，或编码多肽的核酸；或者

[0138] (iii)具有磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧化酶(或PEP羧化酶，或PEPC)活性的多肽，或编码PEPC多肽的核酸；或者

[0139] (iv)具有核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶，或“Rubisco”活性的多肽，或编码Rubisco多肽的核酸，

[0140] 由此产生水利用率(WUE)提高的或抗旱的植物；

[0141] (B)(A)的方法，其中植物是本发明的转基因植物，或用本发明的表达盒、质粒、病毒或载体转导的、转化的或感染的植物，或植物细胞是本发明的转导的细胞；或者

[0142] (C)(A)或(B)的方法，其中过表达或提高的表达存在于植物保卫细胞中；或者[0143] (D)(A)至(C)任意一个的方法，其中过表达CO2Sen(CO2传感器)或碳酸酐酶蛋白质和/或CO2Sen或碳酸酐酶基因或转录物(信使)增强水利用率(WUE)，或增强抗旱性，并且欠表达或抑制表达CO2Sen(CO2传感器)或碳酸酐酶蛋白质和/或CO2Sen或碳酸酐酶基因或转录物(信使)提高水损失或降低WUE；或者

[0144] (E)(A)至(C)任意一个的方法，其中欠表达或抑制表达PEPC蛋白质和/或PEPC基因或转录物(信使)增强水利用率(WUE)，或增强抗旱性，或过表达PEPC蛋白质和/或PEPC基因或转录物(信使)提高水损失或降低WUE。

[0145] 本发明提供植物、植物部分、植物器官、叶或种子：(a)通过包含本发明方法的过程产生；或者(b)通过包含本发明方法的过程产生，或者通过本发明的方法改良，其中植物分离自和/或衍生自：(i)双子叶或单子叶植物；(ii)小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱、玉米(玉黍蜀)、烟草、豆科植物、羽扇豆类、马铃薯、甜菜、豌豆、菜豆、大豆(黄豆)、十字花科植物、花椰菜、油菜(或芜菁或卡诺拉油菜)、甘蔗、亚麻、棉花、棕榈、甜菜、花生、树、杨树、羽扇豆、丝绵树、沙柳、石炭酸灌木、北美驼绒藜、轻木、苎麻、洋麻、大麻、洛神葵、黄麻、剑麻或蕉麻；或者，(c)来自腰果属、落花生属、天门冬属、颠茄属、燕麦属、芸苔属、柑桔属、西瓜属、辣椒属、红花属、椰子属、咖啡属、黄瓜属、南瓜属、胡萝卜属、油棕属、草莓属、大豆属、棉属、向日葵属、萱草属、大麦属、莨菪属、莴苣属、亚麻属、黑麦草属、羽扇豆属、番茄属、苹果属、木薯属、马约兰属、苜蓿属、烟草属、木犀榄属、稻属、黍属、狼尾草属、鳄梨属、菜豆属、黄连木属、豌豆属、梨属、李属、萝卜属、蓖麻属、黑麦属、千里光属、芥属、茄属、高粱属、可可属、葫芦巴属、小麦属、野豌豆属、葡萄属、豇豆属或玉蜀黍属的物种。

[0146] 本发明提供用于产生耐热植物的方法，包括在植物的一个或多个细胞中欠表达CO2Sen蛋白质和/或CO2Sen基因或转录物(信使)，或碳酸酐酶(CA)，方法包括：

[0147] (A)(a)提供：

[0148] (i)CO2Sen基因或转录物(信使)的反义核酸或者抑制CO2Sen基因或转录物(信使)表达的抑制性核酸，其中CO2Sen基因或转录物(信使)包含本发明的序列，和/或编码本发明的CO2Sen蛋白质的序列；

[0149] (ii)编码植物碳酸酐酶(CA)，或植物β-碳酸酐酶的核酸的反义核酸或抑制性核酸；和/或

[0150] (iii)编码磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧化酶(或PEP羧化酶，或PEPC)的核酸，和[0151] (b)在保卫细胞中表达CO2Sen或CA反义或抑制性核酸，和/或表达编码PEPC的核酸，

[0152] 由此通过上调或提高植物的一个细胞或多个细胞中二氧化碳(CO2)和/或水交换产生耐热植物；

[0153] (B)(A)的方法，其中细胞是植物保卫细胞；

[0154] (C)(A)或(B)的方法，其中植物是本发明的转基因植物，或用本发明的表达盒、质粒、病毒或载体转导的、转化的或感染的植物，或植物细胞是本发明的转导的细胞；

[0155] (D)(A)至(C)任意一个的方法，其中植物表征为在环境365ppm CO2、提高的ppm CO2或降低的ppm CO2下可控的CO2交换，或植物表征为在环境365ppm CO2、提高的ppm CO2或降低的ppm CO2下可控的水交换；或者

[0156] (E)(A)至(D)任意一个的方法，其中CO2Sen基因或转录物(信使)的反义核酸或者抑制CO2Sen基因或转录物(信使)表达的抑制性核酸，或碳酸酐酶(CA)或β-碳酸酐酶的反义核酸或者抑制碳酸酐酶(CA)或β-碳酸酐酶表达的抑制性核酸，包括权利要求2的反义寡核苷酸，或权利要求4的双链抑制性RNA(RNAi)分子，或miRNA或siRNA。

[0157] 本发明提供植物、植物部分、植物器官、叶或种子：(a)通过包含本发明方法的过程产生；或者(b)通过包含本发明方法的过程产生，或者通过本发明的方法改良，其中植物分离自和/或衍生自：(i)双子叶或单子叶植物；(ii)小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱、玉米(玉黍蜀)、烟草、豆科植物、羽扇豆类、马铃薯、甜菜、豌豆、菜豆、大豆(黄豆)、十字花科植物、花椰菜、油菜(或芜菁或卡诺拉油菜)、甘蔗、亚麻、棉花、棕榈、甜菜、花生、树、杨树、羽扇豆、丝绵树、沙柳、石炭酸灌木、北美驼绒藜、轻木、苎麻、洋麻、大麻、洛神葵、黄麻、剑麻或蕉麻；或者，(c)来自腰果属、落花生属、天门冬属、颠茄属、燕麦属、芸苔属、柑桔属、西瓜属、辣椒属、红花属、椰子属、咖啡属、黄瓜属、南瓜属、胡萝卜属、油棕属、草莓属、大豆属、棉属、向日葵属、萱草属、大麦属、莨菪属、莴苣属、亚麻属、黑麦草属、羽扇豆属、番茄属、苹果属、木薯属、马约兰属、苜蓿属、烟草属、木犀榄属、稻属、黍属、狼尾草属、鳄梨属、菜豆属、黄连木属、豌豆属、梨属、李属、萝卜属、蓖麻属、黑麦属、千里光属、芥属、茄属、高粱属、可可属、葫芦巴属、小麦属、野豌豆属、葡萄属、豇豆属或玉蜀黍属的物种。

[0158] 本发明提供用于打开植物、植物部分、植物器官、植物叶、或植物细胞中气孔口的方法，包括在植物的一个或多个细胞中、植物部分、植物器官、植物叶或植物细胞中欠表达或抑制表达CO2Sen蛋白质和/或CO2Sen基因或转录物(信使)，或碳酸酐酶(CA)，方法包括：

[0159] (A)(a)提供：

[0160] (i)CO2Sen基因或转录物(信使)的反义核酸或者抑制CO2Sen基因或转录物(信使)表达的抑制性核酸，其中CO2Sen基因或转录物(信使)包含本发明的序列，和/或编码本发明的CO2Sen蛋白质的序列；

[0161] (ii)编码植物碳酸酐酶(CA)，或植物β-碳酸酐酶的核酸的反义核酸或者抑制编码植物碳酸酐酶(CA)，或植物β-碳酸酐酶的核酸的抑制性核酸；和/或

[0162] (iii)编码磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧化酶(或PEP羧化酶，或PEPC)的核酸；和[0163] (b)在植物的一个或多个细胞、植物部分、植物器官、植物叶或植物细胞中表达CO2Sen和/或CA反义或抑制性核酸，或在植物、植物部分、植物器官、植物叶或植物细胞中表达编码PEPC的核酸，

[0164] 由此导致欠表达和/或抑制表达CO2Sen蛋白质和/或CO2Sen基因或转录物(信使)，和/或碳酸酐酶(CA)，和/或表达PEPC，并且导致气孔口打开；

[0165] (B)(A)的方法，其中细胞是植物保卫细胞；

[0166] (C)(A)或(B)的方法，其中植物是本发明的转基因植物，或用本发明的表达盒、质粒、病毒或载体转导的、转化的或感染的植物，或植物细胞是本发明的转导的细胞；

[0167] (D)(A)至(C)任意一个的方法，其中植物表征为在环境365ppm CO2、提高的ppm CO2或降低的ppm CO2下可控的CO2交换，或植物表征为在环境365ppm CO2、提高的ppm CO2或降低的ppm CO2下可控的水交换；或者

[0168] (E)(A)至(D)任意一个的方法，其中CO2Sen基因或转录物(信使)的反义核酸或者抑制CO2Sen基因或转录物(信使)表达的抑制性核酸，或碳酸酐酶(CA)或β-碳酸酐酶的反义核酸或者抑制碳酸酐酶(CA)或β-碳酸酐酶表达的抑制性核酸，包括权利要求2的反义寡核苷酸，或权利要求4的双链抑制性RNA(RNAi)分子，或miRNA或siRNA。

[0169] 本发明提供用于关闭植物、植物叶、植物器官的表皮保卫细胞、或植物细胞上气孔口的方法，包括在植物的一个或多个细胞中过表达CO2Sen蛋白质和/或CO2Sen基因或转录物(信使)，包括：

[0170] (A)(a)过表达或提高表达：

[0171] (i)CO2Sen(CO2传感器)蛋白质和/或CO2Sen基因或转录物(信使)，其中CO2Sen基因或转录物(信使)包含本发明的序列，和/或CO2Sen蛋白质包含本发明的氨基酸序列，或者

[0172] (ii)具有碳酸酐酶(CA)活性或β-碳酸酐酶活性的多肽，或编码多肽的核酸，[0173] 由此导致过表达和/或提高表达CO2Sen蛋白质和/或CO2Sen基因或转录物(信使)，和/或碳酸酐酶(CA)，并且导致气孔口关闭，或者

[0174] (b)抑制或降低表达磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧化酶(或PEP羧化酶，或PEPC)基因或信使(转录物)；

[0175] (B)(A)的方法，其中细胞是植物保卫细胞；或者

[0176] (C)(A)或(B)的方法，其中植物是本发明的转基因植物，或用本发明的表达盒、质粒、病毒或载体转导的、转化的或感染的植物，或植物细胞是本发明的转导的细胞。

[0177] 本发明提供用于通过平衡经气孔的水损失与用于光合作用的净CO2摄取，并因此增强或优化植物、植物叶、植物部分、植物器官、植物细胞或种子中生物量积累，来增强或优化植物、植物叶、植物器官、植物部分、植物细胞或种子中生物量积累的方法，包括使用本发明的组合物和/或方法打开或关闭气孔。

[0178] 本发明提供用于降低叶温度和增强植物、植物叶、或植物细胞中蒸腾作用的方法，包括使用本发明的组合物和/或方法打开植物的一个细胞或多个细胞的气孔口。

[0179] 在任意一个发明方法的备选的实施方案中，植物或植物细胞分离自和/或衍生自：(i)双子叶或单子叶植物；(ii)小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱、玉米(玉黍蜀)、烟草、豆科植物、羽扇豆类、马铃薯、甜菜、豌豆、菜豆、大豆(黄豆)、十字花科植物、花椰菜、油菜(或芜菁或卡诺拉油菜)、甘蔗、亚麻、棉花、棕榈、甜菜、花生、树、杨树、羽扇豆、丝绵树、沙柳、石炭酸灌木、北美驼绒藜、轻木、苎麻、洋麻、大麻、洛神葵、黄麻、剑麻或蕉麻；或者，(c)来自腰果属、落花生属、天门冬属、颠茄属、燕麦属、芸苔属、柑桔属、西瓜属、辣椒属、红花属、椰子属、咖啡属、黄瓜属、南瓜属、胡萝卜属、油棕属、草莓属、大豆属、棉属、向日葵属、萱草属、大麦属、莨菪属、莴苣属、亚麻属、黑麦草属、羽扇豆属、番茄属、苹果属、木薯属、马约兰属、苜蓿属、烟草属、木犀榄属、稻属、黍属、狼尾草属、鳄梨属、菜豆属、黄连木属、豌豆属、梨属、李属、萝卜属、蓖麻属、黑麦属、千里光属、芥属、茄属、高粱属、可可属、葫芦巴属、小麦属、野豌豆属、葡萄属、豇豆属或玉蜀黍属的物种。

[0180] 本发明提供转录激活物，例如作为启动子或增强子，用于调节植物细胞中核酸的表达，其中转录激活物(例如启动子)包含如SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中所列序列，或其功能性(转录调节性)亚序列，

[0181] 其中在一个方面，转录激活物(例如启动子)上调转录，并且在一个方面，转录激活物(例如启动子)以植物保卫细胞特异性方式上调转录，并且在一个方面，保卫细胞是叶保卫细胞或茎保卫细胞。

[0182] 本发明提供用于降低植物、植物叶、植物器官的表皮保卫细胞、或植物细胞中氧合作用效率和增加碳固定的方法，包括抑制或降低植物的一个或多个细胞中的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶，或“Rubisco”活性酶和/或Rubisco基因或转录物(信使)，包括：

[0183] (A)(a)提供编码植物Rubisco的核酸的反义核酸或者抑制编码植物Rubisco的核酸的抑制性核酸；和

[0184] (b)抑制或降低植物保卫细胞中Rubisco基因或信使(转录物)的表达；

[0185] (B)(A)的方法，其中细胞是植物保卫细胞；

[0186] (C)(A)或(B)的方法，其中植物是本发明的转基因植物，或用本发明的表达盒、质粒、病毒或载体转导的、转化的或感染的植物，或植物细胞是本发明的转导的细胞；或者[0187] (D)(A)至(C)任意一个的方法，其中编码Rubisco的核酸是Rubisco基因或信使(转录物)，或包含SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19的全部或亚序列的Rubisco编码核酸。

[0188] 本发明提供用于增加植物、植物叶、植物器官的表皮保卫细胞、或植物细胞中氧合作用效率和降低碳固定的方法，包括增加植物的一个或多个细胞中核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶，或“Rubisco”活性酶和/或Rubisco基因或转录物(信使)的表达：

[0189] (A)(a)提供编码植物Rubisco的核酸；和

[0190] (b)在保卫细胞中表达编码Rubisco的核酸；

[0191] (B)(A)的方法，其中细胞是植物保卫细胞；

[0192] (C)(A)或(B)的方法，其中植物是本发明的转基因植物，或用本发明的表达盒、质粒、病毒或载体转导的、转化的或感染的植物，或植物细胞是本发明的转导的细胞；或者[0193] (D)(A)至(C)任意一个的方法，其中编码Rubisco的核酸是Rubisco基因或信使(转录物)，或包含SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19的全部或亚序列的Rubisco编码核酸。

[0194] 本发明的一个或更多个实施方案的细节在附图和下面的描述中描述。本发明的其他特征、目标和优点根据说明书和附图以及根据权利要求书是显而易见的。

[0195] 本文所引用的所有公布、专利、专利申请、GenBank序列和ATCC保藏在此明确地通过参考并入本文用于所有目的。

附图说明

[0196] 专利或申请文件包含至少一个用彩色制作的附图。带有彩色附图的本专利或专利申请公布的复制品将由办公室根据请求并交纳必要费用后提供。

[0197] 图1图解说明显示野生型拟南芥和本发明CO2 sense双突变体中气孔导度的数据；如下面的实施例1所详细描述。

[0198] 图2是显示保卫细胞(GC)不同发育阶段中不同表达水平的图：图2A：保卫细胞不同发育阶段中的不同表达水平；图2B：幼叶和叶茎中27-GUS的表达；图2C：较上水平下胚轴中27-GUS的表达；图2D：叶茎和边缘中27-GUS的表达；图2E和图2F：野生型(wt)中的四个唇瓣；如下面的实施例1所详细描述。

[0199] 图3A-H是显示27-YC3.6(SEQ ID NO：10)在临近叶的茎上GC中表达但不在极幼叶的茎上GC中表达(已描画出轮廓)(A和A’)的图片。27-YC3.6主要表达于成熟的GC，在年幼或未成熟GC中极弱(B和B’中的白色箭头)。27-YC3.60(SEQ ID NO：11)也在下胚轴上的GC中表达(C和C’)。27-YC3.6(SEQ ID NO：10)也在萼片上的GC中表达(D和D’)；如下面的实施例1所详细描述。

[0200] 图4A图解显示在双突变体SEQ ID NO：1/SEQ ID NO：7植物中，表达该两个基因的能力的丧失导致与野生型(wt)植物相比CO2诱导的气孔关闭强烈受损；图4B图解说明双突变体SEQ ID NO：1/SEQ ID NO：7 CO2表型被转基因表达CORP1 cDNA(SEQ ID NO：7)互补的研究；图4a和图4b图解说明(a)双突变体(corp1 corp2)，WT(野生型)的相对气孔导度，和(b)转基因互补株系(CORP1/corp1 corp2)响应CO2浓度改变的表达CORP1(X轴：ppm[CO2])；图4C图解说明双突变体corp1/corp2植物没有破坏保卫细胞中其他重要信号转导途径，包括由干旱诱导的激素脱落酸(ABA)所诱导的气孔关闭，图4(c)图解说明SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：1，或corp1/corp2双突变体和WT植物对脱落酸(ABA)的响应未受损；
如下面实施例2中所详细描述。

[0201] 图5A和图5B，图解说明CA1(SEQ ID NO：7)和CA4(SEQ ID NO：1)可不同程度互补ca1ca4(突变体用小写斜体字母标明)双突变体；如下面实施例2中所详细描述。

[0202] 图6和7：图6图解说明CA1(SEQ ID NO：7)和CA4(SEQ ID NO：1)所互补植物的相对气孔导度，相对气孔导度反映气体交换和水利用率(WUE)；这些结果总结并图示于图7；如下面实施例2中所详细描述。

[0203] 图8是显示所互补植物中，特别是在如图中所标明的叶、保卫细胞和叶肉细胞中CA1(SEQ ID NO：7)和CA4(SEQ ID NO：1)表达水平的Northern印迹显微照片；如下面实施例2中所详细描述。

[0204] 图9A和9B是显示双敲除突变体(CA1(SEQ ID NO：7)和CA4(SEQ ID NO：1))中CA1(SEQ ID NO：7)和CA4(SEQ ID NO：1)表达水平的Northern印迹显微照片。图9C、9D和9E图解说明来自CO2传感器的数据，显示具有CO2调节气体交换的缺陷；注：光条件＝红-2 -1 -2 -1光(50μmol·m ·s )，蓝光(6μmol·m ·s )；如下面实施例2和4中所详细描述。

[0205] 图10A是显示ca1ca4(CA1(SEQ ID NO：7)和CA4(SEQ ID NO：1))双突变体中脱落酸响应未受损的总结图。图10B是显示野生型(WT)植物中CA1(SEQ ID NO：7)和/或CA4(SEQ ID NO：1)抑制剂模拟CO2不敏感性的总结图；如下面实施例2和4中所详细描述。

[0206] 图11A和11B是显示双敲除突变体(CA1(SEQ ID NO：7)和CA4(SEQ ID NO：1))中CA1(SEQ ID NO：7)和CA4(SEQ ID NO：1)表达水平的Northern印迹显微照片；图11C显示CA1(SEQ ID NO：7)或CA4(SEQ ID NO：1)基因的基因组DNA可补充CO2响应；光条件：红光-2 -1 -2 -1(50μmol·m ·s )，蓝光(6μmol·m ·s )；如下面实施例2和4中所详细描述。

[0207] 图12A、12B和12C图解显示双CO2传感器敲除突变体中光合作用未受损的数据总结图：在PS荧光测量之前的前适应时间阶段的光：50umol/m2/s：88％红光，
12％蓝光；2000umol/m2/s：90％红光，10％蓝光。图12D显示黑暗和红光(其中红光：
-2 -1
300μmol·m ·s )下的CO2同化率；如下面实施例2和4中所详细描述。

[0208] 图13A、13B、13C和13D，图解和照片显示光合作用受损的白叶中CO2调节气体交换不受影响；如下面实施例2和4中所详细描述。

[0209] 图14A和14B显示双敲除突变体(CA1(SEQ ID NO：7)和CA4(SEQ ID NO：1))中CA1(SEQ ID NO：7)和CA4(SEQ ID NO：1)表达水平的Northern印迹显微照片；图14C和14D图解和照片显示，在其中CA1(SEQ ID NO：7)和CA4(SEQ ID NO：1)可操作地连接至本发明的靶向保卫细胞的启动子的CO2传感器过表达植物具有增强的水利用率(WUE)；在图
14D中，数据显示没有观察到对开花时间有影响；如下面实施例2和4中所详细描述。

[0210] 图15图解显示保卫细胞所表达基因在保卫细胞和叶肉细胞中的转录谱；如下面实施例3中所详细描述。

[0211] 图16是GC1(SEQ ID NO：10)的核酸序列；如下面实施例3中所详细描述。

[0212] 图17A-L显示响应不同处理的GC1(At1g22690)基因表达分析的显微照片：图17A是显示GC1启动子介导报告基因在野生型拟南芥属幼苗保卫细胞中强表达的图，图片显示两周龄pGC1::GUS转基因幼苗；图17B显示在叶保卫细胞中以及在叶柄和下胚轴保卫细胞中pGC1::GUS驱动强GUS表达，如在图17C、D、E中所示；较年幼的或未成熟的保卫细胞显示没有GFP表达或者表达更少，如图17F、G中所示；萼片和下胚轴中的保卫细胞也显示具有GFP表达，如图17H、I、J、K中所示；GUS染色显示报告基因在成簇的气孔中表达，如图17L中所示；在用pGC1::YC3.60转化的tmm植物中的成簇的气孔中观察到GFP表达，如图17M中所示；在烟草叶中观察到强的保卫细胞GFP表达，如图17N中所示，如下面实施例3中所详细描述。

[0213] 图18A显示来自不同启动子::GUS转基因系的代表性T1植物的照片；图18B图解说明pGC1启动子的系列(结构或序列)缺失以便定义用于保卫细胞表达的区域，如下面实施例3中所详细描述。

[0214] 图19显示在表达pGC1::YC3.60的保卫细胞中强迫的胞内钙瞬变和存在于完整pGC1::YC3.60转基因植物保卫细胞中的自发钙瞬变：图19A显示pGC1::YC3.60转基因植物叶表皮的荧光图像；图19B显示在图A中的全部响应强迫的钙振荡而引起细胞内钙瞬变的六个保卫细胞的数据；图19C显示来自用pGC1::YC3.60转化的完整Col植物的叶的伪彩色比率度量图像；图19D显示C中箭头所标出的两个保卫细胞发射比率的时间进程，表明在完整的拟南芥属植物中存在自发钙瞬变，如下面实施例3中所详细描述。

[0215] 图20显示pGC1(D1)::anti-GFP导致35S::GFP植物保卫细胞中GFP表达降低的显微照片：图20A显示35S::GFP转基因植物的叶表皮(带有GFP滤光片的亮视野)；图20B显示在20A中所示的同一叶表皮的荧光图像；图20C显示表达pGC1(D1)::anti-GFP的
35S::GFP背景T1转基因植物的叶表皮；图20D显示在20C中所示的同一叶表皮的荧光图像，如下面实施例3中所详细描述。

[0216] 图21A、图21B、图21C和图21D显示，在植物中保卫细胞靶向性过表达CO2传感器显示在气体交换调节中CO2的响应增强，如下面实施例3中所详细描述。

[0217] 图22显示拟南芥属碳酸酐酶的系统发育树，如下面实施例4中所详细描述。

[0218] 图23图解说明气孔对蓝光和光-黑暗转换强烈响应的碳酸酐酶突变体植物的数据，如下面实施例4中所详细描述。

[0219] 图24A显示，ca4ca6双突变体表现出完整的CO2响应，而ca1ca4和ca1ca4ca6表-2 -1现出相同的CO2感知损伤；图24B、图24C、图24D和图24E图解说明以mol水m sec 为单位的气孔导度，如下面实施例4中所详细描述。

[0220] 图25证明用野生型CA1或CA4转化的几个独立的ca1ca4转基因系表现出恢复对[CO2]变化诱导的响应：两个其他的带有CA1的互补株系，CA1#2(图25A)和CA1#3(图
25B)，或者带有CA4的互补株系，CA4#2(图25C)和CA4#3(图25D)表现出响应[CO2]变化的正常气孔导度增加和降低，如下面实施例4中所详细描述。

[0221] 图26显示在烟草原生质体中不同CA1-YFP和CA4-YFP定位模式的细胞的荧光图片(共焦图像)：编码YFP、FLS2-YFP、CA1-YFP和CA4-YFP的质粒在烟草原生质体中瞬时表达；过滤器在图上部标明，而融合体在图左侧标明；在图26最右侧的图片显示YFP和叶绿素图像的叠加图像，如下面实施例4中所详细描述。

[0222] 图27A-G和图14C图解显示，保卫细胞驱动的CA1或CA4cDNA优先表达恢复了ca1ca4和CA过表达植物对CO2的感知，表现出增强的水利用率：图27A和图27B图解说明在CA1或CA4所互补植物保卫细胞原生质体和叶肉细胞中，由本发明的保卫细胞靶向性启动子所驱动的CA1和CA4表达的RT-PCR分析；图27C和图27D图解说明保卫细胞靶向性
株系ca1ca4双突变体和野生型(WT)植物响应所标明的[CO2]变化而发生的CO2诱导的气孔导度改变：CA1或CA4在保卫细胞中表达足以恢复CO2响应；图27E图解说明ca1ca4、野生型、ht1-2和三突变体ca1ca4ht1-2叶响应所标明的[CO2]变化的气孔导度；图27F和图
27G图解说明CA过表达系和野生型(WT)植物响应所标明[CO2]变化的气孔导度，如下面实施例4中所详细描述。

[0223] 图28A-F图解说明保卫细胞特异性互补CA1或CA4恢复ca1ca4的气孔CO2响应：用CA1或CA4的保卫细胞靶向性表达所互补的另一植物株系的CO2响应数据图示于图28A和图28B，并且分析了保卫细胞靶向性互补的4个株系的相对气孔导度CO2响应；两个示于图27C和图27D中，两个示于图28A和图28B中；图28C-F图解说明对365-800ppm CO2转换之前最后数据点进行标准化的相对气孔导度值，如下面实施例4中所详细描述。

[0224] 图29图解说明，在野生型保卫细胞中过表达CA1或CA4降低总体气孔导度并且轻微提高气孔CO2响应的强度；图29C和图29D图解说明由保卫细胞优先性启动子pGC1所驱动的过表达株系的叶中CA1或CA4的RT-PCR分析；过表达CA1基因的另一株系中的气孔导度测定示于图29A中，并且过表达CA4基因的另一株系示于图29B中。如图29C、图29D、图29E和图29F所示的相对气孔导度值对365-800ppm CO2转换之前的最后数据点进行标准化，如下面实施例4中所详细描述。

[0225] 在不同的附图中同样的附图标记指示同样的要素。

具体实施方式

[0226] 本发明提供用于通过控制称作“CO2Sen基因”的CO2传感器基因，包括本发明CO2传感器核酸(例如基因或信使或转录物)和多肽，来操纵水和二氧化碳(CO2)经植物气孔交换的组合物和方法。本发明提供用于过表达或欠表达CO2传感器核酸和CO2传感器多肽，包括本发明的CO2传感器核酸和多肽的组合物和方法。本发明提供用于过表达CO2传感器核酸和CO2传感器多肽，包括本发明的CO2传感器核酸和多肽，以改造成植物、植物部分、植物器官、叶等等中CO2响应改善的组合物和方法。

[0227] 过表达一个或几个称作“CO2Sen基因”的CO2传感器基因，包括CO2传感器核酸(例如基因或信使或转录物)，或CO2传感器多肽，包括本发明的CO2传感器多肽，引起改善的CO2响应。因此，过表达全部或者一个本发明核酸(以过表达CO2Sen蛋白质)增强WUE并且产生更有效的且抗旱的植物，特别是在连续不断升高的大气CO2浓度的情况下。本发明的转基因植物(例如农作物)(通过过表达全部或一个本发明CO2Sen蛋白质)以比野生型植物更大的程度关闭它们的气孔，由此保存了它们的水的利用。因为水利用率定义为植物平衡经气孔的水损失与用于光合作用的净CO2摄取以及由此获得的生物量积累的情况如何，本发明可以用于增加植物的生物量，并且因此本发明方法可应用于生物燃料/替代能源领域。

[0228] 本发明还提供用于通过例如CO2传感器的反义和/或RNAi阻抑，来抑制任何植物如农作物的保卫细胞或植物细胞中CO2Sens基因、转录物和CO2Sens蛋白质表达的组合物和方法。本发明的CO2Sens欠表达转基因植物或CO2Sens欠表达植物可以以比野生型植物更大的程度打开它们的气孔。

[0229] 本发明还提供能够耐受提高的温度，从而防止代谢、光合作用和生长“崩溃”的植物，例如农业农作物。因此，本发明的组合物和方法，通过抑制CO2Sens核酸和/或CO2Sens蛋白质的表达，帮助对提高的温度敏感的农作物应对提高的大气CO2浓度，并且降低或改善叶温度的急剧增加。本发明提供组合物和方法，包括用于阻抑保卫细胞中CO2传感器的反义和RNAi。在一个方面，保卫细胞启动子提供了经过这些农作物中增强的蒸腾作用来降低叶温度并使农作物产量最大化的方法。

[0230] 本发明提供用于下调/降低或备选地增加植物中经过例如植物保卫细胞、植物细胞、植物叶、植物器官或植物部分的二氧化碳(CO2)和/或水交换的组合物和方法，尤其包括具有碳酸酐酶、“磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧化酶”(或PEP羧化酶，或PEPC)和/或核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶，或“Rubisco”酶活性的多肽的使用。

[0231] 本发明提供用于操纵PEP羧化酶的组合物和方法，PEP羧化酶是C4植物光合作用中的关键酶。由于PEP羧化酶或PEPC不能够直接利用CO2作为底物，所以PEPC依赖碳酸-酐酶(CA)来提供HCO3。PEP羧化酶(PEPC)所催化的反应是(注：Pi是无机磷酸)：

[0232] PEP+HCO3-＜＝＞草酰乙酸(OAA)+Pi

[0233] 随后OAA可以还原成苹果酸。在一些植物细胞中，CO2被释放用于Rubisco和C3光合作用。

[0234] 在C4植物中(使用C4碳固定途径，也称作Hatch-Slack途径)，苹果酸可转运进入维管束鞘细胞(在C4植物中，维管束鞘细胞是在叶脉周围紧密排列成致密鞘的光合细胞；卡尔文循环被限定在维管束鞘细胞的叶绿体中)，其中CO2被释放用于Rubisco和C3光合作用；并且本发明还提供用于操纵Rubisco酶的组合物和方法。在本发明的一个方面，例如在植物的保卫细胞中，Rubisco酶如Rubisco小亚基的表达被抑制或阻抑(降低)。通过抑制或阻抑(降低)Rubisco表达，氧合作用效率降低并且碳固定可增加，并且保卫细胞中的CO2水平降低。这将减少CO2调节的气孔关闭。

[0235] 在本发明的的一个方面，将植物保卫细胞中的PEP羧化酶或PEPC改造成高水平或降低的水平，以操纵气孔运动的CO2控制和细胞内有机阴离子苹果酸2-的数量。PEPC水平的增加将引起气孔打开；PEPC的降低将导致气孔关闭；因此，虽然本发明不被任何特定的作用机制限制，但是PEPC水平的增加会引起苹果酸的增加，这在气孔打开过程中平衡了钾+ +阳离子(K)积累；并且因为细胞内钾(K)盐浓度的增加会引起气孔打开。因此，本发明提供用于分别通过过表达或欠表达PEPC，来打开和关闭植物气孔，或提高或降低气孔数量的组合物和方法。

[0236] 本发明提供用于通过操纵CO2结合蛋白质“磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧化酶”(或PEP羧化酶，或PEPC)和/或核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶，或“Rubisco”酶的表达，来调节植物或植物部分例如叶中二氧化碳(CO2)交换以及CO2利用和摄取的组合物和方法；因此，本发明还提供用于操纵植物或植物部分中CO2信号转导和调节气体交换的组合物和方法。例如，在一个方面，本发明提供用于工程改造增加PEPC数量(以促进气孔打开)和/或工程改造“Rubisco”酶数量的组合物和方法。

[0237] 在本发明的备选方面，PEPC和Rubisco核酸表达于植物细胞中，例如在植物保卫细胞和叶肉细胞中；并且在一个方面，它们以高水平(高于野生型水平)表达；或者植物细胞中，例如植物保卫细胞和叶肉细胞中PEPC和Rubisco核酸表达被抑制、降低或者阻抑；并且在一个方面，它们以较低水平(低于野生型水平)表达。在这些备选的实施方案中工程改造的植物细胞包括本发明的分离的、培养的或转基因的植物和植物细胞。

[0238] 转录调节元件

[0239] 本发明还提供用于调节核酸在植物细胞中表达的启动子，其中启动子包含如SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中所列序列，或其功能性(转录调节性)亚序列，其中，在一个方面，启动子上调转录，并且在一个方面，启动子以植物保卫细胞特异性方式上调转录，并且在一个方面，保卫细胞是叶保卫细胞或茎保卫细胞。本发明还提供包含本发明启动子的表达盒、质粒、病毒和载体。在一个方面，本发明还提供包含可操作地连接至本发明核酸的启动子的表达盒、质粒、病毒和载体，例如基于示例性SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的任意种类多核苷酸。

[0240] 该本发明启动子是强启动子，特别是在植物保卫细胞中，并且在一些实施方案中是保卫细胞特异性的，例如例证性的SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11(其在其它细胞中，如表皮细胞或叶肉细胞中的表达弱，并且仍考虑为“保卫细胞特异性的”)。

[0241] 基于多重微阵列数据，本发明的启动子比已知的保卫细胞KAT1启动子强约20倍，并且在保卫细胞中也比已知的花椰菜花叶病毒35S启动子强。见本发明附图以及下面的实施例。

[0242] 虽然本发明的核酸可以可操作地连接至本发明的启动子，但是在备选的实施方案中，它还可以可操作地连接至任何的组成型启动子和/或植物特异性启动子，或植物细胞特异性启动子，例如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、甘露碱合酶(MAS)启动子、衍生自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA的1′或2′启动子、玄参花叶病毒34S启动子、肌动蛋白启动子、稻肌动蛋白启动子、遍在蛋白启动子，例如玉米遍在蛋白-1启动子等等。

[0243] 可以用于表达TF序列的组成型植物启动子实例包括：花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，其使得在大多数植物组织中组成型高水平表达(见例如Odell等，(1985)Nature313：810-812)；胭脂碱合酶启动子(An等，(1988)Plant Physiol.88：547-552)；和章鱼碱合酶启动子(Fromm等，(1989)Plant Cell 1：977-984)。

[0244] 本发明的转录因子(例如启动子)或其它转录因子可以可操作地连接至本发明的编码序列，例如本发明的CO2调节性蛋白质。本发明的CO2调节性蛋白质可与特异性启动子或增强子可操作地连接，导致转录因子并且因此导致编码序列响应环境信号、组织特异性信号或者时间信号表达。调节基因响应环境的、激素的、化学的、发育的信号并以组织活化方式表达的多种植物基因启动子可用于TF序列在植物中的表达。对启动子的选择主要基于目的表型，并且通过诸如组织(例如种子、果实、根、花粉、维管组织、花、心皮等)、可诱导性(例如对创伤、热、冷、干旱、光、病原体等的响应)、时限、发育阶段等等因素确定。

[0245] 众多已知启动子已经被表征，并且可以有利地用来促进本发明多核苷酸在目的转基因植物或细胞中表达。例如，组织特异性启动子包括：种子特异性启动子(例如美国专利号5,773,697中描述的油菜籽蛋白、菜豆球蛋白或DC3启动子)、在果实成熟过程中具有活性的果实特异性启动子(例如dru 1启动子(美国专利号5,783,393)，或2A11启动子(例如见美国专利号4,943,674)和蕃茄聚半乳糖醛酸酶启动子(例如见Bird等，(1988)Plant Mol.Biol.11：651-662)、根特异性启动子如美国专利号5,618,988、5,837,848和5,905,186中描述的那些、花粉活性启动子如PTA29、PTA26和PTA13(例如见美国专利号
5,792,929)、维管组织活性启动子(例如见Ringli和Keller(1998)Plant Mol.Biol.37：
977-988)、花特异性(例如见Kaiser等，(1995)Plant Mol.Biol.28：231-243)、花粉(例如见Baerson等，(1994)Plant Mol.Biol.26：1947-1959)、心皮(例如见Ohl等，(1990)Plant Cell 2：837-848)、花粉和胚珠(例如见Baerson等，(1993)Plant Mol.Biol.22：
255-267)、生长素可诱导启动子(如van der Kop等，(1999)Plant Mol.Biol.39：979-990 or Baumann等，(1999)Plant Cell 11：323-334中所述)、细胞分裂素可诱导启动子(例如见Guevara-Garcia(1998)Plant Mol.Biol.38：743-753)，赤霉素响应性启动子(例如见Shi等，(1998)Plant Mol.Biol.38：1053-1060，Willmott等，(1998)Plant Molec.Biol.38：
817-825)等等。

[0246] 可以用于实施本发明的另外的启动子是那些响应下列因素而表达的那些启动子：热(例如见Ainley等，(1993)Plant Mol.Biol.22：13-23)、光(例如豌豆rbcS-3A启动子，Kuhlemeier等，(1989)Plant Cell 1：471-478，和玉米rbcS启动子，Schaffner和Sheen(1991)Plant Cell 3：997-1012)；创伤(例如wunI，Siebertz等，(1989)Plant Cell1：961-968)；病原体(例如Buchel等，(1999)Plant Mol.Biol.40：387-396中所述的PR-1启动子，和Manners等，(1998)Plant Mol.Biol.38：1071-1080中所述的PDF1.2启动子)，和化学物质如茉莉酸甲酯或水杨酸(例如见Gatz(1997)Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48：89-108)。此外，表达时限可以通过使用启动子，如在衰老时(例如见Gan和Amasino(1995)Science270：1986-1988)；或者晚期种子发育时(例如见Odell等，(1994)Plant Physiol.106：447-458)激活的那些启动子控制。

[0247] 组织特异性启动子仅在该组织内发育阶段的某一时限内促进转录。见例如Blazquez(1998)Plant Cell 10：791-800，其中表征了拟南芥属LEAFY基因启动子。还可见Cardon(1997)Plant J 12：367-77，其中描述了转录因子SPL3，SPL3识别拟南
芥(A.thaliana)花分生组织特征基因AP1启动子区域的保守序列模体；并且还可见
Mandel(1995)Plant Molecular Biology，第29卷，第995-1004页，其描述了分生组织启动子eIF4。可以使用组织特异性启动子，其在特定组织的整个生命周期中具有活性。在一个方面，本发明核酸可操作地连接至仅主要在棉花纤维细胞中有活性的启动子。在一个方面，本发明核酸可操作地连接至主要在棉花纤维细胞延长阶段有活性的启动子，例如上面Rinehart(1996)所述。核酸可可操作地连接至在棉花纤维细胞中优先表达的Fbl2A基因启动子(同前)。还可见John(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5769-5773；John，等，美国专利号5,608,148和5,602,321，描述了棉花纤维特异性启动子和用于构建转基因棉花植物的方法。根特异性启动子也可用于表达本发明的核酸。根特异性启动子的实例包括来自醇脱氢酶基因的启动子(DeLisle(1990)Int.Rev.Cytol.123：39-60)。可用于表达本发明核酸的其它启动子包括，例如胚珠特异性、胚胎特异性、胚乳特异性、珠被特异性、种皮特异性启动子或它们的一些组合；叶特异性启动子(见，例如Busk(1997)Plant J.11：1285
1295，描述了玉米中叶特异性启动子)；来自发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的ORF13启动子(其在根中表现出高活性，见例如Hansen(1997)见上)；玉米花粉特异性启动子(见例如Guerrero(1990)Mol.Gen.Genet.224：161168)；在果实成熟、叶和花(较少时候)衰老和脱落过程中具有活性的蕃茄启动子可以使用(见例如Blume(1997)Plant J.12：
731746)；来自马铃薯SK2基因的雌蕊特异性启动子(见例如Ficker(1997)Plant Mol.Biol.35：425431)；来自豌豆的Blec4基因，其在转基因苜蓿的营养枝条顶端和花枝条顶端的表皮组织中具有活性，这使得其是将外源基因靶向至活跃生长的枝或纤维中表达的有用工具；胚珠特异性BEL1基因(见例如Reiser(1995)Cell 83：735-742，GenBank号U39944)；
和/或，Klee，美国专利号5,589,583中描述的启动子，描述了能够使得在分生组织和/或快速分裂细胞中高水平转录的植物启动子区域。

[0248] 备选地，当暴露于植物激素如生长素时可诱导的植物启动子用于表达本发明的核酸。例如，本发明可以使用大豆(Glycine max L.)中的生长素应答元件E1启动子片段(AuxRE)(Liu(1997)Plant Physiol.115：397-407)；生长素响应性拟南芥属GST6启动子(也对水杨酸和过氧化氢响应)(Chen(1996)Plant J.10：955-966)；来自烟草的生长素可诱导parC启动子(Sakai(1996)37：906-913)；植物生物素应答元件(Streit(1997)Mol.Plant Microbe Interact.10：933-937)；和对应激激素脱落酸响应的启动子(Sheen(1996)Science 274：1900-1902)。

[0249] 本发明的核酸也可以可操作地连接至当暴露于可以应用于植物的化学试剂，如除莠剂或抗生素时可诱导的植物启动子。例如，可以使用被苯磺酰胺除莠剂安全剂活化的玉米In2-2启动子(De Veylder(1997)Plant Cell Physiol.38：568-577)；应用不同的除莠剂安全剂诱导不同的基因表达模式，包括在根、排水器和茎端分生组织中表达。编码序列可处于例如四环素可诱导启动子控制之下，例如所描述的包含燕麦(Avena sativa L.)(燕麦)精氨酸脱羧酶基因的转基因烟草植物(Masgrau(1997)Plant J.11：465-473)；或者处于水杨酸应答元件控制之下(Stange(1997)Plant J.11：1315-1324)。使用化学性(例如激素或杀虫剂)诱导启动子，即对可应用于田间转基因植物的化学药品响应的启动子，本发明多肽的表达可以在植物发育的特定阶段诱导。因此，本发明还提供包含编码本发明多肽的可诱导基因的、在农作物发育的任意阶段可诱导的转基因植物，所述基因的宿主范围限于靶植物物种，诸如玉黍蜀、稻、大麦、小麦、马铃薯或其它农作物。

[0250] 技术人员会认识到，组织特异性植物启动子可驱动可操作地连接的序列在除靶组织之外的组织中表达。因此，组织特异性启动子是优先驱动在靶组织或细胞类型中表达，但是也可以导致在其它组织中具有一些表达的启动子。

[0251] 本发明核酸也可以可操作地连接至当暴露于化学试剂时可诱导的植物启动子。这些试剂包括例如可以向转基因植物施用，如喷洒的除莠剂、合成的生长素、或抗生素。本发明核酸的可诱导性表达允许种植者选择带有最佳蛋白质表达和/或活性的植物。因此，可以控制植物部分的发育。以该方式，本发明提供便于植物和植物部分收获的方法。例如，在几个实施方案中，使用通过苯磺酰胺除莠剂安全剂活化的玉米In2-2启动子(De Veylder(1997)Plant Cell Physiol.38：568-577)；应用不同的除莠剂安全剂诱导不同的基因表达模式，包括在根、排水器和茎端分生组织中表达。本发明的编码序列也可以处于四环素可诱导的启动子控制之下，例如如所描述的包含燕麦精氨酸脱羧酶基因的转基因烟草植物(Masgrau(1997)Plant J.11：465-473)；或者处于水杨酸应答元件的控制之下(Stange(1997)Plant J.11：1315-1324)。

[0252] 在一些方面，正确的多肽表达会需要位于编码区3′端的多腺苷化区。多腺苷化区可衍生自天然基因、多种其它植物(或动物或其它)基因、或农杆菌(Agrobacterial)T-DNA中的基因。

[0253] 包含本发明核酸的植物

[0254] 本发明提供包含本发明核酸、多肽(例如CO2Sen蛋白质)、表达盒或载体或转染或转化细胞的转基因植物和种子。本发明还提供包含核酸和/或多肽(例如本发明的CO2Sen蛋白质)的植物产物，例如种子、叶、提取物等等。转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。本发明还提供用于产生和使用这些转基因植物和种子的方法。表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞可以按照本领域众所周知的任何方法构建。见例如美国专利号6,309,872。

[0255] 本发明的核酸和表达构建体可以通过多种方法导入至植物细胞内。例如，核酸或表达构建体可以导入至目的植物宿主的基因组中，或者，核酸或表达构建体可以是附加体。可以导入至目的植物的基因组中，使得宿主CO2Sen蛋白质的产生由内源转录或翻译控制元件调节，或者由异源启动子如本发明的启动子调节。本发明还提供“敲除植物”，其中通过例如同源重组的基因序列插入破坏了内源基因的表达。产生“敲除”植物的方法在本领域众所周知。

[0256] 本发明的核酸和多肽可以表达于或者插入于任何植物、植物部分、植物细胞或种子中。本发明的转基因植物或包含本发明核酸的植物或植物细胞(例如转染的、感染的或转化的细胞)可以是双子叶的或者单子叶的。包含本发明核酸的单子叶植物的实例，例如本发明的转基因单子叶植物是草类，诸如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草(blue grass)、早熟禾属(Poa))、牧草(forage grass)如羊茅属(festuca)、黑麦草属、温带草类(temperate grass)如剪股颖属(Agrostis)和谷类如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱和玉米(玉黍蜀)。包含本发明核酸的双子叶植物实例，例如本发明的转基因双子叶植物是烟草、豆类如羽扇豆类、马铃薯、甜菜、豌豆、菜豆和大豆、和十字花科植物(十字花科(brassicaceae))如花椰菜、油菜籽、和近缘模式生物拟南芥。因此，包含本发明核酸的植物或植物细胞(包括本发明的转基因植物和种子)包括广泛多种的植物，其包括但不限于来自腰果属、落花生属、天门冬属、颠茄属、燕麦属、芸苔属、柑桔属、西瓜属、辣椒属、红花属、椰子属、咖啡属、黄瓜属、南瓜属、胡萝卜属、油棕属、草莓属、大豆属、棉属、向日葵属、萱草属、大麦属、莨菪属、莴苣属、亚麻属、黑麦草属、羽扇豆属、番茄属、苹果属、木薯属、马约兰属、苜蓿属、烟草属、木犀榄属、稻属、黍属、狼尾草属、鳄梨属、菜豆属、黄连木属、豌豆属、梨属、李属、萝卜属、蓖麻属、黑麦属、千里光属、芥属、茄属、高粱属、可可属、葫芦巴属、小麦属、野豌豆属、葡萄属、豇豆属和玉蜀黍属的物种。

[0257] 本发明的核酸和多肽可以表达于或者插入于任何植物细胞、器官、种子或组织中，包括已分化和未分化的组织或植物，包括但不限于根、茎、枝、子叶、上胚轴、下胚轴、叶、花粉、种子、肿瘤组织和培养中的多种形式的细胞，如单细胞、原生质体、胚胎和愈伤组织。植物组织可以是植物中的组织或者器官、组织或细胞培养中的组织。

[0258] 转基因植物

[0259] 本发明提供包含和表达本发明CO2Sen基因和蛋白质的转基因植物；例如，本发明提供在有限水条件下表现出改善生长的植物，例如转基因植物；因此本发明提供耐干旱植物(例如农作物)。

[0260] 本发明的转基因植物还可以包括这样的机构，其对于通过例如改变多肽的磷酸化状态以维持其活化状态，来表达或改变由内源基因所编码多肽的活性是必需的。

[0261] 并入本发明多核苷酸和/或表达本发明多肽的转基因植物(或植物细胞，或植物外植体，或植物组织)可以通过如上所述的多种广为接受的技术产生。在构建包含本发明的多核苷酸，例如编码转录因子或转录因子同系物的多核苷酸的载体(最有代表性的是表达盒)之后，可以使用标准技术将多核苷酸导入目的植物、植物细胞、植物外植体或植物组织中。在一个方面，植物细胞、外植体或组织可以再生以产生转基因植物。

[0262] 植物可以是任何高等植物，包括裸子植物、单子叶植物和双子叶植物。对于豆科(Leguminosae)(苜蓿、大豆、三叶草(clover)等)、伞形科(Umbelliferae)(胡萝卜(carrot)、芹菜(celery)、欧洲防风(parsnip))、十字花科(Cruciferae)(甘蓝(cabbage)、萝卜(radish)、油菜籽、西兰花(broccoli)等)、葫芦科(Curcurbitaceae)(甜瓜(melons)和黄瓜(cucumber))、禾本科(Gramineae)(小麦、玉黍蜀、稻、大麦、栗(millet)等)、茄科(Solanaceae)(马铃薯、番茄、烟草、辣椒(pepper)等)和多种其它农作物的适宜方案是可以得到的。见描述于Ammirato等编，(1984)Handbook of Plant Cell Culture--Crop Species，Macmillan Publ.Co.，New York，N.Y.；Shimamoto 等，(1989)Nature 338：274-276；Fromm等，(1990)Bio/Technol.8：833-839；以及Vasil等，(1990)Bio/Technol.8：429-434中的方案。

[0263] 现在，单子叶和双子叶植物细胞的转化和再生是常规性的，并且对于最适当的转化技术的选择将由实施者确定。对方法的选择将随着待转化植物的类型而改变；本领域技术人员会识别出特定方法对于给定植物类型的适宜性。适宜方法可包括但不限于：植物原生质体电穿孔；脂质体介导的转化；聚乙二醇(PEG)介导的转化；使用病毒的转化；植物细胞微注射；植物细胞的微粒轰击；真空渗入；和根癌农杆菌介导的转化。转化意味着将核苷酸序列以引起序列稳定或瞬时表达的方式导入植物内。

[0264] 通过用所克隆序列的转化来修饰植物性状的成功的实例用作说明该技术领域的当前知识现状，并且包括例如美国专利号5,571,706；5,677,175；5,510,471；5,750,386；5,597,945；5,589,615；5,750,871；5,268,526；5,780,708；5,538,880；5,773,269；
5,736,369和5,619,042。

[0265] 在转化之后，使用整合入转化载体内的显性选择标记优选地选择植物。有代表性地，此类标记可以赋予所转化植物抗生素抗性或除莠剂抗性，并且对转化体的选择可以通过使植物暴露于适宜浓度抗生素或除莠剂下实现。

[0266] 在选择出所转化植物并且生长至成熟之后，鉴定出表现为改良形状的那些植物。改良形状可以是任何上述的那些形状。此外，为了证实改良形状归因于本发明多肽或多核苷酸的表达水平或活性的改变，可通过使用Northern印迹、RT-PCR或微阵列分析mRNA的表达，或者使用免疫印迹或Western印迹或凝胶位移测定分析蛋白质表达来确定。

[0267] 本发明的核酸和表达构建体可以通过任何方法导入至植物细胞中。例如，核酸或表达构建体可以导入至目的植物宿主的基因组内，或者核酸或表达构建体可以是附加体。可以导入至目的植物的基因组内，使得宿主的CO2传感器生产由内源转录或翻译控制元件调节。

[0268] 本发明还提供“敲除植物”，其中基因序列通过例如同源重组的插入已经破坏了内源基因的表达。产生“敲除”植物的方法在本领域众所周知，见例如Strepp(1998)Proc Natl.Acad.Sci.USA 95：4368-4373；Miao(1995)Plant J 7：359-365。见下面关于转基因植物的讨论。

[0269] 在一个方面，产生转基因植物或种子包括将本发明的序列，并且在一个方面(可选地)将本发明的序列和标记基因，一同整合入靶表达构建体(例如质粒)中，并定位启动子和终止子。这涉及通过适宜方法将所修饰基因转移入植物内。例如，可以使用诸如植物细胞原生质体电穿孔和微注射的技术将构建体直接导入植物细胞的基因组DNA中，或者使用轰击方法，如DNA粒子轰击将构建体直接导入植物组织中。例如，见例如Christou(1997)Plant Mol.Biol.35：197-203；Pawlowski(1996)Mol.Biotechnol.6：17-30；Klein(1987)Nature 327：70-73；Takumi(1997)Genes Genet.Syst.72：63-69，讨论了使用粒子轰击将转基因导入小麦中；以及Adam(1997)(见上)，公开了使用粒子轰击将YAC导入植物细胞内。例如，Rinehart(1997)(见上)，公开了使用粒子轰击产生转基因棉花植物。用于加速粒子的装置描述于美国专利号5,015,580；并且可以商业购买BioRad(Biolistics)PDS-2000粒子加速仪；还可见John，美国专利号5,608,148；和Ellis，美国专利号5,681,730，描述了粒子介导的裸子植物转化。

[0270] 在一个方面，可将原生质体固定并注射核酸，例如表达构建体。虽然对于谷类而言从原生质体再生植物并非易事，但是，在豆类中使用从原生质体所衍生愈伤组织的体细胞胚胎发生来再生植物是可能的。构成器官的组织(organized tissue)可以用基因枪技术以裸DNA转化，其中DNA包被在钨微粒上，枪弹为细胞大小的1/100，其携带DNA深入到细胞和细胞器内。然后诱导所转化组织再生，通常通过体细胞胚胎发生诱导所转化组织再生。该技术已经成功用于几种谷类物种，包括玉米和稻。

[0271] 在一个方面，第三个步骤可涉及对能够将所并入靶基因传递至下一代的全株的选择和再生。此类再生技术依赖于在组织培养的生长培养基中用某些植物激素处理，有代表性地依赖于已经随同目的核苷酸序列引入的抗微生物剂和/或除莠剂标记。植物从所培养的原生质体的再生描述于Evans等，Protoplasts Isolation and Culture，Handbook of Plant Cell Culture，第124-176页，MacMillilan Publishing Company，New York，1983；和Binding，Regeneration of Plants，Plant Protoplasts，第21-73页，CRC Press，Boca Raton，1985。也可以从植物愈伤组织、外植体、器官或其部分再生。此类再生技术一般描述于Klee(1987)Ann.Rev.of Plant Phys.38：467-486。为了从转基因组织如未成熟胚胎得到全株，可将它们于可控环境条件下在含营养物和激素的一系列培养基中生长，该方法称作组织培养。一旦全株产生并产生种子，则开始鉴定子代。

[0272] 在表达盒稳定整合入转基因植物中之后，可通过有性杂交将其导入至其他植物中。取决于待杂交的物种，可以使用诸多标准育种技术中的任何技术。一旦本发明核酸的转基因表达导致表型改变，则包含本发明重组核酸的植物可以与第二株植物有性杂交以得到最终产物。因此，本发明的种子可以来自两株本发明转基因植物之间杂交，或者本发明植物与另一植物的杂交。当两个亲本植物均表达本发明的多肽，例如CO2传感器时，则可提高目的效果(例如本发明多肽的表达以产生开花行为被改变的植物)。目的效果可通过标准繁殖方法传送至未来植物世代。

[0273] 反义抑制性分子

[0274] 在一个方面，本发明提供包含本发明序列的反义抑制性分子(其包括有义链和反义链)。天然存在的或合成的核酸可以用作反义寡核苷酸。反义寡核苷酸可以是任何长度；例如，在备选的方面中，反义寡核苷酸为约5至100、约10至80、约15至60、约18至40之间。最佳长度可以通过常规筛选确定。反义寡核苷酸可以任何浓度存在。最佳浓度可以通过常规筛选确定。可以解决该潜在问题的多种合成的、非天然存在的核苷酸和核酸类似物是已知的。例如，可以使用包含非离子主链，如N-(2-氨乙基)甘氨酸单元的肽核酸(PNA)。
还可使用具有硫代磷酸酯键的反义寡核苷酸，如WO 97/03211；WO 96/39154；Mata(1997)Toxicol Appl Pharmacol 144：189-197；Antisense Therapeutics，Agrawal编(Humana Press，Totowa，N.J.，1996)中所描述。如上所述，本发明提供的具有合成的DNA主链类似物的反义寡核苷酸还可以包括二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、烷基磷酸三酯、氨基磺酸酯、3′-硫缩醛、亚甲基(甲基亚氨基)、3′-N-氨基甲酸酯和吗啉代氨基甲酸酯核酸。

[0275] RNA干扰(RNAi)

[0276] 在一个方面，本发明提供包含本发明序列的RNA抑制性分子，所谓的“RNAi”分子。在一个方面，RNAi分子包含双链RNA(dsRNA)分子。RNAi分子可以包含双链RNA(dsRNA)分子，例如siRNA、miRNA(microRNA)和/或短发夹RNA(shRNA)分子。RNAi分子，例如siRNA(小的抑制性RNA)可抑制CO2Sen基因或任何相关的CO2传感器基因的表达，和/或miRNA(micro RNA)抑制CO2Sen基因或任何相关的CO2传感器基因的翻译。

[0277] 在备选的方面中，RNAi长度约11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个双链体核苷酸。本发明不受特定作用机制的限制，RNAi可进入细胞并且引起相似的或相同的序列的单链RNA(ssRNA)，包括内源mRNA降解。当细胞暴露于双链RNA(dsRNA)中时，来自同源基因的mRNA被一种称作RNA干扰(RNAi)的过程选择性降解。RNAi例如用于抑制转录的siRNA和/或抑制翻译的miRNA背后可能的基本机制是，将与特异基因序列匹配的双链RNA(dsRNA)断裂成称作短干扰RNA的短片段，这触发了与其序列匹配的mRNA的降解。在一个方面，本发明的RNAi用于基因沉默治疗中，见例如Shuey(2002)Drug Discov.Today 7：1040-1046。在一个方面，本发明提供使用本发明的RNAi选择性降解RNA的方法。
方法可以体外、间接体内或体内实施。在一个方面，本发明的RNAi分子可用于在细胞、植物组织或器官或种子或者植物中产生功能丧失型突变。

[0278] 在一个方面，RNAi(例如miRNA或siRNA)向细胞内的转导，是通过结合至包含所吸附RNAi(例如microRNA)的RNA结合蛋白的靶细胞特异性配体内化。配体是独特的靶细胞表面抗原特异性的。配体可以在结合细胞表面抗原之后自发内化。如果独特的细胞表面抗原在结合其配体之后不天然内化，可通过将精氨酸丰富肽或者其他膜透过性肽加入到配体或RNA结合蛋白结构中，或者将此类肽与配体或RNA结合蛋白连接，来促进内化。见例如美国专利申请公布号20060030003；20060025361；20060019286；20060019258。在一个方面，本发明提供用于递送的基于脂质的制剂，例如作为包含RNAi分子的核酸-脂质颗粒将本发明的核酸导入至细胞内，见例如美国专利申请公布号20060008910。

[0279] 产生和使用RNAi分子，例如siRNA和/或miRNA以选择性降解RNA的方法在本领域众所周知，见例如美国专利号6,506,559；6,511,824；6,515,109；6,489,127。

[0280] 用于产生从其中可转录CO2Sen基因抑制性多核苷酸(例如本发明的双链体siRNA)的表达构建体，例如载体或质粒的方法是众所周知的和常规的。调节区(例如启动子，增强子、沉默子、剪接供体、剪接受体等)可用于从表达构建体转录CO2Sen基因抑制性多核苷酸的一个RNA链或者多个RNA链。当产生双链体siRNA CO2Sen基因抑制性分子时，靶向IRES的靶向部分的有义链和反义链可作为两个分开的RNA链转录，两个分开的链将一起复性，或者作为一条RNA链转录，该条RNA链将形成发夹环并自身复性。例如，靶向CO2Sen基因部分的构建体插入到两个启动子(例如两个植物启动子、病毒启动子、噬菌体T7启动子或其他启动子)之间，使得产生双方向转录并且将产生互补的RNA链，互补的RNA链随后会复性形成本发明的抑制性siRNA。备选地，可将CO2Sen基因的靶向部分设计成共同在一个表达载体上的第一编码区和第二编码区，其中所靶向CO2Sen基因的第一编码区相对于控制它的启动子是有义方向，并且其中CO2Sen基因的第二编码区相对于控制它的启动子是反义方向。如果所靶向CO2Sen基因的靶向部分的有义编码区和反义编码区的转录是从两个单独的启动子转录的，结果会产生两条单独的RNA链，两条单独的RNA链随后会复性形成CO2Sen基因抑制性siRNA，例如本发明的CO2Sen基因抑制性siRNA。

[0281] 在另一个方面，所靶向CO2Sen基因的有义和反义靶向部分的转录由单一启动子控制，并且所得到的转录物将是单一发夹RNA链，其自身互补，即通过自身回折形成双链体以产生CO2Sen基因抑制性siRNA分子。在该构型中，所靶向CO2Sen基因的靶向部分的有义和反义编码区之间的间隔子，例如核苷酸间隔子可以改善单链RNA形成发夹环的能力，其中发夹环包含间隔子。在一个实施方案中，间隔子包含约5至50个核苷酸长度的核苷酸。在一个方面，siRNA的有义和反义编码区的每一个可以在不同的表达载体上并且处于其自身启动子控制下。

[0282] 抑制性核糖核酸酶

[0283] 本发明提供能够结合CO2传感器基因信使的核糖核酸酶。这些核糖核酸酶可以通过例如靶向mRNA来抑制CO2传感器基因活性。设计核糖核酸酶并选择用于靶向的CO2传感器基因特异性反义序列的策略已在科技文献和专利文献中充分描述，并且技术人员可以使用本发明的新的试剂设计此类核糖核酸酶。核糖核酸酶通过经核糖核酸酶的靶RNA结合部分与靶RNA的结合起作用，其与RNA的酶切部分紧密结合在一起并将靶RNA切割。因此，核糖核酸酶通过互补的碱基配对识别并结合靶RNA，并且核糖核酸酶一旦结合至正确位点，则其酶促作用以切割靶RNA并使之失活。此种方式的靶RNA切割，如果切割发生在编码序列内，则会破坏其指导所编码蛋白质合成的能力。在核糖核酸酶已经结合并切割其RNA靶之后，核糖核酸酶可从该RNA释放出以重复地结合并切割新的靶标。

[0284] 碳酸酐酶(碳酸脱水酶)

[0285] 本发明提供用于下调或降低植物保卫细胞、植物细胞、植物叶、植物器官或植物部分中二氧化碳(CO2)和/或水交换的方法，包括在细胞中表达具有碳酸酐酶(碳酸脱水酶)活性或β-碳酸酐酶活性的多肽。在备选的方面中，可使用任何的碳酸酐酶(碳酸脱水酶)，例如包括植物或细菌碳酸酐酶(碳酸脱水酶)。可以用于实施本发明的示例性碳酸酐酶(碳酸脱水酶)包括从下列物种分离或衍生的碳酸酐酶(碳酸脱水酶)：

[0286] 稻(稻(Oryza sativa))

[0287] NM_001072713(＝Genbank登录号)

[0288] 稻 ( 粳稻栽培种群 )(Oryza sativa(japonica cultivar-group))Os12g0153500(Os12g0153500)mRNA，完整cds

[0289] gi|115487387|ref|NM_001072713.1|[115487387]

[0290] NM_001072308(＝Genbank登录号)

[0291] 稻(粳稻栽培种群)Os11g0153200(Os11g0153200)mRNA，完整cds

[0292] gi|115484228|ref|NM_001072308.1|[115484228]

[0293] NM_001069944(＝Genbank登录号)

[0294] 稻(粳稻栽培种群)Os09g0464000(Os09g0464000)mRNA，完整cds

[0295] gi|115479630|ref|NM_001069944.1|[115479630]

[0296] NM_001069887(＝Genbank登录号)

[0297] 稻(粳稻栽培种群)Os09g0454500(Os09g0454500)mRNA，完整cds

[0298] gi|115479516|ref|NM_001069887.1|[115479516]

[0299] NM_001068550(＝Genbank登录号)

[0300] 稻(粳稻栽培种群)Os08g0470200(Os08g0470200)mRNA，完整cds

[0301] gi|115476837|ref|NM_001068550.1|[115476837]

[0302] NM_001068366(＝Genbank登录号)

[0303] 稻(粳稻栽培种群)Os08g0423500(Os08g0423500)mRNA，完整cds

[0304] gi|115476469|ref|NM_001068366.1|[115476469]

[0305] NM_001064586(＝Genbank登录号)

[0306] 稻(粳稻栽培种群)Os06g0610100(Os06g0610100)mRNA，完整cds

[0307] gi|115468903|ref|NM_001064586.1|[115468903]

[0308] NM_001053565(＝Genbank登录号)

[0309] 稻(粳稻栽培种群)Os02g0533300(Os02g0533300)mRNA，完整cds

[0310] gi|115446500|ref|NM_001053565.1|[115446500]

[0311] NM_001050212(＝Genbank登录号)

[0312] 稻(粳稻栽培种群)Os01g0640000(Os01g0640000)mRNA，完整cds

[0313] gi|115438794|ref|NM_001050212.1|[115438794]

[0314] NM_001050211(＝Genbank登录号)

[0315] 稻(粳稻栽培种群)Os01g0639900(Os01g0639900)mRNA，部分cds

[0316] gi|115438792|ref|NM_001050211.1|[115438792]

[0317] EF576561

[0318] 稻 ( 籼米栽培种群 )(Oryza sativa(indica cultivar-group)) 克隆OSS-385-480-G10碳酸酐酶mRNA，部分cds

[0319] gi|149392692|gb|EF576561.1|[149392692]

[0320] AF182806

[0321] 稻碳酸酐酶3mRNA，完整cds

[0322] gi|5917782|gb|AF182806.1|AF182806[5917782]

[0323] U08404

[0324] 稻叶绿体碳酸酐酶mRNA，完整cds

[0325] gi|606816|gb|U08404.1|OSU08404[606816]

[0326] 玉黍蜀：(玉米(zea may))

[0327] NM_001111889

[0328] 玉米碳酸酐酶(LOC542302)，mRNA

[0329] gi|162459146|ref|NM_001111889.1|[162459146]

[0330] U08403

[0331] 玉米Golden Bantam碳酸酐酶mRNA，完整cds

[0332] gi|606814|gb|U08403.1|ZMU08403[606814]

[0333] U08401

[0334] 玉米碳酸酐酶mRNA，完整cds

[0335] gi|606810|gb|U08401.1|ZMU08401[606810]

[0336] M95073

[0337] 玉米假定的碳酸酐酶同系物mRNA，部分cds

[0338] gi|168561|gb|M95073.1|MZEORFN[168561]

[0339] 大豆：(大豆属)

[0340] AJ239132

[0341] 大豆碳酸酐酶mRNA

[0342] gi|4902524|emb|AJ239132.1|[4902524]

[0343] 番茄(番茄属)

[0344] AJ849376

[0345] 番茄(Lycopersicon esculentum)叶绿体碳酸酐酶mRNA(ca2基因)

[0346] gi|56562176|emb|AJ849376.1|[56562176]

[0347] AJ849375

[0348] 番茄碳酸酐酶mRNA(ca1基因)

[0349] gi|56562174|emb|AJ849375.1|[56562174]

[0350] 烟草烟草属

[0351] AF492468

[0352] 朗氏烟草(Nicotiana langsdorffii)x花烟草(Nicotiana sanderae)蜜蛋白III(NEC3)mRNA，完整cds

[0353] gi|29468279|gb|AF492468.1|[29468279]

[0354] AF454759

[0355] 烟草(Nicotiana tabacum)β-碳酸酐酶(CA)mRNA，完整cds；编码叶绿体产物的细胞核基因

[0356] gi|22550385|gb|AF454759.2|[22550385]

[0357] AB009887

[0358] 烟草碳酸酐酶mRNA，部分cds

[0359] gi|8096276|dbj|AB009887.1|[8096276]

[0360] AB012863

[0361] 圆锥烟草(Nicotiana paniculata)NPCA1 mRNA，完整cds

[0362] gi|3061270|dbj|AB012863.1|[3061270]

[0363] L19255

[0364] 烟草叶绿体碳酸酐酶mRNA，3′端

[0365] gi|310920|gb|L19255.1|TOBCARANHY[310920]

[0366] M94135

[0367] 烟草叶绿体碳酸酐酶基因，完整cds

[0368] gi|170218|gb|M94135.1|TOBCLCAA[170218]

[0369] AY974608

[0370] 本塞姆氏烟草(Nicotiana benthamiana)克隆30F62叶绿体碳酸酐酶mRNA，部分cds；编码叶绿体产物的细胞核基因

[0371] gi|62865756|gb|AY974608.1|[62865756]

[0372] AY974607

[0373] 本塞姆氏烟草克隆30C84叶绿体碳酸酐酶mRNA，部分cds；编码叶绿体产物的细胞核基因

[0374] gi|62865754|gb|AY974607.1|[62865754]

[0375] AY974606

[0376] 本塞姆氏烟草克隆30B10叶绿体碳酸酐酶mRNA，部分cds；编码叶绿体产物的细胞核基因

[0377] gi|62865752|gb|AY974606.1|[62865752]

[0378] 大麦(大麦属)

[0379] L36959

[0380] 大麦(Hordeum vulgare)碳酸酐酶mRNA，完整cds

[0381] gi|558498|gb|L36959.1|BLYCA[558498]

[0382] 棉花(棉属)

[0383] AF132855

[0384] 陆地棉(Gossypium hirsutum)碳酸酐酶同种型2(CA2)mRNA，部分cds；编码质体产物的细胞核基因

[0385] gi|4754914|gb|AF132855.1|AF132855[4754914]

[0386] AF132854

[0387] 陆地棉碳酸酐酶同种型1(CA1)mRNA，部分cds；编码质体产物的细胞核基因[0388] gi|4754912|gb|AF132854.1|AF132854[4754912]

[0389] 杨树

[0390] U55837

[0391] 欧洲山杨(Populus tremula)x美洲山杨(Populus tremuloides)碳酸酐酶(CA1a)mRNA，细胞核基因编码叶绿体蛋白质，完整cds

[0392] gi|1354514|gb|U55837.1|PTU55837[1354514]

[0393] ：U55838

[0394] 欧洲山杨x美洲山杨碳酸酐酶(CA1b)mRNA，细胞核基因编码叶绿体蛋白质，完整cds

[0395] gi|1354516|gb|U55838.1|PTU55838[1354516]

[0396] 黄瓜属

[0397] DQ641132

[0398] 黄瓜(Cucumis sativus)克隆CU8F3碳酸酐酶mRNA，部分cds

[0399] gi|117663159|gb|DQ641132.1|[117663159]

[0400] 番茄属

[0401] AJ849376

[0402] 番茄叶绿体碳酸酐酶mRNA(ca2基因)

[0403] gi|56562176|emb|AJ849376.1|[56562176]

[0404] AJ849375

[0405] 番茄碳酸酐酶mRNA(ca1基因)

[0406] gi|56562174|emb|AJ849375.1|[56562174]

[0407] 苜蓿属

[0408] X93312

[0409] 紫花苜蓿(M.sativa)碳酸酐酶mRNA

[0410] gi|1938226|emb|X93312.1|[1938226]

[0411] 菜豆属

[0412] AJ547634

[0413] 菜豆(Phaseolus vulgaris)碳酸酐酶的部分mRNA(ca基因)

[0414] gi|28556429|emb|AJ547634.1|[28556429]

[0415] 豌豆属

[0416] X52558

[0417] 豌豆碳酸酐酶cap mRNA(EC 4.2.1.1)

[0418] gi|20672|emb|X52558.1|[20672]

[0419] M63627

[0420] 豌豆(P.sativum)碳酸酐酶mRNA，完整cds

[0421] gi|169056|gb|M63627.1|豌豆CAMRA[169056]

[0422] 梨属

[0423] AF195204

[0424] 黄金梨(Pyrus pyrifolia strain Whangkeumbae)碳酸酐酶同种型1(CA1)mRNA，完整cds

[0425] gi|8698882|gb|AF195204.1|AF195204[8698882]

[0426] 李属

[0427] EF640698

[0428] 杏仁(Prunus dulcis)克隆Pdbcs-E45假定的碳酸酐酶mRNA，部分cds

[0429] gi|148807206|gb|EF640698.1|[148807206]

[0430] 豇豆属

[0431] AF139464

[0432] 绿豆(Vigna radiata)碳酸酐酶(CipCa1)mRNA，完整cds；编码叶绿体产物的细胞核基因

[0433] gi|8954288|gb|AF139464.2|AF139464[8954288]

[0434] 来自任何碳酸酐酶基因，例如包括植物和细菌基因的编码碳酸酐酶的核酸可用于实施本发明；例如，可使用来自任何植物的任何碳酸酐酶基因的核酸，包括来自拟南芥属任何基因家族的任何编码碳酸酐酶的核酸序列，例如来自拟南芥科，如拟南芥的任何编码碳酸酐酶的核酸序列可用于实施本发明的组合物和方法，如示例性的编码碳酸酐酶的核酸序列(见下面的实施例6)：

[0435]

[0436] a 拟南芥基因组计划基因座号

[0437] b 根据Fabre N.等，(2007)Plant，Cell Environment 30：617-629；或来自拟南芥属信息资源网站(Carnegie Institution for Science，Department of Plant Biology，Stanford，CA，National Science Foundation基金资助)。

[0438] 因此，在备选的方面中，任何碳酸酐酶(碳酸脱水酶)可用于实施本发明。

[0439] 产生和操作核酸

[0440] 在备选的方面中，本发明提供，例如分离的、合成的和/或重组的编码本发明的新CO2传感器基因的核酸和编码序列、可抑制CO2传感器基因或信使表达的核酸(例如siRNA、microRNA、反义核酸)，和保卫细胞特异性转录调节元件如启动子。本发明的核酸可通过例如cDNA文库克隆和表达、经PCR的信使或基因组DNA的扩增等等产生、分离和/或操作。

[0441] 用于实施本发明的核酸，不论是RNA、iRNA、反义核酸、cDNA、基因组DNA、载体、病毒或其杂合体，可以通过遗传工程方法、扩增方法和/或重组表达/产生方法从多种来源分离。从这些核酸产生的重组多肽(例如本发明的糖基水解酶)可以单独分离或克隆并测试其目的活性。可使用任何重组表达系统，包括细菌、真菌、哺乳动物、酵母、昆虫或植物细胞表达系统。

[0442] 备选地，这些核酸可以通过众所周知的化学合成技术体外合成，如描述于例如 Adams(1983)J.Am.Chem.Soc.105：661；Belousov(1997)Nucleic Acids Res.25：3440-3444；Frenkel(1995)Free Radic.Biol.Med.19：373-380；Blommers(1994)
Biochemistry 33：7886-7896；Narang(1979)Meth.Enzymol.68：90；Brown(1979)Meth.Enzymol.68：109；Beaucage(1981)Tetra.Lett.22：1859；美国专利号4,458,066中的化学合成技术。

[0443] 操作核酸的技术，例如亚克隆、标记探针(例如使用Klenow酶、切口平移、扩增进行的随机引物标记)、测序、杂交等等已在科技文献和专利文献中充分描述，见例如Sambrook编，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL(第2版)，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory，(1989)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，Ausubel编，John Wiley & Sons，Inc.，New York(1997)；LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY：HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES，Part I.Theory and Nucleic Acid Preparation，Tijssen编，Elsevier，N.Y.(1993)。

[0444] 得到和操作用于实施本发明方法的核酸的另一个有用的方法是从基因组样品中克隆，并且如果需要，可将从例如基因组克隆或cDNA克隆分离或扩增的插入物进行筛选和再克隆。在本发明方法中使用的核酸的来源包括包含在例如哺乳动物人工染色体(MAC)中的基因组或cDNA文库，见例如美国专利号5,721,118；6,025,155；人人工染色体，见例如Rosenfeld(1997)Nat.Genet.15：333-335；酵母人工染色体(YAC)；细菌人工染色体(BAC)；P1人工染色体，见例如Woon(1998)Genomics 50：306-316；P1衍生载体(PAC)，见例如Kern(1997)Biotechniques 23：120-124；粘粒、重组病毒、噬菌体或质粒。

[0445] 本发明提供融合蛋白和编码它们的核酸。本发明的多肽可以融合至异源肽或多肽，例如赋予目的特性如荧光检测、增加的稳定性和/或简化纯化的N-末端鉴定肽。本发明的肽和多肽也可以作为带有与其连接的一个或多个另外结构域的融合蛋白合成和表达，例如产生免疫原性更强的肽，以便更容易地分离重组合成的肽，以鉴定和分离抗体和表达抗体的B细胞等等。利于鉴定和纯化的结构域包括，例如允许在固定化金属上开展纯化的金属螯合肽，如多组氨酸段和组氨酸-色氨酸组件、允许在固定化免疫球蛋白上开展纯化的蛋白质A结构域、和在FLAGS伸展/亲和纯化系统(Immunex Corp，Seattle WA)中利用的结构域。在纯化结构域和包含模体肽或多肽之间包含可切割接头序列，如因子Xa或肠激酶(Invitrogen，San Diego CA)利于纯化。例如，表达载体可包含编码表位的核酸序列，该序列与六组氨酸残基相连，后面跟有一个硫氧还蛋白和肠激酶切割位点(见例如Williams(1995)Biochemistry 34：1787-1797；Dobeli(1998)Protein Expr.Purif.12：404-414)。组氨酸残基利于检测和纯化，而肠激酶切割位点提供了从融合蛋白其余部分纯化表位的手段。关于编码融合蛋白的载体和融合蛋白应用的技术已在科技文献和专利文献中充分描述，见例如Kroll(1993)DNA Cell.Biol.，12：441-53。

[0446] 本发明的核酸或核酸序列可以是寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸或任何这些核苷酸的片段、基因组来源或人工来源的DNA或RNA(其可以是单链或双链的并且可以是有义链或反义链)、肽核酸(PNA)或任何DNA样或RNA样物质、天然或人工来源的。术语“核酸”或“核酸序列”包括寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸、或任何这些核苷酸的片段、基因组来源或人工来源的DNA或RNA(例如mRNA、rRNA、tRNA、iRNA)(其可以是单链或双链的并且可以是有义链或反义链)、肽核酸(PNA)或任何DNA样或RNA样物质、天然或人工来源的，包括例如iRNA、核糖核蛋白(例如双链iRNA，例如iRNP)。术语包含含有已知天然核苷酸类似物的核酸，即寡核苷酸。术语还包括带有合成的主链的核酸样结构，见例如Mata(1997)Toxicol.Appl.Pharmacol.144：189-197；Strauss-Soukup(1997)Biochemistry 36：8692-8698；Samstag(1996)Antisense Nucleic Drug Dev 6：153-156。“寡核苷酸”包括可以化学合成的单链多聚脱氧核苷酸或者两条互补的多聚脱氧核苷酸链。此类合成的寡核苷酸不具有
5′磷酸并且因此不与未经ATP和激酶添加磷酸的另一寡核苷酸连接。合成的寡核苷酸可与未脱磷酸的片段连接。

[0447] 在备选的方面中，术语基因意思是指参与产生多肽链的DNA片段；其可以包括编码区之前和之后的区域(前导区和非转录尾区)，以及在适当的时候还包括位于各个编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)。“可操作地连接的”指的是两个或更多个核酸(例如DNA)片段之间的功能性关联。在备选的方面中，其指的是转录调节序列与所转录序列的功能性关联。例如，如果启动子在适宜的宿主细胞或其他表达系统中刺激或者调节编码序列如本发明的核酸转录，则启动子可操作地连接至编码序列。在备选的方面中，启动子转录调节序列可以可操作地连接至所转录序列，在其中启动子转录调节序列与所转录序列可以直接相邻，即它们可以顺式作用。在备选的方面中，转录调节序列如增强子无需与它们所增强转录的编码序列直接相邻或者非常接近。

[0448] 在备选的方面中，本发明提供包含本发明核苷酸序列的“表达盒”，其能够实现核酸如结构基因(即本发明的蛋白质编码序列)在与此类序列相容的宿主中表达。表达盒可以包括至少一个与编码多肽的序列可操作地连接的启动子；并且在一个方面，表达盒还包括其他序列，例如转录终止信号。还可使用实现表达所需要的或者帮助实现表达的另外的因子，例如增强子。在备选的方面中，表达盒还包括质粒、表达载体、重组病毒、任何形式的重组“裸DNA”载体等等。在备选的方面中，本发明的“载体”可包含能够感染、转染、瞬时或永久转导细胞的核酸。在备选的方面中，载体可以是裸核酸，或用蛋白质或脂质复合的核酸。在备选的方面中，载体包含病毒或细菌核酸和/或蛋白质，和/或膜(例如细胞膜、病毒脂质外膜等)。在备选的方面中，载体包括但不限于复制子(例如RNA复制子、细菌噬菌体)，DNA片段连接至复制子并变成可复制的。因此，载体包括但不限于RNA、自主性自我复制的环状或线性DNA或RNA(例如质粒、病毒等等，见例如美国专利号5,217,879)，并且包括表达质粒和非表达质粒。在备选的方面中，载体可以在细胞有丝分裂过程中作为自主结构稳定复制，或者可以整合入宿主基因组内。

[0449] 在备选的方面中，用于实施本发明的“启动子”包括能够驱动编码序列在细胞，例如植物细胞中转录的所有序列。因此，在本发明构建体中使用的启动子包括参与调节或调整基因转录时限和/或速率的顺式作用转录控制元件和调节序列。例如，用于实施本发明的启动子可以是参与转录调节的顺式转录控制元件，包括增强子、启动子、转录终止子、复制原点、染色体整合序列、5′和3’非翻译区或内含子序列。这些顺式作用序列有代表性地与蛋白质或其他生物分子相互作用以执行(打开/关闭、调节、调整等)转录。用于实施本发明的“组成型”启动子可以是在大多数环境条件和发育或细胞分化状态下连续性驱动表达的那些启动子。用于实施本发明的“可诱导”或“可调节”启动子可以指导本发明的核酸在环境条件或发育条件感应下表达。影响通过用于实施本发明的可诱导启动子转录的环境条件实例包括缺氧条件、提高的温度、干旱或光的存在。用于实施本发明的“组织特异性”启动子可以是仅在例如植物或动物的特定细胞或组织或器官内具有活性的转录控制元件。组织特异性调节可通过某些内因子实现，这保证了编码特定组织特异性的蛋白质的基因的表达。

[0450] “杂交”指一个核酸链通过碱基配对与另一互补链结合在一起的过程。杂交反应可以是敏感的和选择性的，使得甚至在以低浓度存在的样品中可以鉴定特定的目的序列。适当严格条件可以通过例如预杂交和杂交溶液中的盐和甲酰胺浓度或者通过杂交温度定义，并且在本领域众所周知。具体而言，严格性可以通过降低盐浓度、增加甲酰胺浓度或提高杂交温度来提高。在备选的方面中，本发明的核酸通过其在不同(例如高、中和低)严格条件下杂交的能力定义，如本文所述。

[0451] 例如，在高严格条件下的杂交可在约50％甲酰胺中于约37℃至42℃下存在。低严格条件下的杂交可在约35％至25％甲酰胺中于约30℃至35℃下存在。具体而言，高严格条件下的杂交可于42℃下在50％甲酰胺、5X SSPE、0.3％SDS和200ug/ml剪切和变性的鲑精DNA中存在。低严格条件下的杂交如上所述，但存在于35％甲酰胺和降低的温度35℃下。相应于特定严格性水平的温度范围可通过计算目的核酸的嘌呤与嘧啶比率和根据期望调整温度进一步缩小。上述范围和条件的改变在本领域众所周知。

[0452] 蛋白质和/或核酸序列同源性可使用本领域熟知的任何多种序列比较算法和程序评价。此类算法和程序包括，但决不限于，TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA和CLUSTALW(Pearson 和 Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(8)：2444-2448，1988；
Altschul 等，J.Mol.Biol.215(3)：403-410，1990；Thompson 等，Nucleic Acids Res.22(2)：4673-4680，1994；Higgins 等，Methods Enzymol.266.：383-402，1996；
Altschul 等，J.Mol.Biol.215(3)：403-410，1990；Altschul 等，Nature Genetics
3:266-272，1993)。

[0453] 同源性或同一性常常使用序列分析软件(例如Genetics Computer Group的序列分析软件包，University of Wisconsin Biotechnology Center，1710 University Avenue，Madison，WI 53705)测定。此类软件通过对不同的缺失、替代和其他修饰指定同源性程度，将相似序列配对。术语“同源性”和“同一性”指的是，在两个或更多个核酸或多肽序列的情况下，当使用任何数量的序列比较算法或通过手工比对和视检测量整个比较窗口或者指定区域内的最大对应程度来比较并对齐的相同的或具有相同的特定氨基酸残基或核苷酸百分数的两个或更多个序列或亚序列。

[0454] 有用的算法的一个实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等，Nuc.Acids Res.25：3389-3402，1977和Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410，1990。开展BLAST分析的软件可通过National Center for Biotechnology Information公开获得。该算法涉及首先通过鉴定查询序列内短的长度W的单词来鉴定高评分的序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的单词比对时，则它们是匹配的或者满足一些正值的阈分值T。T指邻域单词评分阈值(Altschul等，(见上))。这些最初的邻域单词命中作为起始搜索的种子以找到包含它们的更长的HSP。单词命中沿着每一序列双方向延长直至积累的比对分值被提高。积累的分值使用用于核苷酸序列的参数M(对于匹配残基对的奖励分值；总＞
0)计算。对于氨基酸序列，使用评分矩阵计算积累分值。当出现下列情况时每一方向的单词命中的延长停止：积累的比对分值从其所达到的最大数值跌落数量X；由于一个或多个负评分残基比对的积累导致积累的分值变成零或低于零；或者到达了任一序列末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的敏感性和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用单词长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和双链比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用单词长3和期望值(E)10和BLOSUM62评分矩阵(见Henikoff和Henikoff，Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 89：10915，1989)比对(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和双链比较作为默认值。

[0455] 在一个方面，蛋白质和核酸序列同源性使用Basic Local Alignment Search Tool(″BLAS T″)评价。具体而言，使用五个特定的BLAST程序开展下列工作：

[0456] (1)用BLASTP和BLAST3将氨基酸查询序列与蛋白质序列数据库比较；

[0457] (2)用BLASTN将核苷酸查询序列与核苷酸序列数据库比较；

[0458] (3)用BLASTX将查询的核苷酸序列(双链)的六-阅读框概念翻译产物与蛋白质序列数据库比较；

[0459] (4)用TBLASTN将查询的蛋白质序列与在所有六个阅读框(双链)翻译的核苷酸序列数据库比较；和

[0460] (5)用TBLASTX将六-阅读框翻译的核苷酸查询序列与在六-阅读框翻译的核苷酸序列数据库比较。

[0461] 多肽和肽

[0462] 在一个方面，本发明提供分离的、合成的或者重组的具有CO2传感器活性的多肽和肽，或能够产生特异性结合CO2传感器的抗体的多肽和肽，CO2传感器包括本发明的CO2传感器，其包括本发明的氨基酸序列，氨基酸序列包括与示例性本发明CO2传感器多肽具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％或更高或100％(完全)序列同一性的那些氨基酸序列。

[0463] 例如，示例性的本发明序列包括：

[0464]

[0465]

[0466]

[0467]

[0468]

[0469]

[0470]

[0471] 本发明的多肽和肽可以是从天然来源分离的、合成的或者重组产生的多肽。肽和蛋白质可以体外或体内重组表达。本发明的肽和多肽可以使用本领域已知的任何方法产生或分离。本发明的多肽和肽也可以是使用本领域众所周知的化学方法全部或部分合成的。见例如Caruthers(1980)Nucleic Acids Res.Symp.Ser.215-223；Horn(1980)Nucleic Acids Res.Symp.Ser.225-232；Banga，A.K.，Therapeutic Peptides and Proteins，Formulation，Processing and Delivery Systems(1995)Technomic Publishing Co.，Lancaster，PA。例如，肽合成可以使用多种固相技术(见例如Roberge(1995)Science 269：202；Merrifield(1997)Methods Enzymol.289：3-13)开展，并且可以例如使用ABI 431A肽合成仪(Perkin Elmer)依照生产商提供的说明书实现自动合成。

[0472] 本发明的肽和多肽也可以被糖基化。糖基化可以在翻译后通过化学加入或者通过细胞的生物合成机制加入，其中后者加入了已知的糖基化模体，模体可以是序列天然的模体，或者可以作为肽加入，或者加入在核酸编码序列中。糖基化可以是O-连接的或N-连接的。

[0473] 在备选的方面中，本发明的氨基酸和/或氨基酸序列包括寡肽、肽、多肽或蛋白质序列，或者任何这些序列的片段、部分或亚单位，以及天然存在的或合成的分子。在备选的方面中，本发明的多肽通过肽键或修饰肽键彼此连接的氨基酸，并且可以包含20个基因编码氨基酸之外的修饰氨基酸。多肽可通过天然过程如翻译后加工，或者通过本领域众所周知的化学修饰技术修饰。修饰可存在于多肽的任何地方，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。可以意识到，同类型的修饰可以在给定多肽的几个位点以相同或不同的程度存在。同样，给定的多肽可具有许多类型的修饰。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价连接黄素、共价连接血红素部分、共价连接核苷酸或核苷酸衍生物、共价连接脂质或脂质衍生物、共价连接磷脂酰肌醇、交联环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联形成、半胱氨酸形成、焦谷氨酸形成、甲酰化、γ羧基化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化和转移RNA介导的向蛋白质添加氨基酸如精氨酰化。见例如，Creighton，T.E.，Proteins-Structure and Molecular Properties 第 2 版，W.H.Freeman and Company，New York(1993)；Posttranslational Covalent Modification of Proteins，B.C.Johnson 编，Academic Press，New York，第1-12页(1983))。

[0474] 本发明的肽和多肽，如上面所定义，包括所有的“模拟物”和“肽模拟物”形式。术语“模拟物”和“肽模拟物”指基本上具有本发明多肽同样结构和/或功能特性的合成的化合物。模拟物可以全部由氨基酸的人工的、非天然类似物构成，或者是部分天然肽氨基酸与部分氨基酸非天然类似物的嵌合分子。模拟物还可以掺入任何数量的天然氨基酸保守替换，只要此类替换基本上没有改变模拟物的结构和/或活性即可。对于是保守变体的本发明多肽，通过常规试验可以确定模拟物是否处于本发明的范围内，即其结构和/或功能基本上未改变。因此，在一个方面，如果模拟物组合物具有CO2传感器活性，则其处于本发明范围内。

[0475] 本发明的多肽模拟物组合物可包含非天然结构成分的任何组合。在备选的方面中，本发明的模拟物组合物包括下列三组结构基团之一或全部：a)天然酰胺键(“肽键”)之外的残基连接基团；b)非天然残基替换天然存在的氨基酸残基；或者c)引起二级结构模拟，即引起或稳定二级结构，例如β转角、γ转角、β折叠、α螺旋构型等等的残基。例如，当本发明多肽中全部或一些残基通过天然肽键之外的化学方式连接时，则本发明多肽可以表征为模拟物。各个肽模拟物残基可以通过肽键、其他化学键或偶联手段，例如戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯、双功能性马来酰亚胺、N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)或N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)来连接。可替代传统酰胺键(“肽键”)连接的连接基包括例如酮亚甲基(例如代替-C(＝O)-NH-的-C(＝O)-CH2-)、氨基亚甲基(CH2-NH)、乙烯、链烯(CH＝CH)、醚(CH2-O)、硫醚(CH2-S)、四唑(CN4-)、噻唑、逆酰胺(retroamide)、硫代酰胺或酯(见例如Spatola(1983)在Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides and Proteins，第7卷，第267-357页中，“Peptide Modifications，”Marcell Dekker，NY)。

[0476] 本发明多肽也可以表征为模拟物，其包含替代天然存在氨基酸残基的所有或一些非天然残基。非天然残基已在科技文献和专利文献中充分描述；作为天然氨基酸残基的模拟物使用的少数示例性非天然组合物以及使用规则在下面描述。芳香族氨基酸的模拟物可以通过用例如D或L-萘丙氨酸；D或L-苯基甘氨酸；D或L-2噻吩基丙氨酸；D或L-1、-2、3-或4-芘基丙氨酸；D或L-3噻吩基丙氨酸；D或L-(2-吡啶基)-丙氨酸；D或L-(3-吡
啶基)-丙氨酸；D或L-(2-吡嗪基)-丙氨酸；D或L-(4-异丙基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯丙氨酸；D-p-氟苯丙氨酸；D或L-p-二苯基苯丙氨酸；D或L-p-甲氧基-二苯基苯丙氨酸；D或L-2-吲哚(烷基)丙氨酸；和D或L-烷基胺
替代产生，其中烷基可以是取代的或非取代的甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、异丙基、异丁基、仲异丁基(sec-isotyl)、异戊基、或非酸性氨基酸。非天然氨基酸芳环包括例如噻唑基、苯硫基、吡唑基、苯并咪唑基、萘基、呋喃基、吡咯基和吡啶基芳环。

[0477] 酸性氨基酸模拟物可以通过被例如维持负电荷的非羧化氨基酸、(膦酰基)丙氨酸、硫酸化苏氨酸替换产生。羧基侧链基团(例如天冬氨酰或谷氨酰)也可以通过与碳二亚胺(R’-N-C-N-R’)，例如1-环己基-3(2-吗啉基-(4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3(4-氮-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺反应进行选择性修饰。天冬氨酰或谷氨酰也可以通过与铵离子反应转变成天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰残基。碱性氨基酸模拟物可以通过用例如(除了赖氨酸和精氨酸之外)氨基酸鸟氨酸、瓜氨酸或(胍基)-乙酸或(胍基)烷基-乙酸替换产生，其中烷基如上所定义。腈衍生物(例如包含代替COOH的CN-部分)可替代天冬酰胺或谷氨酰胺。天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰残基可以脱氨成为相应的天冬氨酰或谷氨酰残基。精氨酸残基模拟物可以通过精氨酰与例如一种或一种以上常规试剂，包括例如苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮或茚三酮，优选在碱性条件下反应产生。酪氨酸残基模拟物可以通过酪氨酰与例如芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反应产生。N-乙酰咪唑和四硝基甲烷可分别用于形成O-乙酰酪氨酰种类和3-硝基衍生物。半胱氨酸残基模拟物可通过半胱氨酰残基与例如α-卤乙酸如2-氯乙酸或氯乙酰胺以及相应的胺反应产生，以得到羧甲基或羧基酰胺甲基衍生物。半胱氨酸残基模拟物也可以通过半胱氨酰残基与例如溴-三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸；氯乙酰磷酸、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物；甲基2-吡啶基二硫化物；p-氯汞苯甲酸；2-氯汞-4-硝基酚；或者，氯-7-硝基苯- -1，3-二唑反应产生。赖氨酸模拟物可以通过赖氨酰与例如琥珀酸酐或其他羧酸酐反应产生(并且氨基末端残基可以被改变)。赖氨酸和其他包含α-氨基残基的模拟物也可以通过与亚氨酸酯如甲基吡啶酰胺(methyl picolinimidate)、磷酸吡哆醛、吡哆醛、硼氢化氯(chloroborohydride)、三硝基-苯磺酸、O-甲基异脲、2，4-戊二酮的反应和与乙醛酸的转酰胺基酶催化的反应产生。甲硫氨酸模拟物可以通过与例如甲硫氨酸亚砜反应产生。脯氨酸模拟物包括，例如哌啶酸、噻唑烷羧酸、3-或4-羟基脯氨酸、脱氢脯氨酸、3-或4-甲基脯氨酸、或3，3，-二甲基脯氨酸。组氨酸残基模拟物可以通过组氨酰与例如焦碳酸二乙酯或对溴苯酰甲基溴反应产生。其他模拟物包括，例如通过脯氨酸和赖氨酸羟基化；丝氨酰或苏氨酰残基羟基磷酸化；赖氨酸、精氨酸和组氨酸α-氨基的甲基化；N-末端胺的乙酰化；主链酰胺残基的甲基化或用N-甲基氨基酸替换；或者C-末端羧基的酰胺化产生的那些。

[0478] 本发明还提供用于通过天然过程如翻译后加工(例如磷酸化、酰化等)或者通过化学修饰技术修饰本发明多肽的方法、以及所得到的经修饰多肽。修饰可以在多肽的任何地方发生，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。可以意识到，同类型的修饰可以在给定多肽的几个位点以相同或不同的程度存在。同样，给定的多肽可具有许多类型的修饰。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价连接黄素、共价连接血红素部分、共价连接核苷酸或核苷酸衍生物、共价连接脂质或脂质衍生物、共价连接磷脂酰肌醇、交联环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联形成、半胱氨酸形成、焦谷氨酸形成、甲酰化、γ羧基化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化和转移RNA介导的向蛋白质添加氨基酸如精氨酰化。见例如Creighton，T.E，Proteins-Structure and Molecular Properties第2版，W.H.Freeman and Company，New York(1993)；Posttranslational Covalent Modification of Proteins，B.C.Johnson编，Academic Press，New York，第1-12页(1983)。

[0479] 固相化学肽合成方法可用于合成本发明的多肽或片段。自二十世纪六十年代初期开始此类方法已经在本领域众所周知(Merrifield，R.B.，J.Am.Chem.Soc.，85：2149-2154，1963)(还可见Stewart，J.M.和Young，J.D.，Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，Pierce Chemical Co.，Rockford，Ill.，第11-12页))并且最近已经用于可商业购买的实验室肽设计和合成试剂盒中(Cambridge Research Biochemicals)。此类可商业购买的实验室试剂盒普遍利用H.M.Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，81：3998(1984)的技术，并且提供在大批“棒”或“针”的尖端上合成肽，所有这些棒或针都连接在一个板上。
当使用此类系统时，一个板上的棒或针倒置并插入到第二块板上的相应孔或池中，孔或池中包含用于将适当氨基酸附着或锚定至针或棒尖端的溶液。通过重复此过程，即倒置并将棒和针的尖端插入到适当溶液中，将氨基酸构建成目的肽。此外，大量可用的FMOC肽合成TM
系统可以得到。例如，多肽或片段的组装可以使用Applied Biosystems公司的431A 型自动肽合成仪在固相支持物上开展。使用此仪器容易地得到本发明的肽，可以通过直接合成，或者通过合成一系列片段，这些片段可以使用其他已知技术偶联。

[0480] 本发明包括带有和不带有信号序列，即前导区序列的本发明的多肽。包含信号序列的本发明多肽可以是本发明的CO2传感器或者另一种CO2传感器或者另一种酶或者其他多肽。

[0481] 抗体和基于抗体的筛选方法

[0482] 本发明提供特异性结合本发明CO2传感器的分离的、合成的或重组的抗体。这些抗体可以用于分离、鉴定或定量本发明的CO2传感器多肽或相关多肽。这些抗体可以用于分离本发明范围内的其他多肽或者其他相关的CO2传感器。可以将抗体设计成结合至CO2传感器的活性部位。因此本发明提供使用本发明的抗体抑制CO2传感器的方法。

[0483] 本发明提供本发明酶的片段，包括本发明多肽的免疫原性片段。本发明提供包含本发明多肽或肽以及佐剂或载体等的组合物。

[0484] 抗体可以用于免疫沉淀、染色、免疫亲和柱等等。如果期望的话，针对特异抗原的核酸编码序列可如下产生：免疫、之后分离多肽或核酸、扩增或克隆并且将多肽固定化至本发明的阵列上。备选地，本发明方法可用于修饰由待修饰细胞所产生抗体的结构，例如抗体亲和性可以提高或降低。此外，制造或修饰抗体的能力可以是通过本发明方法工程改造细胞的表型。

[0485] 在备选的方面中，本发明的抗体包括从能够特异性结合抗原或表位的一个免疫球蛋白基因或多个免疫球蛋白基因或其片段衍生或仿制或基本编码的肽或多肽，见例如Fundamental Immunology，第3版，W.E.Paul编，Raven Press，N.Y.(1993)；Wilson(1994)J.Immunol.Methods 175：267-273；Yarmush(1992)J.Biochem.Biophys.Methods 25：85-97。术语抗体包括抗原结合部分，即保留了结合抗原能力的“抗原结合部位”(例如片段、亚序列、互补决定区(CDR))，包括(i)Fab片段，包含VL、VH、CL和CH1结构域的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，由抗体单个臂的VL和VH结构域组成，(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341：544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。单链抗体也包括在术语“抗体”之内。

[0486] 免疫、产生和分离抗体(多克隆和单克隆抗体)的方法是本领域技术人员熟知的，并且描述于科技文献和专利文献中，见例如Coligan，CURRENT PROTOCLS IN IMMUNOLOGY，Wiley/Greene，NY(1991)；Stites(编者)BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY(第7版)Lange Medical Publications，Los Altos，CA(“Stites”)；Goding，MONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLES AND PRACTICE(第2版)Academic Press，New York，NY(1986)；Kohler(1975)Nature 256：495；Harlow(1988)ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Publications，New York。除了使用动物的传统体内方法之外，抗体也可以体外产生，例如使用表达噬菌体展示文库的重组抗体结合位点。见例如Hoogenboom(1997)Trends Biotechnol.15：62-70；Katz(1997)Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26：27-45。

[0487] 阵列或“生物芯片”

[0488] 本发明的核酸和/或多肽可以固定化或应用至阵列，例如“生物芯片”。阵列可用于筛选或监测组合物库(例如小分子、抗体、核酸等)结合或调节本发明核酸或多肽活性的能力。例如，在本发明的一个方面，所检测的参数是CO2传感器基因的转录物表达。一种或一种以上或者全部的细胞转录物可以通过包含细胞转录物的样品，或者代表细胞转录物的核酸或者与细胞转录物互补的核酸，与阵列或“生物芯片”上的固定化核酸杂交来测定。通过使用微芯片上的核酸“阵列”，一些或全部的细胞转录物可以同时定量。备选地，包含基因组核酸的阵列可用于确定通过本发明方法所产生的新改造株的基因型。多肽“阵列”也可用于同时定量多种蛋白质。本发明可用任何已知的“阵列”，也称作“微阵列”或“核酸阵列”或“多肽阵列”或“抗体阵列”或“生物芯片”或其变体实施。阵列从类属上是大量的“斑”或“靶元件”，包含确定量的一种或一种以上的生物分子如寡核苷酸的每一个靶元件，固定化至基质表面的确定区域，用于特异性结合样品分子，例如mRNA转录物。

[0489] 如本文所使用的术语“阵列”或“微阵列”或“生物芯片”或“芯片”是许多靶元件，包含确定量的一种或一种以上多肽(包括抗体)或核酸的每一靶元件固定化至基质表面的确定区域，如下面所开展的更详细的讨论。

[0490] 在实施本发明的方法中，任何已知的阵列和/或制造和使用阵列的方法，或其变体，可以全部地或部分地并入，如美国专利号6,277,628；6,277,489；6,261,776；6,258,606；6,054,270；6,048,695；6,045,996；6,022,963；6,013,440；5,965,452；
5,959,098；5,856,174；5,830,645；5,770,456；5,632,957；5,556,752；5,143,854；
5,807,522；5,800,992；5,744,305；5,700,637；5,556,752；5,434,049中所描述；还可见例如WO 99/51773；WO 99/09217；WO 97/46313；WO 96/17958；还可见例如Johnston(1998)Curr.Biol.8：R171-R174；Schummer(1997)Biotechniques 23：1087-1092；Kern(1997)Biotechniques 23：120-124；Solinas-Toldo(1997)Genes，Chromosomes & Cancer 20：
399-407；Bowtell(1999)Nature Genetics Supp.21：25-32.还可见公布的美国专利申请号 20010018642；20010019827；20010016322；20010014449；20010014448；20010012537；
20010008765。

[0491] 试剂盒和文库

[0492] 本发明提供包含本发明组合物和方法的试剂盒，包括本发明的细胞和/或荧光原位杂交试剂(fish)、靶序列、转染试剂、转导试剂、说明书(关于本发明方法的)，或其任意组合。照此，本文提供试剂盒、细胞、载体等等。

[0493] 本发明提供用于调节植物大小和/或高度的组合物和方法，例如包括对例如整个植物、或植物的特定部分、或生长率、或幼苗活力的选择调节使得可以产生更适宜特定工业的植物。例如，特定农作物和树种高度的降低可以更容易收获。备选地，增加高度、粗度或器官大小、器官数目可有益地提供更多生物量，用于加工成食品、饲料、燃料和/或化学制品。商业上所期望性状的其他实例包括增加切花的花茎长度、增加或改变叶大小和形状或者增强种子和/或果实大小。器官大小、器官数目和生物量的改变还导致组分分子如次级产物生物量的改变，以及导致将植物变成生产这些化合物的工厂。因此，本发明的组合物和方法可用于调节植物大小、营养生长、植物生长率、器官数目、植物体系结构和/或生物量。

[0494] 本发明将通过下面的实施例进一步描述；然而，应当理解本发明并不限于这些实施例。

[0495] 实施例

[0496] 实施例1：通过控制本发明的CO2传感器基因操纵经植物气孔的水和二氧化碳(CO2)交换

[0497] 本发明提供用于通过控制本发明的CO2传感器基因操纵经植物气孔水和二氧化碳(CO2)交换的方法。

[0498] 构建拟南芥双突变体：根据细胞特异性微阵列分析该该双突变体缺乏两个同源基因的全长表达，两个同源基因在野生型保卫细胞中高度表达。

[0499] 根据细胞特异性微阵列分析，拟南芥双突变体缺乏在野生型保卫细胞中高度表达的同源基因的全长表达。CO2Sen双突变体显示受损的对[CO2]改变的气孔响应，其通过实时气体交换分析所测定；[CO2]改变涉及从环境365ppm CO2至提高的800ppm CO2和从800ppm CO2至降低的100ppm CO2。CO2sens类型编码的蛋白质结合CO2。

[0500] 图1图解说明显示野生型拟南芥生态型ColumbiA和CO2 sense双突变体中气孔导度的数据。环境365ppm CO2 0-1800秒，800ppm CO2 1800-3600秒，100ppm CO2 3600-9000秒。

[0501] 图2显示保卫细胞(GC)不同发育阶段中的不同表达水平：

[0502] 图2A：GC不同发育阶段中的不同表达水平。

[0503] 图2B：幼叶和叶茎中27-GUS的表达。

[0504] 图2C：较上水平下胚轴中27-GUS的表达。

[0505] 图2D：叶茎和边缘中27-GUS的表达。

[0506] 图2E和图2F：wt中的四个唇瓣。

[0507] 图3显示27-YC3.6(SEQ ID NO：10)在临近叶的茎上GC中表达但不在极幼叶的茎上GC中表达(已描画出轮廓)(A和A’)。27-YC3.6主要表达于成熟的GC，在年幼或未成熟GC中极弱(B和B’中的白色箭头)。27-YC3.60(SEQ ID NO：11)也在下胚轴上的GC中表达(C和C’)。27-YC3.6(SEQ ID NO：10)也在萼片上的GC中表达(D和D’)

[0508] 实施例2：控制植物CO2摄取和水利用率的CO2受体的表征

[0509] 本发明提供用于控制打开和/或关闭植物气孔的组合物和方法。气孔由叶表皮中的保卫细胞对形成，并且能够控制植物水损失和二氧化碳(CO2)向植物内的流入量。本发明提供用于控制用于光合碳固定的CO2摄取数量和控制通过蒸腾作用经这些“可控”气孔水损失数量的组合物和方法。本发明提供用于提供给保卫细胞信号转导机制以感应感知CO2水平、水状态、光和其他环境刺激，从而调节气孔孔径以便最优化不同条件下CO2流入量、水损失和植物生长的组合物和方法。

[0510] 本发明提供用于使植物对高水平CO2敏感以触发气孔关闭，和使植物对低CO2水平敏感以诱导气孔打开的组合物和方法。在一个方面，本发明的组合物和方法可用于去除大气[CO21(在一个方面，这通过体内或原位抑制CO2响应蛋白质的表达实现)，例如，以缓解大气[CO2]水平的增加，经预测大气[CO2]水平本将在本世纪内加倍。在一个方面，本发明的组合物和方法将改善大气[CO2]水平增加所带来的“气孔关闭”效应(在一个方面，这通过体内或原位增强CO2响应蛋白质的表达来实现)，注意到CO2提高会使不同植物物种的气孔孔径缩小高达40％。在一个方面，本发明的组合物和方法可用于改善由例如在全球范围内的大气[CO2]水平增加所导致的对植物气体交换、碳固定、叶温度和/或水利用率的深远影响。

[0511] 本发明人第一次产生并表征了表现出气孔CO2响应为CO2不敏感性，但未损伤脱落酸响应的突变体。使用保卫细胞特异性微阵列分析，本发明鉴定了两个同源基因发生突变的双突变体，该两个同源基因命名为CO2响应蛋白质1(CORP1)，也称作“CA1”或At3g01500或SEQ ID NO：7；和CO2响应蛋白质2(CORP2)，也称作“CA4”或At1g70410或SEQ ID NO：1；该两个同源基因均在拟南芥属植物保卫细胞中高度表达。虽然单敲除突变体没有表现出表型变化，但是该两个基因突变的双突变体植物与野生型(wt)植物相比，在CO2诱导气孔关闭方面表现出强烈受损，如图4a中所示。研究显示该CO2表型通过转基因表达CORP1 cDNA(SEQ ID NO：7)而互补，如图4b中所示。图4a和图4b显示双突变体(corp1 corp2)、WT(野生型)和(b)表达CORP1的转基因互补株系(CORP1/corp1 corp2)响应CO2浓度变
化的相对气孔导度(X轴：ppm[CO2])。

[0512] CORP蛋白质结合CO2。corp1(由例如SEQ ID NO：7编码)和corp2(由例如SEQ ID NO：1编码)也在其他植物细胞中表达。双突变体corp1/corp2植物没有破坏保卫细胞中其他重要信号转导途径，包括由干旱诱导的激素脱落酸(ABA)所诱导的气孔关闭，如图4c所示。图4(c)图解说明SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：1或corp1/corp2双突变体和WT植物对脱落酸(ABA)的响应未受损。

[0513] 这些数据表明，CORP1(由例如SEQ ID NO：7编码)和CORP2(SEQ ID NO：1)在控制总体植物气体交换的保卫细胞中作为CO2受体起作用，并且能够理解保卫细胞中由CORP1(由例如SEQ ID NO：7编码)和CORP2(由例如SEQ ID NO：1编码)介导CO2信号转导的分子机制。

[0514] 在另一个方面，为了便于分析CORP蛋白质，包括本发明的CORP蛋白质，例如CORP1和CORP2蛋白质的亚细胞定位，本发明还提供了带有N-末端标签和C-末端标签(例如YFP融合体)的CORP蛋白质，包括本发明的CORP蛋白质，例如CORP1和CORP2。这些标记的的CORP蛋白质导入至野生型和corp1 corp2双突变体植物中。分析细胞定位和同时存在的互补。

[0515] 在另一个方面，编码CORP的基因，例如编码CORP蛋白质的本发明核酸，例如corp1和corp 2，可操作地连接至不同的转录调节序列如启动子，例如可操作地连接至保卫细胞特异性转录调节序列，如本发明的保卫细胞特异性启动子。这些核酸用于确定CORP1和/或CORP2是否可以在保卫细胞中表达用于功能性气孔CO2信号转导；例如单独的CORP1和/或CORP2或者两者一起对于植物细胞、组织或器官内的功能性气孔CO2信号转导是否足够。

[0516] 在一个方面，本发明将处于保卫细胞特异性启动子(例如本发明的保卫细胞特异性转录调节序列，例如本发明的保卫细胞特异性启动子)、叶肉细胞特异性启动子和/或异位35S启动子控制下的这两个基因导入corp1 corp2双突变体植物内，以确定细胞对于受损CO2响应的互补的特异性需求。为此目的开展了气体交换和气孔信号转导分析。数据显示这些受体在保卫细胞内的气孔CO2信号转导中起作用。

[0517] 在一个方面，本发明表征通过CORP蛋白质所介导的CO2信号转导机制，例如使用本发明的编码CORP的核酸，并且在一个例证性的方法中，CORP相互作用蛋白质分离自植物、细菌或其它细胞。在一个方面，方法包括是用酵母双杂交筛选系统、分离的便在蛋白筛选系统和/或使用如YFP标记的(或等效标记的)CORP蛋白质的免疫共沉淀系统。鉴定和分析了CORP相互作用物在CO2信号转导中的功能。

[0518] 在一个方面，本发明提供细胞类型特异性过表达CORP的细胞、组织、器官和/或细胞系，以便例如分析植物在不同CO2浓度下的水利用率和拟南芥属和所选择的重要经济农作物的改良水利用率，例如从经济角度改良的水利用率对于碳固定至关重要。数据显示，通过过表达CORP(使用本发明的编码corp的核酸)使拟南芥属的水利用率增加大于百分之五十(＞50％)。

[0519] 制作了两个同源基因CO2响应蛋白质1(CORP1)，也称作“CA1”或At3g01500或SEQ ID NO：7；和CO2响应蛋白质2(CORP2)，也称作“CA4”或At1g70410或SEQ ID NO：1双突变体的互补株系。我们测定了互补植物和过表达植物的气孔指数。如图5A和图5B中所示，CA1(SEQ ID NO：7)和CA4(SEQ ID NO：1)可不同程度互补该双突变体。CA1过表达降低“气孔指数”。“气孔指数”定义为：(每平方毫米的气孔数量×100)/(每平方毫米的气孔数量+每平方毫米的表皮细胞数量)；或者备选地简化成：气孔指数(I)＝[S/(E+S)]*100，其中S是每单位面积的气孔数量，E是同样单位面积的表皮细胞数量。该“气孔指数”数值可用于比较不同大小的叶；在叶发育过程中相对湿度和光强度影响气孔指数数值。

[0520] 也测量了CA1(SEQ ID NO：7)和CA4(SEQ ID NO：1)所互补植物的气体交换和水利用率(WUE)。在上午测量植物气体交换和WUE。示例性的结果分析并示于图6，图6显示相对气孔导度；这些结果总结并图示于图7。

[0521] 图8是显示互补植物中，特别是在叶、保卫细胞和叶肉细胞中CA1(SEQ ID NO：7)和CA4(SEQ ID NO：1)表达水平的Northern印迹显微照片。

[0522] 图9A和9B是显示双敲除突变体(CA1(SEQ ID NO：7)和CA4(SEQ ID NO：1))中CA1(SEQ ID NO：7)和CA4(SEQ ID NO：1)表达水平的Northern印迹显微照片。图9C、9D和9E图解说明来自CO2传感器的数据，显示具有CO2调节气体交换的缺陷；注：光条件＝红-2 -1 -2 -1光(50μmol·m ·s )，蓝光(6μmol·m ·s )。

[0523] 图10A是显示ca1ca4(CA1(SEQ ID NO：7)和CA4(SEQ ID NO：1))双突变体中脱落酸响应未受损的总结图。图10B是显示野生型(WT)植物中CA1(SEQ ID NO：7)和/或CA4(SEQ ID NO：1)抑制剂模拟CO2不敏感性的总结图。

[0524] 图11A和11B是显示双敲除突变体(CA1(SEQ ID NO：7)和CA4(SEQ ID NO：1))中CA1(SEQ ID NO：7)和CA4(SEQ ID NO：1)表达水平的Northern印迹显微照片；图11C显示CA1(SEQ ID NO：7)或CA4(SEQ ID NO：1)基因的基因组DNA可在不同光条件下补充CO2响-2 -1 -2 -1应：红光(50μmol·m ·s )，蓝光(6μmol·m ·s )。

[0525] 图12A、12B和12C图解显示双CO2传感器敲除突变体中光合作用未受损的数据总结图：在PS荧光测量之前的前适应时间阶段的光：50umol/m2/s：88％红光，
12％蓝光；2000umo1/m2/s：90％红光，10％蓝光。图12D显示黑暗和红光(其中红光：
-2 -1
300μmol·m ·s )下的CO2同化率。

[0526] 图13A、13B和13C，图解和照片显示光合作用受损的白叶中CO2调节气体交换不受影响。

[0527] 图14A和14B显示双敲除突变体(CA1(SEQ ID NO：7)和CA4(SEQ ID NO：1))中CA1(SEQ ID NO：7)和CA4(SEQ ID NO：1)表达水平的Northern印迹显微照片；图14C和14D图解和照片显示，在其中CA1(SEQ ID NO：7)和CA4(SEQ ID NO：1)可操作地连接至本发明的靶向保卫细胞的启动子的CO2传感器过表达植物具有增强的水利用率(WUE)；在图
14D中，数据显示没有观察到对开花时间有影响。

[0528] 实施例3：强的拟南芥属保卫细胞启动子的分离和表征以及它们作为保卫细胞转录激活物的用途

[0529] 本发明提供在植物保卫细胞中非常活跃的转录激活物；包括保卫细胞特异性转录激活物，例如启动子。例如，本发明提供具有下述序列的核酸(多核苷酸)，所述序列与SEQ ID NO：10和/或SEQ ID NO：11，在至少约50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800或更多个残基范围内，或具有保卫细胞特异性活性的启动子或具有保卫细胞特异性活性的转录调节区的全长范围内，具有至少约70％、71％、72％、73％、
74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高或完全的序列同一性，其中核酸包含保卫细胞特异性启动子或者保卫细胞特异性转录调节区，或者由其组成。

[0530] 在一个方面，本发明提供持续性地使异源序列在植物细胞中高表达，例如持续性地使目的转基因高表达的保卫细胞转录调节区。在一个方面，本发明的转录调节区用于改良用于在保卫细胞中靶向表达基因的可用方法。

[0531] 基于23,000个基因的新的保卫细胞特异性微阵列分析分离强的保卫细胞启动子候选物。基于保卫细胞特异性微阵列的方法用于分析假定的强保卫细胞特异性启动子。启动子pGC1(At1g22690)驱动报告基因(GUS和基于GFP的钙报告基因)在拟南芥属和烟草的保卫细胞中极强烈的表达。保卫细胞特异性的基因阻抑也通过pGC1驱动的反义抑制实现。

[0532] 结果：启动子pGC1(At1g22690)驱动报告基因强烈地和相对特异性地在保卫细胞中表达，包括GUS(β-葡糖苷酸酶)和黄卡默莱昂(yellow cameleon)YC3.60(基于GFP的钙FRET报告基因)。报告基因的基因表达在未成熟保卫细胞中较弱。YC3.60的表达足够2+
强，以致能对未受损植物保卫细胞中的细胞内Ca 动力学和保卫细胞中的分辨的自发钙瞬变成像。GC1启动子还介导报告基因在气孔发育突变体too-many-mouths(tmm)的成簇气孔中强表达。

[0533] 此外，相同的启动子::报告基因构建体还驱动报告基因特异性地在烟草保卫细胞中表达，说明该启动子作为用于在保卫细胞中高水平表达的方法的潜力。系列缺失启动子确定了保卫细胞表达启动子区域。此外使用pGC1的反义阻抑可有效地降低GFP基因特异性在保卫细胞中表达，而在叶表皮细胞中的表达不受抑制，这证明了强的细胞类型优选的基因抑制。

[0534] 结论：本发明的pGC1启动子驱动报告基因在拟南芥属和烟草植物保卫细胞中强表达。本发明启动子可提供用于靶向保卫细胞表达或基因沉默的有效工具。本发明的启动子可用于降低保卫细胞中的特异性基因表达，这提供了用于规避源自遗传冗余和致死性的局限性的规避方法。本发明的启动子可用于操纵保卫细胞中的信号转导途径并且改良植物在应激条件下的性能。

[0535] 结果

[0536] 强保卫细胞启动子pGC1的分离

[0537] 将保卫细胞特异性微阵列数据与叶肉细胞特异性微阵列数据[见下面所引用的参考文献26]一起分析，以搜索在叶肉细胞中低表达水平的强保卫细胞启动子候选物。开展涵盖234,000个基因(来源：ATH1 Affymetrix，Santa Clara，CA)的保卫细胞和叶肉细TM胞微阵列试验。此外，使用GENEVESTIGATOR 分析候选基因，以在2000个微阵列试验[见下面所引用的参考文献27]中，选择出在非叶组织中低表达水平的基因。还分析了暴露于ABA的保卫细胞和叶肉细胞，因为在几种应激条件下诱导ABA的合成。下列标准用于选择强保卫细胞启动子候选物。保卫细胞中的原始信号设置成高于10000，叶肉细胞中的原始信号设置成低于1000，并且因ABA的降低倍数或诱导倍数设置成小于2。几个基因的转录谱符合这些标准，见图15，其图解显示在保卫细胞和叶肉细胞中保卫细胞所表达基因的转录谱。

[0538] 在图15 中，显示了来自两个独立微阵列的 KAT1(At5g46240)、AtMYB60(At1g08810)、AtMYB61(At1g09540)、RAB18(At5g66400)、GC1(At1g22690)(SEQ ID NO：10)和AtACT7(At5g09810)的平均转录水平。虽然KAT1、AtMYB60和GC1全部表现为保卫细胞特异性表达，但是GC1的转录水平在这三个基因中最高。RAB18也表现为极强的保卫细胞表达，但是其在叶肉细胞中的表达水平被ABA处理强烈诱导。

[0539] 假定的启动子(所注释的ATG起始密码子上游1-2kb，见图16)通过PCR扩增，并克隆入GUS报告基因载体。T1转基因植物GUS染色显示，对于一个称作pGC1的特定启动子候选物(At1g22690)表现出保卫细胞特异性染色。At1g22690是在保卫细胞中表达最高的基因。显示其在保卫细胞中相对高表达，并且在叶肉细胞中低表达。At1g22690编码小的半胱氨酸丰富蛋白质(119个氨基酸)。At1g22690属于GASA家族(GA刺激的转录物(GAST1)蛋白质同系物)。Wigoda等[28]的研究表明，GIP2(来自矮牵牛(Petunia hybrida)的GASA蛋白质)表现出植物原位(in planta)抗氧化剂活性。在At1g22690中插入T-DNA的株系在我们的标准实验室条件下没有得到任何显著的气孔表型(未公布数据)。此外，我们的保卫细胞微阵列数据显示，两个其他GASA基因也表现出在保卫细胞中高表达(GASA
1(At1g75750)和GASA 4(At5g15230)。

[0540] 图16是启动子序列GC1(SEQ ID NO：10，但是图16的序列具有添加在3’端的ATG)：在GC1中转录起始位点指定为+1，假定的起始密码子(ATG)位于+23/+25bp。已经证明促成保卫细胞特异性基因表达的Dof靶位点，即5’-TAAAG-3’(+)或5’-CTTTA-3’(-)[24]加框表示。脱落酸应答元件ABRE，即5’-ACGTG-3’(+)或5’-CACGT-3’(-)加下划线表示并且标记。TATA盒(5’-TATATAA-3’)和起始密码子(ATG)用带虚框的粗体显示。箭头标记用于图18中启动子缺失分析的位置。

[0541] 我们分析了通过GENEVESTIGATORTM编辑的微阵列数据中[27，29]相应不同处理的GC1(At1g22690)基因表达。在96种处理当中，8种处理影响At1g22690表达超出两倍。盐和渗透应激急剧降低At1g22690基因表达(超过10倍)[30]。同时，光、ABA、GA、冷或干旱没有诱导出超过两倍的At1g22690基因表达变化。这表明，在绝大多数常见的情况下，GC1(At1g22690)具有相对稳定的表达。

[0542] 有趣地，pGC1::GUS不仅在叶保卫细胞中驱动强GUS表达(图17AB)，而且也在叶柄和下胚轴保卫细胞中驱动强GUS表达(图17C、D、E)。来自其他候选物启动子-GUS融合体的GUS染色显示没有一个在保卫细胞中很强表达和/或显示报告基因在其他组织中表达。因为，对于本研究的剩余部分我们集中于pGC1。GC1启动子还融合至第二报告基因，即基于GFP的钙报告基因黄卡默莱昂3.60(YC3.60)[31]。大多数用pGC1::YC3.60转化的T1转基因植物(大约75％)表现出强的保卫细胞特异性荧光，指示了每一转化体的高程度的保卫细胞表达效率。一些植物在叶表皮细胞中也显示荧光(数据未显示)。然而，较年幼的或者未成熟保卫细胞显示没有GFP表达或者表达更少(图17F、G)。此外，在萼片和下胚轴的保卫细胞中也显示GFP表达(图17H、I、J、K)。

[0543] 我们进一步试验了GC1(SEQ ID NO：10)启动子是否能够在保卫细胞发育突变体too many mouths(tmm)[32]中驱动保卫细胞特异性报告基因表达。tmm突变体用pGC1::GUS或pGC1::YC3.60构建体转化。GUS染色显示报告基因在成簇的气孔中表达(图17L)。同样地，在用pGC1::YC3.60转化的tmm植物的成簇的气孔中观察到GFP表达(图17M)。

[0544] 为了验证GC1启动子是否能够驱动报告基因在除拟南芥属之外的植物中进行保卫细胞特异性表达，我们还将pGC1::YC3.60转化入烟草植物。有趣地，在烟草叶中观察到强的保卫细胞GFP表达，见图17N。

[0545] 总之，对于图17：GC1启动子介导报告基因在野生型拟南芥属幼苗、too many mouths突变体和烟草的保卫细胞中强表达：

[0546] 图17A：两周龄pGC1::GUS转基因幼苗。

[0547] 图17B.不同阶段保卫细胞表现不同水平的GUS表达。

[0548] 图17C.下胚轴的上面部分。

[0549] 图17D：幼叶和叶柄。

[0550] 图17E：叶边缘和叶柄。

[0551] 图17F和图17G：pGC1::YC3.60主要表达于成熟保卫细胞中，在年幼或未成熟保卫细胞中表达非常弱((f)&(g)中的白色箭头)。

[0552] 图17H和17I：pGC1::YC3.60表达于下胚轴上的保卫细胞中。

[0553] 图17J和17K：pGC1::YC3.60表达于萼片上的保卫细胞中。

[0554] 图17L和17M：pGC1介导GUS(L)和GFP(M)报告基因在too many mouths的成簇气孔中表达。

[0555] 图17N：pGC1介导报告基因在烟草保卫细胞中强表达。

[0556] 决定保卫细胞特异性和强度的区域的系列启动子缺失

[0557] 启动子区域可以包含增强子和阻抑物元件。为了探查出最初1716碱基对(bp)启动子(全长，FL，-1693bp/+23bp)的哪一部份是强的保卫细胞特异性报告基
因表达所需要的，产生了GC1(SEQ ID NO：10)启动子的四个5’截短形式的启动子，为D 1(-1140bp/+23bp)、D2(-861bp/+23bp)、D3(-443bp/+23bp) 和 D4(-224bp/+23bp)，见图18。这些截短的启动子与GUS报告基因融合，产生下列构建体:pGC1(D1)::GUS、pGC1(D2)::GUS、pGC1(D3)::GUS和pGC1(D4)::GUS。这些GUS报告基因构建体以及最初的pGC1(FL)::GUS构建体转化入哥伦比亚(Columbia)野生型植物。来自每一转化事件的T1幼苗(n＝50-100)汇集在一起并染色。与最初全长启动子相比，截短的pGC1(D1)在幼苗驱动相似地或者更强的GUS表达(图4A)，表明从-1693bp至-1140bp区的元件可能抑制启动子在保卫细胞中的活性。与pGC1(FL)相比，启动子pGC1(D2)和pGC1(D3)导致较弱的保卫细胞中的报告基因表达，表明从-1140bp至-443bp区的元件可能增强启动子在保卫细胞中的活性。最短的启动子pGC1(D4)驱动报告基因在除保卫细胞之外的组织，如根和种皮中表达，表明从-861bp至-224bp的区域是保卫细胞特异性活性所需要的。该区域包含8个(T/A)AAAG元件，已经证明该元件是KST1启动子在马铃薯中保卫细胞特异性活性所必需的[24]。截短的启动子pGC1(D1)表现出强的保卫细胞表达，表明其包含保证保卫细胞特异性和启动子强度的元件。因此，本发明提供保卫细胞特异性转录激活物(如启动子)，其包含从-861bp至-224bp的区域或者基本上由其组成；并且提供保卫细胞特异性的转录激活物(如启动子)，其包含从-1140bp至-443bp的区域或者基本上由其组成。

[0558] 总之，图18图解说明pGC1启动子的系列缺失以便定义用于保卫细胞表达的区域，其中图18A显示来自不同启动子::GUS转基因系的代表性T1植物的照片。与最初全长启动子(FL)(-1693/+23)相比，pGC1(D1)(-1140/+23)启动子介导更强的保卫细胞GUS表达。pGC1(D2)::GUS和pGC1(D3)::GUS介导的GUS表达弱于pGC1(FL)::GUS和pGC1(D1)::GUS。
最短的启动子pGC1(D4)(-224/+23)驱动报告基因在除保卫细胞之外的组织和细胞中表达。

[0559] 图18B图解说明pGC1启动子的系列(结构或序列)缺失以便定义用于保卫细胞表达的区域。黑色箭头代表TAAAG元件，较小的灰色箭头代表AAAAG元件。启动子线上面的箭头位于有义链上，而启动子线下面的箭头位于反义链上。在有义链上的中心TAAAG用星号标记出并且选择用于区段诱变分析。从-1693至-1140的区域包含用于保卫细胞表达的阻抑物元件，并且从-1140至-224的区域包含用于保卫细胞特异性的元件以及用于保卫细胞表达的增强子元件。

[0560] 完整植物保卫细胞中的钙成像

[0561] 植物细胞中的许多生理刺激诱导细胞内钙浓度的改变。钙在许多信号转导级联反+应中充当第二信使[33]。胞质中的钙浓度可以通过化学报告分子如参比Ca2-敏感荧光染料fura-2[34、35]、遗传编码钙敏感发光蛋白质水母发光蛋白[14]或荧光参比钙报告基因黄卡默莱昂[12、15、36]检测。气孔关闭信号如ABA和CO2已经显示诱导保卫细胞钙升高[16、18、19、37-42]。在无任何ABA处理的叶表皮样品中也已经观察到自发钙瞬变[15、
43、44]。尚不清楚自发钙瞬变是否存在于完整植物保卫细胞中，因为fura-2注射的蚕豆(Vicia faba)保卫细胞显示无此瞬变[45]。

[0562] 新一代的钙指示剂黄卡默莱昂，YC3.60，与黄卡默莱昂2.1相比，显示以几乎600％的YFP/CFP比率增强钙依赖性变化[31]。如上所述，通过GC1启动子(SEQ ID NO：
10)与YC3.60的组合，即pGC1::YC3.60，我们观察到在完整叶、下胚轴和萼片中强保卫细胞表达YC3.60，如图19中所示。

[0563] 简言之，图19显示在表达pGC1::YC3.60的保卫细胞中强迫的胞内钙瞬变和存在于完整pGC1::YC3.60转基因植物保卫细胞中的自发钙瞬变：

[0564] 图19A显示pGC1::YC3.60转基因植物叶表皮的荧光图像。注意，周围的表皮细胞没有荧光。

[0565] 图19B显示在图A中的全部响应强迫的钙振荡而引起细胞内钙瞬变的六个保卫细2+
胞。箭头标出从去极化缓冲液至含Ca 超极化缓冲液的转换点(见方法部分)。

[0566] 图19C显示来自用pGC1::YC3.60转化的完整Col植物的叶的伪彩色参比图像。橙2+ 2+
黄色指示较高的[Ca ]并且蓝色指示较低的[Ca ]。自发钙瞬变存在于完整拟南芥属植物的叶中。

[0567] 图19D显示C中箭头所标出的两个保卫细胞发射比率的时间进程(25分钟)，表明在完整的拟南芥属植物中存在自发钙瞬变。通过YFP发射强度除以CFP发射强度计算各个细胞的比率。

[0568] 我们通过如前所述施加钙振荡第一次测量了以pGC1::YC3.60转化的植物完整叶表皮中的钙瞬变[11、46]。可以在保卫细胞观察到相对于基线比率高达4倍参比变化的强烈钙瞬变，见图19B。观察到使用35S::YC2.1响应所施加的钙瞬变的参比变化为大约0.5[15、43、44、46]。这进一步证实了YC3.60的强烈参比信号对噪声效率。

[0569] 接着，我们通过将叶封片于显微镜盖玻片上开展完整拟南芥属幼苗中的钙成像。实验了两种不同的方法：第一种方法是仅将根浸没入水中，而茎干在空气中，第二种方法是将整个植物浸没入水中。在两种条件下检测自发钙瞬变，见下面表1。

[0570] 代表性钙瞬变/时间进程示于图19D。有趣地，来自同一气孔的两个保卫细胞内的自发钙瞬变经常不同步，见图19C、D。这些实验清楚地表明存在于完整植物保卫细胞中的自发钙瞬变不是离体表皮成像的假象，并且表明了本发明的pGC1(SEQ ID NO：10)启动子作为用于驱动转基因和报告基因在保卫细胞中表达的方法的潜能。

[0571] pGC1用于操纵基因特异性地在保卫细胞中表达的用途

[0572] 操纵基因特异性地在保卫细胞中表达，或者通过高表达野生型基因或显性突变体形式，或者降低其在保卫细胞中表达，将会十分有效地探测保卫细胞中的特异性基因功能。为了进一步探讨GC1(SEQ ID NO：10)启动子的应用，我们采用反义方法以分析保卫细胞中的基因表达降低。为此目的，在保卫细胞和表皮细胞中带有稳定GFP表达的35S::GFP转基因株系，见图20A、B，以pGC1(D1)::anti-GFP构建体(anti-GFP融合至截短的GC1启动子pGC1(D1))转化。以pGC1(D1)::anti-GFP转化的35S::GFP植物的40株T1植物中的34株显示在保卫细胞中GFP表达非常低，而在表皮细胞中的GFP表达水平未改变，如图20C、D所示。

[0573] 总之，图20显示pGC1(D1)::anti-GFP导致35S::GFP植物保卫细胞中GFP表达降低的显微照片：

[0574] 图20A显示35S::GFP转基因植物的叶表皮(带有GFP滤光片的亮视野)。箭头标记气孔。

[0575] 图20B显示在A中所示的同一叶表皮的荧光图像。气孔用更亮的(黄色)箭头标记。注意，保卫细胞和周围的表皮细胞具有荧光。

[0576] 图20C显示35S::GFP背景下表达pGC1(D1)::anti-GFP的T1转基因植物的叶表皮。所有气孔用较亮的(黄色)箭头标记。

[0577] 图20D显示在20C中所示的同一叶表皮的荧光图像。注意，8个气孔当中的7个(通过相对较暗的(蓝色)箭头标记)显示，与周围的表皮细胞相比GFP表达降低。一对保卫细胞(通过更亮的(黄色)箭头标记)仍然表现出中等的GFP表达。该气孔与其他7个气孔相比是相对未成熟的。

[0578] 这些观察证明了本发明pGC1(D1)序列(SEQ ID NO：10)具有显著的反义阻抑效率。有趣地，在未成熟保卫细胞中观察到较小的GFP表达抑制(见图20D中的较亮的(黄色)箭头，对相对较暗的(蓝色)箭头)。这与pGC1驱动报告基因在未成熟保卫细胞中表达更少的观察相一致，见例如上面讨论的图17G。该实验证明了，使用本发明序列的反义方法可用于降低所选择基因在保卫细胞中表达，而没有影响其在其他细胞类型中表达。

[0579] 讨论

[0580] 本发明第一次鉴定了强的拟南芥属保卫细胞启动子，pGC1(SEQ ID NO：10)。启动子::报告基因融合分析显示，pGC1(SEQ ID NO：10)在例如野生型拟南芥属植物和保卫细胞发育突变体too many mouths[32]和烟草植物中具有强的保卫细胞特异性报告基因表达。GC1(SEQ ID NO：10)启动子的系列缺失确定了用于保卫细胞表达的区域。通过GC1(SEQ ID NO：10)启动子和新一代钙报告分子YC3.60[31]的结合使完整植物保卫细胞中的钙成像成为可能。本发明的GC1(SEQ ID NO：10)启动子也有效地用于使用反义方法敲低在保卫细胞中的特异性基因表达。

[0581] GC1启动子和其他已知保卫细胞启动子之间的比较

[0582] 保卫细胞作为水蒸腾作用和CO2摄取的中心调节器已经作为一体模式系统开发以研究离子通道/转运蛋白活性、光、植物激素、第二信使、细胞骨架和膜运输在调节生理输出信号气孔孔径中的相互影响[2、4、5、47、48]。已经报道了几个保卫细胞启动子。KAT1(At5g46240)启动子驱动报告基因特异性地在保卫细胞中表达，虽然它有时诱导报告基因在其他细胞和组织如根和花序中表达[25]。基于启动子::GUS和启动子::GFP研究，AtMYB60(At1g08810)还显示在保卫细胞中特异性表达[49]。AtMYB61(At1g09540)还显示主要表达于保卫细胞中[50]。

[0583] 基于我们的保卫细胞特异性微阵列数据，我们评估了上面所讨论图15中的平均转录水平。在这些基因中，AtMYB61基因表达信号最低。以KAT1为例，其在保卫细胞中的表达远远高于其在叶肉细胞中的表达。但是，其原始信号比GC1低大约5至10倍。与其在叶肉细胞中的表达相比，AtMYB60还表现出高度的保卫细胞特异性表达。然而，AtMYB60的原始信号仅仅是本发明GC1启动子(SEQ ID NO：10)的大约三分之一。此外，基于TM
GENEVESTIGATOR 微阵列分析，AtMYB60也高度表达于种子中[27、29、51-54]。相似地，RAB18(At5g66400)除了在保卫细胞中强表达之外，还高度表达于种子中。pGC1驱动报告基因非常强地和特异性地在保卫细胞中表达(表达在非叶组织/器官中非常低)，虽然，在以pGC1::YC3.60转化的一些植物中的表皮细胞中观察到报告基因表达。总之，GC1启动子是所分析的那些启动子当中非常强的保卫细胞启动子。

[0584] 保卫细胞中的自发钙瞬变

[0585] 使用由GC1启动子驱动的遗传编码的钙报告基因YC3.60对完整的拟南芥属植物的研究表明，自发钙瞬变存在于完整拟南芥属植物的保卫细胞中。这与先前在拟南芥属保卫细胞中的自发钙瞬变[15、43、44]的观察一致。然而，导致自发钙瞬变的机制尚未深入表征。几方面的证据表明，保卫细胞膜的超极化和保卫细胞内的自发钙瞬变相关联。

[0586] 在同时测量膜电位和[Ca2+]cyt的实验中，超极化导致的ABA所诱导[Ca2+]cyt增加。保持保卫细胞更加超极化的状态在蚕豆保卫细胞中[38]、鸭跖草属(Commelina)亚种群保
2+
卫细胞中[39]和拟南芥属保卫细胞中[43]引起自发[Ca ]cyt振荡。使用pGC1::YC3.60的完整拟南芥属植物钙成像分析显示，自发钙瞬变也存在于植物中。

[0587] 这些自发Ca2+瞬变还可能是会聚在保卫细胞中的多重刺激，如光条件、CO2和水平衡的整合信号传导的结果。在蚕豆完整植物保卫细胞中没有观察到自发钙瞬变[45]。在该例子中，fura-2(大约100μM)注射入保卫细胞中。高浓度的fura-2会抑制自发钙升高，因为向拟南芥属保卫细胞加载fura-2的相似类似物BAPTA有效抑制这些钙瞬变[44]。

[0588] 相比之下，所估计的pGC1(SEQ ID NO：10)::YC3.60转基因植物保卫细胞中的黄卡默莱昂浓度为大约1μM(见本文所讨论的方法)。较低的黄卡默莱昂浓度将较少地干扰保卫细胞钙稳态并且将检测到更真实的钙浓度动力学。请注意，所注射的低浓度fura-2还允许分辨出保卫细胞中的反复性钙瞬变[38、39]。请注意，BAPTA衍生的荧光染料如fura-2和indo-1与卡默莱昂(cameleon)具有某些互补优点，因为它们可以加载到不容易转化的2+
细胞之内[55]并且这些染料可以迅速报告发生在神经元内的毫秒尺度的Ca 瞬变[56]，但是目前还没有在植物中使用fura-2或indo-1的报道。

[0589] 使用水母发光蛋白作为钙报告基因的几个组[57-59]已经证明了具有昼夜节律的全株叶水平的生理节奏钙振荡。该昼夜节律钙振荡最有可能源于细胞群体中基线胞质钙的同步变化[60]。由于昼夜节律钙振荡与胞内钙基线有关，各个保卫细胞内的快速自发钙瞬变可能从昼夜节律钙测量中滤过掉[60]。反复性钙瞬变可反映功能，包括胞外钙、细胞质钙和胞内钙储库之间的连续钙稳态。保卫细胞内的自发钙瞬变还与最近提出的对于信号转导中的钙特异性的钙传感器引发假设有关，其中提出气孔关闭信号ABA和CO2引发介导气孔关闭的(去失活)钙敏感步骤[44、61]。

[0590] (T/A)AAAG顺式元件和保卫细胞特异性表达

[0591] 基于区段诱变分析已经表明，Dof锌指转录因子的结合模体(T/A)AAAG对于KST1启动子在马铃薯中的保卫细胞特异性表达活性起着至关重要的作用[24]。然而，对于AtACT7(At5g09810)、KAT1(At5g46240)、RAB18(At5g66400)、AtMYB60(At1g08810)、AtMYB61(At1g09540)和GC1(At1g22690)的假定的启动子区域(ATG起始密码子之前的
1800bp)全部包含相似数量的Dof因子结合模体(T/A)AAAG元件，虽然它们中的一些不具有保卫细胞表达优先性。显示在保卫细胞中低表达的AtMYB61(图15)在其假定的启动子区域包含29个(T/A)AAAG元件，而AtACT7启动子包含23个(T/A)AAAG元件。启动子截短研究表明，在GC1(SEQI NO：10)启动子的从-861bp至-224bp的区域包含对于保卫细胞特异性启动子活性的元件；见上面所讨论的图18。该区域包含8个(T/A)AAAG元件。然而，在该区域内有义链上(在图18B中通过星号标记)中心TAAAG模体的区段诱变分析没有影响报告基因在保卫细胞中表达。因此，单独的(T/A)AAAG元件不能够解释为什么GC1和其他保卫细胞特异性基因表现出保卫细胞特异性表达。

[0592] 讨论

[0593] 保卫细胞所表达基因的微阵列(ATH1)分析用于分离和表征本发明的新的强保卫细胞启动子pGC1(SEQ ID NO：10)。我们分析了pGC1(SEQ ID NO：10)作为操作基因在保卫细胞中表达的工具的潜能。GC1(SEQ ID NO：10)启动子用于检测几个实验处理。GC1(SEQ ID NO：10)启动子用于在保卫细胞中表达钙报告基因YC3.60。这使得我们能够在完整拟南芥属植物保卫细胞中开展钙成像实验。

[0594] 对于T-DNA插入突变体，当使用35S启动子时，常常需要产生成百上千个转化体，而充其量得到在保卫细胞中表达报告基因的少数几个株系。相反，本发明GC1(SEQ ID NO：10)启动子的使用提供了显著增加报告基因基因表达成功率的方法。此外，使用GC1启动子的保卫细胞特异性反义GFP表达在35S::GFP转基因植物保卫细胞中有效地使GFP表达沉默。

[0595] 这些数据和高转化效率一起证明，本发明的启动子，包括本发明的GC1(SEQ ID NO：10)启动子提供了用于操纵保卫细胞信号转导组分表达以及用于表达不同第二信使报告基因的强大工具。因此，本发明的启动子，包括本发明的GC1(SEQ ID NO：10)启动子，提供了选择性增强在保卫细胞中表达、检测保卫细胞中响应不同处理的信号转导事件以及研究保卫细胞特异性转基因突变体中的全株响应的组合物和方法。

[0596] 材料和方法

[0597] 植物材料

[0598] 除非另外说明，拟南芥(哥伦比亚生态型)植物用于转化试验。产生35S::GFP转基因株系用于先前研究[62]。保卫细胞发育突变体too many mouths由温哥华大不列颠哥伦比亚大学(the University of British Columbia，Vancouver)的Fred Sack博士惠赠。

[0599] 基因芯片微阵列试验

[0600] 植物生长、ABA处理、保卫细胞原生质体分离和RNA提取如先前所述开展[26]。使用Affymetrix拟南芥属ATH1基因组阵列(Affymetrix，Santa Clara，CA)，其代表着大约24,000个基因。转录物在加利福尼亚大学圣地亚哥基因芯片核心设施(the University of California，San Diego Gene Chip Core facility)中扩增、标记和杂交。对于每一条件(ABA处理或无ABA处理，保卫细胞或叶肉细胞)，开展两个独立的杂交。在用于如所述的四个芯片杂交的RNA样品的原生质体分离过程中，加入转录抑制剂(33mg/L放线菌素TM
D和100mg/L蛹虫草菌素)[26]。ATH1微阵列数据保存于MIAMEXPRESS [63]，登录号为E-MEXP-1443。

[0601] 重组体质粒的构建

[0602] 为了通过PCR从Col基因组DNA扩增GC1(At1g22690)启动子，使用引物YZ27(5’-CATGCCATGGatttcttgagtagtgattttgaag-3’，刚好在ATG起始密码子之前带有NcoI位点)和YZ28(5’-ACGCGTCGACgagtaaagattcagtaacccg-3’，转录起始上游1693bp(图16)带有SalI位点)。PCR产物克隆入pGEM-Teasy载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)，产生pGEM-T-pGC1。

[0603] 为了将GC1启动子克隆入pBI101载体，将pGEM-T-pGC1用NcoI第一次切割。然后通过T4 DNA聚合酶补平粘性末端(New England BioLabs)以产生平末端。然后通过SalI消化释放pGC1片段。同时，目的载体pBI101通过SmaI和SalI连续切割。然后，将pGC1片段插入到pBI101载体中GUS报告基因的上游，产生pBI101-pGC1::GUS构建体(简写作pGC1::GUS)。

[0604] 为了产生5’-缺失的系列pGC1启动子，引物YZ27用于分别与引物YZ159(5’-GCGTCGACatggttgcaacagagaggatga-3’，转录起始上游1141bp，D1)，YZ160(5’-GCGTCGACctaatgaagggtgccgcttattg-3’，转录起始上游861bp，D2)，YZ161(5’-GCGTCGACcaatattgcgtctgcgtttcct-3’，转录起始上游466bp，D3)和YZ162(5’-GCGTCGACgaaccaatcaaaactgtttgcata-3’，转录起始上游224bp，D4)进行基因组PCR，以分别扩增pGC1(D1)、pGC1(D2)、pGC1(D3)和pGC1(D4)(图4)。然后将PCR片段克隆入pGEM-Teasy载体，并且然后亚克隆入pBI101载体，以产生pBI101-pGC1(D1)::GUS、pBI101-pGC1(D2)::GUS、pBI101-pGC1(D3)::GUS和pBI101-pGC1(D4)::GUS。

[0605] 为产生pBI101-pGC1::YC3.60构建体，首先通过EcoRI/BamHI双消化将YC3.60从pcDNA3-YC3.60中释放出来[31]。然后将BamHI-5’-YC3.60-3’-EcoRI片段克隆入pSK载体(通过EcoRI和BamHI消化制备)，以产生pSK-YC3.60构建体。然后将
pSK-YC3.60用 NotI 和NcoI 消化，从 pGEM-T-pGC1得到 NotI-5’-pGC1-3’-NcoI片段。该连接产生pSK-pGC1::YC3.60。pGC1::YC3.60片段通过SalI/SacI双消化释
放，同时pBI101载体用SalI/SacI消化以去除GUS报告基因。pBI101(SalI/SacI)与
SalI-5’-pGC1::YC3.60-3’-SacI连接产生pBI101-pGC1::YC3.60构建体。

[0606] 为产生带有用于植物中的潮霉素选择标记的pGreenII0179-pGC1(D1)::anti-GFP二元载体，用YZ439(5’-AAGAGATCTATCTAGAGTCCGCAA-3’，带有XbaI位点)和YZ440(5’-GCACGCTCGAGCTCgtcactggattttggttttagg-3’，带有SacI位点)从载体pAVA319扩增35S终止子[64]。随后，用XbaI和SacI消化PCR产物。5’-XbaI-35S终止子-SacI-3’连接入pGreenII0179-XabI…SacI，产生pGreenII 0179-终止子。pGC1(D1)通过NotI消化从pGEM-T-pGC1(D1)释放，然后补平，再用SalI切割产生5’-SalI-pGC1(D1)-NotI(补平的平末端)。同时，pGreenII 0179-终止子用SalI和EcoRV双消化。这两个片段连接产生pGreenII 0179-pGCP(D1)-终止子载体。反义GFP用引物YZ449(5’-ACATGCCATGGttacttgtacagctcgtccatgcc-3’，GFP的相反端带有NcoI)和YZ513(5’-ctagTCTAGAatggtgagcaagggcgagg-3’，GFP起始带有XbaI)扩增。PCR片段用NcoI和XbaI双消化。pGreenII0179-pGC1(D1)-终止子也用NcoI和XbaI双消化。pGeenII 0179-pGC1(D1)-终止子片段与5’-NcoI-anti-GFP-XbaI-3’连接产生pGeenII 0179-pGC1(D1)::anti-GFP二元构建体。

[0607] 使用来自Stratagene(La Jolla，California)的QUICKCHANGETM位点定向诱变试剂盒，通过区段诱变分析将有义链上的中心TAAAG模体(-579--＞-575)变成CGGGA。

[0608] 拟南芥属转化和选择

[0609] 通过电穿孔将二元构建体 pBI101-pGC1::YC3.60、pBI101-pGC1::GUS、pBI101-pGC1(D1)::GUS、pBI101-pGC1(D2)::GUS、pBI101-pGC1(D3)::GUS 和pBI101-pGC1(D4)::GUS转化入根癌农杆菌GV3101株中。在LB平板上用卡那霉素(对于构建体的选择标记)和庆大霉素(对于农杆菌的选择标记)选择转化体。依照如Clough和Bent[65]所述的浸入法，将带有各个构建体的农杆菌GV3101转化入拟南芥属植物中。在含
50μg/ml卡那霉素的1/2MS平板上选择T0种子。

[0610] 至于pGreenII 0179-pGC1(D1)::anti-GFP，带有辅助质粒pSOUP的GV3101用作宿主株，并且在含卡那霉素、庆大霉素和四环素的LB平板上选择农杆菌转化体。这用于转化35S::GFP转基因植物(卡那霉素抗性)。在含25μg/ml潮霉素(Roche)的1/2MS平板上
选择T0种子。

[0611] GUS染色

[0612] 幼苗按照先前所述的方法[62]染色。

[0613] 落射荧光图像采集

[0614] pBI101-pGC1::YC3.60的转基因拟南芥属幼苗或萼片简单地置于显微镜载玻片和盖玻片之间。NIKONTM数码照相机与显微镜相连。明亮图像的曝光时间是5秒，对于荧光TM图像(激发波长是440nm)的曝光时间是15-25秒。对于35S::GFP植物和用pGREENII
0179-pGC1(D1)::anti-GFP转化的35S::GFP植物，完整的叶表皮用于落射荧光图像采集。

[0615] 烟草植物转化

[0616] 在含15g/l蔗糖的1/2MS琼脂培养基上维持烟草SR1栽培变种(Nicotianatabacum cv.SR1)的无菌体外茎培养。在高压灭菌前将pH调整至5.5。烟草培养物在25℃、-2 -1
16/8h的光/暗周期(光强度大约70μmol m s )下生长。带有pBI101-pGC1-YC3.60的烟草SR1的稳定转化如前所述开展[66]。转基因再生的烟草苗通过卡那霉素(100μg/ml)抗性选择，然后转移至补充有卡那霉素(100μg/ml)和头孢噻肟(200μg/ml)的含15g/l蔗糖的1/2MS琼脂培养基上。然后，分析能够在卡那霉素存在下建立起根器官发生的T1再生植物的卡默莱昂表达。

[0617] 转基因烟草共焦分析

[0618] pBI101-pGC1-YC3.60转化的烟草叶用Leica TCS SP2TM激光共焦显微镜(Leica Microsystems)观察。对于卡默莱昂检测，激发波长为514nm，发射波长为525和540nm之TM间。从共焦显微镜采集的图像使用IMAGE J [67]处理。

[0619] 钙成像和强迫的Ca2+瞬变

[0620] 在该工作中的所有钙成像使用带有TE-FMTM落射荧光附加器的TE300TM倒置显微镜(Nikon Inc.Melville，NY)开展。使用4x和8x中性密度滤光片(3％透射)从75W氙灯(Osram，Germany)的激发通常衰减97％，以降低在时间解析图像过程中报告分子的漂白。波长特异性使用卡默莱昂滤光片设置(440/20激发，485/40发射1，535/30发射2，TM TM
455DCLP 二色性；滤光器设置71007a Chroma Technology，Rockingham，VT)得到。滤光TM
片轮、快门和来自Photomerics(Roper Scientific，Germany)的COOLSNAP CCD照相机用TM
METAFLUOR 软件(MDS，Inc.，Toronto，Canada)控制。

[0621] 如Mori等，(2006)[11]中所述制备用于显微术的pGC1::YC3.60转基因植物的完整叶表皮。在显微镜上，完整表皮用去极化缓冲液(10mM MES-Tris缓冲液，pH 6.1，含25mM2+
亚氨基二乙酸二钾和100μM BAPTA)灌流10分钟以得到背景。随后，含Ca 的超极化缓冲液(10mM MES-Tris缓冲液，pH 6.1，1mM亚氨基二乙酸二钾，和1mM CaCl2)以2分钟的间隔应用，接着应用去极化缓冲液5分钟。

[0622] 完整植物保卫细胞中的钙成像

[0623] 在该研究中使用完整叶和完整植物。医用粘合剂(Hollister Inc.，Libertyville，IL)用于将叶粘附在盖玻片上。使用漆刷轻轻地将叶压在盖玻片上。至于完整植物，两种不同的方法如下。第一种方法是仅将根浸没入水中，而茎干留在空气中。第二种方法是完全将整个幼苗浸没入水中。有时，仅将根而非茎干浸没导致粘附在盖玻片上的叶在小于10分钟内萎蔫，随后气孔关闭。因此，大多数的完整植物成像实验通过将茎干(叶)和根均浸没入水中开展。将整个植物浸没防止了叶脱水，并且超过50分钟未观察到气孔关闭。成像方法与Mori等，2006[11]中描述的相同。

[0624] 保卫细胞黄卡默莱昂浓度的估计

[0625] 在大肠杆菌(E coli.)中表达并分离重组黄卡默莱昂蛋白质。以确定的浓度将重组卡默莱昂蛋白质加至玻璃盖玻片上，用于荧光成像。然后，使用两个额外盖玻片产生卡默莱昂溶液厚度的斜面梯度。这使得可以分析气孔保卫细胞厚度范围内的不同溶液厚度。分析不同浓度下的稀释黄卡默莱昂蛋白质溶液并且对于每一浓度在不同厚度下测量荧光强度。对于不同厚度下的蛋白质浓度和荧光强度产生校正曲线。这用于估计pGC1::YC3.6转基因植物保卫细胞中的黄卡默莱昂蛋白质浓度。

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[0694] 表I.完整pGC1::YC3.60转基因拟南芥属植物保卫细胞中的钙成像总结

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[0696] 在实验I中，仅根浸没在水中。在实验II、III和IV中，叶和根浸没在水中。

[0697] 实施例4：控制植物CO2摄取和水利用率的CO2受体的表征

[0698] 本发明提供用于下调或降低植物保卫细胞、植物细胞、植物叶、植物器官或植物部分中二氧化碳(CO2)和/或水交换的组合物和方法，尤其包括使用具有碳酸酐酶(碳酸脱水酶)活性或β-碳酸酐酶活性的多肽，或编码碳酸酐酶多肽的核酸；和，在保卫细胞中表达或过表达表达CO2Sen(CO2传感器)蛋白质的核酸和/或CO2Sen基因或转录物(信使)和/或碳酸酐酶或β-碳酸酐酶。本发明提供用于上调或提高植物保卫细胞、植物细胞、植物叶、植物器官或植物部分中二氧化碳(CO2)和/或水交换的组合物和方法，尤其包括使用编码植物碳酸酐酶(碳酸脱水酶)或植物β-碳酸酐酶的核酸的反义或抑制核酸；和在保卫细胞中表达反义或抑制性核酸。

[0699] 本发明提供用于体内控制保卫细胞的组合物和方法，包括它们在植物表皮中形成可调节气孔的能力；因此，本发明提供用于控制用于光合作用的CO2流入量和从植物向环境的蒸腾水损失的组合物和方法。

[0700] 本发明提供用于控制黑暗阶段过程中叶CO2浓度的日增加以及导致气孔的气体交换孔关闭的大气[CO2]持续增加的组合物和方法；并且因此，本发明可影响植物的碳固定和水利用率。本发明提供用于控制信号转导机制的组合物和方法，所述信号转导机制控制CO2所诱导气孔运动，包括控制该响应的CO2传感器。

[0701] 使用保卫细胞和叶叶肉细胞特异性微阵列，我们鉴定出强表达的β-碳酸酐酶基因，例如在本文中称作CA1和CA4，在该申请中也称作SEQ ID NO：3(由例如SEQ ID NO：1编码，或“CA4”或“CORP2”)，或SEQ ID NO：9(由例如SEQ ID NO：7编码，或“CA1”或“CORP1”)；并且也包括SEQ ID NO：6(由例如SEQ ID NO：4编码，或“CA6”)。

[0702] 本发明证明，双敲除突变体植物(对于本发明CA1和CA4的核酸)表现出植物气体交换和气孔运动的CO2调节的极大减少。ca1ca4双突变体植物表现出对其他生理刺激，包括蓝光、光-黑暗转换和植物激素脱落酸的功能性响应。向野生型叶表皮短期加入碳酸酐酶酶(CA)抑制剂模拟ca1 ca4的CO2不敏感性，这与本发明证明的碳酸酐酶在CO2信号传导中的作用相一致。

[0703] 本发明的任一CA基因的保卫细胞靶向表达互补了ca1ca4突变体植物中的CO2感知和信号传导，这证明该CO2响应源于保卫细胞。完整的突变体叶的光合作用分析显示，ca1ca4突变不影响叶绿素荧光或CO2同化率。此外，氟草敏漂白的野生型叶表现出完整的CO2所诱导的气孔运动，这共同证明，控制气体交换的CA介导的信号传导途径在第一次序中不与光合作用联系。

[0704] 对ht1激酶突变体的上位性分析(例如见Hashimoto等，2006)进一步提供了遗传学证据证明CA1和CA4在保卫细胞中CO2信号转导途径的上游起作用。

[0705] 靶向保卫细胞中过表达CA1或CA4极大增强拟南芥属植物的水利用率，这与这些CA在CO2调节植物气体交换中的重要作用相一致。综合这些发现第一次证明了，这些保卫细胞表达的碳酸酐酶，包括本发明的多肽在植物CO2流入量和水利用率的CO2调节中的基本功能，并且还证明了CA1和CA4在CO2信号传导的CO2感觉机构中起作用。

[0706] 本发明组合物和方法可用于改善预计影响全球水平自然和农业生态系统的大气[CO2]持续增加。

[0707] 结果：

[0708] 本发明提供用于过表达和欠表达β-碳酸酐酶基因，例如在本文中称作CA1和CA4的本发明基因，在本申请中也称作SEQ ID NO：3(由例如SEQ ID NO：1编码，或“CA4”或“CORP2”，或At1g70410)，或SEQ ID NO：9(由例如SEQ ID NO：7编码，或“CA1”或“CORP1”，或At3g01500)；还包括SEQ ID NO：6(由例如SEQ ID NO：4编码，或“CA6”或At1g58180)的组合物和方法。

[0709] 根据细胞特异性微阵列分析，在催化CO2可逆水合的不同碳酸酐酶(CA)类别当中，β类的CA成员CA1(At3g01500)、CA4(At1g70410)和CA6(At1g58180)表现出在保卫细胞中高水平表达，见图22，如例如Leonhardt等，2004；Yang等，2008所描述。图22图解说明拟南芥属碳酸酐酶(CA)系统发育树，见例如Fabre等，2007，括号中是相应的保卫细胞特异性微阵列表达数据；左边是来自Leonhardt等，2004的8K微阵列数据；右边是来自Yang等，2008的23K微阵列数据。如图22中所记录，在CA当中，CA1、CA4和CA6(粗体显示)显示在保卫细胞中的表达值最高。

[0710] 图9图解说明保卫细胞所表达碳酸酐酶CA1和CA4的破坏损害了CO2所诱导的气孔运动。例如，通过RT-PCR连同高保卫细胞特异性KAT1(At5g46240)和叶肉特异性CBP(At4g33050)标记基因(Mori等，2006)证实，保卫细胞表达CA1、CA4和CA6，如图9A中所示。

[0711] RT-PCR用于证实，保卫细胞和叶肉细胞中的CA1和CA4表达与高保卫细胞特异性标记基因KAT1(At5g46240)和叶肉细胞标记基因CBP(At4g33050)相当，；见例如Nakamura等，1995；Mori等，2006。图9B和9C图解说明ca1ca4双突变体叶的RT-PCR分析，数据显示缺乏CA1和CA4转录物。

[0712] 图9C、图9D、图9E和图23图解说明WT、ca1ca4或ca1ca4ca6突变体植物(d，e，n＝7；n＝5)中对CO2、蓝光和光-黑暗转换的气孔导度响应。ca1ca4双突变体叶显示对高CO2所诱导关闭的强烈不敏感性(图9C、图9C、图9C)，并且与在环境(365-400ppm)[CO2]下提高的气孔导度(图9C、图9E)的表型一致；而ca突变体植物显示出对蓝光和光-黑暗转换的强烈气孔响应(图23)。d中的数值经过对365-800ppm CO2转换之前的最后数据点进行标准化。

[0713] 图10A图解说明ca1ca4双突变体叶中的气孔响应脱落酸而关闭；n＝3次试验，30气孔/实验和条件。误差棒表示平均值±s.e.m。图10B图解说明在ca1ca4双突变体
叶和用碳酸酐酶抑制剂6-乙氧基-2-苯并噻唑次磺酰胺(EZA)处理的野生型叶表皮中CO2所诱导的气孔运动受损(n＝6，30气孔/样品)；见例如Becker等，2007。

[0714] 通过拟南芥属信息资源(TAIR)中心得到三个CA基因的每一个基因的单序列索引的T-DNA(转移DNA)插入突变体，并且称作ca1(SALK_106570)、ca4(WiscDsLox508D11)和ca6(SALK_044658)。由于原始数据表明所有的单突变体保留了正常的CO2敏感性，随后产生ca1ca4、ca4ca6、ca1ca6双突变体以及ca1ca4ca6三突变体用于评估CO2敏感性。在ca1ca4双突变体叶中未检测到CA1和CA4表达，如图9B中所示，并且还证实了在ca1ca4ca6中还额外缺乏CA6转录物，如图24A中所示。图24A图解显示ca4ca6双突变体表现出完整的CO2响应，而ca1ca4和ca1ca4ca6显示相同的CO2感知损伤。图24B、图24C、图24D和图-2 -124E图解显示以mol水m sec 为单位的气孔导度。

[0715] 响应[CO2]变化的气孔导度分析显示ca1ca4双突变体(如图9C、图9D、图9E中所示)和ca1ca4ca6三突变体(如图24B、图24C、图24D和图24E中所示)具有强的CO2不敏感性，而ca1ca6和ca4ca6植物的行为像野生型。

[0716] 图9C图解说明ca突变体植物显示在环境下[CO2](365-400ppm)具有较高的气孔导度。与如图9C、图9D、图9E和图24D、图24E和图24F中所示的CO2响应损伤相比，ca1ca4ca6植物显示出蓝光和光-黑暗转换强烈的诱导响应，尽管ca突变体植物具有较高的起始气孔导度，如图23中所示。

[0717] 为了确定完整叶中的受损的CO2响应(见图9C、图9D、图9E)是否与气孔运动相联系，分析了叶表皮中的CO2响应。与野生型相比，ca1ca4中CO2所诱导的气孔运动受损，如图10B中所示。此外，当野生型叶表皮用膜透过性CA抑制剂EZA处理30分钟(见例如Becker等，2007)，CO2所诱导的气孔打开和关闭被抑制，这与碳酸酐酶在CO2传感中起作用、而不是CA基因破坏对快速CO2响应的长期发育影响相一致，如图10B中所示。相反，在ca1ca4叶表皮中，脱落酸(ABA)诱导的气孔关闭是完全功能性的，如图10A中所示。

[0718] 当仅包含野生型CA1或CA4基因和侧翼序列的基因组构建体(大约4.5Kb)导入到ca1ca4突变体中时，在几个独立的转基因株系的叶中恢复了CA1或CA4表达，如图11A和图11B中所示。与ca1ca4相反，所有转基因株系对[CO2]变化表现出野生型样响应，如图11C和图11D和图25中所示。因此，这些数据证明CA1和CA4的破坏的确关系到在ca1ca4植物中所观察到的表型，并且证明任一基因的表达对于互补而言是足够的。

[0719] 总之，图11图解说明，导入CA1或CA4的野生型基因组拷贝互补了ca1ca4CO2不敏感表型。图11A和图11B：图解说明证实转化有基因组CA1(图11A)或CA4(图11B)构建体的ca1ca4双突变体叶中CA1(图11A)和CA4(图11B)表达恢复的RT-PCR分析数据(29个循环)。对于每一基因组构建体分析了三个独立的转基因株系。肌动蛋白(At2g37620)用作对照。与ca1ca4相反，在图11C和图11D中，两个CA1#1(图11C)和CA4#1(图11D)互
补株系表现出[CO2]调节的气孔导度改变的恢复(对于ca1ca4，n＝8个叶，对于WT，n＝
10并且对于任一互补株系，n＝4)。误差棒表示平均值±s.e.m。对于来自其他独立转基因株系的数据还可见图25。

[0720] 总之，图25图解证明转化有野生型CA1或CA4的几个独立的ca1ca4转基因株系表现出[CO2]变化诱导的响应恢复。互补有CA1(CA1#2(图25A)和CA1#3(图25B))或
CA4(CA4#2(图25C)和CA4#3(图25D))的两个额外的互补株系响应[CO2]变化表现出正常的气孔导度增加和降低。对于每一互补株系，n＝4个叶。此处所显示的野生型(n＝10)和ca1ca4(n＝8)与上面所讨论的图11中所述的野生型和ca1ca4一样。误差棒表示平均值±s.em。

[0721] 为了确定CA1和CA4的亚细胞定位，融合至CA1或CA4的C末端的黄色荧光蛋白质(YFP)在烟草原生质体中瞬时表达，如图26中所示；图26图解说明在烟草原生质体中具有CA1-YFP和CA4-YFP不同定位模式的细胞的荧光图像(共焦图像)。如图26中所记录，编码YFP、FLS2-YFP、CA1-YFP和CA4-YFP的质粒在烟草原生质体中瞬时表达；滤光片在图的顶部标明，而融合体在图左侧标明；图26最右侧的图片显示YFP和叶绿素图像的叠加图像。与质膜定位的FLS2-YFP融合体相似，该数据证明CA4-YFP定位在细胞周围，而CA1-YFP荧光与叶绿体出现共定位。

[0722] CA4-YFP的共焦图像显示与亮氨酸丰富重复跨膜受体激酶FLS2-YFP(FLAGELLIN SENSITIVE2)(见例如Robatzek等，2006)融合模式相同的细胞周围表达模式，如图26中所示。相反，来自CA1-YFP融合体的荧光似乎围绕着叶绿素自发荧光，表明CA1可以定位在叶绿体，如图26中所示。CA1-YFP和CA4-YFP融合体的这种差异表达模式与另一CA定位研究一致(见例如Fabre等，2007)。

[0723] 由于CA4表现出定位在叶绿体，然后我们通过比较野生型和ca1ca4ca6突变体(其中三个主要的保卫细胞所表达CA基因(见图22)被敲除)的叶绿素荧光，评估CA在CO2感知中的作用是否依赖于光合作用。暗适应叶中的光系统II的最大效率(Fv/Fm)没有-2 -1 -2 -1
被CA错表达影响，如图12A中所示。同样，在低(50μmol m s )或高(2000μmol m s )光合有效辐射下预适应的野生型和ca1ca4ca6叶的光系统II量子产额(PSII，ΦPSII)之间没有检测到不同，如图12B和图12C中所示。如果CA在CO2感知中的作用是通过光合活性介导的，在从黑暗向具有光合成活性红光的光照转换处的光合作用起始应该被影响。对-2 -1
ca1ca4ca6和野生型中CO2同化率的分析显示，当于300μmol m s 红光辐照时，两个基因型均在相同时限达到它们的稳态光合活性，如图12D中所示。

[0724] 为了进一步分析对于CO2调节的气孔运动是否需要完整光合作用，开展了另一方法。通过向3至4周龄野生型拟南芥植物灌溉类胡萝卜素生物合成抑制剂氟草敏(Nf)，得到缺乏功能性叶绿体的白化的叶绿素缺陷野生型叶，在新出现的叶中阻断光合活性，如图13A中所示(见例如Roelfsema等，2006)。通过用共焦显微镜进行叶绿素荧光显影(如图
13B中所示)和定量(如图13C中所示)证实了Nf处理的植物中缺乏功能性叶绿体。如图
13D中所示，在完整叶中，对高和低[CO2]的气孔CO2响应没有因功能性叶绿体缺乏而受影响(白化0ppm.[CO2]与白化800ppm.[CO2]相当，P＝8.9E-21，n＝6)。因此，我们的数据证明，在显示CO2感知受损的ca突变体植物中光合活性没有被破坏，并且在拟南芥属中光合活性对于功能性气孔CO2响应是不需要的(如图12和13中所示)，如先前在蚕豆中所报道(见例如Roelfsema等，2006)。然而，请注意，本发明不被任何特定作用机制所限制，这些发现没有排除另外的CA依赖性机制，通过该机制可以把光合作用与气孔运动联系起来(见例如Messinger等，2006)。

[0725] 总之，在图12和13中：光合作用相关的活性没有与CA介导的CO2所诱导的气孔响应直接联系起来。图12A、图1B和图12C图解说明叶绿素荧光分析，显示对于在暗适应-2 -1叶中(n＝10)光系统II(PSII)最大效率Fv/Fm(图12A)或者对于在50μmol m s (图
-2 -1
12B)或2000μmol m s (图12C)光合有效辐射下预适应的叶(n＝6)中PSII-ΦPSII量子产额，在WT和ca1ca4ca6突变体植物之间没有差异。图12D图解说明在ca1ca4ca6中完整叶的红光所诱导的光合活性未受损(n＝6)。

[0726] 图13A图解说明通过应用类胡萝卜素生物合成抑制剂氟草敏产生的缺乏功能性叶绿体的叶绿素缺乏白化野生型叶的图像。与野生型相比，白化的保卫细胞中叶绿素的缺乏通过共焦显微镜显像(图13B图解说明数据)并通过叶绿素荧光强度图像分析定量(图13C图解说明数据)(n＝3，12气孔/样品)。图13D图解显示，白化植物叶和对照植物叶(n＝7，50气孔/样品)中CO2所诱导的气孔运动。误差棒表示平均值±s.e.m。

[0727] CA1和CA4表达于保卫细胞和叶肉细胞中(见图9A)，并且敲除突变体植物显示受损的CO2响应。我们接着分析了靶向保卫细胞的CA1或CA4表达是否足以互补ca1ca4突变体的CO2响应表型。

[0728] 由如上面实施例3中所述的本发明强保卫细胞启动子驱动的CA1或CA4的cDNA转化入ca1ca4双突变体植物中，并且通过RT-PCR，使用保卫细胞特异性标记基因KAT1(见例如Nakamira等，1998)和叶肉细胞标记基因CBP(见，例如Mori等，2006)，在几个独立的转基因株系证实了它们的保卫细胞优先表达，如图27A和图27B中所示。优先在保卫细胞中表达CA1或CA4的转基因ca1ca4植物显示出响应[CO2]变化的更强的气孔导度变化，如图27C、图27D和图28中所示；总共分析了四个独立的转基因株系。这些结果证明，使本发明的CO2传感器基因在保卫细胞中表达，包括CA1或CA4表达，足以互补ca1ca4双突变体的受损的CO2响应，并且证明这些碳酸酐酶(CA)主要在保卫细胞中的CO2感知中起作用。因此，这些结果证明，使本发明的CO2传感器基因在保卫细胞中表达，包括CA1或CA4表达可以操纵植物CO2响应。

[0729] 迄今为止鉴定的最早的保卫细胞中CO2信号转导成分是HT1激酶，它是该途径的负调节物(见例如Hashimoto等，2006)。强的ht1-2等位基因表现出组成型高[CO2]响应。为了研究碳酸酐酶(CA)是否在HT1的上游或下游起作用，产生ca1ca4ht1-2三突变体，并且分析了其响应[CO2]变化的气孔导度。如图27E所清楚显示并且与ca1ca4双突变体或野生型清楚对比，ca1ca4ht1-2植物表现出与单一ht1-2突变体无差别的表型。这些数据提供了遗传学证据证明CA1和CA4在迄今已知的最早的CO2信号转导成分上游起作用，这与这些碳酸酐酶(CA)的CO2传感器功能相一致。

[0730] 总之，图27A至G和图14C图解显示，CA1或CA4 cDNA的保卫细胞优先表达恢复了ca1ca4中的CO2感知，并且CA过表达植物表现出改善的水利用率。图27A和图27B图解说明CA1或CA4的互补植物的保卫细胞原生质体和叶肉细胞中CA1和CA4表达的RT-PCR分析，其中CA1和CA4的表达由本发明的保卫细胞靶向性启动子pGC1驱动(见上面实施例3)。GC，保卫细胞；MC，叶肉细胞。CA1gc #n，带有由保卫细胞启动子驱动的CA1 cDNA的互补株系n。KAT1，At5g46240，保卫细胞标记基因(Nakamura等，1998)；CBP，At4g33050，叶肉细胞标记基因(Mori等，2006)。

[0731] 图27C和图27D图解说明保卫细胞靶向性株系ca1ca4双突变体和野生型(WT)植物响应所标明的[CO2]变化的CO2所诱导的气孔导度改变(单位为ppm，n＝4，±s.em.)。CA1或CA4在保卫细胞中表达足以恢复CO2响应。图27E图解说明ca1ca4(n＝4)、野生型(n＝4)、ht1-2(n＝7)和ca1ca4ht1-2三突变体(n＝7)叶响应所标明的[CO2]变化的气孔导度(单位为ppm，±s.em.)。图27F和图27G图解说明CA过表达株系和野生型(WT)植物响应所标明的[CO2]变化的气孔导度(单位为ppm，n＝4，±s.e.m.)。

[0732] 图14C图解说明CA1和CA4过表达植物显示出改善的水利用率(WUE，μmol CO2 -1mmol H2O )(n＝5，±s.e.m.)。图14D图示在标准条件下生长的野生型、ca1ca4和CA过表达株系的照片。

[0733] 总之，图28A至F图解说明在ca1ca4中保卫细胞CA1或CA4的特异性互补恢复气孔CO2响应。分析了互补有CA1或CA4保卫细胞靶向性表达的额外株系的CO2响应数据，如图28A和图28B中所示(n＝4)，和保卫细胞靶向性的4个独立互补株系的相对气孔导度CO2响应(两个在图27C和图27D中；两个在图28A和图28B中)。图28C至F图解说明相对气孔导度值对于365-800ppm CO2转换之前的最后数据点进行标准化。误差棒表示平均值±s.e.m。

[0734] 我们还分析了在野生型植物保卫细胞中过表达CA1或CA4是否可以成为一个增强植物对大气[CO2]变化响应的良好策略。在本发明强保卫细胞启动子控制下过表达CA1或CA4的转基因植物(如上面实施例3所述)在野生型背景下产生并通过RT-PCR证实，如图14A和图14B中所示。4个独立的CA1-和CA4-过表达株系在所有测试CO2浓度下表现出降低的气孔导度，这与提高的CO2响应相一致，如图27F和图27G中所示。有趣地，在ca1ca4双突变体、CA过表达和野生型植物当中始终观察到水利用率(WUE)的显著差异。在野生型中过表达CA1或CA4任一基因在环境[CO2]下基本上提高水利用率50％，如图14C中所示，其中p＜0.01。在强迫的标准条件下，在野生型和CA过表达植物当中没有观察到其他表型生长差异，如图14D中照片所示。这些数据证明，保卫细胞靶向性过表达碳酸酐酶(CA)，包括本发明的CA基因，提供了改善植物水利用率的高效且有力的方法。这些数据证明，本发明的组合物和方法可用于解决和改善大气CO2浓度的增加。

[0735] 总之，图29图解显示，在野生型保卫细胞中过表达CA1或CA4任一基因降低总体气孔导度并稍微提高气孔CO2响应强度。图29C和图29D图解说明由优选的保卫细胞启动子pGC1驱动的过表达株系叶中CA1或CA4的RT-PCR分析。测量了过表达CA1基因的另外株系(如图29A中所示)和过表达CA4基因的另外株系(如图29B中所示)的气孔导度、如图29C、图29D、图29E和图29F中所示的相对气孔导度值对365-800ppm CO2转换前的最后数据点进行标准化。误差棒表示平均值±s.e.m。图29A、图29C、图29D和图29E，n＝
4；图29B、图29F，n＝3。

[0736] 所引用的参考文献

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[0763] 实施例5：控制植物CO2摄取和水利用率的示例性PEPC和Rubisco酶

[0764] 本发明提供用于通过操纵CO2结合蛋白“磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧化酶”(或PEP羧化酶或PEPC)和/或核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶或“Rubisco”酶表达，来调节植物或植物部分，例如叶中二氧化碳(CO2)交换和CO2利用和摄取的组合物和方法；因此，本发明还提供用于操纵植物或植物部分，例如植物器官、叶等中CO2信号转导和气体交换调节的组合物和方法。例如，在一个方面，本发明提供用于工程改造成增加数量PEPC(为了促进气孔打开)和/或工程改造“Rubisco”酶数量的组合物和方法。

[0765] 在本发明的备选方面中，PEPC和Rubisco核酸表达于植物细胞中，例如植物保卫细胞和叶肉细胞中；并且在一个方面，它们以高水平(高于野生型水平)表达；或者，PEPC和Rubisco核酸在植物细胞，例如植物保卫细胞和叶肉细胞中的表达被抑制、降低或者阻抑；并且在一个方面，它们以较低水平(低于野生型水平)表达。在这些备选实施方案中工程改造的植物细胞包括本发明的分离的、培养的或转基因的植物和植物细胞。

[0766] 下列示例性PEPC和Rubisco核酸及其亚序列，包括有义编码序列和反义序列(诸如siRNA、miRNA等等)可以用于实施本发明的组合物和方法：

[0767]

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[0769]

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[0771]

[0772]

[0773]

[0774]

[0775]

[0776] 实施例6：控制植物CO2摄取和水利用率的示例性碳酸酐酶

[0777] 本发明提供用于下调或降低植物保卫细胞、植物细胞、植物叶、植物器官或植物部分中二氧化碳(CO2)和/或水交换的组合物和方法，尤其包括使用具有碳酸酐酶活性的多肽。来自任何碳酸酐酶基因，例如包括植物和细菌基因的编码碳酸酐酶的核酸可用于实施本发明；例如，可以使用来自任何植物的任何碳酸酐酶基因的核酸，包括来自拟南芥属任何基因家族的编码碳酸酐酶的核酸序列，例如来自拟南芥属家族，例如来自拟南芥的任何编码碳酸酐酶的核酸序列可用于实施本发明的组合物和方法，诸如示例性的编码碳酸酐酶的核酸序列：

[0778]

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[0788]

[0789]

[0790]

[0791] 已经描述了本发明的许多方面。然而，应当理解，在不脱离本发明精神和范围的情况下可以进行各种修改。因此，其他方面处于下列权利要求书的范围之内。

标题	发布/更新时间	阅读量
一种防治犬细小病毒的复方水剂及其制备方法-专利编号CN104667236A	2020-05-15	381
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植物CO2传感器、编码它们的核酸以及制造和使用它们的方法

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