本发明涉及植物中的抗病性。

葡萄树扇叶(fanleaf)病毒(GFLV)是葡萄线虫传多面体病毒， 它通过宝剑线虫，xiphinema index从植物传染到植物。GFLV是葡萄 树扇叶疾病的主要因素，在世界广泛存在。该疾病因其GFLV感染的叶 的扇叶形外表而命名。它是葡萄树最具破坏性和普遍的疾病之一。GFLV 感染的症状包括变态的枝条形态和叶片的脱色，生成扇样的外表 (Agrios，植物病理学，第三版，学院出版社，1988，pp．687-688)。 另外，感染的葡萄结果量低，葡萄树产生具有变态的果实成形和果实催 熟的矮小枝条。最终，感染的葡萄树退化死亡。

一般认为，GFLV的大范围扩散是使用感染的栽培材料的结果。尽 管天然的宿主范围限于葡萄，GFLV也可通过树液摩擦接种传染到大范 围的草本种。Chenopodium quinoa是有效的病毒诊断种。一般GFLV 分离株为抗原一致的且通过ELISA的诊断是标准程序。

目前控制葡萄树扇叶病和其它线虫传多面体病毒在葡萄园引发的 疾病的策略包括线虫控制(例，土壤熏蒸和运用其它杀虫剂)，培育 对线虫取食有抗性的根状茎，培育对GFLV抗性的葡萄树，和栽培经鉴 定无病的葡萄树。

发明概述

一般来说，本发明的特征在于生产和选择具有增强的对扇叶病抗 性的转基因葡萄树或葡萄树部分的一种方法。该方法一般包括以下步 骤(a)用能在植物细胞中表达的葡萄线虫传多面体病毒外壳蛋白核 酸分子或其片段(例如，与SEQ．ID．NO：1具有约50％或更多序列同一 性的葡萄线虫传多面体病毒外壳蛋白核酸分子或其片段)转化葡萄植 物细胞；(b)从该植物细胞再生转基因葡萄树或葡萄树部分；和(c) 选择低水平表达核酸分子或其片段的转基因葡萄树或葡萄树部分，其 中低水平表达与高水平表达核酸分子的植物相比，增强了转基因葡萄树 或葡萄树部分对扇叶病的抗性。葡萄线虫传多面体病毒的mRNA和在转 基因植物表达的外壳蛋白本身的低水平表达依照标准方法测量，包括但 不限于Northern印迹分析，ELISA，以及用病毒接种对转基因植物并 选择抗性葡萄。在优选的实施方案中，核酸分子或其片段又在转基因 葡萄中发现的转基因编码。在其它优选的实施方案中，核酸分子或其 片段以正义或反义方向表达。在另外优选的实施方案中，此种葡萄树 线虫传多面体病毒外壳蛋白核酸分子或其片段(一个不受限制的例子 为正义非翻译的葡萄线虫传多面体病毒外壳蛋白mRNA具有阅读框外起 始ATG起始密码子和框外的mRNA残余)在转基因葡萄树或葡萄树部 分中表达。

如上所述，本发明还包括当在低水平表达时，有利于增强转基因 葡萄树或其葡萄树部分对扇叶病的抗性的葡萄线虫传多面体病毒外壳 蛋白核酸分子片段。因此，在此描述的葡萄线虫传多面体病毒外壳蛋 白核酸序列或其部分可在植物中表达从而促进疾病抗性。本发明认为 介导对扇叶病增加抗性的序列十分有用。在此所用的术语“片段”， 当应用于核酸分子的序列时，指至少5个连续的核苷酸，优选至少10 个连续核苷酸，更优选至少连续20至30个连续核苷酸，最优选至少 40至80个或更多连续核苷酸。葡萄线虫传多面体病毒核酸分子的片 段依照本领域技术人员熟知的方法可产生并继而与任何标准表达载体 整合(例如，本文描述的载体)。

优选的是，本发明中有用的葡萄树是葡萄属的一员；葡萄树部分 是体细胞胚，接穗，根状茎，或母块。在另一优先的实施方案中，扇 叶病是由葡萄线虫传多面体病毒引起的葡萄树扇叶病。在还有一个优 点的实施方案中，葡萄线虫传多面体病毒是葡萄树扇叶病毒南芥属花 叶病毒。

在另一方面，本发明的特征在于一种葡萄园，它包括均以低水平 表达葡萄线虫传多面体病毒衣壳蛋白核酸分子或其片段的3种或更多 种转基因葡萄树或葡萄树部分，其中该核酸分子或其片段的低水平表 达增强了葡萄园中转基因葡萄树或葡萄树部分对扇叶病的抗性。

在另一方面，本发明的特征在于一种基本上纯的蛋白质(例如， 重组蛋白质)，它包含与图1所示的葡萄线虫传多面体病毒“日内瓦” 分离株衣壳蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)具有至少97％氨基酸 相同性的氨基酸序列。在优选的实施方案中，该蛋白质包含图1所示 的葡萄线虫传多面体病毒衣壳蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。 在还有另一优选的实施方案中，该蛋白质具有图1所示的葡萄线虫传 多面体病毒衣壳蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)或其片段。

在另一方面，本发明的特征在于一种分离的核酸分子，它编码的 蛋白质(例如，重组蛋白质)包含与图1所示的葡萄线虫传多面体病 毒“日内瓦”分离株衣壳蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)具有至 少97％氨基酸相同性的氨基酸序列。在优选的实施方案中，由该核酸 分子编码的蛋白质包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在另一优选的 实施方案中，由该核酸分子编码的蛋白质具有SEQ ID NO：2的氨基 酸序列或其片段。

另一方面，本发明的特征在于编码葡萄线虫传多面体病毒外壳蛋 白的分离的核酸分子(例如，DNA分子)，该核酸分子特异地与包括 图1的核酸序列(SEQ ID NO：1)的核酸分子杂交。优选的是，该特 异性杂交的核酸分子编码葡萄线虫传多面体病毒序列，此序列在葡萄 植物细胞中低水平表达时介导针对扇叶疾病(例如，葡萄树扇叶病) 的抗性。本发明还鉴定了一种具有与任何上述分离的核酸分子互补的 序列的RNA转录物。

在相关方面，本发明进一步报道一种包括本发明的分离的核酸分 子的细胞(例如，一种原核细胞或真核细胞如哺乳动物细胞或酵母细 胞)。在优选的实施方案中，此细胞为细菌(例如，大肠杆菌或根癌 农杆菌)或植物细胞(例如，来自任何在此列出的栽培品种的葡萄植 物细胞)。该植物细胞见有抗扇叶病(例如，葡萄树扇叶病)的抗性。

在其它相关方面，本发明进一步报道一种包括本发明的分离的核 酸分子的栽体(例如，植物表达载体)。在优选的实施方案中，分离 的核酸分子与调节由此核酸分子(例如，作为正义翻译的或正义非翻 译的mRNA转录物，或反义mRNA转录物表达的核酸分子(如DNA)) 编码的蛋白的表达的表达控制区可操作地相连。

在其它相关方面，本发明进一步报道一种转基因植物或植物部分 (例如，葡萄树或葡萄树部分)，它包括编码一种蛋白(例如，一种 重组蛋白)的核酸分子，该蛋白编码与图1(SEQ ID NO：2)中表示 的日内瓦分离株葡萄线虫传多面体病毒外壳蛋白的氨基酸序列至少 97％相同的氨基酸序列。在优选的实施方案中，这样的转基因植物或植 物部分包括SEQ ID NO：1的核酸分子。此外，可制备这些序列的片 段，则该核酸分子表达正义翻译的，正义非翻译的，或反义的RNA转 录物。在其它优选的实施方案中，植物或植物部分具有SEQ ID NO：1 的核苷酸序列或其片段。如此包括本发明的核酸分子的植物或植物部 分具有对葡萄线虫传多面体病毒(例如，GFLV)引起的扇叶病抗性水 平的增加。

在此描述的方法和GFLV序列有效向不同品种的葡萄树(例如，葡 萄属(Vitis spp．，)Vitis spp．杂种，和Euvitis和Muscadinia亚 属的所有成员)，包括接穗或根状茎栽培品种，提供疾病抗性或耐性 或二者。典型的接穗栽培品种包括，但不限于，那些指作为餐桌或葡 萄干的葡萄和用在酿酒中的葡萄，如Cabernet Franc，Cabernet Sauvignon，Chardonnay(例如，CHO1，CHO2，CH Dijon)，Merlot，Pinot Noir(PN，PN dijon)，Semillon，白雷司令(White Riesling)， Lambrusco，Thompson Seedless，Autumn Seedless，Niagrara Seedless， 和Seval B1anc。本发明中有用的根状茎栽培品种包括，但不限于

                                                                      Vitis rupestris Constantia, Viris rupestris St. George, Vitis california, Vitis girdiana, Vitis rotundifolia, Vitis rotund~olia Carlos, Richter 110 (Vitis berlandieri x rupestris), 101-14 Millarder et de Grasset ( Vitis riparia x rupestris), Teleki 5C ( Vitis berlandieri x riparia), 3309 Courderc ( Vitis riparia x rupestris), Riparia Gloire de Montpellier ( Vitis riparia), 5BB Teleki (selection Kober, Vitis berlandieri x riparia), SO4 (Vitis berlandieri x rupestris), 41B Millardet ( Vitis vinifera x berlandieri), and 039-16 (Vitis vinifera x Muscadinia).

本发明还报道从在此描述的任何转基因葡萄树或葡萄树部分制备 的接穗，根状茎，体细胞胚或合子胚，细胞，或种子。

“非翻译的”指一段不翻译为蛋白的RNA序列。此类非翻译的序 列的例子包括，但不限于，包括起始ATG密码子及随后的基因工程的 移码突变和阻止mRNA翻译为蛋白的终止密码子的序列。表达该种非翻 译mRNA序列的葡萄线虫传多面体病毒外壳蛋白基因可根据标准方法构 建(例如，在此描述的方法)。

“低水平表达”指葡萄线虫传多面体病毒外壳蛋白基因在转基因 植物中的表达的水平，超过零但足够低，可给予扇叶病抗性。“高水 平表达”指在表达外壳蛋白基因转基因植物中发现的基因表达水平， 它过高以至于无法给予对该疾病的抗性。分析葡萄线虫传多面体病毒 外壳蛋白基因的低水平表达的典型的方法包括，但不限于检测mRNA转 录物的Northern印迹分析，以及免疫技术如检测蛋白的ELISA。

“基本上相同”指蛋白或核酸分子表现与参考氨基酸序列(例如，图 l中显示的氨基酸序列；SEQ ID NO：2)或核酸序列(例如，图1中所示的 核酸序列；SEQ ID NO：1)至少97％，并优选98％，或最优选99％相同。对 蛋白而言，对照序列的长度一般为至少16个氨基酸，优选至少20个 氨基酸，更优选至少25个氨基酸，并最优选35个氨基酸或更多。对 核酸而言，对照序列的长度一般为至少50个核苷酸，优选至少60个 核苷酸，更优选至少75个核苷酸，并最优选110个核酸或更多。

在氨基酸或核酸水平的序列相同性，一般用序列分析软件测量(例 如，MadiSon，1710大学路，威斯康星大学生物技术中心，遗传计算 机组，序列分析软件包，WI53705，BLAST，或PILEUP/PRETTYBOX程 序)。这些软件通过对不同的取代，缺失，和/或其它修饰指定同源性 的程度匹配相同或相似的序列。保守氨基酸取代典型包括在以下基团 中的取代：甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，天冬氨酸， 谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，赖氨酸，精氨酸， 和苯丙氨酸，酪氨酸。

“基本上纯的蛋白”指从天然含有葡萄线虫传多面体病毒外壳蛋 白的部分中分离的该种蛋白(例如，来自日内瓦，N．Y．葡萄线虫传多 面体外壳蛋白分离株(图1；SEQ ID NO：2))。典型的，当该蛋白占与 之天然关联的蛋白和天然产生的有机分子重量比至少为60％时，是基 本上纯的。优选的是，制剂蛋白重量比至少为75％，更优选至少为90％， 最优选至少为99％。基本上纯的蛋白(例如，日内瓦葡萄线虫传多面 体病毒分离株的外壳蛋白)可通过以下方法获得，例如，从天然来源 抽提(例如，GFLV-GP感染的植物如C．quinoa)；编码蛋白的重组核 酸的表达；或化学合成蛋白。纯度可通过任何适当的方法测量，例如， 柱层析，聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过HPLC分析。

“分离的核酸分子”指一种核酸分子(例如，DNA)，它不含在产 生本发明的核酸分子的天然存在的生物体基因组中与之侧面连接的核 酸分子。此术语因此包括，例如，一种重组DNA，它被掺入到载体； 自主复制质粒或病毒；或原核生物或真核生物基因组DNA；或作为与 其它序列分离的分子(例如，通过PCR或限制性内切核酸酶消化制备 的cDNA或基因组或cDNA片段)。它还包括作为编码额外蛋白序列的 杂种基因的部分的重组DNA。

“特异性杂交”指至少能够在弱严格条件，并优选在强严格条件 下与核酸序列(例如，DNA)杂交的核酸分子。

“蛋白”指任何氨基酸链，包括多肽，无论长度或翻译后修饰(例 如，糖基化或磷酸化)，包括多肽。

“表达定位”指核酸分子(例如，DNA)经定位与指导核酸分子转 录的序列(例如，表达非翻译反义序列或正义非翻译序列的基因)邻 近。

“表达控制区”指任何足以指导转录的最小序列。在本发明中包 括足以使启动子依赖的基因表达控制细胞，组织，或器官特异性的基 因表达的启动子和增强子元件，或可被外来信号或试剂诱导的元件(例 如，光的-，病原体的-，创伤的-，压力的-，或激素诱导的元件；或 组成元件)；这些元件可定位在天然基因的或基因工程改造进转基因 构建体的5’或3’区。

“可操作的连接”指当适当的分子(例如，转录激活蛋白)与调 节序列结合时，基因和调节序列以此种方式连接，允许基因表达。

“植物细胞”指由半透膜包裹的并含有质体的任何自体繁殖细胞。 在此所用的植物细胞，从以下来源获得，但不限于此，包括种子，悬 浮培养物，胚，分生组织区，愈伤组织，原生质体，叶，根，芽，体 细胞或合子胚，以及生殖或营养组织或器官的任意部分。

“植物部分”指从完整植物或植物细胞获得的部分，节段，或器 官。典型的植物部分包括，但不限于，体细胞胚，叶，果实，接穗和 根状茎。

“葡萄园”指一块土地，它包括三或更多经选择低水平表达葡萄 线虫传多面体病毒外壳蛋白核酸分子或其片段的转基因葡萄树或葡萄 树部分。

“转基因的”指包括通过技巧插入到细胞并成为由之发展而来的 生物体的基因组(以整合或染色体外方式，例如，包括亚基因组启动 子的病毒表达构建体)的部分的核酸分子(例如，DNA序列)的任何 细胞。如在此所用，转基因生物体一般为转基因的葡萄树或葡萄树部 分，核酸分子(例如，转基因)通过技巧插入到植物细胞的核或质体 的区室。优选，此转基因葡萄树或葡萄树部分表达至少一种正义翻译 的，正义非翻译的，或反义葡萄线虫传多面体病毒转录物(例如GFLV-CP 反义序列)。

“转基因”指任何通过技巧插入细胞并成为由之发展而来的生物 体的部分(整合到基因组或保持在染色体外)的核酸分子(例如DNA)。 这样的转基因可包括与转基因生物体部分或完全异源的基因，或可代 表与生物体的内源基因同源的基因。

“反义核酸序列”指与转录的RNA互补的核酸序列。一般该反义 序列长度通常为至少15个核苷酸，优选约15-200个核苷酸，并更优 选200-2000核苷酸。反义序列可与所有或部分的转录的RNA核苷酸 序列互补(例如，葡萄线虫传多面体病毒序列例如在此描述的GFLV-CP 反义构建体或任何在Brandt等Arch．Virol．140：157-164，1995； Margis等，普通病毒学杂志74：1919-1926，1993；Fuchs等，普通病 毒学杂志955-962，1989；Serghini等，普通病毒学杂志71：1433- 1441，1990；Bardonnet等，植物细胞报道13：357-360，1994； Krastanova等，植物细胞报道。14：550-554，1995；Ritzenthaler等， 普通病毒学杂志72：2357-2365，1991；Mauro等植物科学：112：97- 106，1995；和Sanchez等，核酸研究19：5440，1992中描述的任何GFLV 序列)，并且，如本领域技术人员可预料到的，特别位点或反义序列结合 位点以及反义序列的长度依赖于期待的抑制程度和反义序列的独特性 而可变。优选的是，表达葡萄线虫传多面体病毒序列的转录构建体(例 如，GFLV-CP反义核苷酸序列)在转录的方向上，包括，表述控制区， 正义链上为反义RNA编码的序列，和转录终止区。反义葡萄线虫传多 面体病毒序列(例如，GFLV序列)可如在此描述或例如在van Der Krol 等，基因72：45，1988；Rodermel等，细胞55：673，1988；Mol等， FEBS Lett．268：427，1990：Weigel和Nilsson，自然 377：495，1995；Cheung等，细胞82：383，1995)和美国专利号 5，107，065中描述的进行构建和表达。

“增强的对扇叶病的抗性”指在转基因葡萄树(或葡萄树部分或 其细胞或种子)中对扇叶病(例如，任何由葡萄线虫传多面体病毒引 起的疾病，如由GFLV，南芥属花叶病毒，及类似病毒引起的疾病)的 抗性比在对照葡萄树(例如，非转基因葡萄树)中抗性水平更高。在 优选的实施方案中，转基因葡萄树中的抗性水平比对照葡萄树的抗性 至少高5至10％(优选20％，30％或40％)。在另一优选的实施方 案中，对扇叶病的抗性与对照葡萄树相比，高出50％，60％，更优选75％ 或90％；最优选高出达到100％。使用常规方法测定抗性水平。例如， 对扇叶病的抗性水平通过比较转基因葡萄树的物理特征和特性(例如， 植物高度和重量，或通过比较疾病症状，例如，延迟的病灶发展，减 少的病灶大小，叶枯萎和卷曲，斑点和叶的坏死，茎杆的变形，节间 数，叶上的花叶圈，和细胞的变色)而确定。葡萄线虫传多面体病毒 (例如GFLV或南芥属花叶病毒)的感染性也可用例如标准ELISA监 测。

如上所述，葡萄线虫传多面体病毒正义翻译的外壳蛋白基因以及 反义序列的低水平表达，给转基因葡萄树提供了对葡萄线虫传多面体 病毒引起的疾病的抗性。因此，本发明为葡萄栽培者提供许多重要进 展和优势。例如，通过选择表达低水平重组葡萄线虫传多面体外壳蛋 白基因的并具有对葡萄线虫传多面体病毒感染的增强的抗性的转基因 葡萄树，本发明促进防止葡萄树扇叶病和其它葡萄线虫传多面体病毒 引起的疾病的有效和经济的方法。这种保护降低或最小化对葡萄栽培 者为控制葡萄线虫传多面体病毒的扩散而典型应用的传统化学实践的 需要，并提供对造成疾病的病原体的防护。此外，因为表达此葡萄线 虫传多面体病毒序列的葡萄植物对葡萄线虫传多面体病毒感染和扇叶 病较不敏感，本发明进一步提供增加的产率，以及改善的质量，色泽， 滋味和葡萄的产量。进一步的，因为本发明减低对防葡萄树病原体的 化学保护的需求，本发明对种植葡萄的环境也有利。本发明还用于与 对土壤传播的线虫有抗性的栽培的根茎结合。

本发明的其它特征和优点在随后的对其优选的实施方案的描述中 和权利要求中显而易见。

详述

首先描述附图。

附图

图1为示意性的图解显示日内瓦，N．Y．葡萄线虫传多面体病毒分 离株的外壳蛋白的核苷酸(SEQ ID NO：1)和推断的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。

图2为示意性的图解显示包括不同病毒基因构建体的植物表达载 体的图谱。

图3显示分析在转基因的3309C和Gloire中葡萄扇叶外壳蛋白 的表达水平的实验的结果。

以下是对疾病抗性的转基因葡萄树制备的描述。从根状茎(3309 Couderc(“3309C”)，Riparia Gloire(“Gloire”)，Teleki 5C (“5C”)，110 Richter(“110R”)，S04，和MGT 101-14(“101-14”)) 的花药衍生的胚性愈伤组织培养物再生表达葡萄树扇叶病毒外壳蛋白 (GFLV-CP)基因正义翻译的，正义非翻译的，或反义的序列的转基 因葡萄植物。出人意料的是，发现重组葡萄树扇叶外壳蛋白基因低水 平表达的转基因植物对扇叶病具抗性。

以下提供的实施例是为了说明本发明，不可视为是对本发明的限 制。

结果

胚性愈伤组织的起始和胚胎发育

愈伤组织起始于葡萄树栽培种：MSE培养基(下文)上的Gloire， 3309C，5C，110R，和101-14。培养一周后五种根状茎的花芽的花药 开始膨胀。四周后，生长出光滑，胶状，明黄色的愈伤组织。此时， 在愈伤组织中可见Gloire，3309C和110R的胚。八周后，将所有愈 伤组织转移到HMG培养基(下文)，容许胚的进一步发育。HMG培养 基上生长八周后，从愈伤组织诱导出许多胚聚簇。

植物再生

在HMG培养基中生长8到16周后，从愈伤组织上生长出胚聚簇和 下胚轴。同时，从初生胚继续生长次生胚。胚聚簇然后转移到MGC培 养基(下文)，增加胚体积和生长速度。但是，与在供所有检测的根 状茎栽培种的HMG培养基相比，MGC培养基上生长较少的胚。栽培种 110R的胚发育依赖于两种培养基的应用；既需要HMG培养基诱导许多 小的次生胚，又需要MGC培养基刺激下胚轴的生长。

顺序将下胚轴转移到木本植物培养基(Lloyd和McCown下文)， 一到两月内可见到芽出现。在木本植物培养基中，小植株的诱导频率 一般为30至66。

所获得小植株移植到土壤中，并在温室中保持。植物Gloire，5C， 110R，101-14和3309C表现正常的形态。

体细胞胚胎发生的维持

运用胚循环方法制备胚发生愈伤组织的连续供应；在MSE培养基 上下胚轴在两到三个月内诱导胚发生愈伤组织。这些愈伤组织可易于 转化，因为它们发育许多同样的胚。5C的胚需要在MSE培养基上培养 三个月，随后在HMG培养基上在培养两到三个月诱导胚的形成。胚循 环(胚发生愈伤组织到下胚轴再到胚性愈伤组织)需要的持续时间因 不同栽培种而不同；Riparia Gloire需要两到三个月，3309C和101- 14需要5到6个月，5C需要6到7个月。

转化

使用分子生物学的标准技术，分离并鉴定编码日内瓦，NY葡萄线 虫传多面体病毒分离株的外壳蛋白基因的核酸序列。日内瓦分离株外 壳蛋白基因的核酸序列(SEQ ID NO：1)和推断的氨基序列(SEQ ID NO： 2)示于图1。将该序列与三种不同的来自法国(Serghini等，普通 病毒学杂志。71：1433-1442，1990)，加利福尼亚(Sanchez等，核 酸研究。19 5440，1991)和澳大利亚(Brandt等Arch．Virol．140： 157-164，1995)的GFLV分离株序列比较，使用Prettybox程序。来 自法国，加利福尼亚，和澳大利亚的分离株与‘日内瓦’分离株的氨基酸 序列的一致性比分别为96．4％，95．0％和95．4％。

使用三种不同的基因构建体(正义可翻译的，正义非翻译的，和 反义的)转化葡萄(图2)。五种根状茎G1oire，3309C，110R，5C 和101-14的小体细胞胚和胚性愈伤组织与包含携带‘日内瓦’分离株 的外壳蛋白基因的二元载体的根瘤农杆菌菌株C58Z707共培养。共培 养后，将体细胞胚转移到加头孢氨噻肟，羧苄青霉素，和卡那霉素HMG 或MSE培养基中选择转基因的胚和植物，从而产生转基因植物。

对转基因的植物的分析

在使用GFLV-CP正义可翻译的和β葡糖醛酸糖苷酶基因表达构建 体(FLcpST+GUS，图2)的实验中，测定Gloire和110R的推定的转 基因植物的GUS活性，NPTII基因，并通过ELISA测定GFLV-CP基因 的表达。通过PCR分析，发现约93％的转化Gloire植物具有期望大小 的GFLV-CP基因，但ELISA测得植物中GFLV表达阴性。

这些结果说明在Gloire转基因植物中的GFLV-CP基因表达太低， 无法用ELISA检测。与此对照，用无GUS的GFLV-CP正义翻译的构建 体的载体转化栽培种3309C。分析推定的转基因植物中外壳蛋白的表 达，发现97．7％的ELISA阳性植物．在这些植物中，37．7％表现为低表 达(0．1＜OD405＞O．5)，30．7％表现为中度表达(O．5＜OD405＞1．O)，31．O％ 表现为高表达(OD405＞1．O)未转化的对照植物为阴性(OD405＜0．020)。

在另一系列的实验中，ELISA结果还揭示在3309C和Gloire转基 因植物中GFLV外壳蛋白基因的不同表达水平。分别在61％和53％的转 化3309C和Gloire中观察到外壳蛋白基团低表达。分别在26％和22％ 的转化3309C和Gloire中观察到外壳蛋白基团中度表达。以及分别 在13％和25％的转化3309C和Gloire中观察到外壳蛋白基团高表达(图 3)。

抗GFLV感染的防护

如下检测转基因植物对GFLV的抗性。植物进行GFLV接种，根据 标准方法将它们异种嫁接到GFLV感染的C．quinoa中或嫁接到非转基 因的GFLV感染的栽培种中。接种后植物保持数月，然后评价其对疾病 的抗性。标准ELISA评估痰病抗性。这些实验的结果显示于表Ⅰ-Ⅴ(以 下)。特别如表Ⅲ所示，发现表达反义表达构建体的转基因系 GFLVcpAntiS(图2)抗GFLV感染。

表1 用感染的C．quinoa异种嫁接的转基因110Richter的ELISA评估 转基因系：     ELISA         ELISA     ELISA        ELISA          (％)     4／31／97    5／27／97 8／6／97    2／12／97    感染的百分比     #2     #3     #6     #8     #21     #41     #45     #50     #84   对照       0／2         1／2      1／4        1／4          25．0       0／6         1／6      4／10       4／10         40．0       O／2          nt       1／2        1／2          50．0       0／2         2／2      2／5         NT           40．0       0／8          nt       8／8        8／8          100．0        nt          2／8      5／8         NT           62．0        -            -        2／2         NT           100．0        -           3／4      4／4        4／4          100．0        -           4／6      5／6        5／6          83．0        -           6／8     14／16      14／16         88．0 1FLcpST+GUS(图2)；NT：未测试的

表Ⅱ 用GFLV感染的C．quinoa异种嫁接的转基因Riparia(Gloire的ELISA评估 转基因系1     2个月     4-5个月     总数     (％) 感染的百分比     #5     #6     #7     #9     #10     #12     #13     #14     #15     #16     #19     #20     #21     #22     #B-6     #B-17     ##B-20     #B-24     #B-42     对照     0/3     0/3     0/5     0/5     1/16     0/4     3/11     0/7     0/4     0/5     nt     2/12     0/11     0/1     nt     nt     0/7     nt     0/4     23/26     0/10     0/3     2/7     1/8     4/14     0/4     3/8     0/7     11/15     0/9     0/4     2/12     3/14     0/4     0/8     6/13     0/6     0/3     0/4     23/26     0/10     0/3     2/7     1/8     4/14     0/4     3/8     0/7     11/15     0/9     0/4     2/12     3/14     0/4     0/8     6/13     0/6     0/3     0/4     23/26     0     0    29.0    13.0    29.0     0    38.0     0    73.0     0     0    17.0    14.0     0     0    46.0     0     0     0    88.0 1FLcpST+GUS(图2)

表Ⅱ 以感染的C．quinoa异种嫁接的转基因MGT-101-14的ELTSA评估     转基因系   ELISA  3/27/97   ELISA  4/31/97    ELISA   5/27/97    ELISA    8/6/97    (％) 感染的百分比 T18,FL(5-1)11 T18,FL(1-1)12  T1 8,FL(1-1)22  T18,FL(1-1)32  T18FL(1-1)E2  T18,FL(B-8)2  T1 8,FL(A-3)2  T1 8,FL(K-1)2   CONTROL     0/7     0/8     3/4     2/5     0/4     0/2     nt     nt     -     nt     1/8     3/4     3/5     1/4     1/2     0/4     2/8     -     0/7     2/8     3/4     4/5     3/4     2/2     3/4     2/8     11/16     0/7     4/8     3/4     4/5     4/4     2/2     4/4     2/8     23/29     0     50.0     75.0     80.0     100.0     100.0     100.0     25.0     79 1FLcpAntiS(图2)；2FLcpST(图2)

表Ⅳ 体外微嫁接          转基因的L/          GFLV葡萄树   在GH上的小植株数    ELISA   11/27/9      6    ELISA   1/30/97   ELISA  4/24/97 Riparia#16/Cabemet sauv. Riparia#21/Cabemet sauv. Riparia#23/Cabemetsauv. Riparia#19/Cabemetsauv. RipariaB-2/Cabemetsauv. Riparia B-13/Cabemet sauv. Riparia B-17/Cabernet sauv. RipariaB-67/Cabernet sauv. Riparia,ht/Cab           5           5           5           4           4           4           2           2           5     0/2     1/5     2/5     0/4     0/4     1/4     1/2     0/2     4/5     0/2     1/5     2/5     0/4     0/4     2/4     1/2     0/2     4/5    0/2    5/5    4/5    0/4    0/4    3/4    2/2    0/2    4/4

表Ⅴ 体外微嫁接     转基因的L/     GFLV葡萄树     GH上的小植株数     ELISA     11/27/97     ELISA     1/30/97    ELISA    4/24/97     Richter 45/Rupestris     Richter 26/Rupestris     Richter 56/RRupestris     Richter 11/Rupestris     Richter 75/Rupestris     Rupestris/Richter 56     Rupestris/Richter 75     Rupestris/Richter 4     Ricbter ht/Rup     3     6     2     3     6     2     6     4     4     2/3     0/6     0/2     0/3     2/3     0/2     2/3     0/3     3/4     2/3     0/6     0/2     0//3     2/3     0/2     2/3     0/2     3/4     2/3     0/6     0/2     0/3     2/4     0/2     2/5     0/2     4/A

材料和方法

以上所述的结果采用以下材料和方法获得。

植物材料

在以上所述的实验中，使用根状茎栽培种3309(“3309C”) (V．riparia x V．rupestris)，Riparia Gloire(“Gloire”)(V． riparia)，Teleki 5C(“5C”)(V．berlandieri x V．riparia)，MGT 101-14(“101-14”)(V．riparia x V．rupestris)和110 Richter (“110R”)(V．rupestris x V．berlandieri)。愈伤组织培养物从 花药开始，使用Rajasekaram和Mullins的方法 (J．Exp．Bot．30：399-407，1979)。从日内瓦实验研究中心的葡萄园 收集3309C，5C，110R和101-14的花芽，在同一个葡萄园收集日内 瓦N．Y．Gloire休眠蔓，4℃储存在塑料袋中的湿润珍珠岩中。在温室 中的装有珍珠岩的花盆中2到5节段生根，4周内花芽发育。在花药 之前从田中生长的葡萄树中收获花芽。从芽簇收集芽，表面用70％ETOH 消毒1到2分钟。将芽转移到1％次氯酸钠中15分钟，然后在无菌水 中洗三次。使用立体显微镜从花芽无菌切除花药。为确定适合愈伤组 织诱导的最佳时期，根据标准方法将花粉在显微镜上用一滴乙酸胭脂 红的盖片粉碎，观察细胞学阶段。

培养基

使用4种不同的固体培养基产生胚和再生植物。

使用如下4种培养基。(1)起始培养基。此培养基为改进的MS 培养基(Murashige和Skoog，植物生理学15：473-497，1962)且 称为MSE(Mozsar和Sule，Vitis 33：245-246，1994)。(2)分 化培养基。此培养基如Mozsar和Sule(Vitis 33：245-M246，1994) 所述称为HMG培养基；(3)再生培养基。此培养基称为MGC培养基。 它包括全强度MS盐，修改为20g/L蔗糖，4．6g/L甘油，1g/L酪蛋白 水解物和0．8％纯净琼指；和(4)生根培养基。该培养基(pH 5．8)为木 本植物培养基(Lloyd和McCown，Proc．Intl．Plant Prop．Soc．30：421-427，1981)，补充有O．1mg/L BA，3g/L活性碳和1．5％ 蔗糖。

体细胞胚发生和再生

在无菌条件下分离花药，并按40到50花药/9．0厘米直径的培养 皿铺皿，28℃黑暗中培养。在MSE中诱导愈伤组织。60天之后，诱导 出胚，将其转移进无激分的HMG培养基中以进行分化。将重雷期胚从 HMG转移到MGC培养基促进胚萌芽。培养物在26-28℃黑暗中保持，3 到4周间隔换到新鲜培养基中。转移下胚轴(伸长的胚)到儿童食品 罐中的生根培养基中(5到8个胚/罐)。胚在25℃下生长，日常16 小时光周期，诱导芽和根形成。根发育后，植物移植到土壤并种于温 室中。

体细胞胚的维持和繁殖

将在HMG或MGC培养基中发育的来自伸长的胚的下胚轴切为3-4mm 段，置于MSE培养基中促进次级胚性愈伤组织的发育。次级胚性愈伤 组织随后转入到HMG中分化和发育新的下胚轴。这些来自HMG培养基 的次级下胚轴然后转到MSE培养基中，获得第3轮胚发生愈伤组织和 下胚轴。用相同的方法获得胚发生愈伤组织的第四和第五循环。可选 择从花药发育的胚发生愈伤组织在MSE培养基上繁殖，产生足够的幼 胚用于转化。在维持过程中，所有的胚培养物以20到30天的间隔换 新鲜培养基。

基因和载体

在此研究中使用三种遗传构建体来遗传转化葡萄树(图2)。使 用包含二元质粒pGA482GG或pGA482G的根瘤农杆菌菌株C58Z707转 化含GFLV-cp的葡萄植物。根据标准方法对命名为‘日内瓦’NY分离 株CF57的GFLV的外壳蛋白基因克隆并测序。葡萄树扇叶病线虫传多 面体病毒外壳蛋白通过用病毒编码的蛋白酶进行多蛋白的翻译后加工 制备。定位在RNA2基因组的3’半边的外壳蛋白基因，不包括ATG起始 密码子。包括NcoI位点的寡核苷酸引物因此用于向遗传构建体中引入 翻译起始密码子。根据标准方法设计侧面连接外壳蛋白基因的两套引 物用于PCR扩增引物组 (P2：cgtcagTCTAGACCATGGTGAGAGGATTAGCTGGTAGAGGAG(SEQ ID NO：3) 和KSL95-10：ctgtaCCATGGTCTTTTAAAGTCAGATACC(SEQ ID NO：4)) 用于产生翻译构建体。为基因工程制备正义非翻译构建体，我们在翻译 起始密码子(ATG)下游三个核苷酸处引入额外的核苷酸(T)产生移码突 变，产生终止密码子。通过使用KSL95-10(SEQ ID NO：4)和KSL96- 15(acgttaCCATGGTGTAGAGGATTAGCTGGTAGA；SEQ ID NO：5)引物完成。 (小写字母为用于有效限制性消化的无意义序列。下划线区域是用于 有效克隆的限制性位点。黑体字母代表用于基因工程制备正义非翻译 构建体的终止密码子)。获得的扩增PCR产物用限制性酶，NcoI处理， 并克隆到植物表达载体pEPI8。通过标准限制性图谱和PCR分析确定 正义或反义定向，PCR分析运用定向35S启动子特异的引物(KSL96-12： agtgctCTCGAGCAATTGAGACTTTTCAACAA；SEQ ID NO：6)和转基因引物。 表达盒包括转基因和植物转录元件，35S增强子，35S启动子，苜蓿花 叶病毒RNA4 5’非翻译序列和35S终止子，将其克隆到植物转化载体 pGA482G。

转化

转化步骤修改自Scorza和Cordts所描述的方法(植物细胞报 道．14：589-592，1995；Krastanova等．，植物细胞报道．24：550- 554，1995)。农杆菌属菌株C58Z707的过夜培养物在LB培养基中28 ℃摇床中培养。细菌5000rpm(或3000rpm)离心5分钟，在MS液体 培养基中重悬(OD600=0．4-1．O)。将球形或心形胚的愈伤组织浸入细 菌悬液15到30分钟，印干，转移到加或不加乙酰丁香酮(100μM) 的HMG培养基中。胚胎发生愈伤组织与细菌28℃黑暗中共培养48小 时。然后，植物物质在加有氨中噻肟头孢菌素(300mg/ml)和羧苄青 霉素(200mg/ml)的MS液体中洗两到三次。将材料转移到包含20或 40mg/L卡那霉素，300mg/L氨苄噻肟头孢菌素，和200mg/L羧苄青霉 素HMG培养基中选择转基因胚。在与农杆菌共培养48小时后，也可选 择将胚发生愈伤组织转移到含25mg/L卡那霉素以及以上列出的抗生素 的起始MSE培养基中。所有的植物材料连续在28℃黑暗中温育。在选 择培养基中生长三个月后，将胚转移到无卡那霉素的HMG或MGC中， 以便下胚轴发育。然后在将胚转移到无抗生素的生根培养基中。非转 化的愈伤组织在相同的培养基中生长，加和不加卡那霉素，检验卡那 霉素选择的效率和植物在抗生素存在时再生的能力。

对转基因植物的分析

运用标准试验GUS验定法(Jefferson，植物分子生物学报道5： 387-405，1987)，检测NPTII的ELISA(Cabanes-Bastos等．，基 因77：69-176，1989)，检测cp的ELISA(Clark等，遗传病毒学 杂志34：475-483)，和PCR和Southern分析(Ausubel等，下文) 分析转基因植物。

其它葡萄线虫传多面体病毒-CP基因的分离

任何葡萄线虫传多面体病毒(例如，GFLV)分离株都可作为对葡 萄线虫传多面体病毒外壳蛋白(CP)基因的分子克隆的核酸来源。例 如，GFLV-CP基因的分离包括编码表现CP-相关结构，特性，或活性 的蛋白的DNA序列的分离。基于在此描述的GFLV-CP核苷酸和氨基酸 序列(图l；SEQ ID NOS：1和2)，使用本领域所熟知的标准策略和 技术可进行对另外的GFLV-CP编码序列的分离。

在一个具体的实例中，在此描述的GFLV-CP序列可与常规的核酸 杂交筛选的筛选方法一起使用。这些杂交技术和筛选方法为本领域技 术人员众所周知，并在许多文献中描述，例如，在Benton和Davis， 科学196：180，1977；Grunstein和Hogness，美国国立科学院院刊 72：3961，1975；Ausubel等(上文)；Berger和Kimmel(上文)；和 Sambrook等，分子克隆：实验指南，冷泉港实验室出版社，纽约。在一 个具体实例中，所有或部分的‘日内瓦’分离株核苷酸序列(在此所 述)可用作探针在重组GFLV DNA文库筛选具有与‘日内瓦’分离株 的外壳蛋白基因具有序列相同性的基因。根据标准方法，通过蚀斑或 克隆杂交检测杂交序列。

可选择使用所有或部分的‘日内瓦’分离株的外壳蛋白基因的氨 基酸序列可容易地设计出CFLV-CP特异的寡核苷酸探针，包括GFLV-CP 简并的寡核苷酸探针(即，为提供的氨基酸序列编码的所有可能序列 的混合物)。这些寡核苷酸可基于DNA链和GFLV-CP序列任何适当的 部分(图1；SEQ ID NOS：1和2)的序列。以下文献提供设计和制备 该探针的一般方法，例如，在Ausubel等，1996，分子生物学流行方 法，Wiley Interscience，纽约，和Berger和Kimel，分子克隆技 术指导，1987，学院出版社，纽约。这些寡核苷酸有效用于GFLV-CP 基因分离，无论将其用作能与GFLV-CP互补序列杂交的探针或用于不 同扩增技术的引物，例如，多聚酶链式反应(PCR)克隆策略。如需要， 可将不同寡核苷酸探针的组合物用于筛选重组DNA文库。可用本领域 熟知的方法对寡核苷酸进行可探测的标记，将其用于探测从重组DNA 文库复制的滤膜。重组DNA文库按照本领域熟知的方法制备，例如，在 Ausubel等(上文)中描述的方法，或从商业渠道获得。

GFLV-CP序列的其它来源包括在以下文献中描述的，Brandt等， Arch．Virol．140：157-164，1995；Margis等，普通病毒学杂志。 74：1919-1926，1993；Fuchs等，普通病毒学杂志。955-962，1989； Serghini等，普通病毒学杂志71：1433-1441，1990；Bardonnet等，植 物细胞报道13：357-360，1994；Krastanova等，植物细胞报道，14： 550-554，1995；Ritzenthaler等，普通病毒学杂志，72：2357- 2365，1991；Mauro等，植物科学：112：97-106，1995；和Sanehez等， 核酸研究。19：5440，1992。GFLV-CP序列鉴定之后，根据标准方法克隆， 如本文所述用于植物表达载体的构建。

植物转基因的构建

最优选的是，葡萄线虫传多面体衣壳蛋白(例如，GFLV-CP)作为 正义翻译的或正义非翻译的mRNA转录物或作为反义mRNA转录物表 达，通过稳定转染的葡萄细胞系或转基因的葡萄树或葡萄树部分。许 多适合植物细胞稳定或染色体外转染的栽体，或适合转基因植物建立 的载体公众都可以享有；这些载体在Weissbach和Weissbach(植物分 子生物学方法，学术出版社，1989)和Gelvin等(植物分子生物学指 南，Kluwer，学术出版社，1990中描述。构建这些细胞系的方法在例 如Weissbach和Weissbach(上文)，Gelvin等(上文)中表述。在 Scorza等(植物细胞报道14：589-592，1995)，Baribault等 (J．Expt．Bet．41：1045-1049，1990)Mullins等(生物技术8： 1041-1045，1990)，Nakano等。(J．Expt．Bot．45：649- 656，1994)，Kikkert等。(植物细胞报道15：311-316，1995)， Krastanova等。(植物细胞报道．1：550-554，1995)，Scorza等。(植物 细胞报道。14，589-592，1994)，Scorza等(．J． Amer．Soc．Hort．Sci．121：616-619，1996)，Martinelli等(遗转应 用理论88：621-628，1994)，和Legall等(植物科学102．161- 170，1994)中描述了对葡萄树中转基因的表达有用的载体例子。

典型的，植物表达栽体包括(1)处于5‘和3’表达控制序列转录 控制下的克隆基因(例如，表达正义翻译的，正义非翻译的，或反义葡 萄树线虫传多面体病毒RNA的核酸分子)和(2)显性选择标记。这 些植物表达载体如期望还可包括，启动子调节区(例如，可诱导的或 组成性的，病原体或创伤诱导的，环境或发育调节的，或细胞或组织 特异性表达)，转录起始位点，核糖体结合位点，RNA加工信号，转 录终止位点，和/或聚腺苷酸化信号。

当如上述获得期望的葡萄线虫传多面体病毒外壳蛋白核酸分子 后，可用本领域熟知的不同方式操作。例如，本发明的GFLV-CP DNA 序列如需要，可与其他DNA序列以不同方式组合。GFLV-CP DNA序列 可与所有或部分与GFLV-CP相关的基因序列共用。在其组分部分，编 码GFLV-CP的DNA序列组合在具有在宿主葡萄树细胞中能促进转录的 转录起始控制区的DNA构建体中。

一般，该构建体包括在植物中作用的调节区，如此所述，它供给 GFLV-CP的修饰产物。例如，GFLV-CP的正义非翻译序列或其片段， 其5‘端与转录起始调节区相连，此转录起始调节区例如在植物结构 基因的5’上游区天然发现的序列。许多转录起始区可供组成性或可 诱导的调节。

在需要应用于发育，细胞，组织，激素或环境表达时，从其它基 因获得适当的5‘上游非编码区域，例如，在分生组织发育，种子发 育，胚发育，叶发育，茎发育，或卷须发育期间调节的基因。

调节转录终止区也可在本发明的DNA构建体中提供。转录终止区 可由编码GFLV-CP的DNA序列或任何便利的由不同基因来源(例如， NOS或35S CaMV终止子)衍生的转录终止区提供。转录终止区包括优 选衍生终止区的结构基因的序列3‘端的至少1-3kb。以GFLV-CP(无 论mRNA反义定向或正义翻译的或正义非翻译的产物)作为感兴趣的、 要表达的DNA序列的植物表达构建体可用于广泛的葡萄树。如此遗传 改造的植物可有效用于不同的工业和农业应用。重要的是，本发明应 用于所有葡萄树或葡萄树组分，并可容易的用于任何新的或改进的葡 萄转化或再生方法。

表达构建体包括至少一个可操作地与至少一段正义翻译的或正义 非翻译的或反义GFLV-CP序列相连的启动子。根据本发明的有效的植 物启动子的实例为花椰菜花叶病毒启动子，例如，花椰菜花叶病毒 (CaMV)启动子。这些启动子在多数植物组织中给予高水平表达，且 这些启动子的活性不依赖于病毒编码的蛋白。CaMV是35S和19S启动 子的来源。在转基因植物的多数组织中，CaMV 35S启动子为强启动子 (见，例如，Odell等，自然，313：810，1985)。CaMV启动子在单 子叶植物中也具有高度活性(例如，参见Dekeyser等，植物细胞2： 591，1990；Terada和Shimamoto，Mol．Gen．Genet．220：389，1990)。 此外，通过CaMV 35S启动子的重复，启动子的活性可进一步增加(即， 2-10倍)(例如，参见Kay等，科学236：1299，1987；Ow等，美 国国家科学院院刊84：4870，1987；和Fang等，植物细胞1：141，1989， 和McPherson和Kay美国专利号5，378，142)。

其它有效的植物启动子包括，但不限于，胭脂氨酸合酶(NOS)启动子 (An等，植物生理学．，88；547，1988)，章鱼氨酸合酶启动子(Fromm等．， 植物细胞1：977，1989)，稻肌动蛋白启动子(Wu和McElroy， WO91/09948)，环化酶启动子(Chappell等，WO 96/36697)，和木 薯叶脉花叶病毒启动子(Verdaguer等，，植物分子生物学31：1129- 1139，1996)。在本发明中有效的其它典型启动子包括，但不限于，鸭 拓草黄色斑驳病病毒启动子，甘蔗badna病毒启动子，水稻tungro 杆状病毒启动子，玉米茶斑病毒元件，和小麦矮小病毒启动子。

作某些应用时，可在适当组织中制备适当发育时间，适当水平的 GFLV-CP序列。为此目的，存在一类基因启动子，每种的独特特性具 体表现在其调节序列，当存在诱导信号如环境，激素，和/或发育暗示 时，表现为受调节的。这些包括，但不限于，下列基因启动子，负责 热调节的基因表达(例如，Callis等，植物生理学。88：965，1988； Takahashi和Komeda，Mol．Gen．Genet．219；365，1989；和Takahashi 等，植物杂志2：751，1992)，光调节的基因表达(例如，豌豆rbcS-3A， Kuhlemeier等，植物细胞1：471，1989，玉米rbcS启动子，Schaffner 和Sheen，植物细胞3：997，1991；豌豆中发现的叶绿素a/b-结合蛋 白基因，Simpson等，欧洲分子生物学杂志4：2723，1985；Arabssu 启动子，或水稳rbs启动子)，激素调节的基因表达(例如，源自小 麦Em基因的脱落酸(ABA)响应序列，Marcotte等，植物细胞1：969， 1989；用于大麦和拟南芥的ABA诱导的HVA1和HVA22和rd29A启动 子，Straub等，植物细胞6：617，1994和Shen等，植物细胞7：295， 1995；和创伤诱导的基因表达(例如，wunI，Sieberta等，植物细胞 1：961，1989)，器官特异的基因表达(例如，块茎特异的贮藏蛋白 基因，Roshal等，欧洲分子生物学杂志6：1155，1987；23kDa玉米 融溶蛋白基因，Schernthaner等，欧洲分子生物学杂志7：1249，1988； 或法国豆β-云扁豆蛋白基因，Bustos等，植物细胞1：839，1989)， 或病原体诱导的启动子(例如，PR-1，prp-1，或β-1，3葡聚糖酶 启动子，真菌诱导的小麦wirla启动子，和线虫诱导的启动子，分别 在烟草和芹菜中的TobRB7-5A和Hmg-1)。

植物表达载体也可随意包括RNA加工信号，例，对有效的RNA合 成和积累重要的内含子(Callis等，基因和发育1：1183，1987)。 RNA剪接序列的定位能剧烈影响植物中的转基因表达水平。考虑到这 一事实，内含子可位于转基因GFLV-CP序列的上游或下游以调节基因 表达的水平。

除了上述的5’调节控制序列，表达载体还可包括一般在植物基因 的3’区的调节控制区(Thornburg等，美国国家科学院院刊84：744， 1987；An等，植物细胞：115，1989)。例如，表达载体可包括3‘终 止子区，以增加mRNA的稳定性。此种终止子区可从土豆的PI-II终 止子区衍生。此外，其它普遍应用的终止子从章鱼氨酸或胭脂氨酸合 酶信号产生。

植物表达载体还典型包括用于鉴定转化的细胞的显性选择标记基 因。植物系统的有效选择基因包括编码抗生素抗性基因的基因，例如， 编码对潮霉素，卡那霉素，博来霉素，G418，链霉素，或奇霉素的基 因。光合作用需要的基因也可用作光合缺陷菌株的选择标记。最后， 编码除草剂抗性的基因可用作选择标记，有效的除草剂抗性基因包括 编码膦丝菌素乙酰转移酶和给予对广谱除草剂BASTA_(Hoechst AG， Frankfurt，德国)抗性的bar基因。

此外，如需要，植物表达构建体可包括被转变以增加植物中基因 的性能的修饰的或完全合成的GFLV-CP序列。

分子生物学领域，尤其是植物分子生物学领域的技术人员，可容 易地看出基因表达的水平不仅依赖与启动子，RNA加工信号，和终止 子元件的结合，还依赖于运用这些元件提高选择标记基因表达的水平。

葡萄树转化

在植物表达载体构建后，可用若干标准方法将栽体引入植物宿主， 从而再生转基因植物。这些方法包括(1)农杆菌介导的转化(毛根农 杆菌或根瘤农杆菌)(例如，Lichtenstein和Fuller遗传工程， 第6卷，PWJ Rigby，ed，伦敦，学术出版社，1987；和Lichtenstein， C．P．，和Draper，J，DNA克隆，卷Ⅱ，D．M．Glover，ed．牛津，IRI 出版社，1985))，(2)微粒传递系统(例如，Gordon-Kamm等，植 物细胞2：603(1990)；或Sanford等，美国专利号4，945，050， 5，036，006和5，100，792)，(3)显微注射方法(例如，Green等， 上述)，(4)聚乙二醇(PEG)方法(例如，Draper等，植物细胞 生理学23：451，1982；或例如，Zhang和Wu，遗传应用理论76：835， 1988)，(5)脂质体介导的DNA摄入(例如，Freeman等，植物细胞 生理学25：1353，1984)，(6)电融合方法(例如，Gelvin等，上 述；Dekeyser等，上述；Fromm等，自然319：791，1986；Sheen植 物细胞2：1027，1990；或Jang和Sheen植物细胞6：1665，1994)， 和(7)涡旋振荡方法(例如，Kindle上述)。本发明中转化方法并 不关键。可使用任何用于有效转化的方法。转化葡萄的典型方法可在 以下文献中找到，Scorza等(植物细胞报道14：589- 592，1995)，Baribault等(J．Expt．Bot．41：1045-1049，1990)，Mullins 等(生物技术8：1041-1045，1990)，Nakano等，(J．Expt．Bot 45：649-656，1994)，Kikkert等，(植物细胞报道15：311- 316，1995)，Krastanova等。(植物细胞报道．1：550-554，1995)，Scorza 等。(植物细胞报道．14：589-592，1994)，Scorza 等．(J．Amer．Soc．Hort．Sci．121：616-619，1996)，Martinelli 等，(Theor Appl Genet．88：621-628，1994)，和Legall等(植物科 学．102：161-170，1994)。其它可用于转化农作物或其它宿主细胞的方 法也可直接应用。

适用于本发明实践的植物包括，但不限于，葡萄树(例如，Vitis spp．Vitis spp．，杂种，和Euvitis和Muscadinia亚属的所有成员)， 包括接穗或根状茎栽培物。典型的接穗栽培物包括，但不限于，通常 所指的餐桌或葡萄干葡萄树，和用于葡萄酒生产的栽培物如Cabernet Franc，Cabernet Sauvignon，Chardonnay(例如，CH01，CH02，CH Dijon)，Merlot，Pinot Noir(PN，PN Dijon)，Semillon，White Riesling，Lambrusco，Thompson Seedless，Autumn Seedless， Niagrara Seedless，和Seval B1anc。其它可用的接穗栽培物包括通 常所指的餐桌或葡萄干葡萄树，如

                                                Alden，Almeria，Anab-E-Shahi， Autumn Black，Beauty Seedless，Black Corinth，Black Damascus, Black Malvoisie， Black Prince，Blackrose，Bronx Seedless，Burgrave，Calmeria, Campbell Early，Canner， Cardinal，Catawba，Christmas，Concord，Dattier，Delight，Diamond，Dizmar，Duchess， Early Muscat，Emerald Seedless，Emperor，Exotic，Ferdinand de Lesseps，Fiesta，Flame seedless，Flame Tokay，Gasconade，Gold，Himrod，Hunisa，Hussiene，Isabella，Italia，July Muscat，Khandahar，Katta，Kourgane，Kishmishi，Loose Perlette，Malaga，Monukka， Muscat of Alexandria，Muscat Flame，Muscat Hamburg，New York Muscat, Niabell， Niagara，Olivette blanche，Ontario，Pierce，Queen，Red Malaga，Ribier，Rish Baba， Romulus，Ruby Seedless，Schuyler，Seneca，Suavis (IP 365), Thompson seedless，and Thomuscat．它们还包括在葡萄酒生产中应用的，Alicante Bouschet，Aligote，Alvarelhao，Aramon，Baco blanc(22A)，Burger，Cabemet franc， Cabernet，Sauvignon，Calzin，Carignane，Charbono，Chardonnay，Chasselas dore，Chenin blanc，Clairette blanche，Early Burgundy，Emerald Riesling，Feher Szagos，Fernao Pires， Flora，French Colombard，Fresia，Furmint，Gamay，Gewurztraminer，Grand noir，Gray Riesling，Green Hungarian，Green Veitliner，Grenache，Grillo，Helena，Inzolia，Lagrein， Lambrusco de Salamino，Malbcc，Malvasia bianca，Mataro，Melon，Merlot，Meunier， Mission，Morntua de Pilas, Muscadelle du Bordelais，Muscat blanc，Muscat Ottonel， Muscat Saint-Vallier，Nebbiolo，Nebbiolo fino，Nebbiolo Lampia，Orange Muscat， Palomino，Pedro Ximenes，Petit Bouschet，Petite Sirah，Peverella，Pinot noir，Pinot Saint- George，Primitivo di Gioa，Red Veltliner，Refosco，Rkatsiteli，Royalty，Rubired，Ruby Cabernet，Saint-Emilion，Saint Macaire，Salvador，Sangiovese，Sauvignon blanc， Sauvignon gris，Sauvignon vert，Scarlet，Seibel 5279，Seibel 9110，Seibel 13053， Semillon，Servant，Shiraz，Souzao，Sultana Crimson，Sylvaner，Tannat，Teroldico，Tinta Madeira，Tinto cao，Touriga，Traminer，rebbiano Toseano，Trousseau，Valdepenas， Viognier，Walschriesling，White Riesling，and Zinfandel．

本发明有用的根状茎栽培物包括，但不限于， Vitis rupestris Constantia，Vitis rupestris St．George，Vitis california, Vitis girdiana，Vitis rotundifolia，Vitis rotundifolia Carlos，Richter 110 (Vitis berlandieri x rupestris)，101-14 Millarder et de Grasset(Vitis riparia x rupestris)，Teleki 5C(Vitis berlandieri x riparia)， 3309 Courderc(Vitis riparia x rupestris)，Riparia Gloire de Montpellier ( Vitis riparia)， 5BB Teleki (selection Kober，Vitis berlandieri x riparia)，SO4 (Vitis berlandieri x rupestris)，41B Millardet (Vitis vinifera x berlandieri)，and 039-16 (Vitis vinifera x Muscadinia)．其它可用的根状裁培品种包括 Couderc 1613，Couderc 1616，Couderc 3309，Dog Ridge，Foex 33EM，Freedom，Ganzin 1(AxR#1)，Harmony，Kober 5BB，LN33，Millardet & de Grasset 41B，Millardet & de Grasset 420A，Millardet & de Grasset 101-14，Oppenheim 4 (SO4)，Paulsen 775，Paulsen 1045，Paulsen 1103，Richter 99，Richter 110，Riparia Gioire，Ruggeri 225，Saint-George， Salt Creek，Teleki 5A，Vitis rulpestris Constantia，Vitis california，and Vitis girdiana．

通常，植物细胞，包括葡萄植物，中转基因的转移和表达对本领 域的技术人员为常规实践，并成为在植物中进行基因表达研究和制备 改进的各种农业或商业需要的植物的主要手段。

转基因葡萄树的再生

以植物表达载体转化的植物细胞可再生，例如，从单个细胞，愈 伤组织，叶片根据标准植物组织培养技术再生。在本领域众所周知， 来自几乎任何植物的不同的细胞，组织，和器官都能成功的经过培养 再生为整个植物；这些技术在例如Vasil上述，Green等，上述； Weissbach和Weissbach，上述；和Gelvin等，上述中都有描述。

在一个具体的实例中，一个克隆的正义非翻译的GFLV-CP序列(例 如，正义翻译的或正义非翻译的衣壳蛋白基因，或反义构建体)构建 体(例如，具有包括在起始密码后的终止密码的阅读框外的ATG的正 义定向的GFLV-CP序列)，在35S CaMV启动子和胭脂氨酸合酶终止 子的控制下，携带选择标记(例如，卡那霉素抗性)，将此序列转化 到农杆菌属。如Scorza和Cordts所述进行对葡萄树的转化，使用包 含载体的农杆菌属。推定的转化子在含卡那霉素的植物组织培养基中 选择数周。然后将卡那霉素抗性植物材料置于无促根起始的激素的植 物组织培养基中。

对表达选择标记的转基因植物进行筛选，运用上述标准探测技术 筛选转基因DNA的传递。每种阳性转基因植物和其转基因后代，与其 它用相同转基因建立的转基因植物相比，是唯一的。转基因DNA与植 物基因组DNA的整合在多数情况下是随机的，整合位点能深刻影响到 转基因表达的水平和组织，以及发育模式。因而，许多转基因系通常 经过筛选每中转基因，从而鉴定和选择具有最合适表达状况的植物。

评价转基因系的转基因表达水平。最初确定RNA水平的表达以鉴 定和定量表达阳性植物。使用RNA分析的标准技术，包括Northern印 迹测定和核泄出测定(例如，Ausubel等，上述)。然后运用以上描 述的方法分析RNA阳性植物对GFLV感染的抗性。表达正义非翻译的 GFLV-CP序列的转化葡萄树与对照植物相比具有对扇叶病的抗性，在 本发明中有用。

所有在本说明书中提到的出版物和专利申请本文引用以供参考， 其程度如同特别和单独表明作为参考文献引用每个独立的出版物或专 利申请。 序列表 > Cornell研究基金公司 > 葡萄树中线虫传多面体病毒

> 07678/023WO2

> 60/060，384

> 1997-09-29

> 6

> FastSEQ for Windows Version 3．0

> 1

> 1542

> DNA

> Grapevine Fanleaf Virus Coat Protein Gene

>

> CDS

> (7)...,(1518)

> 1 gtgagt gga tta gct ggt aga gga gtg att tat atc cct aag gat tgc         48

Gly Leu Ala Gly Arg Gly Val Ile Tyr Ile Pro Lys Asp Cys

 1                5                  10 cag gca aat agg tac ttg ggc acc tta aat ata cga gat atg atc tca        96 Gln Ala Asn Arg Tyr Leu Gly Thr Leu Asn Ile Arg Asp Met Ile Ser 15                  20                  25                  30 gat ttt aag ggt gtc cag tac gaa aag tgg ata act gca gga tta gtc        144 Asp Phe Lys Gly Val Gln Tyr Glu Lys Trp Ile Thr Ala Gly Leu Val

            35                  40                  45 atg cct act ttt aga ata gtt gtt agg cta cct gca aat gcc ttt act        192 Met Pro Thr Phe Arg Ile Va1 Va1 Arg Leu Pro Ala Asn Ala Phe Thr

        50                  55                  60 gga ttg acg tgg gtg atg agc ttc gat gct tat aac cgg ata gct agt         240 Gly Leu Thr Trp Val Met Ser Phe Asp Ala Tyr Asn Arg Ile Ala Ser

    65                  70                  75 aga att act gct agt gcg gat cct gta tac act ctg tca gtc cca cat         288 Arg Ile Thr Ala Ser Ala Asp Pro Val Tyr Thr Leu Ser Val Pro His

80                  85                   90 tgg ctt atc cat cat aag ttg ggc acg ttt aca tgt gaa ata gac tat       336 Trp Leu Ile His His Lys Leu Gly Thr Phe Thr Cys Glu Ile Asp Tyr  95                 100                 105                 110 gga gaa ttg tgt ggt cac gcc atg tgg ttt aag tcc aca acc ttt gag       384 Gly Glu Leu Cys Gly His Ala Met Trp Phe Lys Ser Thr Thr Phe Glu

            115                 120                 125 tct ccg agg cta cac ttc acg tgc tta acg ggc aac aac aaa gag ttg       432 Ser Pro Arg Leu His Phe Thr Cys Leu Thr Gly Asn Asn Lys Glu Leu

        130                 135                 140 gcg gca gac tgg caa gct gtc gta gaa ctg tat gcg gaa ttg gaa gag       480 Ala Ala Asp Trp Gln Ala Val Val Glu Leu Tyr Ala Glu Leu Glu Glu

    145                 150                 155 gcc acg tcc ttc ctt ggg aaa cca act ttg gtt ttt gac cca ggt gct        528 Ala Thr Ser Phe Leu Gly Lys Pro Thr Leu val Phe Asp Pro Gly Ala

160                165                  170 ttt aat ggt aaa ttt caa ttc ctg act tgc cct ccc att ttc ttt gat        576 Phe Asn Gly Lys Phe Gln Phe Leu Thr Cys Pro Pro Ile Phe Phe Asp 175                 180                 185                 190 cta aca gcc gtt acg gct ctt agg agt act ggg cta acg tta gga caa        624 Leu Thr Ala Val Thr Ala Leu Arg Ser Thr Gly Leu Thr Leu Gly Gln

            195                 200                 205 gtc cca atg gtt ggt act acc aag gta tac aat cta aat agt act ctc        672 Val Pro Met Val Gly Thr Thr Lys Val Tyr Asn Leu Asn Ser Thr Leu

        210                 215                 220 gtg agt tgt att tta gga atg gga ggt act att aga gga agg gtg cac        720 Val Ser Cys Ile Leu Gly Met Gly Gly Thr Ile Arg Gly Arg Val His

    225                 230                 235 att tgt gcg cca atc ttc tat agt att gtt tta tgg gtt gtt agt gag        768 Ile Cys Ala Pro Ile Phe Tyr Ser Ile Val Leu Trp Val Val Ser Glu

240                 245                 250 tgg aac ggg acc act atg gat tgg aat gaa ctt ttc aaa tat ccc ggg        816 Trp Asn Gly Thr Thr Met Asp Trp Asn Glu Leu Phe Lys Tyr Pro Gly 255                 260                 265                 270 gtg tat gta gaa gag gac gga agt ttt gaa gtc aaa atc cgt tct cca        864 Val Tyr Val Glu Glu Asp Gly Ser Phe Glu Val Lys Ile Arg Ser Pro

            275                  280                285 tat cac cga act cct gct aga ttg ctt gct aac caa agc cag agg gat        912 Tyr His Arg Thr Pro Ala Arg Leu Leu Ala Asn Gln Ser Gln Arg Asp

        290                 295                 300 atg agc tct ctg aat ttc tat gca ata gca gga cct ata gct ccg tcg       960 Met Ser Ser Leu Asn Phe Tyr Ala Ile Ala Gly Pro Ile Ala Pro Ser

    305                 310                 3l5 ggt gaa act gca cga ctt cct ata gtc gtg cag att gat gaa atc gtg       1008 Gly Glu Thr Ala Arg Leu Pro Ile Va1 Val Gln Ile Asp Glu Ile Val

320                 325                  330 cgc cca gat ctc tct ctg cca agt ttt gaa gat gat tac ttt gta tgg       1056 Arg Pro Asp Leu Ser Leu Pro Ser Phe Glu Asp Asp Tyr Phe Val Trp 335                 340                 345                  350 gtg gac ttt tca gag ttc act ctt gac aaa gaa gaa atc gag att ggt       1104 Val Asp Phe Ser Glu Phe Thr Leu Asp Lys Glu Glu Ile Glu Ile Gly

            355                 360                 365 tct cgc ttc ttt gac ttt act tca aat act tgt aga gtg tct atg gga       1152 Set Arg Phe Phe Asp Phe Thr Ser Asn Thr Cys Arg Val Ser Met Gly

        370                 375                 380 gaa aat ccg ttt gct gct atg att gct tgt cat gga ttg cac agt ggc       1200 Glu Asn Pro Phe Ala Ala Met Ile Ala Cys His Gly Leu His Ser Gly

    385                 390                 395 gta ttg gac ctc aaa ttt caa tgg agt ctg aac acc gaa ttt ggc aag       1248 Val Leu Asp Leu Lys Phe Gln Trp ger Leu Asn Thr Glu Phe Gly Lys

400                 405                 410 agc agc ggg agc att aca att acg aag ctg gtg ggt gat aaa gcc aca       1296 Set Ser Gly Ser Ile Thr Ile Thr Lys Leu Val Gly Asp Lys Ala Thr 415                 420                 425                 430 ggc ttg gat ggg cct tct tgt gtt ttc gcc ata caa aag ctg gag gga       1344 Gly Leu Asp Gly Pro Ser Cys Val Phe Ala Ile Gln Lys Leu Glu Gly

            435                  440                445 act gca gag ttg ttg att ggg aat ttt gca gga gca aac cca aac tct       1392 Thr Ala Glu Leu Leu Ile Gly Asn Phe Ala Gly Ala Asn Pro Asn Ser

        450                 455                 460 cat ttc tct ctc tac agt cgg tgg atg gcg att aaa cta gat caa gca       1440 His Phe Ser Leu Tyr Ser Arg Trp Met Ala Ile Lys Leu Asp Gln Ala

    465                 470                 475 aag agt atc aaa gta ctc cgc gtt ttg tgt aaa cct cgt cca ggc ttt       1488 Lys Ser Ile Lys Val Leu Arg Val Leu Cys Lys Pro Arg Pro Gly Phe

480                 485                 490 agt ttt tat gga aga acc agc ttc cca gtc tagggtatct tactttaaaa         1538 Ser Phe Tyr Gly Arg Thr Scr Phe Pro Val 495                         500 gacc                                            1542

> 2

> 504

> 蛋白

> 萄树扇叶病毒外壳蛋白

> 2 Gly Leu Ala Gly Arg Gly Val Ile Tyr Ile Pro Lys Asp Cys Gln Ala  1               5                    10                  15 Asn Arg Tyr Leu Gly Thr Leu Asn Ile Arg Asp Met Ile Ser Asp Phe

         20                  25                  30 Lys Gly Val Gln Tyr Glu Lys Trp Ile Thr Ala Gly Leu Val Met Pro

     35                  40                  45 Thr Phe Arg Ile Val Val Arg Leu Pro Ala Asn Ala Phe Thr Gly Leu

 50                  55                   60 Thr Trp Val Met Ser Phe Asp Ala Tyr Asn Arg Ile Ala Ser Arg Ile  65                  70                  75                  80 Thr Ala Ser Ala Asp Pro Val Tyr Thr Leu Ser Val Pro His Trp Leu

             85                   90                 95 Ile His His Lys Leu Gly Thr Phe Thr Cys Glu Ile Asp Tyr Gly Glu

         100                 105                 110 Leu Cys Gly His Ala Met Trp Phe Lys Ser Thr Thr Phe Glu Ser Pro

     115                 120                 125 Arg Leu His Phe Thr Cys Leu Thr Gly Asn Asn Lys Glu Leu Ala Ala

130                 135                 140 Asp Trp Gln Ala Val Val Glu Leu Tyr Ala Glu Leu Glu Glu Ala Thr 145                  150                155                 160 Ser Phe Leu Gly Lys Pro Thr Leu Val Phe Asp Pro Gly Ala Phe Asn

            165                 170                 175 Gly Lys Phe Gln Phe Leu Thr Cys Pro Pro Ile Phe Phe Asp Leu Thr

        180                 185                 190 Ala Val Thr Ala Leu Arg Ser Thr Gly Leu Thr Leu Gly Gln Val Pro

    195                 200                 205 Met Val Gly Thr Thr Lys Val Tyr Asn Leu Asn Ser Thr Leu Val Ser

210                 215                 220 Cys Ile Leu Gly Met Gly Gly Thr Ile Arg Gly Arg Val His Ile Cys 225                 230                 235                 240 Ala Pro Ile Phe Tyr Ser Ile Val Leu Trp Val Val Ser Glu Trp Asn

            245                 250                 255 Gly Thr Thr Met Asp Trp Asn Glu Leu Phe Lys Tyr Pro Gly Val Tyr

        260                 265                 270 Val Glu Glu Asp Gly Ser Phe Glu Val Lys Ile Arg Ser Pro Tyr His

    275                 280                 285 Arg Thr Pro Ala Arg Leu Leu Ala Asn Gln Ser Gln Arg Asp Met Ser

290                  295                300 Ser Leu Asn Phe Tyr Ala Ile Ala Gly Pro Ile Ala Pro Ser Gly Glu 305                 310                 315                 320 Thr Ala Arg Leu Pro Ile Val Val Gln Ile Asp Glu Ile Val Arg Pro

            325                 330                 335 Asp Leu Ser Leu Pro Ser Phe Glu Asp Asp Tyr Phe Val Trp Val Asp

        340                 345                 350 Phe Ser Glu Phe Thr Leu Asp Lys Glu Glu Ile Glu Ile Gly Ser Arg

    355                  360                365 Phe Phe Asp Phe Thr Ser Asn Thr Cys Arg Val Ser Met Gly Glu Asn

370                 375                 380 Pro Phe Ala Ala Met Ile Ala Cys His Gly Leu His Ser Gly Val Leu 385                 390                 395                 400 Asp Leu Lys Phe Gln Trp Ser Leu Asn Thr Glu Phe Gly Lys Ser Ser

            405                 410                 415 Gly Ser Ile Thr Ile Thr Lys Leu Val Gly Asp Lys Ala Thr Gly Leu

        420                 425                  430 Asp Gly Pro Ser Cys Val Phe Ala Ile Gln Lys Leu Glu Gly Thr Ala

    435                 440                 445 Glu Leu Leu Ile Gly Asn Phe Ala Gly Ala Asn Pro Asn Ser His Phe

450                 455                  460 Ser Leu Tyr Ser Arg Trp Met Ala Ile Lys Leu Asp Gln Ala Lys Ser 465                 470                 475                 480 Ile Lys Val Leu Arg Val Leu Cys Lys Pro Arg Pro Gly Phe Ser Phe

            485                490                  495 Tyr Gly Arg Thr Ser Phe Pro Val

        500

ɯ

ᡢ

>DNA

>人工序列

>

>引物

> 3 cgtcagtcta gaccatggtg agaggattag ctggtagagg ag                               42

> 4

> 30

> DNA

>人工序列

>

> 引物

> 4 ctgtaccatg gtcttttaaa gtcagatacc                                                30

ɱ

ᡙ

>DNA

>人工序列

>

> 引物

> 5 acgttaccat ggtgtagagg attagctggt aga                                           33

> 6

> 32

> DNA

> 人工序列

>

> 引物

> 6 agtgctctcg agcaattgag acttttcaac aa                                            32

发明背景