技术领域

本发明涉及一种用作酶掺入到洗涤剂中的碱性蛋白酶；一种编码 该酶的基因：一种产生该酶的微生物；和一种含有该酶的洗涤剂组合 物。

技术背景

蛋白酶被广泛地用在各种洗涤剂中，例如衣用洗涤剂；化妆品组 合物；浴用添加剂；食品修饰剂；以及药物如消化辅助药和消炎药。

用于洗涤剂的蛋白酶最大量地按工业规模生产，因此占商品供应 的主要部分。上述蛋白酶的实例包括Alcalase和Savinase(Novo Nordisk公司的产品)、Maxacal(Genencor公司的产品)、Blap (Henkel公司的产品)、和蛋白酶K(KAP，Kao联合公司的产品)。

同时，进行了许多尝试以改善用在洗涤剂中酶类的特性。例如， 日本专利申请公开(kokai)6-70765号公开了一种对热和表面活性剂 高度稳定的酶。日本专利申请公开(kokai)9-121855号公开了一种 对如角蛋白等不溶蛋白起作用并且具有高度专一活性的酶。日本专利 申请公开(kokai)5-211868和9-121856号公开了一种在低温度范 围具有优异活性的酶。欧洲专利0130756号公开了一种增强酶对氧化 剂稳定性的方法。

在许多情况下，衣服上的污渍包括多种非蛋白诸如脂类和固体颗 粒的组分。因此，对上述复杂的污渍需要用优良去垢性的洗涤剂。为 了满足该需求，一般来说洗涤剂中掺入各种酶类和表面活性剂。

然而，尽管掺入了各种酶类，但假如存在复杂的污渍时，酶类不 稳定以及不表现稳定和足够的活性，酶类的作用就不能完全发挥。在 这一点上普通酶类并不令人满意。

发明公开

鉴于前面已描述，本发明者发现了一种碱性蛋白酶，该蛋白酶甚 至在高浓度的脂肪酸存在下也具有稳定的降解酪蛋白的活性，并且甚 至在复杂污渍存在条件下，如含有蛋白和皮脂的污渍，表现出优异的 去垢性。

相应地，本发明的一个方面提供一种具有下列物理化学特性的碱 性蛋白酶：

(ⅰ)起作用的pH范围

在4-13的广泛pH范围起作用并且在6-12的pH范围内有在最 适pH值时活性的80％或更多：

(ⅱ)pH范围的稳定性 在6-11pH范围内当在40℃下处理30分钟时，表现稳定；

(ⅲ)等电点 等电点为大约8．9-9．1；以及

(ⅳ)脂肪酸的影响 降解酪蛋白活性不被油酸所抑制。 本发明的另一方面，提供一种编码如上所述的碱性蛋白酶的基因。 本发明的再一方面，提供一种产生如上所述的碱性蛋白酶的微生 物。

本发明的再一方面，提供一种含有如上所述的碱性蛋白酶的洗涤 剂组合物。

附图简述

图1显示pH对碱性蛋白酶KP43活性的影响。图2显示pH对碱 性蛋白酶KP43稳定性的影响(40℃，30分钟)。图3显示pH对碱性 蛋白酶KP43稳定性的影响(10℃，24小时)。图4显示温度对碱性 蛋白酶KP43活性的影响。图5显示温度对碱性蛋白酶KP43稳定性的 影响。图6显示氧化剂(50mM过氧化氢)对碱性蛋白酶KP43活性的 影响。图7显示KP9860蛋白酶的N-末端序列和其部分降解产物。图 8显示根据KP9860蛋白酶的N-末端序列设计的引物序列。图9显示 57 bp的PCR扩增片段和设计的引物。

实施本发明的最佳方式

本发明的碱性蛋白酶具有上面所述的从(ⅰ)至(ⅳ)的物理化学 特性。这些特性中，特性(ⅳ)尤为重要。所述的碱性蛋白酶在10mM 的油酸、皮脂组分的存在下具有降解酪蛋白的活性，其活性与在缺乏 油酸时一样高。

优选的本发明的碱性蛋白酶(ⅴ)具有大约43，000的估计分子量， 该值由SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确定。

特别优选的是除了(ⅰ)至(ⅴ)特性外，还具有如下所述的从(ⅵ) 至(ⅸ)特性的碱性蛋白酶。

(ⅵ)作用温度和最适的温度

在60℃-70℃的最适温度下起作用，并且也在低于20℃或更低的 温度下作用；

(ⅶ)金属离子的影响 活性被Hg2+和Cu2+抑制而热稳定性被Ca2+所增强；

(ⅷ)抑制剂的影响

活性不被乙二胺四乙酸(EDTA)和对氯汞苯甲酸(PCMB)所抑 制，但被二异丙基氟代磷酸(DEP)和苯甲基磺酰氟(PMSF)所抑制。

(ⅸ)表面活性剂的影响

活性不被线性烷基苯磺酸钠、聚氧乙烯烷基硫酸钠、十二烷基磺 酸钠、α-烯属磺酸钠或α-磺基脂肪酸酯所抑制。

优选的本发明的碱性蛋白酶具有由序列No．1或2、或其中一个或 多个氨基酸被缺失、替换或添加的上述序列所显示的氨基酸序列。序 列No．1与序列No．2不同，在于在序列No．2中的第3位的赖氨酸被 缺失。在序列Nos．1和2中的Xaa指的是一种任意的氨基酸。在序列 No．2中每个部位的Xaa的优选氨基酸在下列表中显示。 表

位置    位置

24    Ser或Asn    30    Gly或Asp

33    Asn或Thr    47    Ala或Val

48    Lys或Ser    54    Gly或Arg

71    Pro或Leu    75    Gln或Leu

90    Ile或Val    103   Gln或Lys

106   Lys或Thr    129   Lys或Gln

131   Ala或Lys    132   Thr或Val

133   Ser或Arg    134   Thr或Ser

147   Ile或Lys    149   Arg或Lys

161   Glu或Thr    166   Val或Leu

173   Lys或Asn    184   Gln或Glu

188   Phe或Tyr    189   Ala或Val

190   Ile或Ala    195   Leu或His

287   Ser或Ala    307   Gly或Ser

325   Tyr或Phe    370   Gly或Arg

432   Phe或Tyr    502   Ile或Val

532   Ser或Ala    542   Ser或Thr

585   Gln或Arg    592   Thr或Ser

593   Ser或Ala    595   Tyr或Phe

596   Asn或Asp    597   Asp或Asn

612   Ala或Ser    633   Thr或Asn

在本发明碱性蛋白酶中的缺失、替换和添加没有特别限制。然而， 在序列No．1或2中显示的氨基酸序列优选地70％或更高量的保守性， 更优选的80％或更高。特别优选的90％或更高的保守性。

该碱性蛋白酶的实例包括具有由序列号3、4或5、或其中一个或 多个氨基酸被缺失、替换或添加的上述序列所显示的氨基酸序列。

通过培养芽孢杆菌属的产碱性蛋白酶的微生物，然后从培养液中 收集该酶，可生产本发明的碱性蛋白酶。根据本发明产生碱性蛋白酶 的微生物的实例包括芽孢杆菌属的野生型菌株和一种含有编码具有上 述氨基酸序列的肽的基因的转化体。野生型菌株的实例包括KP- 43、KP-1790和KP-9860。这些菌株的真菌学特点在以下显示。

表1-a

    KP43     KP1790     KP9860  A．形态学特征 (a)格兰氏染色 阳性 阳性 阳性 (b)氨肽酶 未确定 未确定 未确定 (c)运动性 有 有 有 (d)鞭毛 有绿毛鞭毛 有绿毛鞭毛 有绿毛鞭毛 (e)孢子(类型、形状、     位点、肿大) 形成孢子， 椭圆形， 中心，   无肿大 形成孢子， 椭圆形， 中心，   无肿大 形成孢子， 椭圆形， 中心至末 端，肿大 B．生理学特征 (a)硝酸盐还原性 阴性 阴性 阴性 (b)吲哚的产生 阴性 阴性 阴性 (c)生长pH范围 能在pH 6．2 -11．7下生 长，pH 8- 10生长良好 能在pH 6．2 -11．7下生 长，在 pH  8．5-10下 生长良好 能在pH 6．2 -10．0下生 长，大约在 pH 9下生长 良好 (d)对氯化钠的抗性 不能生长在 ≥7％NaCl下 不能生长在 ≥7％NaCl下 不能生长在 ≥7％NaCl下 (e)生长温度范围 10-40℃ 10-40℃ 20-40℃ (f)β-半乳糖苷酶 阳性 阳性 阳性 (g)Arginine dihydrolase 阴性 阴性 阴性 (h)Lysine dihydrolase 阴性 阴性 阴性 (i)氧化酶 阳性 阳性 阳性 (j)柠檬酸利用性 阴性 阴性 阴性 (k)尿素的利用性 阴性 阴性 阴性 (l)过氧化氢酶 阳性 阳性 阳性 (m)从葡萄糖和硝酸盐产 阴性 阴性 阴性     生气体 (n)在厌氧条件下生长 阴性 阴性 阴性 (o)V-P测验 阴性 阴性 阴性

(续表1-b)

表1-b                      KP43      KP1790    KP9860 (p)从糖类的酸产生     D-葡萄糖     +     ±     +     L-阿拉伯糖     -     -     -     D-木糖     -     -     -     D-甘露醇     +     +     +     D-半乳糖     ±     -     -     蔗糖     +     +     +     D-甘露糖     +     ±     +     肌醇     -     -     -     D-山梨糖醇     +     -     -     海藻糖     ±     +     +     乳糖     -     -     -     甘油     -     -     -     麦芽糖     +     ±     +     D-果糖     +     +     +     棉子糖     -     -     -     蜜二糖     +     -     -     淀粉     +     +     +

根据上述真菌学特征，参考在“Bergery”氏系统细菌学手册的有 关描述，检测三种菌株(Williams和Wilkins Co．，1984)，可认为 它们属于芽孢杆菌属。然而，这些菌株是新颖的微生物，因为这些物 种的特性不完全与那些属于芽孢杆菌属的已知物种的特性相匹配。因 此，该三种菌株以Bacillus sp．KSM—KP43(FERM BP-6532)、 Bacillus sD．KSM-KP1790(FERM BP-6533)和Bacillus sp． KSM-KP9860(FERM BP-6534)的名称保藏在通商产业省工业技 术院生命工学和人体技术研究所(日本茨城县筑波市东1丁曰1番3 号，305-0046)，最初保藏日期1996年9月18日。

为了利用上述菌株生产本发明的碱性蛋白酶，将菌株接种在含有 能同化的碳源、氮源和必需营养成分的培养基中，通过常规方法培养。

按照常规应用于收集和纯化的普通酶的方法，从上面得到的培养 液中，进行目标碱性蛋白酶的收集和纯化。例如，通过离心法和过滤 法从培养液中分离细胞，然后通过常规纯化方法从该上清液中得到目 标碱性蛋白酶。上述得到的酶液可按上述方法应用，或通过熟知的方 法进一步纯化和结晶。

另外，本发明的碱性蛋白酶可通过下列步骤产生：得到编码该碱 性蛋白酶的基因；使用该基因制备重组载体；培养获得的转化体；然 后从培养产物中收集该目标碱性蛋白酶。

编码本发明碱性蛋白酶的基因可从上述三种菌株中的任一种克 隆。克隆可通过熟知的方法进行。这些方法的实施例包括(1)鸟枪方 法，该方法包括应用合适的限制性核酸内切酶，通过完全或部分消化 染色体DNA，制备DNA片段；将该片段结合到合适的载体中；然后 导入到大肠杆菌或枯草芽孢杆菌中表达，(2)合成合适的引物，通过 PCR克隆靶基因的方法。

本发明碱性蛋白酶的核苷酸序列的实例在Nos．3～5中显示。该核 苷酸序列并不局限于序列Nos．3～5，能接受的序列可以包括编码在序 列No．1或2的氨基酸序列的核苷酸序列，也包括编码其中一种或多种 氨基酸缺失、替换或添加的氨基酸序列的核苷酸序列。这些序列中， 由序列Nos．3～5表示的核苷酸序列，或者其中一个或多个氨基酸被缺 失、替换或添加的上述序列是优选的。在这些情况中，优选的缺失、 替换或添加在上述氨基酸序列的变异体中产生。

为了制备包括上述编码碱性蛋白酶基因的重组载体，所述的基因 可结合到适于在目的宿主中进行基因表达的任意载体中。这些载体的 实例包括pUC18、pBR322和pUC19，这是在大肠杆菌用作宿主时； 以及枯草芽孢杆菌用作宿主时的pUB110。

使用由此获得的重组载体，通过诸如原生质体法或感受态细胞法 等常规方法，转化宿主。虽然对宿主没有具体的限制，微生物是优选 的。实施例包括诸如属于芽孢杆菌属微生物的革兰氏阳性细菌、如大 肠杆菌的革兰氏阴性菌、属于糖酵母属的酵母，以及属于曲霉的真菌。

为了通过培养所得到的转化体生产本发明的碱性蛋白酶，可使用 上述野生菌株所采用的方法相一致的方法，进行培养、收集和纯化。

如上面所述，本发明的碱性蛋白酶具有对碱性条件优异的抗性， 并且甚至在脂类存在下拥有优异的蛋白酶活性。因此，该碱性蛋白酶 是可用于掺入到各种洗涤剂组合物的酶。

对于掺入到洗涤剂组合物中的上述碱性蛋白酶的数量，没有具体 限制，优选地以1kg洗涤剂组合物计量为0．1-5000U，特别优选的是 每kg洗涤剂组合物中加入1-500U。

熟知的洗涤剂组分可以掺入到含有碱性蛋白酶的本发明的洗涤剂 组合物中。例如，可以采用在WO 94／26881所描述的组分(p5页，右 上角栏，14行-右下角栏，29行)。

表面活性剂以0．5％-60％总重量比的用量掺入到洗涤剂组合物中 (自此之后简化为“％”)，掺入到粉状洗涤剂组合物中特别优选的 用量为10％-45％，而掺入到液体洗涤剂组合物中特别优选的用量为 20％-50％。当本发明的洗涤剂组合物用作漂白洗涤剂组合物或用于 自动洗碗机的洗涤剂组合物时，一般掺入表面活性剂的用量为1％- 10％，优选地为1％-5％。

二价金属离子捕捉剂以0．01％-50％的用量掺入，优选地为5％ -40％。

碱性剂和无机盐以用量0．01％-80％掺入，优选地为1％-40％。

抗再沉积剂以用量0．001％-10％掺入，优选地为1％-5％。

洗涤剂组合物可以含有除了本发明的碱性蛋白酶之外的酶类。实 施例包括纤维素酶、淀粉酶、原果胶酶、果胶酶、脂酶、半纤维素酶、 β-葡糖苷酶、葡萄糖氧化酶和胆固醇氧化剂。这些酶类以用量 0．001％-5％掺入，优选地为0．1％-3％。

诸如过氧化氢或过碳酸盐的漂白剂优选地以用量1％-10％掺入。 当漂白剂掺入时，漂白活化剂以用量0．01％-10％掺入。

掺入到组合物中荧光剂的实施例包括联苯化合物，如Cinopearl CBS-X和1，2-二苯乙烯化合物如DM-型荧光剂。优选地荧光剂的 用量为0．001％-2％。

上面所描述的洗涤剂组合物可以加工成诸如液体、粉末和颗粒等 各种形态。洗涤剂组合物可用于洗衣房、自动洗碗机、排水管、和牙 科，也可用作漂白剂。

实施例

实施例1(产生碱性蛋白酶的微生物的筛选)

土壤样品(1g)悬浮在生理盐水溶液(10ml)中，80℃加热处理 10分钟，接着接种到用于产生碱性蛋白酶微生物的液体富集培养基中， 该培养基含有下列组合物，然后在20℃培养。在相同的培养基中重复 亚培养富集大约三次后，培养过的产物涂布到用于判别蛋白酶产生的 平板上，然后在20℃培养5-7天。挑选由降解脱脂乳形成周围透明区 的集落，用作收集产蛋白酶的微生物。通过上述过程，得到Bacillus sp． KSM-KP43株、KSM-KP1790株和KSM-KP9860株，用作产生碱 性蛋白酶的微生物。

表2

筛选用液体富集培养基的组成 (pH 11) 磷酸二氢钾 0．1％ 硫酸镁 0．02％ 酵母提取物(Difco) 0．05％ 角蛋白(Tokyo Kasei) 1．0％ 葡萄糖 0．5％ 碳酸钠 0．3％

    筛选用琼脂平板培养基 营养琼脂(Difco) 2．3％ 脱脂乳(Difco) 0．3％ 碳酸钠 1．0％

实施例2

在实施例1获得的Bacillus sp．KSM-KP43菌株接种在液体培 养基中，该液体培养基包含蛋白胨S(1％)、酵母提取物(0．05％)、 磷酸钾(0．1％)、硫酸镁(0．02％)、葡萄糖(分别灭菌)(1％)和 碳酸钠(分别灭菌)(0．5％)，然后在30℃培养24小时。在上清液 中的酶浓度大约为1．5U/L。在搅拌下4℃离心分离的上清液中，加入 粉末硫酸铵，以达到90％的饱和浓度。在4℃搅拌条件下维持溶液一 个完整的白天和晚上，然后离心收集产生的沉淀物。得到的沉淀物溶 解在10mM的Tris-盐酸缓冲液(pH 7．5)，其中含有5mM的氯化钙 中，然后用缓中液透析。接着，透析过的液体被加到DEAE-葡聚糖FF 柱(Pharmacia的产物)，该FF柱已事先用含有5mM氯化钙的10mM Tris-盐酸缓冲液中(pH 7．5)，因此收集非吸附的级分。分级分离过 的液体通过含有2mM氯化钙的50mM HEPES缓冲液(pH 7．5)透析， 然后用相同缓冲液平衡过的SP-Sepharose FF柱中，然后收集非吸 附级分之后稍微抽提的活性级分。当以15％重获率的活性级分用作样 品时，进行SDS-聚丙烯酰胺电泳，结果对各个酶获得单一泳带。

实施例3

获得的Bacillus sp．KSM-KP1790菌株和KSM-KP9860菌株 培养在实施例2中所用的相同培养基中，然后按实施例2相同方式纯 化的碱性蛋白酶。

实施例4

检测在实施例2和3中获得的碱性蛋白酶的酶特性。这些实验的 方法和结果见下面描述。

Ⅰ．用于实验的材料和方法

(1)活性测定方法

(a)酪蛋白用作底物的方法

1mL 50 mmol／L含有1％(w／v)酪蛋白(Hammerstein：Merck Inc．的产品)的各种缓中液维持在40℃5分钟后，将0．1mL酶溶液 加到该溶液中，然后在40℃温育10分钟。加入2mL的TCA溶液 (0．11mol／L三氯乙酸：0．22 mol／L乙酸钠：0．33 mol／L乙酸)以终止 反应，然后将混合液在室温下放置10分钟。接着，过滤酸变性的蛋白 (No．2滤纸：Whattmann的产品)。往0．5 mL滤液中加入2．5 mL碱 性铜试剂(1％(w／v))酒石酸钠钾：1％(w／v)硫酸铜：2％(w／v) 碳酸钠、0．1 mol／L氢氧化钠=1∶1∶100(v／v))，该溶液在30℃维 持10分钟后，加入0．25 mL稀释过的酚试剂(酚试剂(kanto化学公 司的产品)用去离子水稀释2倍)，在30℃维持30分钟后，该溶液在 660nm下进行吸光值测定。下列溶液用作空白：与上面所述的酶反应 系统和反应终止溶液混合，然后加入酶溶液。

酶活性的一个单位(P．U)定义为在以上反应条件下，每分钟释放 与1mmol酪氨酸相等的酸可溶性的蛋白降解产物的酶量。

(b)使用合成寡肽作底物的方法

0．05mL的50mmol／L合成寡肽溶液(溶于二甲基亚砜中的琥珀酰 -丙氨酰-丙氨酰-脯氨酰-亮氨酸对硝基苯胺)与0．9mL的 100mmol／L硼酸缓冲液(pH 10．0，含2mmol／L氯化钙)混合，该溶液 在30℃维持5分钟后，加入0．05mL的酶溶液，然后在30℃温育10 分钟。加入2ml 5％(w／v)柠檬酸终止反应，然后在420nm测定吸光 率。

酶活性的一个单位(U)定义为在以上反应条件下每分钟释放与 1mmol酪氨酸相等的酸可溶解的蛋白降解产物的酶量。

(c)用血红蛋白作底物的方法

按照Anson的方法(M．L Anson，普通生理学杂志，22，79 (1983))，用尿素变性牛血清血红蛋白，然后用氢氧化钠调pH至10．5。 0．1mL的酶溶液(1．0×10-5～1．0×10-3A．U)加入到0．5 mL的底物 溶液中(对血红蛋白来说2．2％)，得到的溶液在25℃下温育10分钟。 往得到的溶液中加入1．0mL的4．9％三氯乙酸以终止反应。完成反应 后，进行离心(3，000rpm，10分钟)，然后根据Folin-Lowry法定量 测定在上清液中蛋白降解产物(O．H．Lowry等，生物化学杂志，193， 265(1951))。

酶活性的一个单位(A．U)定义为在上述反应条件下每分钟释放 与1mmol酪氨酸相等的酸可溶性的蛋白降解产物的酶量。

(2)最适pH

0．1mL酶溶液(3．0×10-5mP．U)被加入到lmL含有1％(w／v) 酪蛋白的50mmol／L Britlon-Robinson缓冲液中，然后根据酪蛋白法 测定活性。

(3)pH稳定性

酶溶液(8．0×10-4mP．U)混合到Britton-Robinson缓冲液中 (20mmol／L，含2mmol／L氯化钙)，接着在40℃处理30分钟或在 10℃处理24小时。冰冷却后，该处理过的溶液用50mmol／L硼酸缓冲 液稀释40倍，然后按照酪蛋白用作底物的方法测定残留活性。

(4)最适温度

0．1mL酶溶液(2．0×10-5mP．U．)被加入到1mL含有1％(w／v) 酪蛋白的50mmol／L硼酸缓冲液中(pH 10．0)，根据酪蛋白法在温度 10-80℃测定酶活性。

在两种系统中，即存在5mmol／L氯化钙和不存在5mmol／L氯化 钙时进行活性测定。

(5)热稳定性

在两种系统中即存在和缺乏5mmol／L氯化钙情况下，酶溶液 (2．5×10-4mP．U)被加到20mmol／L的硼酸缓冲液中(pH 10．0)， 然后在合适的温度下热处理10分钟。用水冷却后，该处理过的溶液用 50mmol／L硼酸缓冲液(pH 10．0)稀释5倍，然后用酪蛋白作为底物 测定残留活性。

(6)金属离子的影响

酶溶液(4．0×10-4mP．U)被加到含有1mmol／L不同金属盐的 20mmol／L硼酸缓冲液(pH 10．0)中，然后该产生溶液在30℃温育20 分钟。该溶液用50mmol／L硼酸缓冲液(pH 10．0)稀释5倍，接着用 酪蛋白作为底物测定活性。

(7)抑制剂的影响

酶溶液(1．0×10-3mP．U．)被加到含有各种抑制剂的10mmol／L 磷酸缓冲液(pH 7．0)，以达到预先确定的浓度，然后该溶液在30℃ 温育20分钟。接着，该溶液用去离子水稀释20倍，用酪蛋白作为底 物测定剩余活性。

(8)表面活性剂的影响

酶溶液(7．0×10-4mP．U．)被加到含有量为1％的溶解性表面活 性剂的100mmol／L硼酸缓冲液中，然后产生的溶液在40℃温育4小时。 该溶液用50 mmol／L硼酸缓冲液(pH 10．0)稀释20倍，用酪蛋白作为 底物测定剩余活性。

(9)氧化剂的影响(过氧化氢)

2．7mL含有过氧化氢和氯化钙的Britton-Robinson缓冲液(终浓 度：50mmol／L过氧化氢，2 mmol／L氯化钙，20mmol／L Britton- Robinson)(pH 8．0)，在30℃维持15分钟，然后加入0．3mL的酶溶 液。过了反应时间后，取0．8mL产生溶液的样品到预先准备的含有5μL 过氧化氢酶(Boehringer Mannheim Co．：20mg／L)的试管中，因此 终止氧化反应。每个样品用2mmol/L氯化钙适当稀释，按照合成寡肽 用作底物的方法测定剩余活性。

(10)脂肪酸的影响

应用含有1％(w／v)酪蛋白作为底物溶液的50mM磷酸缓冲液 (pH7)，在0-10mM油酸钠存在下20℃进行反应15分钟，然后用 酪蛋白作为底物测定活性。

Ⅱ．结果

(1)最适pH

检测pH对三种蛋白酶(KP43、KP1790和KP9860)的影响。图 1显示在每个和最佳pH相关活性(100％)正常化的pH值的KP43活 性，表明本发明蛋白酶的最佳工作pH范围为6-12。因此，这些酶在 十分宽工作pH范围表现为高降解蛋白活性。

(2)pH稳定性

放在40℃30分钟或10℃24小时后，在pH值范围测定KP43的 剩余活性。图2和3显示处理前酶活性(100％)有关的正常化剩余活 性。结果显示本发明的酶类在40℃处理30分钟后，在pH6-12范围 稳定，加入钙离子在pH 5下改善酶的稳定性。相似地，该结果显示本 发明的酶类在10℃处理24小时后在5-12广泛的pH范围稳定。

(3)最适温度

用酪蛋白作为底物，检测温度对蛋白酶的影响。图4显示KP43 在一定温度范围的活性，该值随缺乏钙离子最高活性(100％)标准化。 结果表示对所有三种蛋白酶来说，在缺乏钙离子时最适温度为60℃， 而存在钙离子时最适温度为70℃。因此，结果显示最适温度通过加入 钙离子向上漂移，用作洗涤剂的常规蛋白酶的情况也是如此。

(4)热稳定性

在30-80℃温度范围进行热处理10分钟(pH 10．0，存在和缺乏 5mol／L氯化钙)，然后测定剩余活性。图5显示在每个处理温度下KP43 的剩余活性，该值随处理前活性(100％)标准化。结果表示所述的蛋 白酶在缺乏氯化钙时温度直至60℃仍稳定，而加入氯化钙(5mmol／L) 对温度稳定性有影响，使其向上移动大约10℃。与商业途径购得的洗 涤剂酶类相比较，这些酶具有高度的温度稳定性，即，与Esperase的 稳定性相比较，在商业途径购得的酶类中表现为最优异的温度稳定性。

(5)金属离子的影响

在20mmol／L硼酸缓冲液(pH 10)中，用各种金属盐(1mmol／L) 在30℃下处理3种蛋白酶20分钟，然后测定剩余活性。该剩余活性用 相同方法处理但未加金属离子所获得的蛋白酶活性标准化(100％)(见 表3)。结果显示该活性被氯化汞和硝酸银所抑制，但该活性对其他金 属盐类极其稳定。

表3

金属盐 (1mM)     KP43 剩余活性(％)     KP1790     KP9860  未加     100     100     100  AgNO3     66     70     45  NiCl2     92     95     96  CaCl2     97     95     101  CoCl2     91     101     98  FeCl3     93     113     96  ZnCl2     85     94     91  CuCl2     91     96     94  HgCl2     38     37     33  MgCl2     92     103     100

处理条件：1mM金属盐，20mM硼酸盐缓冲液(pH 10．0)30℃，20

分钟

(6)不同抑制剂的影响

检测了一般酶抑制剂对本发明碱性蛋白酶的影响。各种抑制剂被 加到10mmol／L磷酸盐缓冲液中(pH 7．0)，以达到预先设定的浓度， 得到的溶液在30℃温育20分钟，自此之后测定剩余活性。该剩余活性 用缺乏抑制剂的上述相同方法处理所获得的蛋白酶活性标准化 (100％)(参见表4)。结果表明所有3种蛋白酶活性被二异丙基氟 磷酸(DFP)、苯甲基磺酰氟和胰凝乳蛋白酶抑制剂所抑制，这些都 是熟知的丝氨酸蛋白酶抑制剂。因此，可以认为本发明的蛋白酶在其 活性中心拥有丝氨酸残基。相反，未发现据报道抑制丝氨酸蛋白酶来 源于放线菌纲的antipine和亮氨酰抑蛋白酶肽的影响。

表4

    抑制剂     剩余活性(％)     浓度     (mM)     KP43  KP1790  KP9860     free     100     100     100     EDTA     5     110     97     101     EGTA     5     92     91     90     邻菲咯啉     5     100     103     100     DTT     5     104     102     105     PCMB     1     125     115     126     NEM     5     97     100     100     DEP     1     14     17     16     PMSF     1     0     0     0 胰凝乳蛋白酶抑制剂     0．1     87     87     80     Antipine     0．1     103     99     97 亮氨酰抑蛋白酶肽     0．1     102     101     93     E-64     0．1     104     99     103     弹性酶抑制剂     0．1     99     102     102 EDTA：乙二胺四乙酸    (Sigma) EGTA：乙二醇四乙酸    (Sigma) DTT：二硫苏糖醇    (Sigma) PCMB：对氯汞苯甲酸    (Sigma) NEM：N-乙基顺丁烯二酰亚胺(Sigma) DEP：二异丙基氟磷酸    (Sigma) PMSF：苯甲基磺酰氟    (Sigma)

(7)表面活性剂的影响

每种蛋白酶用在0．1mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH 9．0)的1％各 种表面活性剂40℃处理4小时，然后测定剩余活性。剩余活性用没有 处理的情况下的酶活性标准化(100％)(参见表5)，结果表明该3 种酶对典型的表面活性剂线性烷基苯磺酸盐(LAS)极其稳定。因此， 可以认为这些酶可用作含有表面活性剂的洗涤剂组分。

表5

    表面活性剂     (浓度：1％)     剩余活性   KP43    KP1790    KP9860 无表面活性剂     100    100    100 线性烷基苯磺酸钠(LAS)     100    88     100 聚氧乙烯钠     101    102    104 烷基硫酸酯(ES) 十二烷基磺酸钠(SDS)     104    97     103 α-烯属磺酸酯钠(AOS)     100    111    100 烷基硫酸钠(AS)     113    107    107 α-磺基脂肪酸酯(α-SFE)     112    113    105 Softanol 70H     109    109    104

处理条件：1％表面活性剂，100mM硼酸缓中液(pH 10．0)40℃，

4小时

(8)氧化剂的影响

每种蛋白酶用含有过氧化氢(pH 8．0)的50mmol／L Britton- Robinson缓冲液30℃处理，然后随着反应时间测定剩余活性。如在图 6所示，KP43表现为比商业途径购得的Savinase或KAP更高的稳定 性，并且显示与Durazyme(Novo Nordisk)一样高的稳定性， Durayme是应用蛋白工程技术开发的破坏对Savinase氧化剂抗性的 酶。

(9)脂肪酸的影响

如在表6所示，本发明的碱性蛋白酶活性不被皮脂的组分之一油 酸所抑制。

表6

    存在脂肪酸时的相对活性(％)     油酸浓度(mM)     0     1     2     5     10  KP43蛋白酶     100     100     100     103     119  KP1790蛋白酶     100     100     100     103     121  KP9860蛋白酶     100     100     100     100     106

实施例5(克隆编码KP9860蛋白酶的基因)

(1)KSM-KP9860基因组DNA的制备

KSM-KP9860菌株在液体培养基中(0．5％葡萄糖、0．2％蛋白胨 -S、0．05％酵母提取物、0．1％KH2PO4·7H2O、0．26％NaCO3：pH 9．0) (500mL)，30℃培养2天，然后由离心法收集细胞。通过Saito和 Miura(生物化学生物物理学报72，619(1963))的方法，从所获得 的细胞中制备基因组DNA。

(2)KP9860蛋白酶的有限蛋白水解

1)KP9860蛋白酶的变性

KP9860蛋白酶(5mg／mL)    45μL

PMSF(100mM)              20μL

EDTA(200mM)              10μL

SDS(0．08mg／mL)         25uL

具有上述组分的蛋白酶溶液在沸水中加热10分钟。蛋白酶溶液用 乙酸铵(2mM)透析，用该方法移去SDS、EDTA和PMSF，然后冷 冻干燥。接着，冻干的蛋白酶溶解在蒸馏水中(100μL)，至此用作变 性蛋白的样品。

2)通过胰蛋白酶的有限蛋白水解

变性的蛋白样品               100μL

胰蛋白酶(1μg／mL，sigma)    100μL

1M Tris-HCl(pH 7．5)         50μL

蒸馏水                       750μL

在含有上述组分的溶液中，胰蛋白酶与1)中制备的变性蛋白在 冰中反应3个小时。加入300μL SDS(0．08mg／mL)、100μL EDTA (200mM)和200μL的PMSF(100mM)后，在沸水中热处理3分钟 终止有限的蛋白水解。

通过对乙酸铵(2mM)的透析，移去SDS、EDTA和PMSF，然 后所述的溶液冷冻干燥。接着，冷冻干燥物溶解在蒸馏水中(100μL)， 至此用作SDS-PAGE的样品。

3)部分降解产物的重新获得

在2)中获得的样品用12％J型制备凝胶(Bio-Rad的产品) 进行SDS-PAGE。蛋白泳带通过快速CBB染色溶液(Bio-Rad的产 品)染色检测。含有蛋白泳带的凝胶用剃刀切下，然后将凝胶条在1．5mL 离心压碎成碎片。用于SDS-PAGE的缓冲液(组分：甘氨酸14．4％ (w／v)、Tris 3．03％、SDS(Bio-Rad的产品)10％)，以5倍体 积加入到压碎的凝胶中，在室温下搅拌该混合液，至此抽提蛋白泳带。 抽提液对乙酸铵(2mM)透析。然后冷冻干燥。冷冻干燥过的样品用 在476A型蛋白序列仪(应用生物系统公司的产品)上测定N-末端的 序列。

所获得的N-末端序列在图7显示。

(3)PCR

合成了相应于所获得的N-末端序列+链和-链的5’末端20-30 个核苷酸的引物。应用模板DNA(100ng)、引物(20pmol)和PwoDNA 聚合酶(Boehringer Mannheim公司的产品)，在100-μL反应体系 中进行PCR反应。当进行反相PCR时，在50-μL反应系统中用 ExpandTM长模板PCR体系(Boehringer Mannheim公司的产品)进 行。用9860-N2和9860-25k-RV这些引物进行PCR，产生一条 527bp的DNA片段。

(4)PCR产物的亚克隆

用高纯度PCR产物纯化试剂盒(Boehringer Mannheim公司的产 品)纯化PCR产物，然后用连接试剂盒Ver．2(Takara公司的产品)， 16℃反应过夜使PCR产物插入到pUC18的Sma I位点。混合得到的 重组质粒和感受态细胞大肠杆菌JM 109菌株(Takara公司的产品)， 将混合物进行热休克(42℃，45秒)，然后转化到大肠杆菌JM 109细 胞中。往细胞中加入LB。在37℃维持1小时后，混合物涂到含有IPTG (0．1mM，Sigma)、X-gal〔0．004％(w／v)，Sigma〕和氨苄青霉素 (50μg／mL，Sigma)的LB平皿上。在37℃下培养过夜，选出生长的 白色集落，即为具有重组质粒的转化体。

(5)核苷酸序列的测定

在含有氨苄青霉素(50μg／mL)的LB中，转化体在37℃下培养 过夜，然后通过离心法收集细胞。应用高纯度质粒分离试剂盒 (Boehringer Mannheim公司的产品)获得重组的质粒。通过使用引 物和DNA测序试剂盒(PERKIN ELMER公司的产品)，在20μL反 应体系中进行测序用PCR、所获得的重组质粒(1μg)被用作模板DNA。 反应产物通过应用快速离心柱(Boehringer mannheim公司的产品) 纯化，然后用离心蒸发机干燥。使用377型DNA测序仪(应用生物系 统公司的产品)对上述处理过的样品进行分析。

通过PCR获得的该DNA片段拥有的氨基酸序列与KP-9860蛋 白酶的N-末端序列相匹配，而观察过的序列与形成诸如枯草芽孢杆 菌蛋白酶等碱性蛋白酶活性中心的3个氨基酸(Asp、His、Ser)中， 近Asp和His的共同序列相匹配。因此，可以认为该DNA片段是KP -9860蛋白酶基因的一部分。

(6)DNA杂交

用EcoR Ⅰ、Sac Ⅰ、Kpn Ⅰ、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ、Xho Ⅰ、 Pst Ⅰ和Bgl Ⅱ处理KP9860的染色体。使用所获得的527 bp DNA 作探针进行DNA杂交，因此检测互补的区域。

结果，除了Kpn Ⅰ处理的泳道外的各泳道中观察到杂交带。

(7)反向PCR

应用根据获得的527 bp序列合成的引物(1-4(图9))进行反 向PCR。使用限制性内切酶，即EcoRⅠ、HindⅢ、PstⅠ、和BglⅡ完全 消化KP-9860的染色体，然后使用连接试剂盒Ver．2(Takara公司的 产品)处理每个样品以环化。每种产生的反应混合液用作反向PCR的 模板DNA。应用上面所述的模板DNA(0．1μg)、引物1和4(分别 为10 pmol)和扩增长模板PCR体系试剂盒进行PCR反应(条件； (94℃-10秒、60℃-30秒、68℃-4分钟)×10个循环；(94℃-10 秒、60℃-30秒、68℃-4分钟+20×循环数)×20个循环；68℃-7 分钟和4℃-1分钟)。另外，使用来源于EcoRⅠ消化的染色体的模板 DNA(0．1μg)、引物2和3(分别为10pmol)和扩增长模板PCR体 系试剂盒，进行PCR(条件如上面所描述)。所产生的扩增DNA片段 通过用高纯度PCR产物纯化试剂盒纯化，然后用DNA钝化试剂盒 (Takara公司的产品)把末端转变成钝端。每种获得的DNA片段与 SmaⅠ消化的pUCl8混合，该混合液用连接试剂盒Ver．2处理。如上面 所述，大肠杆菌JMl09菌株被重组质粒转化，所获得的重组质粒用作 测序用的模板DNA。由此，测定了所扩增的DNA片段的核苷酸序列。

(8)KP-9860蛋白酶基因的完整核苷酸序列的分析

序列测定的结果表明KP-9860蛋白酶基因含有编码1917 bp、 639个氨基酸残基的开读框(ORF)，并且该OFR含有一个与纯化的 KP9860蛋白酶的N-末端序列相匹配的区域 (NDVARHIVKADVAQSSYGLY)。从N-末端序列判别，推导出 KP9860蛋白酶基因的突变区为1302 bp，编码434个氨基酸残基(序 列数3，分子量4．5310 Da)。0RF的上游，推断所观察到序列中拥 有一个启动子区(-35区：ttgtgt，-10区：tacgat)和一个核糖体结 合位点(SD序列：aggagt)。终止密码子(taa)的下游，有一个颠倒 的重复区，具有自由能为-26．2 kcal／mol，推断其为终止子。

重复实施例5的方法，由此分析KP-43蛋白酶和KP-1790蛋白 酶的每个基因的完整核苷酸序列和氨基酸序列。结果在序列Nos．4和 5中显示。

实施例6

清洗测验

根据JIS K 3371的方法进行洗涤测验。其组合物在表7显示的洗 涤剂溶解在含有71．2mg CaCO3／L(4°DH)的水中，从调整浓度，往 洗涤剂溶液中加入每种蛋白酶，根据Anson-Hemoglobin方法调整碱 性蛋白酶的浓度至40mAPU／L(见表8)。

衬衫的领子(穿了3天)用作样品。作为比较，领子的布料剪成 大约8cm×8cm的大小，使用Terg-O-Tometer(Ueshima Seisakusyo)添加酶或不添加酶的情况下，该布料在15℃和100rpm清 洗10分钟。清洗和干燥后，比较成对的领子布料(15对)。并由视觉 判别法评价。当污渍几乎完全被清洗掉时，设定评价值为5，而当污渍 难以清洗掉时，设定评价值为1，然后计算15个样品的总分。清洁力 指数以未加酶的洗涤剂组合物的清洁力作为100，每种组合物的分数值 表示。结果在表8显示。

表7 (重量％) 化合物(％)     洗涤剂A     洗涤剂B     洗涤剂C  LAS     23.0     4.0     20.0  AS     4.0  AE     5.0  AEP     5.0  AES     20.0 脂肪酸盐     3.0     2.5     2.0 沸石     22.0     20.0 碳酸钠     15.0 碳酸钾     3.0 非晶型硅酸盐     7.0     7.0 晶型硅酸盐     4.0 亚硫酸钠     2.0     0.5     2.0 硫酸钠     2.0     23.0 AA-MA     5.0 柠檬酸     10.0 PEG     2.0     2.0 单乙醇胺     8.0 乙醇     5.0 水     3.0     balance     7.0 形式     G*     L**     G* 使用浓度     20g/30L     20g/30L     40g/30L 清洗后pH     10.7     9.2     8.0 *)G代表颗粒。 **)L代表液体。 LAS：烷基苯磺酸线性钠(自由酸掺入到液体洗涤剂中) AS：烷基硫酸盐 AE：聚氧乙烯月桂醚(平均EO添加4摩尔) AEP：聚氧乙烯聚氧化丙烯月桂醚(平均EO添加8摩尔，平均PO      添加3库尔)

AES：烷基硫酸醚(平均EO添加2．5摩尔)

脂肪酸：棕榈油衍生的脂肪酸钠盐

沸石：沸石4A，平均颗粒体积3μm

碳酸钠：致密灰

非晶型硅酸盐：JIS 2号硅酸钠

晶型硅酸盐：粉末SKS-6(Hoechst Tokuyama公司的产品)，

平均颗粒体积15μm

AA-MA：Sokalan CP5，丙烯酸-马来酸共聚物(BASF产品)

PEG：聚乙二醇，平均分子量8．000

表8

    蛋白酶 清洁力指数     洗涤剂A 发明1的洗涤剂 杆菌sp．KSM-KP43 (样品2)     106 发明2的洗涤剂 杆菌sp．KSM-KP1790 (样品3)     106 发明3的洗涤剂 杆菌sp．KSM-KP9860 (样品3)     105 比较洗涤剂1  Savinase 120T type White_ (Novo Nordisk)     103．5 比较洗涤剂2  Durazym 6．0T_ (Novo Nordisk)     103．5 比较洗涤剂3 无     100

表8说明，甚至在相同的活性条件下，与含有常规蛋白酶的洗涤 剂相比较，含有本发明的酶的洗涤剂组合物(洗涤剂A)表现为更超 级的清洁力。洗涤剂B和C也表现为本发明的优异清洁力。

实施例7

根据日本专利申请公开(kokai)62-257990所披露的方法，使用 纯化的本发明蛋白酶样品制备颗粒产品，该蛋白酶样品来源于Bacillus sp．KSM-KP43、KSM-KP1790、或KSM-KP9860并且在实施例2 或3中制备。该颗粒产品(6APU／g)(按重量计为1份)掺入到每种 具有在表9中显示组合物的洗涤剂中(按重量计为100份)，由此获 得本发明的洗涤剂组合物。当该洗涤剂为颗粒型时，由游离组分的颗 粒洗涤剂基本原料即酶、PC、AC-1和AC-2与颗粒化酶、颗粒化PC、 颗粒化AC-1和颗粒化AC-2混合而制备上述洗涤剂。每种洗涤剂以 使用浓度溶于含有71．2mg CaCO3／L(4°DH)的水中，然后按实施 例6所描述的方法清洗衣领。在此产生的洗涤剂表现为优异的清洗能 力，用作衣用洗涤剂。

表9     组分     (％)     本发明的洗涤剂    4     5     6     7     8     9     10     11     12     13  LAS-2    20    20．5     12     5     10  LAS-3     15  AS-2     5     10     20  SAS     3  AOS     3  SFE     8 脂肪酸盐     2     6     4     10     3     3     2     1．5  AES-2     20  AE-3     3     10  AE-4     3     3     15     15     3     15  AE-5     2     20     20     25  AG     5     7 沸石     30     18    15     15     10     20 吸附油的载体     10     12 晶型硅酸盐     20 非晶型硅酸盐     12     1     8    10      5  STPP    25．5     20 碳酸钠     10     27     25     10    10     15   17．5    0．1 碳酸钾     3     2     5 亚硫酸钠     2     2     1    0．2     0．2    0．2 硫酸钠     4．5    1．5     1     11      8     10 柠檬酸钠     4     2     5    1．5     1     1  NTA      2 单乙醇胺     4     5     6  PAA     1     1．5     3  AA-MA     3     3     5  CMC     2

    组分     (％)     本发明的洗涤剂 4     5     6     7     8     9     10     11     12     13  PEG 5     2     2     2     2  1．5  PVP     2 荧光染料 0．3  0．3  0．3  0．3  0．3  0．3  0．3  0．1  0．1    0．1 香水 0．2  0．2  0．2  0．2  0．2  0．2  0．2  0．3  0．3    0．3 水 4     5     3  0．5     6     1     5  43．7  38．2   30．2 乙醇     5     5     5 丙二醇     2     5     5 酶 2     2     2     3     3     2     2  0．1  0．2    0．2  PC     3     3     10     3  AC-1     2  AC-2     1 总计 100   100    100   100  100  100  100  100  100    100 形式 G* G* G*  G* G* G* G* L** L** L** 使用浓度 20g／ 30L  20g／ 30L  20g／ 30L  20g／ 30L  20g／ 30L  20g／ 30L  20g／ 30L  20mL ／30L  20mL ／30L  20mL ／30L

*)G代表颗粒

*)L代表液体

LSA-2：用48％NaOH中和的烷基苯磺酸(C10-C14烷基链)

LSA-3：用50％NaOH中和的烷基苯磺酸(C10-C14烷基链)

AS-2：Dovanol 25硫酸钠盐(C12-C15硫酸盐)

SAS：C13-C18烷烃磺酸钠

AOS：α-烯属磺酸酯钠盐

SFE：棕榈油磺基脂肪酸甲酯钠盐

脂肪酸盐：棕榈酸钠

AES-2：聚氧乙烯烷基(C12-C15)醚硫酸钠(平均EO添加 2摩尔)

AE-3：C12-C13乙醇的EO加合物(平均3摩尔)

AE-4：C12-C15乙醇的EO加合物(平均7．2摩尔)

AE-5：C12-C15次级乙醇的EO加合物(平均7摩尔)

AG：烷基(衍生于棕榈油)葡糖苷(平均聚合化程度为1．5)

吸收油载体：非晶型硅铝酸钠，油吸收率为235mL／100g

晶型硅酸盐：SKS-6(δ-Na2Si2O5，晶型成层硅酸盐，平均颗粒 大小20μM)

非晶型硅酸盐：JIS No．1硅酸钠

STPP：三聚磷酸钠

NTA：次氮基三乙酸酯钠

PAA：聚(丙烯酸)钠盐，平均分子量为12，000

AA-MA：丙烯酸／马来酸共聚物

CMC：羧甲基纤维素钠

PEG：聚乙二醇，平均分子量6，000

PVA：聚乙烯吡咯烷酮，平均分子量为40，000，K值为26-35

荧光染料：Tinopal CBS和Whitex SA(1∶1(重量))，仅 Cinopeanl掺入到液体洗涤剂中

香水：一种在日本专利申请公开(kokai)No．8-239700披露的 香水组合物

酶：Lipolase 100T、Termamyl 60T和KAC 500_(Kao联合 公司的产品)1∶1∶1(以重量计)

PC：过碳酸钠，平均颗粒大小400μm，用偏硼酸钠包被

AC-1：四乙酰乙二胺

AC-2：月桂酰氧基苯磺酸钠

实施例8

在表10显示的组分中，用搅拌法混和过碳酸钠和碳酸钠(致密灰) 往混合物中加入聚丙烯酸钠和线性烷基苯磺酸钠(或非离子表面活性 剂或月桂酰羟苯磺酸钠)的40％水溶液。接着，来源于Bacillus sp． KSM-KP43并在实施例7中制备的碱性蛋白酶颗粒产物被加到混合物 中。所得到的混合物均匀搅拌，由此制备漂白剂。衣领浸入到每种漂 白剂的0．5％水溶液中20℃30分钟，然后在Terg-O-Tometer中用 洗涤剂A(实施例6)以20℃100 rpm清洗10分钟。所得到的漂白剂 具有优异的漂白能力，被用作衣用漂白剂。

表10 (重量％)

    组分     本发明的漂白剂     14     15     16     17 过碳酸钠1）     80．0     80．0     80．0     80．0 碳酸钠     16．0     12．0     16．0     12．0 (致密灰) 离子表面活性剂2)     2．0     2．0     -         -     非离子表面活性剂3)     -         -         2．0     2．0 聚丙烯酸钠4）     1．0     1．0     1．0     1．0 月桂酰基氧基     -         4．0     -         4．0 苯磺酸钠 Bacillus sp．KSM-KP43     1．0     1．0     1．0     1．0 的碱性蛋白酶 (实施例7)

1)颗粒大小：500-700μm

2)烷基苯磺酸线性钠(C12-C14)

3)聚氧乙烯烷基醚(C12-C14烷基，平均EO添加12摩尔)

4)平均分子量8，000

实施例9

重复实施例8的方法，由此制备用于自动洗碗机具有在表11中显 示组合物的洗涤剂组合物。在下列条件下测定所获得组合物的清洗能 力。所获得的洗涤剂拥有优异的清洁能力，并用于自动洗碗机的洗涤 剂。

表1l (重量％)     组分     本发明的洗涤剂     18     19     20     21  Pluronic L-611)     4     -     4     4  Softanol EP-70852)     -     4     -     - 柠檬酸三钠     30     30     -     -  EDTA     -     -     30     - 三聚磷酸钠     -     -     -     30 过碳酸钠     20     20     20     20 碳酸钠(致密灰)     20     20     20     20 非晶型硅酸盐3)     10     10     10     10  AA-MA4)     4     4     4     4 硫酸钠     10     10     10     10 脂肪水解酶100T_     0.5     0.5     0.5     0.5 (Novo Nordisk) Termamyl 60T_ (Novo Nordisk)     1     1     1     1 Bacillus sp.KSM-KP43碱性蛋白酶 (实施例7)     0.5     0.5     0.5     0.5

1)聚氧乙烯聚氧化丙烯共聚物(平均分子量为2,000)

2)C12-C14仲乙醇的环氧乙烷(7摩尔)和1，2-环氧丙烷 (8．5摩尔)加合物

3)JIN No．2硅酸钠

4)丙烯酸-马来酸共聚物

(1)污渍盘的制备

卵黄(2．5g)均匀刷到具有直径25cm的一只瓷盘上。将该盘在干 燥箱中115℃干燥60分钟。

(2)洗涤条件

所用的洗碗机；全自动洗碗机(NP-810，Matsushita电子工业有 限公司的产品)

洗涤类型：标准过程

洗涤用水；硬度62．3mg CaCO3／L(3．5°DH)

洗涤剂的浓度；0．2wt％

(3)评价方法

在上述条件下使用实施例9的洗涤剂组合物，在洗碗机中洗涤5 只有污渍的盘。清洗过的盘用1％赤藓红溶液染色，由此显色残留的蛋 白。蛋白污渍的程度用肉眼判断。

实施例10

根据表12显示的组分得到用于洗碗机的洗涤剂组合物。通过与实 施例9相似的测定方法，评价这些组合物的清洁能力。这些组合物提 供优异的清洗效果。

表12 (重量％)     组分     本发明的洗涤剂组合物     22     23     24     25     26     (a) 碳酸钠     30     30     50 碳酸氢钠     25     25     (b) Sokalan CP51)     5     6     5     5     5     (c) 过碳酸氢钠     5     6     (d) 萜二烯     2     2     1     1 Softanol EP70452)     2     1     1     (c) 非晶型硅铝酸钠 (Synth.Ex.1)3)     2     2     1     3 非晶型硅铝酸钠 (Synth.Ex.2)4)     2     1 脂肪水解酶100T_ (Novo Nordisk)     0.5     0.5     0.5     0.5     0.5  Termamyl 60T_ (Novo Nordisk)     1     1     1     1     1  Bacillus sp.KSM-KP43 的碱性蛋白酶(实施例7)     0.5     0.5     0.5     0.5     0.5 苹果酸钠     10     5 柠檬酸钠     15     10     4     8 硫酸钠     39     53     43     55     30

1)丙烯酸／马来酸共聚物(BASF的产品)

2)C12-C14仲乙醇的环氧乙烷(7摩尔)和1，2-环氧丙烷 (4．5摩尔)加合物

3)、4)在日本专利申请公报(kokai)No．6-179899所披露的 合成实例

实施例11

将酶加到上述洗涤剂A(实施例6)中，所加的量在下列表13中 显示。白衬衫领子部分用实施例6相似的方法清洗。 表13 (重量％)     酶                       本发明的洗涤剂     27  28     29  30  31  32  33 本发明的蛋白酶1)     - 0.5 0.5  0.5  0.5  0.5  0.5 普通蛋白酶2)     -  - 0.6  -  -  0.6  0.6 纤维素酶3)     -  - -  0.7  -  0.7  0.7 脂酶4)     -  - -  -  0.5  -  0.5

1)通过日本专利申请公开(kokai)No．62-257990披露的方 法，使用来源于Bacillus sp．KSM-KP43菌株并在实施例2制备的 本发明蛋白酶纯化样品(6 APU／g)制备的颗粒产品

2)在日本专利申请公开(kokai)No．5-25492披露的蛋白酶 K-16，该酶通过日本专利申请公开(kokai)No．62-257990披露的 方法修饰，具有5 APU／g

3)KAC-500_(纤维素酶，500 U／g，Kao联合公司的产品)

4)脂肪水解酶100T_(Novo Nordisk的产品)     这些结果清楚地表明，本发明的蛋白酶和普通蛋白酶、纤维素酶 或脂酶联合使用增强清洗效果。

工业可应用性

本发明的碱性蛋白酶对各种表面活性剂优异的稳定性；对脂肪酸 抗性：以及对氧化剂的高度稳定性，因此可用于自动洗碗机的洗涤剂 和衣用洗涤剂的酶，该两种洗涤剂含有漂白组分。

序列表 <110>KAO联合公司 <120>碱性蛋白酶 <130>FP-KS-0498 <150>JP 09-274570 <151>1997-10-07 <160>5 <210>1 <211>639 <212>PRT <213>Bacillus sp． <220> <221>misc_特征 <222>23，29，32，46，47，53，70，74，89，102，105，128，130，131，132，133，146，     148，160，165，172，183，187，188，189，194，286，306，324，369，431，501，     531，541，584，591，592，594，595，596，611，632 <223>Xaa=任意氨基酸 <400> Met Arg Lys Lys Lys Val Phe Leu Ser Val Leu Ser Ala Ala Ala Ile 1               5                  10                   15 Leu Ser Thr Val Ala Leu Xaa Asn Pro Ser Ala Gly Xaa Ala Arg Xaa          20                  25                  30 Phe Asp Leu Asp Phe Lys Gly Ile Gln Thr Thr Thr Asp Xaa Xaa Gly      35                  40                  45 Phe Ser Lys Gln Xaa Gln Thr Gly Ala Ala Ala Phe Leu Val Glu Ser  50                  55                  60 Glu Asn Val Lys Leu Xaa Lys Gly Leu Xaa Lys Lys Leu Glu Thr Val 65                  70                  75                  80 Pro Ala Asn Ash Lys Leu His Ile Xaa Gln Phe Asn Gly Pro Ile Leu              85                  90                  95 Glu Glu Thr Lys Gln Xaa Leu G1u Xaa Thr Gly Ala Lys Ile Leu Asp          100                 105                 110 Tyr Ile Pro Asp Tyr Ala Tyr Ile Va1 Glu Tyr Glu Gly Asp Val Xaa      115                 120                 125 Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Glu His Val Glu Ser Val Glu Pro Tyr Leu  130                 135                 140 Pro Xaa Tyr Xaa Ile Asp Pro Gln Leu Phe Thr Lys Gly Ala Ser Xaa 145                 150                 155                 160 Leu Val Lys Ala Xaa Ala Leu Asp Thr Lys Gln Xaa Asn Lys Glu Val              165                 170             175 Gln Leu Arg Gly Ile Glu Xaa Ile Ala Gln Xaa Xaa Xaa Ser Asn Asp          180                 185                 190 Val Xaa Tyr lle Thr Ala Lys Pro Glu Tyr Lys Val Met Asn Asp Val      195                 200                 205 Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Ser Ser Tyr Gly Leu  210                 215                 220 Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala Val Ala Asp Thr Gly Leu Asp Thr 225                 230                 235                 240 Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly Lys Ile Thr              245                 250                 255 Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp Thr Asn Gly          260                 265                 270 His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Gly Xaa Thr Asn      275                 280                 285 Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser Ile Met Asp  290                 295                 300 Ser Xaa Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Gln Thr Leu Phe 305                 310                 315                 320 Ser Gln Ala Xaa Ser Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn Ser Trp Gly              325                 330                 335 Ala Ala Val Asn Gly Ala Tyr Thr Thr Asp Ser Arg Asn Val Asp Asp          340                 345                 350 Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr Ile Leu Phe Ala Ala Gly Asn Glu      355                 360                 365 Xaa Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala Lys Asn Ala  370                 375                 380 Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Leu Arg Pro Ser Phe Gly Ser Tyr 385                 390                 395                 400 Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg Gly Pro Thr              405                 410                 415 Lys Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Met Ala Pro Gly Thr Xaa Ile          420                 425                 430 Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe Trp Ala Asn      435                 440                 445 His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro  450                 455                 460 Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe Val Lys Asn 465                 470                 475                 480 Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Leu Lys Ala Ala Leu Ile Ala              485                 490                 495 Gly Ala Ala Asp Xaa Gly Leu Gly Tyr Pro Asn Gly Asn Gln Gly Trp          500                 505                 510 Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr Val Asn Glu      515                 520                 525 Ser Ser Xaa Leu Ser Thr Ser Gln Lys Ala Thr Tyr Xaa Phe Thr Ala  530                 535                 540  Thr Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Ser Asp Ala Pro 545                 550                 555                 560 Ala Ser Thr Thr Ala Ser Val Thr Leu Val Asn Asp Leu Asp Leu Val              565                 570                 575 Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Xaa Tyr Val Gly Asn Asp Phe Xaa Xaa          580                 585                 590 Pro Xaa Xaa Xaa Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu Asn Val Phe      595                 600                 605 Ile Asn Xaa Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Ile Glu Val Gln Ala Tyr  610                 615                 620 Asn Val Pro Val Gly Pro Gln Xaa Phe Ser Leu Ala Ile Val Asn 625                 630                  635 <210> 2 <211> 640 <212> PRT <213> Baillus sp． <220> <221> misc_特征 <222>3，24，30，33，47，48，54，71，75，90，103，106，129，131，132，133，134，147，      149，161，166，173，184，188，189，190，195，287，307，325，370，432，502，      532，542，585，592，593，595，596，597，612，633 <223> Xaa=任意氨基酸 <400> Met Arg Xaa Lys Lys Lys Val Phe Leu Ser Val Leu Ser Ala Ala Ala 1                5                  10                  15 Ile Leu Ser Thr Val Ala Leu Xaa Asn Pro Ser Ala Gly Xaa Ala Arg          20                  25                  30 Xaa Phe Asp Leu Asp Phe Lys Gly Ile Gln Thr Thr Thr Asp Xaa Xaa      35                  40                  45 Gly Phe Ser Lys Gln Xaa Gln Thr Gly Ala Ala Ala Phe Leu Val Glu  50                  55                  60 Ser Glu Asn Val Lys Leu Xaa Lys Gly Leu Xaa Lys Lys Leu Glu Thr 65                  70                  75                  80 Val Pro Ala Asn Asn Lys Leu His Ile Xaa Gln Phe Asn Gly Pro Ile            85                   90                  95 Leu Glu Glu Thr Lys Gln Xaa Leu Glu Xaa Thr Gly Ala Lys Ile Leu          100                 105                 110 Asp Tyr Ile Pro Asp Tyr Ala Tyr Ile Val Glu Tyr Glu Gly Asp Val      115                  120                125 Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Glu His Val Glu Ser Val Glu Pro Tyr  130                 135                 140 Leu Pro Xaa Tyr Xaa Ile Asp Pro Gln Leu Phe Thr Lys Gly Ala Ser 145                 150                 155                 160 Xaa Leu Val Lys Ala Xaa Ala Leu Asp Thr Lys Gln Xaa Asn Lys Glu              165                 170                 175 Val Gln Leu Arg Gly Ile Glu Xaa Ile Ala Gln Xaa Xaa Xaa Ser Asn          180                 185                 190 Asp Va1 Xaa Tyr Ile Thr Ala Lys Pro Glu Tyr Lys Val Met Asn Asp      195                 200                 205 Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Ser Ser Tyr Gly  210                 215                 220 Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala Va1 Ala Asp Thr Gly Leu Asp 225                 230                  235                240 Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly Lys Ile              245                 250                 255 Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp Thr Asn          260                 265                 270 Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Gly Xaa Thr      275                 280                 285 Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser Ile Met 290                 295                 300 Asp Ser Xaa Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Gln Thr Leu 305                 310                  315                 320 Phe Ser Gln Ala Xaa Ser Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn Ser Trp              325                 330                  335 Gly Ala Ala Val Asn Gly Ala Tyr Thr Thr Asp Ser Arg Asn Val Asp          340                 345                 350 Asp Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr Ile Leu Phe Ala Ala Gly Asn      355                 360                 365 Glu Xaa Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala Lys Asn  370                 375                 380 Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Leu Arg Pro Ser Phe Gly Ser 385                 390                 395                 400 Tyr Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg Gly Pro              405                 410                 415 Thr Lys Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Met Ala Pro Gly Thr Xaa          420                 425                 430 Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe Trp Ala      435                 440                 445 Asn His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met Ala Thr  450                 455                 460 Pro Ile Val Ala Gly Asn Val ALa Gln Leu Arg Glu His Phe Val Lys 465                 470                 475                 480 Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Leu Lys Ala Ala Leu Ile              485                 490                 495 Ala Gly Ala Ala Asp Xaa Gly Leu Gly Tyr Pro Asn Gly Asn Gln Gly          500                 505                 510 Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr Val Asn      515                 520                 525 Glu Ser Ser Xaa Leu Ser Thr Ser Gln Lys Ala Thr Tyr Xaa Phe Thr  530                 535                 540 Ala Thr Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Ser Asp Ala 545                 550                 555                 560 Pro Ala Ser Thr Thr Ala Ser Val Thr Leu Val Asn Asp Leu Asp Leu              565                 570                 575 Val Ile Thr Ara Pro Asn Gly Thr Xaa Tyr Val Gly Asn Asp Phe Xaa          580                 585                 590 Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu Asn Val      595                 600                 605 Phe Ile Asn Xaa Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Ile Glu Val Gln Ala  610                 615                  620 Tyr Asn Val Pro Val Gly Pro Gln Xaa Phe Ser Leu Ala Ile Val Asn 625                 630                  635                640 <210>    3 <211>    1920 <212>    DNA <213>    Bacillus sp． <400> atg aga aag aag aag gtg ttt tta tct gtt tta tca gct gca gcg att  48 Met Arg Lys Lys Lys Val Phe Leu Ser Val Leu Ser Ala Ala Ala Ile 1               5                   10                   15 ctg tcg act gtt gca tta aac aat ccc tcg gct ggt gat gca agg act  96 Leu Ser Thr Val Ala Leu Asn Asn Pro Ser Ala Gly Asp Ala Arg Thr          20                  25                  30 ttt gat ctg gat ttt aaa gga att caa aca aca acc gat gtc agt ggt  144 Phe Asp Leu Asp Phe Lys Gly Ile Gln Thr Thr Thr Asp Val Ser Gly      35                  40                  45 ttc tcc aaa cag cga caa aca ggt gcg gct gca ttt ctg gtg gag tct 192 Phe Ser Lys Gln Arg Gln Thr Gly Ala Ala Ala Phe Leu Val Glu Ser  50                  55                  60 gaa aat gtg aaa ctt ctt aaa gga ttg cta aag aaa ctt gaa aca gta 240 Glu Asn Val Lys Leu Leu Lys Gly Leu Leu Lys Lys Leu Glu Thr Val 65                  70                  75                  80 ccg gca aat aat aaa ctc cat att gtc caa ttc aat ggc ccc att tta 288 Pro Ala Asn Asn Lys Leu His Ile Val Gln Phe Asn Gly Pro Ile Leu              85                  90                  95 gaa gaa aca aaa cag aag cta gag aca act gga gca aag att ctc gac 336 Glu Glu Thr Lys Gln Lys Leu Glu Thr Thr Gly Ala Lys Ile Leu Asp          100                 105                 110 tac atc cct gat tat gca tat att gtc gag tat gag ggg gat gtt cag 384 Tyr Ile Pro Asp Tyr Ala Tyr Ile Val Glu Tyr Glu Gly Asp Val Gln      115                 120                 125 tca aaa gtc cgc tcc att gaa cac gtg gaa tca gtg gag cca tac ttg 432 Ser Lys Val Arg Ser Ile Glu His Val Glu Ser Val Glu Pro Tyr Leu  130                 135                 140 ccg aaa tac aaa ata gat ccc cag ctt ttc aca aaa ggc gca tcg acg 480 Pro Lys Tyr Lys Ile Asp Pro Gln Leu Phe Thr Lys Gly Ala Ser Thr 145                 150                 155                 160 ctg gtg aaa gcg ttg gcg ctt gat acg aag cag aac aat aaa gaa gtg 528 Leu Va1 Lys Ala Leu Ala Leu Asp Thr Lys Gln Asn Asn Lys Glu Val              165                 170                 175 caa tta aga ggc atc gag gaa atc gct cag tac gta gca agc aat gac 576 Gln Leu Arg Gly Ile Glu Glu Ile A1a Gln Tyr Val Ala Ser Asn Asp          180                 185                 190 gtc cat tat att acg gca aag cct gaa tat aag gtg atg aat gat atg 624 Val His Tyr Ile Thr Ala Lys Pro Glu Tyr Lys Val Met Asn Asp Val      195                 200                 205 gcc aga ggt att gtc aaa gcg gat gtg gca cag agc agc tac ggt ttg 672 Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Ser Ser Tyr Gly Leu  210                 215                 220 tat gga caa ggc cag att gtc gca gtt gcc gat act gga tgg gat aca 720 Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala Val Ala Asp Thr Gly Leu Asp Thr 225                 230                 235                 240 gga aga aac gac agt tcg atg cat gaa gcc ttc cgc ggt aaa ata aca 768 Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly Lys Ile Thr              245                 250                 255 gca cta tat gca ctg ggt cgg acg aat aat gcg aat gat acg aac ggt 816 Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp Thr Asn G1y          260                 265                 270 cat ggt acc cat gtg gca ggt tcg gta tta gga aat ggc gca acg aat 864 His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Gly Ala Thr Asn      275                 280                 285 aaa gga atg gca cct caa gcg aat ctg gtt ttt caa tcc atc atg gat 9l2 Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser Ile Met Asp  290                 295                 300 agc agt ggt ggg ctt gga ggc ttg cct tcc aat ctg caa acc tta ttc 960 Ser Ser Gly Gly Leu G1y Gly Leu Pro Ser Asn Leu Gln Thr Leu Phe 305                 310                 315                 320 agc caa gca ttc agt gca ggt gcc aga att cat aca aac tcc tgg ggg 1008 Ser Gln Ala Phe Ser Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn Ser Trp Gly              325                 330                 335 gca gcg gtg aat ggg gcc tac acg aca gat tcc aga aat gtg gat gac 1056 Ala Ala Val Asn Gly Ala Tyr Thr Thr Asp Ser Arg Asn Val Asp Asp          340                 345                 350 tat gta agg aaa aat gat atg acg att ctt ttc gcg gct ggg aat gaa 1104 Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr Ile Leu Phe Ala Ala Gly Asn Glu      355                 360                 365 agg ccg aac ggc ggt acc atc agt gca cct ggt acg gct aaa aac gcc 1152 Arg Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser Ala Plo Gly Thr Ala Lys Asn Ala   370                375                 380 ata aca gtc ggc gca acc gaa aac ctg cgt cca agc ttc ggt tcc tat 1200 Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Leu Arg Pro Ser Phe Gly Ser Tyr 385                 390                  395                400 gca gat aat att aac cac gtt gca cag ttc tct tcc cgt ggc ccg aca 1248 Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg Gly Pro Thr              405                 410                 415 aaa gat ggg cga atc aag cct gat gtc atg gcg cca ggg aca tac att 1296 Lys Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Met Ala Pro Gly Thr Tyr Ile           420                425                 430 tta tca gca aga tct tct ctt gca ccc gat tcc tcc ttc tgg gcg aat 1344 Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe Trp Ala Asn      435                 440                 445 cat gac agc aaa tat gcc tat atg ggt gga acg tcc atg gca aca ccg 1392 His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly G1y Thr Ser Met Ala Thr Pro  450                 455                 460 att gtt gcg ggg aat gtt gca cag ctc cgt gag cat ttt gtg aaa aat 1440 Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe Val Lys Asn 465                 470                  475                480 aga gga atc act cct aag cct tcc cta ttg aaa gca gct ttg att gca 1488 Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Leu Lys Ala ALa Leu Ile Ala              485                 490                 495 ggt gct gct gat gtt gga ttg ggt tat ccg aac gga aac caa gga tgg 1536 Gly Ala Ala Asp Val Gly Leu Gly Tyr Pro Asn Gly Asn Gln Gly Trp          500                 505                 510 ggc cga gtg acc ctg gat aaa tcg ttg aac gtt gcc tat gtg aac gaa 1584 Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr Val Asn Glu      515                 520                  525 tcc agt gcc cta tca act agc caa aaa gcg aca tat acc ttt act gca 1632 Ser Ser Ala Leu Ser Thr Ser Gln Lys Ala Thr Tyr Thr Phe Thr Ala  530                 535                 540 acg gcg ggc aag cca ttg aaa atc tcc ctg gta tgg tcg gat gcc cct 1680 Thr Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Ser Asp Ala Pro 545                 550                 555                 560 gca agc act act gct tct gta acc ctg gtc aat gat ttg gat ttg gtc 1728 Ala Ser Thr Thr Ala Ser Val Thr Leu Val Asn Asp Leu Asp Leu Val              565                 570                 575 att aca gca cca aac gga aca aga tat gtc ggg aat gac ttc tca gca 1776 Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Arg Tyr Val Gly Asn Asp Phe Ser Ala          580                 585                 590 cca ttt gac aat aac tgg gat ggc cgc aat aac gta gaa aat gta ttt 1824 Pro Phe Asp Asn Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu Asn Val Phe       595                 600                 605 att aat tcg ccc caa agt gga aca tat acc att gag gtg caa gca tat 1872 Ile Asn Ser Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Ile Glu Val Gln Ala Tyr  610                 615                 620 aat gtg ccg gtt gga cca caa aac ttc tcg ttg gca att gtg aac taa 1920 Asn Val Pro Val Gly Pro Gln Asn Phe Ser Leu Ala Ile Val Asn 625                  630                635 <210>    4 <211>    1923 <212>    DNA <213>    Bacillus sp． <400> atg aga aag aag aaa aag gtg ttt tta tct gtt tta tca gct gca gcg  48 Met Arg Lys Lys Lys Lys Val Phe Leu Ser Val Leu Ser Ala Ala Ala 1               5                   10                  15 att ttg tcg act gtt gcg tta agt aat cca tct gca ggt ggt gca agg  96 Ile Leu Ser Thr Val Ala Leu Ser Asn Pro Ser Ala Gly Gly Ala Arg          20                  25                  30 aat ttt gat ctg gat ttc aaa gga att cag aca aca act gat gct aaa  144 Asn Phe Asp Leu Asp Phe Lys Gly lle Gln Thr Thr Thr Asp Ala Lys      35                  40                  45 ggt ttc tcc aag cag ggg cag act ggt gct gct gct ttt ctg gtg gaa 192 Gly Phe Ser Lys Gln Gly Gln Thr Gly Ala Ala Ala Phe Leu Val Glu  50                  55                  60 tct gaa aat gtg aaa ctc cca aaa ggt ttg cag aag aag ctt gaa aca 240 Ser Glu Asn Val Lys Leu Pro Lys Gly Leu Gln Lys Lys Leu Glu Thr 65                  70                  75                   80 gtc ccg gca aat aat aaa ctc cat att atc caa ttc aat gga cca att 288 Val Pro Ala Asn Asn Lys Leu His Ile Ile Gln Phe Asn Gly Pro Ile               85                 90                   95 tta gaa gaa aca aaa cag cag ctg gaa aaa aca ggg gca aag att ctc 336 Leu Glu Glu Thr Lys Gln Gln Leu Glu Lys Thr Gly Ala Lys Ile Leu           100                 105                 110 gac tac ata cct gat tat gct tac att gtc gag tat gag ggc gat gtt 384 Asp Tyr Ile Pro Asp Tyr Ala Tyr Ile Val Glu Tyr Glu Gly Asp Val      115                 120                 125 aag tca gca aca agc acc att gag cac gtg gaa tcc gtg gag cct tat 432 Lys Ser Ala Thr Ser Thr Ile Glu His Val Glu Ser Val Glu Pro Tyr   130                 135                 140 ttg ccg ata tac aga ata gat ccc cag ctt ttc aca aaa ggg gca tca 480 Leu Pro Ile Tyr Arg Ile Asp Pro Gln Leu Phe Thr Lys Gly Ala Ser 145                 150                 155                 160 gag ctt gta aaa gca gtg gcg ctt gat aca aag cag aaa aat aaa gag 528 Glu Leu Val Lys Ala Val Ala Leu Asp Thr Lys Gln Lys Asn Lys Glu              165                 170                 175 gtg caa tta aga ggc atc gaa caa atc gca caa ttc gca ata agc aat 576 Val Gln Leu Arg Gly Ile Glu Gln Ile Ala Gln Phe Ala Ile Ser Asn          180                 185                 190 gat gtg cta tat att acg gca aag cct gag tat aag gtg atg aat gat 624 Asp Val Leu Tyr Ile Thr Ala Lys Pro Glu Tyr Lys Val Met Asn Asp      195                 200                 205 gtt gcg cgt gga att gtc aaa gcg gat gtg gct cag agc agc tac ggg 672 Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Ser Ser Tyr Gly  210                 215                 220 ttg tat gga caa gga cag atc gta gcg gtt gcc gat aca ggg ctt gat 720 Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala Val Ala Asp Thr Gly Leu Asp 225                 230                 235                 240 aca ggt cgc aat gac agt tcg atg cat gaa gcc ttc cgc ggg aaa att 768 Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly Lys Ile              245                 250                 255 act gca tta tat gca ttg gga cgg acg aat aat gcc aat gat acg aat 816 Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp Thr Asn          260                 265                 270 ggt cat ggt acg cat gtg gct ggc tcc gta tta gga aac ggc tcc act 864 Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Gly Ser Thr      275                 280                 285 aat aaa gga atg gcg cct cag gcg aat cta gtc ttc caa tct atc atg 912 Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser Ile Met  290                 295                 300 gat agc ggt ggg gga ctt gga gga cta cct tcg aat ctg caa acc tta 960 Asp Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu G1n Thr Leu 305                 310                 315                 320 ttc agc caa gca tac agt gct ggt gcc aga att cat aca aac tcc tgg 1008 Phe Ser Gln Ala Tyr Ser Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn Ser Trp              325                 330                 335 gga gca gca gtg aat ggg gct tac aca aca gat tcc aga aat gtg gat 1056 Gly Ala Ala Val Asn Gly Ala Tyr Thr Thr Asp Ser Arg Asn Val Asp          340                 345                 350 gac tat gtg cgc aaa aat gat atg acg atc ctt ttc gct gcc ggg aat 1104 Asp Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr Ile Leu Phe Ala Ala Gly Asn      355                 360                 365 gaa gga ccg aac ggc gga acc atc agt gca cca ggc aca gct aaa aat 1152 Glu Gly Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala Lys Asn   370                 375                 380 gca ata aca gtc gga gct acg gaa aac ctc cgc cca agc ttt ggg tct 1200 Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Leu Arg Pro Ser Phe Gly Ser 385                 390                  395                400 tat gcg gac aat atc aac cat gtg gca cag ttc tct tca cgt gga ccg 1248 Tyr Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg Gly Pro              405                  410                4l5 aca aag gat gga cgg atc aaa ccg gat gtc atg gca ccg gga acg ttc 1296 Thr Lys Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Met Ala Pro Gly Thr Phe          420                  425                430 ata cta tca gca aga tct tct ctt gca ccg gat tcc tcc ttc tgg gcg 1344 Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe Trp Ala      435                 440                 445 aac cat gac agt aaa tat gca tac atg ggt gga acg tcc atg gct aca 1392 Asn His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met Ala Thr  450                 455                 460 ccg atc gtt gct gga aac gtg gca cag ctt cgt gag cat ttt gtg aaa 1440 Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe Val Lys 465                 470                 475                 480 aac aga ggc atc aca cca aag cct tct cta tta aaa gcg gca ctg att 1488 Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Leu Lys Ala Ala Leu Ile              485                 490                 495 gcc ggt gca gct gac atc ggc ctt ggc tac ccg aac ggt aac caa gga 1536 Ala Gly Ala Ala Asp Ile Gly Leu Gly Tyr Pro Asn Gly Asn Gln Gly          500                 505                 510 tgg gga cga gtg aca ttg gat aaa tcc ctg aac gtt gcc tat gtg aac 1584 Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr Val Asn       515                520                 525 gag tcc agt tct cta tcc acc agc caa aaa gcg acg tac tcg ttt act 1632 Glu Ser Ser Ser Leu Ser Thr Ser Gln Lys Ala Thr Tyr Ser Phe Thr  530                 535                 540 gct act gcc ggc aag cct ttg aaa atc tcc ctg gta tgg tct gat gcc 1680 Ala Thr Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Ser Asp Ala 545                 550                  555                560 cct gcg agc aca act gct tcc gta acg ctt gtc aat gat ctg gac ctt 1728 Pro Ala Ser Thr Thr Ala Ser Val Thr Leu Val Asn Asp Leu Asp Leu              565                 570                 575 gtc att acc gct cca aat ggc aca cag tat gta gga aat gac ttt act l776 Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Gln Tyr Val Gly Asn Asp Phe Thr          580                 585                 590 tcg cca tac aat gat aac tgg gat ggc cgc aat aac gta gaa aat gta 1824 Ser Pro Tyr Asn Asp Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu Asn Val       595                600                 605 ttt att aat gca cca caa agc ggg acg tat aca att gag gta cag gct 1872 Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Ile Glu Val Gln Ala  610                 615                 620 tat aac gta ccg gtt gga cca cag acc ttc tcg ttg gca att gtg aat 1920 Tyr Asn Val Pro Val Gly Pro Gln Thr Phe Ser Leu Ala lle Val Asn 625                 630                 635                 640 taa                                                 1923 <210>   5 <211>   1923 <212>   DNA <212>   Bacillus sp． <400> atg aga aag aag aaa aag gtg ttt tta tct gtt tta tca gct gca gcg  48 Met Arg Lys Lys Lys Lys Val Phe Leu Ser Val Leu Ser Ala Ala Ala 1               5                   10              15 att ttg tcg act gtt gcg tta agt aat cca tct gca ggt ggt gca agg  96 Ile Leu Ser Thr Val ALa Leu Ser Asn Pro Ser Ala Gly Gly Ala Arg          20                  25              30 aat ttt gat ctg gat ttc aaa gga att cag aca aca act gat gct aaa 144 Asn Phe Asp Leu Asp Phe Lys Gly Ile Gln Thr Thr Thr Asp Ala Lys      35                  40                   45 ggt ttc tcc aag cag ggg cag act ggt gct gct gct ttt ctg gtg gaa 192 Gly Phe Ser Lys Gln Gly Gln Thr Gly Ala Ala Ala Phe Leu Val Glu  50                  55                   60 tct gaa aat gtg aaa ctc cca aaa ggt ttg cag aag aag ctt gaa aca 240 Ser Glu Asn Val Lys Leu Pro Lys Gly Leu Gln Lys Lys Leu Glu Thr 65                  70                  75                   80 gtc ccg gca aat aat aaa ctc cat att atc caa ttc aat gga cca att 288 Val Pro Ala Asn Asn Lys Leu His Ile Ile Gln Phe Asn Gly Pro Ile              85                  90                   95 tta gaa gaa aca aaa cag cag ctg gaa aaa aca ggg gca aag att ctc 336 Leu Glu Glu Thr Lys Gln Gln Leu Glu Lys Thr Gly Ala Lys Ile Leu          100                 105                 110 gac tac ata cct gat tat gct tac att gtc gag tat gag ggc gat gtt 384 Asp Tyr Ile Pro Asp Tyr Ala Tyr Ile Val Glu Tyr Glu Gly Asp Val      115                 120                  125 aag tca gca aca agc acc att gag cac gtg gaa tcc gtg gag cct tat 432 Lys Ser Ala Thr Ser Thr Ile G1u His Val Glu Ser Val Glu Pro Tyr   130                135                   140 ttg ccg ata tac aga ata gat ccc cag ctt ttc aca aaa ggg gca tca 480 Leu Pro Ile Tyr Arg Ile Asp Pro Gln Leu Phe Thr Lys Gly Ala Ser 145                 150                 155                 160 gag ctt gta aaa gca gtg gcg ctt gat aca aag cag aaa aat aaa gag 528 Glu Leu Val Lys Ala Val Ala Leu Asp Thr Lys Gln Lys Asn Lys Glu              165                 170             175 gtg caa tta aga ggc atc gaa caa atc gca caa ttc gca ata agc aat 576 Val Gln Leu Arg Gly Ile Glu Gln Ile Ala Gln Phe Ala Ile Ser Asn          180                 185                 190 gat gtg cta tat att acg gca aag cct gag tat aag gtg atg aat gat 624 Asp Val Leu Tyr Ile Thr Ala Lys Pro Glu Tyr Lys Val Met Asn Asp      195                 200                 205 gtt gcg cgt gga att gtc aaa gcg gat gtg gct cag agc agc tac ggg 672 Val Ala Arg Gly Ile Va1 Lys Ala Asp Val Ala Gln Ser Ser Tyr Gly  210                 215                 220 ttg tat gga caa gga cag atc gta gcg gtt gcc gat aca ggg ctt gat 720 Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala Val Ala Asp Thr G1y Leu Asp 225                 230                 235             240 aca ggt cgc aat gac agt tcg atg cat gaa gcc ttc cgc ggg aaa att 768 Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly Lys Ile              245                 250             255 act gca tta tat gca ttg gga cgg acg aat aat gcc aat gat acg aat 816 Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp Thr Asn          260                 265              270 ggt cat ggt acg cat gtg gct ggc tcc gta tta gga aac ggc tcc act 864 Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn GLy Ser Thr      275                 280              285 aat aaa gga atg gcg cct cag gcg aat cta gtc ttc caa tct atc atg 912 Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser Ile Met  290                 295                 300                                                                                                                              gat agc ggt ggg gga ctt gga gga cta cct tcg aat ctg caa acc tta 960 Asp Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Gln Thr Leu 305                 310                 315                 320 ttc agc caa gca tac agt gct ggt gcc aga att cat aca aac tcc tgg 1008 Phe Ser Gln Ala Tyr Ser Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn Ser Trp              325             330                 335 gga gca gca gtg aat ggg gct tac aca aca gat tcc aga aat gtg gat 1056 Gly Ala Ala Val Asn Gly Ala Tyr Thr Thr Asp Ser Arg Asn Val Asp          340                 345                350 gac tat gtg cgc aaa aat cat atg acg atc ctt ttc gct gcc ggg aat 1104 Asp Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr Ile Leu Phe Ala Ala Gly Asn      355                 360                 365 gaa gga ccg aac ggc gga acc atc agt gca cca ggc aca gct aaa aat 1152 Glu Gly Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala Lys Asn  370                 375                 380 gca ata aca gtc gga gct acg gaa aac ctc cgc cca agc ttt ggg tct 1200 Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Leu Arg Pro Ser Phe Gly Ser 385                 390                 395                 400 tat gcg gac aat atc aac cat gtg gca cag ttc tct tca cgt gga ccg 1248 Tyr Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg Gly Pro              405                 410                415 aca aag gat gga cgg atc aaa ccg gat gtc atg gca ccg gga acg ttc 1296 Thr Lys Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Met Ala Pro Gly Thr Phe          420                 425                 430 ata cta tca gca aga tct tct ctt gca ccg gat tcc tcc ttc tgg gcg 1344 Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe Trp Ala      435                 440                  445 aac cat gac agt aaa tat gca tac atg ggt gga acg tcc atg gct aca 1392 Asn His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met Ala Thr  450                 455                 460 ccg atc gtt gct gga aac gtg gca cag crt cgt gag cat ttt gtg aaa 1440 Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe Val Lys 465                 470                 475                 480 aac aga ggc atc aca cca aag cct tct cta tta aaa gcg gca ctg att 1488 Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Leu Lys Ala Ala Leu Ile              485                 490                 495 gcc ggt gca gct gac atc ggc ctt ggc tac ccg aac ggt aac caa gga 1536 Ala Gly Ala Ala Asp Ile Gly Leu Gly Tyr Pro Asn Gly Asn Gln Gly          500                 505                  510 tgg gga cga gtg aca ttg gat aaa tcc ctg aac gtt gcc tat gtg aac 1584 Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr Val Asn      515                 520                 525 gag tcc agt tct cta tcc acc agc caa aaa gcg acg tac tcg ttt act 1632 Glu Ser Ser Ser Leu Ser Thr Ser Gln Lys Ala Thr Tyr Ser Phe Thr  530                 535                 540 gct act gcc ggc aag cct ttg aaa atc tcc ctg gta tgg tct gat gcc 1680 Ala Thr Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Ser Asp Ala 545                 550                 555                 560 cct gcg agc aca act gct tcc gta acg ctt gtc aat gat ctg gac ctt 1728 Pro Ala Ser Thr Thr Ala Ser Val Thr Leu Val Asn Asp Leu Asp Leu              565                 570                 575 gtc att acc gct cca aat ggc aca cag tat gta gga aat gac ttt act 1776 Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Gln Tyr Val Gly Asn Asp Phe Thr          580                 585                 590 tcg cca tac aat gat aac tgg gat ggc cgc aat aac gta gaa aat gta 1824 Ser Pro Tyr Asn Asp Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu Asn Val      595                 600                605 ttt att aat gca cca caa agc ggg acg tat aca att gaa gta cag gct 1872 Phe Ile Asn A1a Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Ile Glu Val Gln Ala  610                 615                 620 tat aac gta ccg gtt gga cca cag aac ttc tcg ttg gca att gtg aat 1920 Tyr Asn Val Pro Val Gly Pro Gln Asn Phe Ser Leu Ala Ile Val Asn 625                 630                 635                 640 taa                                                        1923