蛋白酶在工业领域的应用具有很长的历史，并且业已广泛扩展到 包括洗涤剂在内的各种领域，如衣物洗涤剂，纤维改性剂，皮革处理 剂，化妆组合物，洗浴添加剂，食品改性剂，和药物。其中，用于洗 涤剂的蛋白酶是工业化大量生产的。例如，已知的蛋白酶包括Alcalase (商标；Novozymes的产品)，Savinase(商标；Novozymes的产品)， Maxacal(商标；Genencor的产品)，Blap(商标；Henkel的产品)， 和KAP(Kao的产品)。
将蛋白酶掺入洗涤剂中，是为了降解主要由附着在衣物上的蛋白 组成的污渍。实际上，污渍不仅包括蛋白，而且还包括混在其中的多 种成分，包括有机物和无机物，如由皮脂产生的脂类和固体颗粒。因 此，有必要开发具有足够高的去污能力的洗涤剂，以便除去这种复杂 的污渍。
由于发现若干种碱性蛋白酶即使在存在高浓度脂肪酸的条件下， 也能保持酪蛋白酶解活性，并且，在去除包括蛋白和皮脂的复杂污渍 方面具有良好的去污能力，并且分子量为大约43000，本发明人业已就 此提出了一项专利申请(参见专利文献1)。这种碱性蛋白酶在分子量、 一级结构、酶促特性方面有所不同，并且具有来自枯草蛋白酶的很强 的抗氧化剂作用，这种蛋白酶是已知的源于芽孢杆菌属的微生物的常 规丝氨酸蛋白酶，因此认为应当将其归入新的枯草蛋白酶亚科(参见 非专利文献1)。
上述碱性蛋白酶即使在存在高浓度脂肪酸的条件下，也具有酪蛋 白酶解活性，并且在去除不仅包括蛋白，而且还包括皮脂等的复杂污 渍方面具有出色的去污能力。但其产量不够工业规模生产。在考虑进 一步改善去污力，以及工业规模的产量时，就需要具有与上述碱性磷 酸酶类似的特性，并且具有更有效的蛋白酶解能力的碱性蛋白酶。
用于增强靶蛋白(酶)分泌的常规的已知方法的例子，包括通过 宿主菌株(酶生产菌)改良，以及改良编码所述酶的基因或控制编码 所述酶的基因表达的基因。不过，没有发现能够增加枯草蛋白酶分泌 数量的改良例子。
另一方面，为了改善蛋白酶解能力，常用的方法是改变蛋白酶基 因，以便提高每毫克蛋白的蛋白酶解活性，即比活性。有关为了改善 枯草蛋白酶比活性而进行的蛋白质工程改变，有详细的报导(参见非 专利文献2，非专利文献3，非专利文献4和非专利文献5等)。迄今 为止所报导过的改变，证实了某些合成肽的比活性的提高，但是，没 有改善针对天然底物的活性，这种活性被认为对去污力有影响。
为了提高对天然底物的比活性，据报导，通过用亮氨酸取代枯草 蛋白酶E的31号位置上的异亮氨酸，可以提高对酪蛋白的蛋白酶解活 性(参见非专利文献6)。这种情况不能作为参考，因为在上述碱性蛋 白酶中，相应的氨基酸实际上是亮氨酸；并且，上述碱性蛋白酶在酶 促特性方面，也与分子量大约为28000的枯草蛋白酶不同。
本发明的目的是提供一种具有更有效的蛋白酶解能力，在除去复 杂的污渍方面具有出色的去污力，并且具有高的分泌能力的碱性蛋白 酶。

本发明人找到了一种新型酶，这种酶在培养期间能够有效分泌， 而又没丧失上述碱性蛋白酶的特征。结果，本发明人业已发现，在其 氨基酸序列的特定位置上具有特定氨基酸残基的某些碱性蛋白酶，能 够满足上述要求。
因此，在本发明的一个方面，提供了一种碱性蛋白酶，其中，在 SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的(a)65号位置，(b)101号位置， (c)163号位置，(d)170号位置，(e)171号位置，(f)273号 位置，(g)320号位置，(h)359号位置，或(i)387号位置或与 之相应的位置上的氨基酸残基是从以下氨基酸残基中选择的：
位置(a)：脯氨酸残基，
位置(b)：天冬酰胺残基，
位置(c)：组氨酸，天冬氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸，天冬酰胺， 丝氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，谷氨酰胺，苏氨酸或缬氨酸残基，
位置(d)：缬氨酸或亮氨酸残基，
位置(e)：丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸或苏氨酸残基，
位置(f)：异亮氨酸，甘氨酸或苏氨酸残基，
位置(g)：苯丙氨酸，丙氨酸，苏氨酸，亮氨酸，异亮氨酸或甘 氨酸残基，
位置(h)：丝氨酸，亮氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，或谷氨酰胺残 基，和
位置(i)：丙氨酸，赖氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，精氨酸或组氨 酸残基。
在本发明的另一方面，还提供了含有上述基因的载体，以及含有 这种载体的转化体。
在本发明的另一方面，还提供了一种含有所述碱性蛋白酶的洗涤 剂组合物。

图1表示与SEQ ID NO：1的氨基酸序列有至少80％同源性的碱性 蛋白酶的氨基酸序列比对。

本发明的碱性蛋白酶在SEQ ID NO：1的(a)65号位置，(b) 101号位置，(c)163号位置，(d)170号位置，(e)171号位置， (f)273号位置，(g)320号位置，(h)359号位置，或(i)387 号位置或与之相应的位置上的氨基酸残基是从以下氨基酸残基中选择 的：
位置(a)：脯氨酸残基，位置(b)：天冬酰胺残基，位置(c)： 组氨酸，天冬氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸，天冬酰胺，丝氨酸，异亮氨 酸，亮氨酸，谷氨酰胺，苏氨酸或缬氨酸残基，位置(d)：缬氨酸或 亮氨酸残基，位置(e)：丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸或苏氨酸残基，位 置(f)：异亮氨酸，甘氨酸或苏氨酸残基，位置(g)：苯丙氨酸， 丙氨酸，苏氨酸，亮氨酸，异亮氨酸或甘氨酸残基，位置(h)：丝氨 酸，亮氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，或谷氨酰胺残基，和位置(i)：丙 氨酸，赖氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，精氨酸或组氨酸残基。
换句话说，本发明的碱性蛋白酶具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序 列，其中，位于选自上述(a)-(i)的位置上的或位于相当于另一种 碱性蛋白酶的氨基酸序列的相应位置上的氨基酸残基，是一种特定的 氨基酸残基。所述碱性蛋白酶可以是野生型的，其变体或人工变体。
当本发明的碱性蛋白酶是一种变体时，被称为“具有SEQ ID NO： 1所示氨基酸序列的蛋白酶”或“另一种碱性蛋白酶”的蛋白酶，表示 诱变之前的碱性蛋白酶(可称之为“亲代碱性蛋白酶”)。通过将突 变导入这种亲代碱性蛋白酶的理想位点，可以获得本发明的碱性蛋白 酶。
“另一种碱性蛋白酶”可以是野生型的或野生型的变体。这种蛋 白酶优选具有抗氧化剂作用，并且，在通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰 胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定的分子量为43000±2000。其例子包括 其氨基酸序列与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少有80％的同源性的碱 性蛋白酶。特别优选的是这样的碱性蛋白酶，它的氨基酸序列与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少80％，优选至少87％，更优选至少90％， 更优选至少95％的同源性，在pH8或更高pH的碱性范围内工作，具有 抗氧化剂作用，在50℃下，在pH10的条件下处理10分钟之后，能保 留至少80％的原始活性，能被二异丙基氟磷酸(DFP)和苯甲基磺酰氟 (PMSF)抑制，并且通过SDS-PAGE测定的分子量为43000±2000。
本文所使用的术语“具有抗氧化剂作用”，表示当在30℃下，在 含有50mM过氧化氢和5mM氯化钙的20mM Britton-Robinson缓冲液 (pH10)中处理20分钟之后，所述蛋白酶的残余活性至少为原始活性 的50％。
“具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的碱性蛋白酶”的例子包括 KP43[源于芽孢杆菌菌株KSM-KP43(FERM BP-6532)，WO99/18218]， 而“其氨基酸序列与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少80％的同源 性的碱性蛋白酶”的例子包括蛋白酶KP9860(Genbank保藏号 AB046403)[源于芽孢杆菌菌株KSM-KP9860(FERM BP-6534)， WO99/18218]，蛋白酶KP9865(Genbank保藏号AB084155)[源于芽孢 杆菌菌株KSM-KP9865(FERM P-18566)，专利申请号2002-002653]， 蛋白酶E-1(Genbank保藏号AB046402)[源于芽孢杆菌菌株No.D-6 (FERM P-1592)，日本专利公开号49-71191]，蛋白酶Ya(Genbank 保藏号AB046404)[源于芽孢杆菌菌株YFERM BP-1029]，日本专利公 开号昭61-280268]，蛋白酶SD521[源于芽孢杆菌菌株SD-521 (Genbank保藏号AB046405)(FERM P-11162)，日本专利公开号Hei 3-191781]，蛋白酶A-1(Genbank保藏号AB046406)[源于 NCIB122489，WO88/01293]，和蛋白酶A-2(源于NCIB12513， WO98/56927)；通过用亮氨酸取代SEQ ID NO：1的氨基酸序列46号 位置上的氨基酸残基获得的变体，通过用丙氨酸取代57号位置上的氨 基酸残基获得的变体，通过用精氨酸取代103号位置上的氨基酸残基 获得的变体，通过用赖氨酸取代107号位置上的氨基酸残基获得的变 体，通过分别用赖氨酸和丙氨酸取代124号位置上的氨基酸残基获得 的变体，通过用丙氨酸取代136号位置上的氨基酸残基获得的变体， 通过用丙氨酸取代193号位置上的氨基酸残基获得的变体，通过分别 用天冬酰胺、谷氨酸、精氨酸、脯氨酸、苏氨酸、缬氨酸、组氨酸、 丝氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酰胺、天冬 氨酸、色氨酸、甘氨酸和苯丙氨酸取代195号位置上的氨基酸残基获 得的变体，通过用缬氨酸取代257号位置上的氨基酸残基获得的变体， 通过用丙氨酸取代342号位置上的氨基酸残基获得的变体，通过分别 用天冬氨酸和丝氨酸取代66和264号位置上的氨基酸残基获得的变体 (日本专利申请号2000-355166)；通过用精氨酸取代SEQ ID NO：1 的84号位置上的氨基酸残基获得的变体，通过用脯氨酸取代104号位 置上的氨基酸残基获得的变体，通过分别用丙氨酸和丝氨酸取代256 号位置上的氨基酸残基获得的变体，和通过用天冬酰胺取代369号位 置上的氨基酸残基获得的变体(日本专利申请号2001-114048)；和 通过分别用天冬酰胺、苏氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸和谷氨酰 胺取代SEQ ID NO：1氨基酸序列的251号位置上的氨基酸残基获得的 变体，以及通过分别用丝氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、缬氨酸和丙氨酸 取代256号位置上的氨基酸残基获得的变体(日本专利申请号2001- 329472)；与上述任意一种氨基酸序列具有至少80％，优选至少87％， 更优选至少90％，更优选至少95％的同源性的碱性蛋白酶。
氨基酸序列的同源性是通过Lipman-Pearson’s方法计算的 (Science，227，1435，1985)。
SEQ ID NO：1所示碱性蛋白酶的氨基酸残基优选为位置(a)上 的苏氨酸，位置(b)上的甘氨酸，位置(c)上的谷氨酸，位置(d) 上的异亮氨酸，位置(e)上的丝氨酸，位置(f)上的缬氨酸，位置 (g)上的酪氨酸，位置(h)上的苏氨酸，和位置(i)上的丝氨酸。 与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列具有至少80％的同源性的其他碱性蛋 白酶优选具有苏氨酸作为相当于位置(a)的位置上的氨基酸残基，丝 氨酸作为相当于位置(b)的位置上的氨基酸残基，谷氨酸作为相当于 位置(c)的位置上的氨基酸残基，异亮氨酸作为相当于位置(d)的 位置上的氨基酸残基，丝氨酸作为相当于位置(e)的位置上的氨基酸 残基，缬氨酸作为相当于位置(f)的位置上的氨基酸残基，酪氨酸作 为相当于位置(g)的位置上的氨基酸残基，苏氨酸作为相当于位置(h) 的位置上的氨基酸残基，和酪苏氨酸作为相当于位置(i)的位置上的 氨基酸残基。
当本发明的碱性蛋白酶是一种变体时，所述亲代碱性蛋白酶的优 选例子除了具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的碱性蛋白酶之外，还 包括与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列具有至少80％，优选至少87％， 更优选至少90％，更优选至少95％的同源性，并且具有上述酶促特性和 /或在相当于SEQ ID NO：1的位置(a)-(i)的位置上具有上述氨基 酸残基的蛋白酶。
“与之相应的位置上的氨基酸残基”可以通过使用诸如Lipman- Pearson’s方法的已知程序比较氨基酸序列，并且得出与存在于每一种 碱性蛋白酶的氨基酸序列上的保守氨基酸残基的最大同源性进行鉴 定。通过以不考虑氨基酸序列的插入或缺失的方式比较蛋白酶的氨基 酸序列，可以确定相应氨基酸残基在每一种蛋白酶序列上的位置。据 推测，所述相应位置存在于相同的三维位置上，并且能对有关蛋白酶 的特定功能产生类似影响。
根据图1，其中，通过上述方法对氨基酸序列进行比对，
(a)SEQ ID NO：1的65号位置上的氨基酸残基是苏氨酸残基。 通过采用上述方法，与之相应的位置上的氨基酸残基可以被确定为诸 如蛋白酶KP9860的65号位置上的苏氨酸残基。在本发明的碱性蛋白 酶中，65号位置上的氨基酸残基优选是脯氨酸残基。
(b)尽管SEQ ID NO：1的101号位置上的氨基酸残基是甘氨酸 残基，通过上述方法可以确定诸如蛋白酶E-1的与之相应的位置上的 氨基酸残基是100号位置上的丝氨酸残基。在本发明的碱性蛋白酶中， 101号位置上的氨基酸残基优选是天冬酰胺残基。
(c)尽管SEQ ID NO：1的163号位置上的氨基酸残基是谷氨酸 残基，通过上述方法可以确定诸如蛋白酶E-1的与之相应的位置上的 氨基酸残基是162号位置上的谷氨酸残基。在本发明的碱性蛋白酶中， 163号位置上的氨基酸残基优选是组氨酸，天冬氨酸，苯丙氨酸，赖氨 酸，天冬酰胺，丝氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，谷氨酰胺，苏氨酸或缬 氨酸残基，特别优选的是苏氨酸或缬氨酸残基。
(d)尽管SEQ ID NO：1的170号位置上的氨基酸残基是异亮氨 酸残基，通过上述方法可以确定诸如蛋白酶E-1的与之相应的位置上 的氨基酸残基是169号位置上的异亮氨酸残基。在本发明的碱性蛋白 酶中，170号位置上的氨基酸残基优选是缬氨酸或亮氨酸残基。
(e)尽管SEQ ID NO：1的171号位置上的氨基酸残基是丝氨酸 残基，通过上述方法可以确定诸如蛋白酶E-1的与之相应的位置上的 氨基酸残基是170号位置上的丝氨酸残基。在本发明的碱性蛋白酶中， 171号位置上的氨基酸残基优选是丙氨酸，谷氨酸、甘氨酸或苏氨酸， 特别优选的是甘氨酸或苏氨酸残基。
(f)尽管SEQ ID NO：1的273号位置上的氨基酸残基是缬氨酸 残基，通过上述方法可以确定诸如蛋白酶A-2的与之相应的位置上的 氨基酸残基是272号位置上的缬氨酸残基。在本发明的碱性蛋白酶中， 273号位置上的氨基酸残基优选是异亮氨酸，甘氨酸或苏氨酸残基，特 别优选的是异亮氨酸残基。
(g)尽管SEQ ID NO：1的320号位置上的氨基酸残基是酪氨酸 残基，通过上述方法可以确定诸如蛋白酶SD-521的与之相应的位置上 的氨基酸残基是319号位置上的酪氨酸残基。在本发明的碱性蛋白酶 中，320号位置上的氨基酸残基优选是苯丙氨酸，缬氨酸，苏氨酸，亮 氨酸，异亮氨酸或甘氨酸残基，特别优选的是苯丙氨酸残基。
(h)尽管SEQ ID NO：1的359号位置上的氨基酸残基是苏氨酸 残基，通过上述方法可以确定诸如蛋白酶Ya的与之相应的位置上的氨 基酸残基是358号位置上的苏氨酸残基。在本发明的碱性蛋白酶中， 359号位置上的氨基酸残基优选是丝氨基，亮氨酸，缬氨酸，异亮氨酸 或谷氨酸残基，特别优选的是丝氨酸残基。
(i)尽管SEQ ID NO：1的387号位置上的氨基酸残基是丝氨酸 残基，通过上述方法可以确定诸如蛋白酶D-521的与之相应的位置上 的氨基酸残基是386号位置上的酪氨酸残基。在本发明的碱性蛋白酶 中，387号位置上的氨基酸残基优选是丙氨基，赖氨酸，谷氨酰胺，谷 氨酸，精氨酸或组氨酸残基，特别优选的是丙氨酸残基。
与蛋白酶KP43的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的位置(a)65， (b)101，(c)163，(d)170，(e)171，(f)273，(g)320， (h)359和(i)387相应的位置以及这些位置上的氨基酸残基的具体 例子优选用“其他碱性蛋白酶”中的碱性蛋白酶表示(表1)。
                                                表1   位点                                        蛋白酶 KP43  KP9860  KP9865  E-1  Ya  SD-521  A-1  A-2     (a) 65Thr  65Thr  65Thr  65Pro  65Pro  65Pro  65Pro  65Pro     (b) 101Gly  101Ser  101Gly  100Ser  100Ser  100Ser  101Asn  100Gly     (c) 163Glu  163Glu  163Glu  162Glu  162Glu  162Glu  163Glu  162Glu     (d) 170Ile  170Ile  170Ile  169Ile  169Ile  169Ile  170Ile  169Ile     (e) 171Ser  171Ser  171Ser  170Ser  170Ser  170Ser  171Ser  170Ser     (f) 273Val  273Val  273Val  272Ile  272Ile  272Ile  273Ile  272Val     (g) 320Tyr  320Tyr  320Tyr  319Tyr  319Tyr  319Tyr  320Phe  319Phe     (h) 359Thr  359Thr  359Thr  358Thr  358Thr  358Thr  359Ser  358Thr     (i) 387Ser  387Ala  387Ser  386Tyr  386Tyr  386Tyr  387Ala  386Ala
在位置位置(a)65，(b)101，(c)163，(d)170，(e)171， (f)273，(g)320，(h)359或(i)387或与之相应的位置上具有 预定氨基酸残基的本发明的碱性蛋白酶具有增强了的分泌能力，特别 是当它是转化体时尤其如此(参见例2)，而在位置(c)163，(d) 170或(e)171或与之相应的位置上具有预定氨基酸残基的碱性蛋白 酶对酪蛋白具有特别强的比活性(参见例3)。
在本发明的碱性蛋白酶中，可以同时取代位置(a)-(i)中的 两个或两个以上氨基酸残基，因为这种取代既不会导致酶促活性的改 变，也不会导致酶促特性的改变。以下是在两个或两个以上位置上同 时进行取代的优选的具体例子。氨基酸用三个字母表示，而“+”表 示在紧随一个位置上的取代之后是另一个取代，而“/”表示所标出的 任何氨基酸都可以使用。
从提高分泌能力的角度出发，优选的双重取代例子包括Thr65Pro +Gly101Asn，Thr65Pro+Val273(Ile/Gly/Thr)，Gly101Asn+ Thr359(Ser/Leu/Val/Ile/Gln)，和Val273(Ile/Gly/Thr)+Tyr320 (Phe/Val/Thr/Leu/Ile/Gly)，特别优选的是Thr65Pro+Ser387Ala 和Thr359Ser+Ser387Ala。从增强比活性的角度出发，优选的例子 包括Glu163(Phe/Leu/Gln/Val)+Ser171Ala，Glu163(Ala/Asp/ Ile/Leu/Ser/Thr/Val)+Ser171Gly，和Glu163(Ala/His/Ile/ Lys/Leu/Gln/Thr/Val)+Serl71Thr，特别优选的是Glu163Thr+ Serl71Thr，Glu163Thr+Ser171Gly和Glu163Val+Ser171Gly。
从提高分泌能力角度出发，优选的三重取代的例子包括Thr65Pro +Gly101Asn+Val273(Ile/Gly/Thr)，Tyr320(Phe/Val/Thr/ Ileu/Ile/Gly)+Val273(Ile/Gly/Thr)+Ser387(Ala/Lys/Gln/ Glu/Arg/His)，和Thr65Pro+Tyr320(Phe/Val/Thr/Leu/Ile/Gly) +Thr359(Ser/Leu/Val/Ile/Gln)，优选Thr65Pro+GlyAsn+ Ser387Ala，Thr65Pro+Val673Ile+Tyr320Phe和Thr65Pro+ Tyr320Phe+Ser387Ala，特别优选的是Thr65Pro+Val273Ile+ Thr359Ser，Thr65Pro+Val273Ile+Ser387Ala和Thr65Pro+ Tyr320Gly+Ser387Ala。
从提高分泌能力角度出发，四重取代的例子包括Thr65Pro+ Gly101Asn+Val273(Ile/Gly/Thr)+Tyr320(Phe/Val/Thr/ Ieu/Ile/Gly)，Thr65Pro+Tyr320(Phe/Val/Thr/Ieu/Ile/Gly) +Thr359(Ser/Leu/Val/Ile/Gln)+Ser387(Ala/Lys/Gln/ Glu/Arg/His)，和Gly101Asn+Val273(Ile/Gly/Thr)+Tyr320 (Phe/Val/Thr/Ieu/Ile/Gly)+Ser387(Ala/Lys/Gln/Glu/ Arg/His)，优选Thr65Pro+Val273Ile+Thr359(Ser/Leu/ Ile/Val/Thr)+Ser387(Glu/Ala)，Thr65Pro+Val273Ile+Tyr320 (Val/Leu/Phe/Thr)+Ser387(Ala/His/Gln)；特别优选的是 Thr65Pro+Val273Ile+Thr359Ser+Ser387(Ala/Lys)，Thr65Pro +Val273Ile+Thr359Gln+Ser387Ala，Thr65Pro+Val273Ile+ Tyr320Phe+Ser387(Gln/Lys)，和Thr65Pro+Val273Ile+ Tyr320Ile+Sen387Gln。
还可以采用五重或六重取代。
例如，本发明的碱性蛋白酶可以通过以下方法获得。具体地讲， 可以通过以下步骤获得：将突变导入编码亲代碱性蛋白酶的克隆的基 因(SEQ ID NO：2)，用所得到的突变基因转化合适的宿主，培养所 得到的重组宿主，以及随后从培养液中收集目标碱性蛋白酶。编码亲 代碱性蛋白酶的基因的克隆可以用常用的重组DNA技术进行，例如按 照披露于WO99/18218或WO98/56927中的方法进行。
为了诱变编码亲代碱性蛋白酶的基因，可以采用常用的随机诱变 或位点专一诱变中的任一种。更具体地讲，可以用诸如“定点诱变系 统Mutan-Super Express Km试剂盒”(Takara Bio的产品)的试剂 盒进行诱变。可以通过重组PCR(聚合酶链式反应)方法(PCR方法， Academic Press，New York，1990)，用另一种基因的与目标序列相 应的序列取代一种基因的目标序列。
为了用所得到的突变基因生产本发明的蛋白酶，例如，可以使用 将所述突变基因连接在能够稳定扩增它的载体上的方法，从而导致宿 主细菌的转化，或者将所述突变基因导入能够稳定维持该突变基因的 宿主细菌的染色体DNA上。满足上述条件的宿主细胞包括属于芽孢杆 菌属、大肠杆菌、霉菌、酵母和放线菌属的微生物。使用上述菌株， 可以将业已导入了所述突变基因的宿主细胞接种到含有碳源、氮源和 其他必需养分的可同化的培养基中，然后按常规方法培养。
可以按照常用的酶收获和纯化方法，从由此获得的培养液中收获 所述碱性蛋白酶，并进行纯化。例如，可以通过离心分离或过滤除去 培养液中的细菌，然后按常规方法纯化所述酶获得目标酶。由此获得 的酶溶液可以直接使用，或者按已知方法进一步纯化、结晶、粉碎或 颗粒化。
由此获得的具有抗氧化剂能力的蛋白酶，不会因为高浓度的脂肪 酸而抑制其酪蛋白酶解活性。通过SDS-PAGE测定其分子量为43000± 2000，在碱性范围内具有活性。当它是转化体形式时，具有增强了的 分泌能力，和/或与亲代碱性蛋白酶相比，增强了对酪蛋白的比活性。
本文所使用的术语“具有高的分泌能力”，表示在与类似于亲代 碱性蛋白酶的条件下测定上清液中的蛋白酶活性和蛋白含量时(例 如，在接种到一种培养基中之后，在37℃下摇晃培养3天，该培养基 包括8％(w/v)聚蛋白胨S，0.3％酵母提取物，10％麦芽糖，0.04％硫 酸镁7水合物，0.2％磷酸二氢钾，1.5％无水碳酸钠，和30ppm四环素)， 所述碱性蛋白酶变体至少表现出预定的酶活性或蛋白含量。例如，这 意味着可能发现酶活性或蛋白含量提高了至少5％，优选至少10％，更 优选至少20％。当不能确定比活性的任何变体时，可以测定酶活性或蛋 白含量中的任意一项，因为亲代碱性蛋白酶和碱性蛋白酶变体被认为 在酶活性与蛋白含量的比例上是相似的。
与具有抗氧化剂作用的亲代碱性蛋白酶相比，对酪蛋白底物具有 增强了的比活性的碱性蛋白酶变体，不会因为高浓度的脂肪酸而抑制 其酪蛋白酶解活性，通过SDS-PAGE测定该变体的分子量为43000± 2000，并且在碱性范围内具有活性。特别优选的是具有亲代碱性蛋白 酶的上述各种特性的蛋白酶变体。
因此，本发明的碱性蛋白酶可以作为一种酶掺入各种洗涤剂组合 物中。尽管对添加到洗涤剂组合物中的本发明的碱性蛋白酶的用量没 有具体限制，只要它能发挥其活性就行，不过，通常是以每千克洗涤 剂组合物0.1-5000Pu的用量添加的。出于经济方面的考虑，优选500Pu 或更低。
可以将各种酶与本发明的碱性蛋白酶组合应用于本发明的洗涤剂 组合物中。其例子包括水解酶，氧化酶，还原酶，转移酶，裂合酶， 异构酶，连接酶和合成酶。其中，除了本发明碱性蛋白酶以外的蛋白 酶，优选是纤维素酶，角蛋白酶，酯酶，角化酶，淀粉酶，脂酶，支 链淀粉酶，果胶酶，甘露糖酶，葡糖苷酶，葡聚糖酶，胆甾醇氧化酶， 过氧化物酶，和漆酶，其中特别优选的蛋白酶是纤维素酶，淀粉酶和 脂酶。蛋白酶包括商业化销售的Alcalase(商标；Novozymes的产品)， Esperase(商标；Novozymes的产品)，Savinase(商标；Novozymes 的产品)，Everlase(商标；Novozymes的产品)，Kannase(商标； Novozymes的产品)，Properase(商标；Genencor International 的产品)，Purafect(商标；Genencor International的产品)和 KAP(Kao的产品)。纤维素酶包括Celluzyme(商标；Novozymes的 产品)，Carezyme(商标；Novozymes的产品)，KAC(Kao的产品)， 披露于日本专利公开号Hei10-313859中的由芽孢杆菌菌株KSM-S237 生产的碱性纤维素酶，和披露于日本专利申请号2002-116553中的突 变的碱性纤维素(都是Kao的产品)。淀粉酶包括Termamyl(商标； Novozymes的产品)，Duramyl(商标；Novozymes的产品)，Purastar (商标；Genencor International的产品)和KAM(Kao的产品)。 脂酶包括Lipolase(商标；Novozymes的产品)，和Lipolase Ultra (商标；Novozymes的产品)。
当除了本发明的碱性蛋白酶以外的蛋白酶也被掺入洗涤剂组合物 中时，其用量优选为每千克0.1-500PU。当组合使用所述纤维素酶时， 其添加量优选为每千克洗涤剂组合物300-3000000KU，这一用量是根 据通过披露于[0020]日本专利公开号Hei10-313859中的酶促活性测 定方法测定的单位(KU)确定的。当组合使用淀粉酶时，其用量优选 为每千克0.1-500PU。当组合使用所述纤维素酶时，其添加量优选为 每千克洗涤剂组合物50-500000IU，这一用量是根据通过披露于[0040] 日本专利公开号Hei11-43690中的淀粉酶活性测定方法测定的单位 (IU)确定的。当组合使用脂酶时，其添加量优选为每千克洗涤剂组 合物10000-100000LU，这一用量是根据通过披露于日文公开(PCT) 号Hei8-500013的例1中的脂酶活性测定方法测定的单位(LU)确定 的。
可以将已知的洗涤成分掺入本发明的洗涤剂组合物中。所述已知 洗涤成分如下。
(1)表面活性剂
将用量为0.5-60wt.％的表面活性剂掺入洗涤剂组合物中。优选分 别向粉状洗涤剂组合物和液体洗涤剂组合物中添加10-45wt.％和20- 50wt.％的表面活性剂。当本发明的洗涤剂组合物是漂白洗涤剂或自动 洗碗洗涤剂时，洗涤剂的添加量通常为1-10wt.％，优选1-5wt.％。
作为用于本发明洗涤剂组合物的表面活性剂，可以单独或组合使 用阴离子型表面活性剂，非离子型表面活性剂，两性离子表面活性剂 和阳离子型表面活性剂。其中，优选阴离子型表面活性剂和非离子型 表面活性剂。
非离子型表面活性剂的例子包括C10-18醇的硫酸盐，烷氧基化 C8-20醇的硫酸盐，烷基苯磺酸盐，石蜡磺酸盐，α-烯属磺酸盐，α -磺基脂肪酸盐，α-磺基脂肪酸的烷基酯盐和脂肪酸盐。在本发明中， 特别优选的是具有C10-14，更优选C18-15烷基直链的直链烷基苯磺 酸盐。作为平衡离子，优选碱金属盐和铵，其中特别优选的是钠和/或 钾，单乙醇胺和二乙醇胺。
非离子型表面活性剂的优选例子包括聚氧化亚烃烷基(C8-20) 醚，烷基聚糖苷，聚氧化亚烃烷基(C8-20)苯基醚，聚氧化亚烃山梨 聚糖脂肪酸(C8-22)酯，和聚氧化亚烃二醇脂肪酸(C8-22)酯，和 聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物。其中，特别优选的非离子型表面活性 剂是通过将4-20摩尔的诸如氧化乙烯或氧化丙烯的氧化亚烃添加到 C10-18醇中获得的聚氧化亚烃烷基醚[HLB数量(通过Griffin方法计 算)为10.5-15.0，优选11.0-14.5]。
(2)二价金属离子清除剂
以0.01-50wt％，优选5-40wt％的用量将二价金属离子清除剂添 加到洗涤剂组合物中。可以掺入本发明洗涤剂组合物中的二价金属离 子清除剂的例子包括诸如三聚磷酸盐，焦磷酸盐和正磷酸盐的缩聚磷 酸盐，诸如沸石的硅铝酸盐，合成的层状结晶硅酸盐，次氮基三乙酸 盐，乙二胺四乙酸，柠檬酸盐，异柠檬酸盐和聚缩醛羧酸盐。其中， 特别优选的是结晶硅铝酸盐(合成的沸石)。在A型、X型和P型的沸 石中，A型沸石是特别优选的。平均一级粒度为0.1-10微米，特别是 0.1-5微米的合成沸石是适合使用的。
(3)碱性试剂
以0.01-80wt％，优选1-40wt％的用量将碱性试剂添加到洗涤剂 组合物中。添加到粉状洗涤剂中的碱性试剂包括碱金属碳酸盐，如碳 酸钠，通常被称为稠苏打或轻苏打，以及JIS No.1，2或3的非晶碱 金属硅酸盐。所述无机碱性试剂在干燥洗涤剂时能有效形成每个颗粒 的核心，因此，能够制备具有良好流动性的比较坚硬的洗涤剂。除了 上述试剂之外，碳酸氢三钠和碳酸氢钠也可用作碱性试剂。诸如三聚 磷酸盐的磷酸盐也具有碱性试剂的作用。除了上述碱性试剂之外，可 以添加到液体洗涤剂中的碱性试剂的例子还包括氢氧化钠和1-，2-， 和3-乙醇胺。可将其用作表面活性剂的平衡离子。
(4)抗再沉积剂
以0.001-10wt％，优选1-5wt％的用量将抗再沉积剂添加到洗涤 剂组合物中。添加到本发明洗涤剂组合物中的抗再沉积剂的例子包括 聚乙二醇，羧酸聚合物，聚乙烯醇，和聚乙烯吡咯烷酮。其中，羧酸 聚合物具有金属离子清除功能，和将来自衣物的固体颗粒状污物分散 到洗涤液中的能力，还具有抗再沉积作用。羧酸聚合物包括丙烯酸， 异丁烯酸或亚甲基丁二酸等的均聚物或共聚物。作为共聚物，优选通 过共聚上述单体和马来酸获得的共聚物。共聚物的分子量优选为数千 -100000。同样，作为上述羧酸聚合物，优选诸如聚缩水甘油的聚合物， 诸如羧甲基纤维素的纤维素衍生物，或诸如聚天冬氨酸的氨基羧酸聚 合物，因为它们同样具备金属离子清除剂和分散剂的能力，并且具有 抗再沉积作用。
(5)漂白剂
优选以1-10wt％的用量将诸如过氧化氢或过碳酸盐的漂白剂添加 到洗涤剂组合物中。在使用漂白剂时，可以根据洗涤剂组合物的量添 加0.01-10wt％的漂白激活剂，如四乙基乙二胺(TAED)或披露于日 本专利公开号Hei6-316700中的漂白激活剂。
(6)荧光增白剂
作为荧光增白剂，可以将联苯类(如Tinopal CBS-X)和二苯乙 烯类(如DM荧光染料)增白剂添加到本发明的洗涤剂组合物中。优选 以占洗涤剂组合物0.001-2％的用量添加。
(7)其他成分
在本发明的洗涤剂组合物中，可以添加衣物洗涤剂领域公知的助 洗剂、软化剂、还原剂(如亚硫酸氢盐)、消泡剂(如硅氧烷)、芳 香剂和其他添加剂。
可以通过组合使用通过上述方法获得的本发明的碱性蛋白酶和上 述已知洗涤剂成分，用常规方法制备本发明的洗涤剂组合物。洗涤剂 形式可以根据使用目的进行选择。例如，包括液体、粉末、颗粒、糊 剂和固体。
由此获得的本发明的洗涤剂组合物可以用作衣物洗涤剂，漂白 剂，硬表面清洁剂，管道清洗剂，人工牙齿清洁剂，用于医疗器械的 消毒清洁剂等。
实施例
[蛋白酶活性测定方法——酪蛋白方法]
在30℃下，将1.0毫升含有1％(w/v)酪蛋白的50mM硼酸缓冲液 (pH10.5)保持5分钟，然后添加0.1毫升的酶溶液，并且让所得到 的混合物反应15分钟。将2.0毫升反应终止溶液(0.11M三氯乙酸- 0.22M乙酸钠-0.33M乙酸)添加到该反应混合物中。将该混合物在室 温下放置30分钟，然后过滤。通过Lowry等的改进方法测定滤液中的 酸溶性蛋白。具体地讲，将2.5毫升碱性铜溶液[1％酒石酸钠.钾∶1％5 水合硫酸铜∶2％碳酸钠∶0.1N氢氧化钠＝1∶1∶100]添加到0.5毫升 的滤液中，然后将所得到的混合物在室温下放置10分钟。然后添加 0.25毫升的苯酚溶液[用蒸馏水稀释2倍的苯酚试剂(Kanto Kagaku 的产品)]。将所得到的混合物在30℃下保持30分钟，然后测定660 纳米波长下的吸收值。一个蛋白酶单位(1PU)被定义为在上述反应条 件下，在1分钟内释放出相当于1mM酪氨酸的酸溶性蛋白酶解产物所 需要的酶的量。
例1
将随机诱变导入碱性蛋白酶结构基因中，该基因源于芽孢杆菌菌 株KSM-KP43，它具有大约2.0kb，包括一个终止密码子。为了导入随 机诱变，将没有错误整合回收能力的Taq聚合酶Takara Taq(Takara Bao的产品)用作DNA聚合酶，以便在PCR中使用一个碱基的错误整 合。首先，使用能够扩增该2.0kb DNA的引物1(SEQ ID NO：3)和 引物2(SEQ ID NO：4)进行PCR。引物1通过BamHI接头连接在正 义链的5’末端，而引物2通过XbaI接头连接在反义链的5’末端。作为 使用的反应系统，在100微升混合物中含有10纳克模板DNA，10皮摩 尔每一种引物，20纳摩尔dNTP，10微升Takara Taq-加成反应缓冲 液和2.5U Taq聚合酶。在94℃下，在PCR条件下对模板DNA进行变 性2分钟，然后进行30轮PCR，每一轮包括以下处理：94℃1分钟， 55℃1分钟，和72℃2分钟。通过PCR产物纯化试剂盒(Roche的产品) 纯化PCR产物，然后用100微升无菌水洗脱。用1微升的洗脱物作为 DNA模板，进行第2轮PCR。纯化由此获得的PCR产物，并用于下文披 露的检测。
用BamHI和XbaI(Roche)裂解大约2.0kb的扩增DNA片段的限 制酶接头。作为用于整合扩增DNA的表达载体，pHA64(日本专利申请 号Hei8-323050；在启动子64下游具有BamHI和XbaI位点)能够在 属于芽孢杆菌的细菌中复制。混合用BamHI和XbaI处理过的扩增DNA 片段和用BamHI和XbaI作过类似处理的pHA64，然后用“Ligation High”(Toyobo产品)进行连接酶反应。通过乙醇沉淀从连接酶反应 混合物中收集DNA，并将它用作随后转化的DNA。
将芽孢杆菌菌株KSM-KP43(下面将简称为“菌株KP-43”)用作 转化的宿主细胞。转化方法采用电穿孔方法，并且用“SSH-10” (Shimadzu的产品)和基因脉冲池(BioRad的产品)进行转化。
在含有脱脂乳的碱性琼脂培养基[含有1％脱脂乳(Difco的产 品)，1％细菌培养用胰化蛋白胨(Difco的产品)，0.5％酵母提取物 (Difco的产品)，0.5％氯化钠，1.5％琼脂，0.05％无水碳酸钠和15ppm 四环素]上培养KP43菌株的转化体，并且观察光晕的形成，以便判断 是否导入了所述蛋白酶基因。
选择具有在pHA64上插入了蛋白酶基因的质粒的转化过的菌株 KP43，并用于随后的培养。
例2
在分离单菌落并且证实光晕形成之后，将在例1中获得的转化体 分别接种到5毫升种子培养基A[6.0％(w/v)聚蛋白胨S(Nippon Pharmaceutical的产品)，0.1％酵母提取物，1.5％麦芽糖，0.02％硫 酸镁7水合物，0.1％磷酸二氢钾，0.3％无水碳酸钠和30ppm四环素] 中，并且在30℃下以320rpm的旋转速度预培养过夜。将由此获得的 种子培养基(1％(v/v))接种到500毫升Sakaguchi烧瓶中的20毫 升主培养基[8％(w/v)聚蛋白胨S，0.3％酵母提取物，10％麦芽糖，0.04％ 硫酸镁7水合物，0.2％磷酸二氢钾，1.5％无水碳酸钠和30ppm四环素] 中，并且在30℃下以121rpm的旋转速度培养3天。将由此获得的培 养基进行离心，并测定培养上清液中的蛋白酶活性。采用所述酪蛋白 方法测定蛋白酶活性，同时用蛋白测定试剂盒(Wako Pure Chemicals 的产品)测定蛋白含量。筛选突变的蛋白酶基因，该基因在蛋白酶活 性方面的增强，被认为是与通过在类似条件下培养具有野生型酶基因 的转化体获得的培养上清液的蛋白酶活性进行比较的结果。培养上清 液中蛋白含量表现出大体上与蛋白酶活性成比例地提高，这表明增强 蛋白含量分泌所需要的突变业已被导入由此获得的变体中。
用“高纯度质粒分离试剂盒”(Roche产品)从筛选的转化体中收 集所述质粒，并且测定其核苷酸序列。用300纳克质粒DNA作模板， 使用一种引物和“Big Dye DNA测序试剂盒”(Applied Biosystems 产品)在20微升反应系统中进行PCR。用“DNA测序仪377型”(Applied Biosystems产品)对PCR产物进行分析。
结果发现，具有增强了的蛋白酶活性的变体在65号位置上的苏氨 酸，在101号位置上的甘氨酸，在273号位置上的缬氨酸，在320号 位置上的酪氨酸，在359号位置上的苏氨酸，和在387号位置上的丝 氨酸分别被脯氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸、苯丙氨酸，丝氨酸和丙氨 酸所取代。发现通过这种取代可以将蛋白酶活性提高大约5％(表2)。
研究了由于组合使用上述突变位点所导致的蛋白酶活性的增强。 使用下文所披露的引物和“定点诱变系统Mutan-Super Express Km 试剂盒”作为位点专一性诱变手段，研究了突变位点的组合。
引物3：65号位置上的苏氨酸(T)被脯氨酸(P)取代(SEQ ID NO： 5)
引物4：101号位置上的甘氨酸(G)被天冬酰胺(N)取代(SEQ ID NO：6)
引物5：273号位置上的缬氨酸(V)被异亮氨酸(I)取代(SEQ ID NO：7)
引物6：320号位置上的酪氨酸(Y)被苯丙氨酸(F)取代(SEQ ID NO：8)
引物7：359号位置上的苏氨酸(T)被丝氨酸(S)取代(SEQ ID NO：9)
引物8：387号位置上的丝氨酸(S)被丙氨酸(A)取代(SEQ ID NO：10)
通过将上述筛选获得的突变蛋白酶基因导入具有用于卡那霉素筛 选的琥珀突变标记的pKF18k的多克隆位点中的BamHI和XbaI位点， 构建用于导入突变的模板质粒。
为了进行导入位点专一性突变的PCR，采用“Takara LA Taq” (Takara的产品)。用于导入突变的PCR是使用5’末端磷酸化筛选引 物(“Mutan-Super Express Km”的试剂盒成分)和向其中导入了突 变的引物3-8各5皮摩尔，并使用10纳克模板质粒。在94℃下，在反 应条件下，将模板DNA变性2分钟，然后进行30轮PCR，每一轮包括 以下处理：94℃1分钟，55℃1分钟，和72℃4分钟。用所获得的PCR 产物转化大肠杆菌菌株MV1184，以便获得突变质粒。按照上述核苷酸 序列测定方法，证实所得到的突变质粒的突变位点。
将通过位点专一性诱变导入了突变的蛋白酶基因导入pHA64，用于 转化菌株KP-43，然后在上述培养条件下培养。与研究过的野生型酶相 比，所述突变位点的组合能够加强蛋白酶活性。
结果，在以下组合中发现蛋白酶活性提高了10-30％(突变位点的 组合通过+表示，表2)：T65P+S387A，T359S+S387A，T65P+ V273I+Y320F，T65P+V273I+T359S，T65P+V273I+S387A， T65P+Y320F+S387A，T65P+G101N+S387A，和T65P+V273U +T359S+S387A。
采用以下引物，分别用需要的氨基酸残基取代了65、101、273、 320、359和387号位置上的氨基酸残基。然后研究所述每一个位点上 的氨基酸残基是否能够用除了上述取代氨基酸残基以外的氨基酸残基 取代，并且证实所述氨基酸残基的组合是可以取代的。
引物9：65号位置上的苏氨酸(T)被需要的氨基酸残基(X)所 取代(SEQ ID NO：11)
引物10：101号位置上的甘氨酸(G)被需要的氨基酸残基(X)所 取代(SEQ ID NO：12)
引物11：273号位置上的缬氨酸(V)被需要的氨基酸残基(X)所 取代(SEQ ID NO：13)
引物12：320号位置上的苏氨酸(T)被需要的氨基酸残基(X) 所取代(SEQ ID NO：15)
引物14：387号位置上的丝氨酸(S)被需要的氨基酸残基(X) 所取代(SEQ ID NO：16)
结果发现，与野生型相比，当273号位置上的缬氨酸被异亮氨酸、 甘氨酸或苏氨酸所取代，320号位置上的酪氨酸被苯丙氨酸、缬氨酸、 苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或甘氨酸所取代，359号位置上的苏氨酸被 丝氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或谷氨酰胺所取代，并且387号 位置上的丝氨酸被丙氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸或组 氨酸所取代时，酶的分泌增加，这表明可以在每一个位置上实现所述 氨基酸的取代。
下面是某些组合的结果：在以下组合中发现蛋白酶活性提高了 10-30％(表2)：T65P+Y320F+S387E，T65P+Y320G+S387A， T65P+V273I+T359S+S387E，T65P+V273I+T359L+S387A， T65P+V273I+T359I+S387A，T65P+V273G+T359S+S387A， T65P+V373I+T359S+S387K，T65P+V273I+T359V+S387A， T65P+V273I+T359Q+S387A，T65P+V273I+Y320F+S387K， T65P+V273I+Y320F+S387E，T65P+V273I+Y320F+S387K， T65P+V273I+Y320F+S387A，T65P+V273I+Y320L+S387H， T65P+V273I+Y320V+S387Q，和T65P+V273I+Y320I+S387Q。
                    表2     相对量的活性(％)     野生型     100     T65     106     G101N     104     V273I     105     Y320F     105     T359S     106     S387A     106     T65P+S387A     107     T359S+S387A     109     T65P+G101N+S387A     114     T65P+V273I+Y320F     115     T65P+V273I+T359S     124     T65P+V273I+S387A     122     T65P+Y320F+S387A     123     T65P+Y320F+S387E     115     T65P+V320G+S387A     122     T65P+V273I+T359S+S387A     130     T65P+V273I+T359S+S387E     111     T65P+V273I+T359L+S387A     109     T65P+V273I+T359I+S387A     117     T65p+V273G+T359S+S387A     113     T65P+V273I+T359S+S387K     129     T65P+V273I+T359V+S387A     118     T65P+V273I+T359Q+S387A     132     T65P+V273I+Y320T+S387A     121     T65P+V273I+Y320F+S387E     128     T65P+V273I+Y320F+S387K     127     T65P+V273T+Y320F+S387A     123     T65P+V273I+Y320L+S387H     113     T65P+V273I+Y320V+S387Q     120     T65P+V273I+Y320I+S387Q     130
业已证实，通过上述突变位点的任意一种组合所获得的碱性蛋白 酶在其转化体形式下增强了所述酶的分泌，同时又保持了其亲代碱性 蛋白酶的特征，更具体地讲，具有抗氧化剂作用，不会因为高浓度脂 肪酸而抑制其酪蛋白酶解活性，通过SDS-PAGE测定其分子量为43000 ±2000，并且在碱性范围内具有活性。
例3
在分离单菌落并且证实光晕形成之后，将在例1中获得的转化体 分别接种到试管中的5毫升种子培养基[6.0％(w/v)聚蛋白胨S(Nippon Pharmaceutical的产品)，0.1％酵母提取物，0.1％麦芽糖，0.02％硫 酸镁7水合物，0.1％磷酸二氢钾，0.3％无水碳酸钠和30ppm四环素] 中，并且在30℃下以320rpm的旋转速度预培养过夜。将由此获得的 种子培养基(1％(v/v))接种到500毫升Sakaguchi烧瓶中的20毫 升主培养基[8％(w/v)聚蛋白胨S，0.3％酵母提取物，10％麦芽糖，0.04％ 硫酸镁7水合物，0.2％磷酸二氢钾，1.5％无水碳酸钠和30ppm四环素] 中，并且在30℃下以121rpm的旋转速度培养3天。将由此获得的培 养基进行离心，并测定培养上清液中的蛋白酶活性。蛋白酶活性是通 过采用酪蛋白作底物的活性测定方法测定的，同时用“蛋白测定试剂 盒”(Wako Pure Chemicals的产品)测定蛋白含量。筛选突变的蛋 白酶基因，该基因在蛋白酶活性方面的增强被认为是与通过在类似条 件下培养具有野生型酶基因的转化体获得的培养上清液的蛋白酶活性 进行比较的结果。与培养上清液中蛋白酶活性的增强相比，蛋白含量 的增加不太明显，这表明增强所述酶的比活性所必需的突变被导入了 由此获得的突变蛋白酶基因中。
用“高纯度质粒分离试剂盒”(Roche产品)从筛选的转化体中收 集所述质粒，并且测定其碱基序列。用300纳克质粒DNA作模板，使 用一种引物和“Big Dye DNA测序试剂盒”(Applied Biosystems产 品)在20微升反应系统中进行PCR。用“DNA测序仪377型”(Applied Biosystems产品)对PCR产物进行分析。
结果发现，具有增强了的蛋白酶活性的变体在163号位置上的谷 氨酸，170号位置上的异亮氨酸，171号位置上的丝氨酸分别被组氨酸， 缬氨酸和丙氨酸所取代。
对一部分培养基进行稀释，然后加样到用含有2mM氯化钙的10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)平衡的“DEAE-Toyopearl”(Tosoh的产 品)上，以便收集非吸收性级份，从而获得基本上均匀的蛋白酶。测 定由此纯化的酶的蛋白含量和酪蛋白酶解活性，并且计算其比活性。 结果发现，通过导入上述突变会导致蛋白酶比活性提高大约15-20％(表 3)。
研究了通过用一种需要的氨基酸取代上述突变位点而增强的蛋白 酶活性。使用下文所披露的引物和“定点诱变系统Mutan-Super Express Km试剂盒”作为位点专一性诱变手段，研究了突变位点的组 合。
引物15：163号位置上的谷氨酸(E)被需要的氨基酸残基(X) 所取代(SEQ ID NO：17)
引物16：170号位置上的异亮氨酸(I)被需要的氨基酸残基(X) 所取代(SEQ ID NO：18)
引物17：171号位置上的丝氨酸(S)被需要的氨基酸残基(X) 所取代(SEQ ID NO：19)
引物18：163号位置上的谷氨酸(E)和171号位置上的丝氨酸(S) 分别被需要的氨基酸残基(X)所取代(SEQ ID NO：20)
通过将上述筛选获得的突变蛋白酶基因导入具有用于卡那霉素筛 选的琥珀突变标记的pKF18k的多克隆位点中的BamHI和XbaI位点， 构建用于导入突变的模板质粒。
为了进行导入位点专一性突变的PCR反应，采用“Takara LA Taq” (Takara的产品)。使用5’末端磷酸化筛选引物(“Mutan-Super Express Km”的试剂盒成分)，导入了突变的引物3-8各5皮摩尔和 10纳克模板质粒进行导入突变的PCR。在94℃下，在PCR反应条件下 将模板DNA变性2分钟，然后进行30轮PCR，每一轮包括以下处理： 94℃1分钟，55℃1分钟和72℃4分钟。用所获得的PCR产物转化大肠 杆菌菌株MV1184，以便获得突变基因。按照上述碱基序列测定方法证 实所得到的突变基因的突变位点。
将通过位点专一性诱变导入了突变的蛋白酶基因导入pHA64，用于 转化菌株KP-43，然后在上述条件下培养并纯化。与研究过的野生型酶 相比，所述氨基酸取代能够加强蛋白酶比活性。
结果发现，在以下组合中所述比活性提高了10-30％(表3)： E163I，E163L，E163N，E163T，E163V，I170L，S171D，S171G，S171T， E163F+S171A，E163L+S171A，E163Q+S171A，E163V+S171A， E163A+171G，E163D+S171G，E163I+S171G，E163L+S171G， E163S+171G，E163T+S171G，E171V+S171G，E163A+171T， E163H+S171T，E163I+S171T，E163K+S171T，E163L+S171T， E163Q+S171T，E163T+S171T和E163V+S171T。
                 表3     相对量的活性(％)     野生型     100     E163H     119     E163I     125     E163L     125     E163N     109     E163T     155     E163V     147     I170V     115     I170L     117     S171A     118     S171D     109     S171G     136     S171T     126     E163F+S171A     134     E163L+S171A     125     E163Q+S171A     108     E163V+S171A     131     E163A+S171G     113     E163D+S171G     119     E163I+S171G     104     E163L+S171G     106     E163S+S171G     106     E163T+S171G     156     E171V+S171G     125     E163A+S171T     119     E163H+S171T     117     E163I+S171T     131     E163K+S171T     144     E163L+S171T     144     E163Q+S171T     120     E163T+S171T     169     E163V+S171T     169
业已证实通过上述任意一种突变组合获得的碱性蛋白酶具有增强 了的针对酪蛋白的比活性，同时保留了其亲代碱性蛋白酶的特征，例 如，具有抗氧化剂作用，不会因为高浓度脂肪酸而抑制其酪蛋白酶解 活性，通过SDS-PAGE测定其分子量为43000±2000，并且在碱性范围 内具有活性。
例4
(1)洗涤剂的制备
向体积为1立方米的装有搅拌叶片的水箱中注入465千克水，当 水箱中的水温达到55℃时，添加135千克40％(w/v)聚丙烯酸钠的水 溶液。搅拌所得到的混合物15分钟，然后添加120千克碳酸钠，60 千克硫酸钠，9千克亚硫酸钠和3千克荧光染料。再搅拌15分钟，然 后添加300千克沸石。搅拌该混合物30分钟，以便得到均匀的糊剂(该 糊剂的含水量为50％wt)。通过从安装在喷雾干燥塔顶部附近的高压喷 头中喷出该糊剂，获得基础颗粒(从喷雾干燥塔的底部输入225℃的高 温气体，并且以105℃的温度从其顶部排出气体。
然后将100份重量的所得到的基础颗粒填充到Loedige混合器中 (Matsuzaka Giken的产品，容量：20升，装有一个套管)。在主轴 搅拌条件下(150rpm)用3分钟时间添加含有20份重量的非离子型表 面活性剂，22份重量的直链烷基(C10-13)-苯磺酸钠，4份重量的脂 肪酸(C14-18)的钠盐，2份重量的聚乙二醇和4份重量的水组成的 混合物，然后搅拌5分钟。向所述搅拌器中添加20份重量的结晶硅酸 钠和10份重量的沸石，以便覆盖其表面，从而获得洗涤剂基料。
通过将99％wt的洗涤剂基料与0.5％wt的蛋白酶颗粒和0.5％wt的 芳香剂混合，获得颗粒状洗涤A的成品。
(2)所使用的原材料
非离子型表面活性剂：“Emulgen 108KM”(Kao的产品)，向其 中添加了平均8.5M的还氧乙烷
聚丙烯酸钠的水溶液：平均分子量为10000(按照在日本专利公开 号Hei2-24283的实施例中披露的方法制备)
碳酸钠：稠苏打(Central Glass的产品)
沸石：“沸石A”，平均粒度为3.5微米(Tosoh的产品)
聚乙二醇：“K-PEG6000”(平均分子量为8500，Kao的产品)
结晶硅酸钠：“SKS-6粉”(Hoechst Tokuyama的产品)
本发明的蛋白酶颗粒：按照日本专利公开号昭62-257990的例1 中披露的方法获得颗粒(PU/克)，如表2和3所披露的，将本发明的 每一种溶化的碱性蛋白酶制剂颗粒化
荧光染料：“Tinopal CBS-X”(Ciba Geizy的产品)
例5
(1)洗涤剂的制备
在250℃的热空气温度下对固体含量为50wt％的糊剂进行喷雾干 燥，以便基础颗粒含有7wt％的聚丙烯酸钠(平均分子量为100000)， 26wt％的碳酸钠，20wt％的硫酸钠，6wt％的氯化钠，0.5wt％的荧光 染料，40wt％的沸石和0.5wt％的水。
然后，将100份重量的所得到的基础颗粒装入Loediege搅拌器 (Matsuzaka Giken的产品，容量：20升，装有一个套管)中。在主 轴搅拌条件下(150rpm)用3分钟时间添加含有20份重量的非离子型 表面活性剂，22份重量的直链烷基(C10-13)-苯磺酸钠，4份重量的 脂肪酸(C14-18)的钠盐，2份重量的聚乙二醇和4份重量的水组成 的混合物，然后搅拌5分钟。向所述搅拌器中添加20份重量的结晶硅 酸钠和10份重量的沸石，以便覆盖其表面，从而获得洗涤剂基料。
通过混合95％wt的洗涤剂基料与2.8％wt的漂白颗粒，1.2％wt的 漂白激活剂颗粒，0.5％wt的本发明的蛋白酶颗粒和0.5％wt的芳香剂 获得颗粒状洗涤B的成品。
(2)所使用的原材料
非离子型表面活性剂：“Emulgen 108KM”(Kao的产品)，向其 中添加了平均8.5M的还氧乙烷
聚丙烯酸钠的水溶液：平均分子量为10000(按照在日本专利公开 号Hei2-24283的实施例中披露的方法制备)
碳酸钠：稠苏打(Central Glass的产品)
沸石：“沸石A”，平均粒度为3.5微米(Tosoh的产品)
聚乙二醇：“K-PEG6000”(平均分子量为8500，Kao的产品)
结晶硅酸钠：“SKS-6粉”(Hoechst Tokuyama的产品)
本发明的蛋白酶颗粒：按照日本专利公开号昭62-257990的例1 中披露的方法获得颗粒(PU/克)，如表2和3所披露的，将本发明的 每一种溶化的碱性蛋白酶制剂颗粒化
荧光染料：“Tinopal CBS-X”(Ciba Geizy的产品)
漂白颗粒：碳酸钠.过氧化氢加成物(以用于制备[0019]的日本专 利公开号2000-256699中披露的漂白颗粒的类似方法获得)
漂白激活剂颗粒：颗粒状月桂酰羟苯磺酸钠(以用于制备[0018] 的日本专利公开号2000-256699中披露的漂白颗粒的类似方法获得)
例6
制备了表4所示的液体洗涤剂组合物(洗涤剂C和洗涤剂D)
                         表4          成分   洗涤剂C(wt.％)   洗涤剂D(M.％) 非离子型表面活性剂 1) 非离子型表面活性剂 2) 非离子型表面活性剂 3) 非离子型表面活性剂 4) 非离子型表面活性剂 5) 非离子型表面活性剂 6) 阴离子表面活性剂 7) 硅烷8) 羧酸聚合物 9) 聚合物 10) 柠檬酸 氯化钙 单乙醇胺 三乙二醇苯基醚 丙二醇 乙醇 硫化钠 本发明的蛋白酶 11) 芳香剂 水     25.0     5.0     10.0     -     -     -     1.0     -     2.0     -     0.2     0.05     4.0     3.0     3.0     2.0     0.2     0.5     0.5     平衡     -     -     -     9.0     9.0     2.5     -     0.8     -     0.8     -     -     -     -       2.0     -     1.0     0.5     平衡 总计     100     100 使用浓度     20g/30L     40g/30L 洗涤液pH     10.5     7.3
1)聚氧乙烯(平均添加7摩尔)烷基醚，烷基基团源于C12-14 仲醇(“Softanol 70”，Nippon Shokubai的产品)。
2)聚氧乙烯(平均添加12摩尔)烷基醚，烷基基团源于C12-14 仲醇(“Softanol 120”，Nippon Shokubai的产品)。
3)通过按以下顺序向C10-14直链伯醇中团块添加平均5摩尔的 EO、平均2摩尔的PO和平均3摩尔的EO获得的。
4)平均添加了8摩尔的EO的聚氧乙烯月桂基乙醚。
5)平均添加了15.5摩尔的EO的聚氧乙烯月桂基乙醚。
6)小范围聚氧乙烯烷基(仲-C12/C13)醚。
7)C15-14直链烷基苯磺酸钠。
8)酰胺/醚改性的硅氧烷聚合物(“BY16-96”)，Dow Corning Toray Silicone的产品)。
9)按照披露于日本专利公开号Hei10-60476的第11页第6-13 行披露的方法合成苯氧聚乙二醇-丙烯酸-马来酸共聚物(平均分子 量：10000，固体含量：51.2％)
10)戊烯和马来酰(50∶50摩尔比)共聚物的钠盐(平均分子量 7000)
11)表2和3中所示出的每一种本发明碱性蛋白酶的纯化制剂 (15PU/克)
例7
在下面的表5中所示出的成分中添加聚丙烯酸钠(直链烷基)磺 酸钠或非离子型表面活性剂，以及月桂酰羟苯磺酸钠的40％的水溶液， 同时搅拌并混合过碳酸钠和碳酸钠(稠苏打)。然后添加按照在日本 专利公开号昭62-257990的例1中披露的方法制备的本发明的蛋白酶 颗粒。搅拌所得到的混合物，直到所有溶液变均匀，从而制备了一种 漂白洗涤剂。
                        表5     成分   漂白洗涤剂E     (wt.％)   漂白洗涤剂F     (wt.％) 过碳酸钠 1)     72.0     72.0 碳酸钠(稠苏打)     20.0     20.0 阴离子型表面活性剂 2)     2.0     - 非离子型表面活性剂 3)     -     2.0 聚丙烯酸钠 4)     1.0     1.0 月桂酰羟苯磺酸钠     4.0     4.0 本发明的蛋白酶 5)     1.0     1.0
1)粒度为500-700微米
2)(C12-14)直链烷基苯磺酸钠
3)聚氧乙烯烷基醚(具有C12-14烷基基团，平均添加了12摩尔 的EO)
4)平均分子量为8000
5)用表2和3所示本发明的每一种碱性蛋白酶的纯化制剂制备的 颗粒(6PU/克)，所述制剂是按照在日本专利公开号昭62-257990的 例1中披露的方法制备的。
例8
制备了在下面的表6中示出的自动洗碗洗涤组合物(洗涤剂G和 H)
                        表6     成分   洗涤剂G(wt.％)   洗涤剂H(wt.％) Pluronic L-61 1)     -     4.0 Softanol EP-7085 2)     4.0     - 柠檬酸三钠     -     30.0 三聚磷酸钠     30.0     - 过碳酸钠     20.0     20.0 碳酸钠     20.0     20.0 非晶硅酸盐 3)     10.0     10.0 AA-MA 4)     4.0     4.0 硫酸钠     10.0     10 0 α-淀粉酶     1.0     1.0 本发明的蛋白酶     1.0     1.0
1)聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(平均分子量2000)
2)C12-14仲醇的7摩尔的环氧乙烷和8.5摩尔环氧丙烷的加成 物
3)JIS No.2的柠檬酸钠
4)丙烯酸-马来酸共聚物
5)“Duramy160TTM”(NoVozymes的产品)
6)用表2和3所示本发明的每一种碱性蛋白酶的纯化制剂制备的 颗粒(6PU/克)，所述制剂是按照在日本专利公开号昭62-257990的 例1中披露的方法制备的。
例9
使用在表7中示出的成分制备硬表面洗涤组合物(洗涤剂J)。
                     表7     成分    洗涤剂J(wt.％) 阴离子型表面活性剂 1) 非离子型表面活性剂 2) 非离子型表面活性剂 3) 两性表面活性剂 4) 两性表面活性剂 5) 柠檬酸 聚丙二醇 6) 乙醇 本发明的蛋白酶 7) 芳香剂，水，其它/pH调节剂 总计     15.0     5.0     5.0     7.5     4.0     1.0     2.0     5.0     1.0     54.5     100.0
1)聚氧乙烯(EOP＝4)烷基(C12)醚硫酸钠
2)聚氧乙烯(EOP＝4)烷基(C12)醚
3)烷基(C12)聚葡糖苷(缩合度)：1.3
4)单(长链)叔烷基(C12)氧化二甲胺
5)烷基(C12)羟基二甲基磺基甜菜碱
6)分子量10000
7)披露于表2和3中的本发明的每一种碱性蛋白酶的纯化制剂 (15PU/克)
例10
用上述洗涤剂A(参见例2)获得了在下面的表8中示出的颗粒状 洗涤剂
                            表8      成分(wt.％)   洗涤剂K   洗涤剂L   洗涤剂M   洗涤剂N 例2的洗涤剂基料     98.4     98.3     98.5     97.2 芳香剂     0.5     0.5     0.5     0.5 本发明的蛋白酶 1)     0.5     0.5     0.5     0.5 常规蛋白酶 2)     0.6     0.6 纤维素酶 3)     0.7     0.7 脂酶 4)     0.5     0.5
1)由表2和3所示本发明的每一种碱性蛋白酶的纯化制剂制备的 颗粒(6PU/克)，所述制剂是按照在日本专利公开号昭62-257990的 例1中披露的方法制备的。
2)由披露于日本专利公开号昭Hei5-25492中的蛋白酶K-16获得 的5PU/克的蛋白酶，该蛋白酶是按照在日本专利公开号昭62-257990 的例1中披露的方法制备的。
3)“KAC-500”(Kao的产品)
4)“Lipolase100TTM”(Novogymes的产品)
工业应用
本发明能够有效生产并提供一种碱性蛋白酶，这种蛋白酶在即使 存在高浓度脂肪酸的条件下也具有活性，并且在去除不仅含有蛋白， 而且还含有皮脂等的复杂污渍方面具有出色的去污力，因此，可以作 为一种酶掺入洗涤剂中。
专利文献1：(国际公开号99/18218)
非专利文献1：(Saeki等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，279， 2000，313-319)
非专利文献2：(Wells等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，1987， 1219-1223)
非专利文献3：(Wells等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，1987， 5167-5171)
非专利文献4：(Taguchi等，Appl.Environ.Microbiol.64， 1998，492-495)
非专利文献5：(Takagi等，Protein Eng.，11，1998，1205- 1210，Bryan，Biochem.Biophys.Acta，1543，2000，203-222)
非专利文献6：(Takagi等，J.Biol.Chem.，36，1988， 19592-19596)
                         序列表 <110>花王株式会社(KAO CORPORATION) <120>碱性蛋白酶 <130>KS0696 <150>JP 2002-081428 <151>2002-03-22 <150>JP 2002-165987 <151>2002-06-06 <150>JP 2002-304230 <151>2002-10-18 <150>JP 2002-304231 <151>2002-10-18 <160>20 <170>Patentln Ver.3.1 <210>1 <211>434 <212>PRT <213>芽孢杆菌属种(Bacillus sp.) <400>1 Asn Asp Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Ser Ser   1               5                  10                  15 Tyr Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala Val Ala Asp Thr Gly
        20                   25                  30 Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly
    35                   40                  45 Lys Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp
50                   55                  60 Thr Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Gly 65                  70                   75                  80 Ser Thr Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser
            85                   90                  95 Ile Met Asp Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Gln
        100                 105                 110 Thr Leu Phe Ser Gln Ala Tyr Ser Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn
    115                 120                 125 Ser Trp Gly Ala Ala Val Asn Gly Ala Tyr Thr Thr Asp Ser Arg Asn
130                 135                 140 Val Asp Asp Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr Ile Leu Phe Ala Ala 145                 150                 155                 160 Gly Asn Glu Gly Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala
            165                 170                 175 Lys Asn Ala lle Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Leu Arg Pro Ser Phe
        180                 185                 190 Gly Ser Tyr Ala Asp Asn lle Asn His Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg
    195                 200                 205 Gly Pro Thr Lys Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Met Ala Pro Gly
210                 215                 220 Thr Phe Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe 225                 230                 235                 240 Trp Ala Asn His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met
            245                 250                 255 Ala Thr Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe
        260                 265                 270 Val Lys Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Leu Lys Ala Ala
    275                 280                 285 Leu Ile Ala Gly Ala Ala Asp Ile Gly Leu Gly Tyr Pro Asn Gly Asn
290                 295                 300 Gln Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr 305                 310                 315                 320 Val Asn Glu Ser Ser Ser Leu Ser Thr Ser Gln Lys Ala Thr Tyr Ser
            325                 330                 335 Phe Thr Ala Thr Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Ser
        340                 345                 350 Asp Ala Pro Ala Ser Thr Thr Ala Ser Val Thr Leu Val Asn Asp Leu
    355                 360                 365 Asp Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Gln Tyr Val Gly Asn Asp
370                 375                 380 Phe Thr Ser Pro Tyr Asn Asp Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu 385                 390                 395                 400 Asn Val Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Ile Glu Val
            405                 410                 415 Gln Ala Tyr Asn Val  Pro Val Gly Pro Gln Thr Phe Ser Leu Ala Ile
        420                  425                 430 Val Asn <210>2 <211>1305 <212>DNA <213>芽孢杆菌属种(Bacillus sp.)KSM-KP43 <220> <221>CDS <222>(1)..(1305) <400>2 aat gat gtt gcg cgt gga att gtc aaa gcg gat gtg gct cag agc agc  48 Asn Asp Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Ser Ser 1                5                   10                 15 tac ggg ttg tat gga caa gga cag atc gta gcg gtt gcc gat aca ggg  96 Tyr Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala Val Ala Asp Thr Gly
         20                 25                  30 ctt gat aca ggt cgc aat gac agt tcg atg cat gaa gcc ttc cgc ggg  144 Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly
     35                  40                 45 aaa att act gca tta tat gca ttg gga cgg acg aat aat gcc aat gat  192 Lys Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp
 50                  55                  60 acg aat ggt cat ggt acg cat gtg gct ggc tcc gta tta gga aac ggc  240 Thr Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Gly 65                   70                  75                  80 tcc act aat aaa gga atg gcg cct cag gcg aat cta gtc ttc caa tct  288 Ser Thr Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser
            85                   90                  95 atc atg gat agc ggt ggg gga ctt gga gga cta cct tcg aat ctg caa  336 Ile Met Asp Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Gln
        100                 105                 110 acc tta ttc agc caa gca tac agt gct ggt gcc aga att cat aca aac  384 Thr Leu Phe Ser Gln Ala Tyr Ser Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn
    115                 120                 125 tcc tgg gga gca gca gtg aat ggg gct tac aca aca gat tcc aga aat  432 Ser Trp Gly Ala Ala Val Asn Gly Ala Tyr Thr Thr Asp Ser Arg Asn
130                 135                 140 gtg gat gac tat gtg cgc aaa aat gat atg acg atc ctt ttc gct gcc  480 Val Asp Asp Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr Ile Leu Phe Ala Ala 145                 150                 155                 160 ggg aat gaa gga ccg aac ggc gga acc atc agt gca cca ggc aca gct  528 Gly Asn Glu Gly Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala
            165                 170                 175 aaa aat gca ata aca gtc gga gct acg gaa aac ctc cgc cca agc ttt  576 Lys Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Leu Arg Pro Ser Phe
        180                 185                 190 ggg tct tat gcg gac aat atc aac catgtg gca cag ttc tct tca cgt  624 Gly Ser Tyr Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg
    195                 200                 205 gga ccg aca aag gat gga cgg atc aaa ccg gat gtc atg gca ccg gga  672 Gly Pro Thr Lys Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Met Ala Pro Gly
210                 215                 220 acg ttc ata cta tca gca aga tct tct ctt gca ccg gat tcc tcc ttc  720 Thr Phe Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe 225                 230                 235                 240 tgg gcg aac cat gac agt aaa tat gca tac atg ggt gga acg tcc atg  768 Trp Ala Asn His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met
            245                 250                 255 gct aca ccg atc gtt gct gga aac gtg gca cag ctt cgt gag cat ttt  816 Ala Thr Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe
        260                 265                 270 gtg aaa aac aga ggc atc aca cca aag cct tct cta tta aaa gcg gca  864 Val Lys Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Leu Lys Ala Ala
    275                 280                 285 ctg att gcc ggt gca gct gac atc ggc ctt ggc tac ccg aac ggt aac  912 Leu Ile Ala Gly Ala Ala Asp Ile Gly Leu Gly Tyr Pro Asn Gly Asn
290                 295                 300 caa gga tgg gga cga gtg aca ttg gat aaa tcc ctg aac gtt gcc tat  960 Gln Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr 305                 310                 315                 320 gtg aac gag tcc agt tct cta tcc acc agc caa aaa gcg acg tac tcg  1008 Val Asn Glu Ser Ser Ser Leu Ser Thr Ser Gln Lys Ala Thr Tyr Ser
            325                 330                 335 ttt act gct act gcc ggc aag cct ttg aaa atc tcc ctg gta tgg tct  1056 Phe Thr Ala Thr Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Ser
        340                 345                 350 gat gcc cct gcg agc aca act gct tcc gta acg ctt gtc aat gat ctg  1104 Asp Ala Pro Ala Ser Thr Thr Ala Ser Val Thr Leu Val Asn Asp Leu
    355                 360                 365 gac ctt gtc att acc gct cca aat ggc aca cag tat gta gga aat gac  1152 Asp Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Gln Tyr Val Gly Asn Asp
370                 375                 380 ttt act tcg cca tac aat gat aac tgg gat ggc cgc aat aac gta gaa  1200 Phe Thr Ser Pro Tyr Asn Asp Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu 385                 390                 395                 400 aat gta ttt att aat gca cca caa agc ggg acg tat aca att gag gta  1248 Asn Val Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Ile Glu Val
            405                 410                 415 cag gct tat aac gta ccg gtt gga cca cag acc ttc tcg ttg gca att  1296 Gln Ala Tyr Asn Val Pro Val Gly Pro Gln Thr Phe Ser Leu Ala Ile
        420                 425                 430 gtg aat taa                                                       1305 Val Asn
    435 <210>3 <211>47 <212>DNA <213>人工序列 <400>3 aaatggatcc gtgaggaggg aaccgaatga gaaagaagaa aaaggtg   47 <210>4 <211>36 <212>DNA <213>人工序列 <400>4 atattctaga cgattaccat attaattcct ctaccc 36 <210>5 <211>25 <212>DNA <213>人工序列 <400>5 aatgccaatg atccgaatgg tcatg 25？ <210>6 <211>32 <212>DNA <213>人工序列 <400>6 tctatcatgg atagcaatgg gggacttgga gg 32 <210>7 <211>33 <212>DNA <213>人工序列 <400>7 cttcgtgagc attttatcaa aaacagaggc atc 33 <210>8 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <400>8 aacgttgcct ttgtgaacga gtcc 24 <210>9 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <400>9 gcgagcacat ctgcttccgt aacg 24 <210>10 <211>28 <212>DNA <213>人工序列 <400>10 tgactttact gcgccataca atgataac 28 <210>11 <211>36 <212>DNA <213>人工序列 <400>11 cgaataatgc caatgatnnn aatggtcatg gtacgc 36 <210>12 <211>31 <212>DNA <213>人工序列 <400>12 ctatcatgga tagcnnnggg ggacttggag g 31 <210>13 <211>35 <212>DNA <213>人工序列 <400>13 cgtgagcatt ttnnnaaaaa cagaggcatc acacc 35 <210>14 <211>29 <212>DNA <213>人工序列 <400>14 ccctgaacgt tgccnnngtg aacgagtcc 29 <210>15 <211>30 <212>DNA <213>人工序列 <400>15 cccctgcgag cacannngct tccgtaacgc 30 <210>16 <211>36 <212>DNA <213>人工序列 <400>16 ggaaatgact ttactnnncc atacaatgat aactgg 36 <210>17 <211>28 <212>DNA <213>人工序列 <400>17 cgctgccggg aatnnnggac cgaacggc 28 <210>18 <211>33 <212>DNA <213>人工序列 <400>18 ccgaacggcg gaaccnnnag tgcaccaggc aca 33 <210>19 <211>30 <212>DNA <213>人工序列 <400>19 cggcggaacc atcnnngcac caggcacagc 30 <210>20 <211>54 <212>DNA <213>人工序列 <400>20 cgctgccggg aatnnnggac cgaacggcgg aaccatcnnn gcaccaggca cagc 54