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一种基于植物酯酶快速检测农残的方法

阅读：542发布：2021-02-26

IPRDB可以提供一种基于植物酯酶快速检测农残的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供一种基于植物酯酶快速检测农残的方法,采用三电极系统，以生物传感器作为工作电极；将三电极系统置于有机磷农药溶液中抑制6‑15 min后，放入背景溶液中反应3‑8 min，选用差分脉冲伏安法，建立标准曲线，以标准曲线法检测样品中有机磷农药含量。本发明生物传感器可实现对低浓度有机磷农药的检测，灵敏度高，且具有原料取材简单、成本低、前处理简单、可重复性强、应用范围广的特点。，下面是一种基于植物酯酶快速检测农残的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种基于植物酯酶快速检测农残的方法, 包括如下步骤：

1）采用三电极系统，以生物传感器作为工作电极，Ag/AgCl/3 mol·L-1 KCl作为参比电极，铂丝电极作为辅助电极；

其中，所述生物传感器为基于植物酯酶的生物传感器，它以玻碳电极作为基体，所述基体表面上从内到外依次由检测层1、检测层2和固定层组成；所述检测层1由1 2:2 1体积比~ ~的多壁碳纳米管和纳米金层组成，所述检测层2由牛血清蛋白和植物酯酶水溶液组成，所述固定层为离子交换树脂；所述生物传感器的玻碳电极的厚度为3 mm；

2）将步骤1）所述三电极系统置于有机磷农药溶液中抑制6-15 min后，放入背景溶液中反应3-8 min，选用差分脉冲伏安法，记录下电流-电位曲线，获得基于植物酯酶的生物传感器对不同浓度的有机磷农药溶液的电流响应值，得到电流与有机磷农药浓度之间的线性关系标准曲线；所述有机磷农药为甲基对硫磷；

其中，背景溶液为0.1 M PBS，pH 6.5, 含有0.5 mM 1-乙酸萘酯；

3）在步骤2）得到的标准曲线的基础上，利用所述三电极系统，通过查分脉冲伏安法对样品进行检测，获得基于植物酯酶的生物传感器对样品的电流响应值，并利用标准曲线法对样品中有机磷农药含量进行测定。

2.根据权利要求1所述基于植物酯酶快速检测农残的方法，其特征在于，所述生物传感器的制备方法，包括如下步骤：（a）纳米金颗粒的制备：向3~6℃的超纯水中加入质量浓度为0.5 ~2 %的HAuCl4水溶液和摩尔浓度为0.1 ~ 0.5mol/L的K2CO3水溶液，搅拌条件下迅速加入1 ~ 3 mL 0.5~1 mg/mL的硼氢化钠水溶液，重复加入硼氢化钠水溶液步骤3-5次，直至混合溶液由蓝紫色变为橙红色，得到纳米金颗粒；其中，所述超纯水、HAuCl4水溶液和K2CO3水溶液的体积比为2000:3:2；

（b）多壁碳纳米管溶液的配制：将羧酸功能化的多壁碳纳米管溶于N,N-二甲基甲酰胺中，并超声分散20 50 min，得到浓度为2 4 mg/mL的溶液；

~ ~

（c）将玻碳电极用三氧化二铝粉抛光并超声清洗后，将8-14μL的多壁碳纳米管-纳米金混合溶液以体积比为1:1、2:1或1:2滴涂在电极表面，于室温晾干；

（d）将步骤（c）所制备电极浸泡在200 μL 质量分数为2 mg/mL现配的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液中10 min, 再加入200 μL质量分数为10 mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺浸泡20 min，用于活化多壁碳纳米管上的羧基，然后用0.1 M PBS 溶液润洗2-3次后于室温晾干；

（e）将植物酯酶配制成浓度为50 200 U/mL的水溶液，将所述水溶液与质量浓度为0.1 ~ 0.5 %的牛血清蛋白溶液等体积混合为混合溶液；取6 - 12 μL所述混合溶液滴涂在步骤~（d）晾干后的电极表层，使得混合溶液中的氨基与步骤（d）制得电极上活化的羧基脱水缩合，从而植物酯酶固定于复合材料上，于室温晾干；

（f）然后将5 -15μL的0.05 %离子交换树脂溶液涂覆在步骤（e）晾干后的电极表面进行固定，并于室温下干燥2 4h后，得到所述基于植物酯酶的生物传感器。

3.根据权利要求1或2所述基于植物酯酶快速检测农残的方法，其特征在于，所述生物传感器中植物酯酶采用如下方法提取得到：（1）植物酯酶粗酶的制备

将小麦面粉与水按照的质量体积比为1：3 8混合，并磁力搅拌20 - 50 min后，以3000 ~ 6000 r/min的离心速度离心8 15 min，离心后弃去沉淀取其上清液，获得粗酶；

~ ~

(2）植物酯酶的纯化

称取2 3.5 g的PEG，其分子量为 600、1000 或2000和1 2.5 g无机盐置于带刻度的离~ ~心管中，用蒸馏水溶解后，加入步骤（1）获得的植物酯酶粗酶0.5 ml 1 ml液，再用蒸馏水~调至10 ml，混合均匀后，静置，即可得到双水相体系；加入PEG/NaH2PO4双水相体系中，经过两步双水相萃取后，将其下相在透析液中通过透析处理36 60 h，透析期间换透析液4 ~ ~

6次；其中，所述PEG/NaH2PO4双水相体系的pH值为4.0 8.0，以重量份计包括如下成分：20 ~ 35份PEG，其分子量为 600、1000 或2000、 10 25份NaH2PO4、4 10份 (NH4)2SO4 和 ~ ~ ~

30 66份水；

透析后对被透析的下相进行冷冻干燥，得到的粉末即为植物酯酶的纯品。

4.根据权利要求1所述基于植物酯酶快速检测农残的方法，其特征在于，步骤3）对样品进行检测前，对样品进行粉碎、过滤取滤液后再稀释的前处理。

说明书全文

一种基于植物酯酶快速检测农残的方法

技术领域

[0001] 本发明属于分析化学技术领域，具体涉及基于植物酯酶快速检测有机磷农药的方法。

背景技术

[0002] 有机磷农药作为一种被使用最为广泛的农药种类，主要是通过皮肤接触, 呼吸和直接食用等方式进入人体，而后经血液和淋巴循环到全身各器官和组织。有机磷农药进入神经系统后与乙酰胆碱酯酶活性中心结合生成磷酸化胆碱酯酶，磷酸化胆碱酯酶较难水解，破坏了胆碱酯酶的活性，使得乙酰胆碱在神经突触上大量积累，干扰了神经冲动的正常传导，甚至能导致人的死亡，对人类健康造成极大威胁。

[0003] 目前，农药残留检测的方法主要有紫外可见光谱法、荧光光谱法、拉曼光谱法、气相色谱、气相/液相色谱-质谱联用(GC/HPLC-MS)、酶抑制法(EI)、酶联免疫吸附分析法(ELISA)和电化学传感检测等。大型仪器检测农药残留虽然准确可靠，但仍存在像成本高、检测周期较长、操作步骤繁琐、需要专业操作人员，后续数据分析工作量大等不足，使其无法实现低成本、快速、原位检测。因此，研究和开发快速化、小型化、灵敏可靠的农药残留分析方法, 建立健全农药监测体系已刻不容缓。

[0004] 作为现代仪器分析手段的重要分支之一，电化学分析技术近年来在分析领域中显示出了巨大的潜力和优越性，对农残分析的应用也日趋增多。用于农残检测传统的生物传感器的敏感元件通常由乙酰胆碱酯酶或其修饰之后构成，但是由于乙酰胆碱酯酶大多来源于动物体，取材比较困难，从而增加了以乙酰胆碱酯酶为敏感元件的生物传感器成本，也限制了该类传感器的应用。

发明内容

[0005] 针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种基于植物酯酶快速检测有机磷农药的新方法，解决生物传感器的敏感元件原料取材困难、成本高的问题，实现对低浓度有机磷农药定性和定量检测。

[0006] 实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种基于植物酯酶快速检测农残的方法, 包括如下步骤：

[0007] 1）采用三电极系统，以生物传感器作为工作电极，Ag/AgCl/3 mol·L-1 KCl作为参比电极，铂丝电极作为辅助电极；

[0008] 其中，所述生物传感器为基于植物酯酶的生物传感器，它以玻碳电极作为基体，所述基体表面上从内到外依次由检测层1、检测层2和固定层组成；所述检测层1由1-2:2-1体积比的多壁碳纳米管和纳米金层组成，所述检测层2由牛血清蛋白和植物酯酶水溶液组成，所述固定层为离子交换树脂；

[0009] 2）将步骤1）所述三电极系统置于有机磷农药溶液中抑制6-15 min后，放入背景溶液中反应3-8 min，选用差分脉冲伏安法，记录下电流-电位曲线，获得基于植物酯酶的生物传感器对不同浓度的有机磷农药溶液的电流响应值，得到电流与有机磷农药浓度之间的线性关系标准曲线；

[0010] 3）在步骤2）得到的标准曲线的基础上，利用所述三电极系统，通过查分脉冲伏安法对样品进行检测，获得基于植物酯酶的生物传感器对样品的电流响应值，并利用标准曲线法对样品中有机磷农药含量进行测定。

[0011] 进一步，所述生物传感器的制备方法，包括如下步骤：

[0012] 1）纳米金颗粒的制备：向3 6℃的水中加入质量浓度为0.5 2 %的HAuCl4水溶液~ ~和摩尔浓度为0.1 0.5mol/L的K2CO3水溶液，搅拌条件下迅速加入1 3 mL 0.5 1 mg/mL~ ~ ~
的硼氢化钠水溶液（现配现用），重复加入硼氢化钠水溶液步骤3-5次，直至混合溶液由蓝紫色变为橙红色，得到纳米金颗粒；其中，所述超纯水、HAuCl4水溶液和K2CO3水溶液的体积比为2000:3:2；

[0013] 2）多壁碳纳米管溶液的配制：将羧酸功能化的多壁碳纳米管溶于N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，并超声分散20 50 min，得到浓度为2 4 mg/mL的溶液；~ ~

[0014] 3）将玻碳电极用三氧化二铝粉抛光并超声清洗后，将8-14μL的多壁碳纳米管-纳米金混合溶液（1:1、2:1或1:2, V/V）滴涂在电极表面，于室温晾干；

[0015] 4）将步骤3）所制备电极浸泡在200 μL 现配的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC, 2 mg/mL）溶液中10 min, 再加入200 μL N-羟基琥珀酰亚胺（NHS，10 mg/mL) 浸泡20 min，用于活化多壁碳纳米管上的羧基（-COOH），然后用0.1 M PBS 溶液润洗2-3次后于室温晾干；

[0016] 5）将植物酯酶配制成浓度为50 200 U/mL的水溶液，将所述水溶液与质量浓度为~0.1 0.5 %的牛血清蛋白溶液等体积混合为混合溶液；取6 - 12 μL所述混合溶液滴涂在~
步骤4）晾干后的电极表层，使得混合溶液中的氨基（-NH2）与步骤4）制得电极上活化的羧基（-COOH）脱水缩合，从而植物酯酶固定于复合材料上，于室温晾干；

[0017] 6）然后将5 -15μL的0.05 %离子交换树脂溶液涂覆在步骤5）晾干后的电极表面进行固定，并于室温下干燥2 4h后，得到所述基于植物酯酶的生物传感器。~

[0018] 其中，所述生物传感器中植物酯酶采用如下方法提取得到：

[0019] 1）植物酯酶粗酶的制备

[0020] 将小麦面粉（大豆或玉米面粉亦可）与水按照（1 ：3 8，W/V）的质量体积比混合，~并磁力搅拌20 - 50 min后，以3000 6000 r/min的离心速度离心8 15 min，离心后弃去~ ~
沉淀取其上清液，获得粗酶，置于-20℃下保存；

[0021] 2）植物酯酶的纯化

[0022] 称取2 - 3.5 g的PEG（ 1000、800或1200）和1 - 2.5 g无机盐（NaH2PO4或KH2PO4）置于带刻度的离心管中，用蒸馏水溶解后，加入步骤1）获得的植物酯酶粗酶（0.5 ml 1 ~ml）液，再用蒸馏水调至10 ml，混合均匀后，静置，即可得到双水相体系；加入PEG/NaH2PO4双水相体系中，经过两步双水相萃取后，将其下相在透析液中通过透析处理36 60 h，透析~
期间换透析液4 - 6次；其中，所述PEG/NaH2PO4双水相体系的pH值为4.0 8.0，以重量份计~
包括如下成分：20 35份PEG ( 600、1000 或 2000) 、 10 25份NaH2PO4、4 10份 ~ ~ ~
(NH4)2SO4 和 30 ~ 66份水；

[0023] 透析后对被透析的下相进行冷冻干燥，得到的粉末即为植物酯酶的纯品。

[0024] 相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

[0025] 1、本发明利用基于植物酯酶的生物传感器对有机磷农药进行检测，采用三电极系统，通过差分脉冲伏安法，可以得到电流与有机磷农药浓度之间的线性关系标准曲线，并在该标准曲线的基础上，可利用标准曲线法对样品中有机磷农药含量进行计算，检测结果灵敏度和精度高，可实现对低浓度有机磷农药的检测，可重复性强；且本发明样品无需进行复杂的前处理过程，操作简单。

[0026] 2、本发明基于植物酯酶的生物传感器利用氨基与羧基脱水缩合反应后将植物酯酶固定在纳米材料（多壁碳纳米管/纳米金）上，并利用物理吸附将复合材料修饰于电极表面，通过各检测层物质的协同配伍作用，对有机磷农药具有良好的检测结果。实验结果显示，用本发明基于植物酯酶的生物传感器检测甲基对硫磷，检测限0.02 ppb (0.076 nM) ，对比于一些已经报道的结果显示出更低的检测限；干扰性实验结果也表明，基于植物酯酶的生物传感器对于类似含有硝基、苯环的常规化合物具有较强的抗干扰能力，对有机磷农药具有专一的检测性。

[0027] 3、本发明采用的生物传感器采用纳米金颗粒与羧酸功能化的多壁碳纳米管物理吸附后，多壁碳纳米管上羧基与植物酯酶-牛血清白蛋白复合物中的氨基进行脱水缩合后再采用物理吸附法修饰于基体上，制得生物传感器。其原料来源广泛，成本低廉，制备方法简单。

[0028] 4、采用本发明检测方法无需使用大型仪器，可快速精准地检测水、瓜果蔬菜中的有机磷农药残留含量，可实现实时在线快速原位检测，具有良好的应用前景。

附图说明

[0029] 图1为植物酯酶/石墨烯-纳米金复合材料修饰电极用于检测有机磷农药反应机理图；

[0030] 图2为植物酯酶传感器在不同浓度的甲基对硫磷下的差分脉冲伏安图；

[0031] 图3为植物酯酶传感器检测不同浓度甲基对硫磷（图4）的拟合曲线；

[0032] 图4为植物酯酶纯品白色粉末；

[0033] 图5位纯化结果检验电泳图SDS-PAGE（1：纯品; 2:粗酶）。

具体实施方式

[0034] 下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。

[0035] 一、一种基于植物酯酶快速检测有机磷农药的方法，检测对象为有机磷农药（甲基对硫磷或马拉硫磷），运用基于植物酯酶的生物传感器进行检测。

[0036] 1、检测原理：检测原理见图1，水解方程（1）中，底物1-乙酸萘酯被植物酯酶水解产生1-萘酚和乙酸（电活性物质），从而产生电流信号响应，随着有机磷农药的添加会抑制这一反应的进行，从而电活性产物减少，故电流信号降低，随着有机磷农药添加量的不同，其电流信号降低幅度不同。

[0037] 2、有机磷农药的检测（图2）：采用三电极系统，所述三电极系统中上述基于植物酯酶的生物传感器作为工作电极，Ag/AgCl/3 mol·L-1 KCl作为参比电极，铂丝电极作为辅助电极；

[0038] 将所述三电极系统置于有机磷农药溶液中抑制10 min后，放入背景溶液（0.1 M PBS，pH 6.5, 含有0.5 mM 1-乙酸萘酯）中反应5min，通过差分脉冲法（DPV）研究了植物酯酶/纳米金颗粒-石墨烯复合材料所修饰的玻碳电极对甲基对硫磷检测的电化学行为和作用机制，记录下电流-电位曲线，获得基于植物酯酶的生物传感器对不同浓度的有机磷农药溶液的电流响应值，得到电流与有机磷农药浓度之间的线性关系标准曲线。

[0039] 二、基于植物酯酶生物传感器的制备方法，包括如下步骤：

[0040] 1、纳米金颗粒的制备：向预冷在4℃的100 mL 超纯水中加入0.15 mL 质量浓度为1% 的HAuCl4 水溶液和0.05 mL 0.2 mol/L K2CO3溶液，搅拌条件下迅速加入刚配制的0.1 mL 0.5 mg/mL硼氢化钠水溶液，重复加入硼氢化钠水溶液步骤3-5次，直至混合溶液由蓝紫色变为橙红色，得到纳米金颗粒，测得纳米金颗粒粒径在（13 ± 2 nm），浓度为6.25 nM。

[0041] 2、多壁碳纳米管溶液的配制：将羧酸功能化的多壁碳纳米管溶于N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，并超声分散30 min，得到浓度为2 mg/mL的水溶液。

[0042] 电极修饰：首先将玻碳电极（GCE,3 mm）分别用1μm 和0.05 μm 的三氧化二铝粉抛光并超声清洗后，将10 μL的多壁碳纳米管-纳米金混合溶液（2:1）滴涂在电极表面，室温晾干后，将所制备电极浸泡在200 μL 现配的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC, 2 mg/mL）溶液中10 min, 再加入200 μL N-羟基琥珀酰亚胺（NHS，10 mg/mL) 浸泡20 min，用于活化多壁碳纳米管上的羧基（-COOH），然后用0.1 M PBS 溶液润洗2-3次室温晾干后，再将制得的植物酯酶溶液（129.2 U/mL)与质量浓度为0.2%的牛血清蛋白液等体积混合为混合溶液，取8 μL所述混合溶液滴涂在晾干后的电极表层，于室温晾干；再将10 μL的0.5 %高能离子交换树脂（Nafion）覆盖晾干后的表面用于固定，于室温彻底干燥2h后，将电极浸泡于超纯水中备用。

[0043] 所制备的传感器成功实现了对有机磷农药（甲基对硫磷）0.05 ppb至50 ppb (0.19 nM - 190 nM) 宽的动态范围的检测（附图2），其校准曲线方程分别为∆I/I0 (%) = 26.95 log C + 44.09 (R2=0.9959) （附图3），其检测限为0.016 ppb (0.061 nM)，对比于一些已经报道的结果显示具有明显的更低检测限，取得意想不到的技术效果。并且，干扰性实验结果也表明，基于植物酯酶的生物传感器对于类似含有硝基、苯环的常规化合物具有较强的抗干扰能力，对有机磷农药具有专一的检测性。

[0044] 所述生物传感器以玻碳电极作为基体，所述基体表面上从内到外依次由检测层1、检测层2和固定层组成；所述检测层1的组分包括多壁碳纳米管和纳米金层，所述检测层2的组分包括牛血清蛋白和采用提取得到的植物酯酶，所述固定层的组分包括高能离子交换树脂（Nafion）（配比为: 5：4：5）也就是检测层1为10μL，检测层为8μL，固定层 10 μL。

[0045] 其中，所述植物酯酶的提取方法，步骤包括：

[0046] 1）植物酯酶粗酶的制备

[0047] 将小麦面粉与蒸馏水按照1:5（W/V）比例混合磁力搅拌30 min，然后置于离心机在4000r/min下离心10min，弃去沉淀取其上清液即为粗酶，置于-20℃下保存。

[0048] 2）植物酯酶的纯化（两步双水相萃取法）

[0049] 称取2.7 g的PEG1000和1.3 g NaH2PO4置于带刻度的离心管中，用蒸馏水溶解后，加入步骤1）获得的植物酯酶粗酶（0.5 ml）液，再用蒸馏水调至10 ml（即为27% PEG1000/ 13% NaH2PO4）。混合均匀后，静置，即可得到双水相体系，大部分植物酯酶分配在上相，而后将下相去除；加入6.0% (NH4)2SO（4 6g）得到第二个萃取体系：27% PEG1000/ 13% NaH2PO4/
6.0% (NH4)2SO4。经过两步双水相萃取后，将其下相在透析液中通过透析处理48 h，透析期间换透析液4 次；其中，所述PEG/NaH2PO4双水相体系的pH值为5.0，以重量份计包括如下成分：27份PEG1000、 13份NaH2PO4、6份 (NH4)2SO4 和 54份水。

[0050] 透析后对被透析的下相进行冷冻干燥，得到的粉末即为植物酯酶的纯品（参见附图4）。

[0051] 3）SDS-PAGE 凝胶电泳

[0052] 采用Deutscher法进行SDS-PAGE凝胶电泳，先用质量浓度30% 聚丙烯酰胺制成平板胶，再在50 V、12.5 mA 电泳条件下运行3～4 h，然后用0.05%考马斯亮兰R250、50%甲醇和12%乙酸混合液染色1～2 h，最后用50%甲醇和12%乙酸混合脱色液脱色处理12 h，由SDS-PAGE图（附图5，图5中1泳道为纯品，2泳道为粗酶）可知纯化后的植物酯酶纯度明显提高，提取纯化得的植物酯酶分子量约为68 KDa。

[0053] 本发明的上述实施例仅仅是为说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化和变动。凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

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一种基于植物酯酶快速检测农残的方法

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