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对流增强型递送装置，方法和应用

阅读：755发布：2021-03-03

IPRDB可以提供对流增强型递送装置，方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明的涉及一种微加工的基于硅的对流增强型递送(CED)装置。该装置包含了一个硅柄部分，至少一条独立的聚对二甲苯通道配置在沿着柄全长的至少一部分，其中所述通道具有一种或多种尺寸的排列在通道一个或多个不同位置的出口和流体(药物)入口。流体输入口可以配置或者适应去连接储液室和/或泵和/或计量器和/或阀门或者其他合适控制的装置或者装置提供和/或递送流体(比如，药物)到这个微加工的装置。该装置可以具有多条通道并排在装置的不同表面。，下面是对流增强型递送装置，方法和应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种微流控、对流增强型药物递送装置，其包含：分层结构的柄，所述柄包括微探针组件，其中包含硅基底、聚酰亚胺层和聚对二甲苯层，所述组件中具有位于沿其长度的至少一部分的至少一条微流控通道，所述通道包含流体入口和至少一个流体出口，所述至少一条通道是由聚对二甲苯组分制成的；

其中所述至少一条微流控通道适于在压力下沿着所述柄引导含药流体并将该含药流体通过各个所述至少一个流体出口释放至靶组织中用于恒定压力输注，以及其中所述微探针组件是可插入靶组织的并且具有有助于其穿透组织的解剖学相容形状的远端。

2.权利要求1的装置，其中所述远端具有尖的形状。

3.权利要求1的装置，其中所述至少一条通道位于微探针组件的表面中。

4.权利要求1的装置，其中所述微探针组件的横截面直径尺寸等于或小于0.2mm。

5.权利要求1的装置，其中所述至少一条通道是层流通道。

6.权利要求1的装置，其中所述至少一条通道具有白蛋白涂层。

7.权利要求1的装置，其中所述微探针组件具有2毫米到50毫米的长度LM和1,000平方微米到20,000平方微米之间的横截面积。

8.权利要求1的装置，其中所述至少一条通道具有1微米到50微米之间的高hC。

9.权利要求1的装置，其中所述至少一条通道具有10微米到100微米之间的宽WC。

10.权利要求1的装置，其中所述至少一条通道具有排列在微探针组件的一个或多个表面中的多个出口。

11.权利要求1的装置，进一步包含连接着微探针组件的手柄部分。

12.权利要求1的装置，进一步包含流体供给部分，所述的流体供给部分具有这样的通道，所述通道的出口连接到微探针组件的入口，所述通道的入口与流体供给连接。

13.权利要求12的装置，进一步包含连接流体供给的可控的流体供给发生器。

14.权利要求13的装置，其中所述可控的流体供给发生器是程控压力发生器和程控流速发生器中的至少一种。

15.权利要求13的装置，其中所述可控的流体供给发生器是泵。

16.权利要求1的装置，其中所述微探针组件是柔韧型的。

17.权利要求1的装置，进一步包含嵌入所述装置的电极。

18.权利要求17的装置，其中所述电极是刺激电极或记录电极中的一种。

19.权利要求1的装置，进一步包含连接于该装置的阀和流量计中的至少一种。

20.权利要求1的装置，进一步包含与该微探针组件整合的传感器。

21.权利要求20的装置，其中所述传感器是一种可查询的传感器。

22.权利要求20的装置，其中所述传感器是一种谷氨酸传感器。

23.权利要求20的装置，其中所述传感器是pH传感器，温度传感器，离子浓度传感器，二氧化碳传感器，氧气传感器和乳酸传感器中的至少一种。

24.权利要求7的装置，进一步包含刚性流体供给部分，其具有至少两倍于LM的长度，该流体供给部分具有与至少一条微流控通道流体连接并可连接流体供给的孔。

25.一种微流控对流增强型药物递送装置，包含柔韧型聚对二甲苯微探针体，其具有可植入的柄部分和邻近柄部分的流体入口部分，并具有至少一条位于所述装置长度中的聚对二甲苯组分微流控通道，所述微流控通道具有在流体入口部分近端的近端和邻近可植入柄部分远端的远端，所述至少一条聚对二甲苯通道具有流体入口和至少一个流体出口，其中封装的所述至少一条微流控通道适于在压力下沿所述柄部分引导含药流体并将该含药流体通过所述至少一个流体出口释放至靶组织中用于恒定压力输注。

26.权利要求25的装置，其中所述至少一个出口位于所述至少一条通道的远端。

27.权利要求25的装置，进一步包含可连接到该装置的可插入支持架，所述支持架具有设计为支持微探针体的至少可植入柄部分的架部分和具有在解剖学相容形状的远端。

28.权利要求27的装置，其中所述微探针体的至少可植入柄部分保持在支持架中。

29.权利要求27的装置，其中所述支持架的远端具有尖的形状。

30.权利要求27的装置，其中所述插入支持架由可降解的热塑性聚合物制成。

31.权利要求30的装置，其中所述可降解的热塑性聚合物是可降解的热塑性聚酯和可降解的热塑性聚碳酸酯中的一种。

32.权利要求30的装置，其中所述插入支持架是由乳酸-乙醇酸共聚物制成。

33.权利要求25的装置，进一步包含可连接于流体入口部分的近端的流体供给。

34.权利要求33的装置，进一步包含连接流体供给的可控的流体供给发生器。

35.权利要求34的装置，其中所述可控的流体供给发生器是程控压力发生器和程控流速发生器中的至少一种。

36.权利要求34的装置，其中所述可控的流体供给发生器是泵。

37.权利要求27的装置，其中所述插入支持架包含一定量的药物。

38.权利要求37的装置，其中所述插入支持架表面用药物涂覆。

39.制备柔韧型微流控对流增强型药物递送探针的方法，所述探针具有有通道的柄，所述通道用于在压力下沿所述柄引导含药流体，所述方法包含了如下步骤：沉积一层聚对二甲苯在准备好的硅晶片上；

将选定高度的光阻剂铺在硅晶片上，所述选定高度与所述通道高度相应；

图案化光阻剂层以确定通道的内在区域；

通过在所述晶片上沉积第二层聚对二甲苯形成探针的顶部区域；

将蚀刻掩膜沉积在晶片上；

图案化该蚀刻掩膜以确定探针的总体形状；

蚀透聚对二甲苯层到硅晶片来确定探针主体；

从通道的内部区域移除剩余的光阻剂；和

从晶片上移除已完成的探针。

40.制备用于药物对流增强型递送的柔韧型微加工装置的方法，包括：根据权利要求39的方法制备柔韧型微流控对流增强型药物递送探针，

制备用于所述柔韧型微流控对流增强型药物递送探针的插入支持架，包含如下步骤：提供具有完成的支持架的模具形状的适合的模具；

装填适当量的热塑性聚合物到模具形状中；

压制和加热装填好的模具以至热塑性聚合物被加热到它的玻璃化转变温度Tg之上；

冷却模具到Tg之下；

从模具中移除完成的支持架；以及

将探针的柄固定到支持架的架部分。

41.权利要求40的方法，包含装填适当量的乳酸-乙醇酸共聚物进模具形状中。

42.权利要求40的方法，进一步包含分子靶向型基于对流增强型药物递送的传感器的制备方法，包含步骤：在探针上沉积和图案化电极和电连接部；

在所述电极和电连接部上沉积聚对二甲苯绝缘层；

选择性地蚀刻聚对二甲苯层来暴露所述电极；

将离子传导聚合物施加到所述电极；和

将靶分子特异性的氧化还原酶固定到所述电极。

43.权利要求42的方法，其中所述将离子传导聚合物施加到电极包括将该柔韧型微加工装置浸入溶液中并干燥。

44.权利要求42的方法，其中将靶分子特异性的氧化还原酶固定到所述电极包括将所述柔韧型微加工装置浸入含有谷氨酸氧化酶，牛血清白蛋白和戊二醛的水溶液。

说明书全文

对流增强型递送装置，方法和应用

[0001] 联邦政府赞助发起的研究

[0002] 所公开的发明的某些实施例和某些方面是在政府支持下根据国家健康协会授予的合同No.NS-045236进行的。在此处报告的工作一部分是在康奈尔纳米实验室(Cornell NanoScale Facility)中完成的，它是国家纳米技术基础网状系统(National Nanotechnology Infrastructure Network)的一个成员，是由国家科学基金会Grant ECS03-35765支持的。美国政府可在本发明中享有一定的权利。

[0003] 相关的申请资料

[0004] 本申请权利要求2007年2月13日提交的序列号No.60/889,555，名称为对流增强型递送装置，方法和应用的美国临时申请的优先权，该文件在此处全部引用作为参考。

背景技术

[0005] 1.技术领域

[0006] 本发明总体上涉及治疗和/或诊断试剂(此后称为“药物”但不限于此)的对流增强型递送(Conevection Enhanced Delivery)(CED)。更优选地，本发明涉及微加工的微流控CED装置，制造方法，和药物的对流增强型递送的方法。

[0007] 2.相关技术的说明

[0008] 已经开发了多种局部药物递送策略以绕开血脑屏障。比如，已经报导了植入缓慢释放药物到外周组织的聚合埋植剂在局部治疗组织是成功的。这些埋植剂配合局部化学疗法对于治疗颅内肿瘤也有效果，因为高剂量药物能递送到埋植剂周围的组织。然而，已知药物在释放后渗透到组织中的距离取决于药物输送和药物消除的相对比率。当扩散是主要的输送机制时，药物浓度按离埋植剂的距离是指数级衰减的。在许多情况中，只有离埋植剂几毫米以内的组织是暴露在药物治疗有效浓度下的。在这种状况下，可以通过增加药物渗透到组织中的距离并消除作为扩散介导的输送特征的浓度随距离快速衰减的另外的递送方法来增强治疗。

[0009] 对流增强型药物递送(CED)将包含药物的液体直接输注进组织，因此输送中是对流占主导。通过提高输注的速率，相对于输注点附近组织区域中的消除率，对流率能被扩大。因此，CED有增加药物渗透距离和减轻浓度随与释放点的距离的衰减的潜力。此外，CED可以克服由肿瘤体积大和治疗试剂难以递送到肿瘤致密组织的困难等脑肿瘤传统治疗的局限性。

[0010] 已经在动物和人体中广泛地测试对流增强型药物递送。据报导为了治疗和成像目的，已经将小分子，蛋白质，生长因子，和核苷酸输注到动物模型中。据报导化学治疗试剂，病毒载体和蛋白质已经在临床试验中输注到人体中。最初被报导的研究局限在输注到均质脑灰质体中。已公开的另一个研究涉及内苍白球，外周神经系统，肿瘤和脑干。这些研究的结果表明对流能用来在整个脑的大多数区域递送分子，而不考虑它们的尺寸。然而，当组织的特性随着治疗区域而变化时，控制输注分子的分布是困难的，例如在脑中的异质性瘤和白质纤维束中附近。治疗脑瘤的临床实验已报导在追踪和预测输注的化学治疗试剂的分布方面具有相似的问题。

[0011] CED包括把一根小插管或者针插入疼痛的区域中并且按特定的流速输注药物或成像溶液。这根插管最经常是一根尺寸20到32号(ga)的不锈钢针。在先前发表的研究中，流速分布在0.1-10μL/min的范围内并且由外部注射泵控制。已报告当流速大于1μL/min，输注溶液回流到针体的外表面。显然，当流速足够高时，组织与针分开并且注入的流体优先沿着分离部位流动。回流降低对药物递送的控制，因为输注的溶液能流出脑或者进入输注点周围的可渗透性高的白质纤维束。通过调节流速和针的尺寸能够控制允许回流的分离部位。利用针遇到的另一个问题是在开始输注时针尖产生的压力出乎意料的大。这种大的压力表明针尖当插入到脑中时已经部分或完全的闭合了。

[0012] 具有芯片上流量表和泵的显微操作针提供流体流动控制并使试剂体积最小化。硅装置的移植已经被广泛用于皮质神经修复。一些埋植的装置已经在体内记录电信号达一年。其他的微流控装置可能发挥作用的神经系统科学的应用包括测定脑脊液流动，输注神经递质和神经营养因子，和研究成瘾机制。例如，L-谷氨酸是在哺乳动物的中枢神经系统(CNS)里的最常见的兴奋神经递质。它的存在与包括帕金森病病，精神分裂症，中风和癫痫的多种脑疾病相关。因此在CNS中L-谷氨酸的功能水平的测量引起人们兴趣。颅内的微量透析是用于测量在体内CNS组织中L-谷氨酸和其他氨基酸的一种广泛报告的技术。它通过使用现代分析技术诸如HPLC以及电化学检测和荧光检测对渗析样品中的感兴趣的化学物质进行鉴定。然而，对于研究神经元谷氨酸的释放和摄取的测定的可靠性仍有问题。归因于这种技术的弱的空间分辨率和缓慢的时间分辨力可能导致象L-谷氨酸一样的具有快的药物动力学的神经递质的取样不充足。据报导L-谷氨酸为了保持低和无毒细胞外水平通过位于神经元和神经胶质的谷氨酸转蛋白，迅速从细胞外隙空间中消除。据报导新近在结合毛细管电泳分离和定量测定的微量透析方面取得进步，允许每隔几秒对L-谷氨酸取样。然而，需要在技术方面的取得进步以便一秒接一秒的记录谷氨酸的药物动力学，从而具有类似于神经元活性的电生理学记录一样的微米空间分辨率。

[0013] 据报导结合微电极的伏安测量技术已经为测量在脑细胞外隙空间的例如L-谷氨酸的神经递质的变化展现出希望。然而，以前报导的微电极存在与记录微电极的尺寸，微电极响应时间和不能大量生产微电极相关的问题。Burmeister et al，Journal of Neuroscience Methods,119(2002)163-171报导了用于在CNS组织中快速测定L-谷氨酸的利用光刻工艺加工的精制的基于陶瓷的微电极。

[0014] 关于药物递送技术，对脑疾病的很多有希望的治疗涉及纳米粒子作为药物或基因的载体。血脑屏障防止大多数粒子渗入脑，使得颅内的输注或者对流增强型递送(CED)成为有吸引力的药物递送策略。然而，通过组织细胞外隙空间的粒子输送由于纳米粒子(10-100nm)的大尺寸受阻，该尺寸比更容易穿透脑细胞外基质(ECM)的小分子药物或治疗性蛋白大得多。如果粒子直径小于100nm，电中性或者带负电，并且不受快速的消除机制影响，纳米粒子就能渗透进入脑组织。

[0015] 已发表的文献报导了在动物肿瘤模型内的脂质体CED研究。最初涉及两种尺寸的脂质体显示40nm的脂质体分布在整个老鼠的纹状体，但是90nm的脂质体被限制在输注点附近的区域中。聚苯乙烯粒子的输注显示了相似的粒子尺寸的影响。100nm聚苯乙烯粒子的分布体积为40nm粒子的大约一半。灰质的细胞外基质的有效的孔径大小估计是在38和64nm之间，这可以解释为什么更大的粒子很难穿过ECM。其他因素也可能限制粒子在脑里的渗入程度。纳米粒子能被带到在白质和脑瘤的坏死区域。脂质体能积累在并且穿过血管周隙的空间。通过血管周隙空间的转运被认为是流体从脑中消除的重要部分。CED和基因治疗的临床实验报告暗示了通过血管周围空间的优先转运导致某些副作用。

[0016] 通过对一些ECM组分的选择性酶消化，增加有效的孔尺寸和增强纳米粒子在组织中的渗透是可能的。例如，Netti et al，Role of extracellular matrix assembly in interstitial transport in solid tumors,Cancer Res.60(2000)2497-2503报导了继胶原酶处理异种移植肿瘤后IgG的扩散系数增加100％。与大多数其他组织不同，脑的细胞外基质有低含量的像胶原蛋白那样的纤维基质蛋白。脑ECM主要由称作lecticans的蛋白聚糖家族以及它们结合的两种组分粘蛋白和透明质酸(HA)组成。这3种大分子在成人脑的细胞外隙空间里形成一个三元的结构。HA作为脑ECM的结构性脊梁，带有大量电荷的软骨素硫酸盐蛋白聚糖(CSPG)侧链固定ECM到细胞和血管。HA和CSPG能分别被透明质酸酶和软骨素酶降解。然而，一些透明质酸酶理解CSPG以及HA中的糖苷键。

[0017] 考虑到已知的相关技术，发明人认识到需要去改进有关药物CED的相关装置和技术；消除或者减轻有关药物CED的相关领域的装置和技术的已知的问题和缺点；提供一种药物CED的新装置和技术；和这些关于药物CED的新装置和技术的鉴定和应用。

[0018] 由各种实施例提供的这些和其它的对象，连同益处和优势，基于下列相关的说明书和附图使本领域技术人员更明白。

发明内容

[0019] 本发明一个实施方案涉及微加工基于硅的CED装置。该装置包括硅柄部分，至少一条独立的聚对二甲苯通道，其沿着柄的整个长度的至少一部分排列，其中所述通道中有分布在通道的一个或多个不同位置的一种或多种尺寸的的流体出口和流体(药物)入口。流体入口可以配置或者适合连接储液室和/或泵和/或计量器和/或阀门或者其他合适的控制装置或者装置，以提供和/或递送流体(比如，一种药物)到所述微加工装置。依据一个方面，所述装置包括一个有助于操作该装置的手柄。该装置的远端可以是尖的或这其他合适的形状有助于穿透到组织或其他解剖学结构中。依据一个方面，一条或多条独立的聚对二甲苯通道和与它们相连的释药孔可以分布在柄的一个或多个表面。这个微加工的装置可以基本上是刚性的或半刚性的(比如，柔韧性的)。

[0020] 一个说明性的非限制性例子中，根据本发明一个实施方案的微加工装置用于药物的CED去治疗脑和其它神经组织的疾病。当在脑中使用时，该装置通过在直接对于组织的正压下输注药物而绕过了血-脑屏障(BBB)。根据一个说明性的方面，微加工装置包含一根具有一条或更多条聚对二甲苯通道的硅柄。硅柄提供了把装置插入脑中的刚性；一条或更多条聚对二甲苯通道在压力下引导含药流体沿着柄流动，通过在柄上的开口释放流体来分散到脑中。所述装置对当前的用于药物CED的普通的不锈钢针类的导管进行了改良。本发明的装置的优势包括：1)相对于常规用于CED的针具有更小的横断面积；2)当插入脑时对组织的干扰小于常规的针；3)相对于常规的针，消除了沿着被插入的部分的外表面的回流或者逆流，导致在装置里允许更高速率的药物递送；4)在插入脑期间的最小或者没有通道闭合；5)多条聚对二甲苯通道能被装配进硅柄，每条传导不同的流体(药物)，这就允许了同时、连续或者按程序来递送多样的试剂；6)所述装置能同时作为药物递送系统和作为装备有传感器的探针去测量局部组织的特性，例如但不局限于，压力，pH值，离子比浓度，位置和其他参数。

[0021] 本发明的另一个实施例涉及一种用于药物的对流增强型递送的柔韧性微加工装置。根据一个方面，柔韧性微加工装置包括可连接支持架的聚对二甲苯微探针部分，它提供了将装置插入靶组织的足够的结构刚度。装置可以如同上文所述包括一条或多条药物递送通道以及手柄部分。

[0022] 本发明的另一个实施例涉及一种"功能化"微加工装置用于对流增强型药物递送。如在此使用的那样，"功能化"的意思是该装置装配有集成的电极和/或传感器去检测和/或传送选择性的参数信息或者其他刺激。

[0023] 根据一个实施方案，任何上述微加工CED装置可功能性连接于长的细支持架构例如导管或针，使流体可经由其之内或之上流进连接的微加工CED装置的流体入口中。这可能在涉及相对更厚的组织渗透过程中的应用时特别有利；例如，插穿人颅骨/靶组织相对于插穿大鼠颅骨/靶组织。

[0024] 本发明的另一个实施方案涉及对流增强型药物递送法。在多种非限制的方面中，这种方法可以包括酶或者其它物质的递送以改变组织渗透性和改善在靶组织中药物的分布。根据一个方面，这种方法指的是增强含药纳米粒子进入脑组织的渗透，包括酶消化至少一种脑细胞外基质组分和纳米粒子向脑组织中的颅内输注。根据一个优选的方面，在酶消化步骤过程中至少一种酶可以被固定到纳米粒子的表面。根据另一个方面，本发明的多通道CED装置的使用提供了递送酶和/或例如可修饰药物递送位点的其他物质以及治疗物质的能力，所述的递送可以任何顺序进行、依次进行和/或按时间进行而无需利用不同的递送装置以及由此带来的可能的复杂化。

[0025] 本发明的另一个实施方案涉及对流增强型药物递送装置的制造方法。

[0026] 本发明实施例提供的这些和其它的对象，优势和益处，现在将结合详细的说明书和附图和定义在附属的权利要求中作为参考进行详细说明。

[0027] 附图简述

[0028] 图1是依据本发明的示例性实施方案的微流控CED装置的照片；

[0029] 图2是依据本发明的示例性实施方案的柔韧性微流控CED装置的照片；

[0030] 图3是依据本发明的阐述性实施方案的微流控探针的电子显微镜照片，其有用于流体接触的突出(1)，用于操作的基底(2)和组织渗透插入物(3)。

[0031] 图4是依据本发明的阐述性实施方案的显微探针的插入部分的尖顶的电子显微镜照片；

[0032] 图5(a-1)是用于说明根据本发明的示例性实施方案的示例性CED装置的微加工过程的示意横截面图；

[0033] 图6是依据本发明的阐述性实施方案的图4所示装置中尺寸为50x10μm的聚对二甲苯微流通道的电子显微镜相片；

[0034] 图7是依据本发明的阐述性实施方案的具有分布在探针全长的多个出口的CED装置的微探针组件的电子显微镜相片；

[0035] 图8是依据本发明的阐述性实施方案的具有两条平行通道的CED装置的微探针组件的电子显微镜相片，所述通道的出口距离顶端0.5mm；

[0036] 图9(a-c)是依据本发明的示例性实施方案的剖面示意图显示了具有集成电极的CED微探针；

[0037] 图10(a-c)是依据本发明的示例性实施方案的概要横截面图，说明了典型的CED装置的微加工过程；

[0038] 图11是依据本发明的示例性实施方案的示意图显示了柔韧的聚对二甲苯CED微探针和联合的插入支架；

[0039] 图12(A-D)是依据本发明的阐述性实施方案的概要横截面图，说明典型柔韧的CED装置的微加工过程；

[0040] 图13显示了一幅曲线图，从中用达西定律Darcy's Law在径向坐标中计算注射进0.6％琼脂糖(○)或脑(□)的表观水力渗透性，其中P0＝(Q(a)/4πa)κ；x轴是在装置尖端的压力；来自装置的上游注射压力是7-210kPa；流速是通过测定通过装置排出1μL体积到凝胶或组织所花费的时间来估算的；每一种标记代表了一种输注；对于每一种输注根据输注体积的不同具有5-20测量方法，并且误差条代表这些测量方法的一个标准差；最适合实验数据的等式(8)用阴影线显示；

[0041] 图14A和14B是依据一个本发明的阐述性的实施方案的对比图示，分别显示了从示例性CED装置和从30号针头的染料扩散；

[0042] 图15图示了依据一个本发明的阐述性实施方案的连接有流体储库并插入到大鼠脑中的CED装置，和用于举例说明插入到相对更厚的靶组织(例如，人类)中的扩展的CED装置；

[0043] 图16(a-d)是图15中插入位点草图上处理数据的重叠图，用于说明依据一个本发明的阐述性实施方案的在不同注射压力时染料分布的压力依赖性；

[0044] 图17图示了依据一个本发明的阐述性实施方案的体积分布：偶氮蓝(○)或白蛋白(□)在5kPa输注压力下输注入0.6％琼脂糖中的体积，和与模型预测(-)的比较；每个2
数据点代表了一种独立的输注；与在白蛋白(R ＝0.83)输注过程中获得的相对时间不敏
2
感结果相比，模型精确的预测了对偶氮蓝(R ＝0.70)的输注观察到的时间依赖性Vd：Vi；

[0045] 图18是依据本发明的阐述性实施方案的实验性双重通道的CED装置的图示；每条通道具有它自己的用于连接小孔聚酰亚胺管(small bore polyimide tubing)的突出；该装置用螺丝钉和垫圈固定到常规的固定器。

[0046] 图19(A-D)，依据一个本发明的阐述性实施方案的纳米粒子的分布，显示为大鼠脑组织切片的荧光(粉色中心)和亮视野(蓝色周边)的图像的合并图象；

[0047] 图20(A-D)，依据一个本发明的阐述性实施方案，在注射后30min，6hr，12hr和24hr，透明质酸酶对大鼠脑组织的降解程度；

[0048] 图21A和21B，显示了根据一个本发明的阐述性实施方案纳米粒子如何进入脑动脉的血管周隙空间从而输注入正常(A)和酶降解的脑组织(B)；箭头指向明显干扰纳米粒子分布的动脉；刻度条代表了1mm；

[0049] 图22，图示了依据一个本发明的阐述性实施方案，纳米粒子分布区域作为离输注点距离的函数；和

[0050] 图23图示如何通过包含固定化酶的纳米粒子的活性来追踪与酶保温的培养原液的活性。

[0051] 本发明实施方案的详细说明

[0052] 本发明的一个实施方案涉及一种微流控对流增强型递送(CED)装置，分别通过图1，2和3中的实施例100-1，100-2，100-3来说明。参考图1，4，5和6，CED装置100-1包括分层结构的柄部，所述的柄部包括含有硅基片112，聚酰亚胺层116，以及聚对二甲苯(例如，聚对二甲苯A,C,N)层120的微探针组件105-1(附图5)。CED装置中有至少一条聚对二甲苯的层流通道125，其位于沿着附图3中所示装置全长L的至少一部分。如例如图4和
6中所示，所述至少一条通道具有至少一个流体出口127。如图4中所示，CED装置100的微探针组件105具有解剖学相容的形状物131(例如，适合渗透的尖状)的远端130，以有助于穿透或其它方式进入靶组织例如脑或其它组织的装置插入点。

[0053] 如同在附图1-3中进一步说明的那样，装置100包括手柄部分155-n，其连接微探针组件105和流体供应部分165-n。流体供应部分具有至少一条分离的(respective)流体通道167，其流体连接微探针组件中的至少一条通道125。至少一条在流体供应部分的分离通道167具有入口171，其连接于流体供应部175(治疗性的或其它)和外部的泵，阀门，仪表，或者其它递送控制器176，如同图3所示。

[0054] 如例如图4所示，所述至少一条聚对二甲苯通道位于微探针组件105的上表面中。在各方面中，所述至少一条聚对二甲苯通道可以位于微探针组件的超过1个表面中，并且如在下面更详细描述的，两条或更多条分离的通道可以分布在微探针组件的各个表面上或并列分布在一个或多个表面上。

[0055] 根据不同的示范的方面，微探针横截面的直径尺寸优选等于或小于0.2mm；微探2 2
针组分的长度LM优选约2mm到约50mm且横截面积在约1000μ 到20,000μ ；至少一条通道优选高度hc为约1微米到约50μ和宽wc为约10μ到约100μ。

[0056] 根据在图7中CED装置的一个示例性方面，微探针组件105-7包括通道125-7，其具有多个流体出口127-7，所述流体出口如图所示排列在微探针组件的表面上。

[0057] CED装置实施方案的可插入靶组织的微探针组件可以具有功能化的涂层例如，例如，白蛋白涂层。

[0058] 如上所述，所述CED装置可以具有超过1条通道。根据本发明的示例性方面，微流控的CED装置100-8显示于图8，其中的微探针组件有两条邻近的聚对二甲苯通道1251-8，1252-8。下面更详细的说明，多条(例如，两)通道装置能有利地用于药物递送方案，其中例如，增加靶组织药物渗透性的试剂(比如，酶或高渗透性溶液)可通过其中一条通道递送，治疗性试剂可通过另一条通道递送。多种试剂的递送可以同时，连续，或以任何渴望的方式按程序设计进行以获得特定的效果。

[0059] 根据一个示例性实施方案，如图9(a-c)所示的那样，CED装置105-9也可以更进一步通过合并刺激或者记录电极175-9到该装置的组织穿透性微探针组件105-9中来功能化。附图10(a-c)图示了有集成电极的示例性CED装置的加工层。

[0060] CED装置的一个示例性实施方案在微探针组件中包括传感器。不同种类的传感器可以通过集成使装置实现除了它的药物递送之外的功能。例如，这一般可以包括，可查询的传感器，更具体地例如pH传感器，温度传感器，离子浓度传感器，二氧化碳传感器，氧传感器和，以及作为非限制性例子的乳酸传感器或者谷氨酸传感器。

[0061] 更进一步参考附图9(a-c)和10(a-c)，用于制备谷氨酸传感器的示例性方法包括使用金属剥离步骤图案化微流控探针体105-9上的金属记录电极175-9。在流控探针完成后，施加光阻剂涂层并使用亮场掩膜(bright ﬁeld mask)来图案化。在显象之前，该涂层在NH3气氛下置于图象倒转恒温槽(image reversal oven)中，利用紫外灯进行整片曝光。一旦这层显象之后，除了放置电极的地方，晶片用光致抗蚀剂完全覆盖。然后，一层铬连接层(50nm)和一层金(250nm)用E-光线蒸发法沉积在晶片之上。在金属层之下的保护层随后被除去留下金属薄膜从而形成电极。一旦电极形成，沉积一层聚对二甲苯以绝缘电连接部。该绝缘层用铝膜包覆，而铝膜则使用光蚀刻法和湿蚀刻法来图案化，以建立蚀刻层。然后晶片在O2等离子体中图案化，来打开记录和粘接垫。一旦电极已经图案化，并且清除通道中的光致抗蚀剂，通道用热聚乙二醇(PEG)回填防止它们在随后的制造步骤期间堵塞，所述随后的制造步骤在下属文献中被采用：Burmeister et al.,Improved ceramic-based multisite microelectrode for rapid measurements of L-glutamate in the CNS,Journal of Neuroscience Methods,119(2002)163-171。首先，装置浸泡在溶液(5％，在脂肪族醇中)中并干燥。下一步，装置浸泡在一种含有1％谷氨酸，1％BSA，和0.125％戊二醛的水溶液中，并且再次干燥。任何残留在通道中的PEG之后在水浴中除去，留下具有谷氨酸传感器和微流控通道的装置。

[0062] 柔韧型微流控CED装置100-11的一个示例性实施方案在附图11中图示说明。示例性的装置包括柔韧的聚对二甲苯微探针体105-11，其具有植入柄部分1106和连接着柄部分的流体入口1107。该装置有沿装置纵向的至少一条聚对二甲苯组合物通道1125(图中显示了3条)。至少一条聚对二甲苯通道具有在流体入口部分的近端1136处的近端1137和连接着植入柄部分的远端1126的远端1128。至少一条聚对二甲苯组合物通道1125具有至少一个出口1127(图中显示了3条)，其在通道的远端。依据其他方面(参见附图7)，每条通道可以具有一个或多个出口，分布在通道的不同位置，这样可能适合CED装置的具体应用。

[0063] 在附图11中进一步说明的是可连接到装置100-11的插入支持架1150。插入支持架优选结合柔韧型装置使用，以防止该装置太易弯曲而不能支持其自身插入到靶组织中。所示支持架具有一个架部分1152，其至少支持柔韧的微探针体的植入柄部分1106，和具有解剖学相容形状(比如，尖的)的远端1157去组织穿透或进行导引。依据一个可选择的示例性方面，至少柔韧的微探针的植入柄部分1106可以通过水滴的表面张力，不同的胶水，或生物相容的石油胶固定到支架的架部分。

[0064] 根据一个示例性的方面，支持架1150由一个可降解的热塑性聚合物构成，例如，可降解的热塑性的聚酯或者可降解的热塑性的聚碳酸酯。根据一个优选的方面，插入的支持架由乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)构成。因此，一旦插入，支持架将在靶组织内生物降解，从而无需去除它以及无需可能的CED装置的取出。

[0065] 插入支持架可以另外包含大量一种药物和/或插入支持架的表面可涂覆药物或者其他功能性物质。示例性的试剂可以包括抗炎组分，增加药物渗透性的组分，等等。

[0066] 在一个示例性的系统实施方案里，柔韧的CED装置将在流体入口的近端适当连接流体供给部。该系统可以包括连接流体供给部的可控流体供应发生器，例如程控压力发生器或者程控流速发生器，以及各种的控制组件如泵，阀门，仪表和/或其他微流控组件。

[0067] 本发明的更进一步的非限制性的，示例性和说明性实施方案，现在将结合参考说明和研究数据，装置制造，给药应用，和通过涉及大鼠脑的实验所获得的相关信息来阐述。由于大鼠颅骨相对小，示例性微探针组件长度尺寸也相应小些。然而，为相对更大的靶组织尺寸的应用(例如，人或者其他大型动物颅/脑或者其他组织/器官)，更长的微探针部分和/或更深的组织透入深度可能是必要的。由于结构刚性不足，更长的微加工微探针的使用是不可行的。这种情况根据本发明的示例性实施方案根据附图15通过装置1500-1来举例说明。微加工CED装置的至少微探针部分1501连接着细长的支持结构1503的远端，所述支持结构1503具有比微探针部分长度LM更长(例如，2倍)必要地更长的长度，其有利地以合适规格的导管或针的形式利用并具有适合的孔1505，该孔1505流体连接CED装置的微通道(或至少是微探针部分)以便输送流体。虚线1507代表与示例性的大鼠脑1506显示的相对小尺寸相比相对更大对象(例如，人)的更厚的靶组织深度(例如，颅骨，脑，器官，等等)。更长的导管/针结构适合更深的穿透进靶组织，从而使得微探针部分达到靶位置，而不用冒探针断裂的风险或其它与更长的微探针部分本身相关的可能的失败机制。根据一个示例性方面，延长的支持结构可以代替CED装置的流体供给部分或附加该部分。支持结构的孔能如上所述通过微管或其它已知的装置连接到流体供给源/控制器。

[0068] 现在将描述本发明的制备微流量控制CED装置的示例方法实施例。

[0069] 根据本发明的实施方案，为CED建立综合的微流量控制递送系统的实际的第一个步骤是说明流体能以相当于通过针和插管的速度通过微加工装置来递送。接下来的示例性实施例描述了一种装置的微加工和测试，其能插入到脑组织中和递送适合CED的流速(例如，0.1-5μL/min)。这个说明性的装置是设计用于递送流体到成年大鼠的尾状核，从而直接与先前的用针的研究做比较。输注进琼脂糖脑模型，检测老鼠尾状核，确定用微流控装置能够获得比利用标准的针头时更高的流速，而且没有明显的回流。另外，开发了分析模型去检测扩散对输注药物的渗透的影响。

[0070] 微流孔探针的制造

[0071] 参考附图5(a-l)，用标准微型机加工技术图案化硅和聚合物层来制造一个示例性的装置。附图5显示了一种概要的生产过程，其涉及了一系列的图案化，沉积，和去除步骤。完成的装置由附图3，4和6所示的三部分组成：一个具有100x100μm横断面和2到5mm的长度的可插入微探针部分105，一个具有2mm x2mm x300μm尺寸的手柄部分155，和一个具有2mm长度和100x100μm的横断面的能连接到外部管道的流体供给部分165。

[0072] 开始制造之前，一个1-2μm的二氧化硅蚀刻罩502通过PECVD沉积在厚度300μm的双面、抛光硅晶片(附图5(a))的背面。晶片的背面之后用电感耦合等离子体活性离子蚀刻法蚀刻到200μm的深度来确定插入和突出物厚度503(附图5(b))。2μm的二氧化硅层504之后沉积在晶片背面，采用等离子体增强化学蒸汽沉积(PECVD)。当下一个步骤中晶片的前面被蚀刻时，这层起到终止蚀刻的作用(附图5(c))。

[0073] 5μm厚的正型聚酰亚胺507层(Photoneece，Toray Industries，Japan)被旋涂，图案化，凝固在晶片的正面为微通道形成一个基底层(附图5(d))。下一步，牺牲性光致抗蚀剂在聚酰亚胺之上旋涂形成一个高度10-15μm的层508。然后在一个对流加热炉里，晶片温和的在90℃下烤30分钟。这种光致抗蚀剂被图案化并且显象，原地留下光致抗蚀剂来确定微通道(附图5(e))。在90℃下强烤这个部件5分钟。然后聚酰亚胺底层用一个氧等离子体(400W，1分钟)弄粗糙促进在聚酰亚胺和聚对二甲苯之间的粘着力。然后沉积一层聚对二甲苯C(优选涂覆系统)到5μm的厚度(附图5(f))。

[0074] 聚对二甲苯沉积之后，一个100nm铝层510经电子束蒸发和形成通道的形状(附图5(g))。铝起了通道的入口和出口的蚀刻遮蔽物的作用。旋涂和图案化一层随后的抗蚀剂层511作为对于聚对二甲苯蚀刻和硅的强反应性离子蚀刻的蚀刻遮蔽物(附图5(h))。用150W的氧等离子体以100nm/min的速度来蚀刻聚对二甲苯层(附图5(i))。蚀刻硅层向下到氧化物蚀刻终止层来确定插入和突出的几何形状(附图5(j))。接下来，使用铝蚀刻遮蔽物在聚对二甲苯层来蚀刻出入口和出口(附5(k))。在缓冲氧化物蚀刻中同时去除氧化物蚀刻终止层和铝遮蔽物。最后，丙酮浴4小时，接着在异丙醇4中小时和去离子水中
12小时，来从通道中去除光致抗蚀剂。

[0075] 使用这个过程来加工形成具有1-20μm高和10-100μm宽的通道。在示例性装置的通道具有10μm的高和50μm的宽(附图6)。通道的长度从流体供给部分运行到微探针部分的尖是8mm。

[0076] 根据一个示例性方面用附图12来说明的是，一种柔韧的，微流控CED探针的制备方法包含这些步骤：沉积一层聚对二甲苯1209在一个准备好的硅晶片1201上(附图12(A))；将一种经选择深度的光致抗蚀剂1208施加在硅晶片上，所述深度与一个预期的通道高度相应(附图12(B))；图案化光致抗蚀剂层去确定通道的内在区域；通过沉积第二层聚对二甲苯1210在晶片上形成一个探针的顶部区域；沉积蚀刻掩蔽物在晶片上；图案化该蚀刻掩蔽物以确定探针的全部的形状(附图12(C))；蚀透对聚对二甲苯层直到硅晶片来确定探针主体(附图12(D))；从通道的内部区域去除剩余的蚀刻剂；和从晶片上取出已完成的探针。

[0077] 根据一个示例性的方面，一种用于一种柔韧的微流控CED装置(例如，100-11，附图11)的可插入的支持架的制造方法(例如，1150，附图11)涉及以下步骤：提供具有适合这个要完成的支架的模具形状的合适的模具；填充适当量的热塑性聚合物进这个模具；压制和加热模具从而热塑性聚合物被加热到高于它的玻璃态转化温度Tg；把模具冷却到Tg下；和，从模具中移除已完成的支架。根据一个优选的示例性方面，这种方法包括把适当量的乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)填充进模具。

[0078] 根据一个示例性的方面，一种分子靶向CED基传感器的制造方法涉及另外的步骤：在探针上沉积和成性电极和与电连接；在电极和电连接之上沉积一层聚对二甲苯绝缘层；选择性地蚀刻聚对二甲苯层来暴露电极；应用一种离子传导聚合物到电极上；和固定一种对于靶分子的特异的氧化还原酶到电极上。根据一个具体的方面，所述方法包括将这个装置浸入到Nation溶液(在脂肪族醇中占5％)中和干燥。根据一个具体的方面，所述方法包括将这个装置浸入到包含谷氨酸氧化酶，BSA和戊二醛的水溶液中。

[0079] 试验性的装配

[0080] 已制造的微流控装置使用两段环氧树脂来附加一个微量加液器(OD＝1mm，ID＝0.58mm和OD＝2mm，ID＝1.12mm)。然后这个微量移液器用0.1％(w/v)伊文思蓝，或者
1％的(w/v)伊文思蓝标记白蛋白装填，插入微型操纵器上的微量移液器夹钳。微量加液器夹钳连接这一个有低顺应性的聚乙烯管的程控压力注射器(World Precision Instruments PM8000,Sarasota,FL,USA)。使用压缩的高纯度氮作为压力源。注射器在通道的入口保持一个恒压。通过微量加液器中前方的流体速度的测定来确定通过装置的流速。在一些实验中，30号的钝的针用来代替这个微流控装置，从而能在递送方法间直接比较。

[0081] 相对于典型的CED实验设计中以恒定的流速输注流体，发现在恒定的压力下输注是显著有利的。它更容易在微流控装置通过调节压力而不是流速去操作流体，尤其当启动最初充满空气的通道时。此外，以恒定的压力输注，在组织中的压力分布图显示出与组织材料特性无关。

[0082] 琼脂糖脑模型

[0083] 用琼脂糖凝胶(0.6％的w/v)作为一种脑组织结构类似物来表征装置的递送。显示在这种浓度的琼脂糖中的流动来模拟在脑组织中的压力驱动的流动的一些特性。将琼脂糖粉末添加到3-硼酸盐-依地酸(TBE)缓冲液，和当盖住时一个微波炉里以高热量加热90秒。这个热溶液倒入100mm的组织培养皿并且在室温下2小时容许其形成凝胶。使用微型操纵器以1mm/s的速度将装置插入到凝胶中5mm。以35，70，140和210kPa的压力，将固定量(范围从10到4μL)的染料溶液输注到凝胶中。

[0084] 染料从装置尖呈放射状向外流动，在装置尖附近形成了近似的球形。输注之后，持续在10-80分钟，通过测径器测定已染色的琼脂糖球的直径来确定渗透深度。

[0085] 动物研究

[0086] 12只雄性的斯普拉格·道利氏大鼠(180-200克)用来定性装置在体内的性能。通过腹膜内注射氯胺酮(100mg/kg)/赛拉嗪(xylyzine)(10mg/kg)来麻醉大鼠。将大鼠的头刮毛并且用丁二烯/乙醇/丁二烯棉头拭子消毒。在离前囟点横向3mm做切口并钻一个
1mm直径的孔。用微型操纵器以lmm/s的速率将所述装置插入到脑中。

[0087] 让组织机械平衡3分钟。然后，以35，70和140kPa的压力将伊文思蓝标记的白蛋白输注进尾状壳核。通过测定尾状壳核中流体的速度来确定流速。在5μL伊文思蓝标记的白蛋白输注之后，将装置与大气通风并迅速移开。通过二氧化碳吸入法将动物立即处死，移出大脑，在-70℃己烷中快速冷冻。脑在一台恒冷切片器上被切割成25μm的切片。收集每逢第5个切片来做图象分析。全部程序都是根据耶鲁大学建立的动物关怀和使用委员会的规章来进行的。

[0088] 图像分析

[0089] 使用立体镜和CCD照相机来对脑组织切片的冻结切片拍摄。使用StreamPix软件(Norpix Inc.,Montreal,Canada)来抓取图像存为RGB8-位终端图像记录格式文件。为了确定白蛋白的渗透深度，使用Matlabscript将这个RGB文件分解成红，绿，和蓝色平面。每个平面由480x640像素组成，每个像素的亮度数据在0-255的范围内。通过将每个独立的像素除以三种颜色的总的像素亮度将蓝色平面像素标准化，BN＝B/(R+G+B)，如果BN的值是超过0.333的，就认为像素具有显性的蓝色亮度。指定超过0.333值的像素为值0的像素，指定所有具有少于0.333的像素为值1。结果是二元图象，其中0是黑色的，1是白色的。为了最小化背景噪音，应用蚀刻操作到每个图象上。蚀刻操作说明如果一个黑色像素的八个邻域中的超过四个是白色的，之后转换这个像素成为白色。晶片的拓扑学在这个图象中留下人为产物，显示为在巨大的黑色或染色的区域中的独立的白色像素。扩张操作被使用，该扩张操作规定，如果一个白色像素的八个相邻像素中有超过四个是黑色的，则转换这个像素成为黑色。在成像过程后，通过合计黑色像素的数目来计算每个晶片的区域。用ImageJ软件((National Institutes of Health,Bethesda,MD))中的Analyze Particles工具去计算每个染色点的区域和适合这个点的椭圆形的长轴和短轴。因为我们对检测药物在灰质中的递送感兴趣，只有在灰质中的染色部分被考虑用于计算长轴和短轴之间的比率。这种方法不是测量染色浓度，而是改为只是测定一个阈值浓度。来自每个动物的一些图象也用若丹明滤光器利用落射荧光成像来估算阈浓度。比较荧光图象的亮度轮廓的一种二维平面曲线与处理过的立体镜图像。假设亮度是和浓度成比例，阈浓度是大约注射浓度的60％。

[0090] 流体输送模型

[0091] 在输注进凝胶和组织期间的流体输送部分依赖这种介质对强加的流动的机械响应。已经研制了去描述在刚性细孔，弹性多孔和粘弹性多孔介质模型里的流体输送。在一个模型里包括弹性多孔或粘弹性多孔特性可用于捕获瞬态的基质的响应和在基质里的时间依从性应力。然而在稳态，假定压力和速度场不依赖于材料的特别组成。那这里进行简化处理来估计近似的介质的水渗透率和结合了扩散作用的渗透距离。

[0092] 组织中固体基质的质量守恒和流体组成能表示为

[0093]

[0094] 其中v是流体速度矢量，u是固体基质速度矢量，和是孔隙率。Darcy法则给出了下列的在多孔介质里速度和压力的关系

[0095]

[0096] 其中k是透水率和P是压力。假设稳态和完全径向流动，等式(1)就变成[0097]

[0098] 综合而得vr＝A/r2 (4)

[0099] 替换等式(4)进等式(2)并且积分产生

[0100]

[0101] 通过假定在无穷大时压力减少为0，以及假定P(α)＝P0，求出积分常数A和B，其中P0是在大约这条微流控通道的顶端范围的充满流体的腔里面的压力。评估常数给出了下列压力和速度分布曲线。

[0102] (P(r)/P0)＝α/r (6)

[0103]

[0104] 在通道顶端的通道容积流量是

[0105]

[0106] 在这个实验中，对于各种P0值来测定流速，Q(α)。等式(8)表明Q(a)/4πα作为P0的函数所呈现的图线应该是直线，该直线的斜率是介质的表观渗透率。

[0107] 输注的化合物的渗透距离可以通过假定认为对流和扩散的输送是并联发生来进行估算。扩散的特征时间，τD是，

[0108] τD＝r2/D(9)

[0109] 其中D是在多孔介质里的被输注的分子的扩散系数。对流的特征时间，τc是[0110]

[0111] 为了估算在输注超过一定时间T后的渗透距离，对于扩散和对流的特征时间倒数总计如下

[0112] 1/T＝1/τD+1/τc(11)

[0113] 满足等式11的r的值是对渗透距离R的估计值。

[0114] Peclet(佩克莱)数XPe＝τD/τC给出了对流输送相对于扩散输送的重要性。对输注到一种多孔介质来说，Pe在注入点是最大量并且随着离注入点的距离而减少。在Pe无限大的极限情况下，到处都是对流支配流体输送因而扩散能被忽略，这产生对流支配渗透距离Rc作为时间T的函数

[0115]

[0116] 这个模型很适合对其中没有消除机理的向凝胶中的输注。

[0117] 结果

[0118] 装置特性

[0119] 通过压力注射器来控制恒压输注，这设定了微通道逆流压力到希望的值。然而，在微通道全长中会有明显的压力损失，这是必须考虑在内以便找出输注压力，P0，在通道的出口。为了确定压力损失作为流速的函数，测量在若干个注射压力下在微通道中的流体的流速，微通道的出口处浸在蓄水池(0ga压力)中。找出在流速和注射压力之间的线性关系，这是被期待的，因为在微通道中流动是分层的。发现在注射器和微通道出口处之间的压力下降ΔP是，ΔP(kPa)＝70.0Q(μL/min)。因此，在输注实验过程中，测量Q，用这个等式去算出ΔP，然后从注射器压力中减去这个值来确定在通道出口的压力，P0。

[0120] 输注的化合物的分布和回流

[0121] 染料输注到琼脂糖凝胶中，用于研究在注射器压力7，35，70，140，210和310kPa，相对应的输注流速分别是0.08，0.4，0.8，1.7，2.9，4.5μL/min。在每个情况下，输注导致在微渠道的出口附近的球形匀称的染料分布。在任何一种这些注射压力下没有回流的视觉证据。附图13的曲线图显示在Q(a)＝4πa和P0之间的一种线性关系；根据等式(8),这直-12 2线的斜率给出了在2.05x10 m/Pas的0.6％的琼脂糖的表观水压传导率。即使在最低的注射者压力(7kPa)下，能立即观察到染料的渗透，说明探针的出口没有堵塞。没有对于开始流动的压力障碍的证据。相反，通过钝的30号针以相同的方式插入到凝胶中来输注，压力必须超过11kPa才出现流动的证据。去对比具有针头的微加工装置的表现，直到观测到开始回流，注射压力才阶段性上升。对于这种微加工装置在5mm的插入深度，当压力增加到
310±8kPa(n＝10)相应流速是4.5μL/min时，观测到回流。对于一个30号针头，当压力增加到20kPa±4(n＝10)相应流速0.41μL/min时，观测到回流(参见，例如，附图14A，B分别显示了以下情况的染料分布：示例性的CED微流控探针(Qmax＝4.5μL/min；P临界＝
0kPa)相对于30号针头(Qmax＝0.4μL/min；P临界＝11kPa))。

[0122] 例如图15的附图说明，装置从前囟点横向3mm插入到大鼠的尾状核到5mm的深度。如图16(a-d)所示，研究在注射压力35，70和140kPa下的染料输注。在这些情况中，除了在140kPa的情况外，输注导致了染料分布呈几乎椭圆形。图13显示了在流速和通道出口处的压力P0之间的关系是线性的，比较等式(8)的数据产生得出在尾状壳核灰质中的-12 25.63x10 m/Pa s的表观水力渗透性。

[0123] 在大鼠脑里的染料分布的形状取决于注射器压力。在35kPa的注射器压力下，在每个冠状切面内的染料的分布是轻微的非球形。在70和140kPa，分布更长。对在灰质中的染料总体积和在输注处(前囟点侧面3mm)的分布纵横比进行单因素方差分析(ANOVA)。表格1和2分别显示了对于体积和纵横比的α值0.05的ANOVA结果的总结。在两种情况中，在低，中和高压力组之间具有统计学上的显著的(p<0.05)区别。然而，在输注点外的纵横比不具有统计学上的显著的区别。结果说明不对称分布局限于紧邻着装置的组织。

[0124] 在三种情况之一，是在140kPa的注射器压力而不是在35或70kPa的情况下，发现了回流的证据。在这种情况下，作为沿着微通道的外表面的回流的结果，输注的染料移入了紧邻尾状核上的胼胝体的白质。一旦在白质中，染料之后向前或向后方向流动。在这种情况中的回流是由拙劣地插入引起的，这增加了回流的可能性。在环氧树脂的消除期间，偶尔装置和扶持它的微量加液器之间能变得轻微的失调。在这种情况下，装置不能完全的垂直于它插入的表面，这能导致组织撕裂和回流。

[0125] 由于大鼠脑的小尺寸，甚至在没有回流的情况下染料达到了白质。尾状核是均质的灰质的最大区域。它是大致球形直径为大约3.0mm，并且由胼胝体组成的白质包膜包围。输注的白蛋白到达胼胝体辐射线额部在一个2mm的渗透距离，接着向前流动了若干毫米。
如此广泛的渗透在灰质中是不可能的，但是它能通过高渗透性白质束输送而发生。

[0126] 表1

[0127] 在低(35kPa)，中(70kPa)，和高(140kPa)注射器压力之间分析在灰质中的染料体积偏差

[0128]

[0129]

[0130] 表2

[0131] 在低(35kPa)，中(70kPa)，和高(140kPa)注射器压力之间，分析在前囟点侧面3mm处的方位率偏差

[0132]

[0133] 扩散对渗透距离的影响

[0134] 与通过在控释中的扩散获得的渗透相比，CED的潜在优势是通过对流能增强渗透2
进入组织。对流支配了在微通道顶端附近的扩散，但是输注速度以1/r 衰退，其中r是离开顶端的距离。如果输注的药物从输注点渗透足够远，则在它最远的渗透处扩散可能支配它的运输。这种情况所发生的距离不仅取决于输注速率，也取决于注射分子的扩散能力。

[0135] 为了显示扩散如何影响在CED中的渗透距离，比较两种输注分子向琼脂糖中的输注：小的水溶性分子(伊文思蓝)和大的球形的蛋白质(白蛋白)。执行不同持续时间的输注和测定包含染料的凝胶的体积Va，和与已知的被输注的流体体积Vi相比较。附图17显示比率Vd/Vj作为输注时间的函数。没有扩散时，相应于在流动的自始至终无穷大的Peclet数，比率Vd/Vj等于孔隙率的反函数而与输注时间无关。然而，数据显示比率取决于输注时间，这说明扩散影响渗透距离。比率越大，显示了越强的对于伊文思-6 2蓝的输注时间的敏感性，这可从等式(11)根据它的更大的扩散系数(D＝2.0x10 cm/s,Stokes-Einstein equation,molecular radius from Markou et al.,A novel method for efﬁcient drug delivery,Ann.Biomed.Eng.,26(1998)502-511)相较于白蛋白的扩散系数-7 2
(D＝8.3x10 cm/s，在0.3％琼脂糖中)来预期。对于两种化合物的数据结合上述模型来比较，通过等式(11)去估计渗透深度作为适合的实验性参数。在附图17中所示结果显示
2
了在模型和宽范围的输注时间数据之间的良好的一致性。多重可决系数(R)是伊文思蓝
0.70和白蛋白0.83。

[0136] 讨论

[0137] 对于CED，在这里描述的微加工装置比更大的针头具有许多优势。所述装置能以与利用针的CED相当的流速递送液体并且通常阻碍流体通过针的递送的回流减少。通过选择将若干递送出口放置在单一装置上，装置可制造为用于特殊的解剖学几何位置。此外，其它组件能加入到微加工装置中，包括记录/刺激电极，泵，阀门和流量计。

[0138] 以恒压输注而不是以恒定的流速输注对在组织里的压力和应力分布有重要影响。对恒压输注来说，在组织里的压力分布不依赖于组织的材料特性(等式(6)),包括它的水力渗透性。此外，显示恒压输注到一种粘弹性多孔材料，半径和圆周应力分量也不依赖水力渗透性。相反，对于恒定的流速的输注，水力渗透性强烈影响着压力和应力分量。如果足够高水平的应力引起在神经元和神经胶质细胞中细胞凋亡或坏死的信号级联，甚至当水力渗透性是不确定时，了解应力分布是恒压输注的优势。

[0139] 报导了对于在组织和凝胶中的水渗透率具有一个宽范围的值(从1x10-11到-16 2 -12 2 -12 21x10 m/Pa s)。我们对于大鼠灰质的值2.05x10 m/Pa s与公开的评估值5×10 m/Pa s一致。然而，这种有弹性或者粘弹性多孔介质的渗透性取决于介质的变形。例如，显示琼脂糖的渗透性在单柄流动中降低是由于压缩了在凝胶中的空隙空间。在如本文所述的径向源头流动(radical source flow)中，半径和管周应力分量的强度和标记决定了组织是否是由压缩或拉伸来支配。一组调查发现在白蛋白的恒压输注(2-16kPa)下在纤维肉瘤中的辐向流动中，水力渗透性随着输注压力而增加。对于通过我们的微流控探针达到的恒压输注，近似的水力渗透性不取决于在琼脂糖或脑组织中的流速。然而，在输注这一点的压力和流速的基础上计算近似水力渗透性。为了区别响应流动的局部的渗透性变化，有利的是去作为距离的函数测量压力。我们报导的近似值可能估计比实际的多孔弹性(poroelastic)介质的渗透性高，因为期望在输注位置扩张达到最大程度，导致在那里的增加的孔隙率和更高的渗透性。

[0140] 若干调查发现根据着压力的增加，在恒速输注的开始阶段稳态值陡降。这个结构归因于脑组织的弹性，在细胞外基质中的流体通道的开口，和针尖的简单的闭合。我们的观察和最近的解释相一致。使用钝针头恒压输注进0.6％琼脂糖的过程中，我们发现临界压力(～10kPa)对于观察到对流是必要的。当压力增加到一个只有轻微大于临界压力的值时，随着染料输注突然爆发，在插入深度5mm处出现显著的回流。微流控装置在输注过程中没有展示出任何压力增加。在开始立即观察到输注，而与注射器压力无关。

[0141] 用于CED的递送装置的尺寸影响对于给定的插入深度没有回流的最大允许的输注速率。以前的通过一个32号针头(OD＝0.228mm)进大鼠尾状核的4μL白蛋白的输注的研究显示了而没有回流进胼胝体的最大流速是0.5μL/min。我们的示例性的微流控探针达到2.0μL/min流速(140kPa注射器压力)。在一种动物中，我们发现一种月牙形状的分布(参见附图16)指示回流进入了胼胝体。然而，在这种情况中回流是最可能归因于拙劣的插入。

[0142] 使用标度律(scaling argument)，Morrison et al,Focal delivery during direct infusion to brain:role of flow rate,catheter diameter,and tissue mechanics,Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol.277(4)(1999)R1218-R1229，发现 Xm ＝常数0.6 0.8
Q rc ，其中Xm是回流的轴向长度，Q是流速，rc是导管半径，常数涉及多孔介质的物理特
0.6 0.8
性。对于输注进大鼠灰质，他们发现Xm＝11.41Q(μL/min) rc(cm) (rc＝面积/(周长/2))。应用这个公式到水力半径0.05mm的微流控探针中，给出1.6μL/min的最大流速，这于呈现在这里的观察到的相一致。

[0143] 用成品导管来治疗恶性神经胶质瘤的人体临床试验已经显示在治疗瘤和切除空腔(resection cavities)中有希望。靶肿瘤的大尺寸(～1-5cm)和细胞毒素剂的药物动力学要求长时间的输注时间(2-4天)和高流速(5-10μL/min)。应用Morrison标度率用于灰质的定标关系到这些32号针头的高流速给出了回流距离为1-2cm。应该使用这里所述的示例性的方法设计一种微流控装置，其具有小如10μm的半径。如果大小低到这个尺寸，即使在流速高达10μL/min这个装置导致的回流距离只有几毫米。

[0144] 示例性的微流控CED装置能用于在对流增强型药物递送的相关流动速率下递送流体。装置的小尺寸和几何形状提供了比传统针头/导管输注方案的潜在优势。示例性的在装置顶部的通道入口的定位抑制了在插入组织的过程中的闭合。在恒压输注下小通道操作的使用导致应力域是局部(～100μm)的且不依赖于水力渗透性，这帮助了最小化回流并产生输注液体的球形分布，至少在多孔介质中如此。进大鼠尾状核的流体分布展示了轻微的不对称性。直接与琼脂糖脑模型的针头相比，在5mm的插入深度，能以十倍的流速操作微流控装置而不引起流出脑模型的回流。相似的，在体内输注进大鼠的尾状核可耐受高于先前报导流速4倍的流速。

[0145] 本发明的另一个实施例涉及一种用于增强含药的纳米粒子渗透进脑组织的方法。在这方面，我们研究了两种方法，其用于在对流增强型递送中增强纳米粒子渗透进脑。第一种方法是通过酶的降解的靶组织的预处理。第2种方法使用纳米粒子和高渗性浓度的甘露醇的共同输注。制造一种微流控探针(如上所述)，其具有两条独立的控制通道，这允许了同时或单独的递送纳米粒子和治疗溶液。在普通大鼠的纹状体中执行输注。使用具有54nm的直径的单分散聚苯乙烯微粒作为模型纳米粒子系统。在30分钟或24小时的透明质酸酶消化后输注纳米粒子，透明质酸酶降解透明质酸(脑细胞外基质的主要结构组分)。在24小时的透明质酸酶消化后纳米粒子的分布体积增加了70％，但是在30分钟后没有可检测的改变。在普通和酶降解的组织中，纳米粒子被夹带到大血管的血管周隙中，导致了不规则的分布。纳米粒子和25％甘露醇的共同输注导致在纳米粒子分布体积133％的增加。另外，甘露醇的共同输注进普通或酶降解的组织减少了进入血管周隙的纳米粒子。我们的结果提示可以使用酶消化和高渗性输注液去增强利用CED的纳米粒子渗透，但是高渗性输注液比酶消化在简便性以及纳米粒子扩散程度和模式上具有优势。

[0146] 我们所作的研究表明固定酶到纳米粒子提供了在固定化之后实质上的酶活性。购买具有羧酸基表面的聚苯乙烯纳米粒子。使用碳化二亚胺化学作用以及与纳米粒子的相关处理过程类似的过程将透明质酸酶共价连接到纳米粒子表面。更优选的，通过在缓冲液中N-乙基-N-(3二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDAC)来活化在粒子表面的羧酸组。之后将透明质酸酶添加到溶液中，在溶液中酶的胺基团与羧基形成酰胺基。为了证明酶的活性，我们用透明质酸酶或透明质酸酶包裹的纳米粒子与透明质酸的储存液保温。通过估计添加到纳米粒子的量来选择酶的量。我们使用了比浊测定去确定透明质酸酶的浓度。纳米粒子是100nm的聚苯乙烯，用上述CED实验中所用相同的酶——透明质酸酶共价修饰。在图23中的图片2301显示动力学相似，除了纳米粒子在保温箱中过夜开始沉淀；因此24小时这个时间点比预期的有些少。

[0147] 对脑部疾病的很多有希望的治疗涉及纳米粒子作为药物或者基因载体。血-脑屏障阻止大多数粒子渗入脑中，使得颅内的输注或者对流增强型递送(CED)成为一种具有吸引力的药物递送策略。然而，通过组织的细胞外间隙的粒子输送受阻于粒子的大尺寸(10-100nm)，这比更容易渗透进脑细胞外基质(ECM)的小分子药物或治疗性蛋白质药大的多。结果表明假如粒子直径小于100nm，为电中性和带负电，并不受快速消除机制的影响，纳米粒子就能渗透进脑组织。

[0148] 进行研究并报告动物瘤模型中的脂质体的CED。最初涉及两种尺寸脂质体的研究显示40nm脂质体遍布了整个大鼠的纹状体，但是90nm的脂质体被限制在输注点附近的区域。聚苯乙烯粒子的输注也显示了类似的粒子尺寸的影响。100nm聚苯乙烯粒子的分布体积为40纳米粒子的大约一半。灰质的细胞外基质的有效的孔径大小估计是在38和64nm之间，这可以解释为什么更大的粒子很难穿过ECM。其他因素也可能限制粒子在脑里的渗入程度。

[0149] 已知纳米粒子可以被带到白质中和在脑瘤的坏死区域中。脂质体能积累在并且穿过血管周隙的空间。通过血管周围空间的转运被认为是一个流体从脑中消除的重要部分。根据CED和基因治疗的临床实验报告建议优先的通过血管周围空间的转运对某些副作用负有责任。通过ECM组成的选择性的酶消化来增加有效的孔尺寸和增强纳米粒子在组织中的渗透是可能的。例如，调查者已报导了继胶原酶处理异种嫁接肿瘤后IgG的扩散系数100％的增加。与大多数其他组织不同，脑的细胞外基质有低含量的纤维基质蛋白，例如胶原蛋白。脑ECM主要由称作lecticans的蛋白聚糖家族以及它们结合的双组分，粘蛋白和透明质酸(HA)，组成。这3个大分子在成人脑的细胞外隙空间里形成一个三元的结构。HA作为脑ECM的结构性脊梁，其带有大量电荷的软骨素硫酸盐蛋白聚糖(CSPG)侧链固定ECM到细胞和血管。HA和CSPG能分别被透明质酸酶和软骨素酶降解。然而，一些透明质酸酶如同切割在HA中的糖苷键一样切割在CSPGs中的糖苷键。

[0150] 第二种增强纳米粒子渗透的方法是去扩张细胞外间隙。输注高渗性溶液进入细胞外间隙导致了水从周围的血管和细胞流出，这增加了ECM的孔尺寸。例如，在用于阿耳茨海默(氏)病和桑德霍夫病的动物模型中的AAV载体的单次快速静脉注射中，输注高渗性浓度的甘露醇已经显示出增强病毒载体分布和基因表达。甘露醇和脂质体的共同输注已经显示出增强了对大鼠纹状体的渗透。

[0151] 结合本发明的实施方案，制造一个双通道的微流探针(如上所述)将两种独立的溶液递送到脑中相同的输注位置。使用探针通过一条通道去递送酶溶液和通过另一条去递送纳米粒子。输注等渗的或高渗性的粒子溶液进普通和酶处理的脑中。酶和高渗处理都导致纳米粒子分布体积的增加。

[0152] 微流控探针的制造和实验性的装配

[0153] 使用上述标准微机加工方法来制造一种示例性的双通道的微流控探针(参见，例如，附图8)。简要的说，使用聚对二甲苯C结构层(Specialty Coating Systems,Indianapolis,IN)和牺牲性光致抗蚀剂层(Shipley1075,Phoenix,AZ)，在一个硅基底上形成两条平行的微流控通道。每条通道的横截面是10x25μm。通过前面和后面的强反应性离子蚀刻硅基底来确定探针的几何形状。示例性的探针具有三个主要特征；1)一个用于插入组织的具有100x100μm横截面的5mm长的柄，2)5x5mm的基底，其中间具有一个用于固定装置到一种常规的固定器的孔，3)两个横截面70x100μm的突出，用于连接探针到聚酰亚胺管。附图8显示了探针和通道的电子显微镜照片，同时附图18显示了附加到固定器上的实际的探针的照片。

[0154] 常规的固定器由附加了10×10×10mm的聚碳酸酯块的6.4mm直径的聚碳酸酯枝组成。这些块包含了5x5x0.5mm磨出的凹槽。使用一个0-80不锈钢螺丝钉和一个聚碳酸酯垫圈来使探针固定到固定器上。使用two-part环氧树脂(Epoxy907Adhesive System,Miller-Stephenson)来使聚酰亚胺管(Small Parts Inc.,Miami Lakes,FL)粘在硅突出上。聚酰亚胺管的另一头连接着有刻度的微量加液器(没有在附图中显示)。通过施加10psi的真空于微量加液器和浸探针尖到输注溶液的烧杯中，来装填微流控通道，管路系统，和微量加液器。用高纯度压缩氮气作为压力源。压力注射器(World Precision Instruments PM8000,Sarasota,FL)在通道的入口处维持恒定压力。通过测定在微量加液器中前端流体的速度来确定通过装置的流速。

[0155] 纳米粒子的制备

[0156] 使用羧化物修饰的单分散的聚苯乙烯纳米粒子 (Molecular Probes,FluoSpheres)作为一个模型系统去确定粒子尺寸在渗透中的作用。羧化物修饰的表面相对于裸露的聚苯乙烯提供了带大量电荷和相对亲水性。通过在室温下在磷酸盐缓冲液(BSA)中1％浓度的牛血清白蛋白保温0.02％纳米粒子的固体溶液4小时来减少非特异性结合。通过疏水性相互作用蛋白质迅速吸附到聚苯乙烯粒子表面。通过静电光散射来测定粒子尺寸和通过在带电平行板子(Brookhaven Instruments Corp.,ZetaPlus)间的迁移率来测定粒子电位。尺寸和电位的结果以十次测量的平均和标准误差来报告。为了筛分11
(sizing)，稀释粒子和BSA包覆粒子的原液到10 粒子/ml。对于脑输注，维持纳米粒子固
23
体浓度恒定在0.02％或大约10 粒子/ml。

[0157] 体内纳米粒子的输注

[0158] 25只雄性斯普拉格·道利氏老鼠(270-305克)用于我们的研究。全部程序都是根据耶鲁大学建立的动物关怀和使用委员会的规章来进行的。通过腹膜内注射氯胺酮(100mg/kg)/赛拉嗪(10mg/kg)来麻醉大鼠。头被刮毛并且用丁二烯/乙醇/丁二烯棉头拭子消毒。在离前囟点侧面3mm做切口并钻1.5mm直径的孔。在一个立体的定位的架子上用微型操纵器以lmm/s的速率将探针插入5mm的深度。让组织机械平衡2分钟。应用7.5-15psi的向上的压力来产生0.75-1.0μL/min的流速。输注体积是5μL。对于更粘的
25％甘露醇溶液，需要压力高达30psi。输注之后，探针留在原位2分钟来允许多余压力消散和防止沿着插入腔向上逆流。

[0159] 认为两种处理方法增强了纳米粒子的渗透-酶的降解和渗透引起的扩张。通过探针的一条通道以1μL/min输注5μL1000U/mL透明质酸酶(来自bovine testes,Sigma H3506)来进行ECM的酶降解。在消化后30分钟，输注纳米粒子以0.75μL/min流速通过第二条通道。通过混合纳米粒子进25％甘露醇溶液和经过单个的通道以0.75μL/min流速输注5μL进行渗透诱导的扩张。

[0160] 为了检测消化时间对粒子渗透的影响，进行了一些实验，其中在透明质酸酶的输注和纳米粒子的输注之间有24小时的间隔。在这些情况中，在酶输注之后探针被移除，允许动物复原。24小时之后，重新插入探针用于纳米粒子输注。为了避免可能的纳米粒子的通过酶输注处的逆流，我们使用了另外的位置用于纳米粒子输注。酶输注点是从前囟点横向3mm和前面0.5mm，纳米粒子输注点是从前囟点横向3mm和后面0.5mm。执行两种输注在都在5mm的深度。消化24小时后输注等渗或高渗溶液进入降解了的组织。

[0161] 测定纳米粒子的分布

[0162] 探针移除后通过断头法将动物立即处死，移出大脑，在干冰中冷冻。脑在一台恒冷切片器上从输注点前1.0mm到后1.0mm切割成50μm的晶片(总共2mm)。使用CY3滤光片在荧光实体镜(Zeiss Lumar V.12)上抓取纳米粒子的分布。在CCD相机上优化每片脑的曝光时间来达到在输注处的最大动态范围，而且没有任何像素饱和。对每个脑的所有切片使用相同的曝光时间。使用常规Matlab script来计算纳米粒子的分布体积，它从灰标度影像中产生一幅二元图像和计算粒子渗透区域。对于二元操作的阈值是最大荧光亮度的10％，亮度值在25-255的都包括在内用于计算每个晶片的渗透区域。从组织中没有可探测的背景荧光。通过合计在每个晶片中的渗透区域和乘以晶片厚度(50μm)来计算渗透体积。使用t-检验去测定在受控的输注和疗法之间分布体积上的统计学意义的变化。

[0163] 透明质酸降解的组织学评估

[0164] 在与上述相同的手术操作之后，输注1μL1000U/mL的透明质酸酶进纹状体，接着通过染色透明质酸结合蛋白(HABP)来测定HA的降解。降解时间30分钟，6，12和24小时后，采集脑和在4％多聚甲醛的PBS中在40℃下术后固定4天。组织在30％蔗糖中冷冻保护3天，在-700℃冷冻，切成50μm的切片。将组织切片浸入生物素酰化的HABP(50μg/μL,Calbiochem385911)在PBA中和在定轨振荡器上留过夜。载玻片浸入到Alexa555-抗生蛋白链菌素偶联物(2mg/mL,Invitrogen S21281)2小时。经过在PBS中的几个清洗步骤之后，染色的切片用Pro Long Gold Antifade介质(Invitrogen P36930)包埋和覆盖。使用与用于纳米粒子成像的装置相同的装置来捕获荧光图象。

[0165] 结果

[0166] 附图19(A-D)显示了对于所研究情况范围的荧光粒子的特有分布：用酶预处理的纳米粒子输注，纳米粒子和甘露醇的共同输注，和没有甘露醇或酶预处理(控制)的纳米粒子输注。表格3显示了对于每个情况的纳米粒子分布体积，是通过分析这套图象来测定的。

[0167] 表格3

[0168]

[0169] 在用透明质酸酶消化24小时后，在分布体积上有增加。然而，对于30分钟消化没有测量到影响。纳米粒子和甘露醇的共同输注进正常组织显示了在分布体积上的最大增加。甘露醇共同输注进酶降解的组织也增加了分布体积。

[0170] 纳米粒子尺寸和电荷

[0171] 公认的已测定的纳米粒子的直径是36.0±0.4nm和经测定的电位是-33.4±2.2mV。在供应厂商举例的尺寸(24nm)和测定的尺寸间的偏差是由于聚集还是生产商误差是未知的。为了减少聚集，在分筛或输注进动物前粒子悬浮液在水浴中超声处理10分钟和涡旋。用BSA保温增加直径到53.6±0.4nm和降低电位到-5.6±1.5mV。在直径的18nm的增加与已报导的BSA的流体学直径(7.2nm)很好地一致。

[0172] 细胞外基质的酶降解

[0173] 最初的研究显示用透明质酸酶的30分钟的酶消化对于纳米粒子分布体积没有可测量到的影响(数据没有显示)。根据先前的报导的在24小时后充分消化HA，我们增加消化时间到24小时。在24小时后，在酶降解组织中的纳米粒子的分布体积比在正常组织的纳米粒子分布体积大70％(表格3)。我们假设透明质酸酶(55kDa)在5μL的输注体积时渗透穿过整个纹状体，因为在相似输注体积在相同输注点,BSA(69kDa)(相似尺寸的蛋白质)能渗透穿过纹状体。

[0174] 对HA组织化学染色来支持在HA消化24小时后增强纳米粒子渗透的观察。附图20(a-d)显示一些在30分钟(附图20a)和6小时(附图20b)消化时间的的降解证据，但是HA的痕迹在输注点附近仍然明显，反之，在组织消化12小时(附图20c)和24小时(附图20d)的情况下HA普遍降解。24小时保温显示了最充分的HA降解。在12小时和24小时，从输注点±1mm的切片显示了与图18所示相似的HA降解，同时在30分钟和6小时降解局限于几百微米。在更长的消化时间透明质酸酶更深的渗透可能是HA降解的药动学和原始1μL推注的扩散二者的函数。

[0175] 纳米粒子被带到正常和酶处理的组织中的大动脉的血管周隙空间，如同图21(A,B)显示的那样。在血管壁和ECM间的空间形成了潜在的优先通道用于纳米粒子输送，血管周隙空间的分枝图型相似于附图20中观察到的图型。附图22显示了纳米粒子分布区域作为离输注点距离的函数：对于酶处理组织，在接近于输注点的切片的纳米粒子分布区域是大于没有处理的组织，暗示了在最接近源头的区域组织对于对流的抵抗较小。可能是透明质酸酶的降解使ECM局部刚性降低，因此，在输注过程中对扩张更敏感。因为输注带来的在间质中的压力随着离输注点的距离的增加反而减小，扩张可能局限于很邻近输注点的组织。

[0176] 细胞外基质的渗透性扩张

[0177] 在未处理和酶处理的组织中，通过共同输注25％甘露醇和纳米粒子来引起扩张。在两种情况中在共同输注甘露醇的过程中分布体积都有明显的增加(表格3)。在所有处理中分布体积增加最多的是发生在甘露醇共同输注进未处理的组织的情况中。在酶处理组织和与甘露醇共同输注的降解组织之间，分布体积增加了23％，而在未处理组织和用甘露醇共同输注的未处理组织之间，分布体积增加了133％。

[0178] 对于用甘露醇的共同输注，没有观察到指示血管周隙输送的分枝状纳米粒子分布结构。在酶预处理这个情况中，甘露醇共同输注进未处理组织显示出分布区域在输注点附近的一个峰(附图22)。在酶处理组织和用甘露醇共同输注的酶处理组织之间，在输注点附近也有粒子体积的变化。对于酶处理组织在总分布体积具有差异(p＝0.04)(表3)，尽管差异没有在正常组织中明显。透明质酸酶处理，尤其在输注点附近，显示出减轻了一些高渗性处理的影响。

[0179] 讨论

[0180] 执行CED治疗方案的临床医师强调需要更好的递送装置。用具有单一的内部端口的导管或细针来改良大多数递送装置。这些装置常常导致逆流和不可预知的药物分布。逆流或回流的数量，随着装置直径而减少。

[0181] 在流体递送系统中的另一种有用的特性是从沿着装置全长的多个端口输注。试图从具有多个端口的导管输注，经常导致仅仅从最近的端口发生流动。这里，我们已经证明了通过两条通道单独和独立地输注溶液的能力。这个微流体平台能轻易的扩展到包括了沿着装置的全长的若干条独立控制的具有排出口的通道。通过允许临床医师响应于实时图象技术测定的药物分布来打开/关闭多条通道，这样的装置能增强CED治疗方案的效力。此外，多通道装置允许了先前不可能利用的治疗方案，包括预处理和共同输注策略去改善药物分布。

[0182] 已报导常规灰质的有效孔径是在38-64nm，使得很多纳米粒子无法用于药物递送的运输中。然而已报导的病毒载体和脂质体在动物模型中渗透了几厘米，虽然是分枝的分布形式。一些研究者已经提出细胞外隙空间充当了排除多余水分的通道和充当了纳米粒子的优先通道的角色。这里所观察到的对于正常和酶处理的组织的分枝的纳米粒子的分布是和受控的血管周围的输送相一致的。

[0183] 在我们的研究中，我们试图去降解HA，这导致在正常组织中纳米粒子分布体积增加了70％。在肿瘤中的相似的酶处理已经显示了对于大分子的扩散和对流的相似影响。例如，胶原酶处理极大的增强了通过对流进入卵巢癌的IgG的渗透，尽管透明质酸酶处理在这个情况中没有作用。一种可供选择的用酶预处理组织的方法是固定酶在纳米粒子的表面。胶原酶连接着超顺磁性纳米粒子在一个磁场的作用下以高达90μm/hr的速度通过胶原凝胶移动。我们初步的关于透明质酸酶固定在纳米粒子的结果暗示了通过这个方法能延长酶的寿命。

[0184] HA和其与其他ECM组分形成的结构指示了在正常脑中的细胞间输送。HA的降解产生了大多数四寡糖和六寡糖，它们不能链-链结合。已经显示这些结合阻碍了扩散：它们也可能在没有处理过的组织中阻碍对流，这能至少部分解释，用透明质酸酶预处理后的纳米粒子输送的增加。然而，HA也影响了在脑组织中对输注压力的机械反应。24小时的完全的降解可能充分的减少了脑组织的弹性系数，这能产生渗透性的增加和纳米粒子输送的增强。

[0185] 我们也观察到与未处理组织中的情况相比，酶处理过的组织中，甘露醇共同输注在增加纳米粒子输送方面的有效性降低。在HA和CSPG间形成的聚集体结合了大量的水。如果这些聚集体通过酶处理降解，剩下的ECM可能更不能吸收额外的水分，预期到这会减少甘露醇引起的高渗透压性的有效性。

[0186] 在我们研究中报导的24小时消化时间可能在临床设定中不合理，因为它需要多样的外科处理。增加酶浓度可能减少消化时间，但是透明质酸的药动学对HA浓度的依赖是非线性的，这使预期更高的浓度实际上是否会产生更快的降解变得困难。在我们的研究中，透明质酸酶浓度和消化时间没有被最优化；进一步的工作可能显示更短的暴露或其他的递送技术也可以相同水平地增强输送。此外，其他酶的输注，包括特异性靶向GSPG的软骨素酶，可能导致加速的ECM消化。

[0187] 在人体中脑ECM的降解的临床和生物学后果是未知的。然而，已报导ECM在大鼠大脑中HA充分降解后12天恢复正常。可能的肿瘤酶降解的并发情况是促进了肿瘤细胞的迁移。已知神经胶质瘤通过表达降解天然ECM组分的蛋白酶迁移并渗入健康组织。然而，系统给药的透明质酸酶改善了胶质母细胞瘤的标准化疗和硼中子俘获疗法的结果。

[0188] 通过共同输注高渗性甘露醇的水压重构对于增强纳米粒子在正常组织中的穿透比酶处理更为有效。其他人还报导了在大鼠脑中40nm脂质体的分布体积增加50％，而我们观察到对于54nm聚苯乙烯粒子有133％的增加。然而，当与20％甘露醇共同输注的时候，对于2kDa右旋糖苷来说分布体积没有变化，这暗示了高渗性处理可能只增强了被ECM空间排斥的粒子的渗透。此外，通过血管周隙空间的输送经甘露醇处理减弱，这可能由于20％甘露醇的高粘度。其它报导涉及病毒载体在高粘度聚合物溶液中输注进肿瘤封闭了通过微血管的对流。简单性和对甘露醇的短的响应时间使其成为比酶降解更具有吸引力的策略。高渗性处理对血-脑屏障的渗透性的影响是在10分钟内逆转，事实上对于用全身性施用甘露醇来治疗水肿没有报告过副作用。

[0189] 总之，我们已经在采用新的微流孔探针进行受控输注之后，检查了脑中纳米粒子的渗透。所述探针的小尺寸用于改善临床相关流体流入大脑的递送；多通道的存在提供了由其它方法难以达到的治疗实验设计的可能。我们证明了这个合并输注了纳米粒子和潜在加强纳米粒子透过脑ECM的输送的试剂的微流控系统的用途。我们的结果暗示了酶处理和暴露在高渗性溶液中都极大地增强了聚合纳米粒子的输送。

[0190] 为了说明和描述，描述了本发明的上述实施方案。其目的并非穷举或将本发明限制在公开的确定形式上。根据上述教导可作出许多修改和改变。本发明的范围并不是由这些详细描述来限定，而是由所附的权利要求书来限定。

标题	发布/更新时间	阅读量
对流式炉-专利编号CN102771523B	2020-05-11	71
对流式炉-专利编号CN101981384A	2020-05-11	727
对流式炉-专利编号CN101981384B	2020-05-11	840
对流洗脱-专利编号CN1052259A	2020-05-12	945
对流装置及对流方法-专利编号CN109940159A	2020-05-13	888
对流式炉-专利编号CN102771523A	2020-05-12	734
对流式烤箱-专利编号CN107920687A	2020-05-13	721
对流式炉-专利编号CN103329951A	2020-05-12	668
对流系统-专利编号CN109641471A	2020-05-11	292
对流式衣柜-专利编号CN108851596A	2020-05-13	389

对流增强型递送装置，方法和应用

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