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用有机溶剂和臭氧处理生物质以促进酶解糖化

阅读：192发布：2021-02-28

IPRDB可以提供用有机溶剂和臭氧处理生物质以促进酶解糖化专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且用溶剂如有机溶剂在高温碱性条件下处理包含木质素的木质纤维质生物质，将其过滤，然后使其与包含臭氧的气体接触以制备易于糖化的生物质。，下面是用有机溶剂和臭氧处理生物质以促进酶解糖化专利的具体信息内容。

权利要求

1.制备易于糖化的富集碳水化合物的生物质的方法，所述方法包括：(a)提供包含木质素的木质纤维质生物质；

(b)使所述生物质与包含水和至少一种无机碱的有机溶剂溶液接触，所述无机碱选自氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、碳酸钾、氢氧化钙、碳酸钙、氨、以及它们的混合物，从而形成生物质-溶剂悬浮液；

(c)将所述生物质-溶剂悬浮液加热至约100℃至约220℃的温度，反应时间为约15分钟至约48小时，从而破碎来自所述生物质的木质素并将其溶解于所述悬浮液中；

(d)在(c)中加热所述悬浮液之后加压过滤自由液体，从而除去所述溶解的木质素，由此形成预处理的生物质；

(e)使来自(d)的所述预处理的生物质与包含臭氧的气体在约0℃至约50℃的温度接触，反应时间为至少约1分钟，从而制备易于糖化的富集碳水化合物的生物质。

2.权利要求1的方法，所述方法还包括：

在(d)之后并且在(e)之前，用所述有机溶剂溶液洗涤步骤(d)中制备的所述预处理的生物质。

3.权利要求1的方法，其中所述木质纤维质生物质在步骤(a)之前经过预加工。

4.权利要求1的方法，其中所述有机溶剂溶液还包含选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、2-丁醇、异丁醇、和叔丁醇、以及这些物质的混合物的醇。

5.权利要求4的方法，其中所述醇是乙醇。

6.权利要求5的方法，其中所述有机溶剂溶液包含约百分之0至约百分之100(体积/体积)的乙醇。

7.权利要求1的方法，其中所述无机碱的量为相对于生物质干重约1至约14的重量百分比。

8.权利要求1的方法，其中所述生物质干重的浓度为占(b)的所述生物质-溶剂悬浮液重量的约15％至约70％。

9.权利要求1的方法，其中所述气体包含按体积计约百分之0.1至约百分之20的臭氧。

10.权利要求1的方法，其中所述气体还包含空气、氮气、氧气、氩气、或它们的组合。

11.权利要求1的方法，其中步骤(e)中臭氧对预处理的生物质的比率为按重量计至少约1∶1200。

12.权利要求1的方法，还包括在步骤(e)之前使所述预处理的生物质与含水的第二溶剂溶液接触的步骤，从而形成第二生物质-溶剂悬浮液。

13.权利要求12的方法，其中在所述第二生物质-溶剂悬浮液中的生物质的重量百分比为约20至约70。

14.权利要求1或12的方法，其中所述预处理的生物质包含约百分之30至约百分之

60的水分。

15.权利要求1的方法，所述方法还包括用酶聚生体糖化所述易于糖化的富集碳水化合物的生物质，从而制备可发酵糖。

16.权利要求15所述的方法，所述方法还包括发酵所述糖以制备目标化合物。

说明书全文

用有机溶剂和臭氧处理生物质以促进酶解糖化

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本专利申请要求2008年12月19日提交的暂时申请案61/139106的优先权。该申请以临时申请61/139106全文并入本文。发明领域

[0003] 提供并公开了生产易于糖化的富集碳水化合物的木质纤维质生物质的方法。具体地讲，通过在高温碱性有机溶剂条件下同时破碎并选择性萃取木质素、然后使之与包含臭氧的气体接触来制备预处理的生物质。然后，可对预处理的生物质中所剩余的富集碳水化合物的固体进行酶解糖化以获得可发酵的糖类，可进一步加工上述可发酵的糖类以生产其他目标产物。

[0004] 发明背景

[0005] 纤维质的和木质纤维质的原料以及垃圾例如农业残余物、木材、林业垃圾、来自造纸业的淤渣、和市政及工业固体垃圾提供了潜力巨大的可再生原料，用于生产化学品、塑料、燃料和饲料。由碳水化合物聚合物(包括纤维素、半纤维素、果胶和木质素)组成的纤维质的和木质纤维质的原料以及垃圾一般用多种化学、机械和酶方法进行处理以释放主要的己糖和戊糖，它们然后能进行发酵产生有用产物。

[0006] 预处理方法通常被用于使木质纤维质生物质的多糖更容易被纤维素分解酶处理。纤维素酶消化多糖的其中一个主要障碍是存在木质素、限制酶作用于其底物的障碍、以及酶非生产性结合的表面。因为在预处理过程中酶的高成本，希望通过灭活木质素对酶的吸附或者完全萃取出木质素以最小化载酶量。另一个挑战是由于半纤维素和木质素对纤维素的保护或由于纤维素的结晶度导致的酶水解对纤维素的难以接近性。试图克服这些挑战的预处理方法包括：蒸汽爆破、热水、稀酸、氨纤维爆破、碱解(包括氨回收过滤)、氧化去木质素、有机溶剂、和臭氧处理。

[0007] 公布的PCT专利申请WO 97/36040公开了用有机溶剂浆液漂白的方法，所述方法包括以下步骤：用臭氧漂白获取自有机溶剂制浆过程的粗浆；用低级烷基醇水溶液洗涤臭氧处理后的浆液以除去其中溶解的木质素；以及从洗涤后的浆液中除去水溶液滤液。所述方法还包括在臭氧处理浆液之前用低级烷基醇水溶液洗涤粗浆的步骤。

[0008] J.Quesada等人，在Journal of Applied Polymer Science(1998)，68，1867-1876中公开了对得自自动水解玉米秸秆的木质素溶解度的研究，所述研究在不同的有机溶剂-水混合物中以及在不同条件下进行，随后臭氧处理溶剂解离的固体和浆液。有机溶剂处理的最佳条件是75/25(v/v)丙酮/水混合物在210℃处理45分钟。在有机溶剂解离后，在固定床反应器中用臭氧室温处理材料20分钟。在研究中使用之前，自动水解的玉米秸秆如下制备：在环境温度下干燥，在锤磨机中磨碎，用粒度0.2-0.5mm的筛筛过，用7/3(v/v)乙醇-甲苯混合物进行索氏提取(soxhlet-extracted)，用水进行索氏提取，在蒸汽爆破装置中220℃自动水解3分钟，用足量水在环境温度下提取，然后用一升沸水提取。

[0009] 以前使用的预处理方法的常见缺点包括分开的己糖和戊糖液流、不充分的木质素萃取或不能从多糖、尤其是高木质素含量的那些原料(例如蔗渣、软木)中分离萃取的木质素、废弃产物的处理(例如当中和酸或碱时形成的盐)、以及由于在洗涤步骤中的破坏或损失造成的低碳水化合物回收率。其他问题包括耗能、资本设备和预处理催化剂回收的高成本，以及与糖化酶的不相容。

[0010] 木质纤维质生物质预处理的主要挑战之一，是使木质素的萃取或化学中和(针对纤维素分解酶的无效结合)最大化，同时使碳水化合物(纤维素加上半纤维素)的损失最小化。能保留下来的碳水化合物越多，在预处理和酶解糖化的组合处理之后的单体糖总收率将越高。

[0011] 期望一种用于以高性价比方式选择性萃取生物质中木质素以制备富集碳水化合物的生物质的方法。也期望一种用于制备高度易于酶解糖化并能制备高收率可发酵糖(例如葡萄糖和木糖)的、富集碳水化合物的生物质的方法，所述可发酵糖生物转化成增值的化学制品和燃料。

[0012] 发明概述

[0013] 本发明提供制备易于糖化的富集碳水化合物的生物质、并且选择性萃取和破碎木质素、同时保留高收率碳水化合物的方法。所述方法包括用溶剂如有机溶剂在高温碱性条件下处理木质纤维质生物质，然后使所述生物质与包含臭氧的气体接触。预处理之后，可进一步用糖化酶聚生体处理所述生物质以生产可发酵的糖类。这些糖类可被呈递至用于生产目标产物的进一步的加工。在本发明的一个实施方案中，提供一种方法，所述方法包括：

[0014] (a)提供包含木质素的木质纤维质生物质；

[0015] (b)使所述生物质与包含水和至少一种无机碱的有机溶剂溶液接触，所述无机碱选自氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、碳酸钾、氢氧化钙、碳酸钙、氨、以及它们的混合物，从而形成生物质-溶剂悬浮液；

[0016] (c)将上述生物质-溶剂悬浮液加热至约100℃至约220℃的温度，反应时间为约15分钟至约48小时，从而破碎来自所述生物质的木质素并将其溶解于所述悬浮液中；

[0017] (d)在(c)中加热所述悬浮液之后加压过滤自由液体，从而除去所述溶解的木质素，由此形成预处理的生物质；

[0018] (e)使来自(d)的所述预处理的生物质与包含臭氧的气体在约0℃至约50℃的温度接触，反应时间为至少约1分钟，从而制备易于糖化的富集碳水化合物的生物质。

[0019] 在一些实施方案中，所述方法还包括：在(d)之后、(e)之前，用所述有机溶剂溶液洗涤步骤(d)中制备的所述预处理的生物质。在一些实施方案中，所述木质纤维质生物质在步骤(a)之前经过预加工，前提条件是此类预加工不需要用于制备易于糖化的富集碳水化合物的生物质。

[0020] 在一些实施方案中，(c)中的温度是约140℃至约180℃。在一些实施方案中，(c)中的反应时间为约1小时至约12小时。

[0021] 根据本发明的方法，有机溶剂溶液还包含选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、2-丁醇、异丁醇、和叔丁醇、以及这些物质的混合物的醇。在一些实施方案中，所述醇是乙醇。在一些实施方案中，有机溶剂溶液包含约0至约百分之100(体积/体积)的乙醇。在一些实施方案中，无机碱的量为相对于生物质干重约1至约14的重量百分比。在一些实施方案中，无机碱为碳酸钾。在一些实施方案中，生物质干重的浓度为占(b)的生物质-溶剂悬浮液重量约15％至约70％。

[0022] 根据本发明的方法，气体包含按体积计约百分之0.1至约百分之20的臭氧。在一些实施方案中，气体包含按体积计约百分之0.5至约百分之5的臭氧。在一些实施方案中，气体还包含空气、氮气、氧气、氩气、或它们的组合。在一些实施方案中，步骤(e)中臭氧对预处理的生物质的比率为按重量计至少约1∶1200。在一些实施方案中，(e)中的温度是约0℃至约25℃。

[0023] 在一些实施方案中，所述方法还包括在步骤(e)之前使预处理的生物质与含水的第二溶剂溶液接触，从而形成第二生物质-溶剂悬浮液。在一些实施方案中，在第二生物质-溶剂悬浮液中的生物质的％重量为约20至约70。在一些实施方案中，第二溶剂溶液包含缓冲液。在一些实施方案中，第二生物质-溶剂悬浮液具有约1至约10的pH。在一些实施方案中，所述方法还包括在步骤(e)后将pH调节到足以酶解糖化所述生物质的第二pH。在一些实施方案中，第二溶剂溶液还包含选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、2-丁醇、异丁醇、和叔丁醇、以及这些物质的混合物的醇。在一些实施方案中，所述醇是乙醇。在一些实施方案中，第二溶剂溶液包含约0至约百分之100(体积/体积)的乙醇。

[0024] 在一些实施方案中，所述方法还包括在步骤(e)期间施加能量于预处理的生物质。在一些实施方案中，所述方法还包括在步骤(e)期间施加能量于预处理的生物质，其中通过研磨、压碎、碾磨、切碎、剁碎、盘磨、超声波、微波、或这些方法的组合施加能量。在一些实施方案中，预处理的生物质包含约百分之30至约百分之60的水分。

[0025] 在一些实施方案中，本发明的方法还包括用酶聚生体糖化生物质，从而制备可发酵糖。在一些实施方案中，本发明的方法还包括发酵糖以制备目标产物。在一些实施方案中，目标产物选自乙醇、丁醇、和1，3-丙二醇。

[0026] 发明详述

[0027] 申请人特别将所有引用的参考文献的完整内容引入本公开内容中。此外，当数量、浓度或其他数值或参数以范围、优选范围或优选上限数值和优选下限数值的列表形式给出时，它应理解为具体地公开由任何范围上限或优选数值和任何范围下限或优选数值的任何一对所构成的所有范围，而不管所述范围是否被单独地公开。凡在本文中给出某一数值范围之处，该范围均旨在包含其端点，以及位于该范围内的所有整数和分数，除非另行指出。当定义一个范围时，不旨在将本发明的范围限定于所列举的具体值。

[0028] 本发明提供处理生物质的两步法，该方法用于处理生物质以促进随后的酶解糖化步骤。在第一步骤中，使用碱性有机溶剂条件在高温下同时破碎并萃取木质素。在第二步骤中，使溶剂悬浮液或固体形式的生物质与包含臭氧的气体接触。可用糖化酶聚生体消化处理生物质以制备可发酵糖。

[0029] 定义

[0030] 在本公开中使用了下列定义：

[0031] “室温”和“环境温度”当被用于指温度时，是指从约15℃至约25℃的任何温度。。

[0032] “可发酵糖”指主要包括单糖和一些多糖的糖内容物，在生产目标产物的发酵过程中微生物可利用它们作为碳源。

[0033] “木质纤维质”是指既包含木质素又包含纤维素的材料。木质纤维质材料也可包含半纤维素。在本文所述方法中，在臭氧处理期间将木质素氧化并降解以制备富集碳水化合物的生物质，其包含可发酵糖。在有机溶剂处理期间，在存在和不存在臭氧的情况下溶解木质素并将其基本上从木质纤维质生物质中除去以制备包含可发酵糖的富集碳水化合物的生物质。

[0034] “溶解的木质素”指溶解在溶剂中的木质素。

[0035] “AI木质素”是指酸不溶的木质素。

[0036] “自动水解”指在存在溶剂(水或有机溶剂加上水)并且加热，但无其他附加处理的情况下水解生物质，例如无水解酶。

[0037] “纤维质”是指包含纤维素的组合物。

[0038] “目标产物”指发酵产生的化学制品、燃料、或化学结构物。产物按广义使用，并且包括分子如蛋白质，包括例如肽、酶和抗体。预期乙醇和丁醇也包括在目标产物的定义之内。

[0039] 缩写“EtOH”指乙醇或乙基醇。

[0040] “生物质的干重”是指移除全部的或基本上全部的水分后的生物质的重量。干重通常依照美国材料与试验协会(ASTM)标准E1756-01(Standard Test Method for Determination of Total Solids in Biomass)或纸浆与造纸工业技术协会，Inc.(TAPPI)标准T-412 om-02(Moisture in Pulp，Paper and Paperboard)进行测量。

[0041] “选择性的萃取”是指移除木质素的同时基本上保留了碳水化合物。

[0042] 如本文所用，“溶剂溶液”和/或“有机溶剂溶液”是水中的溶剂混合物，它包括溶解固体、液体、或气体溶质产生溶液的任何有机液体溶剂。就本发明而言，最适合的溶剂的溶液包括有机溶剂，例如乙醇、甲醇、正-丙醇、异丙醇、正丁醇、2-丁醇、异丁醇、叔丁醇、戊醇和己醇以及具有相同碳原子数的二醇。它们也可包括非质子溶剂。溶剂溶液可在混合物中包括与溶液一起的附加组分。

[0043] 如本文所用，“生物质”和“木质纤维质生物质”指任何木质纤维质的材料，包括纤维质的和半纤维质的材料，例如生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、庭院垃圾、木材、林业垃圾以及它们的组合，下文进一步进行描述。生物质具有包括多糖和低聚糖的碳水化合物成分，并且还可包含附加组分，例如蛋白质和/或脂质。

[0044] 如本文所用，“高度保留”是指本文所述的加工步骤之后的木质纤维质材料的碳水化合物成分。在本发明的一个实施方案中，高度保留的碳水化合物成分构成糖化后的糖产量，源自本文所述方法的所述糖产量基本上类似于理论产量和/或显示最低限度的糖产量损失。在本发明的一个实施方案中，“高度保留的”当被用于指碳水化合物成分时，是指与如本文所述的预处理之前的生物质相比，生物质碳水化合物大于或等于85％的保留。

[0045] 如本文所用，“预加工”是指在预处理之前对木质纤维质生物质的加工。预加工是使生物质适合进行预处理的任何处理，例如机械破碎和/或干燥至适当的水份。

[0046] “生物质-溶剂悬浮液”指生物质和溶剂的混合物，其中所述生物质是溶剂溶液中的悬浮液。生物质-溶剂悬浮液可包含附加组分如碱或缓冲液。如本文所用，“浆液”与“悬浮液”互换使用。

[0047] “糖化”是指通过水解酶的作用，从多糖生产可发酵的糖类。可发酵的糖类从经过预处理的生物质的生产，通过由纤维素分解酶和半纤维素分解酶的作用的酶解糖化而实现。

[0048] 如本文所用，“预处理的生物质”或“生物质预处理”指使得天然的或经预加工的生物质经受化学、物理、或生物作用、或它们的任何组合，致使所述生物质在糖化之前较易于受酶解糖化或其他水解方法的作用。例如，本文所主张的方法可被称为有助于使得生物质对用于糖化的水解酶更加敏感的预处理方法。

[0049] 如本文所用，“经过预处理的生物质”是指在糖化之前已受过化学的、物理的或生物的、或者它们的任何组合的作用，使得所述生物质对酶解糖化或其他的水解方法更加敏感的天然的或经过预加工的生物质。

[0050] “空气干燥经过过滤的生物质”可通过允许生物质干燥而进行，其中所述干燥通过与环境空气的平衡实现。

[0051] “易于糖化的生物质”意指富集了碳水化合物并且变得更加适合被纤维素分解酶或半纤维素分解酶水解，以生产单体的和低聚的糖类的生物质。

[0052] 如本文所用，“富集碳水化合物的”指通过本文所述处理方法制备的生物质，其中选择性氧化并降解生物质中的木质素(并且在有有机溶剂的情况下将其溶解并萃取)，同时生物质碳水化合物保持良好收率。在一个实施方案中，通过本文所述方法制备易于糖化的富集碳水化合物的生物质，它与如本文所述进行预处理前的生物质相比，具有大于或等于约85％生物质碳水化合物的碳水化合物浓度，同时除去75％或更多的生物质木质素。

[0053] “加热生物质悬浮液”意指将悬浮于溶剂中的生物质置于高于环境温度或室温的温度。

[0054] “在压力下过滤游离液体”意指在过滤器的对立表面具有一些压力差的情况下，通过过滤移除未受束缚的液体。

[0055] “碱性”指pH大于7.0。尤其适用的生物质-EtOH/水和碱性混合物的pH大于7.0。

[0056] “空气干燥的样品”意指经过预处理的生物质，其已被允许在环境温度下干燥至其含水量与环境空气的含水量大体平衡的状态，典型地为≥85％的干物质。

[0057] “基本上不含木质素的生物质”指包含约≤25％的起始木质素组合物的预处理样品。

[0058] “多组分溶剂”意指溶剂包含有机溶剂、水和能对木质素进行化学侵蚀的试剂。

[0059] “压力容器”是可以装配有或未装配用于搅拌生物质/溶剂悬浮液的机械装置的密封的容器，当加热木质纤维质生物质时，在其内部出现正压力。

[0060] “亲核物质”是能够通过提供双方的键电子而与其反应伙伴形成共价键的化学试剂。

[0061] “水解产物”指与木质纤维素生物质接触的液体，它包含作用于生物质的水解反应的产物(酶解或非酶解)，在这种情况下包括单体糖和低聚糖。

[0062] “有机溶剂(Organosolv)”指有机溶剂和水的混合物。

[0063] “酶聚生体”或“糖化酶聚生体”是酶的集合，通常由微生物分泌，在本案中，其将通常包含一种或多种的纤维素酶、木聚糖酶、糖苷酶、木素酶和阿魏酸酯酶。

[0064] “单体糖类”或“单糖”由单一的戊糖或己糖单元构成，例如葡萄糖。

[0065] “脱木素”是从木质纤维质生物质中移除木质素的作用。在本专利申请中去木质素指1)使用有机溶剂在高温碱性条件下从木质纤维质生物质中破碎并萃取木质素，和/或2)使用臭氧从预处理木质纤维质生物质中破碎并萃取或降解木质素。

[0066] “破碎”是其中在有机溶剂条件下和/或用臭氧处理木质纤维质生物质以将木质素破坏成较小亚基的过程。在本专利申请中，木质素氧化可有助于将木质素降解成较小亚基。

[0067] “选择性萃取”是通过有机溶剂或碱性有机溶剂条件处理萃取并溶解木质素、留下多糖的过程。

[0068] “臭氧化”是用臭氧处理生物质的行为。生物质可以生物质-溶剂悬浮液形式或固体形式存在，无附加液相。

[0069] 提供了用于预处理木质纤维质生物质，以生产易于糖化的生物质的方法。这些方法提供了使得木质纤维质生物质组分较易于或较顺应酶解糖化的经济型方法。预处理可以是化学的、物理的或生物的，或者是上述这些的任何组合。在本公开中，预处理方法涉及首先在碱性有机溶剂条件下处理生物质，然后使处理的生物质与包含臭氧的气体接触。碱性有机溶剂和/或臭氧的存在有助于木质素破碎和除去或降解，以及碳水化合物回收。

[0070] 此外，本公开中所述的方法使预处理过程中的碳水化合物损失最小化，并且使糖化中的单体糖类的收率最大化。

[0071] 如上文所述，本文所述方法包括在高温碱性有机溶剂条件下预处理木质纤维质材料，然后使处理的生物质与包含臭氧的气体接触以制备易于糖化的富集碳水化合物的生物质。

[0072] 木质纤维质生物质

[0073] 本文中预处理的木质纤维质生物质包括但不限于，生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸业的淤渣、庭园垃圾、木材和林业垃圾。生物质的实例包括但不限于玉米芯、作物残余如玉米壳、玉米秸秆、草、小麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、蔗渣、高粱、大豆，获取自谷物、树、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木及矮树丛、蔬菜、水果、花和动物粪肥的研磨物的组分。

[0074] 在一个实施方案中，用于本发明的生物质包括具有相对高碳水化合物含量的生物质，它们相对密集，和/或相对易于收集、运输、贮存和/或处理。

[0075] 在本发明的一个实施方案中，可用的生物质包括玉米芯、玉米秸秆和蔗渣。

[0076] 在另一个实施方案中，木质纤维质生物质包括农业残余物如玉米秸秆、小麦秸秆、大麦秸秆、燕麦秸秆、稻秆、卡诺拉秸秆、和大豆秸秆；草如柳枝稷、芒草、米草、和草芦；纤维加工残余如玉米纤维、甜菜浆、纸浆厂残渣和废弃物以及蔗渣；高粱；林业垃圾如白杨木、其他硬木、软木和锯屑；和消费者用过的纸制品垃圾；以及其他作物或足够丰富的木质纤维质材料。

[0077] 木质纤维质生物质可来源于单一来源，或者生物质可包括来源于一种以上来源的混合物；例如生物质可包括玉米芯和玉米秸秆的混合物，或茎或杆和叶的混合物。

[0078] 生物质从其来源获得之后可被直接使用，或者可对其进行某些预加工，例如可向生物质施加能量，以减小其尺寸、增加暴露的表面积、和/或在提高所述生物质中存在的木质素和纤维素、半纤维素、和/或低聚糖对碱性有机溶剂预处理、臭氧预处理、和糖化酶的可接近性。用于减小尺寸、增加暴露的表面积、和/或提高生物质中存在的木质素和纤维素、半纤维素、和/或低聚糖对碱性有机溶剂预处理、臭氧预处理、和对所使用的糖化酶的可接近性的能量方法包括但不限于研磨、压碎、碾磨、切碎、剁碎、盘磨、超声波、和微波。施加能量可发生在预处理步骤之前或期间或两个时间段都发生、糖化之前或期间、或它们的任何组合。

[0079] 在预处理之前干燥生物质可通过常规装置进行，例如使用旋转烘干机、闪蒸干燥机、或过热蒸汽干燥机。

[0080] 溶剂

[0081] 本文所述方法包括使用有机溶剂溶液预处理的生物质。在本发明的方法中有用的溶剂在本领域中经常被称为有机溶剂(Organosolv)。涉及使用溶剂和其他预处理的预处理技术详细内容已存在，例如Wyman等人，(Bioresource Tech.96：1959，2005)；Wyman等人，(Bioresource Tech.96：2026，2005)；Hsu，(“Pretreatment of biomass”In Handbook on Bioethanol：Production and Utilization，Wyman，Taylor和Francis Eds.，p.179-212，1996)；以及Mosier等人，(Bioresource Tech.96：673，2005)。溶剂在本文中被用于预处理的生物质以移除木质素。去木质素通常在165-225℃下进行，液体对生物质的比率为4∶1至20∶1，使用50％有机溶剂(体积/体积[v/v])的液体组合物，并且反应时间为0.5-12小时。多种一元醇和多元醇已作为溶剂被测试。已经使用乙醇、丁醇和苯酚(Park，J.K.，和Phillips，J.A.，Chem.Eng.Comm.，65：187-205，1988)。

[0082] 在本发明方法中的有机溶剂或有机溶剂溶液预处理可包括在经选择的条件参数下的水和有机溶剂的混合物，所述参数包括温度、时间、压力、溶剂与水的比率和固体与液体的比率。溶剂可包括但不限于醇、有机酸和酮。醇可选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇、叔丁醇、以及这些醇的混合物。醇也可为二元醇。本发明溶液(即水)中的溶剂浓度可为约0％至约100％，或约5％至约95％，或约10％至约90％，或约15％至约85％，或约20％至约80％，或约25％至约75％，或约30％至约70％，或约35％至约65％，或约40％至约60％，或约45％至约55％，或约50％。(v/v)具体地讲，就本文方法的实施方案而言，检查来自约50％-90％(v/v)乙醇的EtOH/H2O混合物并且发现其是有效的。在一个实施方案中，溶剂溶液包含水。

[0083] 为了从生物质中获得足够量的糖，可以在碱性有机溶剂条件下预处理的生物质一次或多次。为了分开地或一起地评估预处理和糖化方法的性能，可测定来源于起始生物质的糖的理论收率并与测量收率进行比较。

[0084] 作为溶剂溶液附加组分的无机碱

[0085] 根据本发明方法，溶剂溶液还可包含至少一种无机碱作为溶剂溶液的附加组分，所述无机碱选自氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、碳酸钾、氢氧化钙、碳酸钙、氨、以及它们的混合物。无机碱加入量可为相对于生物质干重(w/w生物质)小于约20wt％(重量百分比)。例如，无机碱的量可为相对于生物质干重约0.5wt％，或约1wt％，或约2wt％，或约5wt％，或约10wt％，或约14wt％。无机碱的使用浓度可为至少从0.5wt％至约20wt％的多个浓度。
较合适的浓度为约1wt％至约14wt％。最合适的浓度介于约5wt％至约14wt％之间。

[0086] 在一个实施方案中，可使用碳酸钾作为无机碱，它是溶剂溶液的附加组分。具体地讲，可在水溶液或乙醇/水溶剂溶液中使用碳酸钾。可使用不同浓度的碳酸钾，例如其量为相对于生物质干重(w/w生物质)至少约0.5wt％至约20wt％。较合适的浓度为约1wt％至约14wt％。最合适的浓度介于约5wt％至约14wt％之间。将约5％(w/w生物质)碳酸钾加入包含约50％-90％乙醇水溶液(v/v)的溶剂中可有效地对木质素破碎和萃取。

[0087] 在一个实施方案中，可使用氨作为无机碱，它可为溶剂溶液的附加组分。具体地讲，可在水溶液或乙醇/水溶剂溶液中使用氨。可使用不同浓度的氨，例如其量为至少约0.5wt％至约20wt％(w/w生物质)。较合适的浓度为约1wt％至约14wt％(w/w生物质)。
最合适的浓度介于约5wt％至约14wt％(w/w生物质)之间。将约8wt％(w/w生物质)氨加入包含约50％-90％乙醇水溶液(v/v)的溶剂中可对木质素破碎和萃取有效。

[0088] 有机溶剂处理条件

[0089] 用包含至少一种无机碱的溶剂溶液预处理生物质可在任何适用容器中进行。通常该容器是能耐压的容器，具有加热机构和混合内容物的机构。可商购获得的容器包括，例如Zipperclave 反应器(Autoclave Engineers，Erie，PA)、Jaygo反应器(Jaygo Manufacturing，Inc.，Mahwah，NJ所述)、和蒸汽喷射反应器(如一般方法所述；Autoclave Engineers，Erie，PA)。可使用具有相似能力的更大型反应器。作为另外一种选择，生物质和有机溶剂(organosolv)的溶液可在一个容器中合并，然后转移到另一个反应器中。生物质也可以在一个容器中进行预处理，然后在另一个反应器如蒸汽喷射反应器中进行进一步处理。

[0090] 可在任何合适的容器中进行预处理反应，例如分批反应器或连续反应器。本领域的技术人员将认识到，在更高温度下(超过100℃)将需要压力容器。适合的容器可配备如叶轮的装置，以用于搅拌生物质-有机溶剂(organosolv)混合物。反应器设计在Lin，K.-H.，和 Van Ness，H.C.(Perry，R.H. 和 Chilton，C.H.(eds)，Chemical Engineer’s Handbook，第5版(1973)，第4章，McGraw-Hill，NY)中进行了讨论。可以用批量方法或连续方法进行预处理反应。

[0091] 在使所述生物质与溶剂溶液接触之前，可对包含生物质的容器施加真空。通过从生物质的孔中抽出空气，可使溶剂溶液更好地渗透到生物质中。施加真空的时间和施加到生物质上的负压的量将取决于生物质类型，并且能根据经验进行测定，以获得最佳的生物质预处理效果(通过糖化后可发酵糖的产量进行测量)。

[0092] 用包含至少一种无机碱的溶剂溶液加热生物质可在约100℃至约220℃的温度下进行。然后可使加热后的溶液迅速地冷却至室温。在另一个实施方案中，生物质加热在约140℃至约180℃进行。在另一个实施方案中，生物质加热在约150℃至约170℃进行。对生物质-溶剂悬浮液的加热可进行从约15分钟至约48小时，或更优选地从约1小时至约12小时，或者例如从约1小时至约6小时。在一个实施方案中，生物质的接触在约150℃进行约6小时。

[0093] 所述生物质与包含至少一种无机碱的溶剂溶液的接触可在自生压力下进行。也可使用更高或更低的压力，但是一般来讲实用性较低。

[0094] 就预处理方法而言，温度、预处理时间、溶剂溶液、无机碱浓度、生物质浓度、生物质类型、和生物质粒度是相关的；因此如需要可针对各种类型的生物质调节这些变量以最优化本文所述的预处理方法。

[0095] 为了评价预处理的效果，即易于糖化的生物质的生产和随后的糖化，分别地或共同地，可测定来源于起始生物质的糖类的理论收率并与经过测量的收率进行比较。

[0096] 臭氧

[0097] 根据本发明方法，有机溶剂处理的生物质本文也称为处理的生物质，使其与包含臭氧的气体接触。臭氧处理促进木质素的氧化和破碎，并且对预处理有益，导致富集碳水化合物的生物质对酶解糖化的可用性提高。如果在臭氧处理期间使用溶剂，所述溶剂可附加地促进木质素和/或其氧化片段的萃取。作为除去木质素的手段，使用臭氧是相对选择性的，很大程度上保留完整的碳水化合物。此外，臭氧(O3)容易分解成氧气(O2)和水，其使用无残余并且产生最小的大气污染。

[0098] 可通过本领域任何已知方法生成臭氧，例如从氧气或空气中生成臭氧。在本发明方法中，包含臭氧的气体具有约百分之0.1至约百分之20体积的臭氧，例如约百分之0.5至约百分之5体积的臭氧。气体还可包含氮气、氧气、氩气、或它们的组合。包含臭氧的气体也可包含一种或多种其他气体，只要其他气体的存在或浓度不对臭氧处理不利。一般来讲，预处理的生物质的臭氧比率可为按重量计至少约1∶1200，例如至少约1∶1000，或至少约1∶750，或至少约1∶500，或至少约1∶200，或至少约1∶100，或至少约1∶50。

[0099] 臭氧处理条件

[0100] 所述有机溶剂处理的生物质与包含臭氧的气体接触可在任何适用容器中进行，例如间歇反应器或连续反应器。通常该容器是具有加热或冷却机构并且具有混合内容物的机构的容器。任选地，所述容器是能耐压的容器。臭氧预处理反应可在例如固定床反应器中进行，或者在旋转卧式圆筒或连续搅拌槽反应器中进行。合适的容器可配备如叶轮的装置用于搅拌生物质或生物质-溶剂悬浮液，或者容器自身可旋转搅拌固体生物质。反应器设计在Lin，K.-H.，和Van Ness，H.C.(Perry，R.H.和Chilton，C.H.(eds)，Chemical Engineer’s Handbook，第5版(1973)，第4章，McGraw-Hill，NY)中进行了讨论。可以用批量方法或连续方法进行预处理反应。当进行有机溶剂处理时，生物质可与臭氧在相同反应器或另一个反应器中接触。生物质可在一个反应器中与臭氧接触，然后在相同容器中糖化；作为另外一种选择，糖化可在分开的容器中进行。

[0101] 在使生物质与包含臭氧的气体接触之前，可通过常规手段干燥有机溶剂预处理的生物质。干燥的有机溶剂预处理的生物质可包含约百分之30至约百分之70的水分，例如约百分之40至约百分之60的水分。

[0102] 处理的生物质与包含臭氧的气体接触可在约0℃至约50℃的温度下进行。在一个实施方案中，所述温度可为约0℃至约25℃。可使用较高温度，但是一般来讲实用性较低，因为臭氧随着温度升高分解增加。也可使用较低温度，但是一般来讲较不经济，这是因为冷却的需要，并且在其中使用生物质-溶剂悬浮液的情况下，从可操作性的观点来看可能是不实际的。使处理的生物质与包含臭氧的气体接触的反应时间可为至少约1分钟，例如反应时间为约1分钟至约60分钟，或约1分钟至约30分钟，或约1分钟至约25分钟，或约1分钟至约20分钟，或约1分钟至约15分钟，或约1分钟至约10分钟，或约1分钟至约5分钟。臭氧处理时间大于木质素降解最佳时间可导致糖收率降低，这可能是由于糖降解。

[0103] 处理的生物质与包含臭氧的气体接触可在自生压力下进行。也可使用更高或更低的压力，但是一般来讲实用性较低。

[0104] 处理的生物质可在无液相存在的固体状态下与包含臭氧的气体接触。作为另外一种选择，生物质可以生物质-溶剂悬浮液的形式与包含臭氧的气体接触。为了生成生物质-溶剂悬浮液，有机溶剂处理的生物质可如上文公开的那样与水或水和有机溶剂(organosolv)的混合物接触。溶剂可包括但不限于醇、有机酸和酮。醇可选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇、叔丁醇、以及这些醇的混合物。醇也可为二元醇。本发明溶液(即水)中的溶剂浓度为约0％至约100％，或约5％至约95％，或约10％至约90％，或约15％至约85％，或约20％至约80％，或约25％至约75％，或约30％至约70％，或约35％至约65％，或约40％至约60％，或约45％至约55％，或约50％(v/v)。具体地讲，就本文方法的实施方案而言，检查来自约0％-75％(v/v)乙醇的EtOH/H2O混合物并且发现其是有效的。在臭氧处理期间使用的溶剂可与在臭氧处理之前的有机溶剂处理中使用的溶剂相同或不同。

[0105] 在一个实施方案中，溶剂可为水。所得生物质-溶剂悬浮液可具有约1至约10的pH，例如约2至约9，或约1至约7，或约1至约5的pH。水还可包含缓冲液，例如柠檬酸缓冲液。可基于缓冲液对随后的糖化过程中控制pH的适宜性选择合适的缓冲液。在臭氧处理剂结束后，如果需要可将生物质-溶剂悬浮液的pH调节至足以酶解糖化生物质的第二pH。

[0106] 就臭氧预处理步骤而言，生物质-溶剂悬浮液中的生物质％重量可为约5％重量至约70％重量，例如约20％重量至约70％重量，或约30％重量至约60％重量。

[0107] 就臭氧预处理步骤而言，温度、预处理时间、气体中的臭氧浓度、含水量、生物质浓度、臭氧对生物质的比率、生物质类型、和生物质粒度是相关的；因此可根据需要针对各种类型的生物质调节这些变量以优化本文所述的预处理方法。

[0108] 为了评价预处理的效果，即易于糖化的生物质的生产和随后的糖化，分别地或共同地，可测定来源于起始生物质的糖类的理论收率并与经过测量的收率进行比较。

[0109] 进一步的处理

[0110] 糖化

[0111] 在用有机溶剂和臭氧进行预处理后，易于糖化的生物质包含破碎木质素和多糖的混合物。在其中对生物质-溶剂悬浮液进行臭氧处理的情况下，易于糖化的生物质还包含溶剂、萃取的木质素、和任选地缓冲液或无机碱。在进一步处理之前，木质素片段或氧化产物可通过过滤和任选地用EtOH/H2O(0％至100％EtOH体积/体积[v/v])洗涤样品从预处理的生物质中除去。因为过滤和洗涤步骤不是获得改善的糖收率所必需的，并且因为与它们相关联的成本可对所述方法的经济性产生不利影响，在其中溶剂为水或者其中不使用溶剂的情况下优选不进行生物质的过滤和洗涤。生物质可在室温下干燥，产生易于糖化的生物质。可使用本领域熟知的分析方法测定易于糖化的生物质的葡聚糖、木聚糖和酸不溶解的木质素内容物的浓度。

[0112] 然后在糖化酶聚生体的存在下可进一步水解易于糖化的生物质以释放水解产物中的低聚糖和/或单糖。可加入表面活性剂如聚乙烯乙二醇(PEG)以改善糖化过程(美国专利7,354,743 B2，以引用方式并入本文)。糖化酶和处理生物质的方法参见Lynd，L.R.，等人(Microbiol.Mol.Biol.Rev.，66：506-577，2002)。糖化酶聚生体可包含一种或多种糖苷酶；所述糖苷酶可选自纤维素水解糖苷酶、半纤维素水解糖苷酶和淀粉水解糖苷酶。糖化酶聚生体中的其他酶可包括肽酶、脂肪酶、木素酶和阿魏酸酯酶。

[0113] 糖化酶聚生体包括一种或多种酶，所述酶主要选自但不限于：“糖苷酶”类，所述酶水解二糖、低聚糖、和多糖的醚键，存在于广义“水解酶”(EC 3.)的分类酶EC 3.2.1.x中(Enzyme Nomenclature 1992，Academic Press，San Diego，CA with Supplement 1(1993)，Supplement 2(1994)，Supplement 3(1995，Supplement 4(1997)和Supplement5[分别在Eur.J.Biochem.，223：1-5，1994；Eur.J.Biochem.，232：1-6，1995；Eur.J.Biochem.，237：1-5，1996；Eur.j.Biochem.，250：1-6，1997；和Eur.J.Biochem.，264：610-6501999])。本发明的方法中可用的糖苷酶能根据它们水解的生物质组分进行分类。本发明的方法可用的糖苷酶包括纤维素水解糖苷酶(例如，纤维素酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶)、半纤维素水解糖苷酶(例如，木聚糖酶、内木聚糖酶、外木聚糖酶、β-木聚糖苷酶、阿拉伯糖基木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖酶、果胶酶、葡糖醛酸酶)、和淀粉水解糖苷酶(例如，淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、异淀粉酶)。此外，它可用于将其他活性加入糖化酶聚生体中，如肽酶(EC 3.4.x.y)、脂肪酶(EC 3.1.1.x和3.1.4.x)、木素酶(EC 1.11.1.x)、和阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)，以帮助从生物质的其他组分中释放多糖。本领域熟知生产多糖水解酶的微生物常常表现出某种活性，如纤维素降解，该活性由若干种酶或一组具有不同底物特异性的酶催化。因此，来自微生物的“纤维素酶”可包括一组酶，所有酶可有助于纤维素降解活性。取决于获取酶时利用的纯化方案，商业或非商业酶制剂，如纤维素酶，可包括多种酶。因此，本发明方法的糖化酶聚生体可包括酶活性，如“纤维素酶”，然而人们认识到该活性可被一种以上的酶催化。

[0114] 糖化酶可以以分离的形式商购获得，例如Spezyme CP纤维素酶(Genencor International，Rochester，NY)和Multifect 木聚糖酶(Genencor)。此外，糖化酶可在生物燃料植物的宿主生物中表达，包括使用重组微生物。

[0115] 本领域的技术人员将懂得如何测定在复合酶中使用的酶的有效量，以及如何调节条件以获得最佳酶活性。本领域的技术人员也将懂得如何优化在复合酶中的此类酶的所需活性，以在选择条件下获得给定预处理产物的最佳糖化效果。

[0116] 优选地，糖化反应在糖化酶的最佳温度和pH下或接近此最佳pH和温度的条件下进行。在本发明的方法中糖化酶聚生体使用的最佳温度在约15℃至约100℃的范围内。在另一个实施方案中，最佳温度在约20℃至约80℃的范围内。最典型的温度最佳范围为约45至约50℃。最佳pH范围为约2至约11。在另一个实施方案中，在本发明方法中使用的糖化酶聚生体最佳pH可介于约4至约5.5的范围内。

[0117] 糖化可进行约若干分钟至约120小时，优选约若干分钟至约48小时。反应时间将取决于酶浓度和比活性，已经使用的底物和环境条件如温度和pH。本领域的技术人员能够容易地决定特定底物和糖化酶聚生体使用的温度、pH和时间的最佳条件。

[0118] 糖化可分批进行或以连续方法进行。糖化也可一步进行或多步进行。例如，糖化所需的不同酶可表现出不同的最佳pH或温度。可用酶在某个温度和pH下进行首次处理，随后使用不同酶在不同温度和/或pH下进行第二次或第三次(或更多次)处理。此外，用不同酶在连续步骤中进行的处理可以在相同pH和/或温度下进行，或在不同pH和温度下进行，例如使用在较高pH和温度下稳定的和活性更高的半纤维素酶处理，随后用在较低pH和温度下有活性的纤维素酶处理。

[0119] 糖化后来自生物质的糖的溶解度可通过测量释放的单糖和低聚糖进行监控。测量单糖和低聚糖的方法是本领域熟知的。例如，还原糖的浓度可使用1，3-二硝基水杨酸(DNS)检测分析法(Miller，G.L.，Anal.Chem.，31：426-428，1959)测定。作为另外一种选择，可使用适当的柱，通过HPLC测定糖，如下文所述。

[0120] 发酵生成目标产物

[0121] 如上文所述，可以用酶水解通过本发明的方法生产的易于糖化的生物质，以生产可发酵的糖类，然后所述可发酵的糖类能够被发酵成为目标产物。“发酵”是指任何发酵过程或包含发酵步骤的任何过程。目标产物无限制地包括醇(例如阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1，3-丙二醇、山梨醇、和木糖醇)；有机酸(例如乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2，5-二酮-D-葡萄糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸、葡萄糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸、和木质酸)；酮(例如丙酮)；氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、和苏氨酸)；气体(例如甲烷、氢(H2)、二氧化碳(CO2)、和一氧化碳(CO))。

[0122] 发酵过程还包括在酒精消费品工业(例如，啤酒和酒)、乳品工业(例如，发酵的乳制品)、皮革工业、和烟草工业中所使用的工艺。

[0123] 除上文所述之外，如本文所述糖化预处理的生物质制备的糖一般来讲可用于制备有机产品、化学制品、燃料、商品和特定化学制品如木糖、丙酮、乙酸、甘氨酸、赖氨酸、有机酸(例如乳酸)、1，3-丙二醇、丁二醇、甘油、乙二醇、糠醛、聚羟基链烷酸、顺式，顺式-粘康酸、和动物饲料(Lynd，L.R.，Wyman，C.E.，和Gerngross，T.U.，Biocommodity Engineering，Biotechnol.Prog.，15：777-793，1999；和Philippidis，G.P.，Cellulose bioconversion technology，in Handbook on Bioethanol：Production and Utilization，Wyman，C.E.，ed.，Taylor & Francis，Washington，D.C.，179-212，1996；和Ryu，D.D.Y.，以及Mandels，M.，Cellulases：biosyn thesis and applications，Enz.Microb.Technol.，2：91-102，1980)。

[0124] 潜在的协同产品也可被生产，例如来自可发酵的碳水化合物的多种有机产品。预处理和发酵之后剩余的富集木质素的残余物能被转化为源自木质素的化学品、化学品基础材料或被用于产能。

[0125] 发酵和/或糖化的常规方法是本领域已知的，包括但不限于糖化、发酵、分步水解和发酵(SHF)、同步糖化和发酵(SSF)、同步糖化和共发酵(SSCF)、混合糖化和发酵(HHF)、以及直接微生物转化(DMC)。

[0126] SHF采用分别的工序来首先将纤维素酶解为糖类如葡萄糖和木糖，然后将所述糖类发酵为乙醇。在SSF中，纤维素的酶水解和葡萄糖向乙醇的发酵被合并为一个步骤(Philippidis，G.P.，in Handbook on Bioethanol：Production and Utilization，Wyman，C.E.，ed.，Taylor & Francis，Washington，D℃.，179-212，1996)。SSCF包括多糖的共发酵(Sheehan，J.和Himmel，M.，Bioethanol，Biotechnol.Prog.15：817-827，1999)。HHF包括在同一反应器但在不同温度进行的两个分别的步骤，即在高温下进行酶解糖化，然后在发酵菌株能够耐受的较低温度进行SSF。DMC将全部三个过程(纤维素酶生产、纤维素水解、和发酵)合并为一个步骤(Lynd，L.R.，Weimer，P.J.，van Zyl，W.H.，和Pretorius，I.S.，Microbiol.Mol.Biol.Reviews，66：506-577，2002)。

[0127] 这些方法可被用于从通过本文所述的预处理方法生产的易于糖化的生物质生产目标产物。

[0128] 本发明的方法的优点

[0129] 本发明的其中一个优点是从生物质中高选择性的破碎并除去木质素，同时留下很大程度上完整的碳水化合物。选择性较低的预处理方法将一部分碳水化合物水解成糖，例如将一部分葡聚糖水解成葡萄糖和/或将一部分木聚糖水解成木糖。如果存在的话，单体糖可在预处理过程中降解，导致糖总收率降低(即通过糖化步骤降解)。当加热含水生物质混悬液时，生物质中包含的一些乙酰基可水解成乙酸，这能够导致碳水化合物(多糖)水解。继而碳水化合物水解能够增溶一部分糖并降低糖总收率，尤其是假如在预处理后有生物质洗涤步骤的话更是如此。为了阻止乙酸诱导的碳水化合物水解，本发明方法是用无机碱。因此改善了糖回收和总糖回收(通过预处理和糖化步骤)。如实施例所示，延长臭氧处理能够导致糖收率，尤其是木糖收率降低。因此存在臭氧处理的最佳反应时间，低于该时间预处理将失效，高于该时间它将是非选择性的。臭氧处理的最佳反应时间取决于生物质组合物部分和粒度。

[0130] 此外，木质素比生物质中包含的碳水化合物的电子更多，因此木质素比碳水化合物更易于被臭氧氧化。虽然不期望受任何理论的约束，据信臭氧氧化木质素减少木质素片段的分子量，这继而致使木质素片段在溶剂溶液中较易溶并且较少结合到纤维素酶上。因此，能够在糖化过程中使用较低载酶量，这可提供针对酶使用的成本节省。有利的是，本发明方法在高温碱性条件下使用有机溶剂、随后用臭氧处理选择性氧化木质素组合处理木质纤维质生物质以制备易于糖化的生物质。

[0131] 本发明方法提供关于臭氧处理的有利灵活性，因为臭氧处理可在固体生物质或生物质-溶剂悬浮液上进行。两个选项提供了简化总过程和经济有益效果的机会。例如，如果需要以生物质-溶剂悬浮液形式存在的生物质可用臭氧处理，其中从包含选择缓冲液的水溶液中形成悬浮液易于糖化步骤。在臭氧处理后，可直接加入酶聚生体到易于糖化的生物质中，并且可在相同反应容器中进行糖化。如果溶剂溶液包含有机溶剂，可在臭氧处理后过滤易于糖化的生物质以进一步从生物质中除去木质素。作为另外一种选择，可使固体生物质与臭氧接触，即，不存在液相。实施例

[0132] 下文所述实验工作的目的是开发木质纤维素的预处理方法，该方法最大化预处理中的木质素除去并最小化预处理中的碳水化合物损失以制备易于糖化的生物质，其可进行进一步加工以在酶解糖化后获取最大的单体糖收率。采用的方法为在高温碱性条件下用有机溶剂处理选择性萃取并破碎木质素，然后在包含臭氧的气体存在下选择性氧化并破碎剩余木质素，同时保留固体残余中的糖。以下实验显示在碱性有机溶剂条件下处理木质纤维质生物质，随后用臭氧处理破碎的、萃取的、和氧化的木质素以制备易于糖化的生物质。

[0133] 本发明将在下面的实施例中得到进一步阐述。应该理解，尽管这些实施例说明了本发明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。通过上述论述和这些实施例，本领域的技术人员可确定本发明的必要特征，并且在不脱离本发明的实质和范围的前提下，可对本发明作出各种变化和修改以适应多种用途和条件。

[0134] 以下物质用于实施例中。所有商购试剂均按原样使用。

[0135] 葡萄糖、木糖、纤维二糖、和柠檬酸得自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)获得。乙醇得自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)获得。碳酸钾得自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)获得。酶聚生体获取自Genencor(Rochester，NY)。

[0136] 玉米芯购自Independence Corn By Products(ICBP Cob)，Independence，Iowa。售卖者存储玉米芯于60℃，并将其碾磨和筛1/8″。芯的干物质含量为95％。另一种类型的芯称为MD07芯，其得自University of Wisconsin Farm，in Madison，WI，并且锤式粉碎成3/8″的颗粒。

[0137] 生物质的碳水化合物分析

[0138] 采用修订版的NREL LAP方法“Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass”来测定生物质中葡聚糖和木聚糖的重量百分比。通过在80℃下真空干燥或通过在105℃和环境压力下干燥过夜，简化样品的制备。将样品切碎以通过20目筛网，但是不筛分。然后以50mg固体规模使干燥的粉碎固体经历酸水解过程。首先不用水或乙醇提取固体。在Aminex HPX-87H柱上进行糖的HPLC分析，但是没有尝试进行木质素的分析。

[0139] 采用配备适当保护柱的Bio-Rad HPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，使用0.01N的硫酸水溶液作为洗脱剂，由HPLC(Agilent 1100，Santa Clara，CA)测定糖化液体中的可溶性糖：葡萄糖、纤维二糖和木糖。如需要的话，测量样本pH并用硫酸将其调节至5-6。然后使样本通过0.2μ的注射过滤器直接进入HPLC小瓶中。HPLC运行条件如下：

[0140] Biorad Aminex HPX-87H(用于碳水化合物)：

[0141] 注射体积：10-50μL，取决于浓度和检测器限制。

[0142] 流动相：0.01N的硫酸水溶液，0.2微米过滤并且脱气

[0143] 流量：0.6mL/min

[0144] 柱温：50℃，保护柱柱温＜60℃

[0145] 检测器温度尽可能的接近主塔温度

[0146] 检测器：折射率

[0147] 运行时间：15分钟数据收集

[0148] 运行结束后，根据标准曲线测定每个化合物在样本中的浓度。

[0149] 使用臭氧发生器(型号CD1500)从空气制备臭氧，该仪器由ClearWater Tech(San Luis Obispo，CA)制造并设置为最大电压。臭氧处理步骤中每个样品中使用的臭氧量根据指定反应时间内消耗的臭氧来计算，这通过测量进出实验设备的富集臭氧的空气中的臭氧浓度并计算差值。使用Teledyne Instruments(San Diego，CA)臭氧监控器450M型测量臭氧。

[0150] 使用以下缩写：

[0151] “HPLC”为高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography)，“C”为摄氏度；“％”为百分比；“mL”为毫升；“h”为小时；“rpm”为每分钟转数；“EtOH”为乙醇；“mg/g”为毫克每克；“g/100mL”为克每100毫升；“g”为克；“NaOH”为氢氧化钠；“w/v”为重量体积比；“v/v”为体积比；“w/w”为重量比；“mm”为毫米；“mL/min”为毫升每分钟；“min”为分钟；“mM”为毫摩尔每升，“N”为正常值，“μL”为微升。

[0152] 比较实施例A

[0153] 仅用有机溶剂的对照实验(不使用无机碱，不使用臭氧处理)

[0154] 将EtOH(911.0mL)和水(250.0mL)中的ICBP玉米芯(240.00g 95％干物质)浆液加热至180℃两小时。在冷却时，过滤反应混合物并用3×250mL乙醇洗涤。室温下真空干燥残余以提供139.1g残余(61％质量回收量)。然后按照以下程序糖化残余。

[0155] 向来自上文程序的预处理玉米芯残余的浆液(0.499g)加入4.093mL柠檬酸缓冲液(pH＝5)，Accellerase 1000(46.3μL，浓度为97.1mg/mL)和Multifect CX12L(26.7μL，浓度为56.1mg/mL)酶聚生体，并且在培养/振荡器中，在48℃搅拌混合物。
每隔24小时采集样品并通过HPLC进行分析以测定对时间的单体糖收率。结果示于表1和表2中。

[0156] 比较实施例B

[0157] 使用有机溶剂和臭氧处理的对照实验(不使用无机碱)

[0158] 将获取自有机溶剂处理的比较实施例A(1.791g)的残余悬浮在EtOH(10.0mL)和水(2.69mL)的混合物中并室温下通入富集臭氧的空气(流速2L/min)到浆液中30分钟；在反应期间消耗23mg臭氧。然后过滤浆液以除去包含溶解的木质素片段的溶剂，并且真空干燥固体以生成1.513g(84.5％)预处理的生物质，根据以下程序将其糖化。

[0159] 向来自上文程序的预处理玉米芯残余的浆液(0.500g)加入3.498mL柠檬酸缓冲液(pH＝5)，Accellerase 1000(46.3μL，浓度为97.1mg/mL)和Multifect CX12L(26.7μL，浓度为56.1mg/mL)酶聚生体，并且在培养/振荡器中，在48℃搅拌混合物。
每隔24小时采集样品并通过HPLC进行分析以测定对时间的单体糖收率。结果示于表1和表2中。

[0160] 比较实施例C

[0161] 使用有机溶剂和臭氧处理的对照实验(不使用无机碱)

[0162] 将EtOH(50.0mL)中的玉米芯(15g 95％干物质)浆液搅拌加热至180℃12小时。然后迅速将混合物冷却至室温并进行过滤。用EtOH(50.0mL)洗涤固体残余，并且真空干燥以生成11.25g(75％质量回收量)预处理的生物质。

[0163] 将一部分此类物质(3.59g)悬浮在EtOH(16.5mL)和水(7.28mL)的混合物中并室温下通入富集臭氧的空气(流速3L/min)到浆液中5分钟；在反应期间消耗5mg臭氧。然后过滤浆液以除去包含溶解的木质素片段的溶剂，并且真空干燥固体以生成3.45g(99％质量回收量)预处理的生物质，根据以下程序将其糖化。

[0164] 向来自上文程序的预处理的生物质的浆液(0.499g)加入柠檬酸缓冲液(2.995mL)，Accellerase 1000(46.3μL，浓度为97.1mg/mL)和MultifectCX(26.7μL，浓度为56.1mg/mL)酶聚生体，并且在培养/振荡器中，在48℃搅拌混合物。每隔24小时采集样品并通过HPLC进行分析以生成对时间的单体糖收率。结果示于表1和2中。

[0165] 表1：比较实施例A、B、和C的葡萄糖糖化收率。

[0166]糖化时间(小时) 比较实施例A 比较实施例B 比较实施例C
6 8.4 ND 34.7
24 34.5 34.5 42.4
48 44.1 ND 49.3
72 49.8 58.5 52.4
96 59.2 68.2 59.5
120 62.5 69.1 62.2
148 65.8 78.4 73.1

[0167] 注：“ND”指未测定。

[0168] 表2：比较实施例A、B、和C木糖糖化收率。

[0169]糖化时间(小时) 比较实施例A 比较实施例B 比较实施例C
6 26.6 ND 45.9
24 52.5 47.6 54.0
48 53.6 ND 55.7
72 56.1 54.5 56.9
96 60.1 62.9 59.0
120 60.9 75.4 61.1
148 63.5 70.0 72.5

[0170] 注：“ND”指未测定。

[0171] 实施例1

[0172] 碱性有机溶剂和臭氧处理的效应

[0173] 向EtOH(37.0mL)和水(15.0mL)中的MD07玉米芯(15g 91.6％干物质)浆液加入碳酸钾(K2CO3)(0.750g)，并且搅拌加热所述混合物到180℃ 12小时。然后迅速将混合物冷却至室温并进行过滤。用EtOH(50.0mL)洗涤固体残余，并且真空干燥以生成8.40g(59％质量回收量)预处理的生物质。

[0174] 将一部分此类物质(3.64g)悬浮在EtOH(16.5mL)和水(7.28mL)的混合物中并室温下通入富集臭氧的空气(流速1.2L/min)到浆液中30分钟；在反应期间消耗8mg臭氧。然后过滤浆液以除去包含溶解的木质素片段的溶剂，并且真空干燥固体以生成3.175g(88％回收量)易于糖化的生物质，根据以下程序将其糖化。

[0175] 向来自上文程序的易于糖化的生物质的浆液(0.499g)加入柠檬酸缓冲液(2.995mL，pH＝5)，Accellerase 1000(46.3μμL，浓度为97.1mg/mL)和Multifect CX
12L(26.7μL，浓度为56.1mg/mL)酶聚生体，并且在培养/振荡器中，在48℃搅拌混合物。
每隔24小时采集样品并通过HPLC进行分析以测定对时间的单体糖收率。结果示于表3和表4中。

[0176] 实施例2

[0177] 碱性有机溶剂和臭氧处理的效应

[0178] 向EtOH(50.0mL)中的MD07玉米芯(15g 91.6％干物质)浆液加入K2CO3(0.750g)，并且搅拌加热所述混合物到140℃12小时。然后迅速将混合物冷却至室温并进行过滤。用EtOH(50.0mL)洗涤固体残余，并且真空干燥以生成12.68g(88％回收量)预处理的生物质。

[0179] 将一部分此类物质(3.60g)悬浮在EtOH(16.5mL)和水(2.16mL)的混合物中并室温下通入富集臭氧的空气(流速3L/min)到浆液中30分钟；在反应期间消耗15mg臭氧。然后过滤浆液以除去包含溶解的木质素片段的溶剂，并且真空干燥固体以生成3.499g(97％回收量)易于糖化的生物质，根据以下程序将其糖化。

[0180] 向来自上文程序的易于糖化的生物质的浆液(0.503g)加入柠檬酸缓冲液(3.018mL，pH＝5)，Accellerase 1000(46.6μL，浓度为97.1mg/mL)和Multifect CX
12L(26.9μL，浓度为56.1mg/mL)酶聚生体，并且在培养/振荡器中，在48℃搅拌混合物。
每隔24小时采集样品并通过HPLC进行分析以生成对时间的单体糖收率。结果示于表3和表4中。

[0181] 实施例3

[0182] 碱性有机溶剂和臭氧处理的效应

[0183] 向EtOH(37mL)和水(15mL)中的ICBP玉米芯(15g 95％干物质)浆液加入K2CO3(0.750g)。用氮气将压力提高到200psi，然后搅拌加热混合物到180℃ 12小时。然后迅速将混合物冷却至室温并进行过滤。用EtOH(50.0mL)洗涤固体残余，并且真空干燥以生成6.60g(44％回收量)预处理的生物质。

[0184] 将一部分此类物质(3.60g)悬浮在EtOH(16.5mL)和水(2.16mL)的混合物中并室温下通入富集臭氧的空气(流速3L/min)到浆液中30分钟；在反应期间消耗30mg臭氧。然后过滤浆液以除去包含溶解的木质素片段的溶剂，并且真空干燥固体以生成3.499g(97％回收量)易于糖化的生物质，根据以下程序将其糖化。

[0185] 向来自上文程序的易于糖化的生物质的浆液(0.501g)加入柠檬酸缓冲液(3.018mL)，Accellerase 1000(46.6μL，浓度为97.1mg/mL)和Multifect CX(26.9μL，浓度为56.1mg/mL)酶聚生体，并且在培养/振荡器中，在48℃搅拌混合物。每隔24小时采集样品并通过HPLC进行分析以生成对时间的单体糖收率。结果示于表3和表4中。

[0186] 实施例4

[0187] 碱性有机溶剂和臭氧处理的效应

[0188] 向EtOH(50.0mL)中的玉米芯(15g 95％干物质)浆液加入K2CO3(0.750g)，并且搅拌加热所述混合物到180℃1小时。然后迅速将混合物冷却至室温并进行过滤。用EtOH(50.0mL)洗涤固体残余，并且真空干燥以生成12.60g(84％回收量)预处理的生物质。

[0189] 将一部分此类物质(3.64g)悬浮在EtOH(16.5mL)和水(7.28mL)的混合物中并室温下通入富集臭氧的空气(流速1.2L/min)到浆液中5分钟；在反应期间消耗3mg臭氧。然后过滤浆液以除去包含溶解的木质素片段的溶剂，并且真空干燥固体以生成3.61g(99％回收量)易于糖化的生物质，根据以下程序将其糖化。

[0190] 向易于糖化的生物质的浆液(0.499g)加入柠檬酸缓冲液(2.995mL)，Accellerase 1000(46.3μL，浓度为97.1mg/mL)和Multifect CX(26.7μL，浓度为
56.1mg/mL)酶聚生体，并且在培养/振荡器中，在48℃搅拌混合物。每隔24小时采集样品并通过HPLC进行分析以生成对时间的单体糖收率。结果示于表3和4中。

[0191] 表3：实施例1、2、3、和4的葡萄糖糖化收率

[0192]糖化时间(小时) 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4
6 14.7 20.5 15.0 21.2
24 39.8 43.3 36.4 43.5
48 53.3 51.0 48.2 51.4
72 57.2 57.1 55.9 57.8
96 64.4 63.5 62.5 65.1
120 69.3 70.1 63.3 68.2
148 76.9 71.2 66.8 71.5

[0193] 注：“ND ”指未测定。

[0194] 表4：实施例1、2、3、和4的木糖糖化收率

[0195]糖化时间(小时) 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4
6 21.5 17.5 33.8 19.2
24 43.4 41.1 57.7 41.5
48 48.7 44.9 64.2 47.2
72 48.1 47.8 68.3 51.7
96 50.6 51.5 73.8 57.9
120 52.3 55.6 72.6 60.2
148 56.2 57.2 74.8 62.7

[0196] 注：“ND”指未测定。

[0197] 进行上文公开的实验是为了揭示最大化单体糖收率的重要因素。发现在有机溶剂处理步骤中存在碱对总糖回收率是重要的，这可能是由于碱中和在有机溶剂预处理期间木质纤维质生物质中包含的乙酰基水解生成的酸。数据也显示臭氧处理在木质素降解中是选择性的，然后臭氧处理延长可导致糖损失。数据显示有机溶剂预处理期间的初始压力对预处理结果不重要。

[0198] 尽管在以上描述中已用具体实施方案来描述了本发明，但本领域的技术人员将会理解，在不背离本发明必要属性实质的情况下能够作出许多修改、替代和重新排列。指明本

标题	发布/更新时间	阅读量
糖化罐-专利编号CN110756093A	2020-05-11	119
糖化方法-专利编号CN101443439A	2020-05-12	446
糖化方法-专利编号CN1671833A	2020-05-13	597
糖化方法-专利编号CN105623937A	2020-05-13	81
糖化工艺-专利编号CN1918277A	2020-05-12	608
糖化方法-专利编号CN101443439B	2020-05-11	606
糖化工艺-专利编号CN102220192A	2020-05-11	108
糖化工艺-专利编号CN102220193A	2020-05-11	986
糖化方法-专利编号CN101918525A	2020-05-12	657
糖化床-专利编号CN108455233A	2020-05-13	397

用有机溶剂和臭氧处理生物质以促进酶解糖化

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