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耐热性异淀粉酶

阅读：440发布：2021-03-01

IPRDB可以提供耐热性异淀粉酶专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供最适温度进一步提高、即耐热性提高了的新的异淀粉酶和其制造方法。所述异淀粉酶是在由序列号1所示的氨基酸序列构成的异淀粉酶或者序列号1所示的氨基酸序列中缺失、取代或插入有1个～多个的氨基酸残基的异淀粉酶中，具有选自D268A、M277I、A549P、A554P和A580T中的1个或2个以上的氨基酸变异。，下面是耐热性异淀粉酶专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种异淀粉酶，在由序列号1所示的氨基酸序列构成的异淀粉酶或者序列号1所示的氨基酸序列中缺失、取代或插入1个～多个氨基酸残基的异淀粉酶中，具有选自D268A、M277I、A549P、A554P和A580T中的1个或2个以上的氨基酸变异。

2.根据权利要求1所述的异淀粉酶，其中，氨基酸变异为包含选自D268A、M277I、A549P、A554P和A580T中的2～5重变异的变异。

3.根据权利要求1或2所述的异淀粉酶，其中，氨基酸变异为包含选自A554P、M277I、D268A、A580T、A554P/M277I、A554P/M277I/D268A、A554P/M277I/D268A/A549P、A554P/M277I/D268A/A549P/A580T中的变异的变异。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的异淀粉酶，其中，氨基酸变异为包含选自A554P/M277I、A554P/M277I/D268A、A554P/M277I/D268A/A549P和A554P/M277I/D268A/A549P/A580T中的变异的变异。

5.一种基因，编码权利要求1～4中任一项所述的异淀粉酶。

6.一种重组载体，具有权利要求5所述的基因。

7.一种转化体，是用权利要求6所述的重组载体进行转化而得到的。

8.一种异淀粉酶的制造方法，其特征在于，培养权利要求7所述的转化体并从该培养物采集异淀粉酶。

9.一种淀粉糖化用酶组合物，含有权利要求1～4中任一项所述的异淀粉酶。

10.根据权利要求9所述的淀粉糖化用酶组合物，其中，进一步含有选自β－淀粉酶、α－淀粉酶和葡糖淀粉酶中的酶。

说明书全文

耐热性异淀粉酶

技术领域

[0001] 本发明涉及耐热性提高了的变异异淀粉酶和该变异异淀粉酶的制造方法。

背景技术

[0002] 在糖化工业中，作为将淀粉、支链淀粉中的α－1,6－吡喃葡萄糖苷键水解的酶，已知有肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)等生产的普鲁兰酶和异淀粉酶。其中，已知异淀粉酶是将淀粉、支链淀粉、糖原中的α－1,6－吡喃葡萄糖苷键水解的酶，由于未发现可逆反应，因此，通过使用其它淀粉酶、葡糖淀粉酶等，能够生产高纯度的葡萄糖、麦芽糖。作为异淀粉酶生产菌，报告有淀粉假单胞菌(Pseudomonas amyloderamosa)(非专利文献1)等。

[0003] 现有技术文献

[0004] 非专利文献

[0005] 非专利文献1：8tarch(1996),48：295－300

发明内容

[0006] 但是，淀粉假单胞菌等生产的异淀粉酶的最适温度比其它淀粉酶的最适温度低，在工业使用水平的反应温度带时难以并用。

[0007] 因此，本发明的课题在于提供最适温度进一步提高、即耐热性提高了的新的异淀粉酶和其制造方法。

[0008] 因此，本发明人制造了将所述淀粉假单胞菌等生产的异淀粉酶的氨基酸序列的一部分进行修饰而得的蛋白质并对其耐热性进行了研究，结果发现通过使特定位置的氨基酸变异成其它氨基酸，得到耐热性提高了5℃～10℃的变异异淀粉酶，从而完成了本发明。

[0009] 即，本发明提供以下的[1]～[10]。

[0010] [1]一种异淀粉酶，在由序列号1所示的氨基酸序列构成的异淀粉酶或者序列号1所示的氨基酸序列中缺失、取代或插入1个～多个氨基酸残基的异淀粉酶中，具有选自D268A、M277I、A549P、A554P和A580T中的1个或2个以上的氨基酸变异。

[0011] [2]根据[1]所述的异淀粉酶，其中，氨基酸变异为包含选自D268A、M277I、A549P、A554P和A580T中的2～5重变异的变异。

[0012] [3]根据[1]或[2]所述的异淀粉酶，其中，氨基酸变异为包含选自A554P、M277I、D268A、A580T、A554P/M277I、A554P/M277I/D268A、A554P/M277I/D268A/A549P和A554P/M277I/D268A/A549P/A580T中的变异的变异。

[0013] [4]根据[1]～[3]中任一项所述的异淀粉酶，其中，氨基酸变异为包含选自A554P/M277I、A554P/M277I/D268A、A554P/M277I/D268A/A549P和A554P/M277I/D268A/A549P/A580T中的变异的变异。

[0014] [5]一种基因，编码[1]～[4]中任一项所述的异淀粉酶。

[0015] [6]一种重组载体，具有[5]所述的基因。

[0016] [7]一种转化体，是用[6]所述的重组载体进行转化而得到的。

[0017] [8]一种异淀粉酶的制造方法，其特征在于，培养[7]所述的转化体并从该培养物采集异淀粉酶。

[0018] [9]一种淀粉糖化用酶组合物，含有[1]～[4]中任一项所述的异淀粉酶。

[0019] [10]根据[9]所述的淀粉糖化用酶组合物，进一步含有选自β－淀粉酶、α－淀粉酶和葡糖淀粉酶中的酶。

[0020] 本发明的异淀粉酶的耐热性提高了5℃以上，与其它各种淀粉酶的最适温度重叠。因此，本发明的异淀粉酶通过与各种淀粉酶并用而用于淀粉等，能够工业上有利地生产高纯度的葡萄糖、麦芽糖等。在本发明中，“并用”是指在将本发明的异淀粉酶与其以外的1种以上的酶混合的状态下，至少2种以上的酶处于显示活性的状态。

附图说明

[0021] 图1是表示天然和各变异体酶的热稳定性的图。

具体实施方式

[0022] 本发明的异淀粉酶是在由序列号1所示的氨基酸序列构成的异淀粉酶或者序列号1所示的氨基酸序列中缺失、取代或插入有1个～多个氨基酸残基的异淀粉酶中，具有选自D268A、M277I、A549P、A554P和A580T中的1个或2个以上的氨基酸变异的异淀粉酶。

[0023] 在此，由序列号1所示的氨基酸序列构成的异淀粉酶是非专利文献1记载的淀粉假单胞菌产生的异淀粉酶。在该异淀粉酶中，只要具有同一氨基酸序列，则包含不来自淀粉假单胞菌的异淀粉酶。另外，只要具有同一氨基酸序列，则不仅包含多肽，还包含糖肽。应予说明，序列号1表示成熟蛋白质的氨基酸序列。

[0024] 序列号1所示的氨基酸序列中缺失、取代或插入有1个～多个氨基酸残基的异淀粉酶的、氨基酸残基的缺失、取代或插入的数量只要显示与由序列号1所示的氨基酸序列构成的异淀粉酶同等的酶活性就没有限定，优选1～20个，进一步优选1～10个，进一步优选1～8个。另外，该缺失、取代或插入后的异淀粉酶与序列号1的氨基酸序列的同源性优选80％以上，更优选85％以上，进一步优选90％以上，进一步优选95％以上。这样的序列的同源性百分率可以使用带有以基准序列作为参照序列进行比较的算法的公开或市售的软件进行计算。作为例子，可以使用BLAST、FASTA或GENETYX(软件开发公司制)等。

[0025] 本发明的异淀粉酶具有选自D268A、M277I、A549P、A554P和A580T中的1个或2个以上的氨基酸变异。更优选的氨基酸变异为包含选自D268A、M277I、A549P、A554P和A580T中的2～5重变异的变异。

[0026] 作为具体的氨基酸变异，可举出A554P、M277I、D268A、A549P、A580T、A554P/M277I、A554P/D268A、A554P/A549P、A554P/A580T、M277I/D268A、M277I/A549P、M277I/A580T、D268A/A549P、D268A/A580T、A549P/A580T、A554P/M277I/D268A、A554P/M277I/A549P、A554P/M277I/A580T、A554P/D268A/A549P、A554P/D268A/A580T、A554P/A549P/A580T、M277I/D268A/A549P、M277I/D268A/A580T、D268A/A549P/A580T、A554P/M277I/D268A/A549P、A554P/D268A/A549P/A580T、A554P/M277I/A549P/A580T、A554P/M277I/D268A/A580T、M277I/D268A/A549P/A580T、A554P/M277I/D268A/A549P/A580T等。

[0027] 作为进一步优选的氨基酸变异，可举出A554P/M277I、A554P/M277I/D268A、A554P/M277I/D268A/A549P、A554P/M277I/D268A/A549P/A580T。

[0028] 本发明的变异异淀粉酶可以使用基因进行制造，该基因是通过在由序列号1所示的氨基酸序列构成的异淀粉酶或者序列号1所示的氨基酸序列中缺失、取代或插入有1个～多个氨基酸残基的异淀粉酶中进行选自D268A、M277I、A549P、A554P和A580T中的1个或2个以上氨基酸变异而构建的。

[0029] 用于制造本发明的变异异淀粉酶的基因是具有编码上述变异异淀粉酶的碱基序列的基因，例如可以通过在编码上述序列号1所示的氨基酸序列的基因中，将编码应取代的氨基酸序列的碱基序列取代成编码期望的氨基酸残基的碱基而构建。用于这种部位特异性碱基序列取代的各种方法在该技术领域中是熟知的，例如可以通过使用适当设计的引物利用PCR进行。或者，可以全合成编码修饰型氨基酸序列的基因。

[0030] 将如此得到的基因插入适当的表达载体，将其转化于适当的宿主(例如大肠杆菌)。用于使外源性蛋白质表达的许多载体·宿主系统在该技术领域中是已知的。作为用于导入变异异淀粉酶基因的表达载体，可举出质粒载体，例如作为大肠杆菌用，可举出pET－14b、pBR322等。作为枯草杆菌用，可举出pUB110等。作为丝状菌用，可举出pPTRI等。另外，作为酵母用，可举出pRS403等。

[0031] 得到的重组质粒转化于大肠杆菌、枯草杆菌、霉菌、酵母、放线菌、乙酸菌、假单胞菌属菌等微生物，培养该转化体，则得到本发明变异异淀粉酶。该转化体可以将变异异淀粉酶基因以质粒的状态保持，也可以导入到基因组内。

[0032] 本发明的异淀粉酶与淀粉假单胞菌等生产的异淀粉酶相比，耐热性提高了5℃～10℃且最适pH、异淀粉酶活性等与淀粉假单胞菌等生产的异淀粉酶同等。因此，如果使选自β－淀粉酶、α－淀粉酶、葡糖淀粉酶等中的酶和本发明异淀粉酶作用于淀粉，则容易得到高纯度的葡萄糖、麦芽糖。在此，作为β－淀粉酶，可以使用GODO－GBA2(合同酒精株式会社)、OPTIMALT BBA(Danisco Japan株式会社)、β－淀粉酶L/R(Nagase ChemteX株式会社)、Hi-Maltosin GL(HBI株式会社)等。另外，作为α－淀粉酶，例如可以使用KLEISTASE T10(大和化成株式会社)。作为葡糖淀粉酶，例如可以使用Gluczyme(Amano Enzyme株式会社)、GODO－ANGH(合同酒精株式会社)。

[0033] 本发明的异淀粉酶优选作为糖化用异淀粉酶使用，进一步优选作为淀粉糖化用异淀粉酶使用。

[0034] 本发明的异淀粉酶也优选成为根据需要与其它1种以上的酶混合而得到的淀粉糖化用酶组合物。其它1种以上的酶可以从上述的β－淀粉酶、α－淀粉酶、葡糖淀粉酶中选择。

[0035] 反应通过例如在淀粉以及淀粉酶等淀粉糖化酶中添加上述酶，在该酶发生作用的pH、温度条件下进行混合搅拌来进行。根据本发明方法，能够工业上有利地制造高纯度的葡萄糖、麦芽糖。

[0036] 实施例

[0037] 接着，举出实施例对本发明更详细地进行说明，但本发明并不受这些实施例任何限定。

[0038] 实施例1(异淀粉酶的部位特异性变异导入)

[0039] 以淀粉假单胞菌基因组作为模板，使用引物 P S T P I A － F(AAACTGCAGATGAAGTGCCCAAAGATTCTC(序列号2))和HINDPIA－R(CCCAAGCTTCTACTTGGAGATCAACAGCAG(序列号3))而获得包含耐酸性异淀粉酶基因序列的约
2.3kb的片段。将该片段用限制酶Pst I和Hind III进行酶切，与将pHSG398(Takara Bio株式会社)用限制酶Pst I和Hind III进行酶切而得到的约2.2kb的片段进行连结，由此获得p－PI。对天然的耐酸性异淀粉酶的表达质粒即质粒p－PI进行部位特异性变异导入，获得一重变异体(A554P)表达质粒p－PIA554P。同样地获得一重变异体(M277I)表达质粒p－PIM277I、一重变异体(D268A)表达质粒p－PID268A、一重变异体(A580T)表达质粒p－PIA580T。另外，对p－PIA554P进行部位特异性变异导入，获得二重变异体(A554P/M277I)表达质粒p－PI2M、三重变异体(A554P/M277I/D268A)表达质粒p－PI3M、四重变异体(A554P/M277I/D268A/A549P)表达质粒p－PI4M、五重变异体(A554P/M277I/D268A/A549P/A580T)表达质粒p－PI5M。

[0040] 实施例2(酶的生成)

[0041] 通过天然耐酸性异淀粉酶表达质粒p－PI、一重变异体(A554P)表达质粒p－PIA554P、一重变异体(M277I)表达质粒p－PIM277I、一重变异体(D268A)表达质粒p－PID268A、一重变异体(A580T)表达质粒p－PIA580T、二重变异体(A554P/M277I)表达质粒p－PI2M、三重变异体(A554P/M277I/D268A)表达质粒p－PI3M、四重变异体(A554P/M277I/D268A/A549P)表达质粒p－PI4M、五重变异体(A554P/M277I/D268A/A549P/A580T)表达质粒p－PI5M对大肠杆菌DH5α株进行转化，获得生产各自的异淀粉酶的大肠杆菌株。将这些大肠杆菌在含有30μg/mL的氯霉素的LB培养基(酵母提取物0.5％、胰蛋白胨1.0％、氯化钠0.5％、IPTG 0.1mM pH7.2)中在30℃培养3天，得到培养液1L。通过超声波将菌体破碎后，进行离心分离(10000g，10分钟)，将上清液通过UF浓缩(旭化成公司制AIP模块)浓缩至1000U/mL。将它们用0.2μm孔径的膜进行除菌，由此制成天然耐酸性异淀粉酶、一重变异体(A554P)异淀粉酶、一重变异体(M277I)异淀粉酶、一重变异体(D268A)异淀粉酶、一重变异体(A580T)异淀粉酶、二重变异体(A554P/M277I)异淀粉酶、三重变异体(A554P/M277I/D268A)异淀粉酶、四重变异体(A554P/M277I/D268A/A549P)异淀粉酶、五重变异体(A554P/M277I/D268A/A549P/A580T)异淀粉酶的酶溶液。

[0042] 实施例3(各变异体的热稳定性提高)

[0043] 将它们在40℃、50℃、55℃、57.5℃、60℃、62.5℃、65℃保存10分钟后，进行冰冷，测定剩余活性。使用由各温度下的剩余活性的标绘制成的近似式算出剩余活性成为50％的温度，将该温度与天然耐酸性异淀粉酶比较时，将增加的程度作为耐热度。将四重变异体的氨基酸序列示于序列号4。将五重变异体的氨基酸序列示于序列号5。

[0044] ＜活性测定方法＞

[0045] 异淀粉酶的活性测定法如下。

[0046] 在0.5％糯玉米淀粉溶液0.35mL中混合0.5M的乙酸缓冲液(pH4.5)0.1mL，适时加入0.1mL稀释的酶液，在45℃反应15分钟。然后，加入用0.1N HCl稀释5倍的碘溶液(含有0.05M碘的0.5M碘化钾溶液)0.5mL停止酶反应，加入10mL的水并充分地搅拌后，使用分光光度计在610nm进行测定。对于酶活性的单位，将在上述条件下每1分钟增加0.01吸光度的酶量作为1单位。

[0047] 其结果，如图1和表1所示，确认了一重变异体(A554P)时耐热度提高约1.2℃，一重变异体(M277I)时耐热度提高约1.1℃，一重变异体(D268A)时耐热度提高约1.3℃，一重变异体(A580T)时耐热度提高约4.5℃，二重变异体(A554P/M277I)时耐热度提高约3.2℃，三重变异体(A554P/M277I/D268A)时耐热度提高约4.3℃，四重变异体(A554P/M277I/D268A/A549P)时耐热度提高约5.1℃，五重变异体(A554P/M277I/D268A/A549P/A580T)时耐热度提高约6℃。

[0048] 实施例4(淀粉的糖化)

[0049] 作为淀粉的糖化，进行还原糖游离试验。在10mM乙酸缓冲液(pH4.5)中以成为30％(重量/重量)的方式加热溶解溶性淀粉，将(1)30％溶性淀粉每1g添加20mg溶解成0.05mg/mL的葡糖淀粉酶(和光纯药株式会社制)以及30％溶性淀粉每1g添加125U天然耐酸性异淀粉酶而得到的样品、(2)30％溶性淀粉每1g添加20mg葡糖淀粉酶以及30％溶性淀粉每1g添加125U四重变异体异淀粉酶而得到的样品、(3)30％溶性淀粉每1g添加20mg葡糖淀粉酶以及30％溶性淀粉每1g添加125U五重变异体异淀粉酶而得到的样品各自在55℃、60℃、62.5℃反应16小时。

[0050] 在100℃加热5分钟使反应停止，对于生成的还原糖量，通过DNS法进行测定。

[0051] ＜测定方法＞

[0052] 还原糖量的测定方法如下。

[0053] 在DNS溶液1.5mL中适时加入0.5mL稀释的样品液后搅拌，在沸水中反应5分钟。水冷后，加入4mL的水并充分地搅拌后，使用分光光度计在540nm进行测定。还原糖量由使用葡萄糖溶液制作的校正曲线算出。DNS(3,5－二硝基水杨酸)溶液使用如下溶液：在1％DNS溶液4400mL中溶解4.5％氢氧化钠溶液1500mL和罗谢尔盐1275g后，加入另外制备的苯酚溶液(1％苯酚、2.44％氢氧化钠)345mL和碳酸氢钠34.5g并搅拌溶解，在暗处保存2天后，利用滤纸过滤而得到的溶液。

[0054] 将其结果示于表2。在将使用天然耐酸性异淀粉酶的55℃反应中得到的还原糖量设为100％时，使用四重变异体异淀粉酶时提高至103％，使用五重变异体异淀粉酶时提高至104％。另外，在60℃反应中，尽管天然耐酸性异淀粉酶时降低至98％，但四重变异体异淀粉酶时为102％，五重变异体异淀粉酶时为104％。进而，在62.5℃反应中，尽管天然耐酸性异淀粉酶时降低至97％，但四重变异体异淀粉酶时为102％，五重变异体异淀粉酶时为103％。因此，与天然耐酸性异淀粉酶相比，使用四重变异体异淀粉酶时明显确认到还原糖生成量的提高。另外，与四重变异体异淀粉酶相比，使用五重变异体异淀粉酶时确认到还原糖生成量提高。进而，随着温度上升，天然耐酸性异淀粉酶的脱支效果降低，与此相对，发现四重变异体异淀粉酶或五重变异体异淀粉酶的脱支效果不降低，收率提高，因此，确认到变异所带来的热稳定性效果。

[0055] [表1]

[0056]

[0057] [表2]

[0058]

[0059] *还原糖量以将使用天然耐酸性异淀粉酶

[0060] 的55℃(1)的条件设为100％时的相对值表示

标题	发布/更新时间	阅读量
复合变性淀粉-专利编号CN101628945A	2020-05-12	704
功能性淀粉粉末-专利编号CN1823091B	2020-05-13	359
造纸用淀粉-专利编号CN1250631C	2020-05-11	799
造纸用淀粉-专利编号CN1374337A	2020-05-11	613
淀粉提纯法-专利编号CN101696244A	2020-05-11	376
通过异淀粉酶脱支低直链淀粉的淀粉制成的耐性淀粉-专利编号CN1310950C	2020-05-13	186
功能性淀粉粉末-专利编号CN1823091A	2020-05-12	384
复合变性淀粉-专利编号CN101628945B	2020-05-12	855
淀粉酯涂料-专利编号CN1281017A	2020-05-11	744
西米凝胶淀粉-专利编号CN100355789C	2020-05-13	286

耐热性异淀粉酶

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