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包含明胶的骨再生剂

阅读：359发布：2020-05-16

IPRDB可以提供包含明胶的骨再生剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及包含明胶的骨再生剂和骨补充制剂，其中补充材料自身能够促进骨再生。，下面是包含明胶的骨再生剂专利的具体信息内容。

权利要求

1.肉芽组织形成剂，其包含具有源自胶原的部分氨基酸的氨基酸序列的明胶，并且不包含除所述明胶以外的具有骨再生作用的其他物质，其中所述明胶具有以下(1)或(2)：(1)SEQ ID NO:1中显示的氨基酸序列；或

(2)与SEQ ID NO:1中显示的氨基酸序列具有80％或更高的同源性并且具有骨再生作用的氨基酸序列。

2.权利要求1的肉芽组织形成剂，其中所述明胶包含胶原特征性的由Gly-X-Y表示的序列的重复并且分子量为2KDa-100KDa，其中X和Y各自独立地表示氨基酸并且多个Gly-X-Y序列可相同或不同。

3.权利要求1的肉芽组织形成剂，其中所述明胶包含胶原特征性的由Gly-X-Y表示的序列的重复并且分子量为10KDa-90KDa，其中X和Y各自独立地表示氨基酸并且多个Gly-X-Y序列可相同或不同。

4.权利要求1的肉芽组织形成剂，其中所述明胶包含胶原特征性的由Gly-X-Y表示的序列的重复并且在单个分子中具有两个或更多个细胞粘附信号序列，其中X和Y各自独立地表示氨基酸并且多个Gly-X-Y序列可相同或不同。

5.权利要求4的肉芽组织形成剂，其中所述细胞粘附信号序列是由Arg-Gly-Asp表示的氨基酸序列。

6.权利要求1的肉芽组织形成剂，其中所述明胶的氨基酸序列不包含丝氨酸和苏氨酸中的任何一种。

7.权利要求1的肉芽组织形成剂，其中所述明胶的氨基酸序列不包含丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸和半胱氨酸中的任何一种。

8.权利要求1的肉芽组织形成剂，其中所述明胶的氨基酸序列不包含由Asp-Arg-Gly-Asp表示的氨基酸序列。

9.权利要求1的肉芽组织形成剂，其中所述明胶由下式表示：A-[(Gly-X-Y)n]m-B

其中A表示任意氨基酸或氨基酸序列，B表示任意氨基酸或氨基酸序列，存在n个各自独立地由X表示的氨基酸，存在n个各自独立地由Y表示的氨基酸，n表示3-100的整数，m表示2-

10的整数，并且n个Gly-X-Y序列可相同或不同。

10.权利要求1的肉芽组织形成剂，其中所述明胶由下式表示：Gly-Ala-Pro-[(Gly-X-Y)63]3-Gly其中存在63个各自独立地由X表示的氨基酸，存在63个各自独立地由Y表示的氨基酸，并且63个Gly-X-Y序列可相同或不同。

11.权利要求1的肉芽组织形成剂，其中所述明胶具有SEQ ID NO:1中显示的氨基酸序列。

12.权利要求1-11中任一项的肉芽组织形成剂，其中所述明胶是交联的。

13.权利要求12的肉芽组织形成剂，其中使用醛、缩合剂或酶进行所述交联。

14.权利要求1-11中任一项的肉芽组织形成剂，其中给药所述肉芽组织形成剂的目标疾病是骨缺损、口腔外科疾病、骨质疏松或关节病。

15.权利要求12的肉芽组织形成剂，其中给药所述肉芽组织形成剂的目标疾病是骨缺损、口腔外科疾病、骨质疏松或关节病。

16.权利要求1-11中任一项的肉芽组织形成剂，其中给药所述肉芽组织形成剂的目标疾病是骨缺损。

17.权利要求12的肉芽组织形成剂，其中给药所述肉芽组织形成剂的目标疾病是骨缺损。

18.权利要求1-11中任一项的肉芽组织形成剂，其用于拔牙部位。

19.权利要求12的肉芽组织形成剂，其用于拔牙部位。

20.骨补充制剂，其包含权利要求1-11中任一项的肉芽组织形成剂。

21.骨补充制剂，其包含权利要求12的肉芽组织形成剂。

22.具有源自胶原的部分氨基酸的氨基酸序列的明胶用于制备肉芽组织形成剂或骨补充制剂的用途，所述肉芽组织形成剂或骨补充制剂通过所述明胶诱导骨再生，其中所述明胶具有以下(1)或(2)：(1)SEQ ID NO:1中显示的氨基酸序列；或

(2)与SEQ ID NO:1中显示的氨基酸序列具有80％或更高的同源性并且具有骨再生作用的氨基酸序列。

说明书全文

包含明胶的骨再生剂

[0001] 本申请是2010年9月3日提交的发明名称为“包含明胶的骨再生剂”的中国专利申请201080039114.7的分案申请。

技术领域

[0002] 本发明涉及骨再生剂和骨补充制剂，二者均包含明胶。

背景技术

[0003] 身体组织主要由细胞和胞外基质(高分子结构)组成。从细胞分泌的胞外基质提供细胞在其中发挥功能的水合空间或细胞支架。另外，胞外基质还充当从细胞分泌的各种生长因子的储库，并且对细胞功能的表达或细胞分化具有很大的影响。活体内胞外基质和细胞之间复杂的相互作用对各种生命活动具有影响。

[0004] 近几年，高度发达的医学技术(藉此使用人工器官、基因疗法和再生药物治疗严重疾病)已在临床上取得显著成功并引起全球范围的关注。其中，利用在组织再生中起主要作用的三种主要因素(即细胞、生长因子和胞外基质)使损伤的组织或器官再生的再生药物作为未来一代的治疗方法已引起人们的关注。事实上，对于培养的皮肤或角膜而言，已实现了此类再生药物。

[0005] 整形外科或牙科领域的骨再生作为再生药物的应用实例已经引起了很大关注。换言之，当骨病出现在腿或腰部时，其引起步行不能。当此类骨病出现在牙齿部位时，其引起食物摄入困难。因此认为骨病引起QOL的显著降低。目前，已知的骨再生治疗制剂的代表性实例包括：用于治疗脊柱损伤的Infuse(BMP-2与胶原海绵的组合)；以及被用作使牙槽骨再生的骨补充剂的BioOss(脱蛋白的粉碎的牛骨)、Puros(粉碎的人骨制品)、Gem21(PDGF和βTCP)、Osferion(βTCP)和Teruplug(在美国使用的名称为：FOUNDATION；一种胶原海绵)。已知的骨再生治疗剂的必要性质包括：1.维持结构所需的强度；2.确保骨再生所需的空间；3.骨再生所需的细胞支架；4.骨再生必需的细胞分化和生长；以及5.伴随骨再生的降解性。

[0006] 在牙科领域，已知使用上述骨再生治疗制剂的代表性疾病包括：1.嵴增高；2.牙槽保护(socket preservation)；3.牙周骨质缺损再生；4.植入骨再生；以及5.窦底提升。支架材料在上述疾病中促进骨再生的重要性已得到认同。然而，在目前的情况下，上述制剂依赖于其中包含的药剂(BMP或RDGF)的骨再生能力。此类支架材料被认为是作为用于在患部确保一定空间(强度)的产品。在许多情况下，无机材料被广泛用作此类支架材料。

[0007] 一般而言，在许多情况下，胶原或者作为所述胶原的变性产物的明胶被广泛用作再生药物中的支架材料(有机材料)。已知高取向的胶原作为骨再生材料在钙化中起到重要作用(非专利文件1)。因此，用胶原制成的海绵已作为骨再生材料被投放市场(Teruplug(FOUDATION；Olympus Terumo Biomaterials Corp.))。然而，使用胶原海绵的骨补充材料仅为组织形成提供支架，并且单独使用此类胶原海绵不能形成骨(非专利文件2)。而且，根据以前的发现，从未知晓作为胶原的变性产物的明胶具有骨再生作用。就明胶而言，据记载：1.单独使用明胶海绵抑制骨再生(非专利文件3)，和2.明胶的骨再生能力低于胶原(非专利文件4)。另外，已报道，与通过对胶原进行热处理而制备的明胶海绵一样，人工骨成分β-TCP中没有形成骨(非专利文件2和5)。如上所述，人们已经认识到被广泛用作再生药物的基质材料的明胶不适合作为骨再生治疗剂的支架材料。对于自身不能形成骨的补充材料而言，已研究了用作为生理活性物质的血小板衍生生长因子(PDGF)或骨形态生成蛋白(BMP)浸渍所述补充材料的方法(专利文件1)。但是，由于此类生理活性物质的纯化蛋白价格昂贵，所以该方法未得到广泛应用。

[0008] 另一方面，生物高分子例如明胶已被广泛用作医疗材料。由于近年来基因工程技术的进步，已通过将基因引入大肠杆菌或酵母中来合成蛋白质。通过这一方法已合成了各种类型的重组的胶原样蛋白(例如，专利文件2和3)。此类重组的胶原样蛋白比天然明胶更有利，因为它们具有非常出色的非感染性和均一性，以及由于已测定了它们的序列，因此可精确地设计其强度和降解性。然而，迄今为止提出的所述重组明胶的预期用途仅是用作天然明胶的替代材料。当然，所述重组明胶作为骨再生剂的预期用途仍是未知。

[0009] 现有技术文件

[0010] 专利文件

[0011] [专利文件1]日本专利公布(特开)No.2004-203829

[0012] [专利文件2]美国专利No.6,992,172

[0013] [专利文件3]WO 2008/103041

[0014] 非专利文件

[0015] [非专利文件1]Tabata等人,Biomaterials 19,807-815,1998。

[0016] [非专利文件2]Biomaterials 26:2501-2507,2005

[0017] [非专利文件3]Tabata等人,Journal of Neurosurgery 91,851-856,1999[0018] [非专利文件4]Ishii等人,Shika-i Tenbou(Prospects for Dentists),97(3),665-677,2001

[0019] [非专利文件5]J Neurosurg 91:851-856,1999

发明内容

[0020] 发明要解决的问题

[0021] 本发明要解决的问题是提供骨再生剂和骨补充制剂，其中补充材料自身能够促进骨再生。

[0022] 解决问题的手段

[0023] 本发明人为解决上述问题进行了深入的研究，结果发现，具有源自胶原的部分氨基酸序列的氨基酸序列的明胶，更优选重组明胶具有骨再生作用，由此实现本发明。

[0024] 因此，本发明提供包含具有源自胶原的部分氨基酸的氨基酸序列的明胶的骨再生剂。

[0025] 优选地，所述具有源自胶原的部分氨基酸的氨基酸序列的明胶是重组明胶。

[0026] 优选地，所述明胶包含胶原特征性的由Gly-X-Y表示的序列的重复并且分子量为2KDa-100KDa，其中X和Y各自独立地表示氨基酸并且多个Gly-X-Y序列可相同或不同。

[0027] 优选地，所述明胶包含胶原特征性的由Gly-X-Y表示的序列的重复并且分子量为10KDa-90KDa，其中X和Y各自独立地表示氨基酸并且多个Gly-X-Y序列可相同或不同。

[0028] 优选地，所述明胶包含胶原特征性的由Gly-X-Y表示的序列的重复并且在单个分子中具有两个或更多个细胞粘附信号序列，其中X和Y各自独立地表示氨基酸并且多个Gly-X-Y序列可相同或不同。

[0029] 优选地，所述细胞粘附信号序列是由Arg-Gly-Asp表示的氨基酸序列。

[0030] 优选地，所述明胶的氨基酸序列不包含丝氨酸和苏氨酸中的任何一种。

[0031] 优选地，所述明胶的氨基酸序列不包含丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸和半胱氨酸中的任何一种。

[0032] 优选地，所述明胶的氨基酸序列不包含由Asp-Arg-Gly-Asp表示的氨基酸序列。

[0033] 优选地，所述明胶由下式表示：

[0034] A-[(Gly-X-Y)n]m-B

[0035] 其中A表示任意氨基酸或氨基酸序列，B表示任意氨基酸或氨基酸序列，存在n个各自独立地由X表示的氨基酸，存在n个各自独立地由Y表示的氨基酸，n表示3-100的整数，m表示2-10的整数，并且n个Gly-X-Y可相同或不同。

[0036] 优选地，所述明胶由下式表示：

[0037] Gly-Ala-Pro-[(Gly-X-Y)63]3-Gly

[0038] 其中存在63个各自独立地由X表示的氨基酸，存在63个各自独立地由Y表示的氨基酸，并且63个Gly-X-Y可相同或不同。

[0039] 优选地，所述明胶具有以下(1)或(2)：

[0040] (1)SEQ ID NO:1中显示的氨基酸序列；或

[0041] (2)与SEQ ID NO:1中显示的氨基酸序列具有80％或更高的同源性并且具有骨再生作用的氨基酸序列。

[0042] 优选地，所述明胶是交联的。

[0043] 优选地，使用醛、缩合剂或酶进行所述交联。

[0044] 本发明还提供包含上述本发明的骨再生剂的骨补充制剂。

[0045] 本发明还提供诱导骨再生的方法，其包括向有骨再生需要的个体给药具有源自胶原的部分氨基酸的氨基酸序列的明胶。

[0046] 本发明还提供具有源自胶原的部分氨基酸的氨基酸序列的明胶用于制备骨再生剂或骨补充制剂的用途。

[0047] 发明效果

[0048] 本发明的骨再生剂无需使用生理活性物质例如血小板衍生生长因子或骨形态生成蛋白就能够通过补充材料自身表现出出色的骨再生作用。

[0049] 附图简述

[0050] [图1]图1是未处理的大鼠颅盖骨缺损模型的HE染色图像。

[0051] [图2]图2是显示重组明胶粉末被埋入缺损部位然后在患部形成骨的HE染色图像。

[0052] [图3]图3是显示源自猪的明胶粉末被埋入缺损部位的HE染色图像。

[0053] [图4]图4是显示胶原粉末被埋入缺损部位的HE染色图像。

[0054] [图5]图5是显示为不溶性基质的牛松质骨Bio-Oss(商品名，Osteohealth)被埋入缺损部位的HE染色图像。

[0055] [图6]图6显示R-Gel制剂和Teruplug的内部的电子显微照片。

[0056] [图7]图7显示大鼠颅骨缺损模型。左图：宏观照片。右图：μCT照片(Micro-CT image:Tissue Eng(2007)13(3):501-12)。

[0057] [图8]图8显示用于计算骨再生百分数(从病理标本分析)的方法。

[0058] [图9]图9显示大鼠颅骨缺损部位的骨再生百分数随时间的变化。R-Gel和动物明胶表现出高于Bio-Oss Cancellous和Teruplug的骨再生百分数。

[0059] [图10]图10显示将R-Gel和动物明胶移植入大鼠颅骨一个月和两个月后采集的病理标本照片(H&E染色)。R-Gel(上部的照片)和所述动物明胶(下部的照片)。移植后一个月，在所述R-Gel和所述动物明胶的表面出现了骨再生。移植后两个月，在R-Gel的周围部位出现骨再生，在这些部位中所述R-Gel已被细胞分解并且再生出具有一些空隙的骨。另一方面，在所述动物明胶周围部位观察到软纤维组织，在这些部位中所述动物明胶已被细胞分解，并且再生骨中包含大量的瘢痕性纤维组织。

[0060] [图11]图11显示移植填充物后即刻和两个月后拍摄的犬下颌前磨牙拔除模型的拔牙部位的宏观照片。

[0061] 发明的实施方式

[0062] 下文将详细描述本发明的实施方案。

[0063] 在本发明中，将具有源自胶原的部分氨基酸序列的氨基酸序列的明胶用作骨再生剂。本发明的骨再生剂的特征在于具有源自胶原的部分氨基酸序列的氨基酸序列的明胶自身表现出骨再生作用。因此，本发明的骨再生剂不必包含除所述具有源自胶原的部分氨基酸序列的氨基酸序列的明胶以外的具有骨再生作用的其他物质。因此，本发明的骨再生剂优选不包含除上述明胶以外的具有骨再生作用的其他物质。具体而言，本发明的骨再生剂优选由所述具有源自胶原的部分氨基酸序列的氨基酸序列的明胶组成。对所述胶原的类型没有特别的限制，只要其天然存在的。所述胶原的优选实例包括I型、II型、III型和V型胶原。所述胶原的更优选的实例包括I型、II型和III型胶原。在另一个实施方案中，所述胶原的优选来源是人、牛、猪、小鼠和大鼠。最优选人。

[0064] 对本文使用的明胶没有特别的限制，只要所述明胶具有源自胶原的部分氨基酸的氨基酸序列。优选地，所述明胶包含胶原特征性的Gly-X-Y。当比较明胶/胶原和其他蛋白质的氨基酸组成或序列时，所述GXY序列是胶原特征性的并且形成高度特异的部分结构。甘氨酸总共占所述部分结构的约三分之一。甘氨酸以每三个氨基酸中有一个甘氨酸的比率重复出现在所述氨基酸序列中。甘氨酸是最简单的氨基酸。甘氨酸的分子链的排列几乎不受限制，因此甘氨酸在明胶化时大大促进螺旋结构的再生。由X或Y表示的氨基酸富含亚氨基酸(脯氨酸或羟脯氨酸)，并且所述亚氨基酸总共占所述氨基酸序列的10％-45％。

[0065] 本发明中使用的明胶可为源自天然动物的明胶或可为重组明胶。当使用源自天然动物的明胶时，对所述明胶的来源没有特别的限制。所述来源可为任何动物，例如鱼、牛、猪或山羊。

[0066] 以上之中，优选所述具有源自胶原的部分氨基酸的氨基酸序列的明胶是重组明胶。由于所述重组明胶不是源自动物而是人工明胶，所以它是避免了外源性感染的高度生物相容的补充材料。

[0067] 可使用具有源自胶原的部分氨基酸序列的氨基酸序列的重组明胶作为可用于本发明的重组明胶。可使用的重组明胶的实例包括但不限于EP1014176A2、US6992172、WO2004-85473和WO2008/103041中记载的重组明胶。下文描述了优选用作本发明的重组明胶的重组明胶。

[0068] 用于本发明的重组明胶具有天然存在的明胶的原有性质并且因此是高度生物相容的。另外，所述重组明胶不是直接获自天然来源，因此不具有引起BSE等的风险。就此而言，它具有出色的非传染性性质。另外，用于本发明的重组明胶比天然存在的明胶更均质。而且，所述重组明胶具有预定的序列。因此，可通过下文描述的交联等方式几乎无误差地精确地设计所述重组明胶的强度和降解性。

[0069] 用于本发明的重组明胶的分子量优选为2KDa-100KDa，更优选2.5KDa-95KDa，进一步优选5KDa-90KDa，并且最优选10KDa-90KDa。

[0070] 优选地，用于本发明的重组明胶包含胶原特征性的由Gly-X-Y表示的序列的重复。其中，多个各自由Gly-X-Y表示的序列可相同或不同。Gly-X-Y中的Gly表示甘氨酸。Gly-X-Y中的X和Y表示任意氨基酸(并且优选除甘氨酸以外的任意氨基酸)。当比较明胶/胶原和其他蛋白质的氨基酸组成或序列时，所述GXY序列是胶原特征性的并且形成高度特异的部分结构。甘氨酸总共占所述部分结构的约三分之一。甘氨酸以每三个氨基酸中有一个甘氨酸的比率重复出现在所述氨基酸序列中。甘氨酸是最简单的氨基酸。甘氨酸的分子链的排列几乎不受限制，因此甘氨酸在明胶化时后大大促进螺旋结构的再生。优选地，由X或Y表示的氨基酸富含亚氨基酸(脯氨酸或羟脯氨酸)，并且所述亚氨基酸总共占所述氨基酸序列的
10％-45％。形成所述GXY重复结构的氨基酸优选总共占所述氨基酸序列的80％或更多，更优选95％或更多，并且最优选99％或更多。

[0071] 通常可用的明胶包含比例为1:1的带电荷的极性氨基酸和不带电荷的极性氨基酸。本文中，术语“极性氨基酸”具体指半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或精氨酸。特别地是，术语“不带电荷的极性氨基酸”指半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸。极性氨基酸相对于构成用于本发明的重组明胶的所有氨基酸的百分数是10％-40％并且优选20％-30％。另外，不带电荷的极性氨基酸相对于所述极性氨基酸的百分数优选为5％至低于20％并且更优选低于10％。另外，所述氨基酸序列不包含一种并且优选不包含两种或多种选自丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸和半胱氨酸的氨基酸。

[0072] 一般而言，已知多肽包含充当细胞粘附信号的最小氨基酸序列(例如，"Pathophysiology"(Byotai Seiri)Vol.9,No.7(1990),p.527,Nagai Shoten Co.,Ltd.)。用于本发明的重组明胶的单个分子优选具有至少两个细胞粘附信号序列。具体而言，用单字母符号表示细胞粘附信号序列中的氨基酸。鉴于粘附细胞种类的增加，此类序列的实例为：优选RGD序列、LDV序列、REDV序列、YIGSR序列、PDSGR序列、RYVVLPR序列、LGTIPG序列、RNIAEIIKDI序列、IKVAV序列、LRE序列、DGEA序列和HAV序列，更优选RGD序列、YIGSR序列、PDSGR序列、LGTIPG序列、IKVAV序列和HAV序列；并且特别优选RGD序列。在所述RGD序列中，优选ERGD序列。

[0073] 对于用于本发明的重组明胶中的RGD序列的排列，两个RGD序列之间存在的氨基酸的数量优选为0-100并且更优选25-60。优选地，所述氨基酸数量不是被均一地决定的。

[0074] 考虑到细胞粘附/生长，一个蛋白质分子中此类最小氨基酸序列的数量优选为3-50个，更优选4-30个，特别优选5-20个，并且最优选12个。

[0075] 用于本发明的重组明胶中的RGD基序相对于氨基酸总数的百分数优选为至少0.4％。如果所述重组明胶包含350个或更多个氨基酸，则由350个氨基酸组成的各段优选包含至少一个RGD基序。RGD基序相对于氨基酸总数的百分数更优选为至少0.6％，进一步优选至少0.8％，更进一步优选至少1.0％，甚至进一步优选至少1.2％，并且最优选至少1.5％。
所述重组明胶中GRD基序的数量为每250个氨基酸优选至少4个，更优选6个，进一步优选8个并且甚至进一步优选12-16个。0.4％的GRD基序百分数相当于每250个氨基酸至少一个RGD序列。RGD基序的数量由整数来表示。因此，为了达到0.4％的RGD基序百分数，包含251个氨基酸的明胶必须包含至少两个RGD序列。优选地，在本发明的重组明胶中，每250个氨基酸包含至少2个RGD序列，更优选每250个氨基酸包含至少3个RGD序列，并且进一步优选每250个氨基酸包含至少4个RGD序列。在另一个实施方案中，本发明的重组明胶包含至少4个，优选6个，更优选8个并且进一步优选12-16个RGD基序。

[0076] 另外，所述重组明胶可以被部分地水解。

[0077] 优选地，用于本发明的重组明胶具有包含重复的A-[(Gly-X-Y)n]m-B的结构。在此，“m”是优选为2-10并且更优选为3-5的整数。另外，“n”是优选为3-100，更优选15-70，并且最优选50-65的整数。

[0078] 优选地，多个天然存在的胶原序列单元结合形成重复单元。本文使用的术语“天然存在的胶原”可指任何天然存在的胶原。然而，其优选的实例包括I型、II型、III型、IV型和V型胶原。更优选使用I型、II型和III型胶原。在另一个实施方案中，此类胶原的来源优选是人、牛、猪、小鼠或大鼠，并且所述来源更优选是人。

[0079] 用于本发明的重组明胶的等电点优选为5-10，更优选6-10并且进一步优选7-9.5。

[0080] 优选地，所述重组明胶是脱氨的。

[0081] 优选地，所述重组明胶不是前胶原或者不包含前胶原。

[0082] 优选地，所述重组明胶不包含端肽。

[0083] 优选地，所述重组明胶是从编码天然存在的胶原的核酸制备的基本上纯的胶原材料。

[0084] 特别优选的是，用于本发明的重组明胶是具有以下(1)或(2)的重组明胶：

[0085] (1)SEQ ID NO:1中显示的氨基酸序列；或

[0086] (2)与SEQ ID NO:1中显示的氨基酸序列具有80％或更高、更优选90％或更高并且最优选95％或更高的同源性并且具有骨再生作用的氨基酸序列。

[0087] 可通过本领域技术人员已知的基因重组技术制备用于本发明的重组明胶。例如，可根据EP1014176A2、US6992172、WO2004/85473或WO2008/103041中记载的方法来制备用于本发明的重组明胶。具体而言，通过获得编码预定的重组明胶的氨基酸序列的基因，将所述基因插入表达载体以制备重组表达载体，并且将所述载体引入适合的宿主中，来制备转化体。在适合的培养基中培养所获得的转化体以制备重组明胶。因此，可通过从培养产物中收集产生的重组明胶来制备用于本发明的重组明胶。

[0088] 可根据用于本发明的重组明胶的用途将其化学改性。可通过将低分子量化合物或不同的高分子(例如生物高分子(糖或蛋白质)、合成的高分子或聚酰胺)引入所述重组明胶的侧链的羧基或氨基中，或使重组明胶链之间交联来进行化学改性。例如，使用碳二亚胺系缩合剂向所述明胶中引入低分子量化合物。

[0089] 对用于本发明的交联剂没有特别的限制，只要能够实施本发明。它可为化学交联剂或酶。化学交联剂的实例包括甲醛、戊二醛、碳二亚胺和氨腈。优选使用甲醛或戊二醛。另外，可通过对其中引入了光反应性基团的明胶进行光照、在光敏剂的存在下进行光照等进行明胶交联。光反应性基团的实例包括肉桂基、香豆素基、二硫代氨甲酰基、呫吨染料和樟脑醌。在上述交联剂中，最优选戊二醛。

[0090] 在进行酶法交联的情况下，对所使用的酶没有特别的限制，只要其具有引起明胶链之间交联的作用。然而，可优选使用转谷氨酰胺酶或漆酶并且最优选使用转谷氨酰胺酶进行交联。通过转谷氨酰胺酶被酶法交联的蛋白质的实例包括但不特别限于具有赖氨酸残基和谷氨酰胺残基的蛋白质。可使用源自哺乳动物或源自微生物的转谷氨酰胺酶。其具体的实例包括：Activa系列(由Ajinomoto Co.,Inc.生产)；作为试剂的可商购的源自哺乳动物的转谷氨酰胺酶，例如源自豚鼠肝脏的转谷氨酰胺酶、源自山羊的转谷氨酰胺酶和源自家兔的转谷氨酰胺酶(由Oriental Yeast Co.,Ltd.,Upstate USA Inc.,Biodesign International等生产)；以及源自人的凝血因子(因子XIIIa，Haematologic Technologies,Inc.)。

[0091] 所述明胶的交联包括以下两个步骤：混合明胶溶液和交联剂的步骤；和在所获得的均质溶液中引起反应的步骤。

[0092] 根据本发明，只要能够将所述溶液搅拌均匀，则对用交联剂处理所述明胶的混合温度没有特别的限制。然而，所述混合温度优选为0℃-40℃，更优选0℃-30℃，进一步优选3℃-25℃，更进一步优选3℃-15℃，甚至进一步优选3℃-10℃，并且特别优选3℃-7℃。

[0093] 将所述明胶和所述交联剂搅拌后，可升高所述温度。只要能够进行交联，则对所述反应温度没有特别的限制。然而，考虑到所述明胶的变性或降解，所述反应温度基本为0℃-60℃，优选0℃-40℃，更优选3℃-25℃，进一步优选3℃-15℃，更进一步优选3℃-10℃，并且特别优选3℃-7℃。

[0094] 在本发明中，向有骨再生需要的个体(例如，诸如人的哺乳动物)给药上述具有源自胶原的部分氨基酸序列的氨基酸序列的明胶，从而可诱导骨再生。

[0095] 本发明的骨再生剂可用作骨补充制剂。

[0096] 可根据预期用途适当地确定本发明的骨再生剂和骨补充制剂的剂量、用法和剂型。例如，可将本发明的骨再生剂直接给药于活体内的目标部位。或者，可将本发明的骨再生剂悬浮在包含水性溶剂例如注射用蒸馏水、注射用生理盐水或pH 5-8的缓冲液(磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液等)的液体赋形剂中，然后可通过注射、涂布等方式将其给药。而且，可将本发明的骨再生剂与适合的赋形剂混合从而制备软膏剂、凝胶剂、乳膏剂等，然后将其施用。换言之，本发明的骨再生剂的给药形式可为口服给药或肠胃外给药(例如，静脉内给药、肌内给药、皮下给药、皮内给药等)。

[0097] 本发明的骨再生剂的剂型的实例包括：口服给药剂，例如片剂、散剂、胶囊剂、颗粒剂、浸膏剂或糖浆剂；和肠胃外给药剂，例如注射剂(例如，静脉注射剂、肌内注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂等)。

[0098] 优选地，可将本发明的骨再生剂和骨补充制剂直接给药于活体内的骨缺损部位。因此，当局部给药本发明的骨再生剂时，对其形式无特别的规定。所述形式的实例包括海绵、薄膜、无纺布、纤维(管)、颗粒和网。

[0099] 可根据本领域技术人员已知的方法制备本发明的骨再生剂和骨补充制剂。例如，当药物载体是液体时，可将本发明的骨再生剂和骨补充制剂溶于或分散于所述液体中。另一方面，当药物载体是粉末时，可使本发明的骨再生剂和骨补充制剂与所述粉末混合或吸附于其上。另外，必要时，本发明的骨再生剂和骨补充制剂还可包含药学可接受的添加剂(例如，防腐剂、稳定剂、抗氧化剂、赋形剂、粘合剂、崩解剂、润湿剂、润滑剂、着色剂、芳香剂、矫味剂、包衣、助悬剂、乳化剂、增溶剂、缓冲剂、等渗剂、增塑剂、表面活性剂、无痛剂等)。

[0100] 对所述明胶的剂量没有特别的限制。例如，所述剂量为每cm2被给药所述明胶的活体的表面积1-100mg，并且优选1-50mg。

[0101] 给药本发明的骨再生剂和骨补充制剂的目标疾病的实例包括由外伤引起的骨缺损、口腔外科疾病、骨质疏松和关节病。

[0102] 在以下实施例中更具体地描述本发明。但是这些实施例不限制本发明的范围。实施例

[0103] 制备下文描述的重组明胶CBE3(WO2008-103041)。

[0104] CBE3

[0105] 分子量：51.6kD

[0106] 结构：Gly-Ala-Pro[(Gly-X-Y)63]3Gly

[0107] 氨基酸数量：571

[0108] RGD序列数量：12

[0109] 亚氨基酸含量：33％

[0110] 基本100％的氨基酸形成所述Gly-X-Y重复结构。

[0111] CBE3的氨基酸序列不包含丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸和半胱氨酸中的任何一种。

[0112] CBE3具有ERGD序列。

[0113] 等电点：9.34

[0114] 氨基酸序列(序列列表中的SEQ ID NO:1)(该氨基酸序列对应WO2008/103041中的SEQ ID NO:3中显示的氨基酸序列。注意末尾的“X”被更正为“P”)。

[0115] GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G

[0116] 在以下所述的实施例中，除非另外指明，将上述CBE3用作重组明胶(将其称作R-Gel)。

[0117] 实施例1：

[0118] (1)制备重组明胶凝胶

[0119] 向10％重组明胶水溶液中加入3％戊二醛，至量为总量的1/10量。戊二醛的终浓度为0.3％。将通过搅拌如此制备的溶液获得的混合溶液倾倒入硅框(30mm长×30mm宽×2mm高)中，然后将其在室温下静置2小时。接着，将所得物于4℃静置12小时，从而获得化学交联的明胶片。将该明胶片在过量的甘氨酸水溶液中浸渍1小时，使未反应的戊二醛或醛基失活。接着，用蒸馏水将所得物洗涤两次，然后冻干，从而获得交联的重组明胶凝胶。用粉碎机New Power Mill(Osaka Chemical Co.,LTD.)处理冻干的重组明胶凝胶从而获得粉末。用环氧乙烷气体将获得的粉末灭菌，然后用作动物实验中的样本。

[0120] (2)在大鼠顶骨缺损部位中诱导骨再生的实验

[0121] 将10只SD大鼠(雄性，10-12周龄，0.3-0.5kg)用作实验动物。向每一只大鼠腹腔内给药0.8ml/kg戊巴比妥(Nembutal(注册商标),Dainippon Sumitomo Pharma Co.,Ltd.)将它们麻醉。暴露每一只大鼠的顶骨，制成直径为5mm的圆形骨缺损部位。向由此制成的骨缺损部位填入约10mg灭菌的重组明胶凝胶，然后将皮肤缝合。

[0122] 实验标准组

[0123] 组1：仅缺损

[0124] 组2：重组明胶凝胶(约10mg)

[0125] 组3：源自猪的明胶(高级明胶，类型：APTA，Nippi Inc.)(约10mg)

[0126] 组4：胶原(Teruplug(商品名)粉碎制品，Olympus Terumo Biomaterials Corp.)(约10mg)

[0127] 组5：牛松质骨(Bio-Oss(商品名)，Osteohealth)(约20mg)

[0128] 在进行手术后第4周，在戊巴比妥麻醉下放血处死大鼠，并切除其头部。用HE染色对包括埋入部位的顶骨进行组织学观察。

[0129] (4)结果

[0130] 第1-5组的观察结果显示于图1-5中。在使用源自猪的明胶和重组明胶的情况中观察到显著的骨形成诱导(图2和图3)。胶原或单独使用不溶性基质均不促进骨形成(图4和5)。但是，使用包含大量RGD基序的本发明的重组明胶时，通过单独使用目前为止不可能形成骨的骨补充材料在大鼠的顶骨缺损部位观察到骨形成(图2)。该结果证明无需使用可能引起副作用的生理活性物质例如BMP即可实现有效的骨形成。

[0131] 实施例2：制备重组明胶(R-Gel)和动物明胶制剂

[0132] 充分搅拌包含R-Gel或动物明胶(APAT,由Nippi Inc.生产,浓度：7.5％)和戊二醛(GA,0.3％)的水溶液(pH 6)，并在形成气泡的同时将该溶液搅拌3分钟。将获得的含有无数气泡的溶液于4℃静置过夜，从而获得包含大量气泡的凝胶状固体。用0.1M甘氨酸水溶液将获得的凝胶洗涤两次，使未反应的甘氨酸失活，然后用水将所得物洗涤四次。将已用水洗涤的凝胶冻干以获得海绵状的R-Gel和明胶凝胶。用研磨机粉碎该海绵从而获得颗粒大小约数百μm的海绵状颗粒。在扫描电子显微镜下观察所述颗粒和Teruplug的内部结构。结果发现它们具有相同的多孔结构(图6)。

[0133] 将所述海绵状颗粒的经环氧乙烷灭菌的产品用于下文的效力评价。将通过GA交联的R-Gel和动物明胶各自移植到大鼠或犬中，并且接着评价其效力。

[0134] 实施例3：制备大鼠颅骨缺损模型

[0135] 为了评价R-Gel的骨再生能力，使用被用作骨再生能力评价系统的大鼠颅骨缺损模型(Tissue Eng(2007)13(3):501-12)。颅骨具有与牙槽骨相同的骨形成过程(膜内骨化)。因此，通常将颅骨用于牙科骨补充剂的评价。

[0136] 将Sprague-Dawley大鼠(SD大鼠，雄性，10-12周龄)麻醉，并用钻头(Osada Success 40,Osada Electric Co.,Ltd.)在右侧顶骨内制成圆形的缺损部位(直径＝5mm)(图7)。通过用生理盐水洗涤来除去缺损部位中存在的影响骨再生的骨碎片和血，然后将患部皮肤缝合。在预定的时间段(3周、1个月、2个月和3个月)后，通过剖腹术和放血将大鼠处死。用肉眼观察每一只大鼠的缺损部位，并用福尔马林固定头部并脱钙。然后用苏木精和伊红(H&E)将通过将包埋在石蜡中的组织块切片获得的切片染色，从而制备标本。在光学显微镜下观察病理标本，并将新生骨与缺损部位的比定义为骨再生百分数(图8)。在本文中，使用这样的骨再生百分数评价所述制剂的骨再生能力。

[0137] 当观察骨缺损部位时，每一只大鼠的缺损部位略微中凹，并且几乎整个缺损部位都被软组织覆盖。在切割部位的周围观察到少量的似乎为新生骨(再生骨)的白色固体部分。当进行手术后一个月在光学显微镜下观察该标本时，约30％的缺损部位被薄的肉芽组织覆盖，并且在约10％的缺损部位观察到来自既有骨的骨再生。骨再生百分数随时间推移增加。但是，即使在进行手术后3个月，再生骨的百分数为约30％。再生骨的量与文献的数据一致(3个月的骨再生百分数：约30％)(Tissue Eng(2007)13(3):501-12)，因此，我们考虑可构建一个模型系统。

[0138] 实施例4：评价大鼠颅骨缺损部位的骨再生百分数

[0139] 分别将R-Gel制剂、动物明胶制剂、Teruplug(Olympus Terumo Biomaterials Corp.)和Bio-Oss Cancellous(0.25-1mm,Osteohealth)移植入实施例3中制成的大鼠颅骨缺损部位。在剂型均为颗粒剂的R-Gel、动物明胶和Bio-Oss Cancellous上均放置胶原膜(BioGide,Osteohealth)，从而防止颗粒从患部散失。将未在患部施用任何物质的组定义为对照。

[0140] 施用了Bio-Oss Cancellous的患部的骨再生百分数是与对照相同的水平，并且其在进行手术后3个月仍为约30％。在施用了为胶原海绵的Teruplug的情况中，随着时间的推移出现了骨再生，并且在进行手术后三个月约60％的患部被再生骨修复(图9)。另一方面，在R-Gel和动物明胶的情况中，直到移植后1个月，骨再生以与Teruplug相同的水平进行，但是之后它们的骨再生水平变得高于Teruplug，并且在移植后三个月约90％的患部被再生骨修复(其中骨再生百分数是Teruplug的1.5倍高)。因此，可以认为R-Gel和动物明胶海绵状颗粒具有高于Teruplug的骨再生能力。

[0141] 实施例5：分析使用动物明胶和R-Gel的病理标本

[0142] 为了更详尽地分析使用动物明胶(明胶)和重组明胶(R-Gel)实现的骨再生，分析了每一种基质材料周围的组织的形式和再生骨的组织(图10)。在移植后一个月，在R-Gel和明胶基质材料二者的表面均发现大量的成骨细胞并且发现了新生骨。因此，未发现两种基质材料的组织图像之间的显著差异。

[0143] 在移植后两个月，在R-Gel和新生骨之间形成的空隙中观察到存在大量的成骨细胞、R-Gel被这些细胞分解以及形成具有少量缺损的新生骨。另一方面，在动物明胶和新生骨之间的交界处，观察到大量的成纤维细胞、纤维软组织的形成以及包含大量瘢痕性纤维组织的新生骨。换言之，R-Gel再生的骨比通过动物明胶再生的骨更致密。

[0144] 实施例6：制备犬牙槽保护模型

[0145] 根据前人报道(AraujoM等人.Int.J.Periodontics Restorative Dent.28,123-135,2008.)制备模型。在麻醉的情况下，用聚烯吡酮碘溶液将比格犬的口腔消毒，并用裂钻将两下颌骨的第二前磨牙(P2)和第三前磨牙(P3)的中间切割开。用手术刀切断远侧牙齿周围的牙周膜，并用牙钳和牙挺拔除远侧的牙齿。将浸渍于10倍稀释的肾上腺素注射液(Bosmin injection 1mg/mL,Daiichi Sankyo Co.,Ltd.)中的棉塞填入拔牙部位(拔牙后会形成窝)用于止血。用扩孔钻清除近侧剩余牙齿的牙髓，然后用Gutta-percha填塞牙髓腔，然后用将其用牙髓管封闭剂封闭。

[0146] 实施例7：在犬模型中评价效力

[0147] 用BioOss Cancellous(0.25-1mm,Osteohealth)、Teruplug(Olympus Terumo Biomaterials Corp.)、R-Gel或动物明胶填充实施例6中制成的拔牙部位，直至牙槽骨顶部。在填充物(除Teruplug以外)和牙龈之间放置胶原膜(Biogide,Osteohealth)。在对照中未放置此类填充物和膜。

[0148] 在填充拔牙部位两个月后检测拔牙部位牙龈的厚度(图11)。结果，在未处理的对照中，牙龈厚度降低。在移植入BioOss Cancellous的部位，牙龈厚度得到保持。在移植入Teruplug的部位，牙龈厚度略微降低。相反，在移植入R-Gel的部位，牙龈厚度保持在与BioOss相同的水平。换言之，R-Gel表现出高于Teruplug的效力。

标题	发布/更新时间	阅读量
骨质再生丸-专利编号CN1095600A	2020-05-12	801
骨再生材料-专利编号CN1246048C	2020-05-11	535
骨再生胶囊-专利编号CN1481859A	2020-05-11	140
骨再生剂-专利编号CN110678179A	2020-05-11	897
骨再生材料-专利编号CN110267688A	2020-05-11	466
骨再生用组合物-专利编号CN103957952B	2020-05-12	188
再生骨料混凝土-专利编号CN101671147A	2020-05-13	560
骨再生材料-专利编号CN1447702A	2020-05-12	367
再生性骨植入物-专利编号CN1440731A	2020-05-13	284
再生性骨植入物-专利编号CN1268307C	2020-05-13	253

包含明胶的骨再生剂

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