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改良的凝血因子调节物

阅读：738发布：2021-02-24

IPRDB可以提供改良的凝血因子调节物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供抑制凝血的改良核酸配体和核酸的改良调节物，以提供理想的凝血调节物。这些改良的核酸和调节物尤其用于在经受治疗方案(例如手术或冠状动脉搭桥术)的宿主中抑制凝血。，下面是改良的凝血因子调节物专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种分离的核酸配体，其核酸序列如SEQ ID NO:17所示。

2.权利要求1的核酸配体，其中SEQ ID NO：17所示的核酸配体如SEQ ID NO:34－37所示进行修饰。

3.权利要求1的核酸配体，其中SEQ ID NO：17所示的核酸配体如SEQ ID NO:41－49所示进行修饰。

4.权利要求1的核酸配体，其中SEQ ID NO：17所示的核酸配体如SEQ ID NO:50－54所示进行修饰。

5.权利要求1的核酸配体，其中SEQ ID NO：17所示的核酸配体如SEQ ID NO:34所示进行修饰。

6.权利要求1的核酸配体，其中SEQ ID NO：17所示的核酸配体如SEQ ID NO:37所示进行修饰。

7.权利要求1的核酸配体，其中所述核酸配体用至少一种水溶性聚合物修饰。

8.权利要求7的核酸配体，其中所述水溶性聚合物为聚乙二醇。

9.权利要求7的核酸配体，其中所述水溶性聚合物为40kD聚乙二醇。

10.一种分离的核酸，其与SEQ ID NO：17的核酸配体中至少6-25个核苷酸互补，其中所述核酸是SEQ ID NO:8所示的核酸序列。

11.一种药物组合物，所述组合物包含有效量的核酸配体连同药物可接受的载体，所述核酸配体的核酸序列如SEQ ID NO:17所示。

12.权利要求11的药物组合物，其中SEQ ID NO：17所示的核酸如SEQ ID NO:34－37所示进行修饰。

13.权利要求11的药物组合物，其中SEQ ID NO：17所示的核酸如SEQ ID NO:41－49所示进行修饰。

14.权利要求11的药物组合物，其中SEQ ID NO：17所示的核酸如SEQ ID NO:50－54所示进行修饰。

15.权利要求11的药物组合物，其中SEQ ID NO：17所示的核酸如SEQ ID NO:37所示进行修饰。

16.权利要求11的药物组合物，其中SEQ ID NO：17所示的核酸如SEQ ID NO:34所示进行修饰。

17.权利要求11的药物组合物，其中所述核酸配体序列用水溶性聚合物修饰。

18.权利要求17的药物组合物，其中所述聚合物为聚乙二醇。

19.权利要求18的药物组合物，其中所述聚乙二醇是40kD聚乙二醇。

20.一种药物组合物，所述组合物包含有效量的核酸连同药物可接受的载体，所述核酸与SEQ ID NO：17的核酸配体中至少6-25个核苷酸互补，其中所述核酸是SEQ ID NO:8所示的核酸序列。

21.权利要求11或20的组合物，其中所述组合物适于全身给予。

22.权利要求11或20的组合物，其中所述组合物适于静脉内给予。

23.权利要求11或20的组合物，其中所述组合物适于口服给予。

24.权利要求11或20的组合物，其中所述组合物适于胃肠外给予。

25.有效量的核酸配体在生产药物中的用途，所述核酸配体的核酸序列如SEQ ID NO:17所示，所述药物用于在有需要的宿主中抑制凝血。

26.有效量的结合SEQ ID NO：17的核酸配体的核酸在生产药物中的用途，所述核酸是SEQ ID NO:8所示的核酸序列，所述药物通过所述SEQ ID NO：17的核酸配体在有需要的宿主中逆转凝血抑制。

27.权利要求25或26的用途，其中SEQ ID NO：17所示的核酸配体如SEQ ID NO:37所示进行修饰。

28.权利要求25或26的用途，其中所述宿主经受治疗方案。

29.权利要求25或26的用途，其中所述宿主经受手术干预。

30.权利要求25或26的用途，其中所述宿主患有心血管疾病或干预或处于心血管疾病或干预风险中。

31.权利要求25或26的用途，其中所述宿主患疾病或处于患病风险中，所述疾病选自急性心肌梗死、脑血管意外、局部缺血、血管成形术、冠状动脉旁路移植术、心肺分流术、在心脏旁路装置的循环中或在经受肾透析的患者中的血栓形成、不稳定心绞痛、肺栓塞、深静脉血栓形成、动脉血栓形成和弥漫性血管内凝血。

32.权利要求25或26的用途，其中所述宿主患心脏病发作或中风，或处于患心脏病发作或中风的风险中。

33.有效量的核酸配体在生产药物中的用途，所述核酸配体的核酸序列如SEQ ID NO:17所示，所述药物用于预防凝血诱发的炎症。

34.权利要求33的用途，其中所述凝血诱发的炎症与选自以下的疾病相关：动脉粥样硬化、急性冠状动脉综合症、心肌梗死、再灌注损伤和血管成形术后再狭窄。

说明书全文

改良的凝血因子调节物

[0001] 本申请是申请号为200580019913.7(国际申请号为PCT/US2005/013926)、申请日为2005年4月22日、发明名称为“改良的凝血因子调节物”的中国专利申请的分案申请。发明领域

[0002] 本申请要求2004年4月22日提交的美国临时申请第60/564,873号的优先权。

[0003] 本发明是改良药物、组合物以及用核酸配体(例如适体)调节凝血因子药理学活性的方法。

背景技术

[0004] 尽管治疗和预防血栓形成事件相当努力，但动脉血栓形成仍旧是发达国家成年人群的主要死因。虽然存在众多治疗血栓形成的医疗策略，但没有药物能满足生物利用度和效力二者的治疗终点，同时又具有合理的安全特性(参见Feuerstein等(1999)Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.19:2554-2562)。

[0005] 在正常环境下，对铺衬血管的血管内皮细胞的伤害通过一系列通常称为凝血“级联”的事件触发止血反应。级联最终将可溶性纤维蛋白原转变成不溶性纤维蛋白，其与血小板一起形成局部凝块或血栓，阻止血管外释放血液组分。然后，可发生伤口愈合，接着凝块溶解，并恢复血管完整性和流量。

[0006] 凝血的发生起因于两个不同的途径：内在途径和外在途径。可通过使血液携带的因子接触人造负电荷表面(如玻璃)体外触发内在途径。相反，当受伤后一般与循环系统隔绝的组织因子(TF)开始接触血液时，可体内或体外启动外在途径。接触血液的TF作为VIIa因子(“FVIIa”)的辅因子，催化IX因子(“FIX”)和X因子(“FX”)活化。这导致快速形成FXa和凝血酶，其随后聚合，形成纤维蛋白凝块。内在途径和外在途径二者的特征在于在前凝血剂表面上组装多种蛋白复合物，这使对伤害部位的反应局部化(参见Mann,K.G.等(1990)Blood 76:1)。

[0007] 抗凝疗法

[0008] 香豆素药物，例如华法林以及糖胺聚糖、肝素和硫酸乙酰肝素，经常用作抗凝血剂。华法林是一种香豆素衍生物，通过与凝血酶原和其它维生素K依赖性凝血因子的维生素K依赖性翻译后修饰竞争起作用。其作用比肝素稍微慢，持久作用稍微长。香豆素药物通过抑制凝血酶与VII、IX和X因子以及蛋白C和S的功能所必需的维生素K依赖性羧化反应来抑制凝血。这些药物通过抑制维生素K的醌衍生物还原为其活性氢醌形式而起作用。因为香豆素药物的作用模式，所以实现其最大作用需要几天。肝素结合并活化抗凝血酶III，其然后抑制凝血级联的丝氨酸蛋白酶。肝素和LMW肝素部分地由于其效力而存在缺点。在达7%的接受持续输注的患者中和达14%的给予间歇性推注单次剂量的患者中，观察到的主要并发症是不受控的出血。达到效力而没有置患者于出血风险的治疗范围狭窄，约1至小于3μg肝素/ml血浆。在4μg/ml以上的肝素浓度未检测到凝血活性。因此，必须非常小心地将患者的血浆浓度保持在治疗范围内。

[0009] 有些团队使用凝血因子抗体调节凝血级联。例如授予ScheringAktiengesellschaft的PCT公开号WO 03/093422公开了以比对单独组织因子(TF)大的亲和力结合VIIa因子/组织因子(FVIIa/TF)复合物的抗体。宣称这些抗体不与VII因子和X因子竞争结合组织因子，并抑制FX活化。

[0010] 授予Hamilton Civic Hospitals Research Development Inc.的美国专利第6,001,820号提供了肝素辅因子II特异性催化剂，其能够(1)选择性失活结合凝块中纤维蛋白或某些其它表面的凝血酶，但对游离凝血酶仅具有最小抑制活性；(2)抑制内在Tenase复合物组装，和由此的通过IXa因子活化X因子；和(3)抑制通过XIa因子活化IX因子。

[0011] 适体

[0012] 常规上一般认为核酸在生物过程中主要起提供信息的作用。在过去的十年，已经清楚核酸的三维结构可带给其与蛋白相互作用并调节蛋白的能力。这种核酸配体或“适体”是可以高亲和性和特异性结合特定配体的短DNA或RNA寡聚体。作为一个类别，适体的三维结构是充分可变的，以允许适体结合和充当实际上任意化合物的配体，无论是单体还是聚体。适体已显现为有前景的新诊断和治疗化合物，特别是在癌症治疗和凝血调节中。

[0013] 可通过称为指数富集配体系统进化(SELEX)的方法的相关方法鉴别核酸配体。SELEX包括由候选寡核苷酸混合物中选择结合蛋白的核酸，并逐步地叠代结合、分配和扩增，以达到需要的结合亲和性和选择性标准。SELEX法首先由Gold和Tuerk描述于美国专利第5,475,096号，此后描述于美国专利第5,270,163号(另参见WO 91/19813；Tuerk等(1990)Science 249:505-10)。

[0014] 许多第三方已申请和保护覆盖适体鉴别、生产和使用的专利。如上所述，一般把分离适体的SELEX法的首先开发归功于Gold和Tuerk，其方法在许多美国专利中都有描述，包括美国专利第5,670,637、5,696,249、5,843,653、6,110,900和5,270,163号。Thomas Bruice等在美国专利第5,686,242号中报道了适体生产方法，该方法与Tuerk和Gold报道的原型SELEX法不同，因为其在序列筛选过程中使用严格随机寡核苷酸。在‘242专利中筛选的寡核苷酸没有在SELEX法筛选的寡核苷酸中存在的寡核苷酸引物。

[0015] 几个授予Gold等的专利包含覆盖凝血酶适体的权利要求。例如，美国专利第5,670,637号包含覆盖结合蛋白的适体的权利要求。美国专利第5,696,249号要求保护通过SELEX法生产的适体。授予O’Toole的美国专利第5,756,291和5,582,981号公开并要求保护一种使用含限定6核苷酸序列的标记适体检测凝血酶的方法。美国专利第5,476,766和6,177,557号公开了使用SELEX鉴别凝血酶的核酸配体溶液的化合物和方法。

[0016] Sullenger,Rusconi,Kontos和White在WO 02/26932中描述了与在止血和其它生物事件的调节中有用的凝血因子、E2F家族转录因子、Ang1、Ang2及其片段或肽、转录因子、自身免疫抗体和细胞表面受体结合的RNA适体。另参见Rusconi等,Thrombosis and Haemostasis 83:841-848(2000),White等,J.Clin Invest 106:929-34(2000),Ishizaki等,Nat Med 2:1386-1389(1996)和Lee等,Nat.Biotechnol.15:41-45(1997))。

[0017] 适体的调节

[0018] 授予Duke University的PCT公开号WO 02/096926描述了通过给予调节剂调节核酸配体生物活性的物质和方法。说明书描述了由可为核酸的调节物控制的适体。据描述，可调节适体可用于治疗其中抑制凝血、延伸因子2活性或血管生成很重要的疾病。控制凝血的可调节适体包括凝血因子VII或VIIa、VIII或VIIIa、IX或IXa、V或Va、X或Xa、与这些因子形成的复合物以及血小板受体的适体。调节物可改变核酸配体对其靶的结合，降解或以其它方式切割、代谢或分解核酸配体，同时配体发挥其作用。调节物可基于各种因素按照需要实时给予，这些因素包括患者的病情发展以及医师对如何实现最佳治疗的判断。

[0019] 最大化适体的应用

[0020] 为了使适体成为有用的治疗剂，其应当紧密结合蛋白、抑制该蛋白的特定功能(如果需要拮抗剂的话)以及没有有害的副作用。未修饰的RNA实际上不能用作治疗剂，因为血液富含核糖核酸酶。对单链RNA和DNA的某些修饰可产生在血液中稳定的分子，某些已知适体在各个嘧啶核苷酸中具有2'F或2'NH2基团。

[0021] 但是，没有手段来预测具体的修饰如何改变适体。具体地说，当需要额外限制时(可调节适体的情况就是这样)，没有技术来预测一种或多种修饰如何可影响适体调节其配体的能力，同时继续受解毒剂结合的调节。

[0022] 适体成功用作治疗剂不仅取决于其效力和特异性，而且取决于经济性。由目前可用适体的最成功的动物实验外推，1-2mg/kg体重的适体剂量通常是有效剂量(源自对抑制VEGF、PDGF、L-选择蛋白和P-选择蛋白的适体进行的实验)。对于70kg的成年人，这意味着每次注射剂量应为70-140mg。对于急性适应症，例如器官移植、心肌梗死、中毒性或脓毒性休克、血管成形术或肺栓塞，15天中每3天治疗一次会涉及$700-$1400的药物成本。显然，对于慢性适应症，药物成本是个问题。因此，有需要降低适体的生产成本。

[0023] 已开发了几种方法来改良基础SELEX方法，以获得修饰的适体。例如，专利公开了在SELEX法中使用修饰的核苷酸，以获得表现出改良特性的适体。美国专利第5,660,985号提供了宣称表现出增强的体内稳定性的2′-修饰核苷酸。美国专利第6,083,696号公开了“混合的”SELEX法，其中筛选共价连接至非核酸功能单位的寡核苷酸结合靶分子的能力。其它专利描述了对适体的SELEX后修饰，以降低其大小、增加其稳定性或增加靶结合亲和性(参见例如美国专利第5,817,785和5,648,214号)。

[0024] 在美国专利第5,245,022号中，Weis等公开了约12-25个碱基的寡核苷酸，其末端被聚亚烷基二醇取代。这些修饰的寡核苷酸据报道对外切核酸酶活性有抗性。

[0025] 授予Cook等的美国专利第5,670,633和6,005,087号描述了热稳定的2′-氟代寡核苷酸，其与RNA或DNA碱基序列互补。授予Cook等的美国专利第6,222,025和5,760,202号描述了含修饰嘧啶的2′-O取代嘧啶和寡聚物。EP 0593901B1公开了具有末端3′,3′-和5′,5′-核苷键的寡核苷酸和核酶类似物。授予Gold等的美国专利第
6,011,020号公开并要求保护由聚乙二醇修饰的适体。

[0026] 目前，对于需要抗凝血治疗的患者，仍强烈需要提供治疗方法和组合物，具体地说是在手术或其它医学干预过程中。

[0027] 因此，本发明的一个目标是为有抗凝血治疗需要的患者提供治疗方法和组合物，具体地说是在手术或其它医学干预过程中。

[0028] 本发明的另一个目标是提供对抗凝疗法的治疗作用、药动学和活性时程的更多控制。

发明内容

[0029] 本发明公开了用于抗凝治疗的改良核酸配体以及与解毒剂组合的改良核酸配体，其中解毒剂改变核酸配体与其靶的结合，或者降解或以其它方式切割、代谢或分解核酸配体，同时配体仍发挥其作用。这些改良适体提供对体内应用更有利的抗凝特性，包括在人或畜手术过程中。当外科医生或其它医疗专家需要时，给予其解毒剂可便利地中和改良适体的抗凝功能。

[0030] 在本发明的一个方面，提供凝血级联中因子的改良核酸配体或适体。在某些实施方案中，所述因子包括IX因子(FIX)或切割产物IXa因子(FIXa)。在某些实施方案中，所述适体是由FIXa和VIIIa因子(FVIIIa)形成的复合物(也称为“内在Tenase复合物”)的配体。在某些实施方案中，适体是抑制FIXa和FVIIIa之间形成复合物的配体。在一个子实施方案中，本发明的适体结合FIX和FVIIIa的复合物，并抑制X因子(FX)活化。在有或没有另外的钙存在时，适体可与FIX、FIXa或FIXa与FVIIIa形成的复合物相互作用。适体还可与细胞膜处的复合物的因子相互作用。在一个实施方案中，适体结合在膜表面的内在Tenase复合物。

[0031] 在本发明的另一方面，申请人已发现凝血因子IX(FIX)基因产物及其切割产物IXa因子(FIXa)的改良适体。在一个实施方案中，核酸配体包含至少一个通过Watson-Crick碱基配对结合分子中的另一个区的区(茎)，和至少一个在生理条件下不结合分子中的任何其它区的区(环)。在另一个实施方案中，核酸配体包含两个茎(茎1和茎2)和两个环(环1和环2)。通常，茎1为1-15或1-20个核苷酸对长。茎1还可为10、9、
8、7、6、5、4、3或2个核苷酸长。一般来说，茎2为1-10个核苷酸长。茎2还可为9、8、7、6、
5、4、3或2个核苷酸长。环1和环2的长度也是可变的。环2可为10个核苷酸长，但也可为8个或8个以下核苷酸长，包括7、6、5、4、3或2个核苷酸长。环1的长度也是可变的，在一个实施方案中其在5′-3′方向包含10或9个核苷酸，3′-5′方向包含1个核苷酸。

[0032] 本发明IX因子基因产物的适体可包含核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或其组合。一般来说，改良适体为至少25个核苷酸长，通常不长于35-40个核苷酸。在一个实施方案中，适体至少为25、30、35或40个核苷酸长。在具体的实施方案中，茎1的序列在5′-3′方向含5个核苷酸。在一个子实施方案中，茎1在5′-3′方向含3个鸟嘌呤(G)残基。

[0033] 改良适体可包括“自杀位置”。在一个实施方案中，当解毒剂与改良适体结合时，该位置变成单链和不稳定的，并在解毒剂结合时允许循环中的酶(例如血液或肝核酸内切酶)切割改良适体，由此有效消除循环中的活性适体。自杀位置可位于茎2中羟化的鸟嘌呤处。在一个实施方案中，该核苷酸为双链构型，直至与解毒剂结合该核苷酸才变成单链的，并可在解毒剂结合时用于切割。

[0034] 在一个实施方案中，适体包含核苷酸序列gugg和互补序列ccac。在一个实施方案中，IX因子的适体包含核苷酸序列：gugga cuauacc gcg uaaugc ugc c uccac t(SeqID19)。

[0035] 本发明的另一个实施方案包括与本发明适体成对的解毒剂寡核苷酸。解毒剂寡核苷酸可与适体的至少一部分互补。解毒剂例如可包含以下序列：(5'-3')序列：cgcgguauaguccccau(Apt/AD；SEQ ID NO:1)；(5'-3') 序列：cgcgguauaguccc(Apt6/AD；
SEQ ID NO:2)；(5'-3')序列：cgcgguauaguccac(Apt7/AD；SEQ ID NO:3)；(5'-3')序列：
cgcgguauaguccauc(Apt8/AD；SEQ ID NO:4)；(5'-3') 序列：cgcgguauagucag(Apt9/AD；
SEQ ID NO:5)；(5'-3')序列：cgcgguauagucagg(Aρt10/AD；SEQ ID NO:6)；(5'-3')序列：
cgcgguauagucagag(Apt11/AD；SEQ ID NO:7)；(5'-3')序列：cgcgguauaguccucac(Apt14/AD；SEQ ID NO:8)，或其任意修饰物或衍生物。在某些实施方案中，解毒剂基本由以上的一种序列组成，或完全由以上的一种序列组成。

[0036] 解毒剂序列不需要与改良抗凝适体完全互补，只要解毒剂与适体成功结合或杂交，以中和其活性。

[0037] 本发明的适体对包括以下序列：

[0038]

[0039] 通过纳入对适体或解毒剂或这二者进行的继发性修饰，开发更稳定和更有生物活性的改良适体-解毒剂对。在一个实施方案中，IX因子的改良适体包含一个或多个2'-O-甲基修饰核苷酸。在另一个实施方案中，改良适体包含一个或多个2'-O-甲基和一个或多个2'-氟代修饰。在另一个实施方案中，适体和解毒剂不含2'-氟代修饰。在再另一个实施方案中，改良适体在茎上包含一个或多个2'-O-甲基和一个或多个2'-氟代修饰。在一个实施方案中，改良适体茎2中的至少一个鸟嘌呤含羟基糖(2'-OH)。在另一个实施方案中，以2'-氟代或2'-O-甲基修饰改良适体茎1或茎2中的至少一个尿苷。在另一个实施方案中，改良适体茎2中的至少一个胞苷被2'-氟代修饰。

[0040] 改良适体和解毒剂还可包含用水溶性聚合物修饰的核苷酸。这种聚合物可包括聚乙二醇、聚胺、聚醚、聚酐、聚酯或其它生物可降解的药物可接受聚合物。

[0041] 本发明包括改良适体结合FIX、FIXa或内在Tenase复合物的用途。此结合可为体内或体内结合。结合FIX、FIXa或Tenase复合物的结果可为抑制蛋白或复合物的生物活性。

[0042] 在一个实施方案中，改良适体通过结合FIXa抑制凝血，FIXa来源于与FIX相同的基因产物。本发明包括给予有需要的哺乳动物本发明的改良适体，以抑制凝血。本发明的另一个实施方案提供在治疗方案中使用改良适体和解毒剂的方法。

[0043] 在一个实施方案中，向有需要的哺乳动物提供本发明改良适体的解毒剂，以逆转改良适体的抗凝作用。可基于各种因素按照需要实时给予改良适体和适体-解毒剂对，这些因素包括患者的病情发展以及医师对如何实现最佳治疗的判断。因此，本发明公开了在凝血的核酸配体治疗过程中的改良型可调整治疗方案。在一个实例中，在医师或其它医护人员需要时提供中和改良适体作用的解毒剂，以关闭抗凝活性。在另一个实施方案中，以序贯步骤给予凝血因子的改良适体和解毒剂，其中给予适体，解毒剂用于限制改良适体的活性，随后再给予有需要的患者适体。在一个实施方案中，解毒剂通过与改良适体结合或杂交实现该中和作用。

[0044] 可将改良适体给予患心血管疾病或干预(包括手术干预)或处于其风险中的患者，其中所述心血管疾病或干预引起或导致凝血诱导事件。实例包括急性心肌梗死(心脏病发作)、脑血管意外(中风)、局部缺血、血管成形术、CABG(冠状动脉旁路移植术)、心肺旁路、在心脏旁路装置的循环中或在经受肾透析的患者中的血栓形成、不稳定心绞痛、肺栓塞、深静脉血栓形成、动脉血栓形成和弥漫性血管内凝血。

[0045] 还可以给予改良适体，以预防凝血诱导的炎症。早期炎症似乎由凝血级联的活化诱导。因此，改良适体可用于治疗包含炎症成分的心血管疾病，例如动脉粥样硬化、急性冠状动脉综合症(ACS)、可导致再灌注损伤的心肌梗死，或用于治疗与血管成形术后再狭窄相关的不利事件。

附图说明

[0046] 图1图示了下文描述的Apt A、1-39的提议二维构型。图1a是适体Apt A和1-5的示意图。1b是适体6-11的示意图。1c是适体Apt 12-17的示意图。1d是适体Apt 18-20的示意图，1e是Apt 21的示意图。1f是适体Apt 22-29的示意图，1g是Apt 30-34的示意图，1h是Apt 35-39的示意图。

[0047] 图2是适体Apt A和Apt 1-5的活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)测试实验(左图)和解毒剂AptA-AD中和能力的结果图。

[0048] 图3是适体Apt 2和Apt 6-8的活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)测试实验(右图)和解毒剂中和能力(左图)的结果图。

[0049] 图4是适体Apt 2和9-11的活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)测试实验(左图)和解毒剂中和能力(右图)的结果图。

[0050] 图5是适体Apt A、2和12-17的活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)测试实验(左图)和解毒剂中和能力(右图)的结果图。

[0051] 图6是适体Apt 2、15、16和21的活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)测试实验(左图)和解毒剂中和能力(右图)的结果图。

[0052] 图7是适体Apt 2和16-20的活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)测试实验(左图)和解毒剂中和能力(右图)的结果图。

[0053] 图8是PEG化AptA与PEG化Apt 16和19以及胆固醇修饰的Apt A(chol-A)相比其活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)测试实验的结果图。左图是凝血因子IX的适体控制，右图是解毒剂中和能力。

[0054] 图9是适体Apt 2、16和22-27的活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)测试实验(左图)和解毒剂中和能力(右图)的结果图。

[0055] 图10是适体Apt 2和30-33的活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)测试实验(A，左图)、Apt 2、30和33的解毒剂中和能力(A，右图)、适体Apt 2、30、33和34的APTT测试实验(B，左图)和解毒剂中和能力(B，右图)的结果图。

[0056] 图11是适体Apt A、2、19和35-39的活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)测试实验(左图)和Apt A、19、35、38和39的解毒剂中和能力(右图)的结果图。

[0057] 图12是适体Apt 2、34、39和Peg-19的解毒剂实验的中和能力结果图。

[0058] 图13是PEG-Apt39与CH-AptA和PEG-AptA相比的体外抗凝活性图。

[0059] 图14是PEG-Apt39在猪中的全身抗凝剂活性(14a)和中和能力(14b)图。各自凝血实验值的变化是该时间点的凝血时间和该动物注射前基线之间的差。对于PEG-Apt39治疗动物，n=2，对于CH-AptA治疗动物，n=3。在底部图中显示了全血ACT值，顶部图中显示了血浆APTT值。

[0060] 图15是PEG-Apt39在猪中的全身抗凝剂活性(14a)和中和能力(14b)图。各自凝血实验值的变化是该时间点的凝血时间和该动物注射前基线之间的差。对于PEG-Apt39治疗动物，n=2。该实验的数据与图3中列出的PEG-Apt39的抗凝血和中和数据对比。在左图中显示了全血ACT值，在右图中显示了血浆APTT值。

[0061] 图16是如实施例9所述给予Apt39的猴全身抗凝血图。用APTT监测猴中的抗凝水平。对于以15mg/kg治疗的动物，Apt39数据以平均值±SEM提供。对于以5和30mg/kg剂量水平治疗的动物，数据以平均值±范围提供。因为在这些剂量水平各仅有两只动物。

[0062] 图17是如实施例9所述采用Apt39并用解毒剂Apt7AD反转的猴全身抗凝血图。用APTT监测猴中的抗凝水平。在给予Apt39后3小时给予Apt7AD。数据以平均值±SEM提供。

具体实施方式

[0063] 1．定义

[0064] “核酸配体”或“适体”是可形成三维构型的核酸，该构型允许其作为配体与靶分子相互作用。该术语指具有特异性结合区的寡核苷酸，该特异性结合区能够在环境中与预期靶分子形成复合物，其中相同环境中的其它物质不与该寡核苷酸复合。根据适体对靶的解离常数(Kd)与适体和环境中其它物质或通常不相关分子的解离常数的比较，确定结合特异性。通常，适体对靶的Kd比对环境中不相关物质或伴随物质的Kd小10倍、50倍、100倍或200倍。

[0065] “适体解毒剂对”指包括靶分子的特异性适体和改变适体的三维构型以使适体可不再与其靶相互作用的寡核苷酸。解毒剂可为与适体的部分互补的寡核苷酸。解毒剂可改变适体的构型，以将生理条件下适体的靶结合能力降低10-100%、20-100%、25%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%或10-100%之间的任意百分率。解毒剂还可形成与靶分子具有结合活性的三维结构。该靶可与适体的靶相同或不同。

[0066] “解毒剂”、“调节剂”或“调节物”指可结合适体、并以需要的方式修饰与该适体之间的相互作用和该适体与其靶分子之间的相互作用(例如通过修饰适体结构)的任何药物可接受物质。

[0067] 术语“结合活性”和“结合亲和性”指配体分子结合或不结合靶的倾向性。所述相互作用的能量在“结合活性”和“结合亲和性”中很重要，因为其限定了相互作用配偶体的必需浓度、这些配偶体能够结合的速率以及溶液中结合和游离分子的相对浓度。根据对核酸配体解毒剂的解离常数(Kd)与对环境中的其它物质或通常不相关分子的解离常数的比较，确定结合特异性。

[0068] 本文使用的“共有序列”指存在于至少两个核酸序列的一个或多个区中的核苷酸序列或区(其可由或可不由连续核苷酸组成)。共有序列可短至3个核苷酸长。其还可由一个或多个非连续序列组成，在共有序列之间散布着达数百个碱基长的核苷酸序列或聚合物。可通过各个核酸种之间的序列对比鉴别共有序列，可通过计算机程序以及其它由序列信息建模二级和三级结构的工具辅助该对比。一般来说，共有序列包含至少约3-20个核苷酸，更通常6-10个核苷酸。

[0069] 术语“心血管疾病”意指本领域一般技术人员应理解的任何心血管疾病。具体设想的心血管疾病的非限制性实例包括但不限于动脉粥样硬化、血栓形成倾向、栓塞、心脏梗塞(例如心肌梗塞)、血栓形成、绞痛、中风、脓毒性休克、高血压、高胆固醇血症、再狭窄以及糖尿病(和相关的糖尿病性视网膜病)。心血管疾病可在病情进展的任意阶段进行治疗，例如早期发作的心血管疾病的治疗以及晚期心血管疾病的治疗。涉及通过调节凝血抑制心血管疾病恶化的治疗方法也包括在本发明中。

[0070] 2．IX因子的适体

[0071] 本发明提供通过与凝血级联中的特定因子相互作用来调节凝血的改良核酸配体或适体。本发明还提供调节凝血的改良适体-解毒剂对。改良适体靶向IX因子基因产物(其包括IXa因子)，并因此降低与其它凝血因子靶相关的非特异性副作用。凝血级联中的大部分因子是具有各种生理学作用的广谱蛋白(即凝血酶)。

[0072] 在伤害和血液凝块形成之间发生的事件是一系列细致调节并有关联的反应。在凝血的细胞型模型中，引发(initiation)发生在携带组织因子的细胞(单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞)上。在FVIIa(与组织因子复合)存在下，FIX和FX的活化由凝血酶原产生少量的凝血酶(其随后活化FV)。在扩展(amplifacation)阶段(也称为起动(priming)阶段)，少量的凝血酶产生活化的血小板，引起FVa、FXIa和FVIIIa释放。在凝血的最后阶段传播(propagation)中，FIXa与FVIIIa复合，活化FX。FXa-FVa复合物在钙和磷脂底物(凝血酶原酶复合物)存在下导致“爆发性”的凝血酶产生。

[0073] 抗凝血的细胞型模型已在确定凝血蛋白酶靶中用作工具。大部分以前的工作专注于通过各种因子(例如凝血酶)凝血。凝血酶是全身起作用的广谱作用蛋白。因此，凝血酶抑制剂除了对凝血的作用以外，还具有不可预料的副作用。凝血酶不仅活化内皮细胞，诱导白细胞浸润和水肿，而且活化星形细胞和小神经胶质细胞，而扩散病灶炎症和产生潜在的神经毒性作用。

[0074] 本发明的发明人已经确定，IXa因子由于同时参与凝血的引发和传播阶段而特别地表现为有吸引力的靶。迭代体外选择技术已用于鉴别能够以高亲和性(Kd 0.65±0.2nM)结合FIXa的寡核苷酸。实验研究提示，FIXa在血栓形成以及止血中可能具有关键作用。将纯化的FIXa灌输入兔中诱发血栓形成(Gitel等(1977)PNAS 74:3028-32;Gurewich等(1979)Thromb.Rsch.14:931-940)。相反，活性位点被封闭的FIXa防止凝块形成，降低冠状动脉内的血栓形成(Lowe(2001)Brit.J.Haem.115:507-513)。

[0075] 还已经表明，IX因子的抗体通过IXa因子和组织因子:VIIa因子复合物干扰内在Tenase复合物的功能、酶原因子IX的活化，并有效抑制豚鼠和大鼠血浆
中的活化部分促凝血酶原激酶凝血时间(APTT)(Refmo,C.J.等,(1999)Thromb and Haemost,82:1188-1195;Feuerstein GZ 等 (1999)Arterioscler Thromb Vase Biol
19(10):2554-62;Toomey JR等(2000)Thromb Res.100(1):73-9)。

[0076] 在一个实施方案中，本发明提供凝血级联中因子的核酸配体或适体。在某些实施方案中，所述因子包括IX因子(FIX)或切割产物IXa因子(FIXa)。在某些实施方案中，所述适体是由FIXa和VIIIa因子(FVIIIa)形成的复合物(也称为“内在Tenase复合物”)的配体。在某些实施方案中，适体是抑制FIXa和FVIIIa之间形成复合物的配体。在一个子实施方案中，本发明的适体结合FIX和FVIIIa的复合物，并抑制X因子(FX)的活化。在有或没有另外的钙存在时，适体可与FIX、FIXa或FIXa与FVIIIa形成的复合物相互作用。适体还可与细胞膜处的复合物的因子相互作用。在一个实施方案中，适体结合在膜表面的内在Tenase复合物。

[0077] 在一个实施方案中，申请人已发现凝血因子IX(FIX)基因产物及其切割产物IXa因子(FIXa)的改良适体。在一个实施方案中，核酸配体包含至少一个通过Watson-Crick碱基配对结合分子中的另一个区的区(茎)，和至少一个在生理条件下不结合分子中的任何其它区的区(环)。在另一个实施方案中，核酸配体包含两个茎(茎1和茎2)和两个环(环1和环2)。在一个实施方案中，茎1为1-20个核苷酸长。在另一个实施方案中，茎1为1-10个核苷酸长。在另一个子实施方案中，茎1为7、6、5、4、3或2个核苷酸长。在另一个实施方案中，茎2为1-20个核苷酸长。在再一个实施方案中，茎2为1-10个核苷酸长。在另一个子实施方案中，茎2为7、6、5、4、3或2个核苷酸长。

[0078] 本发明IX因子基因产物的适体可包含核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或其组合。一般来说，改良适体为至少25个核苷酸长，通常不长于35-40个核苷酸。在一个实施方案中，适体至少为25、30、35或40个核苷酸长。在具体的实施方案中，茎1的序列在5′-3′方向含5个核苷酸。在一个子实施方案中，茎1在5′-3′方向含3个鸟嘌呤(G)残基。

[0079] 在一个实施方案中，适体包含共有核苷酸序列gugg和互补序列ccac。当已获得并测序单个靶分子的许多单独不同的适体序列时，可检验这些序列的“共有序列”。本文使用的“共有序列”指存在于至少两个适体的一个或多个区中的核苷酸序列或区(其可由或可不由连续核苷酸组成)，其存在可能与适体-靶结合或适体结构相关。

[0080] 共有序列可短至3个核苷酸长。其还可由一个或多个非连续序列组成。在共有序列之间散布着数百个碱基长的核苷酸序列或聚合物。可通过各个适体种之间的序列对比鉴别共有序列，该对比可通过计算机程序以及其它由序列信息建模二级和三级结构的工具辅助。一般来说，共有序列包含至少约3-20个核苷酸，更通常6-10个核苷酸。并非混合物中的所有寡核苷酸都在此位置具有相同的核苷酸；例如共有序列可包含已知比率的特定核苷酸。例如，共有序列可由一系列的4个位置组成，其中混合物所有成员中的第一个位置都是A，第二个位置为25%A、35%T和40%C，所有寡核苷酸中的第三个位置都是T，50%的寡核苷酸中的第四个位置是G，50%的寡核苷酸中的第四个位置是C。

[0081] 在具体的实施方案中，适体包括以下Seq ID编号的核苷酸序列：

[0082]SeqID 代码大小序列
9 AptA 35聚体 (5’-3’)序列：augggga cuauacc gcg uaaugc ugc c uccccau t
10 Apt1 35聚体 (5’-3’)序列：augggga cuauaccgcguaaugcugcc uccccau t
9 Apt2 35聚体 (5’-3’)序列：augggga cuauacc gcg uaaugc ugc c uccccau t
9 Apt3 35聚体 (5’-3’)序列：augggga cuauacc gcg uaaugc ugc c uccccau t
9 Apt4 35聚体 (5’-3’)序列：augggga cuauacc gcg uaaugc ugc c uccccau t
9 Apt5 35聚体 (5’-3’)序列：augggga cuauacc gcg uaaugc ugc c uccccau t
11 Apt6 29聚体 (5’-3’)序列：ggga cuauaccgcguaaugcugcc uccc t
12 Apt7 31聚体 (5’-3’)序列：gugga cuauaccgcguaaugcugcc uccac t
13 Apt8 33聚体 (5’-3’)序列：gaugga cuauaccgcguaaugcugcc uccauc t
14 Apt9 29聚体 (5’-3’)序列：cuga cuauaccgcguaaugcugcc ucag t
15 Apt10 31聚体 (5’-3’)序列：ccuga cuauaccgcguaaugcugcc ucagg t
16 Apt11 33聚体 (5’-3’)序列：cucuga cuauaccgcguaaugcugcc ucagag t
10 Apt12 35聚体 (5’-3’)序列：augggga cuauaccgcguaaugcugcc uccccau t
10 Apt13 35聚体 (5’-3’)序列：augggga cuauaccgcguaaugcugcc uccccau t
17 Apt14 35聚体 (5’-3’)序列：gugagga cuauaccgcguaaugcugcc uccucac t
17 Apt15 35聚体 (5’-3’)序列：gugagga cuauaccgcguaaugcugcc uccucac t
17 Apt16 35聚体 (5’-3’)序列：gugagga cuauaccgcguaaugcugcc uccucac t
17 Apt17 35聚体 (5’-3’)序列：gugagga cuauaccgcguaaugcugcc uccucac t
11 Apt18 29聚体 (5’-3’)序列：ggga cuauaccgcguaaugcugcc uccc t
12 Apt19 331聚体 (5’-3’)序列：gugga cuauaccgcguaaugcugcc uccac t
13 Apt20 33聚体 (5’-3’)序列：gaugga cuauaccgcguaaugcugcc uccauc t
18 Apt21 35聚体 (5’-3’)序列：gugagga cuauacc gcg uaaugc ugc c uccucac t
18 Apt22 35聚体 (5’-3’)序列：gugagga cuauacc gcg uaaugc ugc c uccucac t
18 Apt23 35聚体 (5’-3’)序列：gugagga cuauacc gcg uaaugc ugc c uccucac t
18 Apt24 35聚体 (5’-3’)序列：gugagga cuauacc gcg uaaugc ugc c uccucac t[0083]
18 Apt25 35聚体 (5’-3’)序列：gugagga cuauacc gcg uaaugc ugc c uccucac t
27 Apt26 33聚体 (5’-3’)序列：gugagga cuauacc gca aucg ugc c uccucac t
28 Apt27 33聚体 (5’-3’)序列：gugagga cuauacc gca aucg ugc c uccucac t
29 Apt28 33聚体 (5’-3’)序列：gugagga cuauacc gca aucg ugc c uccucac t
30 Apt29 33聚体 (5’-3’)序列：gugagga cuauacc gca aucg ugc c uccucac t
18 Apt30 35聚体 (5’-3’)序列：gugagga cuauacc gcg uaaugc ugc c uccucac t
18 Apt31 35聚体 (5’-3’)序列：gugagga cuauacc gcg uaaugc ugc c uccucac t
18 Apt32 35聚体 (5’-3’)序列：gugagga cuauacc gcg uaaugc ugc c uccucac t
18 Apt33 35聚体 (5’-3’)序列：gugagga cuauacc gcg uaaugc ugc c uccucac t
18 Apt34 35聚体 (5’-3’)序列：gugagga cuauacc gcg uaaugc ugc c uccucac t
19 Apt35 31聚体 (5’-3’)序列：gugga cuauacc gcg uaaugc ugc c uccac t
19 Apt36 31聚体 (5’-3’)序列：gugga cuauacc gcg uaaugc ugc c uccac t
19 Apt37 31聚体 (5’-3’)序列：gugga cuauacc gcg uaaugc ugc c uccac t
19 Apt38 31聚体 (5’-3’)序列：gugga cuauacc gcg uaaugc ugc c uccac t
19 Apt39 31聚体 (5’-3’)序列：gugga cuauacc gcg uaaugc ugc c uccac t[0084] 在一个实施方案中，IX因子的适体包含核苷酸序列：gugga cuauacc gcg uaaugc ugc c uccac t(SeqID 19)，或由该核苷酸序列组成，或基本由该核苷酸序列组成。

[0085] 3．适体解毒剂

[0086] 重要的是能够由抑制释放凝血因子。致命疾病可起因于凝血因子(例如IX因子)的过度抑制。例如，B型血友病起因于IX因子缺陷。所有的B型血友病患者都具有延长的凝血时间和降低的IX因子凝血活性。同A型血友病一样，存在严重、中度和轻度的B型血友病，反映了血浆中的IX因子活性。

[0087] 因此，本发明的另一个实施方案包括与本发明适体成对的解毒剂。解毒剂或调节剂可包括可结合适体、并以需要的方式改变该适体与其靶分子之间相互作用(例如通过修饰适体结构)的任何药物可接受物质。这种解毒剂的实例包括(A)与适体序列的至少一部分互补的寡核苷酸(包括核酶或DNA核酶或肽核酸(PNA))；(B)结合核酸的肽、多肽或蛋白(包括结合核酸的三肽(一般参见Hwang等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:12997)；和(C)寡糖(例如氨基糖苷(一般参见Davis等(1993)第8章,185页,RNA World,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Gestlaad和Atkins编辑；Werstuck等(1998)Science
282:296；美国专利第5,935,776和5,534,408号)。(另参见以下文献，其公开的解毒剂类型可按照本发明使用：Chase等(1986)Ann.Rev.Biochem.56:103,Eichorn等(1968)J.Am.Chem.Soc.90:7323,Dale等(1975)Biochemistry 14:2447和Lippard等(1978)Acc.Chem.Res.11:211)。

[0088] 在一个实施方案中，解毒剂寡核苷酸逆转或中和适体至少25%、50%、75%、80%或90%的抗凝活性。一般来说，在低于1μM或低于0.1μM的解毒剂浓度，更优选在低于
0.01μM的解毒剂浓度，解毒剂具有充分结合溶液中的核酸配体的能力。在一个实施方案中，解毒剂降低适体的生物活性达50%。

[0089] 互补寡核苷酸

[0090] 在一个实施方案中，本发明的改良解毒剂为所含序列与靶适体序列的至少一部分互补的寡核苷酸。不需要绝对互补。在一个实施方案中，序列具有的互补性足以能够与适体杂交。杂交能力取决于互补程度和反义核酸长度这二者。有利地，解毒剂寡核苷酸包含与靶适体的6-25个连续核苷酸、优选8-20个连续核苷酸、更优选10-15个连续核苷酸互补的序列。在具体方面，解毒剂为至少10-25个核苷酸长、至少15-25个核苷酸长、至少20-25个核苷酸长、至少14、17或至少25个核苷酸长。本发明的解毒剂可为单链DNA或RNA或其嵌合混合物或衍生物或修饰形式。

[0091] 短寡核苷酸互补对结合形成双链体是相当快速的反应，二级结合速率常数一般6 5 1 1
在1×10 和3×10MS 之间。短双链体的稳定性可高度依赖于双链体的长度和碱基组
成。已严格检测了形成短核酸双链体的热力学参数，获得所有可能碱基对的最近邻法则，使得可精确预测自由能、Tm，并因此可计算给定寡核糖核苷酸双链体的半寿期(例如Xia等(1998)Biochem.37:14719；另参见Eguchi等(1991)Antigensis RNA,Annu.Rev.Biochem.60:631)。

[0092] 在具体的实施方案中，本发明提供特异性并快速逆转改良适体的抗凝和抗血栓形成作用的改良解毒剂，其中改良适体靶向凝血途径的组分，具体地说是FIX和FIXa的适体。可由医师或其它医护人员给予解毒剂，以逆转适体活性。在具体的实施方案中，本发明的改良解毒剂为对应于以下序列的核酸：(5'-3')序列：cgcgguauaguccccau(Apt/AD；SEQ ID NO:1)；(5'-3')序列：cgcgguauaguccc(Apt6/AD SEQ ID NO:2)；(5'-3')序列：
cgcgguauaguccac(Apt7/AD；SEQ ID NO:3)；(5'-3') 序列：cgcgguauaguccauc(Apt8/AD；
SEQ ID NO:4)；(5'-3')序列：cgcgguauagucag(Apt9/AD；SEQ ID NO:5)；(5'-3')序列：
cgcgguauagucagg(Apt10/AD；SEQ ID NO:6)；(5'-3')序列：cgcgguauagucagag(Apt11/AD；
SEQ ID NO:7)；(5'-3')序列：cgcgguauaguccucac(Apt14/AD；SEQ ID NO:8)或其任意修饰物或衍生物。解毒剂序列可与对应适体的序列至少20%、50%、75%或90%同源。在一个实施方案中，反义序列单独给予。

[0093] 反义技术论述于例如 Okano 等 (1991)J.Neurochem.56:560 和“Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression,”(1988)CRC Press,Boca Raton,FL。在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸解毒剂有利地靶向适体的单链区。这可有利于核化，因此促进适体活性调节速率，一般来说又产生所含碱基对比被靶向适体多的分子间双链体。本发明的IXa因子的适体可用于设计反义寡核苷酸。反义寡核苷酸与适体体内杂交，并阻止适体与IXa因子的结合。

[0094] 为设计本发明改良适体的改良解毒剂，可使用各种策略测定最佳结合位点。互补寡核苷酸可围绕着适体“步查”。此“步查”法包括在确定给定改良适体的最小共有配体序列之后，向最小共有配体序列中加入随机序列，并与靶展开另外的接触，例如在单独但邻接的结构域中。步查实验可包含两个序贯进行的实验。制作新候选混合物，其中候选混合物的每个成员都具有对应于目的核酸配体的固定核酸区。候选混合物的每个成员都还包含序列的随机化区。按照该方法，有可能鉴别出被称为“延长的”核酸配体的物质，其包含可结合靶的一个以上结合结构域的区。

[0095] 糖的变化可影响解毒剂稳定性，部分原因是糖修饰产生的RNA样寡核苷酸(例如20-氟代或20-甲氧基)似乎不充当RNA酶H的底物。糖对碱基方向的改变也可以影响RNA酶H活化。另外，骨架修饰影响寡核苷酸活化RNA酶H的能力。磷酸甲酯不活化RNA酶，而硫代磷酸酯是极佳的底物。另外，业已研究了将嵌合分子作为结合RNA和活化RNA酶H的寡核苷酸。例如，含20-甲氧基磷酸酯翼和5个碱基脱氧寡核苷酸空位的寡核苷酸结合其靶RNA并活化RNA酶H。

[0096] 在一个实施方案中，可使用长约15个核苷酸的2'-O-甲基修饰的解毒剂(例如2'-O-甲基寡核苷酸)，其与适体的互补性错开约5个核苷酸(例如寡核苷酸与核苷酸1-15、6-20、11-25等互补)。改良适体的三级结构对杂交效力的影响难以预测。在随后的实施例中描述的实验可用于评价不同寡核苷酸与特定适体杂交的能力。还可通过使用例如BIACORE检测进行动力学研究，测定不同寡核苷酸解毒剂增加适体与其靶分子的解离速率或结合速率的能力。可选择寡核苷酸解毒剂，使得需要5-50倍摩尔过量或更少的寡核苷酸，来以需要的方式修饰适体与其靶分子之间的相互作用。

[0097] 本发明的解毒剂可缀合至另一个分子，例如肽、杂交触发交联剂、转运剂、杂交触发切割剂等。

[0098] 反义寡核苷酸可任选包含至少一个修饰的碱基部分，包括但不限于选自以下的碱基部分：5-氟尿嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基-O-甲基硫尿苷、5-羧甲基氨基-O-甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖Q核苷(queosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、6-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基-O-甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基-O-甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖Q核苷、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-甲氧基胞嘧啶、2-甲基硫代-N&异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶氧乙酸(v)、butoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶氧乙酸(v)、5-甲基硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2,6-二氨基嘌呤。

[0099] 解毒剂还可包含至少一个修饰的糖部分，其选自(包括但不限于)：阿拉伯糖、2-氟代阿拉伯糖、木酮糖、己糖、2'-氟代核糖、2'-O-甲基核糖、2'-O-甲氧基乙基核糖、
2'-O-丙基核糖、2'-O-甲基硫代乙基核糖、2'-O-二乙基氨基氧乙基核糖、2'-O-(3-氨基丙基)核糖、2'-O-(二甲基氨基丙基)核糖、2'-O-(甲基乙酰胺基)核糖和2'-O-(二甲基氨基乙基氧乙基)核糖。在再另一个实施方案中，反义寡核苷酸包含至少一个修饰的磷酸骨架，其选自(包括但不限于)：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、酰氨基硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸二酰胺酯、磷酸甲酯、烷基磷酸三酯及其缩甲乙醛(formacetal)或其类似物。

[0100] 核酶和DNA核酶

[0101] 改良的适体或解毒剂还可为酶性核酸。这种核酶或DNA核酶通过首先结合靶RNA或DNA(参见Cech美国专利第5,180,818号)然后切割靶起作用。酶性核酸可重复地结合并切割新靶，由此使得RNA适体失活。有至少5类各表现出不同类型特异性的核酶。对于解毒剂，该酶活性可补充或置换，用于在改良适体中导入“自杀位置”。

[0102] 核酶的酶特性相对于其它技术可能有优势，因为实施治疗必需的核酶有效浓度低于反义寡核苷酸的有效浓度。单个核酶分子能够切割靶RNA的许多分子。另外，核酶是高度特异性的抑制剂，抑制的特异性不仅依赖于结合的碱基配对机制，而且依赖于该分子抑制其结合的RNA表达的机制。也就是说，抑制由RNA靶的切割引起，所以特异性被定义为靶RNA的切割速率对非靶RNA的切割速率的比率。此切割机制取决于与碱基配对相关的因素以外的因素。因此，可能是核酶作用的特异性高于结合相同RNA位点的反义寡核苷酸作用的特异性。

[0103] 另一类催化分子叫做“DNA核酶”。DNA核酶是单链的，切割RNA和DNA两者。已提出了DNA核酶的通用模型，称为“10-23”模型。符合“10-23”模型的DNA核酶也简称为“10-23DNA核酶”，其具有15个脱氧核糖核苷酸的催化结构域，两个各7-9个脱氧核糖核苷酸的底物识别结构域位于侧翼。体外分析表明，该类DNA核酶在生理条件下可于嘌呤:嘧啶结合处有效地切割底物RNA。本文使用的“DNA核酶”指特异性识别并切割不同靶核酸序列(其或者可为DNA，或者可为RNA)的DNA分子。

[0104] 适合的核酸

[0105] 在本发明的另一个方面，改良适体的解毒剂为肽核酸(PNA)。PNA是类似于寡核苷酸但组成不同的化合物，不同之处在于寡核苷酸的脱氧核糖骨架被肽骨架取代。肽骨架的各个亚单位连接至天然或非天然核碱基。

[0106] PNA作为快速作用的解毒剂可能有优势，因为其比其未取代的寡核苷酸对应物更紧密地结合对应的改良适体。PNA结合DNA和RNA两者，产生的PNA/DNA或PNA/RNA双链体比对应的DNA/DNA或DNA/RNA双链体结合得更紧密，以其较高的解链温度(Tm)为证。PNA/DNA(RNA)双链体的另一个优势是Tm几乎与盐浓度无关。因为PNA是其中骨架为假肽而不是糖的DNA类似物，所以其模拟DNA的性质，结合互补核酸链。

[0107] PNA是由氨基酸N-(2-氨基乙基)-甘氨酸的重复单元组成的合成聚酰胺，核碱基腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶通过亚甲基羰基与其连接。还可将天然和非天然核碱基掺入到PNA合成单体中，这些核碱基例如为假异胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶和2,6-二氨基嘌呤、肌苷、尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、硫代尿嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、溴代胸腺嘧啶、氮杂腺嘌呤或氮杂鸟嘌呤等等。PNA最常按照t-Boc/苄基保护策略由保护的单体(PNA合成单体)合成，其中用叔丁氧基羰基(t-Boc)基团保护生长聚合物的骨架氨基，如果存在核碱基的环外氨基，则用苄基氧羰基(苄基)基团对其保护。使用t-Boc/苄基策略保护的PNA合成单体现在可由市场上购买获得。

[0108] 吗啉代核酸(MNA)也可能在解毒剂制备中有优势，因为吗啉代完全抗核酸酶，它们似乎没有噬菌斑S-DNA的大部分或全部非反义作用。MNA由吗啉代亚单位组装，这些吗啉代亚单位每个含有连接至6元吗啉环的4种遗传碱基(腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶)之一。其中的亚单位通过非离子化磷酸二酰胺亚单位间键连接，产生MNA。这些MNA的反义特性可显著好于RNA、DNA及其具有通过离子键连接的5元核糖或脱氧核糖骨架部分的类似物(参见www.gene-tools.com/Morpholinos/body_morpholinos.HTML)。

[0109] 授予Manoharan等的美国专利第6,153,737号涉及衍生化寡核苷酸，其中用肽、蛋白、水溶性维生素或脂溶性维生素官能化连接的核苷酸。其公开内容涉及通过用有助于复合物选择性进入核膜的肽或蛋白序列修饰寡核苷酸，获得反义治疗剂。同样，水溶性和脂溶性维生素可用于帮助反义治疗剂或诊断剂穿过细胞膜传递。

[0110] 锁定核酸(LNA)也可用于制备本发明的解毒剂。LNA是一类新型DNA类似物，具有使其成为用于改良核酸特性的第一流候选物的某些特征。LNA单体是结构上类似于RNA单体的双环化合物。LNA具有DNA和RNA的大部分化学特性，是水溶性的，可通过凝胶电泳、乙醇沉淀等分离。(Tetrahedron,54,3607-3630(1998))。但是，将LNA单体导入到DNA或RNA寡核苷酸中产生高度热稳定性双链体，而与此同时互补DNA或RNA服从Watson-Crick碱基配对原则。与LNA寡聚物形成的此双链体的高度热稳定性，以及含3'定位的LNA的引物是酶延伸(例如PCR反应)底物的发现，使这些化合物适合成为本发明的解毒剂。LNA的实例参见美国专利第6,316,198号。

[0111] 在其它实施方案中，稳定的核酸可为PCO(假环状寡核碱基)或2'-O,4'-C-亚乙基桥连核酸(ENA)。

[0112] 4．修饰

[0113] 通过置换特定糖残基、通过改变适体组成和适体中特定区域的大小以及通过设计可被解毒剂更有效抑制的适体，修饰本发明的改良适体和适体-解毒剂组合。适体的设计包括对适体二级结构(参见图1)以及二级结构和解毒剂控制之间关系的评价。同常规核酸修饰方法不同，本发明包括的FIX基因产物改良适体的设计必须包含对解毒剂控制的考虑。可控制的适体要求适体在循环中是稳定的，但不是稳定到不受解毒剂控制。可通过截短修饰适体，但需要设计解毒剂，以在截短时控制各适体。此外，某些修饰，具体地说在茎和环接合处，不能由2′-氟代进行修饰，否则适体可能丧失活性。

[0114] 在一个实施方案中，设计包括降低适体或解毒剂或这二者的2'-羟基含量。在另一个实施方案中，设计包括降低适体或解毒剂或这二者的氟含量。在又一个实施方案中，设计包括增加适体或解毒剂或这二者的O-甲基含量。在又一个实施方案中，设计包括降低适体的大小。在另一个实施方案中，相对于适体的大小改变解毒剂的大小。在再一个实施方案中，将鸟嘌呤串减少到少于4个鸟嘌呤，或少于3个鸟嘌呤，或少于2个鸟嘌呤，或没有鸟嘌呤。但是，这些变化的共同效应必须满足产生抗凝剂的挑战，该抗凝剂提供足够活性但易于被解毒剂中和。

[0115] 再另一个实施方案包括具有允许配对解毒剂更有效调节的“自杀位置”的适体的设计方法。在一个实施方案中，该位置在解毒剂与改良适体结合时变成单链和不稳定的，在解毒剂结合时允许循环中的酶(例如血液或肝核酸内切酶)切割改良适体，由此有效消除循环中的活性适体。在一个实施方案中，自杀位置可处于茎2中羟化的鸟嘌呤处。在一个实施方案中，适体为双链构型，直至与解毒剂结合才成为单链的，并在解毒剂结合时可用于切割。

[0116] 申请人已经发现，通过纳入对适体或解毒剂或这二者的次级修饰，适体-解毒剂对是稳定和有生物活性的。在具体的实施方案中，IX因子的适体包括修饰的核苷酸。在一个实施方案中，适体包含一个或多个2'-O-甲基。在另一个实施方案中，适体和解毒剂包含一个或多个2'-O-甲基和一个或多个2'-氟代修饰。在另一个实施方案中，适体和解毒剂不包含2'-氟代修饰。在再另一个实施方案中，适体在其茎上包含一个或多个2'-O-甲基和一个或多个2'-氟代修饰。适体还可包含用可溶性聚合物修饰的核苷酸。这种聚合物可包括聚乙二醇、聚胺、聚酯、聚酐、聚醚或其它药物可接受的水溶性聚合物。

[0117] 给定的FIX抑制剂适体序列中的嘌呤可耐受2′-O-甲基糖对现有的2′羟基糖的置换(实施例1，图1)。申请人发现，适体分为三类：(1)获得抗凝活性(Apt-4)；(2)中度丧失活性(Apt-1、2和3)；和(3)严重丧失活性(Apt 5)(图2)。Apt-5的数据表明，2′-O-甲基嘌呤完全置换2′羟基嘌呤的影响显著高于任何单个区段置换(图2)。就此适体的情况而言，有可能表明区段之间潜在相互作用，或由其中一个区段中的置换引起的损害被另外的修饰恶化(即其中一个区段为致命弱点)。Apt-1、2和3表现出的解毒剂控制增强提示，在解毒剂结合位点中导入2'-O-甲基残基提升了解毒剂寡核苷酸结合适体的能力。这与由各个链中含2'-O-甲基RNA残基的双链体观察到的热力学稳定性增加一致，提示2'-O-甲基-2'-O-甲基链的双链体在热力学上比由2'-O-甲基-2'-F链组成的双链体更稳定。备选结论是Apt-1、2和3的活性降低导致于某一既定时间在血浆中产生更多“游离”的适体，因此更易被解毒剂寡核苷酸结合。

[0118] 在另一个实施方案中，本发明的适体可包含修饰的嘧啶核苷。用2'-O-甲基取代茎1中的2'氟代嘧啶提升了活性，产生耐受更高置换水平的化合物。Apt 30和33与Apt31和32的活性对比表明，C16需要包含2'氟代糖，G25需要包含2'羟基糖(图16a)。由Apt 31和32之间观察到的活性提示，茎2中剩余的位置可包含2'-O-甲基糖。实际上，Apt
31似乎具有比Apt32稍微高的效力，这表明，在C16具有2'氟代、在G25具有2'羟基、剩余残基具有2'-O-甲基的化合物可具有比Apt 33高的效力。Apt 33比Apt 30更易于中和，表明适体的解毒剂结合位点中的额外2'-O-甲基残基提升了解毒剂结合。Apt 34具有为2'氟代而不是2'-O-甲基核苷的C16(图16b)。置换增加了抗凝活性(对比Apt 34和Apt 33)，但确实导致“中和能力”适度损失，尽管为实现90%中和，34仍需要比亲代AptA化合物少的过量解毒剂(约~5:1对10:1)(图16b)。两个结果与茎2稳定性由于2'-O-甲基置换而增加一致。令人惊奇的是，有些显然没有继续进行2'氟代嘧啶的2'-O-甲基置换，这种置换降低合成成本，由于茎稳定性增加而似乎能增加适体修饰。

[0119] 在一个实施方案中，适体茎2中的至少一个鸟嘌呤包含羟基糖(2'-OH)。在一个实施方案中，茎1或茎2中的至少一个尿苷为修饰的碱基。该修饰或者为2'-氟代(2'-F)修饰，或者为2'-O-甲基(2'-OCH3)修饰。在一个实施方案中，茎1或茎2中的至少一个尿苷为2'-O-甲基修饰的。在一个实施方案中，茎2中的至少一个胞苷是修饰的。在一个实施方案中，茎2中的至少一个胞苷是2'-氟代修饰的。

[0120] 但是，Apt 12与Apt 13和17的抗凝活性对比(图6)表明，由Apt6-11观察到的活性丧失是源于在一个或多个关键残基存在2'-O-甲基置换(图7)。Apt 14与Apt 12的抗凝活性对比表明，可改变茎1中的4个连续鸟嘌呤的序列段，而不显著影响抗凝活性。Apt15和16与Apt2、12和17的对比表明：a)除茎1顶部的闭合A-U对之外，在茎1中的各个位置存在2'-O-甲基糖增强活性；和b)为使适体保有效力，在此碱基对中的U的糖必须是
2'-氟代的；和c)在此碱基对中的A的糖可为2'-O-甲基糖，而对抗凝活性没有显著影响。
实际上，Apt 16基本保留了全部效力。

[0121] 数据提示，当茎1为2'-O-甲基-2'-氟代茎时，解毒剂可更容易地结合适体，与双链体的两条链都包含大量2'-O-甲基残基时相反。这又与两条链由2'-O-甲基残基组成的双链体比由大量2'-O-甲基链和大量2'氟代链组成的双链体更稳定的观点一致。Apt 16的抗凝活性相对于Apt 15增强也与此一致。或者，14、15和16之间中和能力的差异可能归因于Apt 16相对于那两个化合物效力增强。无论如何，所有适体都至少和AptA一样被中和。基于Apt 14和15的抗凝活性相似的观测结果，茎1顶部A的糖为2'-O-甲基置换的(Apt 21，图8)。

[0122] 在此腺苷残基处的2'-O-甲基糖置换在大量2'-O-甲基茎的背景中良好耐受(图9)。实际上，Apt 21的效力处于Apt 16和15之间。Apt 21的解毒剂中和与Apt 16相比增强(尤其参见图9中的2.5:1和5:1AD:药物数据点)。

[0123] 糖修饰可确保稳定性，但其不能保证有治疗活性的合适适体药动学。在健康个体中，适体可能通过肾排泄在IV注射后的数分钟内由血浆中清除。通过将适体缀合至较大分子，例如聚乙二醇(PEG)，已实现了注射后在血液中保持完整适体达数小时至数天。在另一个实施方案中，还通过将适体嵌入脂质体中降低适体血浆清除率。

[0124] 本发明的核酸适体还可通过改变茎和环大小来修饰。具有4、5或6个2-O-甲基修饰碱基对的茎1区的两个适体家族表现出可变水平的抗凝活性和解毒剂控制(参见实施例2，图3-5)。据APTT实验的检测(图4和5)，茎1突变体(图3)表现出抗凝活性损失。所有的茎1变体表现出的活性都比完全2'-O-甲基嘌呤/2'氟代嘧啶化合物Apt 5低，提示为使化合物保有效力，茎1中的一个嘧啶必须包含2'氟代糖。但是，全部表现出相似的活性水平提示茎长度可能不引起活性损失。但是，5个碱基对的茎1构建物(Apt 10和7)看起来确实比6个碱基对更易由解毒剂控制。数据提示，相对由4、6或7个碱基对组成的茎1，优选5个碱基对的茎1，以增强解毒中和。

[0125] 对于解毒剂靶向，还可修饰改良适体以包含单链尾(3'或5')，以便促进与寡核苷酸解毒剂的结合。合适的尾可包含1-20个核苷酸，优选1-10个核苷酸，更优选1-5个核苷酸，最优选3-5个核苷酸(例如修饰的核苷酸，例如2'-O-甲基序列)。可以在结合和生物实验中(例如下文所述的实验)测试具尾适体，以证实加入单链尾不破坏适体的活性结构。可设计一系列可与尾序列形成例如1、3或5个碱基对的寡核苷酸(例如2'-O-甲基寡核苷酸)，并测试其与单独具尾适体结合的能力，以及其增加适体与其靶分子的解离速率或结合速率的能力。可使用混杂的序列对照来确认该作用是源于双链体形成而不是非特异性作用。

[0126] 可直接(例如单独或在脂质体制剂中或与载体如PEG复合)给予寡核苷酸解毒剂(参见例如USP 6,147,204、USP 6,011,020)。令人惊奇的是，加入PEG分子不降低茎1长度较短的适体与IX因子的结合，实际上，PEG化的缩短茎1看起来确实增加中和能力，提供潜在更有效的治疗作用。图10显示了具有5个碱基对茎的PEG化适体(Apt 19)的活性和中和能力。Apt 19具有的抗凝活性非常类似于具有7个碱基对茎1的PEG化Apt16，但仅用2.5:1过量的解毒剂:药物就可中和其活性的约90%。

[0127] 因此，在一个实施方案中，改良适体或解毒剂可连接至非免疫原性的高分子量化合物，例如聚乙二醇(PEG)或如本文所述的其它药物可接受的水溶性聚合物。在一个实施方案中，适体或解毒剂通过共价键与PEG分子结合。当使用共价连接时，PEG可共价结合至改良适体或解毒剂上的各个位置。在另一个实施方案中，寡核苷酸适体或解毒剂通过马来酰亚胺或乙烯砜官能团键合至5'-硫醇。在一个实施方案中，多个改良适体或解毒剂可与一个PEG分子结合。改良适体和解毒剂可为相同或不同的序列和修饰。在再另一个实施方案中，多个PEG分子可彼此连接。在该实施方案中，相同靶或不同靶的一种或多种适体或解毒剂可与各PEG分子结合。在其中相同靶特异性的多个适体或解毒剂连接至PEG的实施方案中，可能使相同靶彼此紧密邻接以便在相同靶之间产生特异性相互作用。当不同靶特异性的多个适体或解毒剂连接至PEG时，可能使不同靶彼此紧密邻接以便在靶之间产生特异性相互作用。另外，在其中相同靶或不同靶的适体或解毒剂与PEG连接的实施方案中，药物也可与PEG结合。因此，在PEG用作接头的情况下，复合物应提供药物的靶向传递。

[0128] 本发明的适体或解毒剂还可包含共价结合至官能团(例如伯或仲羟基)的其它缀合基团。本发明的缀合基团包括聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增强寡聚物药效特性的基团和增强寡聚物药动学特性的基团。在本发明背景中，增强药效特性的基团包括增加寡聚物生物利用度、增强寡聚物的降解抗性和/或强化与RNA的序列特异性杂交的基团。

[0129] 在具体的实施方案中，适体包括任何以下序列的核苷酸序列。(“A”是2'OH A；“a”是2'-O-甲基A；“G”是2'-OH G；“g”是2'-O-甲基G；“C”是2'-氟代C；“c”是2'-O-甲基C；“U”是2'氟代U；“u”是2'-O-甲基U；“T”是倒转的2'H T。)

[0130]SeqID 代码序列
20 AptA AUGGGGA CUAUACC GCG UAAUGC UGC C UCCCCAU T
21 Apt1 aUgggga CUAUACCGCGUAAUGCUGCC UCCCCaU T
22 Apt2 AUGGGGA CUaUaCC GCG UAAUGC UGC C UCCCCAU T
23 Apt3 AUGGGGA CUAUACC gCg UAAUGC UgC C UCCCCAU T
24 Apt4 AUGGGGA CUAUACC GCG UaaUgC UGC C UCCCCAU T
25 Apt5 aUgggga CUaUaCC gCg UaaUgC UgC C UCCCCaU T
26 Apt6 ggga CUaUaCCGCGUAAUGCUGCC uccc T
27 Apt7 gugga CUaUaCCGCGUAAUGCUGCC uccac T
28 Apt8 gaugga CUaUaCCGCGUAAUGCUGCC uccauc T
29 Apt9 cuga CUaUaCCGCGUAAUGCUGCC ucag T
30 Apt10 ccuga CUaUaCCGCGUAAUGCUGCC ucagg T
31 Apt11 cucuga CUaUaCCGCGUAAUGCUGCC ucagag T
32 Apt12 aUgggga CUaUaCCGCGUAAUGCUGCC UCCCCaU T
33 Apt13 augggga CUaUaCCGCGUAAUGCUGCC uccccau T
34 Apt14 gUgagga CUaUaCCGCGUAAUGCUGCC UCCUCaC T
35 Apt15 gUgaggA CUaUaCCGCGUAAUGCUGCC UCCUCaC T
36 Apt16 gugaggA CUaUaCCGCGUAAUGCUGCC Uccucac T
37 Apt17 gugagga CUaUaCCGCGUAAUGCUGCC uccucac T
38 Apt18 gggA CUaUaCCGCGUAAUGCUGCC Uccc T
39 Apt19 guggA CUaUaCCGCGUAAUGCUGCC Uccac T
40 Apt20 gauggA CUaUaCCGCGUAAUGCUGCC Uccauc T
41 Apt21 gugagga CUaUaCC GCG UAAUGC UGC C Uccucac T
42 Apt22 gugaggA CUaUaCC gCg UAAUGC UgC C Uccucac T

[0131]43 Apt23 gugaggA CUaUaCC GCG UaaUgC UGC C Uccucac T
44 Apt24 gugaggA CUaUaCC gCg UaaUgC UgC C Uccucac T
45 Apt25 gugaggA CUaUaCC GCg UaaUgC UgC C Uccucac T
46 Apt26 gugaggA CUaUaCC gCa AUCG UgC C Uccucac T
47 Apt27 gugaggA CUaUaCC GCA aUCg UGC C Uccucac T
48 Apt28 gugaggA CUaUaCC gCa aUCg UgC C Uccucac T
49 Apt29 gugaggA CUaUaCC GCa aUCg UgC C Uccucac T
50 Apt30 CUaUaCC gCG UaaUgC UGC C Uccucac T
51 Apt31 gugagga CUaUaCC gcg UaaUgC ugc C Uccucac T
52 Apt32 gugagga CUaUaCC gcg UaaUgC UgC C Uccucac T
53 Apt33 gugagga CUaUaCC gCg UaaUgC UGC C Uccucac T
54 Apt34 gugagga CUaUaCC gCg UaaUgC uGc C Uccucac T
55 Apt35 gugga CUaUaCC gCG UaaUgC UGC C Uccac T
56 Apt36 gugga CUaUaCC gCG UaaUgC ugc C Uccac T
57 Apt37 gugga CUaUaCC gCG UaaUgC UgC C Uccac T
58 Apt38 gugga CUaUaCC gCg UaaUgC UGC C Uccac T
59 Apt39 gugga CUaUaCC gCg UaaUgC uGc C Uccac T

[0132] 在一个具体的实施方案中，IX因子的适体包含核苷酸序列：gugga CUaUaCC gCg UaaUgC uGc C Uccac T(Apt39；SEQ ID NO:59)，或由该核苷酸序列组成，或基本由该核苷酸序列组成。

[0133] 可使用本领域众所周知的技术生产本文描述的改良适体。例如，已颁发的美国专利描述了可用于生产适体的大规模生产方法。例如，Caruthers等在美国专利第4,973,679、4,668,777和4,415,732号中描述了一类用于生产寡核苷酸的磷酸酰胺化合物。在另一个系列的专利中，Caruthers等公开了一种使用无机聚合物支持体合成寡核苷酸的方法。参见例如美国专利第4,500,707、4,458,066和5,153,319号。在再另一个系列的专利中，Caruthers等公开了一类可用于生产寡核苷酸的核苷二硫代磷酸酯。参见例如美国专利第5,278,302、5,453,496和5,602,244号。

[0134] 5．使用方法

[0135] 用改良适体调节凝血

[0136] 本发明包括改良适体结合FIX、FIXa或内在Tenase复合物的用途。结合可为体内的或体外的。与FIX、FIXa或Tenase复合物结合的结果可为抑制蛋白或复合物的生物活性。改良适体可用于治疗疾病如深静脉血栓形成、动脉血栓形成、手术后血栓形成、冠状动物旁路移植术(CABG)、经皮冠状动脉血管成形术(PTCA)、中风、肿瘤转移、炎症、脓毒性休克、高血压、ARDS、肺栓塞、弥漫性血管内凝血(DIC)、血管再狭窄、血小板沉积、心肌梗塞、血管形成，或用于预防性治疗具有处于血栓形成风险中的动脉粥样硬化血管的哺乳动物。

[0137] 在一个实施方案中，改良适体通过结合FIXa抑制凝血，本发明包括给予需要抑制凝血的哺乳动物(例如人)本发明的适体。本发明的另一个实施方案提供完全适于在治疗方案中给予的适体的使用方法。

[0138] 提供在有需要哺乳动物中改善凝血调节的方法。在一个实施方案中，该方法包括：(a)给予有需要的恒温脊椎动物或哺乳动物有效量的改良适体，其选择性结合凝血途径FIX、FIXa或内在Tenase复合物，或抑制内在Tenase复合物亚单位(即结合或活化FX的FIX、FIXa、FVIII)；(b)通过给予步骤(a)中的适体，调节恒温脊椎动物中凝血途径因子的生物活性；和(c)提供改良解毒剂，以逆转适体的作用。在某些实施方案中，恒温脊椎动物或哺乳动物为人。

[0139] 本文使用的术语“哺乳动物”指包括任意人或非人哺乳动物，包括但不限于猪科动物、绵羊科动物、牛科动物、啮齿动物、有蹄类动物、猪、绵羊、羔羊、山羊、牛、鹿、骡、马、猴、狗、猫、大鼠和小鼠。

[0140] 要考虑的一个重要方面是血浆半寿期。修饰可将改良适体的体内半寿期由几分钟变为12或更多个小时。本发明的改良适体可用于治疗经皮冠状动脉干预，在经皮冠状动脉干预中，血管损伤发生在特定的时间和位置，产生突然但相对短暂的促血栓形成刺激。颈动脉血管成形术后的情况也是这样。在另一个实施方案中，改良适体可用于在冠状动脉旁路移植术和血液透析中使用的体外循环。后一种情况由于动静脉(AV)分流术固有的血栓生成性而稍微复杂一些。本发明的适体还可用于治疗静脉血栓栓塞病、人工心瓣替换、心房纤维性颤动，以及可以想象地在具有先前事件、不利的风险预测、有记录的多层血管病、血管炎症(动脉粥样硬化血管病的早期)的患者中用于心血管事件的一级或二级预防。

[0141] 还提供在恒温脊椎动物中治疗心血管疾病的方法。该方法包括给予患心血管疾病的脊椎动物受试者有效量的改良适体，其选择性结合凝血途径因子IX、IXa或内在Tenase复合物，或抑制内在Tenase复合物亚单位(即结合或活化FX的FIX、FIXa、FVIII)。给予适体在脊椎动物受试者中治疗心血管疾病。该方法可进一步包括提供解毒剂，以通过给予解毒剂逆转改良适体的作用。

[0142] 改良适体可给予需要凝血治疗的哺乳动物。本发明提供用抑制凝血的适体治疗哺乳动物的方法。可给予成对的解毒剂，以逆转适体的作用。该发现的益处在于可实时控制凝血，不依赖于哺乳动物自身的代谢。

[0143] 本发明的组合物和方法尤其可用于在心脏旁路装置循环中和经受肾透析的患者中预防血栓形成，并用于治疗患血栓相关性心血管疾病(例如不稳定心绞痛、急性心肌梗死(心脏病发作)、脑血管意外(中风)、肺栓塞、深静脉血栓形成、动脉血栓形成、CABG手术和弥漫性血管内凝血)或处于患该病风险中的患者。

[0144] 另外，本发明的改良适体和解毒剂可抑制与FIX或FIX-调节级联相关的其它心血管疾病。凝血在缺血性心血管疾病中起重要作用。研究结果已经表明，极端凝固性过低起抗缺血性心血管疾病的保护作用。在血友病患者中存在的凝血性轻度下降可具有抗致命性缺血性心血管疾病的保护作用(Sramek A等(2003)Lancet 362(9381):351-4；Bilora F等(1999)Clin Appl Thromb Hemost.5(4):232-5)。

[0145] 可给予适体，以预防凝血诱导的炎症。急性心肌梗死(AMI)患者中的溶栓治疗诱发炎症，其可能促成微血管梗塞和再灌注损伤。本发明的改良适体可抑制这种早期炎症反应。在一个实施方案中，提供通过给予本发明的改良适体，在有需要的哺乳动物中降低早期炎症反应的方法。

[0146] 本发明的改良适体和解毒剂可用于抑制动脉粥样硬化。在动脉粥样硬化中的某些不利事件与斑块破裂相关，斑块破裂是与动脉粥样硬化相关的发病率和致死率的主因。除了常规冠心病风险因素以外，凝血因子IX活化肽和纤维蛋白原可能与冠心病风险正相关(R.Rosenberg等(2001)Thromb Haemost 86:41-50;JA Cooper等(2000)Circulation
102:2816-2822)。在去除内皮细胞层以及SMC和巨噬细胞接触血流之后，内在途径可显著增强动脉粥样硬化损伤的致血栓性(Ananyeva NM等(2002)Blood 99:4475-4485)。另外，还可在患与炎症相关的急性冠状动脉综合症(ACS)的哺乳动物中提供改良适体，以预防发病。

[0147] 在某些临床病情中，接触途径变成了血液凝结的主要途径。这些途径包括其中由体内取出血液产物的手术过程，例如在心肺分流术(CPB)过程中或CPB后CPB回路和人工肺与血液的接触诱发炎症状态。遗传流行病学和前瞻性临床研究已将冠状动脉血管再生过程中的炎症反应度和CPB的多种副作用(包括肾损伤、心房纤维性颤动、中风、肠道损伤和神经元损伤)联系在一起。由凝血途径活化诱发的炎症反应受凝血因子Xa和凝血酶介导，凝血因子Xa和凝血酶除了其在血液凝块形成中的作用以外，其自身也是促炎症和促有丝分裂的信号转导蛋白。还可给予改良适体来预防与血管成形术后再狭窄相关的副作用。

[0148] 用改良适体-解毒剂对调节凝血

[0149] 治疗患血栓病或处于凝血诱导事件中的患者的众多挑战之一是与抗凝药物治疗相关的潜在出血风险。出血风险的基础性机制是复杂的，但毫无疑问地随药物变异性(致血栓性程度或血栓载量范围的过度抗凝血作用)、药物浓度和抗凝作用之间相对较弱的关联、止血障碍(血小板效能、血管完整性、凝血的多阶段性)的普遍失效和抗凝剂性状的有限控制而变化。

[0150] 存在至少三种临床病情，需要快速逆转抗血栓形成或抗凝核酸配体的活性的能力。第一种情况是抗凝或抗血栓形成治疗导致出血时，包括颅内或胃肠出血。尽管鉴别较安全的靶蛋白可能降低此风险，但该类出血事件发病或死亡的可能性使得该风险不能被忽略。第二种情况是接受抗血栓形成治疗的患者需要紧急手术时。这种临床状况出现在一定百分率的在GPIIb/IIIa抑制剂保护下经受经皮冠状动脉干预的同时需要紧急冠状动脉旁路移植术(CABG)的患者中。目前对该状况的处置是考虑化合物清除(对于较小的分子拮抗剂，例如依替巴肽)，这可能需要2-4小时，或血小板灌注(对于阿昔单抗治疗)。第三种情况是在心肺分流术过程中使用抗凝核酸配体时。分流术患者倾向于术后出血。在每种情况下，通过解毒剂(例如靶向抗凝或抗血栓形成的核酸配体的本发明寡核苷酸解毒剂)急性逆转化合物的抗凝作用，允许改进抗凝或抗血栓形成化合物的医学控制，并可能更安全。

[0151] 申请人已发现改良适体-解毒剂对精确调节凝血级联中的蛋白。在一个实施方案中，在提供本发明适体后提供给有需要的哺乳动物本发明的解毒剂，以逆转适体的作用。适体和适体-解毒剂对可基于各种因素按照需要实时给予，这些因素包括患者的病情发展以及医师对如何实现最佳治疗的判断。因此，本发明公开了在凝血的核酸配体治疗期间的改良型可调整治疗方案。

[0152] 经历手术的个体也需要通过使用本发明的改良适体和解毒剂靶向调节出现的凝血。在某些实施方案中，给予经历普通手术的患者适体。在某些其它实施方案中，给予心血管疾病(可包括冠心病)患者适体。患者可经受包括分流手术或经皮冠状动脉干预的治疗。可用本发明适体治疗的哺乳动物还可包括已患有需要抗凝治疗的物理创伤的患者。

[0153] 患者的术前评价可鉴别药物诱导的、后天的或固有的凝血缺陷。对抗凝治疗的主要注意力集中在术前阶段。大部分凝血病的治疗中另外的经常被忽略的管理策略是对成本和个体血液组分中凝血因子半寿期的考虑。通过控制凝血和炎症过程的操作已使预防出血成为可能。另外，因为患者诊断经常很困难，所以，本发明的可调节的改良适体和解毒剂对尤其用于确保在不正确的诊断和治疗情况下可立即中止治疗。例如，冠状动脉梗塞的症状与急性冠状动脉夹层形成的症状酷似。参见Scarabeo等(2002)Italian Heart Journal3:490-494。冠状动脉梗塞诊断急需抗凝血，在急性冠状动脉夹层形成中不必进行抗凝血治疗。使用本文描述的改良适体-解毒剂对，可轻易地更正医护人员的错误。

[0154] 在中风中恢复血管开放的物质也增加脑内出血(ICH)的风险。由于IXa因子是凝血内在途径中的关键中间体，所以IXa因子依赖性凝血的靶向抑制可在中风中抑制微血管血栓形成，而不损害限制ICH的外在止血机制。本发明的改良适体和解毒剂可用于抑制与心血管疾病和手术相关的中风。

[0155] 给药

[0156] 用于治疗组织中的心血管疾病的本发明方法设想，使其中发生心血管疾病或处于发病风险中的组织接触含治疗有效量的、能够结合凝血因子的改良适体的组合物，以及提供改良解毒剂通过给予解毒剂逆转适体的作用。因此，该方法包括给予患者治疗有效量的、含RNA适体的生理耐受组合物，以及通过给予解毒剂提供逆转适体作用的解毒剂的方法。

[0157] 解毒剂给予的剂量范围取决于解毒剂的形式，可由医师或其它医护人员确定。一般来说，剂量随患者的年龄、身体状况、性别和疾病程度而变化，可由本领域技术人员确定。如果发生任何并发症，个体医师还可调整剂量。

[0158] 一般来说，治疗有效量是足以对核酸配体作用产生可检测调节的解毒剂量，包括但不限于凝血调节量或炎症调节量。

[0159] 给予本发明改良适体的优选方式是胃肠外、静脉内、皮内、关节内、滑液内、鞘内、动脉内、心脏内、肌内、皮下、眶内、囊内、脊柱内、胸骨内、局部、透皮贴剂、经直肠、阴道或尿道栓、腹膜、透皮、鼻喷雾、手术植入、内部手术敷料、灌注泵或经导管。在一个实施方案中，以缓释剂型(例如移植片、丸剂、微粒、微米球、纳米颗粒或纳米球体)给予药物和载体。

[0160] 优选可通过注射或通过随时间进行的逐步灌注胃肠外给予本发明的解毒剂。尽管通过全身给予通常可进入到机体中要治疗的组织中，并因此最经常通过静脉给予治疗组合物来治疗，但提供其它组织和传递技术，其中存在被靶向的组织包含靶分子的可能性。因此，本发明的解毒剂通常口服、局部(给予血管组织)，静脉内、腹膜内、肌内、皮下、腔内、透皮给予，并可通过蠕动技术传递。如上所述，可通过各种途径，例如口服、局部(给予血管组织)，静脉内、腹膜内、肌内、皮下、腔内、透皮，将药物组合物提供给个体，并可通过蠕动技术传递。局部给予血管组织的代表性非限制性方法包括(1)用含核酸配体的凝胶剂包被或浸透血管组织，用于体内传递，例如通过植入包被或浸透的血管代替被去除或被分流的损伤或患病血管组织；(2)经导管传递入其中需要传递的血管中；(3)将核酸配体组合物泵入要植入患者体内的血管中。或者，可通过微注射或通过脂质体囊化将核酸配体导入细胞中。有利的是，本发明的核酸配体可以单日剂量给予，或者可以几个分剂量给予总日剂量。此后，通过任何合适的手段提供解毒剂，以通过给予解毒剂改变核酸配体的作用。

[0161] 组合物

[0162] 本发明的适体和解毒剂可配制成药物组合物，其除了可包含改良适体、解毒剂或调节物以外，还可包含药物可接受的载体、稀释剂或赋形剂。组合物的精确特性至少部分取决于改良适体和解毒剂的性质和给予途径。优化的给药方案可由本领域技术人员轻易确定，并可随改良适体、解毒剂组合、患者和追求的作用而变化。

[0163] 有关药用制剂的标准信息，参见Ansel等,Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,第6版,Williams & Wilkins,1995。含本发明适体和解毒剂的治疗组合物例如通过注射单位剂量常规静脉内给予。术语“单位剂量”当用于指本发明的治疗组合物时，表示适合作为单一剂量用于受试者的物理分散单位，各单位包含计算产生需要疗效的预定量活性物质和必需稀释剂(即载体或溶媒)。

[0164] 以和剂型匹配的方式和以治疗有效量给予组合物。要给予的量取决于要治疗的对象、对象系统利用活性成分的能力和需要的治疗效果程度。需要给予的活性成分的精确剂量取决于医师的判断，是每个个体所特有的。但是，本文公开了全身施用的合适剂量范围，其取决于给予途径。合适的给予方案也是可变的，但以初次给予后通过随后注射或其它给予以一个或多个小时间隔重复给药为代表。或者，考虑足以将血液中的浓度保持在体内治疗特有范围内的持续静脉输注。

[0165] 可按照已知方法，例如利用药物可接受载体的混合物，配制含本发明的适体或解毒剂的药物组合物。这种载体和配制方法的实例可见于Remington's Pharmaceutical Sciences。为配制适于有效给予的药物可接受组合物，这种组合物包含有效量的适体。这种组合物可包含一种以上的适体或解毒剂的混合物。

[0166] 本发明改良适体的有效量可根据各种因素而变化，这些因素例如为个体的身体状况、体重、性别和年龄。其它因素包括给予方式。一般来说，以根据体重调整的剂量给予组合物，例如由约0.1mg/kg体重至约100mg/kg体重的剂量范围。在具体的实施方案中，剂量为约0.5mg/kg体重至50mg/kg体重。在具体的实施方案中，剂量为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1mg/kg体重，以及在此之间的任意剂量。具体的剂量单位可为1ng-1g，但更通常约0.01μg、0.1μg、1μg、10μg、100μg、500μg或1g或在此之间的任意量。

[0167] 传递给患者的抗体的有效量可根据各种因素而变化，这些因素例如为个体的身体状况、体重、性别、年龄和给予的核酸配体量。在一个实施方案中，解毒剂在0.5-50mg/kg的范围内。在另一个实施方案中，要传递的解毒剂的量为0.5-10、0.5-5、1-10或1-5mg/kg。一般来说，要传递的解毒剂量不低于要传递的适体量。通常，解毒剂量为适体量的约1至约
20倍。在某些实施方案中，解毒剂是要传递给患者的适体量的约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。

[0168] 以治疗有效量(即以足以产生凝血调节反应的量)或以预防有效量(即以足以预防凝血因子在凝血级联中起作用的量)给予药物组合物中的适体和解毒剂的改良组合。治疗有效量和预防有效量可根据调节物而变化。药物组合物可以单剂或多剂给予。

[0169] 因为改良解毒剂的活性持久，所以一旦通过解毒剂达到需要的核酸配体调节水平，则可终止解毒剂输注，使残余的解毒剂清除出人或动物。这使得随后可根据需要用核酸配体再治疗。或者，鉴于本发明解毒剂的特异性，随后的治疗可包括使用第二种、不同的改良适体/解毒剂对。

[0170] 按照本文公开的方法合成或鉴别的解毒剂可以通过常规测试确定的合适剂量单独使用，以便在凝血中获得核酸配体活性的优化调节，同时使任何潜在的毒性最小。另外，可能需要共同给予或序贯给予其它物质。对于使用一种以上活性物质(其中活性物质在单独的剂型中)的联合治疗，活性物质可同时给予，或者它们各自可于分开的交错时间给予。

[0171] 根据各种因素选择使用本发明改良适体和解毒剂的给药方案，这些因素包括患者的类型、物种、年龄、体重、性别和身体状况；要治疗病症的严重性；给予途径；患者的肾脏和肝功能；以及使用的具体组合。普通医师可轻易地确定和处方预防、对抗或停滞病症发展所需的适体有效量。实现组合浓度处于产生无毒效力范围内的最优精度需要基于适体和解毒剂对靶点利用度的动力学的方案。这包括对调节物的分布、平衡和消除的考量。

[0172] 在本发明方法中，详细描述的组合可构成活性成分，通常作为与针对要给予剂型(即口服片剂、胶囊剂、酏剂、糖浆、栓剂、凝胶剂等)而适当选择的合适药用稀释剂、赋形剂或载体(在本文统称为“载体”物质)的混合物给予，并与常规药学实践相一致。

[0173] 例如，对于以片剂或胶囊剂形式口服给予，活性药物成分可与口服的、无毒的、药物可接受的惰性载体(例如乙醇、甘油、水等)组合。而且，当需要或必须时，还可将合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂掺入到混合物中。合适的粘合剂包括但不限于淀粉、明胶、天然糖(例如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味剂)、天然和合成树胶(例如阿拉伯树胶、黄芪胶或海藻酸钠、羧甲基纤维素)、聚乙二醇、蜡等。用于这些剂型的润滑剂包括但不限于油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等。

[0174] 对于液体剂型，活性药物成分可组合在适当调味的悬浮剂或分散剂中，例如合成和天然树胶，例如黄芪胶、阿拉伯树胶、甲基纤维素等。可使用的其它分散剂包括甘油等。对于胃肠外给予，需要无菌悬浮剂和溶液剂。当需要静脉内给予时，使用一般包含合适防腐剂的等渗制剂。

[0175] 含活性药物成分的局部制剂可与本领域众所周知的各种载体物质混合，例如醇、芦荟凝胶、尿囊素、甘油、维生素A和E油、矿物油、PPG2肉豆蔻丙酸酯等，以形成例如为乳剂或凝胶剂型的醇溶液、局部清洗剂、清洁软膏、皮肤凝胶、润肤液和洗发剂。

[0176] 本发明的适体和解毒剂还可以脂质体传递系统的形式给予，例如小单层脂质体、大单层脂质体和多层脂质体。脂质体可由各种磷脂配制，例如胆固醇、十八胺或磷脂酰胆碱。

[0177] 本发明的适体和解毒剂还可与为可靶向药物载体的可溶性聚合物偶联。这种聚合物可包括聚乙烯-吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟丙基异丁烯酰基-酰胺苯酚、聚羟基-乙基天冬酰胺苯酚或用棕榈酰残基取代的聚氧乙烯聚赖氨酸。而且，本发明的适体和解毒剂可偶联(优选通过共价键)一类生物可降解聚合物，用于实现药物的控释，此生物可降解聚合物例如为聚乙二醇(PEG)、聚乳酸、聚ε己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚乙缩醛、聚二氢吡喃、聚氰丙烯酸酯和水凝胶的交联或两性嵌段共聚物。可将胆固醇或相似的分子连接至适体，以增加和延长生物利用度。

[0178] 在本发明的某些实施方案中，复合物包含脂质体和囊化治疗或诊断剂，靶向核酸配体与脂质体表面结合。预制脂质体可修饰成与核酸配体结合。例如，阳离子脂质体通过静电相互作用与核酸结合。或者，连接至亲脂化合物(例如胆固醇)的核酸可加入到预制脂质体中，胆固醇由此变成与脂质体膜结合。或者，核酸可在脂质体形成过程中与脂质体结合。优选核酸通过载入预制脂质体中与脂质体结合。

[0179] 在以下非限制性实施例中更详细地描述了本发明的某些方面。

[0180] 实施例

[0181] 适体的凝血测试

[0182] 以下的测试用于评价修饰的适体和解毒剂抑制凝血因子的能力。

[0183] 活化凝血时间测试(ACT)是一种类似于活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)测试的筛选测试，但其使用新鲜全血样品进行。ACT可监测与临床进程(例如包括给予高剂量肝素的临床进程(例如CPB和PTCA))相关的患者凝血状态。

[0184] 活化部分促凝血酶原激酶时间测试(APTT)是一种普通的中心实验室测试，通常使用自动化血凝度计进行，例如Diagnostica Stago's STA血凝度计(MDA/96/23)或该公司生产的另一种血凝度计或本领域已知的其它血凝度计。测试使用血浆样品进行，其中通2+
过加入磷脂、活化剂(鞣花酸、高岭土或微粉化硅石)和Ca 活化内在途径。

[0185] 出血时间测试可用于诊断止血障碍、von Willebrand病和血管疾病。其还可用于在手术前筛选血小板异常。该测试通过在前臂上制作小切口并由伤口部位吸出血进行。记录出血至止血所花费的时间，对照受试者约为3.5分钟。出血时间延长是定性或定量血小板缺陷的征兆。

[0186] 凝血酶原时间测试(PT)首先由Quick于1935年描述，检测血液或血浆的组织因子诱导的凝血时间。其用作评价外在凝血途径完整性的筛选测试，对凝血因子I、II、V、VII2+
和X敏感。可通过向患者样品中加入促凝血酶原激酶和Ca 并检测凝块形成时间进行测试。延长的凝血时间提示存在外在途径的一种或多种凝血因子的抑制剂或缺陷。但华法林治疗患者或具有维生素K缺陷或肝机能障碍的患者的PT凝血时间也可能延长。PT测试可提供外在凝血途径的评价，广泛用于监测口服抗凝血治疗。

[0187] 凝血酶凝血时间测试(TCT)检测与正常血浆对照相比的患者凝块形成速率。可通过向已排除血小板的患者血浆中加入标准量的凝血酶，并检测凝块形成所需的时间，进行该测试。该测试已用作诊断弥漫性血管内凝血(DIC)和肝病的辅助手段。

[0188] 还有许多可用于诊断患者凝血状态的测试。这些测试分为两类：复合物测试，其中一些测试基于以上概述的筛选测试，以及免疫测试。复合物测试包括基于实验室检验的特定因子实验，例如APTT、PT和TCT检验。一个实验检测活化因子IXa或IXa因子-抗凝血酶III复合物的水平。这些检测用于测定IXa因子或VII因子-组织介导的复合物的水平。用于活化蛋白C抗性、抗凝血酶、蛋白C缺陷和蛋白S缺陷的实验也是该类别的一部分。具有蛋白C和S杂合缺陷以及活化蛋白C抗性的无症状个体具有比对照显著提升的凝血酶原片段F1.2水平。

[0189] 实施例1：各部分中的2'-O-甲基置换2'-羟基糖

[0190] 在其中存在嘌呤残基的4个二级结构单位中用2'-O-甲基嘌呤置换2'-羟基嘌呤：茎1(Apt 1)；环1(Apt 2)；茎2(Apt 3)；环2(Apt 4)(参见图1A)。

[0191] 方法：在由1μM至以下的nM化合物浓度范围内，以标准APTT凝血实验评价Apt A衍生物Apt 1-5的抗凝活性(图2)。在由5μM至以下的AptA解毒剂(AptA AD；参见序列表)浓度范围内，以标准APTT解毒剂实验评价Apt 1-5的“中和能力”(图2)。对于这些实验，AptA和衍生物的浓度固定在125nM。

[0192] Apt 4表现出获得抗凝活性(图2)；Apt 1-3表现出中度的活性损失；而Apt 5表现出活性严重丧失。Apt 1-3表现出增强的中和，提示在解毒剂结合位点中导入2'-O-甲基残基提升了解毒剂寡核苷酸结合适体的能力。

[0193] 序列表：

[0194]

[0195] “A”：2'OH腺嘌呤；“a”：2'-O-甲基腺嘌呤；“G”：2'OH鸟嘌呤；“g”：2'-O-甲基鸟嘌呤；“C”：2'氟代-胞苷；“c”：2'-O-甲基胞苷；“U”：2'氟代-尿苷；“u”：2'-O-甲基尿苷；“T”：倒转的2'H胸苷。

[0196] 实施例2：茎1修饰

[0197] 设计茎1变体的两个“家族”(Apt 6-8和9-11；图1B)，其由4、5和6个碱基对茎组成。所有的构建物都在Apt-2背景中设计。评价茎1序列的能力，以设计其互补解毒剂寡核苷酸，使得解毒剂包含最小二级结构，并评价适体采取正确二级结构的能力。

[0198] 茎是完全2'-O-甲基修饰的。设计Apt 6-11特异性的解毒剂寡核苷酸，其作为AptA AD以相同的编号(参见下文的序列表)结合其各自的靶适体。

[0199] 实验：在1μM至以下的nM化合物浓度范围内，以标准APTT凝血实验评价Apt6-11的抗凝活性。在由5μM至以下的解毒剂浓度范围内，以标准APTT解毒剂实验评价Apt
6-11的解毒剂控制。对于这些实验，Apt 2和Apt 6-11的浓度设定在250nM(与标准AptA和Apt 2实验的125nM相对比)。

[0200] Apt 6-8表现出抗凝活性丧失(图3)，但是，全部都表现出相似的活性水平。因此，茎长度不是活性丧失的主因。5碱基对茎1构建物(Apt 10和Apt 7)看起来确实比Apt 2更可中和(图3和4)。数据提示，相对4、6或7个碱基对组成的茎，可优选5碱基对的茎1，以增强解毒剂的中和。

[0201] 序列表：

[0202]

[0203] “A”：2'OH腺嘌呤；“a”：2'-O-甲基腺嘌呤；“G”：2'OH鸟嘌呤；“g”：2'-O-甲基鸟嘌呤；“C”：2'氟代-胞苷；“c”：2'-O-甲基胞苷；“U”：2'氟代-尿苷；“u”：2'-O-甲基尿苷；“T”：倒转的2'H胸苷。

[0204] 实施例3：茎1糖化学

[0205] 在1μM至以下的nM化合物浓度范围内，以标准APTT凝血实验评价Apt 12-17的抗凝活性。在由5μM至以下的解毒剂浓度范围内，以标准APTT解毒剂实验评价Apt 12-17的“中和能力”。对于Apt 12、14、15和16，在这些实验中的适体浓度固定在125nM，而对于Apt 13和17，适体浓度固定在250nM。

[0206] Apt 12与Apt 13和Apt17的抗凝活性对比(图5)表明，对Apt6-11观测到的活性损失源于在一个或多个关键残基处存在2'-O-甲基置换。Apt14与Apt12的抗凝活性对比表明，可改变茎1中4个连续鸟嘌呤的序列段而不显著影响抗凝活性。Apt 15和16与Apt2、12和17的对比表明，a)除茎1顶部的闭合A-U对之外，在茎1中各个位置存在2'-O-甲基糖增强活性；b)为使适体保有效力，此碱基对中的U的糖必须是2'-氟代的；和c)此碱基对中的A的糖可为2'-O-甲基糖，而对抗凝活性没有显著影响。实际上，Apt 16基本保留了全部效力。

[0207] Apt 14-16与Apt14/AD的中和对比提示，当茎1为2'-O-甲基-2'-氟代茎时，解毒剂可更容易地结合适体，与双链体的两条链都大量包含2'-O-甲基残基时相反。设计其中茎1顶部A的糖为2'-O-甲基置换的Apt 21(图1)。在此腺苷残基处的2'-O-甲基糖置换在大量2'-O-甲基茎的背景中良好耐受(图6)。Apt 21的解毒剂中和与Apt 16相比增强(尤其参见图4中2.5:1和5:1AD:药物的数据点)。

[0208] 序列表：

[0209]

[0210] “A”：2'OH腺嘌呤；“a”：2'-O-甲基腺嘌呤；“G”：2'OH鸟嘌呤；“g”：2'-O-甲基鸟嘌呤；“C”：2'氟代-胞苷；“c”：2'-O-甲基胞苷；“U”：2'氟代-尿苷；“u”：2'-O-甲基尿苷；“T”：倒转的2'H胸苷。

[0211] 实施例4：缩短茎1长度

[0212] 在1μM至以下的nM化合物浓度范围内，以标准APTT凝血实验评价Apt 18-20的抗凝活性。在由5μM至以下的解毒剂(解毒剂6、7和8分别对应于18-20)浓度范围内，以标准APTT解毒剂实验评价Apt 18-20的“中和能力”。在这些实验中的适体浓度固定在125nM。

[0213] 每种适体(Apt 18-20)都是和Apt 2同样有效或更有效的抗凝剂(图7)。而且，全部三种都易于被其各自的解毒剂寡核苷酸中和。评价PEG化形式的Apt 19的抗凝活性。使用PEG Apt 19和用于对比的PEG-Apt16(PEG是40KDa的聚乙二醇mPEG2-NHS酯(分子量40kDa;Nektar/Shearwater 2Z3XOT01)，在固相合成中通过缀合到加入适体的C6氨基接头添加至5′末端)。图8表明，茎1的长度对40KDa PEG添加如何影响AptA和Apt A衍生物的活性不起作用。PEG Apt 19和16的抗凝活性与既PEG化(PEG AptA)又胆固醇修饰(CH-AptA)形式的亲代AptA序列抗凝活性基本相同。另外，同Apt 19一样，PEG Apt 19比AptA、Apt 16或这些化合物的任意PEG或胆固醇修饰形式更易被其匹配的解毒剂(7AD)中和。图8表明，在2.5:1AD:适体下PEG Apt19约90%逆转。考察APTT中的绝对变化而不是以逆转百分率为基准，用PEG Apt 19+2.5:17AD:适体处理的血浆的APTT仅超出基线
4-5秒。

[0214] 序列表：

[0215]

[0216] “A”：2'OH腺嘌呤；“a”：2'-O-甲基腺嘌呤；“G”：2'OH鸟嘌呤；“g”：2'-O-甲基鸟嘌呤；“C”：2'氟代-胞苷；“c”：2'-O-甲基胞苷；“U”：2'氟代-尿苷；“u”：2'-O-甲基尿苷；“T”：倒转的2'H胸苷。“P”：mPEG2-NHS酯，分子量40kDa (Nektar/Shearwater2Z3XOT01)；
“L”：C6氨基接头。

[0217] 实施例5：茎2和环2置换

[0218] 评价两个系列的变体在茎2和环2中的残基的最优糖组成。第一个系列在Apt 16背景中。第二个系列在Apt 16背景中，但用存在于FIXa适体9.20中的4环(参见Rusconi等Nature 419,90-94页,2002和图1)置换AptA中存在的6核苷酸环。关于Apt 4的研究表明，在环2中的2'-O-甲基嘌呤置换导致AptA效力增强，而茎2中的2'-O-甲基嘌呤置换导致效力适度损失，在2'-O-甲基嘌呤茎1背景中茎2和环2中的同时2'-O-甲基嘌呤置换导致AptA效力显著损失(Apt 5)。因此，独立置换茎2(Apt 22、26)和环2(Apt 23、27)中的2'-O-甲基嘌呤(图9)。如果在该位置需要2'羟基，则除了再评价留下茎2碱基处的G作为2'羟基(Apt 25、29)以外，还要再评价茎2和环2中的嘌呤完全2'-O-甲基置换(Apt 24、Apt 28)。

[0219] 在1μM至以下的nM化合物浓度范围内，以标准APTT凝血实验评价Apt 22-29的抗凝活性。在由5μM至以下的解毒剂浓度范围内，以标准APTT解毒剂实验评价Apt 22-29的“中和能力”。在这些实验中的适体浓度固定在125nM，Apt 24例外，其适体浓度固定在250nM。

[0220] 如先前用Apt 3所观测到的，环2中的2'-O-甲基嘌呤置换产生增强的效力(Apt23，对比Apt 23和16)(图9)。同样，2'-O-甲基嘌呤置换入茎2中导致活性适度损失(Apt
22、24)(图14)。Apt 24明显比Apt 5更有效。和Apt 24相比，将2'羟基保持在茎2碱基的G残基上(Apt 25)未产生增强活性，表明a)在该残基处的2'-O-甲基糖置换不是Apt
22和24中的问题，和b)在该残基上的糖可为2'-O-甲基。9.20四环置换存在于AptA中的6核苷酸环导致活性损失(Apt 26-29)。Apt 23的解毒剂中和与Apt 16相比降低，但仍和AptA相等。

[0221] 序列表：

[0222]

[0223] 实施例6：茎2糖化学

[0224] 在1μM至以下的nM化合物浓度范围内，以标准APTT凝血实验评价Apt 30-33的抗凝活性。在由5μM至以下的解毒剂(Apt 14AD)浓度范围内，以标准APTT解毒剂实验评价Apt 30和33的“中和能力”。在这些实验中的适体浓度固定在125nM(参见图10)。

[0225] Apt 30和33与Apt 31和32的活性对比表明，C16需要包含2'氟代糖，G25需要包含2'羟基糖(图10a)。由Apt 31和32之间观察到的活性提示，茎2中剩余的位置可包含2'-O-甲基糖。实际上，Apt 31似乎具有比Apt32稍高的效力，这表明，在C16具有2'氟代、在G25具有2'羟基以及剩余残基具有2'-O-甲基的化合物可具有比Apt 33高的效力。无论如何，Apt 33具有比Apt 2高的活性，与原始Apt A十分相当。Apt 33比Apt 30更易于中和，表明适体的解毒剂结合位点中的额外2'-O-甲基残基提升了解毒剂结合。

[0226] Apt 34具有为2'氟代而不是2'-O-甲基的C16(图10b)。抗凝活性增加(对比Apt 34和Apt 33)。但是，置换确实产生适度的“中和能力”损失，尽管为实现90%中和，34仍需要比亲代AptA化合物少的过量解毒剂(约5:1对10:1)。两个结果与茎2稳定性由于2'-O-甲基置换而增加一致。

[0227] 序列表：

[0228]

[0229] 实施例7：单个碱基修饰

[0230] Apt 35-39与原始AptA对比(基于AptA茎1编号)：

[0231] 1)Apt 30对31：差异为C16、G17、U24、G25、C26。

[0232] 2)Apt 30对32：差异为C16、G17、G25。

[0233] 3)Apt 31对32：差异为U24、C26。

[0234] 在1μM至以下的nM化合物浓度范围内，以标准APTT凝血实验评价Apt 35-39的抗凝活性。在由5μM至以下的解毒剂(Apt 7AD)浓度范围内，以标准APTT解毒剂实验评价Apt 35、38和39的“中和能力”。在这些实验中的适体浓度固定在125nM(参见图11)。

[0235] Apt 35-39：Apt 39的抗凝活性优于Apt 19和所有其它Apt 19背景中的茎2-优化构建物(图11)。结果与用Apt 34获得的结果一致。另外，Apt 39的效力与亲代AptA相当，高于Apt 2。Apt7AD对Apt 39的中和极佳，类似于Apt 19的中和(图12)。再者，Apt 39的糖优化和截短已导致在比亲代AptA和Apt 2低的过量解毒剂:药物下被中和的化合物(图11)。

[0236] 序列表：

[0237]

[0238] 实施例8：适体与传递载体的缀合

[0239] 测试的抗凝剂是40KDa聚乙二醇(PEG)经6碳NH2接头缀合至适体序列5'末端的Apt39(PEG-Apt39)。解毒剂是Apt7AD。

[0240] 在1μM至以下的nM化合物浓度范围内，以标准APTT凝血实验评价PEG-Apt39的抗凝活性。对比Apt39和两种亲代AptA制备物CH-Apt S(5'胆固醇修饰)和PEG-AptA(5'40KDa PEG修饰)的抗凝活性。对于这些研究，使用单独的“适体”部分的分子量计算每种化合物的浓度。在由5μM至以下的解毒剂(Apt7AD)浓度范围内，以标准APTT解毒剂实验评价PEG-Apt39的“中和能力”。在这些实验中的适体浓度固定在125nM。

[0241] PEG-Apt39的体内抗凝活性基本等同于CH-AptA和PEG-AptA(图13)。

[0242] 体内研究

[0243] 该研究就以下方面对比了PEG-Apt39在猪中的体内抗凝活性和解毒剂中和与先前用CH-AptA获得的数据：a)抗凝活性的效力和持久性，和b)抗凝活性的中和。3个实验组(每组n=2只动物)是a)全身抗凝；b)全身抗凝和药物中和；和c)全身抗凝、药物中和以及再抗凝。

[0244] 实验：将6只初生仔猪(1周龄，2.5-3.5kg)随机分配为3组。将股动脉和静脉管置入仔猪中。动脉管用于监测血压和动脉血采样。静脉管用于给予指定药物和测试化合物。仔猪体温用鼻咽温度传感器监测。

[0245] 用于每只动物的PEG-Apt39剂量为0.5mg/kg(适体剂量只基于核酸组分的分子量；10,103.2Da)。在先前用CH-AptA的实验中，适体剂量也是0.5mg/kg(适体剂量只基于核酸组分的分子量)。在其中Apt7AD用作解毒剂的实验中，解毒剂剂量为3mg/kg。作为对比，其中使用AptA AD的CH-AptA实验中，解毒剂剂量为5mg/kg。

[0246] a)全身抗凝。在注射PEG-Apt39之前取注射前血样，然后注射药物(注射时间为t=0)，在注射后5、15、25、60、90、120和150分钟取出血样。使用Hemochron 801 Junior和活化过的玻璃推顶式管，按照生产商的指引，以两个重复取全血之后立即现场进行活化凝血时间(ACT)，。然后将血样转移至含柠檬酸盐的真空采血管，并储存在冰上。制备血小板缺乏的血浆，按照标准方法进行APTT和PT实验(图14A)。

[0247] PEG-Apt39的体内抗凝效力优于CH-AptA。另外，相比于CH-AptA，PEG-Apt39的抗凝活性随时间的损失下降。这些结果与体外抗凝活性研究相反，体外抗凝活性研究表明，在体外合并的人血浆中，PEG-Apt39和CH-AptA的抗凝活性相等。

[0248] b)全身抗凝和药物中和。在注射PEG-Apt39之前取注射前血样，然后注射药物(0.5mg/kg；注射时间为t=0)，在药物注射后5和15分钟取出血样。在t=药物注射后15分钟时，给予REG1 S7AD(3mg/kg)，于药物注射后25、60、90、120和150分钟时取另外的血样。使用Hemochron 801 Junior和活化过的玻璃推顶式管，按照生产商的指引，以两个重复取全血之后立即现场进行活化凝血时间(ACT)。然后将血样转移至含柠檬酸盐的真空采血管，并储存在冰上。制备血小板缺乏的血浆，按照标准方法进行APTT和PT实验。

[0249] 在给予3mg/kg Apt7 AD的10分钟内，实现了PEG-Apt39抗凝活性的基本完全中和。在实验的整个剩余时间内，抗凝活性保持中和(初次表明药物中和后2小时又5分钟)。因此，PEG-Apt39的中和似乎优于CH-AptA，因为用40%以下剂量的解毒剂可达到相似的PEG-Apt39中和水平(3mg/kg Apt7 AD对5mg/kg REG1 AD)。此体内数据与合并人血浆的体外实验一致，在体外实验中，PEG-Apt39比AptA的任何先前制备物都更易被其匹配的解毒剂中和(图14B)。

[0250] c)系统性凝血、药物中和以及再抗凝。在注射PEG-Apt39之前取注射前血样，然后注射药物(0.5mg/kg；注射时间为t=0)，在药物注射后5和15分钟取出血样。在t=药物注射后15分钟时，给予Apt7 AD(3mg/kg)，于药物注射后25和40分钟时取另外的血样。在t=药物注射后45分钟时(给予解毒剂后30分钟)，再给予PEG-Apt39(0.5mg/kg)，于药物注射后50、60、90、120和150分钟时取另外的血样。使用Hemochron 801 Junior和活化过的玻璃推顶式管，按照生产商的指引，以两个重复取全血之后立即现场进行活化凝血时间(ACT)。然后将血样转移至含柠檬酸盐的真空采血管，并储存在冰上。制备血小板缺乏的血浆，按照标准方法进行APTT和PT实验(图15)。

[0251] 在给予中和解毒剂的30分钟内，于中和初始药物剂量后再给予PEG-Apt39是可行的。在给予第一剂和第二剂后达到的抗凝水平似乎彼此相同，提示在给予第二剂药物时在循环中几乎没有剩余的“游离”解毒剂。

[0252] 实施例9：血浆中形成的适体复合物的定量

[0253] 使用采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测的夹心型杂交实验测定血浆中的适体水平。适体定量使用两种寡核苷酸探针：DNA捕获探针和2'O甲基RNA检测探针。DNA捕获探针为15个核苷酸长，与适体3'端的15个核苷酸互补，并在其5'端包含生物素部分，使得可将含该探针的寡核苷酸复合物捕获至抗生物素蛋白包被的表面。2'O甲基RNA检测探针也是15个核苷酸长，与解毒剂结合的适体部分互补，并包含地高辛部分，使得能够使用标准酶联产荧光酶/底物试剂检测含该探针的复合物。

[0254] 通过捕获和检测探针与血浆中的适体杂交，随后利用5'-生物素基团将复合物固定在Neutravidin包被的微量滴定板表面上，实现适体定量。在板固定化反应之后，使用缀合至碱性磷酸酶(其催化底物荧光)的抗地高辛抗体对地高辛标记的2'-O-甲基RNA探针进行检测。然后检测荧光强度，其信号与存在于校正标准品和验证样品中的适体量成正比。

[0255] APTT实验中时间-凝血的浓度依赖性延长反映了猕猴血浆中适体Apt39(SEQ ID NO:88)的体外抗凝活性。进行血浆FIX实验，以帮助阐明猴血浆中的Apt39 APTT剂量-反应曲线。如表A所示，猴血浆中的APTT对FIX水平敏感。但是，对FIX水平下降的反应程度是适度的。FIX水平降低75%导致APTT增加1.4倍，FIX水平降低95%以上导致APTT加倍，血浆FIX水平降低99.9%使APTT产生2.5倍增加。

[0256]

[0257]

[0258] 表A中的数据表明，在猴中抑制血浆FIX活性的约90%需要约6μg/mL Apt39(即该浓度使APTT产生1.6倍增加)，于10-12μg/mL的Apt39浓度出现95%以上的血浆FIX活性抑制。

[0259] Apt39和Apt7AD在猕猴中的体内活性

[0260] 在猴中评价Apt39和Apt39/Apt7AD复合物的抗凝特性与这些化合物的血浆水平之间的关系。简言之，将12只猴分配为3个治疗组。组1接受抗FIXa适体Apt39，组2接受解毒剂Apt7AD，组3用Apt39治疗，并在3小时后用Apt7AD治疗。通过两个试验样品量逐步增加剂量，第一个剂量出现在研究的第4天，第二个剂量出现在第13天。为更好地理解对适体的剂量-反应，分配为组1的4只猴于第13天再分为两组，两只动物接受低剂量(组1a，5mg/kg)，两只动物接受高剂量(组1b，30mg/kg)。

[0261] 如图16所示，以5-30mg/kg的剂量给予Apt39在猴中产生显著水平的抗凝作用。适体给予后0.25-24小时，各个剂量水平的平均APTT超过60秒，相当于猴中<0.1%正常血浆FIX水平。在Apt39给予作用下APTT剂量依赖性增加。但是，一直到Apt39给予后6小时的时间点，适体血浆水平超过体外APTT剂量-反应曲线接近平台期的浓度(约40-50μg/mL；参见表B)，由于该事实，所以剂量-反应不即时明显。在给予后超过6小时的时间，由于适体浓度降低至该水平以下，所以剂量-反应更明显。在接受5和15mg/kg剂量的猴中，APTT是随动的，直至其回到基线。在5mg/kg剂量水平时，平均APTT在120小时时回到基线，在15mg/kg剂量水平时，平均APTT在192小时时回到基线，与体外APTT剂量-反应曲线(数据未列出)和在猴中观察到的约12小时半寿期均一致(参见表B)。全血活化凝血时间(ACT)数据真实反映了APTT数据(数据未列出)。

[0262] 在组1a动物中给予后24小时的平均Apt39浓度和这些动物的平均APTT之间存在着极佳的对应关系。以5mg/kg治疗的动物在24小时时的平均适体浓度为15.9μg/mL，平均APTT为61.1秒。

[0263]

[0264] 在仅用解毒剂治疗的组2动物中，平均APTT和ACT不受以任一测试剂量水平(30和60mg/kg)给予的解毒剂影响。收集给予后前24小时内的数个时间点的毒代动力学数据。如表C所示，在第4天注射30mg/kg或第13天注射60mg/kg后0.25小时接受解毒剂的动物，血浆中存在低但可检测水平的解毒剂。通过对比IV注射后(组1中)的适体浓度，解毒剂的给药后水平非常低。

[0265]

[0266] 用适体治疗动物后3小时接着用解毒剂治疗(组3)的APTT数据示于图17。和仅用适体治疗的动物数据相一致，以这些剂量水平给予适体产生显著水平的抗凝作用，在给予后0.25和3小时的平均APTT与两个剂量水平的基本完全FIX抑制相一致。随后给予Apt7AD在猴中快速和完全地中和Apt39的抗凝作用，在给予Apt7AD后15分钟内平均APTT返回基线。在用30/60mg/kg Apt39/Apt7AD治疗的组3动物中，在给予适体后的5天中APTT是随动的。在此时限内收集的APTT数据表明，适体的抗凝作用被持久中和，在120小时或约10个适体半寿期内在猴中没有抗凝作用再反弹的证据(图17)。

[0267] 收集组3动物给予Apt39后24小时内的毒代动力学数据(表D)。对于组3动物，检测游离适体和复合适体二者的血浆浓度。在给予解毒剂15分钟内，游离适体的平均浓度降低5,000-10,000倍，达到所使用实验定量下限(LLOQ)以下的水平。伴随游离适体水平的下降，15/30和30/60mg/kg剂量水平的复合适体平均血浆水平由实验的LLOQ以下分别增加至约125-220μg/mL，表明游离Apt39浓度快速降低是由于Apt7AD的结合。在给予解毒剂后长达3小时，游离适体的浓度保持在实验的LLOQ以下，与APTT结果一致。在给予解毒剂后21小时，在几只动物中可检测到非常低水平的Apt39(平均值仅为0.17μg/mL或以下)。

[0268]

[0269] 已参照各种具体和优选的实施方案与技术描述了本发明。应当理解的是，可进行许多变化和修改，而其仍属于本发明的精神和范围。

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冠状动脉张合微导管-专利编号CN109498959A	2020-05-12	264
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