领域

本发明涉及针对由鼠单克隆抗体L243识别的表位的人源化抗体。 在一个实施方案中，本发明涉及用于制备并使用此类抗体的组合物和 方法。特别地，本发明提供了人源化单克隆抗体hL243，其对主要组 织相容性复合物(MHC)的HLA基因簇D区中编码的人白细胞抗原 (HLA)是特异性的，在其他情况下称为HLA-DA。该抗体抑制 HLA-DR+细胞的增殖并且诱导TNF分子的表达和释放。

背景

在人中，主要组织相容性复合物(MHC)是在染色体6上的人白 细胞抗原(HLA)基因簇，其分成称为D、B、C和A的区域。D区 包含II类蛋白质的基因，所述II类蛋白质参与免疫系统细胞之间的合 作和相互作用。D区已涉及许多疾病，包括大多数自身免疫病。

一种抗体L243(下文称作mL243)是鼠IgG2a抗-HLA-DR抗体。 这种抗体在疾病例如自身免疫病的治疗中通过靶向小鼠HLA基因的 D区可能具有潜在用途。mL243证实有效抑制体外免疫功能并且对于 所有HLA-DR是单态的。然而，给人类患者施用小鼠抗体存在问题， 例如诱导人抗小鼠抗体(HAMA)应答。存在具有mL243的抗原特异 性、可以施用于人类受试者的抗体的需要。

概述

本发明的一个实施方案提供了对由鼠单克隆抗体mL243识别的表 位具有特异性的重组人源化抗体分子。这种表位可以是依赖于DR-α 链的抗原决定簇。依照这个实施方案，抗体可以是人源化CDR-移植 抗体。

例如，在一个实施方案中，对由鼠单克隆抗体mL243识别的表位 具有特异性的人源化抗体分子具有抗原结合位点，其中可变结构域的 至少一个互补性决定区(CDRs)来源于小鼠单克隆抗体mL243(MAb L243)并且人源化抗体分子的其余免疫球蛋白来源的部分来源于人免 疫球蛋白或其类似物。在本发明的一个具体实施方案中，人源化抗体 的所有3个重和轻链CDRs来源于mAb mL243。在本发明的另一实施 方案中，人源化抗体分子可以缀合至效应物或报道分子。

在一个例子中，本发明提供了具有重链可变结构域的人源化L243 抗体，其中可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3区以及一个或多个 构架残基27、38、46、68和91来自小鼠单克隆抗体mL243重链，并 且免疫球蛋白构架结构域的其余部分来自一条或多条人重链。依照这 个例子，抗体可以结合HLA-DR+细胞上的HLA-DR的至少一个表位， 并且增加细胞杀伤。在一个具体实施方案中，细胞杀伤可以增加，其 中对于杀伤而言既不需要细胞毒性附加物也不需要免疫效应物机制。

在本发明的另一实施方案中，人源化L243抗体可以包括轻链可 变结构域，其中可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3区以及一个或 多个构架残基37、39、48和49来自小鼠单克隆抗体mL243轻链，并 且免疫球蛋白构架结构域的其余部分来自一条或多条人轻链。依照这 个实施方案，抗体可以结合HLA-DR*细胞上的HLA-DR的至少一个 表位，并且增加细胞杀伤。在一个具体实施方案中，细胞杀伤可以增 加，其中对于杀伤而言既不需要细胞毒性附加物也不需要免疫效应物 机制。

在本发明的另一实施方案中，人源化L243抗体可以包括重链可 变结构域和轻链可变结构域，其中重链可变结构域的CDR1、CDR2 和CDR3区以及一个或多个构架残基27、38、46、68和91来自小鼠 单克隆抗体mL243重链，并且免疫球蛋白构架结构域的其余部分来自 一条或多条人重链。依照这个实施方案，人源化L243抗体可以包括 重链可变结构域和轻链可变结构域，其中轻链可变结构域的CDR1、 CDR2和CDR3区以及一个或多个构架残基37、39、48和49来自小 鼠单克隆抗体mL243轻链，并且免疫球蛋白构架结构域的其余部分来 自一条或多条人轻链。此外，抗体可以结合HLA-DR+细胞上的HLA- DR的至少一个表位，并且增加细胞杀伤。在一个具体实施方案中， 细胞杀伤可以增加，其中对于杀伤而言既不需要细胞毒性附加物也不 需要免疫效应物机制。

在本发明的一个实施方案中，如上所述的任何一种抗体可以在药 物组合物中使用。依照这个实施方案，包括本文所述的一种或多种抗 体的药物组合物可以包含如下文所述的另外治疗剂。

此外，本发明中的一个实施方案提供核酸分子，其编码如下所述 的公开的一种或多种抗体组合物、缀合物和融合蛋白。还可包括包含 这些核酸的表达载体和宿主细胞。

依照这些实施方案，可以包括用于制备抗体的方法，例如使用在 合适的生长培养基中培养的宿主细胞用于产生抗体。

在本发明的一个实施方案中，本发明公开的一种或多种抗体为了 治疗和/或诊断目的可以在药物组合物中使用。例如，一种或多种抗体 可以在治疗或药物组合物中施用于需要此类治疗的受试者(例如具有 免疫病例如自身免疫病的受试者)。

在本发明的一个更具体的实施方案中，人源化L243抗体具有重 链可变结构域，其具有图4中所示序列和/或具有轻链可变结构域，其 具有图3中所示序列。

在另一实施方案中，药物组合物可以进一步包含一种或多种另外 的结合分子，其特异性结合一种或多种选自下列的抗原：CD4、CDS、 CDS、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、 CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、 CD66(a，b，c，d)、CD74、CD80、CD126、CD138、CD154、B7、MUC1、 MUC2、MUC3、MUC4、MUC16、la、HM1.24、腱生蛋白、VEGF、 EGFR、CEA、CSAp、ILGF、胎盘生长因子、Her2/neu、碳酸酐酶IX、 IL-6、SI00、MART-1、TRP-1、TRP-2、gplOO、淀粉状蛋白及其组合， 其中另外的结合分子在本文公开的包含人源化L243抗体组合物和/或 抗体的递送媒介物的任何药物组合物之前、同时或之后给予。

在一个实施方案中，用于给需要此类治疗的受试者施用的药物组 合物可以包含人源化L243抗体和一种或多种肽、脂质、聚合载体、 胶粒、纳米微粒、或其组合；和一种或多种效应物。

本发明公开的一种或多种方法可以用于治疗疾病，包括但不限于 B细胞非霍奇金淋巴瘤、B细胞急性和慢性淋巴细胞白血病、伯基特 淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛细胞白血病、急性和慢性髓细胞白血病、 T细胞淋巴瘤和白血病、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血 症、癌、黑素瘤、肉瘤、神经胶质瘤和皮肤癌。癌可以选自口腔、胃 肠道、呼吸道、乳腺、卵巢、前列腺、子宫、膀胱、胰腺、肝、胆囊、 皮肤和睾丸癌。此外，一种或多种公开的方法可以用于治疗自身免疫 病，例如急性特发性血小板减少性紫瘢、慢性特发性血小板减少性紫 瘢、皮肌炎、西德纳姆氏舞蹈病、重症肌无力、系统性红斑狼疮、狼 疮肾炎、风湿热、多腺体综合征、大疱性类天疱疮、糖尿病、亨-舍二 氏紫瘢、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、高安氏动脉炎、阿狄森氏 病、类风湿性关节炎、多发性硬化、肉状瘤病、溃疡性结肠炎、多形 性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、古德帕斯彻氏 综合征、血栓闭塞性脉管炎、斯耶格伦氏综合征、原发性胆汁性肝硬 变、桥本氏甲状腺炎、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多发 性肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常天疱疮、韦格纳氏肉芽肿、膜性肾病、 肌萎缩性侧索硬化、脊髓痨、巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进 性肾小球性肾炎、牛皮癣、或纤维化肺泡炎。

在一个实施方案中，本发明的药物组合物可以用于治疗具有白血 病的受试者，所述白血病例如慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白 血病、慢性髓细胞白血病或急性髓细胞白血病。

在一个实施方案中，本发明的药物组合物可以用于治疗具有代谢 病例如淀粉样变性、或神经变性疾病例如阿尔茨海默氏病的受试者。 此外，本发明的药物组合物可以用于治疗具有免疫失调病症的受试 者。

本发明的其他目的、特征和优点由于下列详细描述将是显而易见 的。然而，应当理解说明本发明优选实施方案的详细描述和具体实施 例只为了举例说明而给出，因为本发明的精神和范围内的各种改变和 修饰由于这个详细描述对于本领域技术人员将是显而易见的。

附图简述

下列附图构成本说明书的一部分并且被包括以进一步证实本发明 的某些实施方案。通过参照这些附图中的一个或多个，结合本文呈现 的具体实施方案的详细描述可以更好地理解实施方案。

图1(以及SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)举例说明了小鼠抗 -HLA-DR抗体L243的VK的示例性DNA编码和氨基酸序列。推定的 CDR区是有下划线和标明的。核苷酸残基顺次进行编号。对于氨基酸 残基使用Kabat的Ig分子编号。关于含有字母(在顶部)的残基的编 号是前面残基的号码加字母，例如关于N52后的T的号码是52A；关 于82后的N、N和L的号码分别是82A、82B和82C。

图2(以及SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)举例说明了小鼠抗 -HLA-DR抗体L243的VH的示例性DNA编码和氨基酸序列。推定 的CDR区是有下划线和标明的。核苷酸残基顺次进行编号。如上所 述对于氨基酸残基使用Kabat的Ig分子编号。

图3(以及SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6)举例说明了人源化 L243VR的示例性DNA和氨基酸序列。氨基酸序列的粗体和下划线区 段表明如Kabat编号方案定义的CDRs。

图4(以及SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8)举例说明了人源化 L243VH的示例性DNA和氨基酸序列。氨基酸序列的粗体和下划线 区段表明如Kabat编号方案定义的CDRs。

图5(以及SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和 SEQ ID NO：12)举例说明了人RF-TS3和NEWM(构架4)、鼠L243 和hL243VH链的示例性氨基酸序列比对。圆点表明等同于RF-TS3 或NEWM中的相应残基的L243及其人源化版本中的残基。长划表示 引入的缺口以帮助比对。方框表示CDR区。hL243的N和C末端残 基(有下划线的)通过使用分段载体固定。因此，L243的相应末端残 基不与人VH序列的该残基进行比较。

图6(以及SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15 和SEQ ID NO：16)举例说明了人REI、鼠L243和hL243VK链的示 例性氨基酸序列比对。圆点表明等同于REI中的相应残基的L243中 的残基。长划表示引入的缺口以帮助比对。方框表示CDR区。hL243 的N和C末端残基(有下划线的)通过使用分段载体固定。因此，L243 的相应末端残基不与人序列的该残基进行比较。使用Kabat的编号方 案。

图7举例说明了hL243的示例性抗原结合特异性。与或不与饱和 浓度的mL234(用于封闭细胞表面抗原(“Ag”位点)一起预孵育的Raji 细胞重悬浮于包含1％BSA和10μg/ml纯化的hL243的PBS中并于4 ℃孵育1小时。洗涤后，细胞重悬浮于包含1％BSA和PE-标记的山 羊抗人IgG-Fc片段特异性抗体的PBS中。于4℃进一步孵育30分 钟后，细胞在Guava PCA中计数。(A)显示hL243与Raji人淋巴瘤 细胞(红色迹线)的特异性结合，其通过将细胞与mL243(蓝色迹线) 一起预孵育来封闭。(B)是在相等条件下用抗-CEA抗体(hMN-14) 代替hL243进行的阴性结合对照。

图8举例说明了在竞争性细胞表面结合测定法中比较hL243γ4P 和mL243的示例性Ag-结合亲和力。固定量(100,000cpm，-10uCi/ug) 的125l-标记的mL234(A)或hL243γ4P(B)与各种浓度(0.2-700nM) 的未标记的hL243γ4P(A)或mL2343(·)混合。将混合物加入Raji 细胞中并于室温孵育2小时。洗涤细胞以去除未结合的抗体并计数与 细胞相关的放射性。hL243γ4P和mL234显示彼此竞争结合细胞表面 Ag。在2种情况下hL243γ4P看起来比mL243更强烈地结合Raji细胞。

图9举例说明了通过直接细胞表面饱和结合和斯卡恰特作图分析 测定的hL243γ4P和mL243的示例性Ag-结合亲和力。各种浓度的125I- 标记的mL234(>>)或hL243γ4P(A)与2x105 Daudi人淋巴瘤细胞一 起于4℃孵育2小时，并且通过洗涤从细胞悬浮液中去除未结合的放 射性。计数细胞相关放射性，计算放射标记的抗体与细胞表面抗原的 特异性结合，并随后应用斯卡恰特作图分析以测定最大结合位点数目/ 细胞和表观抗原结合亲和常数：mL234或hL243γ4P与Daudi细胞表 面的最大结合是6x106分子/细胞；关于mL234或hL243γ4P测定的解 离常数分别为14和2.6nM。

图10举例说明了示例性h243在人血清补体的存在下有效杀伤靶 细胞：Daudi细胞在人血清补体的存在下与hL 243、hL243γ4P、hA20 (阳性对照)和hMN-14(阴性对照)一起孵育。hL243γ4P显示不产 生任何补体诱导的细胞毒性。

图11举例说明了如对于hL 243、hL243γ4P、hA20(阳性对照) 和1hMN-14(阴性对照)观察到的示例性LDH释放(A)和通过ADCC 的细胞裂解％(B)。

图12A-B举例说明了在2天结束时关于Daudi和Raji细胞系的示 例性体外增殖测定。

图13A-B举例说明了在3天结束时关于Daudi和Raji细胞系的示 例性体外增殖测定。

图14举例说明了注射了hL243γ4P的荷瘤SCID小鼠的示例性平 均存活时间。

图15举例说明了由L243、hL243(IgG4同种型)、hMN-14(人 源化MN-14IgG)和Ag8(鼠骨髓瘤来源的mAb)引起的狗淋巴瘤细 胞凋亡的示例性比较诱导(测量为具有亚GO/G1期DNA含量的细胞 ％)。L243和hL243当分别与山羊抗小鼠(GAM)和山羊抗人(GAH) 抗体交联时引起凋亡。

图16A-B举例说明了如通过3H-胸苷摄取测定法测定的，含或不 含山羊抗人IgG(GAH)的人源化抗体(hLL1、hLL2，利妥希玛、hA20、 hMN-14和hL243(IgG4同种型))对Namalwa人B细胞淋巴瘤细胞 系的示例性抗增殖效应。

图17举例说明了hL243γ4P相对于亲本鼠L243的结合特征。

图18A和18B举例说明了当暴露于本文公开的各种抗体时在 Raji、Ramos和Namalwa细胞系中的CDC测定。

图19举例说明了当SU DHL-6细胞暴露于本文公开的各种抗体 时的ADCC测定和钙黄绿素AM释放。

图20A和20B举例说明了hL243γ4P对本文公开的几种细胞系的 抗增殖效应。A.MTT研究和B.3H-胸苷摄取测定法。在B.的轴标记 中，hL243指γ4P形式。

图21A和21B举例说明了由空白表示的凋亡死细胞的诱导以及以 实心举例说明的凋亡细胞。A.在SU-DHL-6和Namalwa细胞中测量的 Sub G0 DNA和B.在4和24小时时的膜联蛋白V/7-ADD。使用的细 胞在处理前具有97％的存活率。

图22举例说明了在几种细胞系中使用JC-1测定法测得的线粒体 膜电位。

图23A和23B举例说明了在Daudi细胞中研究的切割的胱天蛋白 酶-3(A)和P-AKT(B)时间过程。

图24举例说明了使用鼠L243和L243γ4P治疗荷有Raji的SCID 小鼠。

发明详述

在下列部分中，描述了几种方法以详述本发明的各种实施方案。 对于本领域技术人员显而易见的是实践各种实施方案不需要采用本文 概述的所有或甚至某些具体细节，而是通过常规实验法可以修饰浓 度、时间和其他具体细节。在某些情况下，众所周知的方法或组分未 包括在说明书中以便防止不必要地掩盖各种实施方案。

在本发明的一个实施方案中，提供了结合HLA-DR的人源化小鼠 抗体。在一个具体实施方案中，可以提供人源化mL243抗体，其结合 HLA-DR但与相应的鼠抗体比较具有减少的免疫原性。依照这个实施 方案，抗体可以抑制表达HLA-DR分子的细胞例如淋巴瘤细胞增殖(或 诱导细胞杀伤)。可替代地，本文公开的抗体可以用于结合靶分子并 增加细胞杀伤的可能性。提供了包含抗体的药物组合物和治疗与 HLA-DR+细胞增殖相关的疾病的方法。

mL243是先前由Lampson和Levy(J.Immunol.(1980)125 293) 描述的单克隆抗体。抗体的轻和重链可变区的氨基酸序列在图1和2 (以及分别的SEQ.ID.1和2)中显示。mL243已保藏在美国典型培 养物保藏中心，Rockville，MD，保藏号为ATCC HB55。

在接下来的说明书中，可以使用许多术语并且提供下列定义以帮 助理解本发明。

除非另有说明，“一个”或“一种”指“一个或多个”。

如本文说明书使用的，“受试者”可以包括但不限于哺乳动物例如 人，或哺乳动物例如狗、猫、雪貂、兔、猪、马或牛。

“抗体依赖细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是细胞介导的反应， 其中表达Fc受体的非特异性细胞毒性细胞(自然杀伤细胞、嗜中性 粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体并随后引起靶细胞裂 解。用于介导ADCC的主要细胞是自然杀伤细胞(只表达FcDRIII) 和单核细胞(表达FcDRI、FcDRII和FcDRIII)。

“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指在补体的存在下靶的裂解。补 体活化途径通过补体系统的第一种组分(Clq)结合与相关抗原复合 的分子(例如抗体)起始。

“Fc受体”或“FcR”用于描述结合抗体的Fc区的受体。CDC和ADCC 都需要MAb的Fc部分并且ADCC的效应可以通过增加对效应细胞上 的FcyR(IgG Fc受体)的结合亲和力而增强(Shinkawa，等人，J.Biol. Chem.278：3466-3473，2003；Shields等人，J.Biol Chem.211： 26733-26740，2002；Shields等人，J.Biol.Chem.276：6591-6604，2002； Davies等人，Biotechnol.Bioeng.74：288-294，2001；和Umana等 人，Nature Biotechnol.176-180，1999)。“效应细胞”指能够执行效应 细胞功能的任何类型的细胞。众所周知的是具有不同的专门免疫功能 的效应细胞基于其广泛多样的细胞表面抗原的差异表达可以彼此区分 开，所述细胞表面抗原例如可以与结合结构域多肽特异性结合的本文 描述的许多抗原。效应细胞包括但不限于能够直接介导活性的任何细 胞，所述活性是免疫系统功能的组分，包括天然或由于基因工程而具 有此类能力的细胞。效应细胞包括免疫球蛋白的细胞表面受体，例如 免疫球蛋白恒定区的受体，并且包括通常称为“Fc受体”(FcR)的受 体类别。能够介导ADCC的细胞是效应细胞的例子。其他例子包括自 然杀伤(NK)细胞、肿瘤浸润性T淋巴细胞(TIL)、细胞毒性T淋 巴细胞(CTL)和粒细胞例如包括过敏应答机制的细胞。效应细胞还 影响造血源的细胞包括在骨髓样和淋巴样细胞系中各种分化阶段上的 细胞，以及可能(但不必)表达一种或多种类型的功能性细胞表面FcR 的细胞，例如T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬 细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、 肥大细胞、血小板、红细胞和此类细胞的前体、祖细胞(例如造血干 细胞)、静止、活化和成熟形式。其他效应细胞可以包括能够介导免 疫功能的非造血起源的细胞，例如内皮细胞、角质化细胞、成纤维细 胞、破骨细胞、上皮细胞及其他细胞。免疫效应细胞还可包括介导细 胞毒性或细胞抑制事件，或胞吞、吞噬或胞饮事件的细胞，或实现凋 亡诱导、或实现微生物免疫或中和微生物感染的细胞，或介导过敏、 炎症、超敏和/或自身免疫反应的细胞。

“抑制生长”的抗体是在体外和/或体内抑制病变细胞生长的抗体。 通过抑制病变细胞的生长，减少S期中的细胞百分比。在体外约0.5 μg/mL-20μg/mL的抗体浓度下以及在成人患者中约0.5mg/kg-15 mg/kg的剂量下，通过本发明抗体的生长抑制优选百分比可以大于20 ％，优选大于50％。

如本文使用的“抗体”指全长(即天然存在或通过正常免疫球蛋白 基因片段重组方法形成的)免疫球蛋白分子(例如IgG抗体)或免疫 球蛋白分子的免疫活性(即特异性结合)部分，如抗体片段。术语“抗 体”还包括“人源化”抗体和甚至通过噬菌体展示、基因和染色体转染方 法以及其他方法可以产生的全人抗体。该术语还包括单克隆抗体、多 克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)。

“免疫原应答”或“抗原应答”是在合适的细胞已与其接触后导致产 生针对化合物的抗体的应答。用于诱发免疫原应答的化合物称为免疫 原或抗原。在免疫原应答中产生的抗体特异性结合用于诱发应答的免 疫原。

用于诱发免疫原应答的化合物称为免疫原或抗原。“表位”或“抗原 决定簇”是刺激针对表位的特异性免疫应答的免疫原表面上的区域。 在蛋白质特别是变性蛋白中，表位一般由邻接氨基酸序列定义和表 示。然而，在非变性蛋白的情况下，表位还包括结构例如活性位点， 其通过蛋白质三维折叠以这样的方式形成使得来自蛋白质氨基酸序列 的分离部分的氨基酸达到彼此紧密的物理接触。

天然存在的(野生型)抗体分子是由4条多肽链-2条相同的重 链和2条相同的轻链组成的Y型分子，所述多肽链通过二硫键共价连 接在一起。2种类型的多肽链都具有恒定区和可变区，所述恒定区在 同类(即IgA、IgM等)抗体中不会改变或最低程度地改变。可变区 对于特定抗体是独特的并且包括表位的识别元件。重和轻链的羧基末 端区域在序列中是保守的并且称为恒定区(也称为C结构域)。氨基 末端区域(也称为V结构域)在序列中是可变的并且负责抗体特异性。 抗体主要通过位于其V结构域中的6个短互补性决定区(CDRs)特 异性识别并结合抗原。

抗体的每条轻链与一条重链缔合，并且2条链通过每条链的羧基 末端区域中的半胱氨酸残基之间形成的二硫桥进行连接，这是构成其 抗原结合结构域部分的每条链的氨基末端区域的远侧。抗体分子通过 在称为绞链区的区域中2条重链之间的二硫桥进一步稳定，在更接近 重链羧基末端的位置而不是在重和轻链之间形成二硫桥的位置。绞链 区还提供了抗体的抗原结合部分的柔性。

抗体的抗原结合特异性可以通过其位于轻和重链的氨基末端区域 中的可变区决定。轻链和缔合的重链的可变区形成识别特异性表位的 “抗原结合结构域”；抗体因此具有2个抗原结合结构域。野生型抗体 中的抗原结合结构域针对免疫原性蛋白质的相同表位，并且单个野生 型抗体因此能够同时结合2个免疫原性蛋白质分子。因此，野生型抗 体是单特异性(即针对独特的抗原)和二价的(即能够结合2个抗原 分子)。

“多克隆抗体”在针对具有许多表位的蛋白质的免疫原应答中产 生。多克隆抗体的组合物(例如血清)因此包括针对蛋白质内的相同 和不同表位的各种不同抗体。用于生产单克隆抗体的方法是本领域已 知的(参见，例如Cooper等人，Section III of Chapter 11 in：Short Protocols in Molecular Biology，2nd Ed.，Ausubel等人，eds.，John Wiley 和Sons，New York，1992，第11-37-11-41页)。

“抗肽抗体”(也称为“单特异性抗体”)在针对短(一般为5-20 个氨基酸)免疫原性多肽的体液应答中产生，所述短免疫原性多肽对 应其来源的蛋白质的少数(优选一个)分离表位。许多抗肽抗体包括 针对蛋白质的特定部分，即针对包含至少一个，优选只有一个表位的 氨基酸序列的各种不同抗体。用于生产抗肽抗体的方法是本领域已知 的(参见，例如Cooper等人，Section III of Chapter 11 in：Short Protocols in Molecular Biology，2nd Ed.，Ausubel等人，eds.，John Wiley和Sons， New York，1992，第11-42-11-46页)。

“单克隆抗体”是识别免疫原性蛋白质的单个特异性表位的特异性 抗体。在多数单克隆抗体中，每个抗体分子等同于多数中的其他分子。 为了分离单克隆抗体，首先鉴别表达、展示和/或分泌特定单克隆抗体 的克隆细胞系；这种克隆细胞系可以在生产本发明抗体的一种方法中 使用。用于制备克隆细胞系和由此表达单克隆抗体的方法是本领域已 知的(参见，例如Fuller等人，Section II of Chapter 11 in：Short Protocols in Molecular Biology，2nd Ed.，Ausubel等人，eds.，John Wiley和Sons， New York，1992，第11-22-11-11-36页)。

“裸抗体”是不包含另外修饰例如与毒素或用于结合放射性核素的 螯合物缀合的完整抗体分子。裸抗体的Fc段可以提供效应物功能， 例如补体结合和ADCC(抗体依赖性细胞毒性)，其实行可以导致细 胞裂解的机制。参见，例如Markrides，Therapeutic inhibition of the complement system，Pharmacol.Rev.50：59-87，1998。在一个实施方 案中，抗体的治疗作用可能需要Fc区的效应物功能(参见，例如Golay 等人，Biologic response of B lymphoma cells to anti-CD20 monoclonal antibody rituximab in vitro：CD55and CD59 regulate complement- mediated cell lysis，Blood 95：3900-3908，2000)。

在另一实施方案中，Fc段可能不需要，或者在某些情况下对于受 试者的治疗性处理是需要的。依照这个实施方案，可能引起其他机制 例如凋亡。Vaswani和Hamilton，Humanized antibodies as potential therapeutic drugs.Ann.Allergy Asthma Immunol.81：105-119，1998。

“抗体片段”是完整抗体的一部分例如F(ab′)a、F(ab)2、Fab′、Fab、 Fv、sFv等。不管结构如何，抗体片段结合由全长抗体识别的相同抗 原。例如，抗CD20单克隆抗体片段结合CD20的表位。术语“抗体片 段”还包括通过结合特异性抗原以形成复合物如同抗体一样起作用的 任何合成或基因改造的蛋白质。例如，抗体片段包括由可变区组成的 分离的片段，例如由重和轻链可变区组成的“Fv”片段，轻和重链可变 区通过肽接头连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白质”)，和由模拟 超变区的氨基酸残基组成的最小识别单位。

通过野生型抗体的限制性蛋白水解产生的抗体片段称为蛋白水解 的抗体片段。这些包括，但不限于，下列：通过抗体有限地暴露于蛋 白水解酶例如胃蛋白酶或无花果蛋白酶从抗体中释放的“F(ab′)2片 段”。F(ab′)2片段包括2个“臂”，其中每一个包括针对并特异性结合共 同抗原的可变区。2个Fab′分子通过重链绞链区中的链间二硫键连接； Fab′分子可以针对相同(二价)或不同(双特异性)表位。

“Fab1片段”包含单个抗原结合结构域，其包括Fab和通过绞链区 的另外的重链部分。

“Fab′-SH片段”一般由F(ab′)2片段产生，其通过F(ab′)2片段中的 H链之间的二硫键结合在一起。用温和型还原剂例如，作为非限制性 例子的β-巯基乙胺处理断裂二硫键，并且从一个F(ab′)2片段中释放出 2个Fab′片段。Fab′-SH片段是单价和单特异性的。

“Fab片段”(即包含抗原结合结构域并包括通过二硫键桥接的轻 链和一部分重链的抗体片段)通过木瓜蛋白酶消化完整抗体产生。方 便的方法是使用固定在树脂上的木瓜蛋白酶从而使得酶可以容易地去 除并终止消化。Fab片段不含有在F(ab′)2片段中存在的H链之间的二 硫键。

“单链抗体”是一种类型的抗体片段。术语单链抗体通常缩写为 “scFv”或“sFv”。这些抗体片段使用分子遗传学和重组DNA技术产生。 单链抗体由包括VH和VL结构域的多肽链组成，其相互作用以形成抗 原结合位点。VH和VL结构域通常通过10-25个氨基酸残基的肽连 接。

术语“单链抗体”进一步包括但不限于，2个单链抗体(其中每一 个可以针对不同表位)通过二硫键连接在一起的二硫键连接的Fv (dsFv)；不同特异性的2个分离的scFvs使用肽接头连接的双特异性 sFv；双抗体(diabody)(当第一个sFv的VH结构域与第二个sFv的 VL结构域装配，并且第一个sFv的VL结构域与第二个sFv的VH结构 域装配时形成的二聚sFv；双抗体的2个抗原结合区可以针对相同或 不同表位)；和三抗体(triabody)(以类似于双抗体的形式形成的三聚 sFv，但其中3个抗原结合结构域在单个复合物中产生；3个抗原结合 结构域可以导向相同或不同表位)。

“互补决定区肽”或“CDR肽”是另一种形式的抗体片段。CDR肽(也 称为“最小识别单位”)是对应单个互补性决定区(CDR)的肽，并且 可以通过构建编码目的抗体的CDR的基因来制备。此类基因可以例 如通过使用聚合酶链式反应合成来自抗体产生细胞的RNA的可变区 来制备。参见，例如，Larrick等人，Methods：A Companion to Methods in Enzymology 2：106，1991。

在“半胱氨酸修饰的抗体”中，半胱氨酸氨基酸通过基因操作在抗 体表面上插入或置换并用于将抗体经由例如二硫桥缀合至另一种分 子。关于抗体的半胱氨酸置换或插入已得到描述(参见美国专利号 5,219,996)。用于将Cys残基导入IgG抗体的恒定区中，用于在抗体 的位点特异性缀合中使用的方法由Stimmel等人(J.Biol.Chem 275： 330445-30450，2000)描述。

“人源化抗体”是用于减少非人蛋白质量的重组蛋白质，其中CDRs 来自一个物种的抗体，例如啮齿类动物抗体，例如使用蛋白质工程技 术以啮齿类动物抗体的重和轻可变链交换为某些人重和轻可变结构 域。抗体分子的恒定结构域来源于人抗体。参见Gussow和Seemann， Humanization of monoclonal antibodies，Method Enzymol.203：99-121， 1991以及Vaswani和Hamilton，Ann.Allergy Asthma Immunol.81： 105-119，1998。

抗体片段的生产

所要求的方法和/或组合物的某些实施方案可以涉及抗体片段。此 类抗体片段可以通过常规方法经由胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗 体获得。例如，抗体片段可以通过使用胃蛋白酶酶促切割抗体产生以 提供称为F(ab′)2的5S片段。这种片段可以使用硫醇还原剂切割和任 选地使用由二硫键切割产生的巯基的阻断基进一步切割，以产生3.5S Fab′单价片段。可替代地，使用胃蛋白酶酶促切割产生2个单价Fab 片段和Fc片段。用于生产抗体片段的示例性方法在美国专利号 4,036,945；美国专利号4,331,647；Nisonoff等人，1960，Arch.Biochem. Biophys.，89：230；Porter，1959，Biochem.J.，73：119；Edelman等 人，1967，Methods in Enzymology，第422页(Academic Press)，和 Coligan等人(eds.)，1991，Current Protocols in Immunology，(John Wiley & Sons)中公开。

切割抗体的其他方法，例如分离重链以形成单价轻-重链片段，进 一步切割片段或其他酶促、化学或基因技术也可以使用，只要片段结 合由完整抗体识别的抗原。例如，Fv片段包括VH和VL链的缔合。这 种缔合可以是非共价的，如Inbar等人，1972，Proc.Nat′l.Acad.Sci. USA，69：2659中描述的。可替代地，可变链可以通过分子间二硫键 连接或通过化学试剂例如戊二醛交联。参见Sandhu，1992，Crit.Rev. Biotech.，12：437。

优选地，Fv片段包括通过肽接头连接的VH和VL链。这些单链抗 原结合蛋白(sFv)通过构建包括DNA序列的结构基因来制备，所述 DNA序列编码通过寡核苷酸接头序列连接的VH和VL结构域。结构基 因插入表达载体中，所述表达载体随后引入宿主细胞例如大肠杆菌 中。重组宿主细胞合成含有桥接2个V结构域的接头肽的单个多肽链。 用于生产sFvs的方法是本领域众所周知的。参见Whitlow等人，1991， Methods：A Companion to Methods in Enzymology 2：97；Bird等人， 1988，Science，242：423；美国专利号4,946,778；Pack等人，1993， Bio/Technology，11：1271，和Sandhu，1992，Crit.Rev.Biotech.，12： 437。

另一种形式的抗体片段是编码单个互补性决定区(CDR)的肽。 CDR肽(“最小识别单位”)可以通过构建编码目的抗体的CDR的基 因获得。此类基因例如通过使用聚合酶链式反应合成来自抗体产生细 胞的RNA的可变区来制备。参见Larrick等人，1991，Methods：A Companion to Methods in Enzymology 2：106；Ritter等人(eds.)，1995， Monoclonal Antibodies：Production，Engineering and Clinical Application，第166-179页(Cambridge University Press)；Birch等 人，(eds.)，1995，Monoclonal Antibodies：Principles and Applications， 第137-185页(Wiley-Liss，Inc.)。

在一个实施方案中，人源化抗体可以连接至效应物或报告分子。 例如，用于螯合重金属原子的大环，或毒素例如蓖麻毒素，可以通过 共价桥接结构附着至人源化抗体。可替代地，重组DNA技术的操作 可以用于生产人源化抗体分子，其中完整抗体分子的Fc片段、Cu3或 Cn2结构域已由功能性非免疫球蛋白蛋白质例如酶或毒素分子代替或 已通过肽键附着到其上。

在本发明的另一实施方案中，人源化抗体可以包括具有全长重和 轻链的完整抗体分子；其片段，例如Fab、Fab′、F(ab′)2或Fv片段； 单链抗体片段，例如单链Fv、轻链或重链单体或二聚体；包括通过连 接结构彼此结合的2、3、4或更多个抗体或其片段的多价单特异性抗 原结合蛋白；或具有与MAb mL243一样的特异性的这些或任何其他 分子中任何一种的片段或类似物。在一个具体实施方案中，抗体可以 包括具有全长重和轻链的完整抗体分子。

人源化L243抗体

嵌合和人源化抗体

嵌合抗体是人抗体的可变区已由例如包括小鼠抗体互补性决定区 (CDRs)的抗-L243小鼠抗体的可变区代替的重组蛋白。嵌合抗体当 施用于受试者时显示减少的免疫原性和增加的稳定性。用于构建嵌合 抗体的方法是本领域众所周知的(例如，Leung等人，1994，Hybridoma 13：469)。

嵌合单克隆抗体可以通过将来自小鼠免疫球蛋白的重和轻可变链 的小鼠CDRs转移到人抗体的相应可变结构域中进行人源化。嵌合单 克隆抗体的小鼠构架区(FR)同样用人FR序列代替。为了保持人源 化单克隆的稳定性和抗原特异性，一个或多个人FR残基可以由小鼠 对应物残基代替。人源化单克隆抗体可以用于受试者的治疗性处理。 人源化抗体对靶的亲和力还可以通过CDR序列的选择性修饰来增加 (WO0029584A1)。用于生产人源化单克隆抗体的技术是本领域众所 周知的。(参见，例如，Jones等人，1986，Nature，321：522；Riechmann 等人，Nature，1988，332：323；Verhoeyen等人，1988，Science，239： 1534；Carter等人，1992，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA，89：4285；Sandhu， Crit.Rev.Biotech.，1992，12：437；Tempest等人，1991，Biotechnology 9：266；Singer等人，J.Immun.，1993，150：2844.)

其他实施方案可以涉及非人灵长类动物抗体。用于在狒狒中产生 治疗上有用的抗体的一般技术可以在例如Goldenberg等人，WO 91/11465(1991)，和Losman等人，Int.J.Cancer 46：310(1990)中 找到。

在另一实施方案中，抗体可以是人单克隆抗体。此类抗体从转基 因小鼠中获得，所述转基因小鼠已工程化以响应抗原攻击产生特异性 人抗体。以这种技术将人重和轻链基因座的元件引入来源于胚胎干细 胞系的小鼠品系中，其包含内源性重链和轻链基因座的靶向破坏。转 基因小鼠可以合成对人抗原特异的人抗体并且小鼠可以用于生产分泌 人抗体的杂交瘤。用于从转基因小鼠获得人抗体的方法由Green等 人，Nature Genet.7：13(1994)，Lonberg等人，Nature 368：856(1994)， 和Taylor等人，Int.Immun.6：579(1994)描述。

在一个实施方案中，人源化抗体可以包括在人抗体构架序列内的 mL243的CDR区序列并且含有人抗体恒定区序列。更具体而言，人 源化抗体可以包括在CDR1(31-35)、CDR2(50-65)和CDR3(95 -102)上都包含mL243VH残基的重链可变结构域(VH)。在另一 实施方案中，轻链可变结构域(VL)的CDRs在CDR1(24-34)、CDR2 (50-56)和CDR3(89-97)上都对应mL243VL残基。在本发明 的另一具体实施方案中，在人源化设计中保留的其他鼠L243VH残基 在一个或多个下列位置上：F27、K38、K46、A68和F91。类似地， 在人源化设计中保留的VL中的鼠L243残基在一个或多个下列位置 上：R37、K39、V48、F49和G100。

关于同时保留原始非人抗体的抗原特异性的人源化抗体序列的进 一步细节例如在2001年11月16日提交的美国专利申请号09/988,013 中公开，其完整文本引入本文作为参考。

在一个实施方案中，本发明进一步提供了具有可变区结构域的 CDR-移植的人源化抗体重链，其包括来源于亚类I的人重链的受体构 架和来源于mL243供体的抗原结合区，其中构架在F27、K38、K46、 A68和F91中的一个或多个位置上包括mL243供体残基。分别参见图 3和4。

在本发明的一个实施方案中，可以提供具有可变区结构域的CDR- 移植的人源化抗体轻链，其包括来源于亚类I的人κ轻链的受体构架 和mL243供体的抗原结合区，其中构架在R37、K39、V48、F49和 G100中的一个或多个位置上包括mL243供体残基。

在本发明实施方案的CDR-移植的人源化抗体分子中，其余非- L243免疫球蛋白来源(受体)部分可以来源于任何合适的人免疫球蛋 白，条件是人源化抗体可以折叠使得它保留特异性结合HLA-DR的能 力。优选地，使用的人构架(FR)的类型具有与供体抗体相同/相似 的分类/类型。

在本发明的一个实施方案中，可以选择人构架以最大化与供体抗 体序列的同源性，特别是在空间靠近或邻近CDRs的位置上。依照这 个实施方案，人源化L243VH或VL的构架(即FR1-4)可以来源于 人抗体的组合。可以用于构建CDR-移植抗体的人构架的例子是LAY、 POM、TUR、TEI、KOL、NEWM、REI、RF和EU；优选地对于重 链使用人RF-TS3FR1-3和NEWM FR4，并且对于轻链使用REI FR1- 4。本文使用的V结构域残基编号系统在Kabat等人，(1991)，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Edition，United States Department of Health and Human Services中描述。关于人RF-TS3(FR 1-3和NEWM FR4)、mL243和hL243VH链的比较性氨基酸序列比对 参见图5。关于人REI、mL243和hL243VL链的比较性氨基酸序列 比对参见图6。

适当时人源化抗体分子的轻和重链可变结构域可以融合至人轻或 重链恒定结构域(除非另有说明术语“重链恒定结构域”包括绞链区)。 存在的人源化抗体分子的人恒定结构域可以针对提议的抗体功能进行 选择。在一个实施方案中，人恒定结构域可以基于效应物功能的缺乏 进行选择。融合至重链可变区的重链恒定结构域可以是人IgA(a1或 a2链)、IgG(71，72、j3＞或y4链)或IgM(u链)的那些。优选使 用人y链。可以融合至轻链可变区的轻链恒定结构域包括人λ和k链。

在本发明的一个具体实施方案中，使用y1链。在本发明的再一具 体实施方案中，使用γ4链。y4链的使用在某些情况下可以增加受试 者中hL243的耐受性(减少的副作用和输液反应，更大的耐受性等)。

在一个实施方案中，可以使用人恒定结构域的类似物。这些包括 但不限于与相应的人结构域比较包含一个或多个额外的氨基酸的那些 恒定结构域，或其中相应的人结构域的一个或多个现有氨基酸已删除 或改变的那些恒定结构域。此类结构域可以通过例如寡核苷酸定向诱 变获得。

如本文使用的，术语‘改变的’当与抗体结合补体的能力一起使用 时指与开始未改变的抗体比较抗体结合补体的能力减少。改变合适的 氨基酸可以改变抗体结合补体的能力。如本文使用的，短语‘基本上’ 减少补体结合指人补体结合优选少于或等于使用野生型抗体可见的水 平的30％，更优选少于或等于20％，并且最优选少于或等于10％。

改变的补体结合能力可以通过本领域众所周知的技术产生，例如 删除残基、在分子中的合适位置上插入糖基化位点，或交换不同同种 型抗体的低级绞链区。

编码HL243抗体的基因的制备

本领域已知的任何分子生物学标准技术可以用于制备编码根据本 发明的抗体的DNA序列。例如，DNA序列可以使用寡核苷酸合成技 术完全或部分合成。适当时可以使用定点诱变和聚合酶链式反应 (PCR)技术。合适的方法包括如例如“PCR Technology Principles and Applications for DNA Amplification”(1989)，Ed.H.A.Erlich，Stockholm Press，N.Y.，London，中描述的PCR链重叠操作和PCR诱变，以及 寡核苷酸定向诱变(Kramer等人，Nucleic.Acid.Res.12 9441(1984))。

任何分子生物学标准技术还可以用于制备编码CDR-移植产物的 DNA序列。例如，DNA序列可以使用寡核苷酸合成技术完全或部分 合成。适当时可以使用定点诱变和聚合酶链式反应(PCR)技术。可 以使用先存在的可变结构域区的寡核苷酸定向合成(Jones等人(1986) Nature 321 522-525)和寡核苷酸定向诱变(Verhoeyen等人(1988) Science 23 1534-1536)。还可以使用利用T4 DNA聚合酶的酶促填入 有缺口的寡核苷酸(Queen等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86 10029-10033)。任何合适的宿主细胞/表达载体系统可以用于表达编码 嵌合或CDR-移植的重和轻链的DNA序列。“重组宿主”可以是包含克 隆载体或表达载体的任何原核或真核细胞。这个术语还包括那些原核 或真核细胞，以及已进行基因工程化以在宿主细胞的染色体或基因组 中包含克隆基因的转基因动物。可以有利地使用细菌例如大肠杆菌和 其他微生物系统，特别用于表达抗体片段，例如Fv、Fab或Fab’片段 和单链抗体片段，例如单链Fvs。还可使用真核宿主例如哺乳动物细 胞表达系统获得根据本发明的抗体，特别用于生产较大的嵌合或CDR- 移植抗体产物。合适的哺乳动物宿主细胞包括骨髓瘤细胞，例如Sp2/0 和NSO细胞，以及中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，杂交瘤细胞系和对 于表达抗体有用的其他哺乳动物细胞。

如本文使用的“表达载体”是包括在宿主细胞中表达的目的基因的 DNA分子。一般地，基因表达置于某些调节元件的控制下，所述调节 元件包括组成型或诱导型启动子、组织特异性调节元件和增强子。此 类基因可以说是与调节元件“可操作地连接”。在进一步的方面，一个 实施方案还包括编码本发明抗体的重和轻链的DNA序列、包含这些 DNA序列的克隆和表达载体、用这些DNA序列转化的宿主细胞、以 及用于生产重或轻链和抗体分子的方法，包括在转化的宿主细胞中表 达这些DNA序列。

编码人免疫球蛋白序列的DNA可以通过本领域已知的任何方法 获得。例如，优选的人受体构架例如-LAY、POM、KOL、REI、EU、 TUR、TEI、RF和NEWM的氨基酸序列是广泛可用的。类似地，人 轻和重链亚类的共有序列也是可用的。技术人员知道多个密码子序列 可以编码相同氨基酸，并且在各种实施方案中公开的核酸序列可以用 编码相同氨基酸序列的可替代序列取代。技术人员还知道取决于用于 从核酸序列表达蛋白质的细胞系的物种来源，密码子选择可以优化以 增强在所选择的物种中的表达。此类物种优选的密码子频率是本领域 众所周知的。

在一个实施方案中，本文公开的抗体可以是完整抗体，或如上文 说明的，其片段、单体或二聚体或多价单特异性抗原结合蛋白。因此， 本发明的一个进一步的方面，可以提供包括通过连接结构彼此结合的 2、3、4或更多个抗体或其片段的多价单特异性抗原结合蛋白，这种 蛋白质不是天然免疫球蛋白，所述抗体或片段中的每一个具有对于由 鼠MAb L243识别的表位的特异性，所述抗原结合蛋白任选地与效应 物或报道分子缀合。

依照这些实施方案，每种抗体或片段可以是人源化抗体或如上文 定义的其片段，并且多价单特异性抗原结合蛋白可以是人源化多价单 特异性抗原结合蛋白。然而，可以考虑非人源化例如鼠多价单特异性 抗原结合蛋白并且一个实施方案可以延伸至其中可应用的这些。

在一个具体实施方案中，多价抗原结合蛋白可以提供通过连接结 构彼此结合的2、3、或4种抗体或其片段。在另一实施方案中，用于 生产人源化抗体的方法可以包括：i)在表达载体中生产编码包括可变 结构域的抗体重或轻链的DNA序列，其中可变结构域的至少一个 CDRs可以来源于mL243 MAb并且抗体链的其余免疫球蛋白来源部分 来源于人免疫球蛋白；ii)在表达载体中生产编码包括可变结构域的 互补抗体轻或重链的DNA序列，其中可变结构域的至少一个CDRs 来源于MAb mL243并且抗体链的其余免疫球蛋白来源部分可以来源 于人免疫球蛋白；iii)用上述DNA序列转染宿主细胞；和iv)培养 转染的细胞系以生产人源化抗体分子。

重组hL243在宿主细胞中的生产

在一个实施方案中，用于生产重组hL243的宿主细胞系可以用2 种载体转染，第一种载体包含编码轻链来源的多肽的DNA序列，并 且第二种载体包含编码重链来源的多肽的DNA序列。优选地，除去 涉及的编码序列和可选标记。载体是相同的，以便尽可能确保每条多 肽链相等地表达。转染可以通过本领域技术人员已知的任何技术进 行。参见例如Maniatis等人(1982)(Molecular Cloning，Cold Spring Harbor，New York)以及Primrose和Old(1980)(Principles of Gene Manipulation，Blackwell，Oxford)。用于转染的一种具体技术可以是 电穿孔。其他例子包括磷酸钙介导的转染、阳离子-脂质介导的转染等。 在一个可替代的实施方案中，可以使用单个载体，该载体包括编码轻 链和重链来源的多肽的DNA序列以及可选标记。

用于生产包含抗体片段的重组融合蛋白的一般方法

编码识别特异性表位的抗体片段的核酸序列可以通过本领域众所 周知的技术获得。例如，分泌所需特异性抗体的杂交瘤可以用于获得 编码抗体的DNA，所述DNA可以使用已知技术例如通过PCR或通过 传统cDNA克隆技术进行制备。可替代地，可以构建Fab′表达库或 抗体噬菌体展示文库以筛选具有所需特异性的抗体片段。

编码抗体片段的核酸随后可以直接或经由编码肽间隔物的序列连 接至编码DDD或AD的核酸。生产编码这些类型的融合蛋白的核酸 序列的方法是本领域众所周知的并且在下面的实施例中进一步讨论。

在另一实施方案中，另外的氨基酸残基可以加入由A/DDD或B/AD 组成的模块亚单位的N或C末端，其中确切的融合位点可以取决于是 DDD还是AD附着至N或C末端(或在内部位置上)。另外的氨基酸 氨基可以包括肽标记、信号肽、细胞因子、酶(例如，前药激活酶)、 激素、毒素、肽药物、膜相互作用肽或其他功能性蛋白质。

蛋白质或肽可以完全或部分地在溶液中或在固体支持物上依照常 规技术合成。各种自动合成仪是商购可得的并且可以依据已知规程使 用。参见，例如Stewart和Young，(1984，Solid Phase Peptide Synthesis， 2d.ed.，Pierce Chemical Co.)；Tam等人，(1983，J.Am.Chem.Soc.， 105：6442)；Merrifield，(1986，Science，232：341-347)；以及Barany 和Merrifield(1979，The Peptides，Gross and Meienhofer，eds.，Academic Press，New York，第1-284页)。通常为约6直至约35-50个氨基 酸的短肽序列可以通过此类方法容易地合成。可替代地，可以采用重 组DNA技术，其中编码目的肽的核苷酸序列插入表达载体中，转化 或转染到合适的宿主细胞中，并在适合于表达的条件下培养。

用于在所需宿主细胞中生产重组蛋白的方法是本领域众所周知 的。为了促进纯化，稳定束缚结构可以包含合适的肽标记，例如FLAG 序列或聚HIS序列，以促进其使用相关亲和柱纯化。

在一个实施方案中，Fv片段可以包含通过肽接头连接的VH和VL 链。这些单链抗原结合蛋白(sFv)通过构建包括DNA序列的结构基 因来制备，所述DNA序列编码通过寡核苷酸接头序列连接的VH和VL 结构域。结构基因插入表达载体中，所述表达载体随后引入宿主细胞 例如大肠杆菌中。重组宿主细胞合成含有桥接2个V结构域的接头肽 的单个多肽链。用于生产sFvs的方法是本领域众所周知的。参见 Whitlow等人，1991，Methods：A Companion to Methods in Enzymology 2：97；Bird等人，1988，Science，242：423；美国专利号4,946,778； Pack等人，1993，Bio/Technology，11：1271，和Sandhu，1992，Crit. Rev.Biotech.，12：437。

另一种形式的抗体片段是编码单个互补决定区(CDR)的肽。CDR 肽(“最小识别单位”)可以通过构建编码目的抗体的CDR的基因获 得。此类基因例如通过使用聚合酶链式反应合成来自抗体产生细胞的 RNA的可变区来制备。参见Larrick等人，1991，Methods：A Companion to Methods in Enzymology 2：106；Ritter等人(eds.)，1995，Monoclonal Antibodies：Production，Engineering and Clinical Application，第166 -179页(Cambridge University Press)；Birch等人，(eds.)，1995， Monoclonal Antibodies Principles and Applications，第137-185页 (Wiley-Liss，Inc.)。

用于表达稳定束缚结构的构成亚单位的合适宿主细胞或细胞系是 本领域技术人员已知的。人宿主细胞的使用使得任何表达的分子能够 以人糖基化模式进行修饰。然而，这并不表示人宿主细胞对于公开的 方法是必需或优选的。

双特异性抗体和缀合物

在某些实施方案中，本文公开的L243配体可以与附着至配体的 另一种分子组合使用。附着可以是共价的或非共价的。在某些实施方 案中，L243配体可以附着至双特异性抗体，即具有2个不同结合位点 的抗体-一个针对L243配体并且另一个针对疾病相关靶抗原。可以 靶向与血管发生、癌、转移或细胞运动性相关的任何疾病或状况，包 括但不限于，原发癌、转移癌、增生、类风湿性关节炎、炎性肠病、 克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、肉状瘤病、哮喘、水肿、肺高压、肿瘤 组织的形成和发展、牛皮癣、糖尿病性视网膜病、黄斑变性、角膜移 植物排斥、新生血管性青光眼、心肌血管发生、斑块内新生血管形成、 再狭窄、血管创伤后新内膜形成、毛细血管扩张、血友病关节、血管 纤维瘤、慢性炎症相关的纤维化、肺纤维化、深静脉血栓形成和伤口 肉芽肿。用于构建和使用双特异性和多特异性抗体的方法在例如 2/11/2004提交的美国专利申请公开号20050002945中公开，其完整文 本引入本文作为参考。

当双特异性抗体部分靶向针对肿瘤相关抗原时，预期还可以这样 靶向任何类型的肿瘤和任何类型的肿瘤抗原。可以靶向的示例性肿瘤 类型包括急性成淋巴细胞白血病、急性骨髓源白血病、胆囊癌、乳癌、 子宫颈癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病、结肠直肠癌、 子宫内膜癌、食管、胃、头和颈癌、霍奇金氏淋巴瘤、肺癌、甲状腺 髓样癌、非霍奇金氏淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、神经胶质瘤、黑素瘤、 肝癌、前列腺癌和膀胱癌。优选的是具有L243组成型表达或可以被 刺激生产L243的肿瘤。

各种重组方法可以用于生产双特异性抗体和抗体片段。例如，双 特异性抗体和抗体片段可以在转基因家畜的乳中生产。(参见，例如， Colman，A.，Biochem.Soc.Symp.，63：141-147，1998；美国专利号 5,827,690，各自引入本文作为参考。)制备分别包含编码成对的免疫 球蛋白重和轻链的DNA区段的2种DNA构建体。将片段克隆到包含 启动子序列的表达载体中，所述启动子序列优先在哺乳动物上皮细胞 中表达。例子包括但不限于，来自兔、牛和羊酪蛋白基因，牛α-乳球 蛋白基因，羊β-乳球蛋白基因和小鼠乳清酸蛋白基因的启动子。优选 地，插入的片段在其3′侧与来自乳腺特异性基因的同源基因组序列侧 面相接。这提供了聚腺苷酸化位点和转录物稳定序列。将表达盒共注 射到哺乳动物受精卵的原核中，其随后植入受体雌性动物的子宫中并 允许妊娠。出生后，通过DNA分析在后代中筛选2种转基因的存在。 为了使抗体存在，重和轻链基因必须同时在同一细胞中表达。使用本 领域已知的标准免疫性方法分析来自转基因雌性动物的乳中抗体或抗 体片段的存在和功能性。抗体可以使用本领域已知的标准方法从乳中 纯化。

预靶向

用于使用双特异性抗体的一种策略包括预靶向方法，其中效应分 子例如抗血管生成或抗肿瘤配体在双特异性抗体已施用后施用于受试 者。包括L243配体的结合位点和患病组织的位点的双特异性抗体定 位于患病组织并增加效应物L243配体定位于患病组织的特异性(美 国专利申请号20050002945)。因为效应分子可以比双特异性抗体快得 多地从循环中清除，所以当使用预靶向策略时与效应分子直接连接至 疾病靶向抗体时比较正常组织可以减少暴露于效应分子。

已开发预靶向方法以增加检测或治疗剂的靶：背景比率。预靶向 和生物素/抗生物素蛋白方法的例子在例如Goodwin等人，美国专利 号4,863,713；Goodwin等人，J.Nucl.Med.29：226，1988；Hnatowich 等人，J.Nucl.Med.28：1294，1987；Oehr等人，J.Nucl.Med.29： 728，1988；Klibanov等人，J.Nucl.Med.29：1951，1988；Sinitsyn等 人，J.Nucl.Med.30：66，1989；Kalofonos等人，J.Nucl.Med.31： 1791，1990；Schechter等人，Int.J.Cancer 48：167，1991；Paganelli等 人，Cancer Res.51：5960，1991；Paganelli等人，Nucl.Med.Commun. 12：211，1991；美国专利号5,256,395；Stickney等人，Cancer Res.51： 6650，1991；Yuan等人，Cancer Res.51：3119，1991；美国专利号 6,077,499；美国序列号09/597,580；美国序列号10/361,026；美国序 列号09/337,756；美国序列号09/823,746；美国序列号10/116,116；美 国序列号09/382,186；美国序列号10/150,654；美国专利号6,090,381； 美国专利号6,472,511；美国序列号10/114,315；美国临时申请号 60/386,411；美国临时申请号60/345,641；美国临时申请号60/3328,835； 美国临时申请号60/426,379；美国序列号09/823,746；美国序列号 09/337,756；和美国临时申请号60/342,103中描述，所有这些引入本 文作为参考。

在某些实施方案中，双特异性抗体和可靶向构建体可以具有治疗 和/或使正常或患病组织和器官成像的用途，例如使用美国专利号 6,126,916；6,077,499；6,010,680；5,776,095；5,776,094；5,776,093； 5,772,981；5,753,206；5,746,996；5,697,902；5,328,679；5,128,119； 5,101,827；和4,735,210中描述的方法，各自引入本文作为参考。另 外的方法在1999年6月22日提交的美国申请序列号09/337,756和2001 年4月3日提及的美国申请序列号09/823,746中描述。

hL243的治疗和诊断用途

在另一实施方案中，本发明还提供了包含本发明实施方案的抗体 的治疗和诊断组合物。此类组合物可以包括根据本发明的抗体连同药 学可接受的赋形剂、稀释剂或载体，例如用于体内使用。

“治疗剂”是与抗体部分分开、同时或顺次施用，或缀合至抗体部 分，即抗体或抗体片段、或亚片段的分子或原子，并且在疾病治疗中 有用。治疗剂的例子包括抗体、抗体片段、药物、毒素、酶、核酸酶、 激素、免疫调节剂、寡核苷酸、干扰RNA、螯合剂、硼化合物、光敏 剂或染料和放射性同位素。

“诊断/检测剂”是与抗体部分，即抗体或抗体片段，或亚片段，连 接或缀合施用的分子或原子，并通过定位包含抗原的细胞在疾病的诊 断或检测中有用。有用的诊断/检测剂包括但不限于，放射性同位素、 染料(例如含有生物素-链霉亲和素复合物)、造影剂、荧光化合物或 分子和用于核磁共振成像(MRI)的增强剂(例如顺磁离子)，以及微 粒或脂质体作为用于超声成像的试剂的例子。超声增强剂在美国专利 申请US20040219203 A1和US20050014207 A1中公开，并且因此整体 引入作为参考。优选的是充气脂质体。参见Maresca，G.等人，Eur J. Radiol.Suppl 2S171-178(1998)；Demos，Sm.等人J.Drug Target 5 507-518(1998)；和Unger，E.等人，Am J.Cardiol.8158G-61G(1998)。 可替代地，双特异性抗体可以用于靶向脂质体。在一个此类实施方案 中，脂质体是二价DTPA-肽共价附着至脂质体脂质膜外表面的充气脂 质体。美国专利申请US20040018557A1公开了此类脂质体，并整体 引入作为参考。

美国专利号6,331,175描述了MRI技术和与MRI增强剂缀合的抗 体的制备并整体引入作为参考。在一个具体方法中，诊断/检测剂可以 选自放射性同位素、用于在核磁共振成像中使用的增强剂、超声剂和 荧光化合物。为了给抗体组分装上放射性金属或顺磁离子，可能必须 使其与具有长尾部的反应物反应，所述长尾部附着多个螯合基团用于 结合离子。此类尾部可以是聚合物例如聚赖氨酸、多糖或具有侧基的 其他衍生或可衍生的链，所述侧基可以结合螯合基团例如乙二胺四乙 酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、多胺、冠醚、双 缩氨基硫脲、聚肟、以及已知对这个目的有用的相似基团。螯合物可 以使用标准化学偶联至抗体。螯合物可以通过基团连接至抗体，这使 得能够与分子形成键，伴随免疫反应性最低限度地丧失和最小的聚集 和/或内部交联。用于缀合螯合物与抗体的其他更罕见的方法和反应物 在名称为“Antibody Conjugates”、1989年4月25日授权给Hawthorne 的美国专利4,824,659中公开，所述专利的公开内容整体引入本文作 为参考。在另一具体实施方案中，有用的金属-螯合物组合可以包括与 一般能量范围为60-4,000keV的诊断同位素一起使用的2-苄基-DTPA 及其一甲基和环己基类似物，所述同位素例如1251、1311、1231、124I、62Cu、 MCu、18F、inln、67Ga；68Ga、″″″Tc、94mTc、HC、13N、15O、76Br、97Zr， 用于放射成像。同一螯合物当与非放射性金属例如锰、铁和钆复合时 可以用于MRI(当连同本文公开的任何抗体一起使用时)。大环螯合 物例如NOTA、DOTA和TETA具有与各种金属和射电金属一起使用 的用途，最特别的是分别与镓、钇和铜的放射性核素一起使用。此类 金属-螯合物复合物可以通过修整环大小以适于目的金属来稳定。本文 的实施方案涵盖了其他环型螯合物例如大环聚醚，其对于稳定结合核 素是有利的，例如223Ra对于RAIT。

治疗剂的例子包括但不限于抗体、抗体片段、药物，包括化学治 疗剂、毒素、酶、酶-抑制剂、核酸酶、激素、激素拮抗剂、免疫调节 剂、细胞因子、螯合剂、硼化合物、铀原子、光敏剂和放射性核素。

有用的诊断/检测剂包括但不限于，放射性同位素、染料(例如含 有生物素-链霉亲和素复合物)、不透射线的材料(例如碘、钡、镓和 铊化合物等)、造影剂、荧光化合物或分子和用于核磁共振成像(MRI) 的增强剂(例如顺磁离子)。美国专利号6,331,175描述了MRI技术和 与MRI增强剂缀合的抗体的制备并整体引入作为参考。优选地，诊断 /检测剂选自用于核成像、手术中和内窥镜检查的放射性同位素；用于 在核磁共振成像或超声检查法中使用的增强剂；用于X射线和计算机 断层摄影术的造影和造影剂；和用于荧光透视法包括内窥镜荧光透视 法的荧光化合物。

用于本公开内容目的的化学治疗剂包括所有已知的化学治疗剂。 已知的化学治疗剂包括但不限于紫杉烷、氮芥、氮丙啶衍生物、烷基 磺酸盐、亚硝基脲、三氮烯、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、 反义寡核苷酸、转录因子的拮抗剂或抑制剂、干扰RNAs、生物碱、 抗生素、酶、铂配位复合物、COX-2抑制剂、凋亡剂、取代的尿素、 甲肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、或拮抗剂。在一个更具体的实施方 案中，化学治疗剂可以包括类固醇、黄体酮、雌激素、抗雌激素或雄 激素。在另一具体实施方案中，化学治疗剂可以包括放射菌素、阿扎 立平、阿纳托唑、氮杂胞苷、博来霉素、苔藓抑素-1、白消安、卡莫 司汀、希乐葆、苯丁酸氮芥、顺铂、依立替康(CPT-11)、卡铂、克 拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、氮烯咪胺、多西他奇、氮烯咪胺、放 线菌素D、道诺红霉素、地塞米松、二乙基己烯雌酚、多柔比星、乙 炔基雌二醇、磷雌氮芥、依托泊苷、5-氟脱氧尿苷、氟达拉滨、氟他 胺、氟尿嘧啶、氟甲睾酮、吉西他滨、己酸羟孕酮、羟基脲、依达比 星、异磷酰胺、L-天冬酰胺酶、亚叶酸、罗莫司汀、二氯甲基二乙胺、 乙酸甲羟孕酮、乙酸甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、氨甲蝶呤、米托 蒽醌、rnithramycin、丝裂霉素、米托坦、奥沙利铂、丁酸苯酯、泼尼 松、甲基苄肼、紫杉醇、喷司他丁、司莫司汀链唑霉素、SN-38、它 莫西芬、紫杉烷、紫杉酚、丙酸睾酮、沙立度胺、硫鸟嘌呤、噻替 派、替尼泊苷、托泊替康、尿嘧啶氮芥、长春碱、长春瑞滨或长春新 碱。

某些合适的化学治疗剂在Remington’s Pharmaceutical Sciences 19th Ed.(Mack Publishing Co.1995)中描述。其他合适的化学治疗剂 例如实验性药物是本领域技术人员已知的。

在本发明的一个实施方案中，毒素可以包括但不限于蓖麻毒素、 相思豆毒素、核糖核酸酶、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素A、美洲商陆 抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素或假单胞菌内毒 素。

在本发明的一个实施方案中，酶也是有用的治疗剂并且可以选自 下列组，包括但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-类固醇 异构酶、酵母醇脱氢酶、a-磷酸甘油脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根 过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、p-半乳糖苷 酶、核糖核酸酶、尿素酶、过氧化氢酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、葡萄 糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。

如本文使用的，术语“免疫调节剂”包括细胞因子，干细胞生长因 子，淋巴毒素例如肿瘤坏死因子(TNF)，和造血因子例如白介素(例 如白介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18和IL-21)、 集落刺激因子(例如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细 胞集落刺激因子(GM-CSF))、干扰素(例如干扰素-α、-β和-γ)、称 为“S1因子”的干细胞生长因子、以及促红细胞生成素和血小板生成 素。合适的免疫调节剂部分的例子包括IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、 IL-21、干扰素-y、TNF-a等。可替代地，受试者可以接受干扰素组合 物和分开施用的细胞因子，所述细胞因子可以在本文公开的组合物施 用之前、同时或之后施用。本发明的实施方案可以包括缀合至免疫调 节剂的组合物。

为了本公开内容的目的，细胞因子包括任何细胞因子，包括但不 限于IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、干扰素- α、干扰素-β和干扰素-γ。它还可以是集落刺激因子，例如GM-CSF、 G-CSF、促红细胞生成素、血小板生成素等。

此外，螯合剂可以包括但不限于DTPA、DOTA、TETA或NOTA 或合适的肽，可检测的标记例如荧光分子、或细胞毒性剂例如重金属 或放射性核素可以与其缀合。例如，治疗上有用的免疫缀合物可以通 过将光敏剂或染料缀合至抗体复合材料获得。本文预期荧光组合物例 如荧光染料、和其他色原体、或染料例如对可见光敏感的卟啉，已通 过将合适的光导向损伤而检测和治疗损伤。在治疗中，这已称为光辐 射、光疗法或光动力疗法(Jori等人(eds.)，Photodynamic Therapy of Tumors and Other Diseases(Libreria Progetto，1985)；van den Bergh， Chem.Britain 22：430，1986)。此外，预期用于实现光疗法、与光敏 化染料偶联的单克隆抗体可以用于本文的诊断或治疗目的。Mew等 人，J.Immunol.130：1473，1983；idem.，Cancer Res.45：4380，1985； Oseroff等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：8744，1986；idem.， Photochem.Photobiol.46：83，1987；Hasan等人，Prog.Clin.Biol.Res. 288：471，1989；Tatsuta等人，Lasers Surg.Med.9：422，1989；Pelegrin 等人，Cancer 67：2529，1991。然而，这些初期研究不包括使用内窥 镜治疗应用，特别是伴随抗体片段或亚片段的使用。因此在一个实施 方案中本文预期的是包括光敏剂或染料的免疫缀合物的治疗用途。因 此，本治疗方法可以包含包括光敏剂或染料的免疫缀合物的治疗用 途。内窥镜检查方法和疗法在美国专利号4,932,412；5,525,338； 5,716,595；5,736,119；5,922,302；6,096,289；和6,387,350中描述， 所述专利整体引入本文作为参考。

在本发明的一个实施方案中，可以使用核素。在一个具体实施方 案中，本文预期的是具有有用的诊断或治疗特性的放射性核素，例如 分别为铟-111或钇-90。其他有用的核素包括但不限于，F-18、P-32、 Sc-47、Cu-62、Cu-64、Cu-67、Ga-67、Ga-68、Y-86、Y-90、Zr-89、 Tc-99m、Pd-109、Ag-111、In-111、I-123、I-125、1-131、Sm-153、Gd-155、 Gd-157、Tb-161、Lu-177、Re-186、Re-188、Pt-197、Pb-212、Bi-212、 Bi-213、Ra-223、Ac-225、As-72、As-77、At-211、Au-198、Au-199、 Bi-212、Br-75、Br-76B、C-11、Co-55Co、Dy-166、Er-169、F-18、Fe-52、 Fe-59、Ga-67、Ga-68、Gd-154-158、Ho-166、1-120、1-121、1-124、 In-110、In-111、M194、Lu-177、Mn-51、Mn-52、Mo-99、N-13、O-15、 P-32、P-33、Pb-211、Pb-212、Pd-109、Pm-149、Pr-142、Pr-143、Rb-82、 Re-189、Rh-105、Sc-47、Se-75、Sr-83、Sr-89、Tb-161、Tc-94、Tc-99、 Y-86、Y-90或Zr-89。例如，合适的诊断性放射性核素包括但不限于 In-110、In-111、Lu-177、F-18、Fe-52、Cu-62、Cu-64、Cu-67、Ga-67、 Ga-68、Y-86、Zr-89、Tc-94m、Tc-94、Tc-99m、I-120、I-123、I-124、 I-125、I-131、Gd-154-158、P-32、C-11、N-13、0-15、Re-186、Re-188、 Mn-51、Mn-52m、Co-55、As-72、Br-75、Br-76、Rb-82m、Zr-89和 Sr-83。典型的诊断性放射性核素发射25-10,000keV的粒子和/或正 电子。

另外，合适的治疗性放射性核素包括但不限于In-111、Lu-177、 Bi-212、Bi-213、At-211、Cu-62、Cu-64、Cu-67、Y-90、1-125、1-131、 P-32、P-33、Sc-47、Ag-111、Ga-67、、Pr-142、Sm-153、Tb-161、Dy-166、 Ho-166、Re-186、Re-188、Re-189、Pb-212、Ra-223、Ac-225、Fe-59、 Se-75、As-77、Sr-89、Mo-99、Rh-105、Pd-109、Pr-143、Pm-149、Er-169、 Ir-194、Au-198、Au-199、Ac-225和Pb-211。典型的治疗性阳离子发 射20-10,000keV的粒子和/或正电子。

有用的β-粒子-发射核素的最大衰变能量优选是20-5,000keV、 更优选100-4,000keV、并最优选500-2,500keV。还优选的是基本 上伴随俄歇-放射粒子的衰变的放射性核素。例如，Co-58、Ga-67、 Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-111、Sb-119、1-125、Ho-161、 Os-189m和Ir-192。有用的俄歇-粒子-发射核素的衰变能量优选＜1,000 keV、更优选＜100keV、并最优选＜70keV。还优选的是基本上伴随 α-粒子产生而衰变的放射性核素。此类放射性核素包括但不限于： Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、 Fr-221、At-217、Bi-213和Fm-255。有用的α-粒子-发射放射性核素 的衰变能量优选2,000-10,000keV、更优选3,000-8,000keV、并最 优选4,000-7,000keV。

其他有用的治疗剂包括金属，例如作为光动力疗法一部分的那 些，和核素，例如在基于中子捕获操作的治疗中有价值的那些。特别 地，锌、铝、镓、镥和钯对于光动力疗法有用并且B-10、Gd-157和 U-235对于中子俘获疗法有用。

在一个实施方案中，金属可以用作诊断剂，包括用于核磁共振成 像技术的那些。这些金属包括但不限于：钆、锰、铁、铬、铜、钴、 镍、镝、铼、铕、铽、钬和钕。为了给抗体组分装上放射性金属或顺 磁离子，可能必须使其与具有长尾部的反应物反应，所述长尾部附着 多个螯合基团用于结合离子。例如此类尾部可以是聚合物例如多聚赖 氨酸、多糖或具有侧基的其他衍生或可衍生的链，所述侧基可以结合 螯合基团例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、 卟啉、多胺、冠醚、双缩氨基硫脲、聚肟、以及已知对这个目的有用 的相似基团。此外，螯合物可以使用标准化学偶联至肽。螯合物可以 通过基团连接至抗体，这使得能够与分子形成键，伴随免疫反应性最 低限度地丧失和最小的聚集和/或内部交联。用于缀合螯合物与抗体的 其他方法和反应物在名称为“Antibody Conjugates”、1989年4月25日 颁发给Hawthorne的美国专利4,824,659中公开，所述专利的公开内 容整体引入本文作为参考。在一个具体实施方案中，有用的金属-螯合 物组合可以包括与一般能量范围为20-2,000keV的诊断同位素一起 使用的2-苄基-DTPA及其一甲基和环己基类似物，所述同位素例如 1251、1311、1231、124I、62Cu、MCu、18F、inln、67Ga；68Ga、″″″Tc、94mTc、 HC、13N、15O、76Br、97Zr，用于放射成像。同一螯合物当与非放射性 金属例如锰、铁和钆复合时可以用于MRI(当连同本文公开的任何抗 体一起使用时)。大环螯合物例如NOTA、DOTA和TETA可以具有与 各种金属和射电金属一起使用的用途，最特别的是分别与镓、钇和铜 的放射性核素一起使用。此类金属-螯合物复合物可以通过修整环大小 至目的金属而变得非常稳定。本文的实施方案涵盖了其他环型螯合物 例如大环聚醚，其对于稳定结合核素是有利的，例如223Ra对于RAIT。

在本发明的一个实施方案中，治疗上有用的免疫缀合物可以通过 将光敏剂或染料缀合至抗体复合材料获得。荧光和其他色原体、或染 料例如对可见光敏感的卟啉，已通过将合适的光导向损伤用于检测和 治疗损伤。在治疗中，这已称为光辐射、光疗法或光动力疗法(Jori 等人(eds.)，Photodynamic Therapy of Tumors and Other Diseases (Libreria Progetto，1985)；van den Bergh，Chem.Britain 22：430， 1986)。此外，单克隆抗体已与光敏化染料偶联用于完成光疗法。Mew 等人，J.Immunol.130：1473，1983；idem.，Cancer Res.45：4380， 1985；Oseroff等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA 83：8744，1986；idem.， Photochem.Photobiol 46：83，1987；Hasan等人，Prog，Clin.Biol.Res. 288：471，1989；Tatsuta等人，Lasers Surg.Med.9：422，1989；Pelegrin 等人，Cancer 67：2529，1991。然而，这些初期研究不包括使用内窥 镜治疗应用，特别是伴随抗体片段或亚片段的使用。因此在本发明的 一个实施方案中预期包括光敏剂或染料的免疫缀合物的治疗用途。

适合于在本发明实施方案中使用的顺磁离子包括但不限于铬 (III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕 (HI)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、 钬(III)和铒(III)，而钆是特别优选的。

在其他背景例如X射线成像中有用的离子包括但不限于镧(III)、 金(III)、铅(II)、和特别是铋(III)。荧光标记包括若丹明、荧光素 和renographin。若丹明和荧光素通常经由异硫氰酸酯中间体连接。造 影和对比材料对于增强X射线和计算机断层摄影术有用，并且包括碘 化合物、钡化合物、镓化合物、铊化合物等。特异性化合物包括钡、 泛影葡胺、乙碘油、柠檬酸镓、碘卡明酸、碘西他酸、碘酰胺、 iodiparmde、碘沙酸、iogulamide、碘海醇、碘必乐、碘番酸、碘普西 酸、碘西法酸、碘丝酸、碘砜葡胺、iosemetic acid、碘酞硫、碘替酸、 碘他拉酸、碘托西酸、碘克沙酸、羟泛影酸、碘泊酸盐、葡甲胺、甲 泛葡胺、甲泛影钠、丙碘酮和氯化亚铊。因此，在另一实施方案中， 可以提供包括本文公开的抗体，与药学可接受的赋形剂、稀释剂或载 体组合的治疗、药物或诊断组合物。

在本发明的另一实施方案中，可以提供用于制备治疗、药物或诊 断组合物的方法，包括将本文公开的抗体连同药学可接受的赋形剂、 稀释剂或载体一起混合。

抗体和组合物可以根据使用它们的疗法以任何合适的形式和量用 于施用。

在一个实施方案中，治疗、药物或诊断组合物可以采取用于施用 的任何合适的形式，并且优选适合于肠胃外施用的形式，例如通过注 射或输注，例如通过快速浓注或持续输注。当产物是用于输注注射时， 它可以采取在油或水媒介物中的悬浮液、溶液或乳状液的形式，并且 它可以包含配制剂例如悬浮、防腐、稳定和/或分散剂。可替代地，抗 体或组合物可以是干燥形式，在使用前用合适的无菌液体重建。

本文预期治疗和诊断用途可以包括给人受试者施用有效量的根据 本文公开的实施方案的抗体。施用的确切剂量将根据使用的抗体以及 患者的年龄、性别和状况而变，但一般可以是约0.1mg-1000mg， 例如约1mg-500mg。抗体可以作为单次剂量或以连续的方式经过一 段时间施用。适当时剂量可以重复。

在一个例子中，本文公开的抗体和组合物可以根据使用它们的治 疗以任何合适的形式和量用于施用。抗体施用的剂量取决于待治疗状 况的性质以及抗体是预防地使用还是用于治疗现有状况。剂量还可根 据患者的年龄和状态进行选择。抗体的治疗剂量因此可以是例如优选 0.1-25mg/kg体重/单次治疗剂量，并且对于单次治疗剂量最优选0.1 -10mg/kg体重。

在一个实施方案中，本文公开的任何抗体可以依照常规实践进行 配制用于通过任何合适途径施用，并且一般可以是液体形式(例如溶 于无菌的生理学可接受缓冲液的抗体溶液)用于通过例如静脉内、腹 膜内、皮下或肌内途径施用。

本文预期的“免疫缀合物”是抗体、融合蛋白、或其缀合至至少一 种治疗和/或诊断/检测剂的片段。诊断/检测剂可以包括放射性核素或 非放射性核素、造影剂(例如用于核磁共振成像、计算机断层摄影术 或超声)，并且放射性核素可以是γ-、β-、α-、俄歇电子-或正电子发 射同位素。

如本文使用的，术语“抗体融合蛋白”是重组生产的抗原结合分子， 其中2种或多种相同或不同的天然抗体、单链抗体或含有相同或不同 特异性的抗体片段区段进行连接。融合蛋白的价态指融合蛋白具有的 与抗原或表位结合的臂或位点的总数目；即单价、二价、三价或多价。 抗体融合蛋白的多价指它在与抗原的结合中可以利用多重相互作用， 从而增加与抗原结合的亲和力。特异性指抗体融合蛋白能够结合多少 不同的抗原或表位；即单特异性、双特异性、三特异性、多特异性。 使用这些定义，天然抗体例如IgG是二价的因为它具有2个结合臂， 但是是单特异性的因为它结合一种抗原。单特异性、多价的融合蛋白 具有对于表位的超过一个的结合位点但只结合在相同抗原上的相同表 位，例如具有2个与相同抗原反应的结合位点的双抗体。融合蛋白可 以包括不同抗体组分的多价或多特异性组合或相同抗体组分的多重拷 贝。融合蛋白可以另外包括治疗剂。适合于此类融合蛋白的治疗剂的 例子包括免疫调节剂(“抗体-免疫调节剂融合蛋白”)和毒素(“抗体- 毒素融合蛋白”)。一种优选的毒素包括核糖核酸酶(RNase)，优选重 组RNase。

在另一实施方案中，选择性键合可以通过使用异双功能接头例如 马来酰亚胺-羟基琥珀酰亚胺酯实现。酯与抗体或片段的反应可以衍生 抗体或片段上的胺基团，并且衍生物随后可以与例如具有游离巯基的 抗体Fab片段(或，具有巯基通过例如Traut试剂与其附着的较大片 段或完整抗体)反应。此类接头较不可能交联相同抗体中的基团并改 善键合的选择性。

在一个具体实施方案中，本文公开的抗体或片段可以在远离抗原 结合位点的位点处连接。这可以通过例如如上所述与切割的链间巯基 键合来实现。另一种方法涉及使具有氧化的碳水化合物部分的抗体与 具有至少一种游离胺官能团的另一种抗体反应。这产生起始的希夫碱 (亚胺)键，所述键优选通过还原为仲胺例如通过硼氢化物还原来稳 定，以形成最终产物。对于小分子，此类位点特异性键合在美国专利 号4,671,958中公开，并且对于较大的附加物在美国专利号4,699,784 中公开。

具有靶特异性的F(ab′)2片段的链间二硫桥可以用半胱氨酸还原， 避免轻-重链键合，以形成Fab′-SH片段。SH基团可以用过量二-马来 酰亚胺接头(1，1′-15(亚甲基二-4，1-亚苯基)二-马来酰亚胺激活。

在一个实施方案中，本文公开的hL243抗体以及具有不同特异性 的其他结合分子可以在组合治疗中使用。例如，多特异性抗体可以包 括由鼠单克隆抗体mL243识别的表位的至少一个结合位点，以及由鼠 单克隆抗体mL243识别的另一种表位的至少一个结合位点，或另一种 抗原。此外，多价抗体(包括对于相同表位或抗原的多个结合位点)， 或抗体可以是多价和多特异性的。

在一个具体实施方案中，结合分子可以是融合蛋白。在一个更具 体的实施方案中，融合蛋白可以包含人源化、嵌合、人或鼠L243抗 体的4种或多种Fvs或Fab′s或如本文所述的片段。在另一实施方案 中，抗体融合蛋白可以包含人源化、嵌合、人或鼠L243MAb的mAbs 或片段的一种或多种Fvs或Fab′s或如本文所述的片段。依照这些实 施方案，可以包括来自对另一种抗原特异的抗体的一种或多种Fvs或 Fab′s，其对除HLA抗原以外的细胞标记是特异的。例如，非HLA抗 原可以包括选自B细胞系抗原的肿瘤标记(例如用于治疗B细胞恶性 肿瘤的CD19、CD20或CD22)。在另一例子中，非HLA抗原还可以 在引起其他类型的恶性肿瘤的其他细胞上表达，例如黑素瘤中的SI 00 等。此外，细胞标记可以是非B细胞系抗原，例如选自HLA-DR、CD30、 CDS3、CD52、CD66、MUC1和TAC。

在一个实施方案中，本文公开的L243抗体可以与其他抗体组合 并用于治疗患有或怀疑发生疾病的受试者。依照这个实施方案，L243 抗体或其组合物可以与抗癌单克隆抗体例如人源化单克隆抗体(例如 hA20(CD20 Mab)组合并用于治疗癌症。在一个更具体的实施方案 中，L243的HLA-DR抗体可以与抗癌单克隆抗体(例如hA20)组合 并用于具有或怀疑发生疾病的受试者。本文预期的是hL243抗体可以 作为分开的抗体组合物与一种或多种其他分开的抗体组合物组合使 用，以及作为双功能抗体使用例如hL243的一种和hA20的另一种。 依照这个实施方案，hL243抗体可以是hL243的HLA-DR。在另一具 体实施方案中，疾病可以包括患有此类疾病的受试者中的B细胞恶性 肿瘤中的靶。B细胞恶性肿瘤可以由缓慢进展形式的B细胞淋巴瘤、 迅速进展形式的B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞 白血病、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症和多发性骨髓瘤组成。还存在 非恶性B细胞病症和相关疾病，例如许多自身免疫和免疫失调疾病， 在免疫失调疾病中包括败血症和败血症性休克(还参见Goldenberg和 Hansen于2004年12月8日提交并且整体引入本文的美国临时申请号 60/634,076)。特别地，本文描述的组合物特别用于治疗各种自身免疫 病，以及缓慢进展形式的B细胞淋巴瘤、迅速进展形式的B细胞淋巴 瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤和瓦 尔登斯特伦氏巨球蛋白血症，以及其他造血系统恶性肿瘤，例如急性 和慢性髓细胞白血病和T细胞白血病和淋巴瘤。例如，hL243抗体组 分和免疫缀合物可以优选地用于治疗缓慢进展和迅速进展形式的非霍 奇金氏淋巴瘤和淋巴性白血病。

可以靶向的肿瘤相关抗原包括但不限于，A3、对A33抗体特异 的抗原、BrE3-抗原、CD1、CD1a、CD3、CD5、CD15、CD19、CD20、 CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD45、CD74、CD79a、CD80、 HLA-DR、NCA95、NCA90、HCG及其亚单位、CEA(CEACAM-5)、 CEACAM-6、CSAp、EGFR、EGP-1、EGP-2、Ep-CAM、Ba733、 HER2/neu、缺氧诱导的因子(HIF)、KC4-抗原、KS-1-抗原、KS1-4、 Le-Y、巨噬细胞抑制因子(MIF)、MAGE、MUC1、MUC2、MUC3、 MUC4、PAM-4-抗原、PSA、PSMA、RS5、S100、TAG-72、p53、腱 生蛋白、IL-6、IL-8、胰岛素生长因子-1(IGF-1)、Tn抗原、 Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、VEGF、17-1A-抗原、血 管发生标记(例如，ED-B纤连蛋白)、致癌基因标记、致癌基因产物、 和其他肿瘤相关抗原。肿瘤相关抗原的新近报道包括Mizukami等人， (2005，Nature Med.11：992-97)；Hatfield等人，(2005，Curr.Cancer Drug Targets 5：229-48)；Vallbohmer等人(2005，J.Clin.Oncol.23： 3536-44)和Ren等人(2005，Ann.Surg.242：55-63)，各自引入本文 作为参考。

此外，本发明的另一实施方案可以包括用于制备免疫缀合物和组 合物的双特异性或多特异性抗体。依照这些实施方案，L243抗体或其 片段或抗体融合蛋白可以连接至对癌症标记物质特异的抗体或抗体片 段，传染病生物表面上的表位，或血液或其他体液中的有害物质。双 特异性和多特异性抗体可以用于诱导各种有害物质的清除。例如，双 特异性抗体可以具有对于有害物质例如病原生物的一种或多种特异 性，以及对于HLA-DR、HLA II类不变链(ii)的一种或多种特异性。 HLA II类不变链(ii)在1999年5月19日提交、名称为“Therapeutic Using a Bispecific Antibody”的美国序列号09/314,135中详细描述，所述专利 整体引入本文作为参考。

在另一实施方案中，本文公开的免疫缀合物和组合物还可以包括 L243多价抗体。依照这个实施方案，多价靶结合蛋白可以通过缔合第 一种和第二种多肽来构建。第一种多肽可以包括共价连接至第一种免 疫球蛋白样结构域的第一种单链Fv分子，所述第一种免疫球蛋白样 结构域优选是免疫球蛋白轻链可变区结构域。第二种多肽可以包括共 价连接至第二种免疫球蛋白样结构域的第二种单链Fv分子，所述第 二种免疫球蛋白样结构域优选是免疫球蛋白重链可变区结构域。第一 种和第二种单链Fv分子中的每一种形成靶结合位点，并且第一种和 第二种免疫球蛋白样结构域缔合以形成第三种靶结合位点。

在一个可替代的实施方案中，人源化、嵌合或人L243单克隆抗 体可以用于生产抗原特异性双抗体、三抗体和四抗体。例如，单特异 性双抗体、三抗体和四抗体可以选择性结合靶向的抗原，并且随着分 子上的结合位点数目增加，对于靶细胞的亲和力增加并且在所需位置 观察到更长的停留时间。对于双抗体，可以使用包括人源化L243mAb 的VH多肽的2条链，所述VH多肽通过5个氨基酸残基的接头连接 至人源化L243mAb的VK多肽。每条链形成人源化L243双抗体的 一半。在三抗体的情况下，使用包括人源化L243mAb的VH多肽的 3条链，所述VH多肽不通过接头连接至人源化L243mAb的VK多 肽。每条链形成hL243三抗体的三分之一。

在另一实施方案中，本文公开的免疫缀合物和组合物还可以包括 功能性双特异性单链抗体(bscAb)(参见例如，Mack等人，Proc.Natl. Acad.Sci.USA，92：7021-7025，1995，其引入本文作为参考)。例如， bscAb可以通过使用重组方法经由甘氨酸-丝氨酸接头连接2个单链Fv 片段来产生。2种目的抗体的V轻链(VL)和V重链(VH)结构域 可以使用标准PCR方法分离。从每种杂交瘤获得的VL和VH cDNA 可以在两步融合PCR中连接以形成单链片段。在一个例子中，第一个 PCR步骤引入(Gly4-Serl)3接头，并且第二个步骤连接VL和VH 扩增子。每种单链分子可以克隆到细菌表达载体中。扩增后，一种单 链分子可以切除并亚克隆到包含第二种目的单链分子的其他载体中。 随后bscAb片段可以亚克隆到真核表达载体中。功能性蛋白质表达可 以通过将载体转染到中国仓鼠卵巢细胞中获得。其他双特异性融合蛋 白以类似方式制备。双特异性单链抗体和双特异性融合蛋白可以用于 制备药物载体。

此外，一个实施方案可以包括具有双重特异性的四价串联双抗体 (称为tandab)(Cochlovius等人，Cancer Research(2000)60： 4336-4341)。双特异性tandab是2个相同多肽的二聚体，所述多肽各 自包含2种不同抗体的4个可变结构域(VH1、VL1、VH2、VL2)， 所述可变结构域在方向上连接以促进自身缔合后形成针对2种不同特 异性中的每一种的2个潜在结合位点。

在另一实施方案中，缀合的多价L243抗体可以用于制备免疫缀 合物或组合物。另外的氨基酸残基可以加至第一种或第二种多肽的N 或C末端。另外的氨基酸残基可以包括肽标记，例如信号肽、细胞因 子、酶(例如，前体药物激活酶)、激素、寡核苷酸、干扰RNA、肽 毒素例如假单胞菌外毒素、肽药物、细胞毒性蛋白质或其他功能性蛋 白质。如本文使用的，功能性蛋白质是具有生物学功能的蛋白质。

在再一实施方案中，hL243抗体或其片段可以用于制备多价蛋白 质复合物-包括3种或4种抗原结合位点的新型抗体融合蛋白。依照 这些实施方案，一种或多种抗原结合位点可以由hL243可变结构域组 成，并且一种或多种其余抗原结合位点可以包括所需的其他抗原特异 性抗体的可变结构域。此类多价蛋白质复合物在PCT公开 WO04094613A2(Rossi等人，2004)中描述。当与合适的抗原特异 性抗体可变链组合时，包括hL243可变结构域的多价蛋白质复合物可 以用于治疗各种瘤、感染性、代谢、神经变性、自身免疫或免疫失调 病症。

在本发明的一个实施方案中，药物、毒素、放射性化合物、酶、 激素、细胞毒性蛋白质、寡核苷酸、干扰RNAs(例如RNAi分子)、 螯合物、细胞因子和其他功能试剂可以缀合至多价靶结合蛋白。依照 这些实施方案，可以使用多价靶结合蛋白的氨基酸残基侧链的共价附 着，例如胺、羧基、苯基、硫醇基或羟基。各种常规接头可以用于这 个目的，例如，二异氰酸酯、二异硫氰酸酯、双(羟基琥珀酰亚胺) 酯、碳化二亚胺、马来酰亚胺-羟基琥珀酰亚胺酯、戊二醛等。试剂与 多价蛋白质的缀合优选不会显著影响蛋白质对其靶的结合特异性或亲 和力。如本文使用的，功能试剂是具有生物学功能的试剂。优选的功 能试剂是细胞毒性剂。

在再其他的实施方案中，治疗剂或前体药物聚合物至体内靶的双 特异性抗体指导的递送可以与放射性核素的双特异性抗体递送组合， 从而使得实现组合化学疗法和放射免疫疗法。每种治疗剂可以缀合至 可靶向的缀合物并同时施用，或者核素可以作为第一种可靶向的缀合 物的一部分给予并且药物在随后步骤中作为第二种可靶向的缀合物的 一部分给予。合适的可靶向的缀合物和药物是本领域已知的。

在另一实施方案中，细胞毒性剂可以缀合至聚合载体，并且聚合 载体随后可以缀合至多价靶结合蛋白。对于这种方法，参见Ryser等 人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75：3867-3870，1978，美国专利号 4,699,784和美国专利号4,046,722，其引入本文作为参考。缀合优选 不会显著影响多价结合蛋白的结合特异性或亲和力。

人源化、嵌合和人抗体用于治疗和诊断的用途

本文描述的人源化、嵌合和人单克隆抗体适合于在使用如本文所 述的免疫缀合物和组合物的治疗方法和诊断方法中使用。因此，免疫 缀合物或组合物可以包括裸露的人源化、嵌合和人抗体，其可以缀合 至载体、治疗剂或诊断剂。免疫缀合物可以作为多模式疗法施用。例 如，另外的治疗或诊断剂可以在免疫缀合物或组合物施用之前、同时 或之后施用。免疫缀合物或组合物的功效可以通过用一种或多种其他 结合分子(即，针对特异性抗原的mAbs，例如CD4、CDS、CD8、CD14、 CD15、CD19、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD37、 CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、 CCD138、CD154、B7、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC16、 NCA66、坏死抗原、PAM-4、KS-1、Le(y)、MAGE、la、IL-2、IL-6、 腱生蛋白、HM1.24、VEGF、EGFR、EGP-1、EGP-2、叶酸受体、人 绒毛膜促性腺激素、结肠特异性抗原-p(CSAp)、胰岛素样生长因子 (ILGF)、胎盘生长因子(PlGF)、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PSMA、 T101、TAG、TAG-72、Her2/neu、碳酸酐酶IX、IL-6、SI00、α-胎蛋 白、A3、CA125、癌胚抗原(CEA)、非特异性交叉反应抗原例如CD66 (a，b，c，d)、MART-1、TRP-1、TRP-2、gplOO、淀粉状蛋白、含有hL243 抗体、或其免疫缀合物、或针对这些所述抗原的抗体)补充人源化、 嵌合和人L243免疫缀合物或组合物来增强。优选的B细胞相关抗原 包括等同于人CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD46、CD52、 CD74、CD80和CDS抗原的那些。优选的T细胞抗原包括等同于人 CD4、CDS和CD25(IL-2受体)抗原的那些。

可替代地，HLA-DR抗原的取代分子可以在B细胞和T细胞病症 的治疗中使用。在一个具体实施方案中，B细胞抗原可以等同于人CD 19、CD22、CD21、CD23、CD74、CD80和HLA-DR抗原。在另一具 体实施方案中，可以使用等同于人CD4、CDS和CD25抗原的T细胞 抗原。可替代地，可以使用阻断补体依赖性裂解(CDC)的癌细胞表 面上的CD46和CD59抗原。在一个实施方案中，可以使用恶性黑素 瘤相关抗原例如等同于MART-1、TRP-1、TRP-2和gplOO的抗原。 此外，在一个具体实施方案中，多发性骨髓瘤相关抗原是等同于 MUC1、CD38和CD74的那些。

在一个例子中，补充性结合分子可以是裸露的或与载体、治疗剂 或诊断剂缀合，包括脂质、聚酯、药物、毒素、免疫调节剂、激素、 酶、寡核苷酸、干扰RNAs和治疗性放射性核素等。依照这个实施方 案，补充性结合分子可以与人源化、嵌合和人L243免疫缀合物或组 合物同时、顺次或根据建议的给药方案进行施用。

此外，本文预期免疫缀合物或组合物的施用用于在B细胞淋巴瘤、 T细胞淋巴瘤和其他疾病或病症中的诊断和治疗用途。如本文所述的 免疫缀合物可以是分子，包括缀合至载体的结合分子。依照这个实施 方案，免疫缀合物可以用于形成进一步包括治疗或诊断剂的组合物， 其可以包括可能荷有诊断或治疗剂的肽。免疫缀合物保留了结合分子 的免疫反应性(即，抗体部分在缀合后具有的结合相关抗原的能力与 缀合前大约相同或略微减少)。免疫缀合物可以包括缀合至任何合适 的第二种分子(例如，可以形成高级结构的脂质，蛋白质、碳水化合 物，或其自身是高级结构，例如脂质体、胶粒和/或纳米微粒)的结合 分子。为了促进某些效应物的递送，可能需要将hL243抗体缀合至能 够形成高级结构的一种或多种分子(例如两亲性脂质)。两亲性分子 还可能是促进效应物递送所需要的，所述效应物证实在水溶液中的溶 解性有限。

在另一实施方案中，广泛多样的诊断和治疗剂可以用于形成如本 文所述的免疫缀合物和组合物。治疗剂包括，例如化学治疗药物例如 长春花生物碱、蒽环类抗生素、epidophyllotoxin、紫杉烷、抗代谢物、 烷化剂、抗生素、Cox-2抑制剂、抗有丝分裂物、抗血管发生和凋亡 剂，特别是多柔比星、氨甲蝶呤、紫杉酚、CPT-11、喜树碱，以及来 自这些和其他类抗癌剂的其他，等等。用于制备免疫缀合物和抗体融 合蛋白的其他有用的癌症化学治疗药物包括氮芥、烷基磺酸盐、亚硝 基脲、三氮烯、叶酸类似物、COX-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似 物、铂配位复合物、激素等。合适的化学治疗剂在Remington’s Pharmaceutical Sciences，19th Ed.(Mack Publishing Co.1995)，以及 Goodman和Oilman’s The pharmacological Basis of Therapeutics，7th Ed. (MacMillan Publishing Co.1985)以及这些出版物的修订版中描述。 其他合适的化学治疗剂，例如实验性药物，可以使用并且是本领域已 知的。

另外，在另一实施方案中，螯合剂例如DTPA、DOTA、TETA或 NOTA可以缀合至本文描述的组合物的一种或多种组分。可替代地， 包括可检测标记(例如荧光分子)或细胞毒性剂(例如重金属或放射 性核素)的合适的肽可以共价、非共价或以别的方式与本文描述的组 合物的多种组分缔合。例如，一种治疗上有用的免疫缀合物可以通过 在如本文描述的组合物中掺入光敏剂或染料获得。荧光组合物，例如 荧光团，和其他色原体、或染料例如对可见光敏感的卟啉，已通过将 合适的光导向损伤用于检测和治疗损伤。在治疗中，这已称为光辐射、 光疗法或光动力疗法(Jori等人(eds.)，PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES(Libreria Progetto 1985)；van den Bergh，Chem.Britain 22：430(1986))。此外，单克隆抗体已与光敏 化染料偶联用于完成光疗法。Mew等人，J.Immunol.130：1473 (1983)；idem.，Cancer Res.45：4380(1985)；Oseroff等人，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 83：8744(1986)；idem.，Photochem.Photobiol.46：83 (1987)；Hasan等人，Prog.Clin.Biol.Res.288：471(1989)；Tatsuta 等人，Lasers Surg.Med.9：422(1989)；Pelegrin等人，Cancer 67： 2529(1991)。内窥镜应用也是预期的。内窥镜检查和治疗方法在美 国专利号4,932,412；5,525,338；5,716,595；5,736,119；5,922,302； 6,096,289；和6,387,350中描述，所述专利整体引入本文作为参考。

在一个实施方案中，本文预期包括光敏剂或染料的hL243免疫缀 合物组合物的治疗用途，和本诊断/治疗方法可以包含包括光敏剂或染 料的hL423免疫缀合物组合物的诊断或治疗用途。免疫缀合物还可包 含上文讨论的超声剂类型。还预期了放射性和非放射性试剂在如本文 描述的人源化、嵌合和人L423免疫缀合物组合物中作为诊断剂的用 途。合适的非放射性诊断剂是适合于核磁共振成像、计算机断层摄影 术或超声的造影剂。磁成像剂包括例如与金属-螯合物组合复合的非放 射性金属，例如锰、铁和钆，所述金属-螯合物组合包括2-苄基-DTPA 及其一甲基和环己基类似物(当连同本文描述的抗体一起使用时)(参 见于2001年10月10日提交的美国序列号09/921,290，其整体引入作 为参考)。

在另一实施方案中，人源化、嵌合和人L423免疫缀合物组合物 可以包括对于诊断成像有用的放射性同位素或正电子发射体。合适的 放射性同位素可以包括能量范围为60-4,000keV的那些。合适的放 射性同位素可以包括18-F、52-Fe、62-Cu、64-Cu、67-Cu、67-Ga、68-Ga、 86-Y、89-Zr、94-Tc、94m-Tc、99m-Tc、111-In、123-1、124-1、125- 1、131-1，等等。(参见，例如名称为“Labeling Targeting Agents with Gallium-68”的美国专利申请-发明人G.L Griffiths和W.J.McBride(美 国临时申请号60/342,104)，其公开了用于成像目的的正电子发射体， 例如18-F、68-Ga、94m-Tc等，并且其整体引入作为参考)。

在本发明的另一实施方案中，毒素例如假单胞菌外毒素，可以存 在于如本文描述的人源化、嵌合和人L243抗体，或其免疫缀合物或 组合物中。例如，毒素可以复合至或形成本文描述的hL243的抗体融 合蛋白的治疗剂部分。其他毒素包括蓖麻毒素、相思豆毒素、核糖核 酸酶(RNase)、DNase I、葡萄球菌肠毒素A、美洲商陆抗病毒蛋白、 白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。(参见， 例如Pastan等人，Cell 47：641(1986)，和Goldenberg，CA-A Cancer Journal for Clinicians 44：43(1994)。适合于本文使用的另外毒素是 本领域技术人员已知的并且在美国专利6,077,499中公开，所述专利 整体引入作为参考)。

可替代地，免疫调节剂例如细胞因子也可以存在于如本文描述的 施用的hL423免疫缀合物组合物中。例如，免疫调节剂可以缀合至， 或形成抗体融合蛋白的治疗剂部分，或作为如本文描述的人源化、嵌 合和人L423免疫缀合物组合物的一部分施用。合适的细胞因子包括 但不限于，如下文描述的干扰素和白介素。

在一个实施方案中，人源化L243抗体可以用作预靶向、非免疫 原性、高度选择性可替代物的一部分用于诊断和治疗应用，其中使用 共识别在载体分子上的肿瘤抗原和一种或多种半抗原的双特异性抗 体，其中载体分子可以包括效应分子。双特异性抗体(bsAb)具有能 够工程化为相对非免疫原性的人源化蛋白质的优点。bsAb的结合亲和 力可以取决于原始靶向剂的结合亲和力。通过使用二价肽，可以达到 亲和力增强，与单价肽比较其可以极大地改善肽与靶位点的结合。参 见，例如，美国专利号5,256,395，其内容整体引入本文。

在一个实施方案中，使用hL243 bsAb的预靶向可以包括来源于 如本文描述的hL243抗体可变区的bsAb的一个臂，以及识别包含诊 断或治疗剂的部分的抗体的第二个臂(例如，载体与诊断或治疗剂一 起作为“可靶向构建体”)。合适的可靶向构建体和使用方法在美国专利 申请20050002945中描述，所述专利的内容因此整体引入作为参考。 可靶向构建体可以是例如(i)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG) -NH2；(ii)DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys-(HSG)-NH2；或(iii) Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2，尽管技术 人员应当理解可以使用其他可靶向构建体。在其他系统中，可靶向构 建体包括由抗体的第二个臂识别的半抗原部分和治疗或诊断剂。例 如，治疗剂可以是化学治疗剂或毒素，例如上文描述的那些。

一个具体实施方案包括由Janevik-Ivanovska等人描述的预靶向系 统，其使用针对组胺衍生物，即组胺-琥珀酰-glycl(HSG)的抗体作 为在其上可以制备各种效应物物质的识别系统。本发明的人源化L243 抗体可以在此类系统中使用。这种预靶向系统代表超过其他预靶向系 统的显著优点，因为它可以与各种不同成像或治疗剂一起使用。在一 个例子中，这种系统可以基于针对DTPA或HSG的抗体的使用和包 含DTPA或HSG残基的肽的开发。可以合成包含DTPA和/或包含HSG 的肽，并且当肽包含DTPA时，肽可以用螯合的核素进行标记，例如 In、Y或Lu，其在治疗或诊断中可能有用。抗体已针对DTPA-In部分 产生。在其他实施方案中，系统包括半抗原的肽和/或螯合剂例如 DTPA，并且其可能适合于用90Y、″′in和177Lu以及99mTc放射标记。

免疫缀合物的制备

本文描述的免疫缀合物可以通过将抗体与脂质、碳水化合物、蛋 白质或其他原子和分子连接的已知方法进行制备。例如，本文描述的 结合分子可以与本文描述的一种或多种载体(例如脂质、聚合物、脂 质体、胶粒或纳米微粒)缀合以形成免疫缀合物，并且免疫缀合物可 以共价、非共价或以别的方式掺入治疗或诊断剂。此外，本文描述的 任何结合分子可以与本文描述的一种或多种治疗或诊断剂，或另外的 载体缀合。一般地，一种治疗或诊断剂可以附着至每种结合分子，但 超过一种的治疗剂或诊断剂可以附着至相同的结合分子。在一个实施 方案中，本文预期的抗体融合蛋白可以包括2种或多种抗体或其片段， 并且包括这种融合蛋白的每种抗体可以与本文描述的一种或多种载体 缀合。此外，抗体融合蛋白中的一种或多种抗体可以具有附着的一种 或多种治疗或诊断剂。此外，治疗不必是相同的而可以是不同的治疗 剂。例如，本文描述的组合物可以包括药物和放射性同位素。

在一个例子中，IgG可以用131-1放射标记并缀合至脂质，从而 使得IgG-脂质缀合物可以形成脂质体。依照这个例子，脂质体可以掺 入一种或多种治疗或诊断剂(例如药物，例如FUdR-dO)。可替代地， 除了载体以外，IgG可以缀合至131-1(例如在酪氨酸残基上)和药物 (例如在赖氨酸残基的ε氨基上)，并且载体可以掺入另外的治疗或 诊断剂。治疗和诊断剂可以与结合分子共价缔合(例如缀合至还原的 二硫基、碳水化合物侧链、或结合分子上的任何其他反应基团。

在另一实施方案中，载体、治疗剂或诊断剂可以经由二硫键形成 附着在还原的抗体组分的绞链区。作为可替代方法，肽可以使用异双 功能交联剂，例如N-琥珀酰3-(2-吡啶二巯基)丙酸酯(SPDP)附 着至抗体组分。Yu等人，Int.J.Cancer 56：244(1994)。用于此类缀 合的一般技术是本领域众所周知的。(参见，例如，Wong，Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking(CRC Press 1991)；Upeslacis等 人，“Modification of Antibodies by Chemical Methods，”in Monoclonal Antibodies Principles and Applications，Birch等人(eds.)，第187D230 页(Wiley-Liss，Inc.1995)；Price，“Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies，”in Moniclonal Antibodies： Production，Engineerting and Clinical Application，Ritter等人(eds.)， 第60D84页(Cambridge University Press 1995))。可替代地，载体、 治疗剂或诊断剂可以经由抗体Fc区中的碳水化合物部分缀合。碳水 化合物基团可以用于增加结合硫醇基的相同肽的装载，或者碳水化合 物部分可以用于结合不同肽。

用于经由抗体碳水化合物部分将肽缀合至抗体组分的方法是本领 域技术人员众所周知的。(参见，例如，Shih等人，Int.J.Cancer 41： 832(1988)；Shih等人，Int.J.Cancer 46：1101(1990)；和Shih等 人，美国专利号5,057,313，所有这些整体引入作为参考)。类似化学 作用可以用于将一种或多种hL243抗体或其组分缀合至一种或多种载 体、治疗剂或诊断剂。在一个实施方案中，一种一般方法涉及使具有 氧化碳水化合物部分的抗体组分与载体聚合物反应，所述载体聚合物 具有至少一个游离胺官能团并装载了多个多肽。这种反应产生起始的 希夫碱(亚胺)键，所述键可以通过还原为仲胺来稳定，以形成最终 缀合物。

在一个实施方案中，Fc区可以缺乏，例如，如果hL423结合分子 是抗体片段。可替代地，碳水化合物部分可以引入全长抗体或抗体片 段的轻链可变区中。(参见，例如，Leung等人，J.Immunol.154：5919 (1995)；Hansen等人，美国专利号5,443,953(1995)，Leung等人， 美国专利号6,254,868，所有这些整体引入作为参考)。依照这些实施 方案，改造的碳水化合物部分可以用于附着载体、治疗或诊断剂。

载体(脂质、脂质体、胶粒、聚合物和纳米微粒)

用于形成脂质体和胶粒的任何方法可以使用并且是本领域已知 的。(参见，例如，Wrobel等人，Biochimica et Biophysica Acta，1235： 296(1995)；Lundberg等人，J.Pharm.Pharmacol.，51：1099-1105 (1999)；Lundberg等人，Int.J.Pharm.，205：101-108(2000)； Lundberg，J.Pharm.Sci.，83：72-75(1994)；Xu等人，Molec.Cancer Then，1：337-346(2002)；Torchilin等人，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA， 100：6039-6044(2003)；U.S.5,565,215；U.S.6,379,698；和U.S. 2003/0082154)。由聚合物、二氧化硅或金属形成的纳米微粒或纳米胶 囊已得到描述，其在本文预期用于药物递送或成像。(参见，例如， West等人，Applications of Nanotechnology to Biotechnology，11： 215-217(2000)；U.S.5,620,708；U.S.5,702,727；和U.S.6,530,944)。

免疫脂质体

将抗体或结合分子缀合至脂质体以形成关于治疗或诊断剂的靶向 载体的某些方法已得到描述。(参见，例如，Bendas，Biodrugs，15： 215-224(2001)；Xu等人，Molec.Cancer Ther.，1：337-346(2002)； Torchilin等人，Proc.Nat′l.Acad.Sci.，100：6039-6044(2003)；Bally， 等人，J.Liposome Res.，8：299-335(1998)；Lundberg，Int.J.Pharm.， 109：73-81(1994)；Lundberg，J.Pharm.Pharmacol.，49：16-21(1997)； Lundberg，Anti-cancer Drug Design，13：453-461(1998))。还参见US. 6,306,393；U.S.序列号10/350,096；U.S.序列号09/590,284，和1999 年6月9日提交的U.S.序列号60/138,284。所有这些参考文献引入本 文作为参考。

药学可接受的赋形剂

在一个实施方案中，免疫缀合物或组合物可以包括一种或多种药 学合适的赋形剂、一种或多种另外的成分、或其组合。

在另一实施方案中，本文公开的免疫缀合物或组合物可以根据已 知方法配制以制备药学有用的组合物，由此免疫缀合物或组合物在混 合物中与药学合适的赋形剂组合。无菌磷酸盐缓冲盐水是药学合适的 赋形剂的一个例子。其他合适的赋形剂是本领域技术人员众所周知 的。(参见，例如，Ansel等人，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，5th(Lea和Febiger 1990)，和Gennaro(ed)， Remington’s Pharmaceutical Sciences，18th Edition(Mack Publishing Company 1990)，及其修订版。

在另一实施方案中，本文公开的免疫缀合物或组合物可以配制用 于经由例如快速注射或持续输注静脉内施用。

用于注射的制剂可以以例如单位剂型与加入的防腐剂一起存在于 例如安瓿或多剂量容器中。组合物可以采取此类形式，如在油或水媒 介物中的悬浮液、溶液或乳状液，并且可以包含配制剂例如悬浮、稳 定和/或分散剂。可替代地，活性成分可以是粉末形式用于在使用之前 用合适的媒介物例如灭菌无热原水构建。另外的药学方法可以用于控 制治疗、诊断缀合物或裸抗体的作用持续时间。例如，控制释放制剂 可以通过使用聚合物复合或吸附免疫缀合物或裸抗体来制备。在一个 例子中，生物相容性聚合物包括聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)基质和硬 脂酸二聚体和癸二酸的聚酐共聚物基质。Sherwood等人， Bio/Technology 10：1446(1992)。免疫缀合物或抗体从此类基质中释 放速率中的一些取决于免疫缀合物或抗体的分子量，基质内的免疫缀 合物、抗体的量和分散微粒的大小。Saltzman等人，Biophys.J.55： 163(1989)；Sherwood等人，同上。其他固体剂型在Ansel等人， Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，5th Edition (Lea & Febiger 1990)，和Gennaro(ed.)，Remington’s Pharmaceutical Sciences，18th Edition(Mack Publishing Company 1990)，及其修订版 中描述。

在一个实施方案中，免疫缀合物或组合物还可以皮下或还通过其 他肠胃外途径施用于哺乳动物。此外，施用可以通过持续输注或通过 单次或多次快速浓注。在一个例子中，对于人施用的免疫缀合物、融 合蛋白或裸抗体的剂量将依此类因素而变，所述因素例如患者年龄、 重量、身高、性别、一般医疗条件和以往医疗史等。在一个具体实施 方案中，受体可以施用约1mg/kg-mg/kg免疫缀合物或包括免疫缀合 物的组合物的剂量作为单次静脉内输注，尽管根据环境指示也可以施 用较低或较高剂量。这种剂量可以根据需要重复，例如，每周一次共 4-10周，优选每周一次共8周，并更优选每周一次更4周。它还可 以较不频繁地给予，例如每隔一周共数月。剂量可以通过各种肠胃外 途径给予，伴随剂量和时间表的合适调整。

在一个实施方案中，为了治疗目的，免疫缀合物或包括免疫缀合 物的组合物以治疗有效量施用于哺乳动物。对于本文公开的治疗和诊 断方法的合适受试者可以是人，尽管非人动物受试者也是预期的。

在一个例子中，如果施用的量是生理学显著的，那么抗体制剂认 为是以“治疗有效量”施用。如果试剂的存在导致受体哺乳动物生理学 中可检测的改变，那么它是生理学显著的。特别地，如果抗体制剂的 存在产生抗肿瘤应答或减轻自身免疫状况态的体征和症状，那么它是 生理学显著的。生理学显著效应还可以是受体哺乳动物中体液和/或细 胞免疫应答的诱发。

使用包括人源化、嵌合和人L243抗体的组合物的治疗方法

在一个实施方案中，可以用本发明的抗体治疗的免疫病可以包 括，例如关节疾病例如强直性脊柱炎、青少年类风湿性关节炎、类风 湿性关节炎；神经系统疾病例如多发性硬化症和重症肌无力；胰腺疾 病例如糖尿病，特别是幼年发作型糖尿病；胃肠道疾病例如慢性活动 性肝炎、腹部疾病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、恶性贫血；皮肤病 例如牛皮癣或硬皮病；过敏性疾病例如哮喘和移植相关状况例如移植 物抗宿主病和同种异体移植物排斥。

在本发明的另一实施方案中，提供了可以包括本文公开的抗体、 或其免疫缀合物的组合物和方法用于治疗自身免疫病或病症。使用靶 向B细胞的抗体的自身免疫性病症的免疫治疗在PCT申请公开号WO 00/74718中描述，所述PCT申请要求美国临时申请序列号60/138,284 的优先权，所述专利中的每一种的内容整体引入本文。示例性自身免 疫病包括但不限于急性特发性血小板减少性紫瘢、慢性特发性血小板 减少性紫瘢、皮肌炎、西德纳姆氏舞蹈病、重症肌无力、系统性红斑 狼疮、狼疮肾炎、风湿热、多腺体综合征、大疱性类天疱疮、糖尿病、 亨-舍二氏紫瘢、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、高安氏动脉炎、阿 狄森氏病、类风湿性关节炎、多发性硬化、肉状瘤病、溃疡性结肠炎、 多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、古德帕斯 彻氏综合征、血栓闭塞性脉管炎、斯耶格伦氏综合征、原发性胆汁性 肝硬变、桥本氏甲状腺炎、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、 多发性肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常天疱疮、韦格纳氏肉芽肿、膜性 肾病、肌萎缩性侧索硬化、脊髓痨、巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血、 急进性肾小球性肾炎、牛皮癣、和纤维化肺泡炎。

在本发明的另一实施方案中，提供了用于治疗选自下列病症的组 合物和方法：癌、肉瘤、神经胶质瘤、淋巴瘤、白血病或皮肤癌。癌 可以选自皮肤、食管、胃、结肠、直肠、胰腺、肺、乳腺、卵巢、膀 胱、子宫内膜、颈、睾丸、肾脏、肾上腺或肝癌。B细胞相关疾病可 以是缓慢进展形式的B细胞淋巴瘤、迅速进展形式的B细胞淋巴瘤、 非霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、瓦 尔登斯特伦氏巨球蛋白血症或多发性骨髓瘤。此外，B细胞相关疾病 可以是人或牲畜类型的疾病。另一方面，T细胞相关疾病可以包括人 或其他哺乳动物T细胞白血病或淋巴瘤、皮肤牛皮癣、牛皮癣性关节 炎或蕈样霉菌病。在一个例子中，代谢病可以是淀粉样变性病。在一 个例子中，神经变性疾病可以是阿尔茨海默氏病。

在本发明的一个实施方案中本文还预期的是抗体包括免疫缀合物 作为用于治疗下列任何疾病或病症的组合物的用途，其中疾病或病症 选自免疫失调疾病、自身免疫病、器官移植物排斥、移植物抗宿主病、 代谢病(例如淀粉样变性病)、和神经变性疾病(例如阿尔茨海默氏 病)。恶性病或病症选自实体瘤、造血系统肿瘤(淋巴瘤、白血病、 骨髓瘤等)。实体瘤选自黑素瘤、癌和肉瘤，并且癌选自肾癌、乳癌、 肺癌、胃肠癌和泌尿生殖系统癌。B细胞恶性肿瘤选自缓慢进展形式 的B细胞淋巴瘤、迅速进展形式的B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血 病、急性淋巴细胞白血病、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症和多发性骨 髓瘤。还存在非恶性B细胞病症和相关疾病，例如许多自身免疫和免 疫失调疾病，在免疫失调疾病中包括败血症和败血症性休克(免疫失 调疾病的列表可以在由Goldenberg和Hansen于2004年12月8日提 交并且整体引入本文的美国临时申请号60/634,076中更全面地找到)。 特别地，本文描述的组合物对于治疗下列疾病特别有用：各种自身免 疫病，以及缓慢进展形式的B细胞淋巴瘤、迅速进展形式的B细胞淋 巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓 瘤和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症，以及其他造血系统恶性肿瘤，例 如急性和慢性髓细胞白血病以及T细胞白血病和淋巴瘤。例如，hL243 抗体组分和免疫缀合物可以优选用于治疗缓慢进展和迅速进展形式的 非霍奇金氏淋巴瘤和淋巴性白血病。

在另一实施方案中，适当时本发明的人源化、嵌合和人L243抗 体可以用于治疗所有哺乳动物中的上述疾病和病症，所述哺乳动物包 括人和驯养哺乳动物，包括但不限于，狗、猫、马和牛。

在一个具体实施方案中，用于治疗B细胞恶性肿瘤的方法可以包 括给具有B细胞相关恶性肿瘤的受试者施用治疗组合物，所述治疗组 合物包括药学可接受载体、治疗剂、和包括L243抗体或其组分的免 疫缀合物(例如，人源化、嵌合或人L243抗体或其片段或其抗体融 合蛋白)，其中B细胞恶性肿瘤是淋巴瘤或白血病。更具体而言，B 细胞恶性肿瘤是缓慢进展形式的B细胞淋巴瘤、迅速进展形式的B细 胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病或急性淋巴细胞白血 病。在一个更具体的实施方案中，免疫缀合物或包括免疫缀合物的组 合物可以以约20-2000mg的剂量静脉内或肌内施用，其进一步包括 在用于检测或治疗B细胞恶性肿瘤的至少一种另外的治疗剂或诊断剂 施用之前、同时或之后施用免疫缀合物或组合物。例如，另外的试剂 可以包括如本文描述的包括治疗或诊断剂的另外免疫缀合物。依照这 些实施方案，治疗剂可以包括裸抗体、免疫调节剂、激素、细胞毒性 剂、酶和/或抗体，所述抗体缀合至至少一种免疫调节剂、放射性标记、 激素、酶、寡核苷酸、干扰RNA或细胞毒性剂，或其组合。在一个 具体例子中，免疫调节剂可以是细胞因子并且细胞毒性剂可以是药物 或毒素。在一个更具体的实施方案中，可以作为裸抗体或作为补充性 免疫缀合物组合施用的抗体优选与下列反应：CD4、CDS、CDS、CD14、 CD15、CD19、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD37、 CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、 CD138、CD154、B7、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC16、NCA66、 坏死抗原、PAM-4、KS-1、90Le(γ)、MAGE、la、IL-2、IL-6、腱 生蛋白、HM1.24、VEGF、EGFR、EGP-1、EGP-2、叶酸受体、人绒 毛膜促性腺激素、CEA、结肠特异性抗原-p(CSAp)、胰岛素样生长 因子(ILGF)、胎盘生长因子(PlGF)、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PSMA、 T101、TAG、TAG-72、Her2/neu、碳酸酐酶IX、IL-6、SI00、α胎蛋 白、A3、CA125、癌胚抗原(CEA)、非特异性交叉反应抗原例如CD66 (a，b，c，d)、MART-1、TRP-1、TRP-2、淀粉状蛋白或gplOO。

本文还预期的是恶性肿瘤的治疗可以包括给具有除淋巴瘤或白血 病以外的恶性肿瘤的受试者施用治疗组合物，所述治疗组合物可以包 括：(1)hL243抗体，或其免疫缀合物，和载体；(2)效应物；和(3) 药学可接受的赋形剂。组合物还可以以20-2000mg的剂量静脉内或 肌内施用。此外，组合物还可以在至少一种另外的治疗剂或诊断剂施 用之前、同时或之后施用。如上文和说明书自始至终描述的，治疗剂 可以包括免疫调节剂、激素、细胞毒性剂或结合分子(裸露的或缀合 至至少一种免疫调节剂、放射性标记、酶、激素、细胞毒性剂、反义 寡核苷酸、干扰RNA、或其组合，其中免疫调节剂优选是细胞因子并 且细胞毒性剂优选是药物或毒素)。治疗剂或诊断剂可以包括如本文 公开的组合物或免疫缀合物。在一个具体实施方案中，抗体可以与治 疗和/或诊断组合物组合施用以治疗不是B细胞恶性肿瘤的恶性肿瘤， 但很可能与除由hL243抗体识别以外的标记反应，所述标记由包括被 治疗的恶性肿瘤的细胞表达，并且抗体应当在药学可接受的媒介物中 配制。可以对于恶性黑素瘤相关抗原施用的抗体的例子是与MART-1、 TRP-1、TRP-2和gplOO反应的那些抗体。此外，针对多发性骨髓瘤 相关抗原的优选抗体包括与MUC1、CD74和CD38反应的那些。用 于治疗的组合物可以包含WL243抗体，或其免疫缀合物，单独或与 其他抗体组合，例如其他人源化、嵌合或人抗体。

在一个例子中，组合物可以包括免疫调节剂作为效应物。如本文 使用的，术语“免疫调节剂”包括细胞因子，干细胞生长因子，淋巴毒 素，例如肿瘤坏死因子(TNF)，和造血因子，例如白介素(例如，白 介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18和IL-21)， 集落刺激因子(例如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细 胞集落刺激因子(GM-CSF))、干扰素(例如干扰素α、β和γ)、称 为“SI因子”的干细胞生长因子、促红细胞生成素、血小板生成素或其 组合。合适的免疫调节剂部分的例子包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、 IL-12、IL-18、IL-21及其组合，和干扰素-ct、p和j，TNF-a和P等。 在一个实施方案中，免疫调节剂可以存在于组合物中，或可替代地， 免疫调节剂可以在治疗和/或诊断组合物施用之前、同时或之后施用。 在一个具体实施方案中，hL243抗体还可缀合至免疫调节剂。免疫调 节剂还可以缀合至由结合不同抗原的一种或多种抗体组成的杂交抗 体。

在一个例子中，本文预期的多模式疗法可以包括使用免疫缀合物 例如hL243抗体的免疫治疗，伴随补充施用另外的结合分子(例如抗 -CD22、抗-CD19、抗-CD21、抗-CD20、抗-CD80、抗-CD23、抗-CD46 或HLA-DR，优选裸抗体、融合蛋白形式或作为免疫缀合物的成熟的 HLA-DR二聚抗体)。此外，如本文描述的胶粒、脂质体或纳米微粒 可以包括除hL243抗体以外的结合分子。例如，抗体可以是识别上述 抗原决定簇上至少一种表位的多克隆、单克隆、嵌合、人或人源化抗 体。此外，抗-CD19和抗-CD22抗体是本领域已知的。(参见，例如， Ghetie等人，Cancer Res.48：2610(1988)；Hekman等人，Cancer Immunol.Immunother.32：364(1991)；Longo，Curr.Opin.Oncol.8： 353(1996)以及美国专利号5,798,554和6,187,287，整体引入作为参 考。)

在一个具体例子中，另一种形式的多模式疗法可以是其中受试者 接受hL243免疫缀合物连同标准癌症化学治疗。例如，“CVB”(1.5g/m2 环磷酰胺、200-400mg/m2依托泊苷和150-200mg/m2卡莫司汀)是 用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤的方案。Patti等人，Eur.J.Haematol.51： 18(1993)。其他合适的组合化学治疗方案是本领域技术人员众所周 知的。(参见，例如，Freedman等人，“Non-Hodgkin′s Lymphomas，”in Cancer Medicine，第2卷，3rd Edition，Holland等人(eds.)，第2028 -2068页(Lea和Febiger 1993))。作为举例说明，用于治疗中度非 霍奇金氏淋巴瘤(NHL)的第一代化学治疗方案包括C-MOPP(环磷 酰胺、长春新碱、甲基苄肼和泼尼松)和CHOP(环磷酰胺、多柔比 星、长春新碱和泼尼松)。在本发明的一个具体实施方案中，第二代 化学治疗方案可以是m-BACOD(氨甲蝶呤、博来霉素、多柔比星、 环磷酰胺、长春新碱、地塞米松和亚叶酸)，而合适的第三代方案是 MACOP-B(氨甲蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、泼尼松、 博来霉素和亚叶酸)。另外的治疗可以包括丁酸苯酯和苔藓抑素-1。在 一种优选多模式疗法中，化学治疗药物和细胞因子可以与抗体、免疫 缀合物或融合蛋白共同施用。细胞因子、化学治疗药物和抗体或免疫 缀合物可以以任何顺序或同时施用。

在一个具体实施方案中，NHL可以用hL243免疫缀合物(例如治 疗组合物)每周一次输注治疗4次，以25-700mg/m2的剂量每周一 次连续4周，或每隔一周一次(静脉内经过2-8小时)，需要时经过 接下来的月/年重复，更优选以100-400mg/m2的剂量每周一次连续4 周，或每隔一周一次(静脉内经过2-8小时)，需要时经过接下来的 月/年重复。此外，NHL可以如上用每半个月一次输注治疗4次，但 在同一天与依帕珠单抗(抗-CD22人源化抗体)组合，剂量为360 mg/m2，作为静脉内输注经过1小时给予，在hL243抗体免疫缀合物 输注之前、之时或之后。可替代地，HL可以如上用hL243抗体免疫 缀合物每周一次输注治疗4次，与用治疗同位素例如钇-90f放射标记 的CD22mAb的一次或多次注射组合(90-Y的剂量为5-35mCi/m2 作为一次或多次注射经过数周或数月的时间段。在一个例子中，当在 对CK20抗体有较低应答的患者中使用时，WL243可以与此类CD20 抗体如利妥希玛或hA20组合。依照这个例子，后面的组合可以在同 一天或周内顺次或同时给予，并且以各种剂量，例如对于利妥希玛或 hA20为375mg/m2每周一次通过静脉内输注，并且对于H1243为250 mg/m2每周一次同样通过静脉内输注给予。在所有上述情况下，剂量 可以分开，作为持续输注或通过本领域已知的肠胃外途径施用。它们 还可以通过其他途径例如皮下施用。

此外，在一个实施方案中，如本文公开的治疗组合物可以包含 hL243免疫缀合物的杂交分子的混合物，所述hL243免疫缀合物针对 由hL243抗体识别的不同的非封闭表位。根据这个实施方案，治疗组 合物可以包括结合由hL243抗体识别的至少2个表位的hL243免疫缀 合物的混合物。同样地，本文描述的免疫缀合物可以包含具有各种CDR 序列的hL243抗体的混合物。

在本发明的一个实施方案中，hL243抗体或其免疫缀合物可以用 于治疗B细胞淋巴瘤和白血病，或其他B细胞疾病或病症以及其他恶 性肿瘤，在所述其他恶性肿瘤中感染或关联的恶性细胞与由hL243抗 体识别的表位反应。例如，hL243抗体或其免疫缀合物可以用于治疗 免疫失调疾病和相关的自身免疫病，包括但不限于III类自身免疫病 例如免疫介导的血小板减少症，例如急性特发性血小板减少性紫瘢、 慢性特发性血小板减少性紫瘢、皮肌炎、斯耶格伦氏综合征、多发性 硬化、西德纳姆氏舞蹈病、重症肌无力、系统性红斑狼疮、狼疮肾炎、 风湿热、多腺体综合征、大疱性类天疱疮、糖尿病、亨-舍二氏紫瘢、 链球菌感染后肾炎、结节性红斑、高安氏动脉炎、阿狄森氏病、类风 湿性关节炎、肉状瘤病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结 节性多动脉炎、强直性脊柱炎、古德帕斯彻氏综合征、血栓闭塞性脉 管炎、原发性胆汁性肝硬变、桥本氏甲状腺炎、甲状腺毒症、硬皮病、 慢性活动性肝炎、多发性肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常天疱疮、韦格 纳氏肉芽肿、膜性肾病、肌萎缩性侧索硬化、脊髓痨、巨细胞动脉炎/ 多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球性肾炎、和纤维化肺泡炎。

在一个更具体的实施方案中，hL243抗体或其免疫缀合物或片段 或其抗体融合蛋白可以施用于具有一种或多种这些自身免疫病的受试 者。本文公开的hL243抗体在治疗自身免疫性病症的方法中特别有用， 所述方法在2000年6月9日提交、名称为“Immunotherapy of Autoimmune Disorders using Antibodies that Target B-Cells”的未决的美 国序列号09/590,284中公开，其整体引入作为参考。在一个具体实施 方案中，hL243抗体可以以20-2000mg的剂量静脉内或肌内施用。 此外，hL243抗体还可以在至少一种治疗剂或诊断剂施用之前、之时 或之后施用。在一个更具体的实施方案中，如本文描述的治疗剂可以 包括抗体、免疫调节剂、激素、酶、细胞毒性剂、抗体，所述抗体缀 合至至少一种免疫调节剂、放射性标记、激素、酶、或细胞毒性剂、 反义寡核苷酸、干扰RNA，或其组合，其中免疫调节剂是细胞因子并 且所述细胞毒性剂是药物或毒素。例如，治疗剂可以包括如本文描述 的免疫缀合物。在一个具体实施方案中，可以作为裸抗体或作为补充 性免疫缀合物组合施用的抗体包括在药学可接受媒介物中配制的与下 列反应的抗体，即针对特异性抗原的mAbs，所述抗原例如CD4、CDS、 CDS、CD14、CD15、CD19、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、 CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、 CD80、CD126、CCD138、CD154、B7、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、 MUC16、NCA66、坏死抗原、PAM-4、KS-1、Le(y)、MAGE、la、IL-2、 IL-6、腱生蛋白、HM1.24、VEGF、EGFR、EGP-1、EGP-2、叶酸受 体、人绒毛膜促性腺激素、结肠特异性抗原-p(CSAp)、胰岛素样生 长因子(ILGF)、胎盘生长因子(PlGF)、前列腺酸性磷酸酶、PSA、 PSMA、T101、TAG、TAG-72、Her2/neu、碳酸酐酶IX、IL-6、S100、 α胎蛋白、A3、CA125、癌胚抗原(CEA)、非特异性交叉反应抗原例 如CD66(a，b，c，d)、MART-1、TRP-1、TRP-2、淀粉状蛋白或gplOO。

如本文使用的，“药物组合物”指其中载体是药学可接受的载体、 包括药物的组合物，而“兽医学组合物”是其中载体是兽医学可接受的 载体的组合物。术语“药学可接受的载体”或“兽医学可接受的载体”可 以包括任何介质或材料，其不是生物学或在其他方面不希望的，即载 体可以连同本发明的组合物或化合物一起施用于生物，而不引起任何 不希望的生物效应或以有害的形式干扰复合物或其任何组分或生物。 药学可接受的反应物的例子在由此整体引入本申请中作为参考的美国 药典，美国药品集，美国药典委员会，Inc.，Rockville，MD 1990中 提供，如Pharmaceutical Dosage Forms & Drug Delivery Systems，7th Edition，Ansel等人，editors，Lippincott Williams和Wilkins，1999。

药物(即可靶向的构建体或复合物)可以包括在药物组合物中， 其量足以在患者中产生所需效应。本发明的药物组合物可以进一步包 括其他化学组分，例如稀释剂和赋形剂。“稀释剂”是在溶剂优选含水 溶剂中稀释的化学化合物，其促进药物在溶剂中的溶解并且它还可以 用于稳定生物学活性形式的药物或其一种或多种组分。在缓冲溶液中 溶解的盐用作本领域的稀释剂。例如，优选的稀释剂是包含一种或多 种不同盐的缓冲溶液。优选的缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(特别是结 合预期用于药学施用的组合物)，因为它模拟人血液的盐条件。因为 缓冲盐可以控制溶液的pH在低浓度，所以缓冲的稀释剂很少修饰生 物活性肽的生物活性。

在本发明的一个实施方案中，药物组合物促进人源化抗体给生物 的施用，优选动物，优选哺乳动物。具体的哺乳动物包括牛科、犬科、 马科、猫科、羊科和猪科动物，和非人灵长类。人是特别优选的。本 领域现有的施用或递送化合物的多种技术包括但不限于，口服、直肠 (例如灌肠剂或栓剂)、气雾剂(例如用于鼻或肺递送)、胃肠外(例 如，静脉内、肌内、皮下)和局部施用。优选地，可以递送足够量的 组合物或化合物以达到预期效应。待递送的组合物或化合物的具体量 将取决于多种因素，包括达到的效应、组合物递送到的生物的类型、 递送途径、给药方案，以及生物的年龄、健康状态和性别。像这样， 在给定制剂中本文公开的实施方案的组合物或化合物的具体剂量留给 普通技术人员的判断(例如，健康提供者的判断)。

本领域技术人员应当理解当本发明的药物组合物作为试剂施用以 达到特别希望的生物学结果时，所述生物学结果可以包括治疗或保护 效应(包括疫苗接种)，必须将本文公开的组合物或化合物与合适的 药学载体组合。药学载体的选择和作为治疗或保护剂的组合物或化合 物的制备将取决于预期用途和施用方式。治疗剂的合适配制和施用方 法包括但不限于，用于口服、肺、鼻、颊、眼睛、皮肤、直肠或阴道 递送的那些。

取决于采用的递送方式，背景依赖性功能实体可以以各种药学可 接受的形式递送。例如，背景依赖性功能实体可以以固体、溶液、乳 状液、分散系、胶粒、脂质体等的形式，掺入到丸剂、胶囊、片剂、 栓剂、气溶剂、滴剂或喷雾剂中递送。丸剂、片剂、栓剂、气溶剂、 粉剂、滴剂和喷雾剂可以具有复杂的多层结构并且具有大范围的尺 寸。气溶剂、粉剂、滴剂和喷雾剂的尺寸可以从小(大约1微米)到 大(大约200微米)。

本文公开的药物组合物可以以固体、冻干粉末、溶液、乳状液、 分散系、胶粒、脂质体等的形式使用，其中所得到的组合物包含作为 活性成分、与适合于肠或肠胃外应用的有机或无机载体或赋形剂混合 的本发明实施方案的一种或多种可靶向的构建体或复合物。活性成分 可以与用于片剂、丸剂、胶囊、栓剂、溶液、乳状液、悬浮液以及适 合于使用的任何其他形式的通常无毒、药学可接受的载体化合。可以 使用的载体包括固体、半固体或液体形式的葡萄糖、乳糖、甘露糖、 阿拉伯胶、明胶、甘露醇、淀粉糊、三硅酸镁、滑石粉、玉米淀粉、 角蛋白、胶体二氧化硅、土豆淀粉、尿素、中等链长的甘油三酯、葡 聚糖、以及适合于在制造业制备中使用的其他载体。此外，可以使用 辅助、稳定、增稠和着色剂以及香料。稳定干燥剂的例子包括丙酮糖， 优选浓度为0.1％或更大(参见，例如美国专利号5,314,695)。

尽管个体需要可能不同，但关于药物组合物有效量的最佳范围的 测定在本领域技术内。人剂量可以由动物研究推断(Katocs等人， Chapter 27In：Remmgton′s Pharmaceutical Sciences，18th Ed.，Gennaro， ed.，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1990)。一般地，提供有效量 药物组合物需要的剂量将依受体的年龄、健康状态、身体条件、重量、 疾病或病症的类型和程度、治疗频率、共存的治疗(如果有)的性质 以及所需效应的性质和范围而变，所述有效量可以由本领域技术人员 调整。参见，例如，Nies等人，Chapter 3 In：Goodman & Oilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics，9th Ed.，Hardman等人，eds.， McGraw-Hill，New York，N.Y.，1996)。

治疗组合物的剂量取决于待治疗的疾状况态的严重度和应答性， 疗程从数天持续至数月，或直至达到治愈或实现疾状况态减轻。最佳 给药时间表可以由患者体内的药物蓄积的测量结果计算。术语“患者” 意欲包括动物(例如、猫、狗和马)以及人。普通技术人员可以容易 地确定最佳剂量、给药方法和重复率。最佳剂量可以依个别治疗剂的 相对功效而变，并且一般可以基于在体外和体内动物模型中发现有效 的EC50进行估计。

剂量范围(施用的可靶向的构建体或复合物的量)是广泛的，因 为一般而言对于不同哺乳动物的疗效的功效伴随剂量广泛改变，一般 在人中比在大鼠中小20、30或甚至40倍(每单位体重)。一般而言， 剂量为0.01μg-100mg/kg体重，优选0.01μg-10mg/kg体重，0.01μg -50μg/kg体重，0.01μg-100mg/kg体重，0.01μg-10mg/kg体重， 0.01μg-1mg/kg体重，0.01μg-100μg/kg体重，0.01μg-10μg/kg 体重，0.01μg-1μg/kg体重，0.01μg-10μg/kg体重，0.01μg-1μg/kg 体重，0.01μg-0.1μg/kg体重，并且范围基于前面浓度范围的边界。 因此，例如，前面的剂量描述包括10mg-100mg/kg体重、1.0mg- 100mg/kg体重、0.1mg-100mg/kg体重等的剂量。

在一个实施方案中，剂量可以每天、每周、每月或每年给予一次 或多次，或甚至每2-5或更多年一次。本领域普通技术人员可以基 于测量的停留时间和体液或组织中的可靶向的构建体或复合物的浓度 估计剂量的重复率。成功治疗后，可能需要使患者经历维持疗法以预 防疾状况态复发，其中治疗剂以0.01ug-100mg/kg体重的维持剂量 施用，每天一次或多次至每5年一次。

在一个实施方案中，具体剂量可以根据患者的近似体重或体表面 积计算。确定合适剂量的其他因素可以包括待治疗或预防的疾病或状 况，疾病的严重度，施用途径，以及患者的年龄、性别和医疗条件。 确定关于治疗的合适剂量所需计算的进一步改进由本领域技术人员常 规进行，特别是根据本文公开的剂量信息和测定法。剂量还可以通过 使用已知测定法用于测定与合适的剂量应答数据结合使用的剂量来测 定。

在一个实施方案中，单个患者的剂量可以根据疾病进展的监控进 行调整。可以测量患者中可靶向的构建体或复合物的血液水平以判断 剂量是否需要调整以达到所需结果。

在一个例子中，药物基因组研究可以用于测定哪个可靶向的构建 体和/或复合物及其剂量最可能对给定个体有效(Schmitz等人，Clinica ChimicaActa 308：43-53，2001；Steimer等人，Clinica ChimicaActa 308： 33-41，2001)。

本文公开的人源化抗体的施用可以是肠胃外的，包括静脉内、动 脉内、腹膜内、肌内、皮下、胸膜内、鞘内、腔内，通过经由导管灌 注或通过直接损伤内注射。依照这种施用，抗体可以每天施用一次或 多次，每周一次或多次，每月一次或多次，和每年一次或多次。

本文提及或引用的文章、专利、和专利申请、以及所有其他文件 和可电子获得的信息的内容在此整体引入作为参考，其程度与每个单 个出版物特别并个别指出引入作为参考相同。申请人保留将来自任何 此类文章、专利、专利申请或其他文件的任何和所有材料和信息实体 并入本申请的权利。

本文举例说明性描述的实施方案可以适当地在不存在本文未具体 公开的任何一种或多种元素、一种或多种限制的情况下实践。因此， 例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等应当广泛且不加限制地理解。 此外，本文采用的术语和表达可以用作描述性而非限制性的术语，并 且在此类术语和表达的使用中不预期排除显示和描述的特征的任何等 价物或其部分，但认识到在本发明请求保护的范围内的各种修改是可 能的。因此，应当理解尽管本发明已通过优选实施方案和任选的特征 具体公开，但本领域技术人员可以采用公开的本文具体表达的修改和 变化，并且此类修改和变化视为在本发明范围内。

本发明的实施方案已在本文广泛且一般地描述。属于一般公开内 容的更窄的种类和亚一般分类中的每一种也可形成本发明的部分。这 包括本文的一般描述，附带条件或负面限制从种类中去除任何主题， 不管删除的材料是否在本文中具体叙述。

此外，当特征或方面按照Markush组进行描述时，本领域技术人 员将认识到实施方案因此也针对Markush组的任何个别成员或成员亚 组进行描述。

实施方案通过下列实施例和详细规程进一步举例说明。然而，实 施例仅仅希望举例说明实施方案并且不解释为限制本文的范围。本申 请自始至终引用的所有参考文献以及公布的专利和专利申请的内容由 此引入作为参考。

实施例

实施例1.人源化L243抗体的构建

L243Vk和VH基因的分子克隆

在一种示例性方法中，生产mAb mL243的杂交瘤细胞克隆在补 充有10％FBS(Hyclone)的HSFM培养基(Life Technologies，Inc.，) 中进行培养。编码mL243的VK(VK1BACK/CK3′)和VH (VH1BACK/VH1FOR)的基因通过RT-PCR克隆并且序列通过DNA 测序确定。多个独立克隆进行测序以消除由PCR反应产生的可能错 误。

hL243V基因的序列设计

在一个例子中，通过在Kabat数据库中检索人VK和VH序列， 发现mL243VK和VH的FRs分别显示与人REI VK和RT-TS3VH的 最高程度的序列同源性。一个例外是mL243VH的FR4，其显示与 NEWM VH的最高序列同源性。因此，在一个例子中，人REI构架序 列用作移植mL243VK的CDRs的支架(图5)，并且对于hL243Vn使 用RF-TS3和NEWM构架序列的组合(图6)。事实上，hL243VH具 有与另一种人源化Ab-hRS7相同的人VH构架(Govindan等人，Breast Cancer Res.Treat.84，173-182，2004)。当与起始人抗体构架比较时， 在CDR区外的每条链中存在许多氨基酸变化。基于先前建立的指导 方针，侧面与假定CDRs相接的鼠FRs中的几个氨基酸残基在工程化 的hL243Fv中保留(Qu等人，Clin.Cancer Res.(1999)53095s-3100s)。 这些残基是mL243Vk的R37、K39、V48、F49和G 100以及mL243VH 的F27、K38、K46、A68和F91(分别为图3和4)。关于hL243VL 和hL243VH的序列还分别参见SEQ.ID.3和4。

hL243V序列的构建

使用如Leung等人(Mol.Immunol.(1995)32 1413-1427)描述 的修改策略，使用如图4中图解的长寡核苷酸合成和PCR的组合构建 对于hL243设计的VK和VH基因。对于hL243VH结构域的构建，2 种长寡核苷酸-hL243VHA(175-聚体)和hL243VHB(168-聚体)在 DNA自动合成仪(Applied Biosystem)上合成。

hL243VHA代表HL243VH结构域的nt 23-197。

5′-GGTCTGAGTT GAAGAAGCCT GGGGCCTCAG TGAAGGTTTC CTGCAAGGCT TCTGGATTTA CCTTCACAAA CTATGGAATG AACTGGGTGA AGCAGGCCCC TGGACAAGGG CTTAAGTGGA TGGGCTGGAT AAACACCTAC ACTAGAGAGC CAACATATGC TGATGACTTC AAGGG-3′(SEQ ID NO：16) hL243VHB代表与nt 176-343互补的hL243VH结构域的负链。

5′-ACCCTTGGCC CCAGTAGTCA AAACCCGTAG GTACAACCGC AGTAATATCT CTTGCACAGA AATACACGGC AGTGTCGTCA GCCTTTAGGC TGCTGATCTG GAGATATGCC GTGCTGACAG AGGTGTCCAA GGAGAAGGCA AACCGTCCCT TGAAGTCATC AGCATATG-3′(SEQ ID NO：17)

如上文序列中有下划线的，hL243VHA和B的3′-末端序列(22nt 残基)彼此互补。在一个例子中，在限定的PCR条件下，hL243VHA 和B的3′-末端退火以形成侧面与长寡核苷酸其余部分相接的短双链 DNA。每个退火的末端在PCR反应中充当单链DNA复制的引物，产 生包含hL243VH的nt 23-343的双链DNA。这种DNA在短寡核苷 酸引物对-hRS7VHBACK和hL243VHFOR的存在下进一步扩增，以 形成全长hL243VH。由于在这个区域中hRS7VH和hL243VH之间的 序列同一性，此处使用先前对于hRS7 Ab设计并使用的 hRS7VHBACK。

hRS7VHBACK5′-GTGGTGCTGC AGCAATCTGG GTCTGAGTTG AAGAAGCC-3′(SEQ ID NO：18)hL243VHFOR 5′-

TGAGGAGACG GTGACCAGGG ACCCTTGGCC CCAGTAGT-3′(SEQ ID NO：19)

在这个实施例中，最小量的hL243VHA和B(凭经验确定)在下 列物质的存在下进行扩增：10ul 10x PCR缓冲液(500mM KC1，100 mM Tris.HCL缓冲液，pH 8.3，15mM  MgCl2)，2umol hRS7VHBACK 和hL243VHFOR，以及2.5单位Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus， Norwalk，CT)。对这种反应混合物实施由94℃变性1分钟、45℃退 火1分钟和72℃聚合1.5分钟组成的3个循环的PCR反应，并且随后 为由94℃变性1分钟、55℃退火1分钟和72℃聚合1分钟组成的27 个循环的PCR反应。关于hL243VH的双链PCR扩增产物凝胶纯化， 用PstI和BstEII限制性消化，并克隆到重链分段载体VHpBS4的互补 性Pstl/BstEII位点中。

在一个例子中，为了构建人源化VK序列的全长DNA，如上所述 合成hL243VKA(155-聚体)和hL243VKB(155-聚体)。如上所述通 过2种短寡核苷酸hlmmu31VKBACK和hlmmu31VKFOR扩增 hL243VKA和B。设计并使用先前用于人源化抗-AFP Ab的hlmmuS 1 VKB ACK和hlmmuSl VKFOR(Qu等人，Clin.Cancer Res.(1999)5 3095-3100)。

hL243VKA代表hL243VD结构域的nt 21-175。

5′-TCCATCATCT CTGAGCGCAT CTGTTGGAGA TAGGGTCACT ATCACTTGTC GAGCAAGTGA GAATATTTAC AGTAATTTAG CATGGTATCG TCAGAAACCA GGGAAAGCAC CTAAACTGCT GGTCTTTGCT GCATCAAACT TAGCAGATGG TGTGC-3′(SEQ ID NO：20)

hL243VKB代表与nt 154-312互补的hL243VK结构域的负链。

5′-CAGCTTGGTC CCTCCACCGA ACGCCCACGG AGTAGTCCAA AAATGTTGAC AATAATATGT TGCAATGTCT TCTGGTTGAA GAGAGCTGAT GGTGAAAGTA TAATCTGTCC CAGATCCGCT GCCAGAGAAT CGCGAAGGCA CACCATCTGC TAAGTTTGA-3′(SEQ ID NO：21)

Mmmu31VKBACK 5′-GACATTCAGC TGACCCAGTC TCCATCATCT CTGAGCGC-3′(SEQ ID NO：22)

hImmu31VKFOR 5′-CCGGCAGATC TGCAGCTTGG TCCCTCCACC G-3′(SEQ ID NO：23)

在这个实施例中hL243VK的凝胶纯化的PCR产物用PvuII和 BglHI限制性消化并克隆到轻链分段载体(staging vector)VKpBR2 的互补性PvuI/BcII位点中。最终表达载体hL243pdHL2如上所述通过 将hL243Vic和VH的Xbal-BamHI和XhoI/NotI片段分别顺次地亚克 隆到pdHL2中来构建。

hL243抗体的表达载体的构建

在一个例子中，最终表达载体hL243pdHL2如先前所述通过将 hL243Vx和VH的Xbal-BamHI和XhoI/NotI片段分别顺次地亚克隆到 pdHL2中来构建(Losman等人Cancer，80：2660(1997))。如Gilles 等人(J.Immunol.Methods 125：191(1989)所述，表达载体pdHL2 包含人yl链的基因组序列，因此，hL243是IgGl/K同种型。

在一种示例性方法中，为了构建其他同种型hL243例如IgG4/K 的表达载体，人γ1链的基因组序列由通过PCR扩增获得的γ4链的序 列代替。使用的模板是从ATCC CRL-11397细胞中提取的基因组 DNA，并且引物对是P-SacII(5′-CCGCGGTCACATGGCACCA CCTCTCTTGCAGCTTCCACCA AGGGCCC-3′)(SEQ ID NO：24)和 P-EagI(5′-CCGGCCGTCG CACTCAT TTA CCCAGAGACA GGG-3′) (SEQ ID NO：25)。扩增的PCR产物克隆到TOPO-TA测序载体 (Invitrogen)中，并且序列通过DNA测序证实。

将点突变Ser241Pro(基于Kabat编号)引入γ4序列的绞链区， 以避免当IgG4Ab在哺乳动物细胞培养中表达时形成半分子 (Schuurman等人，Mol.Immunol.38：1(2001))。PstI和StuI限制 性位点之间的人γ4绞链区序列(56bp)由合成DNA片段代替，所述 合成DNA片段使用Ser241的TCA密码子取代Pro的CCG。 hL243pdHL2中的人γ1基因组序列由突变的y4序列取代，产生IgG4 同种型hL243的称为hL243γ4PpdHL2的最终表达载体。

hL243抗体的转染和表达

在一种示例性方法中，大约30μg hL243和hL243γ4P的表达载体 通过用Sail消化线性化并通过电穿孔(450V和20uF)转染到Sp2/0- Agl4细胞中。转染的细胞铺板到96孔板中2天并随后通过将MTX 以0.025pM的最终浓度加入培养基中选择抗药性。MTX-抗性菌落2 -3周在孔中出现。来自菌落存活选择的上清液通过ELISA测定法筛 选人Ab分泌。简言之，将100ul上清液加入用GAH-IgG-F(ab′)2片 段特异性Ab预包被的微量滴定板孔中，并在室温下孵育1小时。未 结合的蛋白质通过用洗涤缓冲液(包含0.05％polysorbate 20的PBS) 洗涤3次去除。HRP-缀合的GAH-IgG-Fc片段特异性Ab加入孔中。 孵育1小时后，洗涤板。结合的HRP-缀合的Ab通过加入包含4mM OPD 和0.04％H2O2的底物溶液后在A490nm读数而显现。扩展阳性细胞克 隆并通过在A蛋白柱上的亲和色谱法从细胞培养上清液中纯化 hL243γ4P。

hL243的Ag-结合特异性。

在一个例子中，HL243的Ag-结合活性和特异性通过细胞表面结 合测定法显示。Raji细胞在包含饱和浓度的纯化hL243(20μg/ml) 的PBS/BSA(1％)中于4℃孵育1小时。洗涤后，细胞表面-结合的 hL243通过将Raji细胞在包含PE-缀合的第二抗体(山羊抗人IgG，Fc 片段特异性)的缓冲液中孵育并在Guave PCA系统(Guava Technologies，Inc.，Hayword，CA)中计数来检测。如图7中所示， hL243结合Raji细胞上由mL243识别的抗原，因为结合通过将细胞与 mL243一起预孵育被特异性阻断，表明mL243的Ag-结合特异性在人 源化形式中保留。

hL243γ4P的Ag-结合活性。

在一种示例性方法中，进行竞争细胞结合测定法以评估hL243γ4P 相对于亲本mL243的免疫反应性。固定量的125I-标记的鼠L243或 hL243γ4P(100,000cpm，-10uCi/ug)在各种浓度(0.2-700nM)的 纯化hL243γ4P或鼠L243的存在下与人淋巴瘤细胞(Raji、Daudi或 Ramos)一起于4℃孵育1-2小时。未结合的Abs通过在PBS中洗涤 细胞去除。与细胞相关的放射性在洗涤后测定。如图8中所示，鼠L243 和hL243γ4P mAbs彼此竞争结合细胞表面抗原，表明它们识别相同的 抗原决定簇。hL243γ4P显示比mL243明显强约2倍的结合亲和力， 因为它比mL243更好地竞争(约7对约16.5nM的ECso)。

hL243γ4P的抗原结合亲和常数通过放射标记抗体的直接细胞表面 结合测定法和斯卡恰特作图分析来测定。为了测量特异性细胞表面抗 原结合，制备2组细胞并在结合测定法中用于分别估计非特异性和总 结合放射性。用于非特异性结合的细胞在加入放射标记的抗体之前与 过量未标记的Ab一起预孵育以封闭所有表面抗原位点，而用于总结 合的那些在PBS中预孵育。预孵育后，加入各种量的125I-hL243γ4P 或125I-mL243并与2×105人淋巴瘤细胞(Raji、Daudi或Ramos)一起 于4℃孵育2小时并通过洗涤去除未结合的抗体。计数细胞相关的放 射性。在放射标记抗体给定浓度上的放射标记抗体的特异性细胞表面 结合计算为：总结合计数减去非特异性结合的计数。随后进行斯卡恰 特作图分析以确定每个细胞的hL243γ4P和mL243结合位点的最大数 目以及平衡结合的表观解离常数。如图9中所示，hL243γ4P和mL243 与Daudi细胞的最大结合基本上是相同的，约6×105个分子/细胞， 表明它们结合相同的Ag。关于hL243γ4P和mL243的表观解离常数 值分别计算为2.6和14nM。使用Raji和Ramos细胞获得相似结果(数 据未显示)。

实施例2.hL243γ4P功能研究

在一种示例性方法中，进行基于体外细胞的研究以确定hL243γ4P 是否已保留其抗增殖效应以及效应细胞和补体结合功能是否已取消。 在这个实施例中，下文描述的研究表明抗增殖效应已保留，而效应细 胞和补体结合功能已取消。

效应细胞测定法

用IgG4同种型Fc区代替hL243的Fc区的目的是取消经由Fey- 受体的效应细胞功能和补体-结合。进行CDC和ADCC测定法以评估 经由hL243y4P的这些功能。

CDC

Daudi细胞在人补体的存在下与系列稀释的抗体hL243、 hL243γ4P、hA20(作为另一种阳性对照)和hMN14(阴性对照)一 起孵育2小时。随后添加刃天青以评估细胞存活率。包括未处理的和 最大裂解对照。荧光读数在刃天青添加后5小时获得。获得的荧光水 平与有活力细胞的量正相关。存活细胞％通过式(测试-最大裂解)/ (未处理的对照-最大裂解)×100计算。结果表明与hL243(EC50＝2.6 nM)和hA20(EC50＝0.66nM)比较，hL243γ4P对细胞不产生任何补 体介导的细胞毒性效应。参见图10。

ADCC

Daudi细胞与5μg/ml hA20、hL243、hL243γ4P和hMN14一起孵 育。效应细胞以50∶1的比率添加。4小时后，细胞裂解通过LDH释 放(图11A)和细胞裂解(图1IB)测定。

在其中显示单独的抗体对效应细胞的效应的这些结果中，可以看 出KL243诱导效应细胞显著裂解而hL243γ4P则不是。当特异性裂解 数字与效应细胞上的效应相关时，与hL243比较，hL243γ4P显示靶 细胞裂解减少很多(12％对48％)。

体外增殖测定法

进行利用MTS生物还原(用于测定有活力细胞的数目)和BrdU (用于基于在DNA合成过程中掺入的BrdU的测量结果定量细胞增 殖)的多重比色测定法。Daudi和Raji细胞与系列稀释的hL243γ4P 一起孵育2和3天。mL243和hMN-14分别用作阳性和阴性对照。孵 育后，进行BrdU和MTS测定法。下文显示了MTS测定法的结果。 BrdU测定法产生相似结果。

在一种示例性方法中，进行利用MTS生物还原(用于测定有活 力细胞的数目)和BrdU(用于基于在DNA合成过程中掺入的BrdU 的测量结果定量细胞增殖)的多重比色测定法。Daudi和Raji细胞与 系列稀释的hL243γ4P一起孵育2和3天。鼠L243和hMN-14分别用 作阳性和阴性对照。孵育后，进行BrdU和MTS测定法。图12和13 中显示了MTS测定法的结果。BRDU测定法产生相似结果(未显示)。 这些结果表明hL243γ4P抑制Daudi和Raji细胞系的增殖。然而在EBV 阴性细胞系Ramos的类似实验中，只在交联抗Fc(Fab)2的存在下 观察到增殖的抑制。

实施例3：在人非霍奇金氏淋巴瘤的异种移植物模型中hL243γ4P 和mL243(IgG2a)的体内功效比较

在一种示例性方法中，进行治疗性研究以比较在人非霍奇金氏淋 巴瘤(Raji)的异种移植物模型中人源化L243-IgG4和鼠L243-IgG2a 单克隆抗体同种型的体内功效。先前的体外研究已显示用IgG4同种 型代替L243-IgG1的Fc区取消抗体的效应细胞功能(ADCC和CDC)， 同时保留抗增殖效应。使用工程化为IgG4同种型的全人抗-HLA-DR 抗体的先前研究也已显示最小化由于Fc-部分-介导的效应物功能的副 作用，同时在体外以及体内非霍奇金氏淋巴瘤的异种移植物模型和动 物模型(猕猴)中提供了极佳的杀肿瘤活性而没有长效血液效应。参 见Nagy等人，Nature Medicine，8：801(2002)。因此，这项研究旨 在确定hL243-IgG4在异种移植物模型中是否能维持显著的抗肿瘤功 效。在足够量的hL243-IgG1的缺乏下，使用mL243 IgG2a(鼠IgG2a 在补体结合和实现ADCC方面是人IgG1的等价物)。

SCID小鼠用2.5×106个Raji细胞注射。使用hL243-IgG4或 mL243-IgG2a的治疗在肿瘤细胞施用后1天开始。用盐水或非特异性 对照抗体hMN-14注射的2组小鼠具有17天的平均存活时间(MST)。 与用盐水或hMN-14注射的小鼠比较，用人源化或鼠L243治疗的所 有小鼠组具有明显改善的生存期限(PO.0001)。用各种剂量的hL243 IgG4治疗导致剂量-应答关系，接受更高剂量的小鼠具有更佳的存活 时间。在用各种剂量的mL243IgG2a治疗的动物组中，治愈率为80- 100％。参见图14。

这项研究显示L243的IgG4构建体同时保留抗肿瘤功效和去除补 体结合活性。尽管这项研究在小鼠中进行，但使用前述构建体可以在 患有自身免疫病、淋巴瘤或白血病的所有哺乳动物中达到显著的治疗 利益。特别地，前述构建体可以在(i)家畜，特别是猫、狗和马中有 效用于治疗自身免疫病和淋巴瘤/白血病；和(ii)人，用于治疗自身 免疫病、淋巴瘤和白血病，以及涉及HLA-DR表达的免疫失调、代谢 和神经变性疾病。

实施例4：在人和犬科淋巴瘤治疗中hL243与L243和抗-B细胞 MAbs的体外比较

与鼠L243比较以及与其他抗-B细胞MAbs比较，测试0.5mg hL243(IgG4同种型)样品与淋巴瘤细胞系和狗B细胞淋巴瘤抽吸物 的反应性。还进行2种功能研究。测定hL243在狗淋巴瘤抽吸物中诱 导凋亡的能力，并测试hL243针对Namalwa-报道对利妥希玛有抗性 的人淋巴瘤细胞系的抗增殖活性。

通过流式细胞法使用荧光激活细胞分类器(FACS)测量人源化或 嵌合MAbs在人B细胞淋巴瘤上的结合，其中下列MAbs-hMN-14、 hLL1、hLL2、hA20、Rituxan和hL243与FITC山羊抗人(GAH)IgG Fc一起进行染色。选择的细胞系是Namalwa(利妥希玛抗性人B细 胞淋巴瘤细胞系)、SU-DHL-6(人B细胞非霍奇金淋巴瘤)、WSU- FSCCL(EBV-阴性低度人B细胞淋巴瘤细胞系)、Raji、Daudi和Ramos 细胞：如表2中所示，hL243结合所有上述细胞系。特别地，hL243 结合CD20-无应答的Namalwa细胞，显示比其他人源化MAbs更大的 结合。参见表1。此外，如通过3-H-胸苷摄取测定法测量的，hL243 在利妥希玛抗性人B细胞淋巴瘤细胞系Namalwa中证实了抗增殖活 性。其他CD20抗体-由Immunomedics，Inc.开发的人源化A20(hA20) 显示与利妥希玛-称为的嵌合抗-CD20类似的结果。参见 Stein等人(2004)Clin.Cancer Res.10：2868-2878。

如图16A-B中所示，当单独给予时hL243产生28％的增殖抑制； 当hL243与抗人IgG第二抗体组合给予时这增加至51％。当与利妥希 玛组合使用时，活性增加至比任何一种单独MAb的那种更大的水平。 参见图16-B。

研究还证实hL243与狗淋巴瘤细胞的结合亲和力比其他人源化 MAbs更大。参见表3。此外，KL243当与抗-人IgG第二抗体交联时 在狗淋巴瘤细胞中能够诱导凋亡，测量为具有亚GO/G1期DNA含量 的细胞％。参见图15。

实施例5：hL243抗体组合及其效应

方法

抗体

在一种示例性方法中，产生抗-HLA-DR单克隆抗体L243的杂交 瘤细胞克隆从ATCC(ATCC号HB-55)获得。细胞在补充有10％FBS (Hyclone)的HSFM培养基(Life Technologies，Inc.)中进行培养。 编码L243Vκ和VH基因的基因通过RT-PCR进行克隆。如先前所述 (Leung等人，Hybridoma 13：469(1994)；Leung等人，Mol.Immunol. 32：1413(1995)；Stein等人，Blood 104：3705(2004)；Govindan等 人，Breast Cancer Res.Treat.84：173(2004))类似地产生人源化L243 (IgG1/κ同种型)hL243γ1。

hL243的IgG4/κ同种型hL243γ4p可以通过用γ4链的重链恒定区 编码序列代替人γ1链的重链恒定区编码序列进行构建。将点突变 Ser241Pro(基于Kabat编号)引入γ4序列的绞链区，以便避免当抗 体在哺乳动物细胞培养中表达和生产时形成半分子(Schuurman等人， Mol.Immunol.38：1(2001))。在研究中使用的其他MAbs是购自例 如IDEC Pharmaceuticals Corp.(San Diego，CA)的利妥希玛，和 hMN-14，或由Immunomedics，Inc提供的拉贝珠单抗(labetuzmab) (人源化抗-癌胚抗原IgG1)。此处用作阴性同种型对照的hMN-14的 构建和表征先前已描述。

细胞

示例性细胞系在几项研究中使用。例如，伯基特淋巴瘤系- Daudi、Raji和Ramos购自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)。 非伯基特淋巴瘤细胞系如下获得。包含染色体易位(14；18)的RL 和SU-DHL-6分别从Dr.John Gribben(Dana-Farber Cancer Institute， Boston，MA)和Dr.Alan Epstein(University of Southern California， Los Angeles，CA)获得。细胞系SU-DHL-4、SU-DHL-10和Karpas422 由Dr.Myron Czuczman(Roswell Park Cancer Institute，Buffalo，NY) 提供，并且WSU-FCCL和DoHH2细胞系从Dr.Mitchell Smith(Fox Chase Cancer Center，Philadelphia，PA)获得。细胞在补充有10％胎 牛血清、盘尼西林(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)和L-谷氨酰胺 (2mM)的DMEM(Life Technologies，Gaithersburg，MD)(完全培 养基)中作为悬浮培养进行培养。

hL243MAbs的抗原结合特异性

hL243γ1的抗原结合活性和特异性通过细胞表面结合测定法显 示。Raji细胞在包含饱和浓度的纯化hL243(20μg/ml)的PBS/BSA (1％)中于4℃孵育1小时。洗涤后，细胞表面-结合的hL243γ1通 过将Raji细胞在包含PE-缀合的第二抗体(山羊抗人IgG，Fc片段特 异性)的缓冲液中孵育并在例如Guave PCA系统(Guava Technologies， Inc.，Hayword，CA)中计数来检测。

进行竞争细胞结合测定法以评估hL243γ4P相对于亲本mL243的 反应性。固定量的125I-标记的鼠L243或hL243γ4P(100,000cpm，约 10μCi/μg)在各种浓度(0.2-700nM)的纯化hL243γ4P或鼠L243 的存在下与人淋巴瘤细胞(Raji、Daudi或Ramos)一起于4℃孵育1 -2小时。未结合的Abs通过在PBS中洗涤细胞去除。与细胞相关的 放射性在洗涤后测定。

在一个例子中，hL243γ4P的抗原结合亲和常数通过放射标记抗体 的直接细胞表面结合测定法和斯卡恰特作图分析来测定。为了测量细 胞表面抗原结合，制备2组细胞并在结合测定法中用于分别估计非特 异性和总结合放射性。用于非特异性结合的细胞在加入放射标记的抗 体之前与过量未标记的Ab一起预孵育以封闭所有表面抗原位点，而 用于总结合的那些在PBS中预孵育。预孵育后，加入各种量的125I- hL243γ4P或125I-mL243并与2×105个人淋巴瘤细胞(Raji、Daudi或 Ramos)一起于4℃孵育2小时并通过洗涤去除未结合的抗体。计数 细胞相关的放射性。在放射标记抗体给定浓度上的放射标记抗体的特 异性细胞表面结合计算为：总结合计数减去非特异性结合的计数。

流式细胞测定法。

免疫表型分型：使用上述细胞系实验对象组、使用FITC-山羊抗- 人IgG(Tago，Inc.，Burlingame，CA)基本上如前所述进行间接免 疫荧光测定法，并使用FACSCaliber(Becton Dickinson，San Jose，CA) 通过流式细胞法进行分析。

凋亡实例分析：碘化丙啶染色后进行细胞DNA的流式细胞分析。 细胞置于24孔板中(5×105细胞/孔)并随后用MAbs(5μg/ml)处 理。3个孔用每种MAb制备以研究与山羊抗-小鼠或山羊抗-人第二抗 体交联的效应。与第一MAbs(37℃，5％CO2)一起孵育20分钟后， F(ab’)2山羊抗-小鼠IgG Fcγ-特异性第二抗体(Jackson Laboratories， West Grove，PA)加入来自每种第一MAb的一个孔中以将第二抗体 的浓度调整至20μg/ml。F(ab’)2山羊抗-人IgG Fcγ-特异性(Jackson Laboratories)类似地加入来自每种第一MAb的第二个孔中，并通过 添加培养基均衡第三组的体积。孵育(37℃，5％CO2)48小时后， 将细胞转移至测试管，用PBS洗涤，并随后重悬浮于低渗碘化丙啶溶 液(溶于0.1％柠檬酸钠，0.1％Triton X-100的50mg/ml碘化丙啶) 中。使用FACSCaliber通过流式细胞法分析样品。凋亡细胞百分比定 义为在G1/G0峰(亚二倍体)之前具有DNA染色的细胞的百分比。

hL243的构建和表征。

在一种示例性方法中，产生2种人源化抗-DR MAbs。hL243γ1设 计为含有人IgG1/κ恒定区，并且hL243γ4p通过用人γ4链的序列代替 人γ1链的重链恒定区编码序列进行构建。将点突变Ser241Pro引入γ4 序列的绞链区，以便减少当抗体在哺乳动物细胞培养中表达和生产时 形成半分子(Schuurman等人，Mol.Immunol.38：1(2001))。2种人 源化L243抗体γ1和γ4P结合Raji细胞的能力显示于图7、8和17中。 在图7中，hL243γ1与Raji细胞的结合通过将细胞与亲本鼠L243 (mL243)一起预孵育被特异性阻断，表明mL243的抗原-结合特异 性在人源化形式中保留。

在一个例子中，评估hL243γ4P相对于亲本mL243的反应性并进 行竞争细胞结合测定法。固定量的125I-标记的mL243或hL243γ4P在 各种浓度的纯化hL243γ4P或mL243的存在下与人淋巴瘤细胞(Raji、 Daudi或Ramos)一起孵育。如图8中所示，mL243和hL243γ4P MAbs 彼此竞争结合细胞表面抗原，表明识别共同的抗原决定簇。hL243γ4P 具有比mL243明显强约2倍的结合亲和力(约7对约16.5nM的EC50)。 通过斯卡恰特作图分析确定每个细胞的hL243γ4P和mL243结合位点 的最大数目以及平衡结合的表观解离常数。如图17中所示，hL243γ4P 和mL243与Daudi细胞的最大结合基本上是相同的，约6×105分子/ 细胞，与结合共同抗原一致。关于hL243γ4P和mL243的表观解离常 数值分别计算为2.6nM和14nM。使用Raji和Ramos细胞获得相似 结果(数据未显示)。

培养的淋巴瘤细胞的抗原表达。

在一种示例性方法中，使用间接荧光染色进行流式细胞法分析以 显示hL243γ4P结合培养的人B细胞淋巴瘤实验对象组。显示了与其 他表面抗原的比较。如表4中所示，hL243γ4P MAb结合所有测试的 细胞系。对于Daudi和Raji观察到更强烈的表达，但荧光染色的水平 对于所有细胞系都是强烈的。结合与针对其他B细胞抗原(CD74、 CD22、CD20)的人源化MAbs，鼠-人嵌合抗-CD20MAb利妥希玛和 人源化抗-CEA MAb(阴性对照)的结合进行比较。对于所有7种细 胞系hL243γ4P的染色明显大于CD22和CD74的染色。如通过与人源 化(hA20)和嵌合(利妥希玛)MAbs的反应性所示，CD20染色是 更易变的。伯基特系Daudi、Raji和Ramos表达中等水平的CD20， 而滤泡性和弥散性大B细胞淋巴瘤系评估为易变的。与通过hL243γ4P 结合测量的HLA-DR表达比较，SU-DHL-6具有较高的CD20表达， Namalwa和WSU-FSCCL具有较低的CD20表达，并且RL的2种抗 原表达大约相等。

效应细胞测定法

在一个例子中，hL243的Fc区用IgG4同种型Fc区代替以取消经 由Fc-受体的效应细胞功能和补体-结合。进行CDC和ADCC测定法 以评估这些功能。

在另一种示例性方法中，CDC Daudi细胞在人补体的存在下与系 列稀释的抗体hL243γ1、hL243γ4P、hA20(作为另一种阳性对照)和 hMN14(抗-CEA，阴性对照)一起孵育2小时。这随后为添加刃天青 以评估细胞存活率。包括未处理的和最大裂解对照。荧光读数在刃天 青添加后5小时获得。获得的荧光水平与有活力细胞数目正相关。此 处的结果表明与其中观察到CMC的hL243γ1(EC50＝2.6nM)和hA20 (EC50＝0.66nM)比较，hL243γ4P对细胞不产生补体介导的细胞毒 性效应(图10和18)。

通过钙黄绿素AM释放在Raji、Daudi和SU-DHL-6中还测量到 ADCC的诱导。hL243γ4P的活性与作为阳性对照的鼠L243和利妥希 玛的那种进行比较。如预期的，利妥希玛和鼠L243诱导比阴性对照 (无MAb和鼠和人源化MN-14)明显更多的细胞裂解，而hL243γ4P 则不是(图19)。

体外抗增殖效应。

在一个例子中，使用3H-胸苷摄取测定法在Raji、FSCCL和Namalwa 细胞上评估hL243对细胞增殖的效应(图20B和表5)。在交联抗Fc 抗体的存在或缺乏下，hL243γ4P的效应与利妥希玛以及与hL243γ4P 组合的利妥希玛的效应进行比较。在先前显示对利妥希玛相对不敏感 的FSCCL中，hL243γ4P产生比利妥希玛明显更大的增殖抑制。在Ramos 中，hL243和利妥希玛的活性是相似的，并且组合比任何一种单独的 更有效。组合可能具有协同效应。与抗人Fc抗体的交联是在Ramos 中看到的显著抗增殖活性所必需的。在Namalwa中，如同FSCCL一 样，hL243γ4P产生比利妥希玛明显更大的增殖抑制，并且利妥希玛和 hL243γ4P的组合产生比任何一种单独的MAb明显更多的增殖抑制。

凋亡诱导的评估

在一种示例性方法中，hL243γ4P-诱导的细胞死亡测定法的机制 通过测量各种凋亡标记进行评估。这些包括DNA断裂的诱导、膜联 蛋白V/7-AAD染色、激活的胱天蛋白酶-3的测量、线粒体膜电位的 丧失和AKT存活途径的激活。

在另一例子中，在SU-DHL-6和Namalwa中通过流式细胞法评估 DNA断裂。细胞与含或不含用于交联的第二MAb的MAbs一起培养 48小时，随后为使用碘化丙啶的DNA染色。细胞通过流式细胞法分 析，并且G1区下的阳性荧光代表DNA断裂并且是凋亡的测量。hL243 γ4P的活性与针对其他B细胞抗原的人源化MAbs，包括抗-CD74 (hLL1)、抗CD22(hLL2，依帕珠单抗(epratuzumab))、抗-CD20 (hA20)，以及鼠-人嵌合抗-CD20MAb利妥希玛的活性进行比较。对 照包括无第一MAb和阴性对照人源化抗-CEA MAb-hMN-14。hL243 γ4P在2种细胞系中诱导凋亡，水平类似于或大于其他抗B细胞MAbs (图21A和21B)。

在一个具体实施方案中，使用试剂盒(例如Guava NexinTM试剂 盒)以区别Daudi细胞中的凋亡和非凋亡死细胞。在这个例子中，试 剂盒利用膜联蛋白-V-PE检测凋亡细胞外膜上的磷脂酰丝氨酸(PS) 和细胞不透性染料7-AAD作为膜结构完整性的指示剂。7-AAD排除 活的健康细胞和早期凋亡细胞，但渗入晚期凋亡和死细胞。如图21B 中所示，这项研究的结果表明在4小时和24小时处理后hL243γ4P诱 导类似于mL243的凋亡。相反，抗-CD20MAb在Daudi中不诱导可 测量的凋亡。因此，通过次级试剂例如抗-人IgG或A蛋白的高度交 联可以在包括Daudi的许多细胞系中用于诱导通过抗-CD20MAbs的 凋亡。

在另一例子中，人源化和鼠L243对线粒体电位的效应在不同细 胞，即SU-DHL-6、Daudi、Raji、WSU-FSCCL、RL和Namalwa中进 行研究。结果在图22中表示，表明使用鼠和人源化L243MAbs都观 察到线粒体膜电位的凋亡变化。与第二抗体的交联可能不是必需的， 但可以增加评估的6种细胞系中的2种-FSCCL和Namalwa中的效 应。无需交联剂，通过hL243γ4P诱导的线粒体膜电位的丧失大于抗- CD20MAb(hA20)的那种。使用交联，hA20水平在6种细胞系中的 3种(RL、SU-DHL-6和Daudi)中增加至hL243γ4P的那些。

在一个例子中，通过人源化和鼠L243诱导的活化胱天蛋白酶-3 通过流式细胞法在淋巴瘤细胞系实验对象组中进行评估。表6中概括 的结果代表在与第二抗体交联的缺乏下在类似水平上的鼠和人源化 L243诱导的胱天蛋白酶-3激活。使用L243MAbs诱导的活化胱天蛋 白酶-3在所有细胞系中大于hA20的那种。使用第二抗体这些水平增 加并且hA20的效应类似于hL243γ4P的那种，除了在Namalwa和 FSCCL中，这2种细胞系我们照例观察到对于抗-CD20MAbs相对不 敏感。切割的胱天蛋白酶-3也在Daudi中经过2天的时间进程进行测 定(图23A)。对于L243γ4P的大约2天孵育，活性持续增加。小于1 小时的时间段未进行。

在一个例子中，在L243作用机制中AKT的涉及在6种细胞系中 通过流式细胞法进行测定。细胞与各种MAbs一起孵育2天，随后测 定磷酸-AKT。表7中列出的结果显示L243在所有细胞系中激活AKT。 对于所有细胞系在抗-CD20-hA20处理的细胞以及抗-CD74和抗- CD22处理的细胞中磷酸-AKT水平(未显示)类似于未处理的细胞。 为了确定P-AKT激活的时间进程，Daudi细胞与MAbs一起孵育各种 时间，在0分钟-约2天的时间点上去除MAbs(通过离心法)(图 23B)。这些结果表示通过L243的AKT激活可以比通过这种测定法可 以测量的发生得更快，因为即使在0时间点上P-AKT水平也等于2 天时间点。

在非霍奇金氏淋巴瘤(Raji)异种移植物模型中hL243的体内治 疗效应

在一种示例性方法中，进行治疗性研究以比较比较在人非霍奇金 氏淋巴瘤(Raji)的异种移植物模型中hL243γ4P和mL243(IgG2a同 种型)单克隆抗体的体内功效。这项研究的目标是确定hL243γ4P在 异种移植物模型中是否能维持显著的抗肿瘤功效。SCID小鼠用2.5× 106个Raji细胞注射。使用hL243γ4P或mL243的治疗在肿瘤细胞施 用后1天开始。结果显示于图24中。用盐水或非特异性对照抗体 hMN-14注射的2组小鼠具有17天的平均存活时间(MST)。与用盐 水或hMN-14注射的小鼠比较，用人源化或鼠L243治疗的所有小鼠 组具有明显改善的生存期限(P＜0.0001)。用各种剂量的hL243γ4P治 疗导致剂量-应答关系，接受更高剂量的小鼠具有更佳的存活时间。在 用各种剂量的mL243IgG2a治疗的动物组中，治愈率为80-100％。

表1.人源化和鼠MAbs对Namalwa结合的比较

[利妥希玛不是人源化的，而是嵌合MAb。]

表2.细胞系的表型分型(通过FACS测定法测定的B细胞系上 的人源化或嵌合Mabs的结合)。

使用FITC-GAH Fc第二Ab染色的间接测定法

表3.狗淋巴瘤抽吸物的表型分型

表4.B细胞系上的人源化或嵌合MAbs的结合。使用FITC-GAH Fc特异性第二抗体染色进行间接流式细胞测定法。

表5.交联或不交联的MAbs的抗增殖活性概括(3-H-胸苷摄取 的抑制％)

a括号中的数目代表与利妥希玛+hL243γ4P的组合比较的单一 MAbs的P值。

表6.切割的胱天蛋白酶-3测定法

表7.P-AKT测定法

依据本公开内容本文公开和要求的所有组合物和/或方法和/或装 置无需过度实验即可制备和执行。尽管本发明的组合物和方法已根据 优选实施方案进行描述，但对于本领域技术人员显而易见的是，无需 背离本发明的概念、精神和范围即可对本文描述的组合物和/或方法和 /或装置以及方法的步骤或步骤顺序应用变化。更具体而言，显而易见 的是化学和生理学相关的某些试剂可以取代本文描述的试剂同时达到 相同或相似的结果。对本领域技术人员显而易见的所有此类相似取代 和修改视为在如通过所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念 内。

与相关申请的交叉参照

本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求于2005年3月3日提交的 美国临时专利申请序列号60/657,695的优先权。上述申请因此为了所 有目的整体引入作为参考。

序列表

<110>IMMUNOMEDICS，INC.

     GOLDENBERG，David M.

     HANSEN，Hans J.

     QU，Zhengxing

     CHANG，Chien-Hsing

<120>人源化L243抗体

<130>78258-33058

<140>未定

<141>200603-02

<160>25

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>324

<212>DNA

<213>小鼠抗-HLA-DR抗体

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(321)

<400>1

gac atc cag atg act cag tct cca gcc tcc cta tct gta tct gtg gga     48

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly

1               5                   10                  15

gaa act gtc acc atc aca tgt cga gca agt gag aat att tac agt aat     96

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn

            20                  25                  30

tta gca tgg tat cgt cag aaa cag gga aaa tct cct cag ctc ctg gtc    144

Leu Ala Trp Tyr Arg Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val

        35                  40                  45

ttt gct gca tca aac tta gca gat ggt gtg cca tca agg ttc agt ggc    192

Phe Ala Ala Ser Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

agt gga tca ggc aca cag tat tcc ctc aag atc aac agc ctg cag tct    240

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser

65                  70                  75                  80

gaa gat ttt ggg gat tat tac tgt caa cat ttt tgg act act ccg tgg    288

Glu Asp Phe Gly Asp Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Thr Thr Pro Trp

                85                  90                  95

gcg ttc ggt gga ggc acc aac ctg gaa atc aaa cgt                    324

Ala Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys

            100                 105

<210>2

<211>107

<212>PRT

<213>小鼠抗-HLA-DR抗体

<400>2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Arg Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val

        35                  40                  45

Phe Ala Ala Ser Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Gly Asp Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Thr Thr Pro Trp

                85                  90                  95

Ala Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys

            100                 105

<210>3

<211>363

<212>DNA

<213>小鼠抗-HLA-DR抗体L243

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(360)

<400>3

cag atc cag ttg gtg cag tct gga cct gag ctg aag aag cct gga gag     48

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1               5                   10                  15

aca gtc aag atc tcc tgc aag gct tct ggg ttt acc ttc aca aac tat     96

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr

            20                  25                  30

gga atg aac tgg gtg aag cag gct cca gga aag ggt tta aag tgg atg    144

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

        35                  40                  45

ggc tgg ata aac acc tac act aga gag cca aca tat gct gat gac ttc    192

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Arg Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

    50                  55                  60

aag gga cgg ttt gcc ttc tct ttg gaa acc tct gcc agc act gcc tat    240

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

ttg cag atc aac aac ctc aaa aat gag gac acg gct aaa tat ttc tgt    288

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Lys Tyr Phe Cys

                85                  90                  95

gca aga gat att act gcg gtt gta cct acg ggt ttt gac tac tgg ggc    336

Ala Arg Asp Ile Thr Ala Val Val Pro Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly

            100                 105                 110

caa ggc acc act ctc acc gtc tcc tca                                363

Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser

        115                 120

<210>4

<211>120

<212>PRT

<213>小鼠抗-HLA-DR抗体L243

<400>4

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1               5                   10                  15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Arg Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Lys Tyr Phe Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Asp Ile Thr Ala Val Val Pro Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly

            100                 105                 110

Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser

      115                  120

<210>5

<211>324

<212>DNA

<213>人源化小鼠抗体

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(324)

<400>5

gac atc cag ctg acc cag tct cca tca tct ctg agc gca tct gtt gga     48

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

gat agg gtc act atc act tgt cga gca agt gag aat att tac agt aat     96

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn

            20                  25                  30

tta gca tgg tat cgt cag aaa cca ggg aaa gca cct aaa ctg ctg gtc    144

Leu Ala Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val

        35                  40                  45

ttt gct gca tea aac tta gca gat ggt gtg cct tcg cga ttc tct ggc    192

Phe Ala Ala Ser Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

agc gga tct ggg aca gat tat act ttc acc atc agc tct ctt caa cca    240

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

gaa gac att gca aca tat tat tgt caa cat ttt tgg act act ccg tgg    288

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Thr Thr Pro Trp

                85                  90                  95

gcg ttc ggt gga ggg acc aag ctg cag atc aaa cgt                    324

Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Gln Ile Lys Arg

            100                 105

<210>6

<211>108

<212>PRT

<213>人源化小鼠抗体

<400>6

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val

        35                  40                  45

Phe Ala Ala Ser Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Thr Thr Pro Trp

                85                  90                  95

Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Gln Ile Lys Arg

            100                 105

<210>7

<211>363

<212>DNA

<213>人源化小鼠抗体

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(363)

<400>7

cag gtg caa ctg cag caa tct ggg tct gag ttg aag aag cct ggg gcc     48

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1               5                   10                  15

tca gtg aag gtt tcc tgc aag gct tct gga ttt acc ttc aca aac tat     96

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr

            20                  25                  30

gga atg aac tgg gtg aag cag gcc cct gga caa ggg ctt aag tgg atg    144

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met

        35                  40                  45

ggc tgg ata aac acc tac act aga gag cca aca tat gct gat gac ttc    192

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Arg Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

    50                  55                  60

aag gga cgg ttt gcc ttc tcc ttg gac acc tct gtc agc acg gca tat    240

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

ctc cag atc agc agc cta aag gct gac gac act gcc gtg tat ttc tgt    288

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

                85                  90                  95

gca aga gat att act gcg gtt gta cct acg ggt ttt gac tac tgg ggc    336

Ala Arg Asp Ile Thr Ala Val Val Pro Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly

            100                 105                 110

caa ggg tcc ctg gtc acc gtc tcc tca                      363

Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>8

<211>121

<212>PRT

<213>人源化小鼠抗体

<400>8

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Arg Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Asp Ile Thr Ala Val Val Pro Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly

            100                 105                 110

Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>9

<211>108

<212>PRT

<213>人

<400>9

Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser

1               5                   10                  15

Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Ala

            20                  25                  30

Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly

        35                  40                  45

Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe Thr

    50                  55                  60

Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu

65                  70                  75                  80

Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

                85                  90                  95

Arg Glu Asp Ser Asn Gly Tyr Lys Ile Phe Asp Tyr

            100                 105

<210>10

<211>121

<212>PRT

<213>Murinae gen.sp.

<400>10

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1               5                   10                  15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Arg Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Lys Tyr Phe Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Asp Ile Thr Ala Val Val Pro Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly

            100                 105                 110

Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

       115                  120

<210>11

<211>121

<212>PRT

<213>人源化抗体

<400>11

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Arg Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Asp Ile Thr Ala Val Val Pro Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly

            100                 105                 110

Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>12

<211>119

<212>PRT

<213>人

<400>12

Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser

1               5                   10                  15

Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Ala

            20                  25                  30

Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly

       35                  40                  45

Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe Thr

    50                  55                  60

Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu

65                  70                  75                  80

Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

                85                  90                  95

Arg Glu Asp Ser Asn Gly Tyr Lys Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

            100                 105                 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

        115

<210>13

<211>107

<212>PRT

<213>人

<400>13

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ile Lys Tyr

            20                  25                  30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Glu Ala Ser Asn Leu Gln Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu AspIle Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Ser Leu Pro Tyr

               85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr

            100                 105

<210>14

<211>108

<212>PRT

<213>小鼠

<400>14

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Arg Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val

        35                  40                  45

Phe Ala Ala Ser Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Gly Asp Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Thr Thr Pro Trp

                85                  90                  95

Ala Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys Arg

            100                 105

<210>15

<211>108

<212>PRT

<213>人源化小鼠抗体

<400>15

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val

        35                  40                  45

Phe Ala Ala Ser Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Thr Thr Pro Trp

                85                  90                  95

Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Gln Ile Lys Arg

            100                 105

<210>16

<211>175

<212>DNA

<213>人源化小鼠抗体

<400>16

ggtctgagtt gaagaagcct ggggcctcag tgaaggtttc ctgcaaggct tctggattta    60

ccttcacaaa ctatggaatg aactgggtga agcaggcccc tggacaaggg cttaagtgga   120

tgggctggat aaacacctac actagagagc caacatatgc tgatgacttc aaggg        175

<210>17

<211>168

<212>DNA

<213>人源化小鼠抗体

<400>17

acccttggcc ccagtagtca aaacccgtag gtacaaccgc agtaatatct cttgcacaga     60

aatacacggc agtgtcgtca gcctttaggc tgctgatctg gagatatgcc gtgctgacag    120

aggtgtccaa ggagaaggca aaccgtccct tgaagtcatc agcatatg                 168

<210>18

<211>38

<212>DNA

<213>人源化小鼠抗体

<400>18

gtggtgctgc agcaatctgg gtctgagttg aagaagcc                            38

<210>19

<211>38

<212>DNA

<213>人源化小鼠抗体

<400>19

tgaggagacg gtgaccaggg acccttggcc ccagtagt                            38

<210>20

<211>155

<212>DNA

<213>人源化小鼠抗体

<400>20

tccatcatct ctgagcgcat ctgttggaga tagggtcact atcacttgtc gagcaagtga     60

gaatatttac agtaatttag catggtatcg tcagaaacca gggaaagcac ctaaactgct    120

ggtctttgct gcatcaaact tagcagatgg tgtgc                               155

<210>21

<211>159

<212>DNA

<213>人源化小鼠抗体

<400>21

cagcttggtc cctccaccga acgcccacgg agtagtccaa aaatgttgac aataatatgt     60

tgcaatgtct tctggttgaa gagagctgat ggtgaaagta taatctgtcc cagatccgct    120

gccagagaat cgcgaaggca caccatctgc taagtttga                           159

<210>22

<211>38

<212>DNA

<213>人源化小鼠抗体

<400>22

gacattcagc tgacccagtc tccatcatct ctgagcgc                            38

<210>23

<211>31

<212>DNA

<213>人源化小鼠抗体

<400>23

ccggcagatc tgcagcttgg tccctccacc g                                   31

<210>24

<211>47

<212>DNA

<213>小鼠

<400>24

ccgcggtcac atggcaccac ctctcttgca gcttccacca agggccc                 47

<210>25

<211>33

<212>DNA

<213>小鼠

<400>25

ccggccgtcg cactcattta cccagagaca ggg                                33