权利要求

癌症调节抗体技术领域本发明涉及癌症的诊断和治疗，特别涉及肿瘤细胞的细胞毒性介导。本发明尤其涉及癌症调节抗体（CDMAB)的应用，任选的与一 种或多种化学治疗剂联合使用，作为启动细胞毒素反应的方法。本发 明进一步涉及利用本发明的CDMAB的结合测定（binding assays )。背景技术抗人类白血球的单克隆抗体的培养导致了 CD44抗原的发现；单 链透明脂酸（HA)结合糖蛋白表达于多种正常组织和所有类型的造血 细胞上。CD44最初与淋巴细胞活化和寻靶过程有关，目前，其推定 的生理作用还包括：激活炎症反应基因，调节细胞循环，诱导细胞繁殖，诱导分化和发育，诱导细胞支架重组、细胞迁移和细胞存活/抵抗 细月包凋亡。人体中，CD44的单基因拷贝位于11号染色体短臂上，11pl3。该 基因包含19个外显子；前5个是恒定的，接下来的9个是可变的，随 后3个是恒定的，最后2个是可变的。差别剪接能够导致IOOO种不同 的亚型。然而，目前只鉴定出几十个自然发生的变型。CD44标准糖蛋白的组成为： 一个N末端细胞外（包括一个20个 氨基酸的前导序列和一个膜近侧区（85个氨基酸））域（270个氨基酸）、 一个跨膜区（21个氨基酸）和胞质尾区（72个氨基酸）。细胞外区域 还包括一个位于N末端的连接模块。该区域长度为92个氨基酸并表 现出与其他HA结合连接蛋白的同源性。鼠和人的CD44具有高度同 源性。该蛋白的变型被插入外显子5的碳末端，并且在表达时被细胞 外定位。CD44的浆液可溶形式也是自然形成的，可以起源于终止密 码子（在可变区内）或蛋白水解活性。各种刺激物（包括TNF-ce)下 的细胞活化导致了 CD44受体的脱落。受体脱落也可以在肺瘤细胞中发现，并能够导致人体血清中CD44浓度升高至IO倍。高浓度的CD44 血清表明了恶性肿瘤（卵巢癌除外）。以标准形式出现的CD44的分子量大约为37 kD。翻译后的修饰 使其分子量增至80-90 kD。这些修饰包括细胞外域氨基末端在天冬酰 胺残基上的N联糖基化、细胞外域碳末端在丝氨酸/苏氨酸残基上的氧 糖基化和氨基葡聚糖加成。剪接变型的大小为80-250 kD。HA, —种位于哺乳动物体内细胞外基质(ECM)上的多糖，被认为 是主要的CD44配基。但是，也已经发现CD44与胶原、纤维结合素 和层粘连蛋白等这类蛋白结合。HA结合与糖基化之间表现出某种相 互关系。失活的CD44 (不结合HA)具有最高的糖基化水平，活性 CD44 (结合了 HA)的糖基化水平最低，而可诱导的CD44 (不结合 或弱结合HA，除非被细胞因子、单克隆抗体、生长因子等激活）的 糖基化水平介于活性形式和非活性形式之间。CD44能够通过依赖于细胞、刺激物和环境之间相互作用的信号 传导途径来调节其某些功能。这些途径包括NFKB信号级联（涉及炎 症反应）、Ras-MAPK信号传导途径（涉及激活细胞循环和增殖）、Rho 蛋白族（涉及细胞骨架重组和细胞迁移）和PI3-K相关信号传导途径 (涉及细胞存活）。所有上述功能与疾病发生和发展密切关联。CD44 还涉及通过各种其他机制在癌症中起作用。这些机制包括生长因子、 化学增活素和细胞因子被CD44细胞表面上的细胞表面蛋白聚糖展示 给恶性肿瘤中涉及的受体。同时，CD44-HA复合物内陷入细胞后由溶 酶体酶引起的HA细胞内降解有可能提高肿瘤侵袭力和ECM诱导的血 管生成。另外，已经表明存活信号或凋亡信号的传导是通过标准或可 变的CD44受体而发生。CD44还涉及细胞分化和迁移。这些机制中很 多（如果不是全部）是环境和细胞依赖性的，有几种机制产生了可变 的结果。因此，在得出结论前需要更多的研究。为了验证CD44在癌 症中的潜在功能作用，研究了 CD44的表达，来确定受体的差异表达 是否与疾病进展相关联。但是，在多数肿瘤类型中出现了不一致的结 果，这可能归因于研究者之间在试剂组合、技术、病理状况和细胞类 型方面的差异。肾细胞癌和非何杰金淋巴瘤是例外，因为CD44高表达的肿瘤患者的存活时间始终比那些CD44低表达或不表达的患有同 样肿瘤的患者要短。由于与癌症相关，CD44已经成为抗癌治疗研发的目标。依然存 在争议的是肿瘤发展中需要的是标准形式的CD44还是变异形式的 CD44。两种观点都有体内动物实验数据的支持，这可能还是取决于肿 瘤类型、甚至细胞类型。不同的治疗方法包括了可溶性CD44蛋白注 射液、透明质烷合成酶cDNA、透明脂酸酶、CD44反义和CD44特异 性抗体的应用。每种方法已经达到了某种程度的成功，从而为抗CD44 癌症治疗提供了支持。变异的和标准的CD44特异性单克隆抗体都已经通过实验生成， 但是对大部分而言都没有内在的生物学活性，尽管它们特异性的与所 识别的CD44类型结合。然而，有一些单克隆抗体具有体内活性或体 外活性，但一般不是同时具有体内和体外活性。几种抗CD44抗体已 经表现出介导细胞性活动。例如，已经表明靶向抵抗人类红细胞 Lutheran抗原CD44标准形式的鼠抗体A3D8能提高CD2 ( 9-1抗体） 和CD3(OKT3抗体)介导的T细胞活化作用；另外一个抗CD44抗体具 有类似效果。A3D8还诱导了 IL-1从单核细胞的释放和IL-2从T淋巴 细胞的释力丈。有趣的是，A3D8与诸如柔红霉素（daunorubicin )、米托 蒽醌（mitoxantrone )、依托泊戒（etoposide )等药物联合使用，通过 阻断第二信使神经酰胺的生成而抑制了 HL60和NB4AML细胞中细胞 凋亡的诱导。J173抗体没有内在活性并定向抵抗类似的CD44表位， 它没有抑制药物诱导的细胞凋亡。HIH44-1抗体，定向抵抗85-110kD 和200 kD形式的CD44，增强了 T细胞的繁殖，笔者推测其途径是 CD44的交联或聚集。总之，没有证据表明这类抗体适合于癌症治疗 的使用，因为它们不是定向抵抗癌症（如激活淋巴细胞）、诱导细胞繁 殖，在与细胞毒剂联合使用时也没有抑制药物诱导的肿瘤细胞死亡。几种抗CD44抗体已经被报道具有体内抗肿瘤作用。抗体 1.1ASML, —种导向CD44的v6变型的鼠IgGl,已经显示出减少'淋 巴结和鼠胰腺癌的肺转移。受治动物的存活率随之提高。该抗体只有 在淋巴结聚集前给入才是有效的，其假设原理是干扰淋巴结中的细胞繁殖。在体内，抗体对肿瘤细胞没有直接的细胞毒性，也没有提高补 体介导的细胞毒作用或免疫效应细胞的功能。该抗体抵抗人类细胞的 效用没有被描述。Breyer等人描述了 一种可商业获得的抗体用于CD44s，以破坏常 位移植的鼠恶性胶质瘤的发展。鼠恶性胶质瘤细胞系C6被移植入鼠 的额叶中， 一周后，通过脑内注射用抗体对这些鼠进行3次治疗。经 治疗的鼠表现出降低的肺瘤生长，并且体重比采用緩沖液或同种型对 照治疗的鼠更高。该抗体能够在体外抑制细胞对涂有细胞外基质成分 的盖玻片的粘附，但是对细胞没有任何直接的细胞毒作用。该抗体没 有被测试抵抗人类细胞。一项研究比较了抗体对CD44s(IM-7.8.1)的效力和抗体对CD44vl0 (K926)的效力。同时表达上述两种CD44亚型的高度转移的鼠黑素瘤 细胞系B16F10被静脉注入小鼠。2天后，每3天给入一次抗体并持续 整个研究过程。两种抗体都使肺转移数目显著下降50%以上；两种抗 体的效力没有显著差异。抗体没有影响体内增殖，笔者Zawadzki等人 推测其肿瘤生长的抑制作用归因于抗体阻断了 CD44与其配基的相互 作用。在使用IM-7.8.1的另外一项研究中，Zahalka证明了抗体极其 F(ab')2片段能够阻断通过鼠T细胞淋巴瘤LB的淋巴结侵润。这给小 鼠带来了显著的存活受益。Wallach-Dayan表明了 CD44v4-v10对 LB-TRs鼠淋巴瘤的转染（不同时生成肿瘤）赋予了生成肿瘤的能力。 与同种型对照抗体相比，IM-7.8.1的注入降低了植入感染细胞的肿瘤 大小。这些研究中没有一个证明了这种抗体的人类效用。GKW. A3, —种鼠IgG2a,对人类CD44有特异性并防止了人类 黑素瘤移植物在SCID小鼠中的生成和转移。该抗体与转移的人类细 胞系SMMU-2混合后静脉注入小鼠。治疗持续接下来的3周。4周后， 10只小鼠中只有一只在注射部位生成了肿瘤，而未经过治疗的小鼠全 部生成肿瘤。抗体的F(ab')2片段表现出同样的肿瘤生成的一支作用， 表明该作用机制不依赖于补体或抗体依赖性的细胞毒作用。如果肿瘤 细胞在首次注射抗体前1周注入，80%的动物在原发部位生成了肿瘤。 但是，存活时间还是有显著提高。尽管抗体的延迟注入对原发性肿瘤的生成没有作用，但是其完全预防了病灶向肺、肾、肾上腺、肝和腹 膜的转移，这些转移出现在未治疗的动物中。这种抗体对体外细胞系

没有任何直接的细胞毒性或者它干扰了 SMMU-2细胞的繁殖，并通过 影响转移或生长而显示出对肿瘤生成的主要作用。这种抗体的一个显 著特征是其识别了所有的CD44亚型，这表明其在治疗应用上有限的 可能性。

Strobel等人描述了在一个鼠异种移植模型中，使用一种抗CD44 抗体（克隆515 )来抑制人类卵巢癌细胞的腹膜移植。在存在有抗CD44 抗体或对照抗体的情况下，将人类卵巢细胞系36M2被腹膜植入小鼠 中，然后在接下来的20多天进行治疗。5周后，抗体治疗组腹腔内的 根瘤明显较少。抗CD44和对照组的根瘤大小相同，表明一旦细胞被 植入，抗体对肿瘤的生长没有作用。当细胞经皮下注射时，对肺瘤细 胞还是没有作用，表明抗体本身没有抗增殖活性或细胞毒作用。另外， 该抗体在体外对细月包生长没有作用。VFF-18，也被命名为BIWA 1， 是一种对CD44的v6变型具有高度亲和力的抗体，对多肽的360-370 区域有特异性。这种抗体已经以""technetium标记的结合物形式用于 12例患者的临床实验。检测了该抗体在头颈部鳞状细胞癌患者中的安 全性和靶向能力。注射后40小时，14%的注入剂量被肿瘤摄取，在其 他组织（包括肾、脾和骨髓）中有最小的聚集。尽管该抗体的高度选 择性的肿瘤结合显示了其在放射免疫治疗中的作用，但是其极高的亲 和力阻碍了该抗体更深层侵入胂瘤。BIWA 1应用的其他限制是鼠抗体 的免疫原性（12例患者中有11例出现了人体抗鼠抗体（HAMA))、 遍及胂瘤的异源性聚集和抗体可溶性CD44复合物的生成。WO 02/094879公开了 一种人源化的VFF-18，目的是克服HAMA反应，被 命名为BIWA 4。发现BIWA 4的抗原结合力显著低于其亲代VFF 18 抗体。令人惊奇的是，低亲和力的BIWA4抗体比高亲和力的BIWA8 人源化VFF-18抗体具有更好的肿瘤摄取特性。

在有33例患者的I期临床实验中评价了 99TaTechnetium标记和 186Rhenium标记的BIWA 4抗体，来测定关于186Re标记的BIWA 4的 安全性、耐受性、肿瘤聚集和最大耐受剂量。其中显示了 99mTc标记的BIWA4的肿瘤相关摄取。所有剂量的186Re标记的BIWA4都没有 观察到肿瘤反应，虽然有一例病情稳定；剂量限制型细胞毒性发生于 60 mCi/m2。副反应率为50-65%, 33例患者中有12例-故认为具有严 重的副反应（血小板减少、白细胞减少和发热），其中6例（都是使用 ^Re标记的BIWA4进行治疗）由于病情恶化而在治疗中或治疗后死 亡。两例患者出现了人抗人抗体（HAHA)。在20例患者中进行了 186Re 标记的BIWA4的I期剂量倍增实验。观察到口腔粘膜炎和剂量限制型 血小板减少症和白细胞减少症； 一例患者出现了 HAHA反应。以最高 剂量60 mCi/m"台疗的5例患者病情稳定。尽管安全性和耐受性相对 于所获得的效力而言被认为是可以接受的，但是这些研究比其他临床 研究中非放射性同位素生物治疗具有更高的副反应率。美国专利申请 US 2003/0103985公开了一种结合了美登醇的人源化VFF-18,被命名 为BIWIl,用于肿瘤治疗。在人类阴户表皮样癌、磷状细胞癌或乳腺 癌的鼠模型中发现，人源化抗体（BIWA4)与毒素结合时，即BIWA1， 具有显著的抗肿瘤作用。未结合形式（BIWA4)没有抗肿瘤作用，而 结合形式（BIWI1)没有人体安全性或有效性的证据。

Mab U36是鼠单克隆IgGl抗体，产生于UM-SCC- 22B人咽喉癌 细胞免疫和肿瘤及组织特异性选择。通过cDNA克隆和序列分析的抗 原鉴定，将角质化细胞特异性CD44剪接变型epican的v6结构域确定 为MabU36的靶点。免疫组织化学研究表明抗原表位严格限制于细胞 表面。另外，MabU36强烈标记了 94%的头颈部磷状细胞癌(HNSCC), 在这些肿瘤中的细胞染色均一。10例患者的99mTc标记Mab U36研究 表明抗体选择性富集于HNSCC肿瘤（20.4+/-12.4 。/。注射剂量/kg ， 2 天)；没有副反应报告，但是两例患者出现了 HAMA。在放射性碘化 的鼠Mab U36研究中，18例患者中有3例HAMA和HNSCC中的选 择性同源摄取。为降〗氐Mab U36的抗原性和HAMA发生率而构建了 一种杂合抗体。不论是杂合的还是原始的鼠Mab U36都没有ADCC活 性。没有关于Mab U36天然功能活性的证据。1S6Re标记的杂合Mab U36被用于检测MabU36作为治疗剂的效力。在这个I期剂量倍增实 验中，13例患者接受了试验剂量的99mTc标记的杂合Mab U36,随后是^Re标记的杂合Mab U36。没有报告强烈的副反应，除了后续治 疗中观察到剂量限制型骨髓毒性(1.5 GBq/m勺存在于3例患者中的2 例，以及一例患者在接受最大耐受剂量（l.O GBq/m勺治疗时的血小板减 少。尽管对肿瘤大小有一些作用，但这些作用没有达到治疗目的的反 应标准。另一项^Re标记的杂合Mab U36的研究采用了 一种策略， 使用粒细胞集落刺激因子刺激的全血再输入来使最大耐受活性倍增至 2.8 Gy。在这项研究中，9例患有不同的头颈部肿瘤患者中有3例由于 药物相关性贫血而需要输血。其他细胞毒包括3级骨髓中毒和2级粘 膜炎。没有报道目标肿瘤反应，尽管5例患者获得了 3-5个月的病情 稳定。因此，可以发现，尽管MabU36是高度特异性抗体，但是需要 放射性免疫复合物来获得抗癌效果，这个缺点限制了其效用，因为在 获得临床效果的相关治疗伴随着细胞毒。总结，在注入了转移性胰腺癌的鼠或注入了恶性黑素瘤的小鼠中， CD44v6 (UASML)和CD44vl0 (K926)单克隆抗体降低了转移活性。 另一个抗。04*6抗体(>^^- 18及其衍生物），只有与美登醇或放射性 同位素结合时才具有抗肿瘤作用。抗标准CD44单克隆抗体还抑制鼠 恶性胶质瘤的脑内病变（抗CD44s)、鼠T细胞淋巴瘤的淋巴结侵入 (IM-7.8.1),以及抑制人卵巢癌细胞系在棵鼠中的移植(clone 515)、鼠 黑素瘤细胞系的肺转移(IM-7.8.1)和人黑素瘤细胞系在SCID小鼠中的 转移（GKW.A3)。放射性同位素结合的Mab U36抗CD44v6抗体及其衍 生物在临床实验中具有抗肿瘤活性，并伴随着显著的毒性。尽管这些 结果鼓励和支持了抗CD44单克隆抗体作为潜在的肿瘤治疗剂的发 展，但也说明了其对人类肿瘤有效性、安全性或应用性的限制。因此，如果分离到一种介导癌细胞细胞毒的抗体组合物，由于其 吸引CD44在所述细胞表面表达的功能，将实现一种有价值的诊断和 治疗过程。现有专利：美国专利5750102公开了一种方法，其中用MHC基因转染患者 肿瘤细胞，MHC基因可以从患者的组织或细胞中克隆。然后将这些经转染的细胞用于接种患者。美国专利4861581公开了一种方法，该方法包括如下步骤：获得 单克隆抗体，该抗体对哺乳动物的肿瘤细月包及正常细月包的内部细月包成 分有特异性而对外部成分没有特异性；标记单克隆抗体；将标记抗体 与已经接受过肿瘤细胞杀灭治疗的哺乳动物组织接触；以及通过测定 标记抗体与退化肺瘤细胞内部细胞成分的结合来确定治疗的效果。在 制备导向人类细胞内抗原的抗体的过程中，专利权人认识到癌细胞是 这类抗原的 一 个方<更来源。美国专利5171665提供了一种新型抗体和该抗体的生产方法。具 体的，该专利说明了单克隆抗体的制备，所述单克隆抗体具有与人类 肿瘤相关蛋白抗原（如结肠和肺的）牢固结合的性质，而与正常细胞 的结合程度要小得多。美国专利5484596提供了一种癌症的治疗方法，该方法包括：手 术去除癌症患者的肿瘤组织；处理肿瘤组织以获得肿瘤细胞；照射肿 瘤细胞，使其存活但没有致瘤性质；以及用这些细胞为患者制备疫苗， 该疫苗能够抑制原发性肿瘤的复发并同时抑制病灶转移。该专利公开 了与肿瘤细胞表面抗原具有反应性的单克隆抗体的研制。如第4栏第 45行等处说明，专利权人在对人类肿瘤具有活性特异的免疫治疗的单 克隆抗体研发过程中，利用了自体肿瘤细胞。美国专利5693763说明了人类癌细胞的糖蛋白抗原特性不依赖于 原发的上皮组织。美国专利5783186说明了诱导Her2表达细胞凋亡的抗Her2抗体， 产生抗体的杂交瘤细胞系，使用抗体和含有所述抗体的药物组合物治 疗癌症的方法。美国专利5849876描述了用于生产单克隆抗体的新型杂交瘤细胞 系，所述抗体针对从肿瘤和非月中瘤组织来源中提纯的粘蛋白抗原。美国专利5869268 />开了生成人体淋巴细胞的方法，该淋巴细胞 产生对目标抗原具有特异性的抗体，同时公开了一种生产单克隆抗体 的方法及由该方法生产的单克隆抗体。该专利特别公开了用于诊断和 治疗癌症的抗HD人类单克隆抗体的生产。美国专利5869045涉及和人体癌细胞反应的抗体、抗体片段、抗 体偶联物和单链免疫毒素。这些抗体的功能机理是双重的，因为这些 抗体一方面与展示在人体癌细胞表面的膜抗原具有反应性，另外这些 抗体还能够陷入癌细胞，随后结合，使它们特别用于形成抗体-药物和 抗体-毒素结合物。以未修饰形式出现的抗体在特定浓度下也表现出细 胞毒性质。美国专利5780033公开了自体抗体用于肿瘤治疗和预防。不过， 该抗体是从成年哺乳动物中得到的抗细胞核自体抗体。这里，自体抗 体是指在免疫系统中发现的一种天然抗体。因为自体抗体来源于"成年 哺乳动物"，因此就不要求自体抗体真正来源于受治患者。此外，该专 利公开了来自成年哺乳动物的天然的单克隆抗细胞核自体抗体以及生 成单克隆抗细胞核自体抗体的杂交瘤细胞系。美国专利5916561公开了 一种特异性抗体，VFF-18及其CD44定 向抵抗CD44基因的变异外显子v6的变型。这种抗体是对比较抗体 (comparator antibody)的改进，因为它识别的是人CD44v6变型，而 不是鼠CD44v6变型。另外，该抗体公开了 CD44v6表达的诊断实验。 没有公开该抗体的体外或体内功能。美国专利5616468公开了一种单克隆抗体Var3.1,抵抗一种含有 人类CD44基因的外显子6A编码序列的合成肽。特别是这种抗体不与 人CD44的90kD型结合，并区别于Hermes-3抗体。提供了 一种检测 CD44的v6变型的方法，以及筛查和检测基于该抗原的恶性转化的方 法。同时还提供了 一种基于检测血浆中抗原的炎性疾病筛查方法。美国专利5879898公开了一种结合于人CD44变型6的129bp外 显子的特异性抗体，所述变型生成含有43个氨基酸的肽。该单克隆抗 体由许多杂交瘤细胞系生成：MAK开了一种编码CD44样多肽的多聚核苷酸，以及使用该多聚核苷酸及其变型来生成重组蛋白的方法。这些多肽抗 体被要求保护，但是没有具体实施例，也没有分泌这种抗体的保藏克隆。Northern杂交证明该多聚核芬酸出现于几种组织中，但是没有其 他关于该多聚核苷酸翻译和表达的附加证据。因此，没有这样的证据： 生成了针对该多聚核苷酸基因产品的抗体，这些抗体具有体外或体内 功能，以及它们是否与人类肺瘤疾病相关。美国专利5885575公开了一种与CD44变型表位反应的抗体，以 及通过使用该抗体来识别变型的方法。编码这种变型的分离的多聚核 苷酸是从鼠细胞分离的，靶向抵抗这种变型的抗体（mAbl. IASML) 识别分子量为120 kD、 150 kD、 180 kD和200 kD的蛋白质。单克隆 抗体1.1ASML的给入延緩了鼠BSp73ASML在同源鼠中的生长和转 移。重要的是，I.IASML缺乏对LCLC97人类大细胞肺癌的活性而证 明它不识别人类肿瘤。 一种人类同系物从LCLC97分离出来，但是没 有生成识别这种同系物的相应抗体。因此，尽管一种特异性结合鼠 CD44变型的抗体被生成并表现出对鼠肿瘤生长和转移的作用，但是 没有该抗体抵抗人类肿瘤的证据。尤其是发明人指出这种抗体不识别 人类肿瘤。发明内容本发明的发明人之前已经被授予发明名称为"个体化患者特异抗 癌抗体"的美国专利6180357,关于一种用于治疗癌症的个体化筛选个 性化抗癌抗体的方法。基于本文目的，术语"抗体"和"单克隆抗体" (mAb)可以互换使用，是指杂交瘤（如鼠或人）生成的完整的免疫 球蛋白、免疫交联物，以及从所述免疫球蛋白衍生的适当的免疫球蛋 白片段和重组蛋白，如杂合的和人源化的免疫球蛋白、F(ab')和F(ab')2 片段、单链抗体、重组免疫球蛋白可变区（Fv)s、融合蛋白等。现有技 术公认有一些氨基酸序列在多肽中是可变的，并对蛋白质结构或功能 没有显著影响。在抗体的分子重排中，骨架区的核苷酸或氨基酸序列 变化通常是可以接受的，这些变化包括（但不限于）：置换（优选为保 守置换）、缺失或增加。另外，本发明还包括将本发明的CDMAB和标准的化学治疗药征（如放射性核素）结合起来，从而集中了所述化疗的作用。CDMAB还能与毒素、细胞毒残基、酶（生物素结合酶） 或造血细胞结合，藉此形成抗体交联物。本发明实质上利用了美国专利6180357中说明的生产患者特异性 抗癌抗体的方法，用以分离编码癌症调解单克隆抗体的杂交瘤细胞系。 可以为 一种肺瘤而专门制备这些抗体，从而使癌症的个性化治疗成为 可能。在本发明公开的内容中，具有杀灭细胞（细胞毒素的）或抑制 细胞生长（细胞生长抑制的）性能的抗癌抗体将在下文中被称为细胞 毒。这些抗体能够用于帮助癌症分期和诊断，也可用于治疗肿瘤转移 和原发性肿瘤。个性化抗癌治疗的前景将给患者的治疗方式带来变化。 一种可能 的临床情境是在一种肿瘤出现时就取样并入库。通过该样品，能够通 过已有的癌症调节抗体库对该肿瘤进行分类。患者将被常规分期，但 可用的抗体可以对患者进一步分期。可以用已有的抗体立即对患者进 行治疗，和/或肿瘤特异性抗体库可以使用本发明公开的方法或者使用 噬菌体展示库并结合本发明公开的筛选方法来生成。生成的所有抗体 将被添加入抗癌抗体库，因为其它的肿瘤细胞可能具有与被治疗的肿 瘤相同的抗原表位。根据本方法生成的抗体可以用于治疗任何数量的、 患有与这些抗体结合的癌症的患者。基本使用美国专利6180357的方法，用患者肺肿瘤活组织斥全查的 细胞来免疫小鼠后获得鼠单克隆抗体H460-16-2。 H460-16-2在不同组 织源的广泛的人类细胞系的细胞表面表达。乳腺癌细胞系 MDA-MB-231 (MB-231)和皮肤癌细胞系A2058对H460-16-2的体内细 胞毒作用敏感。当被植入小鼠体内后(如S.N. 10/603,000所公开）,H460-16-2在 培养液中对MB-231细胞的细胞毒作用^皮其抗癌活性进一步向癌细胞 扩展。临床前的异种移植肿瘤模型被认为是治疗效力的有效预测器。在人类乳腺癌预防性体内模型中，H460-16-2治疗在抑制治疗期 间肿瘤生长方面比同种型对照抗体（与H460-16-2结构和大小相同， 但不能与MB-231细胞结合）明显更加有效（PO.OOOl )。在治疗末期，给入H460-16-2的小鼠的肿瘤增长只有对照组的1.3%。在治疗后的随 访阶段，H460-16-2的治疗效果继续维持，治疗组的平均肿瘤体积继 续显著小于对照组，直到检测期末。使用存活率作为抗体效能的量度， 在H460-16-2治疗后70天，估计治疗组的死亡风险约是抗体緩冲液对 照组的71 %(p=0.028)。这些数据证明H460-16-2治疗相对于对照治疗 组带来了存活受益。H460-16-2治疗表现安全，因为它没有任何毒性 征兆，包括体重下降和临床不良应激。因此，H460-16-2治疗是有效 的，因为与对照治疗组相比，它在人乳腺癌的成熟模型中延緩了肿瘤 生长并提高了存活率。另夕卜，H460-16-2在构建的体内肿瘤模型中表现出对MB-231细胞 的抗肿瘤活性(如S,N. 10/603,000中所描述的）。将H460-16-2治疗与 标准的化学疗剂顺铂（Cisplatin)进行比较，结果显示顺铂和H460-16-2 治疗组的平均胂瘤体积明显小于抗体稀释緩冲液或同种型对照抗体治 疗组(pO.OOl)。 H460-16-2治疗介导的肿瘤抑制作用约是顺铂化疗的 2/3，但是没有顺铂治疗中发现的明显（19.2% )体重下降(pO.003)和 临床不良应激，包括两例治疗相关死亡。H460-16-2的抗肿瘤活性及 其最低限度的毒性使它成为一种具有吸引力的抗癌治疗剂。在治疗后 的阶段，H460-16-2表现出显著的存活受益(pO.02),因为在治疗后70 天以后，H460-16-2治疗组的死亡风险约为同种型抗体对照组的一半。 观察到的存活受益持续了治疗后120天，其中同种型对照和顺铂治疗 的小鼠全部死亡，而H460-16-2治疗组的死亡率为67%。 H460-16-2 通过延緩肿瘤生长而维持了肿瘤抑制作用，比同种型对照延缓26 % 。 治疗后31天，H460-16-2通过减少肿瘤生长而限制了肺瘤大小，比同 种型对照减少48%，在治疗结束时观察到相当于49%的减少。在已有 的乳腺癌肿瘤模型中，这些结果表明H460-16-2维持肿瘤抑制的能力 超出了治疗阶段，并证明了该抗体在哺乳动物中减少肿瘤负荷和提高 存活率的能力。除了在乳腺癌的体内肿瘤模型中的有益效杲外，H460-16-2治疗 与化疗药物的联合使用在前列腺癌体内模型中具有对PC-3细胞的抗 肿瘤活性。使用配对T检验，H460-16-2加顺铂治疗在治疗后短期抑制肺瘤生长方面比緩冲液对照(pO.OOOl)、顺铂单独治疗（p-0.004)或 H460-16-2单独治疗（p〈0.0001)明显的更加有效。在治疗末期，给入 H460-16-2加顺铂的小鼠的肿瘤增长只有緩冲液对照组的28.5。对于 PC-3 SCID异种移植模型来说，体重能够作为疾病进展的替代指标。 所有组的小鼠都经历了严重的体重下降。在这项研究中，所有组的小 鼠在治疗结束时的体重下降约为23-35%。 H460-16-2治疗组表现出最 低程度的体重下降（21.7% )。治疗后48天，与緩冲液对照组p = 0.5042 ) 相比，H460-16-2和顺铂治疗组的体重下降没有显著增加。因此， H460-16-2加顺铂治疗是有效的，因为与人类前列腺癌模型中同种型 对照治疗组相比，该治疗延緩了肿瘤生长。为了验证H460-16-2抗原表位作为药物靶点，首先检测了 H460-16-2抗原在正常人组织中的表达(S.N. 10/603,000)。这项工作通 过与抗CD44抗体；Ll 78克隆(S.N. 10/647,818)和BU75克隆（本文） 的比较得到了扩展。通过H460-16-2的IHC染色，多数组织未能表达 H460-16-2抗原，包括重要器官的细胞，如肝、肾（除了管状上皮细 胞的边缘染色（marginal staining ))、心和肺。组织染色结果表明 H460-16-2与多种细胞类型的结合限制，但是与侵润巨噬细胞、淋巴 细胞和成纤维细胞具有结合力。BU75抗体显示了类似的染色模式。 但至少有一种公知的差别：BU75与淋巴细胞的染色强度比H460-16-2 更大。在评价H460-16-2的治疗应用和设计有效临床实验中，H460-16-2 抗原的定位以及确定它在人群中（如在乳腺癌患者中）的传播是非常 重要的。为定位H460-16-2抗原在癌症患者的乳腺肿瘤中的表达，首 先在50例个体乳腺癌患者的肿瘤组织样品中筛查了 H460-16-2抗原的 表达(S.N. 10/603,000)，并与L178进行了比较(S.N. 10/647,818)。本项 工作比较了 H460-16-2对BU75和抗Her2抗体c-erbB-2的染色。本项 研究的结果与之前的结果类似，62%的组织样品对H460-16-2抗原染 色阳性，而73。/。的乳腺肿瘤组织对BU75抗原表位是阳性。患者样品 中的H460-16-2表达显示出对肿瘤细胞的特异性，因为染色被限制于 癌细胞。乳腺癌患者正常组织的10个样品中有4个被H460-16-2染色，而有8个被BU75染色。乳腺肿瘤的H460-16-2和BU75抗原表达主 要位于肿瘤细胞的细胞膜，这使CD44成为有吸引力的治疗靶点。在 乳腺肿瘤的荷尔蒙雌激素和黄体酮受体表达基础上进一步评价了 H460-16-2表达，所述受体在乳腺癌的发展、治疗和预测方面发挥重 要作用。H460-16-2抗原表达和雌激素受体或黄体酮受体表达之间没 有明显的关联。在肿瘤分期或进展程度的基础上对肿瘤进行分析，也 没有发现H460-16-2抗原表达和雌激素受体或黄体酮受体表达之间的 明显关联。BU75获得了同样的结果。与c-erbB-2比较，H460-16-2显 示了完全不同的染色结果，其中52 %的乳腺肿瘤组织样品对 H460-16-2抗原是阳性而对Her2表达是阴性，这意味着依然不满足乳 腺癌患者的靶向治疗需求。而对H460-16-2和Her2都呈阳性的乳腺肿 瘤组织切片之间的染色强度也存在差别。c-erbB- 2抗体也阳性染色一 种正常乳腺组织切片。为了进一步扩展H460-16-2潜在的治疗受益， 事先检测了抗原在多种人类肿瘤组织中的频率和定位，并与克隆L178 进行了比较(S.N. 10/647,818)。这些肿瘤类型的多数也是对L178抗原 呈阳性。对于人类乳腺肿瘤组织，H460-16-2和L178的定位发生在肿 瘤细胞膜上。然而，L 178比H460-16-2抗体具有显著多的细胞膜定位。 而且，对于同时被H460-16-2和L178染色的肿瘤类型，43%的组织显 示出对L178抗体更高强度的染色水平。通过与文献中IHC数据的比较，表明没有正确匹配本文提供的 IHC数据的CD44型。CD44标准型正常表达于人脑，而H460-16-2抗 原不是。直接抵抗pan-CD44亚型的抗体对肝（包括Kupper细胞）不 染色，对处于生殖周期所有阶段的子宫内膜腺体染色结果为阳性。 H460-16-2抗原清楚展示于Kupper细胞上，并只展示于生殖周期中的 分泌性子宫内膜腺体上。H460-16-2抗原清楚展示于组织巨噬细胞上， 并且只有V4/5和V8/9变型表现出偶然的巨噬细胞染色。与抗CD44 L178和现在的BU75相比，H460-16-2具有相似而又特殊的结合才莫式， 这表明H460-16-2抗原是独特的CD44抗原表位。正如以前所描述的（S.N. 10/647,818),附加的生化^t据也表明 H460-16-2识别的抗原是CD44的一种亚型。这一点得到了其他研究的支持，所述研究表明对CD44有反应活性的单克隆抗体（L178)识别 那些通过免疫沉淀与H460-16-2结合的蛋白质。Western杂交研究也表 明了 H460-16-2识别的CD44表位抗原不展示在v6或v10上。 H460-16-2抗原表位还在于它是碳水化合物以及构象依赖的，而许多 抗CD44抗体是直接抵抗CD44肽部分的。这些IHC和生化结果证明 了 H460-16-2结合于CD44抗原变型。因此，优势证据表明了 H460-16-2 通过展示于CD44变型上的独特的碳水化合物依赖性构象表位的连接 作用来介导抗癌作用。基于本发明的目的，所述表位被定义为"CD44 抗原性残基"，其特征是它与杂交瘤细胞系编码的单克隆抗体及其抗原 结合片段或抗体交联物的结合能力。为进一步说明H460-16-2的抗癌作用^L制，进^f亍了透明质酸(HA) 结合实验。经测定，要产生MDA-MB-231细胞对HA的50%的粘附 力，需要H460-16-2的平均浓度为1.87 (+/-1.01) jug/mL。这些结果表 明H460-16-2与CD44上负责结合HA的区域相互作用（至少部分作 用），因此可以说明其抗癌作用，通过ECM途径的血管生成或肿瘤侵: 袭力的下调。除了 HA结合实验之外，进行了细胞周期实验来确定 H460-16-2在体内或体外抗癌作用是否归因于细胞循环的调节。20 pg/mL的H460-16-2, 24小时，MDA-MB-231凋亡细胞的数量比同种 型对照增加了。这一作用也表现出剂量依赖性。因此，H460-16-2的 效力也全部或部分归因于其凋亡诱导能力。总体上，本文证明了 H460-16-2抗原是癌症相关抗原，表达于人 类，并且是病理学相关的癌症靶点。而且，本文也证明了 H460-16-2 抗体对人类肿瘤组织的结合，并能适当用于诊断实验、预防性治疗或 预测。另外，该抗原的细胞膜定位指示了细胞的癌症状态，因为该抗 原在多数非癌细胞中缺少表达，而且这一发现使该抗原、其基因或衍 生物、其蛋白质或其变型能够用于诊断实验、预防性治疗或预测。其他涉及抗CD44抗体应用的研究存在治疗潜力的限制，而 H460-16-2没有表现出这些限制。H460-16-2在体内和体外都显示了抗 肺瘤活性。以前提到过的抗体，如MAKtable see original document page 29

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缩写：SMF:平滑肌纤维，NR:切片不是代表性的实施例3人乳腺癌组织染色先前进行了 IHC研究，来确定H460-16-2抗原和人乳腺癌的关联， 以及H460-16-2是否可能识别人类肿瘤（S.N.10/603,000),并通过与 L178的抗CD44染色比较来确定它如何识别人类肿瘤（S.N. 10/647,818)。目前，比较了 BU75抗CD44染色、c-erbB-2抗Her2和 一种輩巴向黑曲霉素葡萄糖氧化酶（ 一种哺乳动物组织中不存在也不可 诱导的酶）的抗体（阴性对照）。使用了来源于50个乳腺癌患者的乳 腺癌组织阵列和来源于乳腺癌患者体内非新生乳腺组织的10个样品 (Imgenex Corporation, San Diego, CA)。为每例患者给出如下信息：年 龄、性别、美国癌症联合会（AJCC)的肿瘤分期、淋巴结、雌激素受 体（ER)、孕激素受体（PR)的状态。IHC的程序在实施例5说明。 所有的抗体的使用都是工作浓度为5/ig/mL,除了抗Her2在1.5 /ig/mL 的浓度下使用。表2和表3分别提供了 H460-16-2和BU75抗CD44抗体对乳腺 癌组织阵列染色的汇总。每个阵列包括来源于50例个体患者的胂瘤样 品。总之，50例受试患者中有62%对H460-16-2抗原呈阳性，而73 %对BU75抗CD44呈阳性。在H460-16-2和BU75抗CD44对相同组织进行染色的情况下，有45%的样品的BU75抗CD44染色强度比 H460-16-2高。对于H460-16-2和BU75抗原来说，来源于乳腺癌患者 的10个正常乳腺组织样品中分别有4和8个呈阳性。没有证明雌激素 和孕激素受体状态之间明显的相关性。也没有呈现这样的趋势： H460-16-2和处于更高肿瘤分期的CD44抗原有更高的阳性表达。表2:人乳腺癌IHC汇总(H460隱16隱2 )

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表3:人乳腺癌IHC汇总(抗CD44 (BU75)) table see original document page 33

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如图2显示的，与正常细胞相比，H460-16-2染色对肿瘤细胞具 有特异性，其中基质细胞明显呈阴性，而癌细胞呈高度阳性。使用 H460-16-2抗原观察到的细胞定位模式为多数情况下集中于细胞膜。 BU75CD44抗体染色了更多的乳腺癌样品，与H460-16-2比较，显示 出细胞膜比细胞质更高程度的定位（表4)。 BU75抗CD44还对佩吉 特疾病的癌细胞进行了染色，而H460-16-2则没有（图3)。对H460-16-2 染色呈阳性的乳腺癌患者正常组织样品也对BU75抗CD44染色呈阳 性。在与c-erbB-2的比较中，H460-16-2呈现出完全不同的染色结果， 31个乳腺癌组织样品中对H460-16-2抗原呈阳性的16个样品对Her2 表达呈阴性，这表明依然未满足乳腺癌患者对靶向治疗的需求（表5、 图4)。对H460-16-2和Her2都呈阳性的乳腺癌组织切片之间还存在 染色强度的差别； 一些乳腺癌组织切片对H460-16-2呈高度阳性而对 Her2只呈中度阳性，而另外一些正好相反（即对Her2呈高度阳性而 对H460-16-2呈中度阳性），这说明H460-16-2将治疗性的靶向不同的 乳腺癌患者队列。c-erbB-2抗体也对一种正常乳腺组织切片的染色呈 阳性。这些结果表明针对H460-16-2的抗原可以被近三分之二的乳腺癌 患者所表达。另夕卜，多数适合于H460-16-2治疗的人将不适合于抗Her2 的治疗。患者样品中的染色模式表明：抗体对肿瘤细胞的高度特异性， 并且H460-16-2抗原被定位于细胞膜而使其成为具有吸引力的药用靶 点。H460-16-2染色与BU75抗CD44相似但更具限制性，这再次表明H460-16-2抗原表位有可能是更加受限制的CD44变型。表4: BU75抗CD44和H460-16-2对人类肿瘤和正常乳腺组织的 IHC比较table see original document page 35

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表5: c-erbB-2抗Her2和H460-16-2对人类肿瘤和正常乳腺组织 的IHC比较table see original document page 39

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实施例4已建立的体内PC-3化疗结合肿瘤实验参考图5和6， 6-8周的雄性SCID小鼠于颈背部皮下注射IOO微 升含1百万PC-3人前列腺癌细胞的生理盐水。通过测径器每周测量肺 瘤生长。在植入后21天，当队列中大部分的肺瘤体积达到80mm3(范围50-130 mm3)时，8只小鼠净皮随才几分入4个治疗组中。腹腔注入 H460-16-2抗体、化学疗剂顺柏、H460-16-2抗体加顺柏、或对照緩冲 液，其中抗体和顺铂的给药量分别为15和6 mg/kg，给药体积为300 微升，是由贮存标准品经稀释液（含有2.7 mM KC1, 1 mM KH2P04, 137mMNaCl和20mMNa2HPO4)稀释而成。第一周，H460-16-2或 对照緩冲液每周注射4次；接下来以同样方式每周3次共11个剂量， 直至植入后41天。顺粕于抗体治疗期的第0、 5、 10和15天注射。测 径器每7天测量一次肿瘤生长，直至植入后48天或直至个体动物达到 CCAC (加拿大动物护理委员会）规定的终点。在研究的持续过程中 记录动物的体重。在研究结束时，所有的动物都根据CCAC指南进行 安乐死。使用配对T检验，发现顺铂治疗或H460-16-2加顺铂的联合治疗 降低了植入后的胂瘤负担（图5)。在植入后的第48天（治疗后7天）， 顺铂和H460-16-2联合治疗比在治疗后短期内抑制肿瘤生长方面比緩 冲液对照(pO細l)、顺柏单独治疗(p = 0.004)或H460-16-2单独 治疗（p<0.0001 )明显更加有效。PC-3是前列腺癌的一种恶病质模型，其中在PC-3前列腺癌异种 移植模型中肿瘤负担的增加和疾病进展伴随着体重的减少。如图6显 示的平均体重，所有组的小鼠都经历了严重的体重下降。在本研究中， 所有组的小鼠在治疗结束时体重下降了约23-35%。 H460-16-2治疗组 表现出最小程度的体重下降（21.7% )。在治疗后短期内，H460-16-2 加顺铂联合治疗与緩冲液对照相比没有额外明显的体重下降 (p=0.5042)。因此，在公认的人乳腺癌疾病模型中，与緩沖液对照相 比，H460-16-2加顺铂降^f氐了肿瘤负担。这些结果表明了该抗体在哺 乳动物（包括人）癌症治疗中的药理和药剂受益。实施例5透明脂酸酶(H A)结合实验MDA-MB-231细胞（之前通过FAC分析表现为表达H460-16-2 抗原（CD44))经过如下步骤被离解：从组织培养亚中吸走废弃培养液，PBS洗涤培养皿，于每个平皿加入5mL裂解緩沖液，平皿置37。C 培养，直至细胞离解。然后，细胞经计数后被收集入50mL试管。细 胞于1200rpm下旋转离心5分钟，细胞悬浮于培养液中形成1-5百万 细胞/mL。每一个深度为2mL的板孔中加入上述细胞溶液lmL。 1200rpm旋转孔板5分钟来沉淀细胞，翻转孔板于纸巾上来去除上清 液。轻轻涡旋振荡深孔板来离散细胞沉淀。每个孔中加入lmL H460-16-2、 BU75(阳性对照，BIOCAN Scientific Inc., Mississauga, ON) 或同种型阴性对照（107.3， BD Biosciences, Oakville， ON)抗体，然后温 和涡旋振荡混合。然后孔板于37。C培养2小时。同时，通过将300^1/ 孔的HA储备液（4 mg/mL)于37。C下培养1-2小时，48孔的孔板被 HA包^皮。培养后，吸除多余的HA，孔板于层流通风厨中完全风干。 抗体孔培养结束后，细胞再次经过1200rpm离心沉淀5分钟。倒置深 孔于纸巾上来去除上清液。深孔再次经涡旋振荡以离散细胞沉淀，随 后于每个孔中加入1.2 mL的2jhM 4丐黄绿素PBS溶液（含有MgCl2 和CaCl2)。悬浮细胞，转移悬浮液（250 jid/孔）至HA包被的孔板。 然后将HA包被孔板于37。C下培养2小时，使发生粘附。培养后，通 过抽吸去除未附着的细胞。用含有MgCl2和CaCl2的PBS溶液洗涤每 个孑L 2-3次，以去除任何未附着的细胞或细胞团。孔板于Perkin-Elmer HTS7000荧光读板机中读板，在Microsoft Excel中分析数据，结果列 于表6或图7。 6次单独实验的平均结果表明：要使MDA-MB-231细 胞与HA的结合减少50% ,需要平均1.87 (+/- 1.01) jtig/mL的H460-16-2 (表6 )。 H460-16-2对MDA-MB-231细胞和HA的结合的影响是剂量 依赖性的；20/ig/mL的H460-16-2使细胞与HA的结合减少了 60%(图 7)。这些结果表明H460-16-2与CD44上负责结合HA的区域相互作 用（至少是部分的相互作用），vt人而可以解释其通过ECM下调血管发 生或肿瘤侵袭力的抗癌作用。表6: H460-16-2对MDA-MB-231细胞与HA结合的影响总结table see original document page 45

2 0.993 2.564 0.70 1.876 1.06平均 1.87标准偏差 1.01实施例6 细胞周期实验通过FACS分析来评价H460-16-2对MDA-MB-231乳腺癌细胞的 细胞周期的影响。将H460-16-2抗体(O、 0.2、 2.0和20]tig/mL)或同种 型对照（克隆107.3, BD Biosciences, Oakville， ON)与MDA-MB-231乳 腺癌细胞一起培养24、 48和72小时。用多典化丙啶对处理过和未处理 过的细胞进行染色，然后用流式细胞计数仪分析单细胞，来评价相对 DNA含量。使用BDCellQuest对需要的数据组进行分析，通过门控单 细胞数量和显示亚二倍体染色的细胞。经过分析，用H460-16-2处理 了 24小时的细胞显示出分裂细胞百分比的整体下降以及剂量依赖型 的Gi期细胞群增加。出现于Gi期细胞群的细胞是那些由于细胞膜丧 失完整性而失去了 DNA的细胞，它可以代表细胞凋亡细胞群（图8)。 这一数据i兌明了 H460-16-2对MDA-MB -231细胞分裂周期具有影响， 而这种影响导致了 一种剂量依赖型的凋亡细胞数目的增加。优势证据表明：H460-16-2通过CD44变型表面展示的依赖碳水化 合物的构象表位的连接作用介导了抗癌作用，并且该表位至少部分参 与CD44与HA的结合。还有i正据表明H460-16-2与该表位的结合能够导致相应细胞的凋 亡。S.N. 10/713,451中已经表明，H460-16-2抗体能够用于免疫沉淀来 自MDA-MB-231等表达细胞的同源性抗原。而且，这还表明H460-16-2 抗体能够用于4企测那些表达CD44抗原性残基（与H460-16-2抗体特 异性结合）的细胞和/或组织，通过利用（但不限于）FACS、细胞ELISA或IHC说明的技术。因此，可以表明，利用FACS、细胞ELISA或IHC实验，免疫沉 淀的H460-16-2抗原能够抑制H460-16-2与这类细胞或组织的结合。 而且，如同H460-16-2抗体一样，其他抗CD44抗体也能够用于免疫 沉淀及分离其他类型的CD44抗原，利用相同类型的实验，这些抗原 也能够用于抑制那些抗体与表达这些抗原的细胞或组织的结合。还可 以表明，如果一种识别所有类型CD44的抗CD44抗体（即一种全CD44 抗体）被用于分离其同源抗原，那么所分离的抗原也能够抑制 H460-16-2抗原与表达该抗原的细胞或组织的结合，因此也证明了 H460-16-2与表达该抗原的细胞和组织上的CD44表位的结合。可选 的，H460-16-2和全CD44在一些实验（如竟争性实验ELISA、细胞 ELISA、 FACS或类似实验）中同时出现，两者的比较也能证明 H460-16-2与表达该抗原的细胞或组织上的CD44抗原表位的结合。领域的技术人员的水平。所有专利和出版物都以参考资料的方式并入 本文，其引用程度如同每个出版物被特别单独指明以参考资料的方式 并入本文。需要理解：尽管本发明以某一方式被说明，这不是要将本发明限 制在本文所描述或显示的特定形式或部分安排。对现有技术人员来说 显而易见的是：在不偏离本发明范围的情况下可以做出不同的变化， 不能认为本发明局限于本说明书所显示和描述的内容。 一个现有技术 人员将容易理解：适当调整本发明来实现目的并获得所提到的及其固 有的结果和优点。本文描述的任何寡核苷酸、肽、多肽、生物学相关 化合物、方法、程序和技术都是目前代表性的优选实施方式，目的是 可效仿实现而不是对范围的限制。对现有技术人员来说一些变化和其的范围所限定。尽管本发明以特定的优选实施方式被描述，但是应该中。实际上，为实施本发明所描述的方式的各种对现有技术人员来说 是显而易见的修改都要在权利要求的保护范围之内。

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双重靶定抗体及其用途-专利编号CN102428104B	2020-05-12	419
抗IgSF4抗体及其利用-专利编号CN101137671A	2020-05-12	580
针对人CD22抗体的抗独特型抗体及其应用-专利编号CN103588882A	2020-05-13	196
一种抗CTLA-4嵌合抗体-专利编号CN102134276A	2020-05-11	852
抗PD－1抗体及其用途-专利编号CN1753912A	2020-05-12	1014
新型EGFRVIII抗体和包含所述抗体的组合物-专利编号CN107108735A	2020-05-11	323
一种稳定的抗体制剂-专利编号CN106620690A	2020-05-13	510
针对人CD22抗体的抗独特型抗体及其应用-专利编号CN103588882B	2020-05-13	886
全人TNFα-Fab抗体及其PEG化抗体-专利编号CN102336834A	2020-05-11	1074
全人TNFα-Fab抗体及其PEG化抗体-专利编号CN102336834B	2020-05-11	703