磷是人类营养的必要元素，并且在机体生物化学、细胞完整性和生理 过程中起必要的结构和功能作用。在包含动物或植物性物质的食物中，可 发现磷作为无机磷酸盐(Pi)(例如，以其五价形式与氧结合作为磷酸盐 (PO43-))，所述无机磷酸盐可容易地从胃肠道被吸收。还可发现磷酸盐作 为生物大分子如蛋白质、核酸、脂类和糖类的组分。植物材料也可富含植 酸(C6H6[OPO(OH)2]6)，所述植酸是许多植物组织(例如，麸和种子)中 磷酸盐的主要储存形式(植酸磷酸盐(phytic phosphate))，占植物中磷酸 盐的70％至80％。植酸或其盐(植酸盐)一般不能被单胃动物吸收，并且 将随粪便排泄。植酸/植酸盐可占成体每日膳食磷酸盐摄入的大约25％。
磷酸盐是骨矿物质的必要组分，因为成体磷酸盐的大约85％在矿化的 胞外基质(如骨和牙齿)中。大约15％的磷酸盐是细胞内的(例如，在软 组织中)，而约0.1％发现于细胞外液(Tenenhouse等，Vitamin D(维生素 D)，第2版，Elsevier，2005)。还可发现细胞磷酸盐为构成细胞膜结构的 磷脂形式。磷酸盐也是核酸(如DNA和RNA)以及核苷酸(如腺苷三磷 酸(ATP)和环腺苷酸)的必要结构组分，腺苷三磷酸(ATP)是重要的 能量储存和转移分子，环腺苷酸是重要的细胞信号分子。细胞内磷酸盐的 其他生理功能包括下述：(1)磷酸化许多蛋白酶、激素和细胞信号分子， 以使它们活化；(2)作为生理缓冲剂保持正常的酸-碱平衡；和(3)在红 细胞中包含含有磷酸盐的分子2，3-二磷酸甘油酸酯 (2，3-diphosphoglycerate，2，3-DPG)。普通人含有约700至1,000克磷(Lau K.，Phosphate Disorders.(磷酸盐病症)Saunders；1986：398-470)，并且每天 以PO43-的形式消耗和排泄约一克至约三克磷。
人类通过至少三条途径保持磷酸盐体内平衡(phosphate homeostasis) -胃肠道、肾和骨。胃肠道作为磷酸盐吸收和排泄/再吸收的器官参与磷酸 盐体内平衡。骨作为磷酸盐的储库，所述磷酸盐可响应于各种生理信号而 被动员。膳食磷酸盐的胃肠吸收是非常高效的，主要吸收部位是十二指肠 和空肠(Delmez JA等，Am J Kidney Dis，1992，19：303-317)。可变量的膳 食磷酸盐(摄食量的10％至80％)被排泄在粪便中，依赖于饮食是植物来 源(大多不能利用的磷酸盐)还是动物组织来源(大多可消化的)。食物 中的无机磷酸盐以两种方式被吸收，经由刷状缘膜的主动跨细胞途径和经 由细胞间紧密连接的被动细胞旁路途径(paracellular route)(Cross等，Miner Electrolyte Metab 1990，16：115-124，和Walton J等，Clin Sci 1979， 56：407-412)。基于大鼠研究的一些报道指出，结肠的磷酸盐转运主要是通 过细胞旁路扩散途径介导的(Hu等，Miner Electrolyte Metab，1997，23：7-12； 和Peters等，Res Exp Med(Berl)，1988，188：139-149)。基于大鼠研究的其 他报道提出，跨细胞主动转运是跨小肠磷酸盐吸收的主要途径(Eto等， Drug Metab Pharmacokinet，2006，21：217-221)。
肾作为磷酸盐滤过、重吸收和排泄的器官参与磷酸盐体内平衡。肾是 保持磷酸盐体内平衡的主要调节器官。在健康成体个体中，每日肾的磷酸 盐排泄等于每日胃肠磷酸盐吸收的量。然而，在磷酸盐缺乏的状态，肾减 少尿的磷酸盐排泄到几乎为零(Knox F等，Am.J.Physiol.1977， 233：F261-F268)。肾的磷酸盐重吸收主要发生在近端小管。磷酸盐的尿排 泄分数可在0.1％至20％之间变化，因此代表了有力的平衡机制。在严重肾 衰竭中(如由慢性肾病引起的肾衰竭)，由于不完全的肾磷酸盐清除而发 生高磷酸盐血症(hyperphosphatemia)。
磷酸盐体内平衡的主要调节因子是血清磷酸盐和甲状旁腺素(PTH)。 增加的血清磷酸盐水平增强了磷酸盐的尿排泄。PTH减少了肾小管磷酸盐 的重吸收，并且增加了可溶性磷酸盐向尿中的排泄。影响磷酸盐体内平衡 的其他因子包括但不限于，年龄、饮食(即摄食的磷酸盐量和/或摄食的磷 酸盐的化学形式)、疾病、药剂和昼夜变异。
维生素D，特别是其活性形式1，25-二羟基维生素D(也称为钙三醇)， 也可通过直接刺激磷酸盐的肠吸收来影响磷酸盐体内平衡。此外，维生素 D通过动员钙和磷酸盐到血浆来增强骨的再吸收(Albaaj F & HutchisonA， Drugs 2003，63：577-596)。
异常磷酸盐体内平衡的实例是高磷酸盐血症，其可通过下述三种机制 的一种或多种而发生。第一种机制是过量的磷酸盐吸收。第二种机制是减 少的磷酸盐排泄。第三种机制是磷酸盐从胞内间隙向胞外间隙的移动。严 重的高磷酸盐血症可引起瘫痪、惊厥和心脏骤停。在血清磷酸盐浓度高于 5mg/dl时发生高磷酸盐血症，其与增加的死亡危险相关(Block G等，J.Am. Soc.Nephrol.2004，15：2208-2218)。正常的生理血清磷酸盐浓度一般认为是 在约2.4mg/dl至约4.5mg/dl之间的血清磷酸盐浓度(Block G & Port F，Am. J.Kidney Dis.2000，35：1226-1237)。
肾功能受损的患者由于肾减少的磷酸盐排泄可发展高磷酸盐血症。当 到肾的维管联结(vascular supply)变得减少或当肾小球变得受损并停止从血 液中滤过磷酸盐时，高磷酸盐血症接着发生。因此，高磷酸盐血症是肾病 的可预测结果，并且大多数肾病患者患有或者将发展高磷酸盐血症。所述 肾病的实例包括但不限于，终末期肾病、急性肾衰竭、慢性肾衰竭、多囊 肾病、慢性肾病、急性肾小管坏死(例如，肾动脉狭窄)、使肾功能衰退 的感染(例如，败血症或肾感染如急性肾盂肾炎)、肾移植排斥和尿路梗 阻。
与慢性肾病相关的高磷酸盐血症导致钙和磷酸盐体内平衡的严重病 理生理，特别是长时间存在时。所述病理生理包括但不限于，甲状旁腺功 能亢进、骨疾病(例如，肾性骨营养不良)和关节、肺、眼和维管结构的 钙化。患有慢性肾病患者的高磷酸盐血症独立地与死亡危险相关，并且高 磷酸盐血症增加死亡危险的确切机制是未知的。对表现肾功能不全的个 体，在正常范围内血清磷酸盐的升高与肾衰竭的渐进和增加的心血管事件 危险相关。美国国家肾脏基金会的肾病结果质量初步调查临床实践指南 (The National Kidney Foundation Kidney Disease Outcomes Quality Initiative Clinical Practice Guidelines)针对骨代谢和慢性肾病疾病推荐，保 持血清磷酸盐低于5.5mg/dl、钙-磷酸盐(Ca X P)产物少于55mg2/dl2， 以及全段甲状旁腺素(iPTH)在150pg/ml和300pg/ml之间。尽管没有完 全说明病因，认为高钙-磷酸盐产物对软组织钙化和心血管疾病负有责任。 在几乎半数的所有透析患者中，心血管疾病是死亡的原因。
许多肾病患者需要服用活性形式的维生素D，如1α，25-二羟基维生素 D3，来保持钙体内平衡和/或来治疗或预防低血钙和/或继发性甲状旁腺功 能亢进，因为这些患者缺乏活性维生素D。维生素D3首先在肝中代谢为 25-羟基维生素D3(也称为钙二醇)，并且随后在肾中代谢为1α，25-二羟基 维生素D3。1α，25-二羟基维生素D3远比25-羟基维生素D3更有活性。功能 受损的肾不能将25-羟基维生素D3转变为1α，25-二羟基维生素D3。低1α，25- 二羟基维生素D3水平刺激甲状旁腺分泌更多的PTH，并且甲状旁腺增生 和继发性甲状旁腺功能亢进接着发生。患有慢性肾病个体的继发性甲状旁 腺功能亢进的标准治疗包括活性维生素D或其类似物。同样地，大约70％ 的患有终末期肾病或衰竭的个体接受某种形式的维生素D。如上文讨论， 维生素D刺激磷酸盐的肠吸收。因此，服用维生素D(如1α，25-二羟基维 生素D3)的肾病患者更易患高磷酸盐血症，并且由于增加的磷酸盐吸收和 伴随的减少的磷酸盐排泄的结合，也能使他们现有的高磷酸盐血症加重。
降低血清磷酸盐水平的治疗性努力包括但不限于，透析、膳食磷酸盐 摄入的减少、施用烟酰胺和口服施用不溶性磷酸盐结合剂。不溶性磷酸盐 结合剂的实例包括但不限于，铝化合物(例如，氢氧化铝凝胶)、 钙化合物(例如，碳酸钙、乙酸盐如乙酸钙片剂、柠檬酸盐、藻 酸盐和酮酸盐)、阴离子交换聚合物(例如，美国专利第5,985,938、 5,980,881、6,180,094、6,423,754号和PCT公布WO 95/05184所述的胺官 能聚合物，氯化物形式的阴离子交换树脂，和结合盐 酸胍的聚合物)、无机化合物如四水合碳酸镧(FosrenalTM)、柠檬酸和乙酸 的铁盐和基于镧的多孔陶瓷材料(RenaZorbTM)。
发明概述
一方面，本发明涉及一种用于在人类或非人类动物受治疗者中减少磷 酸盐吸收的方法，其中所述受治疗者食用含有植酸或植酸盐的饮食，并且 患有高磷酸盐血症或者处于发展高磷酸盐血症的危险。所述方法包括以有 效降低或保持所述受治疗者的血清磷酸盐浓度的量将抗肠碱性磷酸酶抗 体口服施用至所述受治疗者的步骤。所述方法可进一步包括观察血清磷酸 盐浓度的下降或稳定的步骤。例如，可测定并比较抗体处理之前和之后的 血清磷酸盐浓度。
本文公开的方法可用来减弱或预防高磷酸盐血症。在一些实施方案 中，血清磷酸盐浓度被降低到或保持在下述水平或低于下述水平：在可接 受正常范围内最大生理血清磷酸盐浓度的约150％、125％、120％、115％、 110％或105％。在一些实施方案中，血清磷酸盐浓度被降低到或保持在正 常范围内的水平。对人类受治疗者，最大的高-正常血清磷酸盐浓度是5.0 mg/dl。在一个优选实施方案中，人类受治疗者的血清磷酸盐浓度被降低到 或保持在5.5mg/dl或更低或5.0mg/dl或更低。
在一些实施方案中，所述受治疗者(例如，人类受治疗者)患有肾病、 接受维生素D化合物(例如，1α，25-二羟基维生素D3)、或两者，其中所 述维生素D化合物使饮食中的植酸磷酸盐可被吸收。在一些实施方案中， 所述受治疗者是人类肾病患者，所述患者服用维生素D化合物(例如， 1α，25-二羟基维生素D3)，并具有高于5.0mg/dl或5.5mg/dl的血清磷酸盐 水平。肾病的实例包括终末期肾病、急性肾衰竭、多囊肾病、慢性肾病、 急性肾小管坏死、使肾功能衰退的感染(例如，败血症或肾感染如急性肾 盂肾炎)、肾移植排斥或尿路梗阻。
在一些实施方案中，所述方法中采用的抗体是IgY抗体。在一些实施 方案中，所述抗体来自卵(例如，卵黄)，特别来自禽类的卵(如鸡卵)。
在一些实施方案中，所述抗体是结合到由SEQ ID NO：1定义的人类肠 碱性磷酸酶的下述氨基酸内的表位的抗体：氨基酸72-79、氨基酸83-90、 氨基酸123-130、氨基酸181-188、氨基酸226-233、氨基酸260-267、氨基 酸271-278、氨基酸312-319、氨基酸363-370、氨基酸383-390或氨基酸 446-453。
在一些实施方案中，所述抗肠碱性磷酸酶抗体与磷酸盐结合剂同时施 用。在一些实施方案中，所述抗肠碱性磷酸酶抗体随食物一起施用或接近 食用具有诸如植酸磷酸盐的膳食磷酸盐的食物的时间(即在之前或之后约 一小时内)施用。
附图简述
图1显示人类肠碱性磷酸酶(SEQ ID NO：1)和用来产生抗体的片段 (加圈的肽)的氨基酸序列。阴影的氨基酸表示在人类、小鼠、大鼠、狗、 牛和鸡之间保守的氨基酸(在N-和C-末端没有同一性，因为狗的序列缺 少这些部分)。更小的字体表示在鸡中不保守的氨基酸。加下划线的氨基 酸表示基于晶体结构在表面或重要的氨基酸。*表示糖基化位点。
图2显示在体外抗肠碱性磷酸酶抗体阻抑了肠碱性磷酸酶的活性。图 A-I分别显示用肽1、5、6、28、3、9、10、25和29产生的抗肠碱性磷酸 酶抗体对Caco-2细胞的肠碱性磷酸酶活性的影响。图J和K分别显示在 注射肽5和6之前获得的卵黄抗体对Caco-2细胞的肠碱性磷酸酶活性的影 响。图G、H和I的反应在pH＝9下进行，而所有其他图的反应在pH＝7.4 下进行。x轴表示抗体的稀释度，而y轴表示如实施例2所述的OD405的 增加。图A和B中的L-PHE(L-苯丙氨酸，5mM)是已知的肠碱性磷酸 酶的抑制剂，并用作对照。
图3显示用各种抗肠碱性磷酸酶抗体作探针的Caco-2细胞肠碱性磷酸 酶的蛋白质印迹。分子量显示在蛋白质印迹图像的左侧。“Ref”表示商品 化抗人类肠碱性磷酸酶抗体。“Ab#”表示使用如表1提供的特定肠碱性磷 酸酶肽产生的抗体。“Pre#”表示在注射特定肽之前获得的卵黄抗体。
发明详述
本发明部分基于本发明人的下述观察：抗肠碱性磷酸酶抗体可通过减 少吸收到动物血池的植酸磷的量来降低血液磷酸盐水平。具体地说，在其 中当用含有植酸磷酸盐但缺乏容易吸收的无机磷酸盐的饮食喂养时动物 具有降低的血液磷酸盐水平、并且用维生素D补充所述饮食增加了降低的 血液磷酸盐水平的动物模型中，本发明人观察到将抗肠碱性磷酸酶抗体施 用至所述动物降低了由维生素D引起的增加的血液磷酸盐水平。本发明提 供了用于在人类和非人类动物受治疗者(如肾病患者)中减少磷酸盐吸收 的新手段(tool)，所述受治疗者食用含有植酸或植酸盐的饮食并需要服用 维生素D化合物(例如，1α，25-二羟基维生素D3)以保持钙体内平衡或其 他目的，其中所述维生素D化合物使饮食中的植酸磷酸盐可被吸收。
本文公开的本发明人的研究证明抗肠碱性磷酸酶抗体在降低由维生 素D增加的血液磷酸盐水平上是有效的，尽管现有技术有一些表明相反的 证据。首先，现有技术提出不依赖于肠碱性磷酸酶的机制是维生素D(1α，25- 二羟基维生素D3)增加血液磷酸盐水平的原因，因为添加维生素D到无 机磷酸盐缺乏的饮食增加了诸如大鼠的动物和诸如鸡的动物中血液磷酸 盐的水平，所述诸如大鼠的动物中维生素D增加了肠碱性磷酸酶的活性， 所述诸如鸡的动物中维生素D对肠碱性磷酸酶的活性没有影响(Biehl和 Baker，J Nutr 1997，127：2054-2059；和Pileggi等，Arch.Biochem.Biophys. 1995，58：194-204)。其次，肠碱性磷酸酶与肠刷状缘膜结合(Nakano等， Arch Histol Cytol 2001，64：483-491)。现有技术提出在体内抗肠碱性磷酸酶 抗体不能有效阻抑肠碱性磷酸酶的活性，因为为了保护黏膜表面不被肠腔 内的蛋白水解酶降解，肠刷状缘膜由只有低分子量溶质可透过而大的高分 子(例如，抗体/蛋白质)不可透过的黏液层覆盖(Atuma等，Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2001，280：922；和M.Mantle和A.Allen，1989， Gastrointestinal mucus(胃肠黏液)，在Gastrointestinal Secretions(胃肠分泌) 的第202-229页，J.S.Davison，编辑，Butterworth and Co.，Great Britain)。 此外，不确定口服施用的特定抗体是否能在胃的酸性环境中存活并保持活 性。尽管有上述相反的现有技术的证据，本发明人在此显示，可使用抗肠 碱性磷酸酶抗体来降低由维生素D增加的血液磷酸盐水平。不意图被理论 所限，本发明人相信抗肠碱性磷酸酶抗体通过结合到肠碱性磷酸酶以干扰 酶和其底物(植酸/植酸盐)之间的相互作用来减少磷酸盐的吸收，所述酶 和底物之间的相互作用否则将催化磷酸盐的释放。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有如本发明所属领 域普通技术人员所普遍理解的相同含义。尽管在实践或试验本发明中可使 用与本文所述的那些相似或相同的任何方法和材料，现描述优选的方法和 材料。
在描述实施方案和要求保护本发明时，根据下文提出的定义使用下述 术语。
如本文所用，“抗体”包括对特定抗原免疫反应性的免疫球蛋白分子， 并且包括多克隆和单克隆抗体。该术语还包括遗传改造形式如嵌合抗体 (例如，人源化鼠抗体)和异源偶联抗体(heteroconjugate antibody)(例如， 双特异性抗体)。该术语还包括二价或双特异性分子、双抗体(diabody)、三 链抗体(triabody)和四链抗体(tetrabody)。二价和双特异性分子描述于，例如， Kostelny等，J Immunol 1992，148：1547；Pack和Pluckthun，Biochemistry 1992， 31：1579；Zhu等，Protein Sci 1997，6：781；Hu等，Cancer Res.1996，56：3055； Adams等，Cancer Res.1993，53：4026；和McCartney等，Protein Eng.1995， 8：301。术语“抗体”还包括抗体的抗原结合形式，如具有抗原结合能力的 片段(例如，Fab′、F(ab′)2、Fab、Fv和rIgG)。该术语也指重组单链Fv片 段(scFv)。此外，术语“抗体”包括具有使抗体更稳定的共价连接于其上 的稳定基团的抗体。本发明可采用亲和力Kd为10-4M或更低的抗体。优 选地，采用亲和力Kd≤10-5M或≤10-6M的抗体。更优选地，采用亲和力 Kd≤10-7M、≤10-8M或≤10-9M的抗体。
如本文所用，术语“高磷酸盐血症”一般用来描述受治疗者中血清磷 酸盐以高于医学公认的正常范围的浓度存在的状态。
如本文所用，术语“减弱”或“预防”意指获得治疗性益处或预防性 益处。对于治疗性益处，我们意指被治疗的潜在病症的改善或根除。例如， 在患有高磷酸盐血症的受治疗者中，治疗性益处包括潜在高磷酸盐血症的 改善或根除。治疗性益处还包括与潜在病症相关的一种或多种病理生理症 状的改善或根除，以致在所述受治疗者中观察到改善，尽管受治疗者可能 仍然受该潜在病症所困扰。例如，在患有肾功能不全和/或高磷酸盐血症的 患者中，治疗性益处不仅指患者血清磷酸盐水平的降低，也指患者中关于 伴随肾衰竭和/或高磷酸盐血症的其他病症(如异位钙化和肾性骨营养不 良)的改善。对预防性益处，将根据本发明的抗体施用至处于发展高磷酸 盐血症危险的患者或施用至报告了一种或多种高磷酸盐血症病理生理症 状的患者(尽管可能没有作出高磷酸盐血症的诊断)。例如，根据本发明 的抗体可被施用至患有慢性肾病并且高磷酸盐血症未被诊断的患者。预防 性益处包括高磷酸盐血症的预防或延缓。
如本文所用，抗体的有效量是降低患有高磷酸盐血症的受治疗者的血 清磷酸盐、预防患有或处于患有高磷酸盐血症危险的受治疗者的血清磷酸 盐升高、或减少食物磷酸盐吸收(其可例如通过增加的粪便磷酸盐或通过 降低或稳定的血清磷酸盐水平来测定)的量。
如本文所用，“肾病”指影响肾功能的任何疾病或病症，包括那些导 致差的磷酸盐滤过的肾疾病，并且包括影响血液供给到肾的疾病，以及肾 的功能性和结构性缺陷。肾病的实例包括但不限于，终末期肾病、急性肾 衰竭、慢性肾衰竭、多囊肾病、慢性肾病(例如，如按美国国家肾脏基金 会的肾病结果质量初步调查临床实践指南分类的I、II、III、IV或V期慢 性肾病，其表现为肾功能不全以及后期的肾衰竭)、急性肾小管坏死(例 如，肾动脉狭窄)、使肾功能衰退的感染(例如，败血症或肾感染如急性 肾盂肾炎)、肾移植排斥和尿路梗阻。
如本文所用，术语“维生素D”一般指命名为维生素D2、维生素D3、 维生素D4等的有机化合物，以及指它们的代谢物和激素形式，其影响钙和 磷酸盐体内平衡。维生素D化合物的实例包括但不限于，维生素D2(麦 角钙化醇)、25-羟基维生素D2、1α，25-二羟基维生素D2、维生素D3(胆钙 化醇)、25-羟基维生素D3、1α，25-二羟基维生素D3、任何上述的类似物或 可基本上占据细胞内维生素D受体的类似物，以及描述于Bouillon等， Endocrine Reviews 1995，16：200-257的那些，其通过引用整体并入本文。维 生素D化合物还包括那些目前可商业获得或在临床试验中的那些，包括但 不限于：19-去甲-1α，25-二羟基维生素D2(帕立骨化醇，Paricalcitol)；1α- 羟基维生素D2(多西骨化醇，Doxercalciferol)；1α-羟基维生素D3(阿法 骨化醇，Alfacalcidol)；Leo Pharmaceutical的研究药物，包括EB 1089(西 奥骨化醇，Seocalcitol)、KH 1060(20-表-22-氧杂-24a，26a，27a-三同型-1α，25- 二羟基-D3(20-epi-22-oxa-24a，26a，27a-trihomo-1α，25-dihydroxy-D3))、MC 1288和MC 903(钙泊三醇，Calcipotriol)；罗氏制药(Roche Pharmaceutical) 的药物，包括1，25-二羟基-16-烯-D3、1，25-二羟基-16-烯-23-炔-D3和25-二 羟基-16-烯-23-炔-D3；Chugai Pharmaceuticals的22-氧杂钙三醇(22-氧杂 -1α，25-二羟基-D3)；University of Illinois(伊利诺伊大学)的1α-羟基-D5； Institute of Medical Chemistry-Schering AG(医学化学研究所-先灵制药)的 药物，包括ZK 161422和ZK 157202。
一方面，本发明涉及一种用于在人类或非人类动物受治疗者中减少磷 酸盐吸收的方法，其中所述受治疗者食用含有植酸或植酸盐的饮食，并且 患有高磷酸盐血症或者处于发展高磷酸盐血症的危险。所述方法包括以有 效降低或保持所述受治疗者的血清磷酸盐浓度的量将抗肠碱性磷酸酶抗 体口服施用至所述受治疗者的步骤。所述方法可进一步包括观察血清磷酸 盐浓度的下降或稳定的步骤。例如，可测定并比较抗体处理之前和之后的 血清磷酸盐浓度。
本文公开的方法可用来减弱或预防高磷酸盐血症。在一些实施方案 中，血清磷酸盐浓度被降低到或保持在下述水平或低于下述水平：在可接 受正常范围内最大生理血清磷酸盐浓度的约150％、125％、120％、115％、 110％或105％。在一些实施方案中，血清磷酸盐浓度被降低到或保持在正 常范围内的水平。对人类受治疗者，最大的高-正常血清磷酸盐浓度是5.0 mg/dl。在一个优选实施方案中，人类受治疗者的血清磷酸盐浓度被降低到 或保持在5.5mg/dl或更低或5.0mg/dl或更低。
处于发展高磷酸盐血症危险或已发展高磷酸盐血症的患者包括但不 限于具有下述的患者：由于过量摄入维生素D化合物的维生素D中毒；过 量磷酸盐摄入如过量使用含有磷酸盐的缓泻药或灌肠剂；肾疾病或肾功能 不全，如本文所述的急性或慢性的肾衰竭；原发性甲状旁腺机能减退；PTH 抵抗状况如肾小管抵抗PTH的综合征，包括各种类型的假甲状旁腺机能减 退(1a、1b、1c和2)或严重的低镁血症，其损害了PTH分泌并引起外周 PTH抵抗；和/或其中细胞内磷酸盐移动到胞外间隙的状态，如横纹肌溶解、 肿瘤溶解、胰岛素缺乏或急性酸中毒。
在一些实施方案中，本发明的方法应用于在患有肾病、接受维生素D 化合物(例如，1α，25-二羟基维生素D3)、或两者的人类或非人类受治疗者 中减少磷酸盐的吸收。
来自各个物种的肠碱性磷酸酶的氨基酸序列是已知的。例如，人类肠 碱性磷酸酶(SEQ ID NO：1)、小鼠肠碱性磷酸酶(SEQ ID NO：2)、大鼠I 型肠碱性磷酸酶(SEQ ID NO：3)和大鼠II型肠碱性磷酸酶(SEQ ID NO：4) 的氨基酸序列分别可以NCBI GenBank登录号AAA51703、AAA37873、 AAF36717和NP_073171找到。上文列出的不同肠碱性磷酸酶之间的同一 性百分比是高的(≥76.5％)。
在一些实施方案中，使用结合到下述肠碱性磷酸酶片段内的表位的抗 体来实践本发明：人类肠碱性磷酸酶(SEQ ID NO：1)的氨基酸72-79、83-90、 123-130、181-188、226-233、260-267、271-278、312-319、363-370、383-390 或446-453；小鼠肠碱性磷酸酶(SEQ ID NO：2)与上述人类肠碱性磷酸酶 片段对应的片段；大鼠I型肠碱性磷酸酶(SEQ ID NO：3)与上述人类肠 碱性磷酸酶片段对应的片段；或大鼠II型肠碱性磷酸酶(SEQ ID NO：4) 与上述人类肠碱性磷酸酶片段对应的片段。通过本领域普通技术人员熟悉 的任何比对程序可容易地鉴定对应片段。例如，可如Altschul等(Nucleic Acids Res.25，3389-3402，1997)所述使用缺口BLAST(Gapped BLAST)。 在NCBI网站有缺口BLAST。当使用缺口BLAST程序时，可使用程序的 默认参数。
在一个优选实施方案中，使用结合到下述人类肠碱性磷酸酶(SEQ ID NO：1)片段之一内的表位的抗体来实践本发明：氨基酸72-79、181-188、 226-233、260-267、271-278、383-390或446-453。在另一个优选实施方案 中，使用结合到下述人类肠碱性磷酸酶(SEQ ID NO：1)片段之一内的表 位的抗体来实践本发明：氨基酸83-90、181-188、226-233或260-267。
产生抗肠碱性磷酸酶抗体如IgY抗体或结合到肠碱性磷酸酶片段内的 表位的抗体完全在本领域普通技术人员的能力内。在一些实施方案中，所 述方法中采用的抗体来自卵(例如，卵黄)，特别地来自禽类的卵(如鸡 卵)。可使用下述方法来产生卵黄抗体的制品：Polson，A.、M.B.von Wechmar 和M.H.van Regenmortel，“Isolation of Viral IgY Antibodies from Yolks of Immunized Hens(从免疫母鸡的卵黄中分离病毒IgY抗体)”，Immunological Communications 9：475-493(1980)，其通过引用整体并入本文。产卵母鸡可 用肠碱性磷酸酶或其免疫原性片段接种。优选地，合适的佐剂与接种物 (inoculation)结合施用以增强免疫接种。用于此目的的佐剂为油包水乳剂佐 剂，如完全弗氏佐剂。肠碱性磷酸酶或其免疫原性片段促使母鸡产生抗肠 碱性磷酸酶抗体，所述抗体被动地被转移进母鸡产的卵的卵黄内。可收集 含有所述抗体的卵黄或完整的卵并匀浆以形成乳剂。可干燥得到的乳剂以 形成含有所述抗体的粉末。然后该粉末可以适合口服施用的方式配制，然 后口服施用至人类或非人类动物受治疗者。制品可作为饮食或食品补充剂 口服施用。
涵盖任何同种型类或亚类的抗体(例如，IgY、IgG、IgM、IgD、IgA、 IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)及其片段(不管通过酶促 还是化学消化所述抗体而产生)以及通过合成方法或通过编码所述抗体或 其片段的基因序列的表达来制备所述抗体。在IgY的一个实施方案中，使 用禽类动物(例如，鸡、雉、鸭、火鸡、鹅及类似动物)卵黄中的抗体来 实践本发明(参见例如，美国专利第5,080,895、5,989,584和6,213,930号， 其每个通过引用整体并入本文)。可使用可商业途径获得的卵抗体纯化试 剂盒来纯化所述抗体，所述试剂盒如IgY纯化系统(Promega； Madison，WI)或鸡IgY纯化(Pierce Biotechnology，Inc.； Rockford，IL)。也可使用标准亲和纯化方法基于抗体对肽或蛋白质片段的 亲和力来纯化抗体。可选地，含有所述抗体的卵、卵黄或干卵黄粉末可与 食物直接混合用于口服食用或将其容易地引入九剂、片剂或胶囊。也可通 过完善的分子克隆或噬菌体展示技术使用所述抗体鉴定编码所述抗体的 基因，以产生可单独或组合使用的所述抗体的完整或部分单克隆形式。
含有根据本发明的抗肠碱性磷酸酶抗体的组合物可例如一天一次、两 次或三次给药。可选地给药可以某种方式细分，其中处方剂量的一部分在 食用食物或饮料之前摄入，另一部分与食物或饮料一起摄入，而其他部分 在接近摄入食物或饮料之后的时间摄入。活性成分可作为颗粒或粉末通过 口服途径施用，所述颗粒或粉末如下述：撒或散布在食物上或食物内；或 者溶解或悬浮在饮料中；或者以药物固体剂型(如片剂、胶囊和粉末)， 或液体剂型(如酏剂、糖浆剂和混悬剂)提供。在一些实施方案中，所述 抗体随食物一起施用或接近食用具有膳食磷酸盐食物的时间(即之前或之 后约1小时内)施用。在一些实施方案中，所述抗体与磷酸盐结合剂同时 施用。
根据本发明的示例性药物组合物包含IgY和可选地卵组分、或包含IgY 和可选地卵黄组分，可选地具有额外的稳定剂或药学可接受的载体。完整 的卵、或卵黄、或脂类被部分或大部分去除的卵黄可被乳化，可选地与包 囊化合物或冻干保护剂(lyoprotectant)混合，并且经喷雾干燥或冷冻干燥以 形成粉末。
卵黄抗体可被部分纯化，例如去除大量的脂类。参见Camenisch C等， FASEB J.1999，13：81-88；Akita E & Nakai S，J.Immunol.Methods 1993， 160：207-214，其每个通过引用并入本文，如同以其整体提出一样；以及美 国专利公布第2004/0087522号，其通过引用并入本文，如同以其整体提出 一样。
胶囊或片剂可包含控释制剂，所述控释制剂可提供为于羟丙基甲基纤 维素或已知改变活性剂释放动力学的相关材料中的活性化合物的分散体。 使用已知的药学技术，固体剂型可被生产为缓释产品以提供在一段时间内 药物的连续释放。压制片剂可以经糖包衣或薄膜包衣以掩盖任何令人不快 的味道并保护片剂不与大气接触，或包肠溶衣以在胃肠道中选择性崩解。 固体和液体口服剂型都可含有着色剂和调味剂以增加患者的接受度。
稳定剂是在变性条件下(如热或酸)保持抗体结合活性的保护剂。稳 定剂不抑制抗体与靶抗原的相互作用，因而也保持了需要的生物效应。示 例性稳定剂包括卵白、清蛋白或糖类化合物。优选地，所述糖类化合物以 完整卵液体的约5％至30％(按重量)存在，并且更优选地以完整卵液体 的10％至20％(按重量)的量存在。抗体与糖类化合物在液态混悬剂中混 合，然后干燥混悬剂以产生含有所述蛋白质和糖类的固体。用作稳定剂的 糖类化合物包括单糖、二糖、多糖、烷化单糖、烷化二糖、烷化多糖、单 糖醇和烷化单糖醇。优选地，所述糖类化合物主要由5或6碳的单糖单位 组成或基于5或6碳的单糖单位。单糖是具有式(CH2O)n的单个糖残基， 其中n为3或大于3。单糖的实例包括但不限于葡萄糖、核糖、果糖、半 乳糖、塔罗糖、阿拉伯糖、岩藻糖、甘露糖、木糖和赤藓糖。所有异构形 式的单糖具有活性，所述异构形式如α-异构体、β-异构体、D-异构体和L- 异构体。二糖是具有通过糖苷键连接在一起的两个单糖残基的分子。可用 在本发明的二糖的实例包括但不限于海藻糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、麦芽 糖和乳酮糖。多糖是具有以线性、不分支的链或支链连接在一起的三个或 更多单糖的分子。淀粉、糖原和纤维素是具有上百或甚至上千单糖残基的 多糖的实例。淀粉可含有线性、不分支的链(直链淀粉)或高度支链(支 链淀粉)。糖原含有支链，而纤维素含有线性、不分支的链。烷化单糖、 烷化二糖和烷化多糖是至少一个氢基被烷基取代的单糖、二糖和多糖。单 糖醇是含有三个或更多羟基基团的无环多元醇。它们可通过将单糖的酮或 醛基团转变为羟基基团而生成。单糖醇的实例包括但不限于丙三醇、甘露 糖醇、山梨糖醇、木糖醇、乳糖醇、异麦芽糖醇(isomalt)、麦芽糖醇和氢 化淀粉水解物。烷化单糖醇是至少一个氢基被烷基取代的单糖醇。
抗体也可为增强抗体的功效或稳定性目的而被连接到基质(聚合的或 非聚合的)底物上，然后被施用。
考虑下述非限制性实施例后将更完全地理解本发明。
实施例1
降低由维生素D3增加的血清磷酸盐水平
材料和方法
用于抗体产生的动物：单冠白来航鸡(Single Comb White Leghorn) 产卵母鸡用于抗体的产生(每种肽抗原3只母鸡)。使用标准戊二醛程序， 通过将肽偶联到牛γ球蛋白上制备每种肽抗原(序列参见表1，序列和其 他特征参见图1)。在一些研究中，购买完整的酶，并且不经偶联而使用。 在使用完整酶(表2)的制品中，疫苗制品和注射时间表与偶联肽所述的 那些相同(参见下文)。
表1.用来产生卵抗体的肽的氨基酸序列。氨基酸序列是基于动物物种之 间肠碱性磷酸酶的预测保守区域。感兴趣的区域包括亲水表面、活性位点 入口、二聚体界面和金属结合结构域。
随意肽号           氨基酸序列           酶的位置
(SEQ ID NO)        (在SEQ ID NO：1的位置)
1(SEQ ID NO：5)    GPETPLAM(83-90)      表面
2(SEQ ID NO：6)    KTYNVDRQ(100-107)    二聚体界面
3(SEQ ID NO：7)    KANFQTIG(123-130)
4(SEQ ID NO：8)    KQAGKSVG(156-163)
5(SEQ ID NO：9)    HTVNRNWY(181-188)    活性位点入口
6(SEQ ID NO：10)   MFPMGTPD(226-233)    表面
7(SEQ ID NO：11)   EAALRLLS(312-319)    表面
8(SEQ ID NO：12)   GRIDHGHH(332-339)
9(SEQ ID NO：13)   FGGYTLRG(383-390)    活性位点入口
10(SEQ ID NO：14)  LSSETHGG(446-453)    活性位点入口
24(SEQ ID NO：15)  QAAEALDA(34-41)      表面
25(SEQ ID NO：16)  RILKGQKN(72-79)
26(SEQ ID NO：17)  QHASPAGT(171-178)    活性位点入口
27(SEQ ID NO：18)  DADMPASA(150-157)
28(SEQ ID NO：19)  HQGAWYVW(260-267)    表面，金属结合结构域
29(SEQ ID NO：20)  ELMQASLD(271-278)    表面
30(SEQ ID NO：21)  LTSEEDTL(363-370)
表2.用作疫苗以产生卵抗体的可商业途径获得的磷酸酶。
酶                来源            供应商
胎盘碱性磷酸酶    人类                                 Biodesign Intl
植酸酶            真菌(无花果曲霉，Aspergillus ficuum) Sigma
肠碱性磷酸酶      鸡                                   Worthington
肠碱性磷酸酶      小牛                                 Worthington
碱性磷酸酶        微生物(大肠杆菌，E.coli)             Worthington
偶联制备：尽管用于将肽偶联到载体蛋白的程序(许多用于偶联的试 剂盒可从Pierce Scientific获得)和载体蛋白的性质可有显著差异，本实施 例所述的研究中使用的方法涉及使用使需要的肽与载体蛋白牛γ球蛋白 (BgG)偶联的戊二醛程序。溶于0.8ml 0.1M醋酸钠缓冲液(pH＝7)的 BgG(4mg)与4mg需要的肽混合(参见下表1)。向肽载体蛋白混合物 中逐滴加入(以避免起泡)0.52ml 0.02M的戊二醛(溶于0.1M醋酸钠缓 冲液)。搅拌所述混合物2小时。然后加入20mg甘氨酸以终止反应。允 许所述混合物放置1小时，然后用磷酸盐缓冲盐水(pH＝7)透析过夜 (MW＝6000-8000)。然后将透析的偶联物冷冻于-80℃直至使用。
疫苗的制备和用途：为制备针对每只母鸡的疫苗，将0.5mg偶联物用 0.5ml PBS稀释至终浓度，并与0.5ml弗氏完全佐剂(第一次注射)或不 完全佐剂(加强接种)混合以形成油包水的乳化液(emulsification)，其当 滴在冰水上时能保持珠状。然后在四个部位(每条腿和每个胸部)用0.25 ml疫苗乳剂肌内注射所述母鸡。不完全佐剂的加强注射发生在7天后。表 1所示的每种肽被分别偶联到BgG上，并注射入3只产卵母鸡。
抗体样品的制备：到21天获得峰值抗体，因此从21天到110天收集 卵。在大约30天组中，从完整卵中分离每只母鸡的卵黄，混合并冻干。 将含有所述抗体的干卵黄粉末储存在室温下直至用在动物喂养研究中。也 收集每只母鸡的卵、分离卵黄并使用Polson等，Immunol.Commun.1980， 9：475-493所述的程序聚乙烯纯化IgY。
动物模型：无机磷酸盐(Pi)的膳食来源主要是矿物磷酸盐或来自动 物组织和产物(乳和卵)的磷酸盐。这些Pi来源可容易地被单胃动物吸收。 在需要干预磷摄取的疾病中，通常要求患者避免这些食物，并且服用Pi 结合剂。尽管这是减少Pi吸收的有用策略，但在诸如终末期肾衰竭的疾病 治疗过程中服用替代食物(例如，基于植物的食物)的患者接触可作为用 于吸收的Pi库的另一种磷酸盐的来源。植酸磷(PP)代表了基于植物的食 物中所有磷的70-80％。PP当被食用时正常不能被单胃动物吸收，并且随 粪便排泄。
本实施例使用的动物模型是鸡模型，其中鸡用导致低血清磷酸盐水平 的Pi缺乏饮食喂养。为Pi缺乏饮食喂养的鸡提供1α-羟基维生素D3提高 了血清磷酸盐水平。因此，所述模型可用来测试抗肠碱性磷酸酶抗体在降 低由1α-羟基维生素D3引起增加的植酸来源的血清磷酸盐水平上是否有 效。
动物实验：本研究使用的鸡模型如Biehl和Baker，J.Nutr.1997， 127：2054-2059所述，除了使用肠碱性磷酸酶肽的抗体和商品化酶的抗体。 本研究使用的阴性对照是Pi缺乏饮食(Pi＝无机磷酸盐，其主要是矿物磷 酸盐或来自动物组织和产物(如乳和卵)的磷酸盐)，其中使用的膳食磷 是植酸磷酸盐。如下述结果所示，该膳食处理导致低血浆磷。阳性对照是 与阴性对照同样的饮食，但补充了1α-羟基维生素D3(20μg/kg饮食， Sigma)。如下述结果所示，与阴性对照相比，此膳食处理通过释放植酸磷 增加了血液磷水平。所有剩余的膳食处理是阳性对照加抗体(1g如上述 产生的干卵黄粉末)(17种肽的抗体和5种完整酶的抗体)。所述阴性和阳 性对照被喂食1g来自用佐剂注射的母鸡的干卵黄粉末/kg饮食。这些卵黄 粉末缺少特定的抗体。
使用总计24种处理(阴性对照、阳性对照、阳性对照加17种抗肽抗 体中的每种和阳性对照加5种抗磷酸酶抗体中的每种)。六只一天龄的雄 性单冠白来航鸡雏鸡被分配每种膳食处理。用所述膳食处理喂养雏鸡10 天，称重，然后提取血样用于使用罗氏/日立分析仪(Roche/Hitachi analyzer) 确定血浆磷浓度(基于非还原条件下磷酸盐与钼酸铵反应生成磷钼酸铵)。 雏鸡被施安乐死，并且收集每只雏鸡的右胫跗骨、干燥、醚提取并成灰用 于确定无脂干骨的骨矿物质含量。
由于预先计划的差异比较是来测试抗体相对于阳性对照是否降低了 终点，使用t-检验进行统计分析来比较测定的参数和阳性对照。如果*p＜0.1 或**p＜0.05，则值被报告为显著的。
结果
指向肠碱性磷酸酶上许多位点的抗体在预防由活性维生素D引起的血 浆磷的增加上是有效的(表3)。酶表面和催化位点入口的抗体表现出是有 效的(表3)。
表3.在活性维生素D存在下抗肠碱性磷酸酶抗体喂养的鸡的血浆磷1
                        血浆磷酸盐
膳食处理         (mg/dL)     标准误差
                                                
Pi缺乏           3.92        0.35
活性维生素D2     6.70        0.51
肽1**            5.55        0.36
肽2              5.77        0.51
肽3*             4.95        0.87
肽4              6.77        1.06
肽5**            4.65        0.78
肽6**            4.88        0.18
肽7*             5.35        0.73
肽8              5.80        0.57
肽9**            4.93        0.54
肽10**           4.28        0.46
肽24             5.38        0.58
肽25**           4.57        0.69
肽27             5.73        0.98
肽28**           4.70        0.35
肽29**           4.97        0.50
肽30**           5.52        0.32
1一天龄来航鸡雏鸡(n＝6)用含有植酸磷的Pi缺乏饮食喂养，所述饮食单独添加了1α- 羟基维生素D3(活性维生素D，20μg/kg饮食)或添加了1α-羟基维生素D3加肠碱性 磷酸酶肽的卵抗体(1g干卵黄抗体粉末/kg饮食)。用所述饮食喂养10天后测定血浆 磷。
2活性维生素D饮食(1α-羟基维生素D3)的鸡相对于Pi缺乏饮食的鸡具有增加的血 浆磷(p＝0.0004)。
*或**补充了指示肽的抗体的活性维生素D饮食(1α-羟基维生素D3)喂养的鸡相对 于活性维生素D单独处理具有减少的血浆磷(*p＜0.1或**p＜0.05)。
鸡肠碱性磷酸酶的抗体和大肠杆菌碱性磷酸酶的抗体而不是植酸酶 的抗体、小牛肠碱性磷酸酶的抗体或人类胎盘碱性磷酸酶的抗体在降低由 维生素D增加的血浆磷水平上是有效的(表4)。
表4.在活性维生素D存在下抗肠碱性磷酸酶(IAP)抗体喂养的鸡的血浆 磷1
                       血浆磷酸盐
膳食处理      (mg/dL)             标准误差
                                              
Pi缺乏        3.92                0.35
活性维生素D2  6.70                0.51
人类胎盘AP    5.20                0.60
植酸酶        5.97                0.60
鸡IAP**       4.73                0.29
小牛IAP       3.97                0.47
大肠杆菌AP**  4.67                0.55
1一天龄来航鸡雏鸡(n＝6)用含有植酸磷的Pi缺乏饮食喂养，所述饮食单独添加了1α- 羟基维生素D3(活性维生素D，20μg/kg饮食)或添加了1α-羟基维生素D3加磷酸酶 的卵抗体(1g干卵黄抗体粉末/kg饮食)。用所述饮食喂养10天后测定血浆磷。
2活性维生素D饮食(1α-羟基维生素D3)的鸡相对于Pi缺乏饮食的鸡具有增加的血 浆磷(p＝0.0004)。
**补充了指示磷酸酶的抗体的活性维生素D饮食(1α-羟基维生素D3)喂养的雏鸡相 对于活性维生素D单独处理具有减少的血浆磷(p＜0.05)。
本研究也测定了骨灰。添加1α-羟基维生素D3的骨灰当与Pi缺乏阴性 对照饮食喂养的鸡的骨灰比较时增加了8％(分别为37.4％对34.6％)。肽 或磷酸酶的抗体都没有阻止与1α-羟基维生素D3相关的骨灰的增加。这表 示使用抗体可降低血液磷水平，并且不会不利地(adversely)影响骨矿化。
本实施例给出的数据显示肠碱性磷酸酶的抗体和选择的肠碱性磷酸 酶肽的抗体可用来减少植酸磷流向动物血池的增加。相应地，这些抗体可 用来在服用维生素D的患者(诸如肾病患者)中减少磷酸盐的吸收。
实施例2
抗肠碱性磷酸酶抗体结合并抑制肠碱性磷酸酶的活性
材料和方法
抗体：使用各种肠碱性磷酸酶肽产生抗肠碱性磷酸酶抗体已描述于上 述实施例1。
肠碱性磷酸酶(IAP)的测定：Caco-2C2BBel(#CRL-2102，ATCC， 结肠直肠腺癌细胞系)的细胞提取物从达到100％融合的培养物获得。细 胞在测定缓冲液(19mM Tris-HCl、2.68mM KCl、137mM NaCl和0.1％ Triton X-100)中重悬，并且在0.5mg/ml蛋白酶抑制剂(Complete，Roche) 存在下通过超声处理裂解。冻干并经PEG沉淀的抗体(卵黄)溶解于0.9％ 盐水中。200μl的0、2、1、0.2、0.04、0.08、0.0016和0.00032mg/ml抗 体分别与50μl细胞提取物、450μl含有0.5mM MgCl2的测定缓冲液(pH 7.4或pH 9.0)和300μl溶于0.2M Tris缓冲液的1.0mg/ml对硝基苯磷酸 混合。酶反应在37℃进行，持续0、15、30、45、60、90、120、180分钟。 对每个时间点，测定在405nm的光密度。计算对含有抗体的孵育的OD405 的增加。
蛋白质印迹：来自人类肠的蛋白质被上样到10％丙烯酰胺凝胶，并且 在120V运行一小时。然后使用20V在4℃持续12小时将蛋白质转移到 硝化纤维素膜上，并暴露于1/1000稀释的一抗(对抗体#5 1/500稀释)。3 小时后膜被洗涤几次，并与1/5000稀释的二抗(辣根过氧化物酶偶联的) 孵育90分钟。使用Amersham ECL试剂盒检测信号。
结果
使用肽1、3、5、6、9、10、25、28和29产生的抗肠碱性磷酸酶抗 体被体外测试它们对肠碱性磷酸酶活性的影响。如图2所示，测试的所有 抗体能阻抑Caco-2细胞的肠碱性磷酸酶的活性，而肽5和6的免疫前对照 对磷酸酶的活性没有任何影响。此外，蛋白质印迹分析显示使用如实施例 1所述的肠碱性磷酸酶肽产生的所有抗体识别所述酶，而免疫前对照不识 别所述酶(图3)。
实施例3
在腺嘌呤诱导的尿毒症动物中降低血清磷酸盐水平
本实施例中使用的动物模型是腺嘌呤诱导的尿毒症大鼠模型(参见例 如Yokazawa等，Nephron 1986，44：230-234；Katsumata等，Kid Intl 2003， 64：441-450；和Levi R等，J Am Soc Nephrol 2006，17：107-112，其每个通 过引用整体并入本文)。
大鼠(如雄性Sprague Dawley大鼠，大约175-250g，每组最多10只 大鼠)用对照饮食或诱导尿毒症的腺嘌呤饮食(例如，含有0.75％腺嘌呤) 喂养几周时间(例如，3至5周或更长)。在一个实施方案中，所述饮食可 含有植酸磷酸盐或无机磷酸盐和植酸磷酸盐两者。腺嘌呤饮食喂养的大鼠 将发展具有高于4.4mmol/L的血清磷酸盐水平的高磷酸盐血症。这些大鼠 也将发展维生素D3(1α-羟基维生素D3和1α，25-二羟基维生素D3)缺乏。 用增加量的抗肠碱性磷酸酶抗体(如实施例1中所述的那些)每日口服处 理这些腺嘌呤饮食喂养的大鼠，将导致剂量依赖性的血清磷酸盐水平的降 低。如果在腺嘌呤处理的前4周内和之后供给这些抗体，这些抗肠碱性磷 酸酶抗体将预防、延缓或逆转这些大鼠中高磷酸盐血症的发展。
在其他组中，腺嘌呤饮食喂养的大鼠被供给某种形式的维生素D(例 如，25-羟基维生素D或其衍生物或活性维生素D剂如1α，25-二羟基维生 素D3)以预防或补偿活性维生素D缺乏。在一个实施方案中，所述饮食 可含有植酸磷酸盐或无机磷酸盐和植酸磷酸盐两者。所述维生素D处理将 使大鼠更易患高磷酸盐血症，并且一旦发展将加重这些大鼠中的高磷酸盐 血症。用增加剂量的抗肠碱性磷酸酶抗体(如实施例1中所述的那些)口 服处理这些接受维生素D(例如，1α，25-二羟基维生素D3)的大鼠，将以 剂量依赖性方式降低这些大鼠中的血清磷酸盐水平。如果在腺嘌呤处理的 前4周内和之后供给所述抗体，这些抗肠碱性磷酸酶抗体将预防或延缓高 磷酸盐血症的发展或加重。
可使用其他腺嘌呤诱导的尿毒症动物(如狗、猪和猴)进行相似的实 验。
实施例4
在5/6肾切除大鼠中降低血清磷酸盐水平
对于5/6肾切除术(参见例如，Cozzolino M等，Kidney Int.2003， 64：1653-61)，结扎左肾动脉的几个分支并切除右肾。用高磷酸盐饮食(例 如，0.9％磷酸盐)喂养5/6肾切除大鼠(例如，雄性Sprague Dawley大鼠， 大约175-250g，每组最多10只大鼠)。在一个实施方案中，所述饮食可含 有植酸磷酸盐或无机磷酸盐和植酸磷酸盐两者。手术后几周(例如，4至 8周)这些大鼠将变为尿毒症的，并发展肾衰竭、高磷酸盐血症和活性维 生素D3(1α-羟基维生素D3和1α，25-二羟基维生素D3)缺乏。用增加量的 抗肠碱性磷酸酶抗体(如实施例1中所述的那些)每日口服处理这些5/6 肾切除的高磷酸盐饮食喂养的大鼠，将以剂量依赖性方式降低这些大鼠中 的血清磷酸盐水平。如果在手术后的前几周内和之后供给所述抗体(如实 施例1所述的那些)，它们将预防或延缓这些大鼠中高磷酸盐血症的发展。
在其他组中，高磷酸盐饮食喂养的5/6肾切除大鼠被供给某种形式的 维生素D(例如，25-羟基维生素D或其衍生物或活性维生素D剂如1α，25- 二羟基维生素D3)以预防或补偿活性维生素D缺乏。然而，该处理将使 大鼠更易患高磷酸盐血症，并且一旦发展将加重这些大鼠中的高磷酸盐血 症。用增加剂量的抗肠碱性磷酸酶抗体(如实施例1中所述的那些)口服 处理这些接受维生素D(例如，1α，25-二羟基维生素D3)的大鼠，将降低 血清磷酸盐水平。如果在手术的前几周内和之后供给所述抗体，这些抗肠 碱性磷酸酶抗体将预防或延缓这些大鼠中高磷酸盐血症的发展或加重。
本发明将不限于上述实施例，而是包括如落入所附权利要求范围内的 所有此类修改和变化。
序列表
<110>马克.库克
    马丁.佩特科维奇
    克里斯汀.海尔维格
    埃里卡.希尔斯坦
    基思.克劳福
<120>减少磷酸盐吸收的方法
<130>960296.00428
<160>21
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>528
<212>PRT
<213>人类
<400>1
Met Gln Gly Pro Trp Val Leu Leu Leu Leu Gly Leu Arg Leu Gln Leu
1               5                   10                  15
Ser Leu Gly Val Ile Pro Ala Glu Glu Glu Asn Pro Ala Phe Trp Asn
            20                  25                  30
Arg Gln Ala Ala Glu Ala Leu Asp Ala Ala Lys Lys Leu Gln Pro Ile
        35                  40                  45
Gln Lys Val Ala Lys Asn Leu Ile Leu Phe Leu Gly Asp Gly Leu Gly
    50                  55                  60
Val Pro Thr Val Thr Ala Thr Arg Ile Leu Lys Gly Gln Lys Asn Gly
65                  70                  75                  80
Lys Leu Gly Pro Glu Thr Pro Leu Ala Met Asp Arg Phe Pro Tyr Leu
                85                  90                  95