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用于调节HBV和TTR表达的组合物和方法

阅读：723发布：2020-06-26

IPRDB可以提供用于调节HBV和TTR表达的组合物和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文提供了具有缀合物基团的低聚化合物。在某些实施方案中，所述低聚化合物缀合至N-乙酰基半乳糖胺。，下面是用于调节HBV和TTR表达的组合物和方法专利的具体信息内容。

1.一种包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由8至80个连接核苷组成并且具有与编码甲状腺素运载蛋白(TTR)的SEQ ID NO:2至少85％、90％、

95％或100％互补的核碱基序列。

2.如权利要求1所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列在SEQ ID NO:2的核碱基507-608内互补，并且其中所述修饰寡核苷酸与SEQ ID NO:2至少85％、

90％、95％或100％互补。

3.如权利要求1所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列在SEQ ID NO:2的核碱基507-526、508-527、515-534、516-535、580-599、585-604、587-606或589-608内互补，并且其中所述修饰寡核苷酸与SEQ ID NO:2至少85％、90％、95％或100％互补。

4.如权利要求1所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由10至30个连接核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:12、13、14、15、16、17、18或19的核碱基序列中的任一个的至少8个连续核碱基的核碱基序列。

5.如权利要求4所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸具有包含SEQ ID NO:12、13、

14、15、16、17、18或19中列出的序列的核碱基序列。

6.如权利要求4所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸具有由SEQ ID NO:12、13、14、

15、16、17、18或19中列出的序列组成的核碱基序列。

7.如权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由20个连接核苷组成。

8.如权利要求1至7中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少一个修饰的糖。

9.如权利要求8所述的化合物，其中所述修饰的糖为双环糖。

10.如权利要求9所述的化合物，其中所述双环糖选自由以下组成的组：

4'-(CH2)-O-2'(LNA)；4'-(CH2)2-O-2'(ENA)；和4'-CH(CH3)-O-2'(cEt)。

11.如权利要求8所述的化合物，其中所述修饰的糖为2’-O-甲氧基乙基。

12.如权利要求1至11中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少一个修饰的核碱基。

13.如权利要求12所述的化合物，其中所述修饰的核碱基为5-甲基胞嘧啶。

14.如权利要求1至13中任一项所述的化合物，其包含由20个连接核苷组成的修饰寡核苷酸，所述修饰寡核苷酸具有由SEQ ID NO:12、13、14、15、16、17、18或19中列出的序列组成的核碱基序列，其中所述修饰寡核苷酸包含由十个连接脱氧核苷组成的缺口区段；

由五个连接核苷组成的5’翼区段；以及由五个连接核苷组成的3’翼区段；

其中所述缺口区段定位在所述5’翼区段与所述3’翼区段之间；其中所述5’翼区段的每个核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖；其中所述3’翼区段的每个核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖；其中每个核苷间键联为硫代磷酸酯键联；并且其中每个胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶。

15.如权利要求1至14中任一项所述的化合物，其中所述化合物为单链的。

16.如权利要求1至14中任一项所述的化合物，其中所述化合物为双链的。

17.如权利要求1至16中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间键联。

18.如权利要求17所述的化合物，其中所述修饰的核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。

19.如权利要求18所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少一个磷酸二酯核苷间键联。

20.如权利要求18所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少2个磷酸二酯核苷间键联。

21.如权利要求18所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少3个磷酸二酯核苷间键联。

22.如权利要求18所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少4个磷酸二酯核苷间键联。

23.如权利要求18所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少5个磷酸二酯核苷间键联。

24.如权利要求18所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少6个磷酸二酯核苷间键联。

25.如权利要求18所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少7个磷酸二酯核苷间键联。

26.如权利要求19至25中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的每个核苷间键联选自磷酸二酯核苷间键联和硫代磷酸酯核苷间键联。

27.如权利要求18所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的每个核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。

28.一种化合物，其由ISIS 304299和缀合物基团组成。

29.一种化合物，其由ISIS 420915和缀合物基团组成。

30.一种化合物，其由ISIS 420921和缀合物基团组成。

31.一种化合物，其由ISIS 420922和缀合物基团组成。

32.一种化合物，其由ISIS 420950和缀合物基团组成。

33.一种化合物，其由ISIS 420955和缀合物基团组成。

34.一种化合物，其由ISIS 420957和缀合物基团组成。

35.一种化合物，其由ISIS 420959和缀合物基团组成。

36.如权利要求1至35中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团在所述修饰寡核苷酸的5’末端处连接至所述修饰寡核苷酸。

37.如权利要求1至35中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团在所述修饰寡核苷酸的3’末端处连接至所述修饰寡核苷酸。

38.如权利要求1-37中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含恰好一个配体。

39.如权利要求1-37中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含恰好两个配体。

40.如权利要求1-37中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含三个或更多个配体。

41.如权利要求1-37中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含恰好三个配体。

42.如权利要求38-41中任一项所述的化合物，其中每个配体选自以下：多糖、修饰多糖、甘露糖、半乳糖、甘露糖衍生物、半乳糖衍生物、D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-阿拉伯糖、L-半乳糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、α-D-半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖、L-4-硫代核糖。

43.如权利要求42所述的化合物，其中每个配体为N-乙酰基半乳糖胺。

44.如权利要求1至37中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：

45.如权利要求1至37中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：

46.如权利要求1至37中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：

47.如权利要求1至37中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：

48.如权利要求1至37中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：

49.如权利要求1至48中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含至少一个磷连接基团或中性连接基团。

50.如权利要求1至49中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含选自以下的结构：其中n为1至12，并且

其中m为1至12。

51.如权利要求1至49中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团具有其结构选自以下的系链：其中L为磷连接基团或中性连接基团；

Z1为C(＝O)O-R2；

Z2为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；

R2为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；并且每个m1独立地为0至20，其中对于每个系链，至少一个m1大于0。

52.如权利要求1至51中任一项所述的化合物，其中缀合物基团具有其结构选自以下的系链：其中Z2为H或CH3；并且

每个m1独立地为0至20，其中对于每个系链，至少一个m1大于0。

53.如权利要求1至51中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团具有其结构选自以下的系链：其中n为1至12，并且

其中m为1至12。

54.如权利要求1至53中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团共价连接至所述修饰寡核苷酸。

55.如权利要求1至54中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：其中

A为所述修饰寡核苷酸；

B为可裂解部分

C为缀合物接头

D为支链基团

每个E为系链；

每个F为配体；并且

q为1与5之间的整数。

56.如权利要求1至54中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：其中：

A为所述修饰寡核苷酸；

B为可裂解部分

C为缀合物接头

D为支链基团

每个E为系链；

每个F为配体；

每个n独立地为0或1；并且

q为1与5之间的整数。

57.如权利要求1至54中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：其中

A为所述修饰寡核苷酸；

B为可裂解部分；

C为缀合物接头；

每个E为系链；

每个F为配体；并且

q为1与5之间的整数。

58.如权利要求1至54中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：其中

A为所述修饰寡核苷酸；

C为缀合物接头；

D为支链基团；

每个E为系链；

每个F为配体；并且

q为1与5之间的整数。

59.如权利要求1至54中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：其中

A为所述修饰寡核苷酸；

C为缀合物接头；

每个E为系链；

每个F为配体；并且

q为1与5之间的整数。

60.如权利要求1至54中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：其中

A为所述修饰寡核苷酸；

B为可裂解部分；

D为支链基团；

每个E为系链；

每个F为配体；并且

q为1与5之间的整数。

61.如权利要求1至54中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：其中

A为所述修饰寡核苷酸；

B为可裂解部分；

每个E为系链；

每个F为配体；并且

q为1与5之间的整数。

62.如权利要求1至54中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：其中

A为所述修饰寡核苷酸；

D为支链基团；

每个E为系链；

每个F为配体；并且

q为1与5之间的整数。

63.如权利要求1至62中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：其中每个L独立地为磷连接基团或中性连接基团；并且每个n独立地为1至20。

64.如权利要求1至62中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：

65.如权利要求1至62中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有以下结构：

66.如权利要求1至62中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：

67.如权利要求1至62中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：

68.如权利要求1至63中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：

69.如权利要求1至63中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含吡咯烷。

70.如权利要求1至64中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头不包含吡咯烷。

71.如权利要求1至63或69至70中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含PEG。

72.如权利要求1至63或69至71中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含酰胺。

73.如权利要求1至63或69至72中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含至少两个酰胺。

74.如权利要求1至63或71中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头不包含酰胺。

75.如权利要求1至63或69至73中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含聚酰胺。

76.如权利要求1至63或69至75中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含胺。

77.如权利要求1至63或69至76中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含一个或多个二硫键。

78.如权利要求1至63或69至77中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含蛋白质结合部分。

79.如权利要求78所述的化合物，其中所述蛋白质结合部分包含脂质。

80.如权利要求78所述的化合物，其中所述蛋白质结合部分选自以下：胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-二-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)、维生素(例如，叶酸、维生素A、维生素E、生物素、吡哆醛)、肽、碳水化合物(例如，单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖、多糖)、溶内体组分、类固醇(例如，熊果醇、龙舌兰皂苷配基、薯蓣皂苷配基)、萜烯(例如，三萜烯，例如萨洒皂草配基、无羁萜、表无羁萜醇衍生的石胆酸)或阳离子脂质。

81.如权利要求78所述的化合物，其中所述蛋白质结合部分选自以下：C16至C22长链饱和或不饱和的脂肪酸、胆固醇、胆酸、维生素E、金刚烷或1-五氟丙基。

82.如权利要求1至63中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：其中每个n独立地为1至20；并且p为1至6。

83.如权利要求1至63中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：其中每个n独立地为1至20。

84.如权利要求1至63中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：

85.如权利要求1至63中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：其中n为1至20。

86.如权利要求1至63中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：

87.如权利要求1至63中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：其中每个n独立地为0、1、2、3、4、5、6或7。

88.如权利要求1至63中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有以下结构：

89.如权利要求1至88中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构之一：其中每个A1独立地为O、S、C＝O或NH；并且每个n独立地为1至20。

90.如权利要求1至88中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构之一：其中每个A1独立地为O、S、C＝O或NH；并且每个n独立地为1至20。

91.如权利要求1至88中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：

92.如权利要求1至88中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：

93.如权利要求1至88中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：

94.如权利要求1至88中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：

95.如权利要求1至88中任一项所述的化合物，其中所述支链基团包含醚。

96.如权利要求1至88中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：每个n独立地为1至20；并且

m为2至6。

97.如权利要求1至88中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：

98.如权利要求1至88中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：

99.如权利要求1至88中任一项所述的化合物，其中所述支链基团包含：其中每个j为1至3的整数；并且

其中每个n为1至20的整数。

100.如权利要求1至88中任一项所述的化合物，其中所述支链基团包含：

101.如权利要求1至100中任一项所述的化合物，其中每个系链选自以下：其中L选自磷连接基团和中性连接基团；

Z1为C(＝O)O-R2；

Z2为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；

R2为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；并且每个m1独立地为0至20，其中对于每个系链，至少一个m1大于0。

102.如权利要求1至100中任一项所述的化合物，其中每个系链选自以下：其中Z2为H或CH3；并且

每个m2独立地为0至20，其中对于每个系链，至少一个m2大于0。

103.如权利要求1至100中任一项所述的化合物，其中每个系链选自以下：其中n为1至12，并且

其中m为1至12。

104.如权利要求1至100中任一项所述的化合物，其中至少一个系链包含乙二醇。

105.如权利要求1至100或102中任一项所述的化合物，其中至少一个系链包含酰胺。

106.如权利要求1至100或102中任一项所述的化合物，其中至少一个系链包含聚酰胺。

107.如权利要求1至100或102中任一项所述的化合物，其中至少一个系链包含胺。

108.如权利要求1至100或102至107中任一项所述的化合物，其中至少两个系链彼此不同。

109.如权利要求1至100或102至107中任一项所述的化合物，其中所有系链彼此相同。

110.如权利要求1至100中任一项所述的化合物，其中每个系链选自以下：其中每个n独立地为1至20；并且

每个p为1至约6。

111.如权利要求1至100中任一项所述的化合物，其中每个系链选自以下：

112.如权利要求1至100中任一项所述的化合物，其中每个系链具有以下结构：其中每个n独立地为1至20。

113.如权利要求1至100中任一项所述的化合物，其中每个系链具有以下结构：

114.如权利要求1至100中任一项所述的化合物，其中所述系链具有选自以下的结构：其中每个n独立地为0、1、2、3、4、5、6或7。

115.如权利要求1至100中任一项所述的化合物，其中所述系链具有选自以下的结构：

116.如权利要求1至115中任一项所述的化合物，其中所述配体为半乳糖。

117.如权利要求1至115中任一项所述的化合物，其中所述配体为甘露糖-6-磷酸。

118.如权利要求1至115中任一项所述的化合物，其中每个配体选自以下：其中每个R1选自OH和NHCOOH。

119.如权利要求1至115中任一项所述的化合物，其中每个配体选自以下：

120.如权利要求1至115中任一项所述的化合物，其中每个配体具有以下结构：

121.如权利要求1至115中任一项所述的缀合反义化合物，其中每个配体具有以下结构：

122.如权利要求1至121中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含细胞靶向部分。

123.如权利要求122所述的化合物，其中所述缀合物基团包含具有以下结构的细胞靶向部分：其中每个n独立地为1至20。

124.如权利要求122中任一项所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：

125.如权利要求122所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：其中每个n独立地为1至20。

126.如权利要求122所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：

127.如权利要求122所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

128.如权利要求122所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

129.如权利要求122所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：

130.如权利要求122所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：

131.如权利要求122所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

132.如权利要求122所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：

133.如权利要求122所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

134.如权利要求122所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

135.如权利要求122所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

136.如权利要求122所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：如权利要求122所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：

137.如权利要求122所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：

138.如权利要求122所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：

139.如权利要求122所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：

140.如权利要求122所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

141.如权利要求122所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

142.如权利要求122所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

143.如权利要求122所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

144.如权利要求122所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：

145.如权利要求122所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

146.如权利要求122所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：

147.如权利要求122所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：其中每个Y选自O、S、取代或未取代的C1-C10烷基、氨基、取代的氨基、叠氮基、烯基或炔基。

148.如权利要求1至121中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：其中每个Y选自O、S、取代或未取代的C1-C10烷基、氨基、取代的氨基、叠氮基、烯基或炔基。

149.如权利要求122所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：其中每个Y选自O、S、取代或未取代的C1-C10烷基、氨基、取代的氨基、叠氮基、烯基或炔基。

150.如权利要求1至149中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：

151.如权利要求1至149中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：

152.如权利要求1至149中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：

153.如权利要求1至149中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：

154.如权利要求1至153中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含选自以下的可裂解部分：磷酸二酯、酰胺、脱氧核苷或酯。

155.如权利要求1至154中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含磷酸二酯可裂解部分。

156.如权利要求1至152中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团不包含可裂解部分，并且其中所述缀合物基团包含处于所述缀合物基团与所述寡核苷酸之间的硫代磷酸酯键联。

157.如权利要求1至156中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含酰胺可裂解部分。

158.如权利要求1至156中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含酯可裂解部分。

159.如权利要求1至158中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：其中每个n独立地为1至20；

Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

160.如权利要求1至158中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：其中每个n独立地为1至20；

Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

161.如权利要求1至158中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：其中每个n独立地为1至20；

Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；

Z为H或连接的固体载体；并且

Bx为杂环碱基部分。

162.如权利要求1至158中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：其中每个n独立地为1至20；

Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；

Z为H或连接的固体载体；并且

Bx为杂环碱基部分。

163.如权利要求1至158中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

164.如权利要求1至158中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

165.如权利要求1至158中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

166.如权利要求1至158中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

167.如权利要求1至158中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

168.如权利要求1至158中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

169.如权利要求1至158中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

170.如权利要求1至158中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

171.如权利要求1至158中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

172.如权利要求1至158中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

173.如权利要求1至158中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

174.如权利要求1至158中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

175.如权利要求1至158中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

176.如权利要求1至158中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

177.如权利要求159至176中任一项所述的化合物，其中Bx选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶。

178.如权利要求159至177中任一项所述的化合物，其中Bx为腺嘌呤。

179.如权利要求159至177中任一项所述的化合物，其中Bx为胸腺嘧啶。

180.如权利要求159至176中任一项所述的化合物，其中Q13为O(CH2)2-OCH3。

181.如权利要求159至176中任一项所述的化合物，其中Q13为H。

182.一种组合物，其包含如权利要求1-181中任一项所述的化合物或其盐、和药学上可接受的载体或稀释剂中的至少一种。

183.一种前药，其包含如权利要求1-181中任一项所述的化合物。

184.一种方法，其包括向动物施用如权利要求1-181中任一项所述的化合物、如权利要求182所述的组合物、或如权利要求183所述的前药。

185.如权利要求184所述的方法，其中所述动物为人。

186.如权利要求184或185所述的方法，其中施用所述化合物预防、治疗、改善或减缓甲状腺素运载蛋白淀粉样变性的进展。

187.如权利要求184至186中任一项所述的方法，其包括共同施用所述化合物或组合物与第二药剂。

188.如权利要求187所述的方法，其中所述化合物或组合物与所述第二药剂是伴随施用的。

189.如权利要求184至188中任一项所述的方法，其中所述施用是向脉络丛进行的。

190.一种减少动物中的甲状腺素运载蛋白mRNA或蛋白表达的方法，其包括向所述动物施用如权利要求1-181中任一项所述的化合物、如权利要求182所述的组合物、或如权利要求183所述的前药，由此减少所述动物中的甲状腺素运载蛋白mRNA或蛋白表达。

191.如权利要求190所述的方法，其中所述动物为人。

192.如权利要求190或191所述的方法，其中减少甲状腺素运载蛋白mRNA或蛋白表达预防、治疗、改善或减缓甲状腺素运载蛋白淀粉样变性的进展。

193.如权利要求190至192中任一项所述的方法，其包括共同施用所述化合物或组合物与第二药剂。

194.如权利要求193所述的方法，其中所述化合物或组合物与所述第二药剂是伴随施用的。

195.如权利要求190至194中任一项所述的方法，其中所述化合物或组合物被施用到脉络丛。

196.一种治疗受试者中的甲状腺素运载蛋白淀粉样变性的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1-181中任一项所述的化合物、如权利要求182所述的组合物、或如权利要求183所述的前药。

197.如权利要求196所述的方法，其中施用所述化合物或组合物减少与甲状腺素运载蛋白淀粉样变性相关的至少一个症状，所述至少一个症状选自由以下组成的组：不安、缺乏协调、眼球震颤、痉挛性下肢轻瘫、缺乏肌肉协调、视力受损、失眠、异常感觉、肌阵挛、失明、失语、腕管综合征、癫痫发作、蛛网膜下出血、中风和脑出血、脑积水、共济失调和痉挛性麻痹、昏迷、感觉神经病、感觉异常、感觉减退、运动神经病、自主神经病、直立性低血压、周期性便秘、周期性腹泻、恶心、呕吐、出汗减少、阳痿、胃排空延迟、尿潴留、尿失禁、进行性心脏病、疲劳、呼吸短促、体重下降、缺乏食欲、麻木、麻刺感、虚弱、胖大舌、肾病综合征、充血性心力衰竭、劳力性呼吸困难、外周性水肿、心律不齐、心悸、头晕、晕厥、体位性低血压、外周神经问题、感觉运动障碍、下肢神经病变、上肢神经病变、痛觉过敏、温觉改变、下肢无力、恶病质、外周水肿、肝肿大、紫癜、舒张功能不全、过早心室收缩、颅神经病变、深部腱反射低下、玻璃体淀粉样沉积物、玻璃体混浊、干眼症、青光眼、瞳孔中成扇形的外观，以及由保水性所致的脚肿胀。

198.如权利要求196或197所述的方法，其包括共同施用所述化合物或组合物与第二药剂。

199.如权利要求198所述的方法，其中所述化合物或组合物与所述第二药剂是伴随施用的。

200.如权利要求196至199中任一项所述的方法，其中所述化合物或组合物被施用到脉络丛。

201.如权利要求196至200中任一项所述的方法，其中所述受试者为人。

202.一种包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由8至80个连接核苷组成并且具有与编码乙型肝炎病毒(HBV)的SEQ ID NO:1至少85％、90％、95％或100％互补的核碱基序列。

203.如权利要求202所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列在SEQ ID NO:1的 核 碱 基 1583-1602、1780-1799、411-427、1266-1285、1577-1596、1585-1604、

1583-1598、1264-1279或1780-1797内互补，并且其中所述修饰寡核苷酸与SEQ ID NO:1至少85％、90％、95％或100％互补。

204.如权利要求202所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由10至30个连接核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、10或11的核碱基序列中的任一个的至少8个连续核碱基的核碱基序列。

205.如权利要求204所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸具有包含SEQ ID NO:3、4、

5、6、7、8、9、10或11中列出的序列的核碱基序列。

206.如权利要求204所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸具有由SEQ ID NO:3、4、5、

6、7、8、9、10或11中列出的序列组成的核碱基序列。

207.如权利要求202至206中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含由连接脱氧核苷组成的缺口区段；

由连接核苷组成的5’翼区段；以及

由连接核苷组成的3’翼区段；

其中所述缺口区段定位在所述5’翼区段与所述3’翼区段之间；其中所述5’翼区段的每个核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖；其中所述3’翼区段的每个核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖；其中每个核苷间键联为硫代磷酸酯键联；并且其中每个胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶。

208.如权利要求202至207中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含由连接脱氧核苷组成的缺口区段；

由连接核苷组成的5’翼区段；以及

由连接核苷组成的3’翼区段；

其中所述缺口区段定位在所述5’翼区段与所述3’翼区段之间；其中所述5’翼区段的每个核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖或受限制的乙基糖；其中所述3’翼区段的每个核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖或受限制的乙基糖；其中每个核苷间键联为硫代磷酸酯键联；并且其中每个胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶。

209.如权利要求202至208中任一项所述的化合物，其中所述化合物为单链的。

210.如权利要求202至208中任一项所述的化合物，其中所述化合物为双链的。

211.如权利要求202至210中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间键联。

212.如权利要求211所述的化合物，其中所述修饰的核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。

213.如权利要求212所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少一个磷酸二酯核苷间键联。

214.如权利要求212所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少2个磷酸二酯核苷间键联。

215.如权利要求212所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少3个磷酸二酯核苷间键联。

216.如权利要求212所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少4个磷酸二酯核苷间键联。

217.如权利要求212所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少5个磷酸二酯核苷间键联。

218.如权利要求212所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少6个磷酸二酯核苷间键联。

219.如权利要求212所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少7个磷酸二酯核苷间键联。

220.如权利要求213至219中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的每个核苷间键联选自磷酸二酯核苷间键联和硫代磷酸酯核苷间键联。

221.如权利要求212所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的每个核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。

222.一种化合物，其由ISIS 505358和缀合物基团组成。

223.一种化合物，其由ISIS 509934和缀合物基团组成。

224.一种化合物，其由ISIS 510100和缀合物基团组成。

225.一种化合物，其由ISIS 552023和缀合物基团组成。

226.一种化合物，其由ISIS 552024和缀合物基团组成。

227.一种化合物，其由ISIS 552032和缀合物基团组成。

228.一种化合物，其由ISIS 552859和缀合物基团组成。

229.一种化合物，其由ISIS 552925和缀合物基团组成。

230.一种化合物，其由ISIS 577119和缀合物基团组成。

231.如权利要求202至230中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团在所述修饰寡核苷酸的5’末端处连接至所述修饰寡核苷酸。

232.如权利要求202至230中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团在所述修饰寡核苷酸的3’末端处连接至所述修饰寡核苷酸。

233.如权利要求202-232中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含恰好一个配体。

234.如权利要求202-232中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含恰好两个配体。

235.如权利要求202-232中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含三个或更多个配体。

236.如权利要求202-232中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含恰好三个配体。

237.如权利要求202-236中任一项所述的化合物，其中每个配体选自以下：多糖、修饰多糖、甘露糖、半乳糖、甘露糖衍生物、半乳糖衍生物、D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-阿拉伯糖、L-半乳糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、α-D-半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖、L-4-硫代核糖。

238.如权利要求237所述的化合物，其中每个配体为N-乙酰基半乳糖胺。

239.如权利要求202至238中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：

240.如权利要求202至238中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：

241.如权利要求202至238中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：

242.如权利要求202至238中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：

243.如权利要求202至238中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：

244.如权利要求202至243中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含至少一个磷连接基团或中性连接基团。

245.如权利要求202至244中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含选自以下的结构：其中n为1至12；并且

其中m为1至12。

246.如权利要求202至245中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团具有其结构选自以下的系链：其中L为磷连接基团或中性连接基团；

Z1为C(＝O)O-R2；

Z2为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；

R2为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；并且每个m1独立地为0至20，其中对于每个系链，至少一个m1大于0。

247.如权利要求202至246中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团具有其结构选自以下的系链：其中Z2为H或CH3；并且

每个m1独立地为0至20，其中对于每个系链，至少一个m1大于0。

248.如权利要求202至247中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团具有其结构选自以下的系链：其中n为1至12；并且

其中m为1至12。

249.如权利要求202至248中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团共价连接至所述修饰寡核苷酸。

250.如权利要求202至249中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：其中

A为所述修饰寡核苷酸；

B为可裂解部分

C为缀合物接头

D为支链基团

每个E为系链；

每个F为配体；并且

q为1与5之间的整数。

251.如权利要求202至249中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：其中：

A为所述修饰寡核苷酸；

B为可裂解部分

C为缀合物接头

D为支链基团

每个E为系链；

每个F为配体；

每个n独立地为0或1；并且

q为1与5之间的整数。

252.如权利要求202至249中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：其中

A为所述修饰寡核苷酸；

B为可裂解部分；

C为缀合物接头；

每个E为系链；

每个F为配体；并且

q为1与5之间的整数。

253.如权利要求202至249中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：其中

A为所述修饰寡核苷酸；

C为缀合物接头；

D为支链基团；

每个E为系链；

每个F为配体；并且

q为1与5之间的整数。

254.如权利要求202至249中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：其中

A为所述修饰寡核苷酸；

C为缀合物接头；

每个E为系链；

每个F为配体；并且

q为1与5之间的整数。

255.如权利要求202至249中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：其中

A为所述修饰寡核苷酸；

B为可裂解部分；

D为支链基团；

每个E为系链；

每个F为配体；并且

q为1与5之间的整数。

256.如权利要求202至249中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：其中

A为所述修饰寡核苷酸；

B为可裂解部分；

每个E为系链；

每个F为配体；并且

q为1与5之间的整数。

257.如权利要求202至249中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：其中

A为所述修饰寡核苷酸；

D为支链基团；

每个E为系链；

每个F为配体；并且

q为1与5之间的整数。

258.如权利要求202至257中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：其中每个L独立地为磷连接基团或中性连接基团；并且每个n独立地为1至20。

259.如权利要求202至257中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：

260.如权利要求202至257中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有以下结构：

261.如权利要求202至257中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：

262.如权利要求202至257中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：

263.如权利要求202至257中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：

264.如权利要求202至263中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含吡咯烷。

265.如权利要求202至263中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头不包含吡咯烷。

266.如权利要求202至265中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含PEG。

267.如权利要求202至266中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含酰胺。

268.如权利要求202至266中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含至少两个酰胺。

269.如权利要求202至266中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头不包含酰胺。

270.如权利要求202至269中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含聚酰胺。

271.如权利要求202至270中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含胺。

272.如权利要求202至271中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含一个或多个二硫键。

273.如权利要求202至272中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含蛋白质结合部分。

274.如权利要求273所述的化合物，其中所述蛋白质结合部分包含脂质。

275.如权利要求273所述的化合物，其中所述蛋白质结合部分选自以下：胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-二-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)、维生素(例如，叶酸、维生素A、维生素E、生物素、吡哆醛)、肽、碳水化合物(例如，单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖、多糖)、溶内体组分、类固醇(例如，熊果醇、龙舌兰皂苷配基、薯蓣皂苷配基)、萜烯(例如，三萜烯，例如萨洒皂草配基、无羁萜、表无羁萜醇衍生的石胆酸)或阳离子脂质。

276.如权利要求273所述的化合物，其中所述蛋白质结合部分选自以下：C16至C22长链饱和或不饱和的脂肪酸、胆固醇、胆酸、维生素E、金刚烷或1-五氟丙基。

277.如权利要求202至276中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：其中每个n独立地为1至20；并且p为1至6。

278.如权利要求202至277中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：其中每个n独立地为1至20。

279.如权利要求202至277中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：

280.如权利要求202至277中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：其中n为1至20。

281.如权利要求202至277中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：

282.如权利要求202至277中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：其中每个n独立地为0、1、2、3、4、5、6或7。

283.如权利要求202至277中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有以下结构：

284.如权利要求202至283中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构之一：其中每个A1独立地为O、S、C＝O或NH；并且每个n独立地为1至20。

285.如权利要求202至283中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构之一：其中每个A1独立地为O、S、C＝O或NH；并且每个n独立地为1至20。

286.如权利要求202至283中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：

287.如权利要求202至283中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：

288.如权利要求202至283中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：

289.如权利要求202至283中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：

290.如权利要求202至283中任一项所述的化合物，其中所述支链基团包含醚。

291.如权利要求202至283中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：每个n独立地为1至20；并且

m为2至6。

292.如权利要求202至283中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：

293.如权利要求202至283中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：

294.如权利要求202至283中任一项所述的化合物，其中所述支链基团包含：其中每个j为1至3的整数；并且

其中每个n为1至20的整数。

295.如权利要求202至283中任一项所述的化合物，其中所述支链基团包含：

296.如权利要求202至295中任一项所述的化合物，其中每个系链选自以下：其中L选自磷连接基团和中性连接基团；

Z1为C(＝O)O-R2；

Z2为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；

R2为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；并且每个m1独立地为0至20，其中对于每个系链，至少一个m1大于0。

297.如权利要求202至295中任一项所述的化合物，其中每个系链选自以下：其中Z2为H或CH3；并且

每个m2独立地为0至20，其中对于每个系链，至少一个m2大于0。

298.如权利要求202至295中任一项所述的化合物，其中每个系链选自以下：其中n为1至12，并且

其中m为1至12。

299.如权利要求202至295中任一项所述的化合物，其中至少一个系链包含乙二醇。

300.如权利要求202至295或297中任一项所述的化合物，其中至少一个系链包含酰胺。

301.如权利要求202至295或297中任一项所述的化合物，其中至少一个系链包含聚酰胺。

302.如权利要求202至295或297中任一项所述的化合物，其中至少一个系链包含胺。

303.如权利要求202至295或297中任一项所述的化合物，其中至少两个系链彼此不同。

304.如权利要求202至295或297中任一项所述的化合物，其中所有系链彼此相同。

305.如权利要求202至304中任一项所述的化合物，其中每个系链选自以下：其中每个n独立地为1至20；并且

每个p为1至约6。

306.如权利要求202至304中任一项所述的化合物，其中每个系链选自以下：

307.如权利要求202至304中任一项所述的化合物，其中每个系链具有以下结构：其中每个n独立地为1至20。

308.如权利要求202至304中任一项所述的化合物，其中每个系链具有以下结构：

309.如权利要求202至304中任一项所述的化合物，其中所述系链具有选自以下的结构：其中每个n独立地为0、1、2、3、4、5、6或7。

310.如权利要求202至304中任一项所述的化合物，其中所述系链具有选自以下的结构：

311.如权利要求202至310中任一项所述的化合物，其中所述配体为半乳糖。

312.如权利要求202至310中任一项所述的化合物，其中所述配体为甘露糖-6-磷酸。

313.如权利要求202至310中任一项所述的化合物，其中每个配体选自以下：其中每个R1选自OH和NHCOOH。

314.如权利要求202至310中任一项所述的化合物，其中每个配体选自以下：

315.如权利要求202至310中任一项所述的化合物，其中每个配体具有以下结构：

316.如权利要求202至310中任一项所述的缀合反义化合物，其中每个配体具有以下结构：

317.如权利要求202至317中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含细胞靶向部分。

318.如权利要求317所述的化合物，其中所述缀合物基团包含具有以下结构的细胞靶向部分：其中每个n独立地为1至20。

319.如权利要求317所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：

320.如权利要求317所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：其中每个n独立地为1至20。

321.如权利要求317所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：

322.如权利要求317所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

323.如权利要求317所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

324.如权利要求317所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：

325.如权利要求317所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：

326.如权利要求37所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

327.如权利要求317所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：

328.如权利要求317所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

329.如权利要求317所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

330.如权利要求317所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

331.如权利要求317所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：如权利要求317所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：

332.如权利要求317所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：

333.如权利要求317所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：

334.如权利要求317所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：

335.如权利要求317所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

336.如权利要求317所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

337.如权利要求317所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

338.如权利要求317所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

339.如权利要求317所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：

340.如权利要求317所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

341.如权利要求317所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：

342.如权利要求317所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：其中每个Y选自O、S、取代或未取代的C1-C10烷基、氨基、取代的氨基、叠氮基、烯基或炔基。

343.如权利要求202至317中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：其中每个Y选自O、S、取代或未取代的C1-C10烷基、氨基、取代的氨基、叠氮基、烯基或炔基。

344.如权利要求317所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：其中每个Y选自O、S、取代或未取代的C1-C10烷基、氨基、取代的氨基、叠氮基、烯基或炔基。

345.如权利要求202至317中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：

346.如权利要求202至317中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：

347.如权利要求202至317中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：

348.如权利要求202-317中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：

349.如权利要求202至348中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含选自以下的可裂解部分：磷酸二酯、酰胺、脱氧核苷或酯。

350.如权利要求202至348中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含磷酸二酯可裂解部分。

351.如权利要求202至348中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团不包含可裂解部分，并且其中所述缀合物基团包含处于所述缀合物基团与所述寡核苷酸之间的硫代磷酸酯键联。

352.如权利要求202至351中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含酰胺可裂解部分。

353.如权利要求202至351中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含酯可裂解部分。

354.如权利要求202至353中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：其中每个n独立地为1至20；

Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

355.如权利要求202至353中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：其中每个n独立地为1至20；

Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

356.如权利要求202至353中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：其中每个n独立地为1至20；

Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；

Z为H或连接的固体载体；并且

Bx为杂环碱基部分。

357.如权利要求202至353中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：其中每个n独立地为1至20；

Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；

Z为H或连接的固体载体；并且

Bx为杂环碱基部分。

358.如权利要求202至353中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

359.如权利要求202至353中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

360.如权利要求202至353中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

361.如权利要求202至353中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

362.如权利要求202至353中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

363.如权利要求202至353中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

364.如权利要求202至353中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

365.如权利要求202至353中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

366.如权利要求202至353中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

367.如权利要求202至353中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

368.如权利要求202至353中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

369.如权利要求202至353中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

370.如权利要求202至353中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

371.如权利要求202至353中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

372.如权利要求354至371中任一项所述的化合物，其中Bx选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶。

373.如权利要求354至372中任一项所述的化合物，其中Bx为腺嘌呤。

374.如权利要求354至372中任一项所述的化合物，其中Bx为胸腺嘧啶。

375.如权利要求354至371中任一项所述的化合物，其中Q13为O(CH2)2-OCH3。

376.如权利要求354至371中任一项所述的化合物，其中Q13为H。

377.一种组合物，其包含如权利要求202至376中任一项所述的化合物或其盐、和药学上可接受的载体或稀释剂中的至少一种。

378.一种前药，其包含如权利要求202至376中任一项所述的化合物。

379.一种治疗受试者中HBV相关的疾病、病症或病状的方法，其包括向所述受试者施用如权利要求202至376中任一项所述的化合物、如权利要求377所述的组合物或如权利要求378所述的前药，其中所述疾病、病症或病状为黄疸、肝脏炎症、肝纤维化、炎症、肝硬化、肝衰竭、肝癌、弥漫性肝细胞炎症性疾病、噬血细胞综合征、血清性肝炎、HBV病毒血症或肝病相关的移植。

380.一种减少感染HBV的受试者中HBV抗原水平的方法，其包括向所述受试者施用如权利要求202至376中任一项所述的化合物、如权利要求377所述的组合物或如权利要求

378所述的前药，由此减少所述受试者中的HBV抗原水平。

381.如权利要求380所述的方法，其中所述HBV抗原为HBsAG。

382.如权利要求380所述的方法，其中所述HBV抗原为HBeAG。

383.一种化合物，其包含以下结构：其中X为包含GalNAc的缀合物基团。

384.一种化合物，其包含以下结构：

385.一种化合物，其包含以下结构：

386.一种化合物，其包含以下结构：

1 2 1 2 1

其中R为–OCH2CH2OCH3(MOE)并且R为H；或者R 和R 一起形成桥联，其中R 为–

2 1 2

O-并且R为–CH2-、-CH(CH3)-或-CH2CH2-，并且R和R 直接连接成使得所得桥联选自：-O-CH2-、-O-CH(CH3)-和–O-CH2CH2-；

3 4 3

并且对于同一环上的每一对R和R ，独立地对于每个环：R选自H和-OCH2CH2OCH3并且

4 3 4 3 4

R为H；或者R 和R 一起形成桥联，其中R 为–O-并且R 为–CH2-、-CH(CH3)-或-CH2CH2-并

3 4

且R和R 直接连接成使得所得桥联选自：-O-CH2-、-O-CH(CH3)-和–O-CH2CH2-；

5

并且R选自H和–CH3；

- -

并且Z选自S和O 。

387.一种化合物，其包含以下结构：其中X为包含GalNAc的缀合物基团。

388.一种化合物，其包含以下结构：

389.一种化合物，其包含以下结构：

390.一种化合物，其包含以下结构：其中R1为–OCH2CH2OCH3(MOE)并且R2为H；或者R1和R2一起形成桥联，其中R1为–O-并且R2为–CH2-、-CH(CH3)-或-CH2CH2-，并且R1和R2直接连接成使得所得桥联选自：-O-CH2-、-O-CH(CH3)-和–O-CH2CH2-；

并且对于同一环上的每一对R3和R4，独立地对于每个环：R3选自H和-OCH2CH2OCH3并且R4为H；或者R3和R4一起形成桥联，其中R3为–O-并且R4为–CH2-、-CH(CH3)-或-CH2CH2-并且R3和R4直接连接成使得所得桥联选自：-O-CH2-、-O-CH(CH3)-和–O-CH2CH2-；

并且R5选自H和–CH3；

并且Z选自S-和O-。

说明书全文

用于调节HBV和TTR表达的组合物和方法

[0001] 序列表
[0002] 本申请连同序列表一起以电子格式提交。序列表提供为在2014年5月1日创建的名称为BIOL0248WOSEQ_ST25.txt的文件，所述文件的大小为16Kb。电子格式的序列表中
的信息以引用的方式整体并入本文。
[0003] 发明背景
[0004] 反义技术背后的原理是反义化合物与靶核酸杂交并且调节靶核酸的量、活性和/或功能。例如在某些情况下，反义化合物导致靶标的转录或翻译改变。可通过例如靶mRNA
降解或占位型(occupancy-based)抑制来实现表达的所述调节。通过降解实现的RNA靶功
能的调节的实例为在与DNA样反义化合物杂交时靶RNA的基于RNA酶H的降解。通过靶标
降解实现的基因表达的调节的另一个实例为RNA干扰(RNAi)。RNAi是指通过利用RNA诱
导的沉默复合物(RISC)的机制实现的反义介导的基因沉默。RNA靶功能的调节的另一个
实例为通过占位型机制，如微小RNA天然采用的机制。微小RNA为调节蛋白质编码RNA的
表达的小型非编码RNA。反义化合物与微小RNA的结合防止微小RNA与其信使RNA靶标结
合，因此干扰微小RNA的功能。微小RNA模拟物可增强天然微小RNA功能。某些反义化合
物改变前体mRNA(pre-mRNA)的剪接。不管具体机制是什么，序列特异性均使反义化合物具
有作为用于靶标验证和基因功能化的工具以及用以选择性调节涉及疾病发病机理的基因
的表达的治疗剂的吸引力。
[0005] 反义技术是用于调节一种或多种特定基因产物的表达的有效手段并且可因此证明在许多治疗、诊断和研究应用中是特别有用的。可将化学修饰的核苷掺入反义化合
物中，以增强一种或多种性质，如核酸酶抗性、药物代谢动力学或对靶核酸的亲合力。在
1998年，反义化合物 (福米韦生(fomivirsen)；由Isis Pharmaceuticals
Inc.,Carlsbad,CA开发)为第一种从美国食品药品监督管理局(FDA)获得销售许可的反义
药物，并且目前为AIDS患者中巨细胞病毒(CMV)诱发的视网膜炎的治疗。
[0006] 新的化学修饰改进了反义化合物的效力和效能，揭示了经口递送的可能性并且增强了皮下施用、减少了副作用的可能性并在患者方便性上产生改进。增加反义化合物的效
力的化学修饰允许施用较低剂量，所述较低剂量减小了毒性的可能性并且降低治疗的总成
本。增加降解抗性的修饰使从体内清除较慢，从而允许较不频繁的给药。不同类型的化学
修饰可组合在一种化合物中以进一步优化化合物的效能。
[0007] 发明概述
[0008] 在某些实施方案中，本公开提供包含与核酸转录物互补的反义寡核苷酸的缀合反义化合物。在某些实施方案中，本公开提供缀合反义化合物。在某些实施方案中，本公开提供包括使细胞与包含与核酸转录物互补的反义寡核苷酸的缀合反义化合物接触的方法。在
某些实施方案中，本公开提供包括使细胞与包含反义寡核苷酸的缀合反义化合物接触并且
降低细胞中核酸转录物的量或活性的方法。
[0009] 去唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)先前已有描述。参见例如，Park等，PNAS第102卷，第47期，第17125-17129页(2005)。所述受体在肝脏细胞尤其是肝细胞上表达。此
外，已显示，包含三个N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)配体的聚簇的化合物能够结合ASGP-R，
从而导致化合物被摄取到细胞中。参见例如，Khorev等，Bioorganic and Medicinal
Chemistry,16,9，第5216-5231页(2008年5月)。因此，包含所述GalNAc聚簇的缀合物
已用来促进将某些化合物摄取到肝脏细胞(确切地是肝细胞)中。例如，已显示，某些含有
GalNAc的缀合物在体内增加双链siRNA化合物在肝脏细胞中的活性。在所述情况下，含有
GalNAc的缀合物通常连接至siRNA双链体的有义链。因为在反义链最终与靶核酸杂交之前
丢弃有义链，所以存在很少关于缀合物将干扰活性的问题。通常，缀合物连接至siRNA的有义链的3’末端。参见例如，美国专利8,106,022。本文描述的某些缀合物基团比先前描述
的缀合物基团更有活性和/或更易于合成。
[0010] 在本发明的某些实施方案中，缀合物连接至单链反义化合物，包括但不限于基于RNA酶H的反义化合物和改变前体mRNA靶核酸的剪接的反义化合物。在所述实施方案中，
缀合物应该保持连接至反义化合物足以提供益处(摄取到细胞中的改进)的时间，但是随
后应裂解或以其它方式不干扰对于活性所必需的后续步骤，如与靶核酸杂交以及与RNA酶
H或与和剪接或剪接调节相关的酶相互作用。这种性质平衡在单链反义化合物的环境中比
在其中缀合物可简单连接至有义链的siRNA化合物中更为重要。本文公开了与缺乏缀合物
的相同反义化合物相比在体内在肝脏细胞中具有改进效力的缀合的单链反义化合物。已知
这些化合物所需的性质平衡如改进的效力是令人惊奇的。
[0011] 在某些实施方案中，本文的缀合物基团包含可裂解部分。如所指出的，不希望受机制的束缚，合乎逻辑的是，缀合物应在化合物上保持足以提供摄取增强的时间，但其后，希望缀合物的一些部分或理想的是缀合物的全部均裂解，从而释放呈其最具活性形式的母体化合物(例如，反义化合物)。在某些实施方案中，可裂解部分为可裂解核苷。所述实施方
案通过经由一个或多个可裂解键(如具有磷酸二酯键联的那些)通过核苷使缀合物的其余
部分(聚簇)连接至反义寡核苷酸来利用细胞中的内源性核酸酶。在某些实施方案中，聚
簇通过磷酸二酯键联与可裂解核苷结合。在某些实施方案中，可裂解核苷通过磷酸二酯键
联连接至反义寡核苷酸(反义化合物)。在某些实施方案中，缀合物基团可包含两个或三个
可裂解核苷。在所述实施方案中，所述可裂解核苷通过可裂解键(如具有磷酸二酯键联的
那些)彼此连接，连接至反义化合物和/或连接至聚簇。本文的某些缀合物不包含可裂解
核苷而是包含可裂解键。显示了通过至少一个在细胞中易受裂解的键(可裂解键)来提供
缀合物自寡核苷酸的充分裂解。
[0012] 在某些实施方案中，缀合反义化合物为前药。向动物施用所述前药并且其最终代谢为更具活性的形式。例如，使缀合反义化合物裂解以去除缀合物的全部或部分，从而产生缺乏缀合物的全部或一些的反义化合物的活性(或更具活性)形式。
[0013] 在某些实施方案中，缀合物连接在寡核苷酸的5’末端。某些所述5’-缀合物比具有连接在3’末端的类似缀合物基团的对应物更有效地裂解。在某些实施方案中，改进的活性可与改进的裂解相关。在某些实施方案中，在5’末端包含缀合物的寡核苷酸比在3’
末端包含缀合物的寡核苷酸具有更大的效能(参见，例如，实施例56、81、83和84)。此外，
5’-连接允许更简单的寡核苷酸合成。通常，在固体载体上在3’至5’方向上合成寡核苷
酸。为了制得3’-缀合寡核苷酸，通常将预先缀合的3’核苷连接至固体载体，然后按常规构造寡核苷酸。然而，将所述缀合核苷连接至固体载体增加了合成的复杂性。此外，使用所述方法，缀合物则存在于寡核苷酸的整个合成中并且在后续步骤期间可能发生降解或可能
限制可使用的反应和试剂的种类。使用本文针对5’-缀合寡核苷酸所述的结构和技术，可
使用标准自动化技术合成寡核苷酸并且与最后(最5’)的核苷一起或在寡核苷酸从固体载
体上裂解之后引入缀合物。
[0014] 鉴于现有技术和本公开，普通技术人员可简单制得本文的任何缀合物和缀合寡核苷酸。此外，本文公开的某些所述缀合物和缀合寡核苷酸的合成更简单和/或需要更少步
骤，并且因此比先前公开的缀合物的合成更低廉，从而在制造上提供优点。例如，某些缀合物基团的合成由较少合成步骤组成，从而导致相对先前所述的缀合物基团产率增加。缀
合物基团如实施例46中的GalNAc3-10和实施例48中的GalNAc3-7比先前描述的缀合
物简单得更多，所述先前描述的缀合物如需要装配更多化学中间体的U.S.8,106,022或
U.S.7,262,177中所述的那些。因此，本文描述的这些和其它缀合物在与任何寡核苷酸一
起使用方面优于先前描述的化合物，所述寡核苷酸包括单链寡核苷酸和双链寡核苷酸(例
如，siRNA)的任一链。
[0015] 类似地，本文公开了仅具有一个或两个GalNAc配体的缀合物基团。如所示出的，所述缀合物基团改进了反义化合物的活性。所述化合物比包含三个GalNAc配体的缀合物
更易于制备。包含一个或两个GalNAc配体的缀合物基团可连接至任何反义化合物，包括单
链寡核苷酸和双链寡核苷酸(例如，siRNA)的任一链。
[0016] 在某些实施方案中，本文的缀合物大致上不改变耐受性的某些量度。例如，本文显示缀合反义化合物不比未缀合的母体化合物更具有免疫原性。因为效力得到改进，所以其中耐受性保持相同(或甚至与效力增益相比耐受性实际上仅略微变差)的实施方案对于治
疗具有改进的性质。
[0017] 在某些实施方案中，缀合允许人们以在不存在缀合的情况下具有较不吸引人的结果的方式改变反义化合物。例如，在某些实施方案中，用磷酸二酯键联替代完全的硫代磷酸酯反义化合物的一个或多个硫代磷酸酯键联造成耐受性的一些量度的改进。例如，在某些
情况下，具有一个或多个磷酸二酯的所述反义化合物比其中每个键联为硫代磷酸酯的相同
化合物具有更小的免疫原性。然而，在某些情况下，如实施例26中所示，用磷酸二酯键联同样替代一个或多个硫代磷酸酯键联还造成细胞摄取减少和/或效力损失。在某些实施方案
中，本文描述的缀合反义化合物耐受所述键联变化，其中当与缀合的完全硫代磷酸酯对应
物相比时摄取和效力损失很少或没有损失。事实上，在某些实施方案中，例如在实施例44、
57、59和86中，包含缀合物和至少一个磷酸二酯核苷间键联的寡核苷酸实际上表现出增加
的体内效力，即使是相对于也包含相同缀合物的完全硫代磷酸酯对应物来说。此外，因为缀合导致摄取/效力的实质增加，所以为实现改进的耐受性，所述实质增益的些微损失是可
接受的。因此，在某些实施方案中，缀合反义化合物包含至少一个磷酸二酯键联。
[0018] 在某些实施方案中，本文的反义化合物的缀合造成肝细胞中递送、摄取和活性的增加。因此，向肝脏组织递送更多的化合物。然而，在某些实施方案中，仅递送增加不能解释活性的整体增加。在某些所述实施方案中，更多化合物进入肝细胞。在某些实施方案中，即使是肝细胞摄取增加也不能解释活性的整体增加。在所述实施方案中，缀合化合物的生
产性(productive)摄取增加。例如，如实施例102中所示，相对于非实质细胞，含有GalNAc的缀合物的某些实施方案增加了反义寡核苷酸在肝细胞中的富集。此富集对靶向在肝细胞
中表达的基因的寡核苷酸是有益的。
[0019] 在某些实施方案中，本文的缀合反义化合物造成肾暴露减少。例如，如实施例20中所示，包含含有GalNAc的缀合物的某些实施方案的反义寡核苷酸在肾中的浓度低于缺
乏含有GalNAc的缀合物的反义寡核苷酸的浓度。这具有若干有益的治疗意义。对于不想
要在肾中的活性的治疗适应症(indication)，对肾的暴露具有肾毒性的风险而没有相应的
益处。此外，肾中的高浓度通常导致化合物流失至尿液，从而导致更快的清除。因此对于非肾靶标，肾积累是不希望的。
[0020] 在某些实施方案中，本公开提供由下式表示的缀合反义化合物：
[0021]
[0022] 其中
[0023] A为反义寡核苷酸；
[0024] B为可裂解部分
[0025] C为缀合物接头
[0026] D为支链基团
[0027] 每个E为系链；
[0028] 每个F为配体；并且
[0029] q为1与5之间的整数。
[0030] 在上图和在本文的类似图中，支链基团“D”支化多次，所述次数是适应由“q”指示的(E-F)基团数目所必需的。因此，在q＝1时，式为：
[0031] A-B-C-D-E-F
[0032] 在q＝2时，式为：
[0033]
[0034] 在q＝3时，式为：
[0035]
[0036] 在q＝4时，式为：
[0037]
[0038] 在q＝5时，式为：
[0039]
[0040] 在某些实施方案中，提供具有以下结构的缀合反义化合物：
[0041]
[0042] 在某些实施方案中，提供具有以下结构的缀合反义化合物：
[0043]
[0044] 在某些实施方案中，提供具有以下结构的缀合反义化合物：
[0045]
[0046] 在某些实施方案中，提供具有以下结构的缀合反义化合物：
[0047]
[0048] 在具有多于一个具体变量(例如，多于一个“m”或“n”)的实施方案中，除非另外指出，否则独立选择每个所述具体变量。因此，对于具有多于一个n的结构，独立地选择每个n，所以它们可为或可不为彼此相同的。
[0049] 详述
[0050] 应该理解，上述一般描述和以下详细描述均仅为示例性和解释性的并且不限制本公开。在本文中，除非另外确切说明，否则单数的使用包括复数。如本文所使用，除非另外说明，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及其它形式如“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不是限制性的。另外，除非另外确切说明，否则术语如“元件”或“组分”既涵盖包含一个单元的元件和组分，又涵盖包含多于一个子单元的元件和组分。
[0051] 本文所使用的小节标题仅出于组织性目的并且不解释为限制所描述的主题。本申请中引用的所有文件或文件的部分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍和论文，均出于任何目的特此明确地以引用的方式整体并入。
[0052] A.定义
[0053] 除非提供确切的定义，否则结合本文所描述的分析化学、合成有机化学和医药化学所使用的命名法和这些化学领域的工序和技术为本领域熟知和常用的那些。标准
技术可用于化学合成和化学分析。某些所述技术和工序可例如见于由Sangvi和Cook
编著的“Carbohydrate Modifications in Antisense Research”,American Chemical
Society,Washington D.C.,1994；"Remington's Pharmaceutical Sciences,"Mack
Publishing Co.,Easton,Pa.，第21版，2005；和由Stanley T.Crooke编著的“Antisense Drug Technology,Principles,Strategies,and Applications”,CRC Press,Boca
Raton,Florida；以及Sambrook等，“Molecular Cloning,A laboratory Manual”，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989，所述参考文献出于任何目的特此以引用的
方式并入。如果允许，本公开通篇提及的所有专利、申请、已公布的申请和其它出版物以及其它数据以引用的方式整体并入本文。
[0054] 除非另外指出，否则以下术语具有以下含义：
[0055] 如本文所使用，“核苷”意指包含核碱基部分和糖部分的化合物。核苷包括但不限于天然存在的核苷(如在DNA和RNA中发现的)和修饰核苷。核苷可连接至磷酸部分。
[0056] 如本文所使用，“化学修饰”意指当与天然存在的对应物相比时化合物的化学差异。寡核苷酸的化学修饰包括核苷修饰(包括糖部分修饰和核碱基修饰)和核苷间键联修
饰。就寡核苷酸而言，化学修饰不包括仅在核碱基序列上的差异。
[0057] 如本文所使用，“呋喃糖基”意指包含5元环的结构，所述5元环包含四个碳原子和一个氧原子。
[0058] 如本文所使用，“天然存在的糖部分”意指如在天然存在的RNA中发现的呋喃核糖基或如在天然存在的DNA中发现的脱氧呋喃核糖基。
[0059] 如本文所使用，“糖部分”意指核苷的天然存在的糖部分或修饰的糖部分。
[0060] 如本文所使用，“修饰的糖部分”意指取代的糖部分或糖替代物。
[0061] 如本文所使用，“取代的糖部分”意指并非天然存在的糖部分的呋喃糖基。取代的糖部分包括但不限于在2’-位、3’-位、5’-位和/或4’-位上包含取代基的呋喃糖基。某些取代的糖部分为双环糖部分。
[0062] 如本文所使用，“2’-取代的糖部分”意指在2’-位上包含除H或OH之外的取代基的呋喃糖基。除非另外指出，否则2’-取代的糖部分不是双环糖部分(即，2’-取代的糖部分的2’-取代基与呋喃糖基环的另一个原子不形成桥联。
[0063] 如本文所使用，“MOE”意指-OCH2CH2OCH3。
[0064] 如本文所使用，“2’-F核苷”是指包含在2’位上包含氟的糖的核苷。除非另外指出，否则2’-F核苷中的氟在核糖位上(替代天然核糖的OH)。
[0065] 如本文所使用，术语“糖替代物”意指如下结构：所述结构不包含呋喃糖基并且能够替代核苷的天然存在的糖部分，使得所得到的核苷亚基能够连接在一起和/或与其它核苷连接以形成能够与互补的低聚化合物杂交的低聚化合物。所述结构包括如下环：所述环
包含与呋喃糖基(例如，4元环、6元环或7元环)不同的原子数；用非氧原子(例如，碳、硫
或氮)替代呋喃糖基的氧；或原子数和氧替代均有所变化。所述结构还可包含对应于对于
取代的糖部分所描述的那些取代的取代(例如，任选包含另外取代基的6元碳环双环糖替
代物)。糖替代物还包括更复杂的糖代替物(例如，肽核酸的非环系统)。糖替代物包括但
不限于吗啉代、环己烯基和环己六醇。
[0066] 如本文所使用，“双环糖部分”意指包含4至7元环的修饰的糖部分(包括但不限于呋喃糖基)，所述糖部分包含连接4至7元环的两个原子以形成第二个环，从而产生双环
结构的桥联。在某些实施方案中，4至7元环为糖环。在某些实施方案中，4至7元环为呋
喃糖基。在某些所述实施方案中，桥联连接了呋喃糖基的2’-碳和4’-碳。
[0067] 如本文所使用，“核苷酸”意指还包含磷酸酯连接基团的核苷。如本文所使用，“连接核苷”可或可不通过磷酸酯键联连接并且因此包括但不限于“连接的核苷酸”。如本文所使用，“连接核苷”为以连续顺序连接的核苷(即，在那些连接的核苷之间不存在另外的核苷)。
[0068] 如本文所使用，“核碱基”意指可连接至糖部分以形成能够掺入到寡核苷酸中的核苷的原子基团，并且其中原子基团能够与另一个寡核苷酸或核酸的互补的天然存在的核碱基键合。核碱基可为天然存在的或可为修饰的。
[0069] 如本文所使用，术语“未修饰的核碱基”或“天然存在的核碱基”意指RNA或DNA的天然存在的杂环核碱基：嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)；以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)(包括5-甲基C)和尿嘧啶(U)。
[0070] 如本文所使用，“修饰核碱基”意指并非天然存在的核碱基的任何核碱基。
[0071] 如本文所使用，“修饰核苷”意指与天然存在的RNA或DNA核苷相比包含至少一个化学修饰的核苷。修饰核苷包含修饰的糖部分和/或修饰的核碱基。
[0072] 如本文所使用，“双环核苷”或“BNA”意指包含双环糖部分的核苷。
[0073] 如本文所使用，“约束的乙基核苷”或“cEt”意指包含双环糖部分的核苷，所述双环糖部分包含4’-CH(CH3)-O-2’桥联。
[0074] 如本文所使用，“锁核酸核苷”或“LNA”意指包含双环糖部分的核苷，所述双环糖部分包含4’-CH2-O-2’桥联。
[0075] 如本文所使用，“2’-取代的核苷”意指在2’-位上包含除H或OH之外的取代基的核苷。除非另外指出，否则2’-取代的核苷不是双环核苷。
[0076] 如本文所使用，“脱氧核苷”意指包含如在天然存在的脱氧核糖核苷(DNA)中所发现的2’-H呋喃糖基糖部分的核苷。在某些实施方案中，2’-脱氧核苷可包含修饰的核碱基或可包含RNA核碱基(例如，尿嘧啶)。
[0077] 如本文所使用，“寡核苷酸”意指包含多个连接核苷的化合物。在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个未修饰的核糖核苷(RNA)和/或未修饰的脱氧核糖核苷(DNA)和/或一个或多个修饰核苷。
[0078] 如本文所使用，“寡核苷”意指其中没有核苷间键联含有磷原子的寡核苷酸。如本文所使用，寡核苷酸包含寡核苷。
[0079] 如本文所使用，“修饰寡核苷酸”意指包含至少一个修饰核苷和/或至少一个修饰的核苷间键联的寡核苷酸。
[0080] 如本文所使用，“键联”或“连接基团”意指将两个或更多个其它原子基团连接在一起的原子基团。
[0081] 如本文所使用，“核苷间键联”意指寡核苷酸中相邻核苷之间的共价键联。
[0082] 如本文所使用，“天然存在的核苷间键联”意指3'至5'磷酸二酯键联。
[0083] 如本文所使用，“修饰的核苷间键联”意指除了天然存在的核苷间键联之外的任何核苷间键联。
[0084] 如本文所使用，“末端核苷间键联”意指寡核苷酸或其限定区域的最后两个核苷之间的键联。
[0085] 如本文所使用，“磷连接基团”意指包含磷原子的连接基团。磷连接基团包括但不限于具有下式的基团：
[0086]
[0087] 其中：
[0088] Ra和Rd各自独立地为O、S、CH2、NH或NJ1，其中J1为C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；
[0089] Rb为O或S；
[0090] Rc为OH、SH、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、氨基或取代的氨基；并且
[0091] J1为Rb为O或S。
[0092] 磷连接基团包括但不限于磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、磷酸三酯、硫羰基烷基磷酸三酯以及硼烷磷酸酯。
[0093] 如本文所使用，“核苷间磷连接基团”意指直接连接两个核苷的磷连接基团。
[0094] 如本文所使用，“非核苷间磷连接基团”意指不直接连接两个核苷的磷连接基团。在某些实施方案中，非核苷间磷连接基团将核苷连接至除核苷之外的基团。在某些实施方
案中，非核苷间磷连接基团连接两个基团，所述两个基团中没有一个为核苷。
[0095] 如本文所使用，“中性连接基团”意指不带电荷的连接基团。中性连接基团包括但不限于磷酸三酯、甲基膦酸酯、MMI(-CH2-N(CH3)-O-)、酰胺-3(-CH2-C(＝O)-N(H)-)、酰胺-4(-CH2-N(H)-C(＝O)-)、甲乙缩醛(-O-CH2-O-)以及硫代甲乙缩醛(-S-CH2-O-)。另
外的中性连接基团包括包含硅氧烷(二烷基硅氧烷)、羧酸酯、羧酰胺、硫化物、磺酸酯和
酰胺的非离子键联(参见例如：Carbohydrate Modifications in Antisense Research；
Y.S.Sanghvi和P.D.Cook编著ACS Symposium Series 580；第3和4章，(第40-65页))。
另外的中性连接基团包括包含混合的N、O、S和CH2组成部分的非离子键联。
[0096] 如本文所使用，“核苷间中性连接基团”意指直接连接两个核苷的中性连接基团。
[0097] 如本文所使用，“非核苷间中性连接基团”意指不直接连接两个核苷的中性连接基团。在某些实施方案中，非核苷间中性连接基团将核苷连接至除核苷之外的基团。在某些实施方案中，非核苷间中性连接基团连接两个基团，所述两个基团中没有一个为核苷。
[0098] 如本文所使用，“低聚化合物”意指包含两个或更多个子结构的聚合结构。在某些实施方案中，低聚化合物包含寡核苷酸。在某些实施方案中，低聚化合物包含一个或多个缀合物基团和/或端基。在某些实施方案中，低聚化合物由寡核苷酸组成。低聚化合物还包括天然存在的核酸。在某些实施方案中，低聚化合物包含一个或多个连接的单体亚基的骨
架，其中每个连接的单体亚基直接或间接地连接至杂环碱基部分。在某些实施方案中，低聚化合物还可包括没有连接至杂环碱基部分的单体亚基，从而提供无碱基位点。在某些实施
方案中，连结单体亚基、糖部分或糖替代物以及杂环碱基部分的键联可独立地修饰。在某些实施方案中，可或可不包括杂环碱基的键联-糖单元可被模拟物如肽核酸中的单体取代。
[0099] 如本文所使用，“端基”意指连接至寡核苷酸的3’末端或5’末端中的任一或两者的一个或多个原子。在某些实施方案中，端基为缀合物基团。在某些实施方案中，端基包含一个或多个端基核苷。
[0100] 如本文所使用，“缀合物”或“缀合物基团”意指结合至寡核苷酸或低聚化合物的原子或原子基团。通常，缀合物基团改变它们所连接至的化合物的一种或多种性质，包括但不限于药效学、药物代谢动力学、结合、吸收、细胞分布、细胞摄取、电荷和/或清除性质。
[0101] 如本文所使用，在缀合物基团背景下的“缀合物接头”或“接头”意指包含任何原子或原子基团的缀合物基团的一部分并且其(1)将寡核苷酸共价连接至缀合物基团的另一个部分或(2)共价连接缀合物基团的两个或更多个部分。
[0102] 缀合物基团在本文中示为基团，提供用于形成至低聚化合物如反义寡核苷酸的共价连接的键。在某些实施方案中，低聚化合物上的连接点为低聚化合物的3’末端核苷的
3'-羟基的3'-氧原子。在某些实施方案中，低聚化合物上的连接点为低聚化合物的5’末
端核苷的5'-羟基的5'-氧原子。在某些实施方案中，用于形成至低聚化合物的连接的键
为可裂解键。在某些所述实施方案中，所述可裂解键构成可裂解部分的全部或部分。
[0103] 在某些实施方案中，缀合物基团包含可裂解部分(例如，可裂解键或可裂解核苷)和碳水化合物聚簇部分，如GalNAc聚簇部分。所述碳水化合物聚簇部分包含：靶向部分
和任选地缀合物接头。在某些实施方案中，通过配体的数目和身份来鉴定碳水化合物聚
簇部分。例如，在某些实施方案中，碳水化合物聚簇部分包含3个GalNAc基团并且命名
为“GalNAc3”。在某些实施方案中，碳水化合物聚簇部分包含4个GalNAc基团并且命名为
“GalNAc4”。本文描述了具体的碳水化合物聚簇部分(具有具体系链、支链基团和缀合物
接头基团)并且由后面跟着下标“a”的罗马数字命名。因此“GalNac3-1a”是指具有3个
GalNac基团和明确鉴定的系链、支链基团和连接基团的缀合物基团的具体碳水化合物聚簇
部分。所述碳水化合物聚簇片段通过可裂解部分(如可裂解键或可裂解核苷)连接至低聚
化合物。
[0104] 如本文所使用，“可裂解部分”意指能够在生理条件下分裂的键或基团。在某些实施方案中，可裂解部分在细胞或亚细胞区室(如溶酶体)内部裂解。在某些实施方案中，可裂解部分通过内源性酶如核酸酶裂解。在某些实施方案中，可裂解部分包含具有一个、两
个、三个、四个或多于四个可裂解键的原子基团。
[0105] 如本文所使用，“可裂解键”意指能够被分裂的任何化学键。在某些实施方案中，可裂解键选自以下：酰胺、聚酰胺、酯、醚、磷酸二酯的一个或两个酯、磷酸酯、氨基甲酸酯、二硫化物或肽。
[0106] 如本文所使用，“碳水化合物聚簇”意指具有连接至支架或接头基团的一个或多个碳水化合物残基的化合物。(对于碳水化合物缀合物聚簇的实例，参见，
例 如，Maier 等，“Synthesis of Antisense Oligonucleotides Conjugated to a
Multivalent Carbohydrate Cluster for Cellular Targeting,”Bioconjugate
Chemistry,2003,(14):18-29，所述参考文献以引用的方式整体并入本文，或Rensen等，
“Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids
for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asiaglycoprotein Receptor,”J.Med.Chem.2004,(47):5798-5808)。
[0107] 如本文所使用，“碳水化合物衍生物”意指可使用碳水化合物作为起始材料或中间体合成的任何化合物。
[0108] 如本文所使用，“碳水化合物”意指天然存在的碳水化合物、修饰的碳水化合物或碳水化合物衍生物。
[0109] 如本文所使用，“保护基”意指本领域技术人员已知的任何化合物或保护基。保护基的非限制性实例可见于"Protective Groups in Organic Chemistry",T.W.Greene、
P.G.M.Wuts,ISBN 0-471-62301-6,John Wiley&Sons,Inc,New York，所述参考文献以引用
的方式整体并入本文。
[0110] 如本文所使用，“单链的”意指不与其补体杂交并且缺乏足够自身互补性以形成稳定自身双链体的低聚化合物。
[0111] 如本文所使用，“双链的”意指彼此杂交的低聚化合物对或形成发夹结构的单个自身互补的低聚化合物。在某些实施方案中，双链低聚化合物包含第一和第二低聚化合物。
[0112] 如本文所使用，“反义化合物”意指包含寡核苷酸或由寡核苷酸组成的化合物，所述寡核苷酸的至少一部分与其能够杂交的靶核酸互补，从而导致至少一种反义活性。
[0113] 如本文所使用，“反义活性”意指可归因于反义化合物与其靶核酸的杂交的任何可检测和/或可测量的变化。在某些实施方案中，反义活性包括靶核酸转录物(例如mRNA)的量或活性的调节。在某些实施方案中，反义活性包括前体mRNA的剪接的调节。
[0114] 如本文所使用，“基于RNA酶H的反义化合物”意指反义化合物，其中反义化合物的至少一些反义活性可归因于反义化合物与靶核酸的杂交和随后的RNA酶H对靶核酸的裂
解。
[0115] 如本文所使用，“基于RISC的反义化合物”意指反义化合物，其中反义化合物的至少一些反义活性可归因于RNA诱导的沉默复合物(RISC)。
[0116] 如本文所使用，“检测”或“测量”意指用于进行检测或测量的测试或测定。所述检测和/或测量可能得到零值。因此，如果用于检测或测量的测试得到没有活性(活性为零)的发现，尽管如此，也已经进行了检测或测量活性的步骤。
[0117] 如本文所使用，“可检测和/或可测量的活性”意指不为零的在统计学上显著的活性。
[0118] 如本文所使用，“基本上未变化”意指具体地相对于变化更多的另一个参数，具体参数几乎没有或没有变化。在某些实施方案中，当参数变化小于5％时，所述参数基本上未变化。在某些实施方案中，如果参数变化小于两倍而另一个参数变化至少十倍，则所述参数基本上未变化。例如，在某些实施方案中，反义活性为靶核酸的量的变化。在某些所述实施方案中，如果非靶核酸的量比靶核酸的量变化的小得多，那么所述非靶核酸的量基本上未变化，但变化不必需为零。
[0119] 如本文所使用，“表达”意指基因最终产生蛋白质的过程。表达包括但不限于转录、转录后修饰(例如，剪接、聚腺苷酸化、添加5’-帽)以及翻译。
[0120] 如本文所使用，“靶核酸”意指反义化合物意图与其杂交以产生希望的反义活性的核酸分子。反义寡核苷酸与其靶核酸具有足够的互补性以允许在生理条件下杂交。
[0121] 如本文所使用，在提到核碱基时的“核碱基互补性”或“互补性”意指能够与另一个核碱基碱基配对的核碱基。例如，在DNA中，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)互补。例如，在RNA中，腺嘌呤(A)与尿嘧啶(U)互补。在某些实施方案中，互补核碱基意指能够与其靶核
酸的核碱基碱基配对的反义化合物的核碱基。例如，如果反义化合物的某个位置上的核碱
基能够与靶核酸的某个位置上的核碱基氢键合，那么寡核苷酸与靶核酸之间的氢键合的位
置被认为在所述核碱基对上是互补的。包含某些修饰的核碱基可维持与对应核碱基配对的
能力，并且因此仍能够具有核碱基互补性。
[0122] 如本文所使用，关于核碱基的“非互补性”意指彼此不形成氢键的核碱基对。
[0123] 如本文所使用，关于低聚化合物(例如，连接核苷、寡核苷酸或核酸)的“互补性”意指所述低聚化合物或其区域与另一个低聚化合物或其区域通过核碱基互补性杂交的能力。互补的低聚化合物不必需在每个核苷上均具有核碱基互补性。相反，容忍一些错配。在某些实施方案中，互补的低聚化合物或区域在70％的核碱基上互补(70％互补)。在某些实
施方案中，互补的低聚化合物或区域80％互补。在某些实施方案中，互补的低聚化合物或
区域90％互补。在某些实施方案中，互补的低聚化合物或区域95％互补。在某些实施方案
中，互补的低聚化合物或区域100％互补。
[0124] 如本文所使用，“错配”意指当第一和第二低聚化合物对准时，不能够与第二低聚化合物的对应位置上的核碱基配对的第一低聚化合物的核碱基。第一和第二低聚化合物中的任一或两者可为寡核苷酸。
[0125] 如本文所使用，“杂交”意指互补低聚化合物(例如，反义化合物及其靶核酸)的配对。虽然不限于具体机制，但配对的最常见机制涉及氢键合，所述氢键合可为互补核碱基之间的Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键合。
[0126] 如本文所使用，“特异性杂交”意指低聚化合物与一个核酸位点杂交比它与另一个核酸位点杂交具有更大亲合力的能力。
[0127] 如本文所使用，关于寡核苷酸或其部分的“完全互补”意指寡核苷酸或其部分的每个核碱基均能够与互补核酸或其邻接部分的核碱基配对。因此，完全互补区在任一链中均不包含错配或未杂交的核碱基。
[0128] 如本文所使用，“互补百分比”意指与靶核酸的等长部分互补的低聚化合物的核碱基的百分数。通过将与靶核酸中的对应位置上的核碱基互补的低聚化合物的核碱基数除以低聚化合物的总长度来计算互补百分比。
[0129] 如本文所使用，“同一性百分比”意指与第二核酸中的对应位置上的核碱基相同类型(不依赖于化学修饰)的第一核酸中的核碱基数除以第一核酸中的核碱基总数。
[0130] 如本文所使用，“调节”意指当与调节前的分子、功能或活性的量或质量相比时分子、功能或活性的量或质量的变化。例如，调节包括基因表达的变化，增加(刺激或诱导)或减少(抑制或降低)。作为另一个实例，表达的调节可包括前体mRNA加工的剪接位点选择的变化，从而导致与不存在调节情况下的量相比的具体剪接变体的绝对或相对量的变化。
[0131] 如本文所使用，“化学基序”意指寡核苷酸或其区域中的化学修饰的模式(pattern)。可通过寡核苷酸的某些核苷和/或某些连接基团上的修饰来定义基序。
[0132] 如本文所使用，“核苷基序”意指寡核苷酸或其区域中的核苷修饰的模式。这样的寡核苷酸的键联可为修饰或未修饰的。除非另外指出，否则本文中仅描述核苷的基序意图为核苷基序。因此，在所述情况下，键联不受限制。
[0133] 如本文所使用，“糖基序”意指寡核苷酸或其区域中的糖修饰的模式。
[0134] 如本文所使用，“键联基序”意指寡核苷酸或其区域中的键联修饰的模式。这样的寡核苷酸的核苷可为修饰或未修饰的。除非另外指出，否则本文中仅描述键联的基序意图为键联基序。因此，在所述情况下，核苷不受限制。
[0135] 如本文所使用，“核碱基修饰基序”意指沿着寡核苷酸的核碱基的修饰的模式。除非另外指出，否则核碱基修饰基序不依赖于核碱基序列。
[0136] 如本文所使用，“序列基序”意指沿着寡核苷酸或其部分布置的核碱基的模式。除非另外指出，否则序列基序不依赖于化学修饰并且因此可具有化学修饰的任何组合，包括没有化学修饰。
[0137] 如本文所使用，关于核苷或一种“类型”的核苷的“修饰类型”意指核苷的化学修饰并且包括修饰和未修饰的核苷。因此，除非另外指出，否则“具有第一类型的修饰的核苷”可为未修饰的核苷。
[0138] 如本文所使用，“不同修饰的”意指彼此不同的化学修饰或化学取代基，包括不存在修饰。因此，例如，MOE核苷和未修饰的DNA核苷为“不同修饰的”，即使DNA核苷为未修饰的。同样，DNA和RNA为“不同修饰的”，即使这两者均为天然存在的未修饰的核苷。相同但包含不同核碱基的核苷不为不同修饰的。例如，包含2’-OMe修饰的糖和未修饰的腺嘌呤核碱基的核苷和包含2’-OMe修饰的糖和未修饰的胸腺嘧啶核碱基的核苷不为不同修饰
的。
[0139] 如本文所使用，“相同类型的修饰”是指彼此相同的修饰，包括不存在修饰。因此，例如，两个未修饰的DNA核苷具有“相同类型的修饰”，即使DNA核苷为未修饰的。具有相同类型修饰的所述核苷可包含不同的核碱基。
[0140] 如本文所使用，“单独区域”意指寡核苷酸的部分，其中任何相邻部分的化学修饰或化学修饰的基序包括至少一个差异以允许单独的区域彼此区分。
[0141] 如本文所使用，“药学上可接受的载体或稀释剂”意指适合用于向动物施用的任何物质。在某些实施方案中，药学上可接受的载体或稀释剂为无菌盐水。在某些实施方案中，所述无菌盐水为药用级盐水。
[0142] 如本文所使用，术语“代谢病症”意指主要特征在于代谢失调–与食物分解产生能量相关的一系列复杂化学反应的疾病或病状。
[0143] 如本文所使用，术语“心血管病症”意指主要特征在于心脏或血管功能受损的疾病或病状。
[0144] 如本文所使用，术语“单环系统或多环系统”意指包括选自单一或多环基团环系统的所有环系统，其中环稠合或连接并且意图包括单独地选自以下的单环系统和混合环系
统：脂肪族、脂环族、芳基、杂芳基、芳烷基、芳基烷基、杂环、杂芳基、杂芳香族和杂芳基烷基。所述单环结构和多环结构可含有环，所述环各自具有相同水平的饱和或各自独立地具
有不同程度的饱和，包括完全饱和、部分饱和或完全不饱和。每个环可包含选自C、N、O和S的环原子以产生杂环以及仅包含C环原子的环，所述环可存在于混合基序中，例如像苯并
咪唑，其中一个环仅具有碳环原子并且稠环具有两个氮原子。单环系统或多环系统可进一
步被取代基取代，例如像具有两个连接至环中的一个的＝O基团的邻苯二甲酰亚胺。单环
系统或多环系统可使用各种策略连接至母体分子，如直接通过环原子、通过多个环原子稠
合、通过取代基或通过双官能连接部分。
[0145] 如本文所使用，“前药”意指化合物的无活性或具有较小活性的形式，当向受试者施用时，所述前药被代谢形成活性或更具活性的化合物(例如，药物)。
[0146] 如本文所使用，“取代基(substituent)”和“取代基(substituent group)”意指替代指定母体化合物的原子或基团的原子或基团。例如，修饰核苷的取代基为不同于在天然存在的核苷中发现的原子或基团的任何原子或基团(例如，修饰的2’-取代基为在核苷
的2’-位上的除H或OH之外的任何原子或基团)。取代基可为保护或未保护的。在某些实
施方案中，本公开的化合物在母体化合物的一个位置上或多于一个位置上具有取代基。取
代基还可进一步被其它取代基取代并且可直接连接或通过连接基团如烷基或烃基连接至
母体化合物。
[0147] 同样，如本文所使用，关于化学官能团的“取代基”意指不同于通常存在于指定官能团中的原子或原子基团的原子或原子基团。在某些实施方案中，取代基替代官能团的氢原子(例如，在某些实施方案中，取代的甲基的取代基为替代未取代的甲基的一个氢原子
的除氢之外的原子或基团)。除非另外指出，否则适合用作取代基的基团包括但不限于卤
素、羟基、烷基、烯基、炔基、酰基(-C(O)Raa)、羧基(-C(O)O-Raa)、脂族基团、脂环基、烷氧基、取代的氧基(-O-Raa)、芳基、芳烷基、杂环基、杂芳基、杂芳基烷基、氨基(-N(Rbb)(Rcc))、亚氨基(＝NRbb)、酰胺基(-C(O)N(Rbb)(Rcc)或-N(Rbb)C(O)Raa)、叠氮基(-N3)、硝基(-NO2)、氰基(-CN)、脲基(carbamido)(-OC(O)N(Rbb)(Rcc)或-N(Rbb)C(O)ORaa)、脲基(ureido)(-N(Rbb)C(O)N(Rbb)(Rcc))、硫脲基(-N(Rbb)C(S)N(Rbb)(Rcc))、胍基(-N(Rbb)C(＝NRbb)N(Rbb)(Rcc))、脒基(-C(＝NRbb)N(Rbb)(Rcc)或-N(Rbb)C(＝NRbb)(Raa))、巯基(-SRbb)、亚硫酰基(-S(O)Rbb)、磺酰基(-S(O)2Rbb)以及氨磺酰基(-S(O)2N(Rbb)(Rcc)-或-N(Rbb)S(O)2Rbb)。其中每个Raa、Rbb和Rcc独立地为H、任选连接的化学官能团或另外的具有优选列表的取代基，所述列表包括但不限于烷基、烯基、炔基、脂肪族、烷氧基、酰基、芳基、芳烷基、杂芳基、脂环族、杂环和杂芳基烷基。本文描述的化合物内的所选取代基以一定递归度存在。
[0148] 如本文所使用，如本文所使用的“烷基”意指含有最多至二十四个碳原子的饱和直链或支链烃基。烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、正己基、辛基、癸基、十二烷基等。烷基通常包括1至约24个碳原子，更通常地1至约12个碳原子(C1-C12烷基)，其中1至约6个碳原子更优选。
[0149] 如本文所使用，“烯基”意指含有最多至二十四个碳原子并且具有至少一个碳-碳双键的直链或支链链烃基。烯基的实例包括但不限于乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基、二烯如1,3-丁二烯等。烯基通常包括2至约24个碳原子，更通常地2
至约12个碳原子，其中2至约6个碳原子更优选。如本文所使用的烯基可任选地包括一个
或多个另外的取代基。
[0150] 如本文所使用，“炔基”意指含有最多至二十四个碳原子并且具有至少一个碳-碳三键的直链或支链烃基。炔基的实例包括但不限于乙炔基、1-丙炔基、1-丁炔基等。炔基通常包括2至约24个碳原子，更通常地2至约12个碳原子，其中2至约6个碳原子更优选。如本文所使用的炔基可任选地包括一个或多个另外的取代基。
[0151] 如本文所使用，“酰基”意指通过从有机酸中去除羟基形成的基团并且具有通式-C(O)-X，其中X通常为脂肪族、脂环族或芳香族。实例包括脂肪族羰基、芳香族羰基、脂肪族磺酰基、芳香族亚硫酰基、脂肪族亚硫酰基、芳香族磷酸酯、脂肪族磷酸酯等。如本文所使用的酰基可任选地包括另外的取代基。
[0152] 如本文所使用，“脂环族”意指其中环为脂肪族的环系统。环系统可包含一个或多个环，其中至少一个环为脂肪族。优选的脂环族包括其中具有约5至约9个碳原子的环。如本文所使用的脂环族可任选地包括另外的取代基。
[0153] 如本文所使用，“脂肪族”意指含有最多至二十四个碳原子的直链或支链烃基，其中任何两个碳原子之间的饱和度为单键、双键或三键。脂肪族基团优选含有1至约24个碳原子，更通常地1至约12个碳原子，其中1至约6个碳原子更优选。脂肪族基团的直链或
支链可被一个或多个杂原子中断，所述杂原子包括氮、氧、硫和磷。被杂原子中断的所述脂肪族基团包括但不限于聚烷氧基，如聚亚烷基二醇、聚胺和聚亚胺。如本文所使用的脂肪族基团可任选地包括另外的取代基。
[0154] 如本文所使用，“烷氧基”意指在烷基与氧原子之间形成的基团，其中氧原子用来将烷氧基连接至母体分子。烷氧基的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、新戊氧基、正己氧基等。如本文所使用的烷氧基可任选地包括另外的取代基。
[0155] 如本文所使用，“氨基烷基”意指氨基取代的C1-C12烷基。基团的烷基部分与母体分子形成共价键。氨基可位于任何位置并且氨基烷基可在烷基和/或氨基部分上被另外的取代基取代。
[0156] 如本文所使用，“芳烷基”和“芳基烷基”意指共价连接至C1-C12烷基的芳香族基团。所得到的芳烷基(或芳基烷基)的烷基部分与母体分子形成共价键。实例包括但不限于苯
甲基、苯乙基等。如本文所使用的芳烷基可任选地包括连接至烷基、芳基或形成基团的这两个基团的另外的取代基。
[0157] 如本文所使用，“芳基”和“芳香族”意指具有一个或多个芳环的单环或多环碳环系统基团。芳基的实例包括但不限于苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、茚基等。优选的芳环系统在一个或多个环中具有约5至约20个碳原子。如本文所使用的芳基可任选地包括另外的取代基。
[0158] 如本文所使用，“卤代基”和“卤素”意指选自氟、氯、溴和碘的原子。
[0159] 如本文所使用，“杂芳基”和“杂芳香族”意指包含单环或多环芳环、环系统或稠环系统的基团，其中至少一个环为芳香族的并且包括一个或多个杂原子。杂芳基还意图包括稠环系统，所述稠环系统包括其中一个或多个稠环不含有杂原子的系统。杂芳基通常包括
一个选自硫、氮或氧的环原子。杂芳基的实例包括但不限于吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、异噁唑基、噻二唑基、噁二唑基、噻吩基、呋喃基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、喹喔啉基等。杂芳基可直接或通过连接部分如脂肪族基团或杂原子连接至母体分子。如本文所使用的杂芳基可任选地包括另外的取代基。
[0160] 如本文所使用，“缀合物化合物”意指适合用作缀合物基团的任何原子、原子基团或连接的原子基团。在某些实施方案中，缀合物化合物可具有或赋予一种或多种性质，包括但不限于药效学、药物代谢动力学、结合、吸收、细胞分布、细胞摄取、电荷和/或清除性质。
[0161] 如本文所使用，除非另外指出或修改，术语“双链的”是指彼此杂交的两个单独的低聚化合物。所述双链化合物可在一个或两个链的一个或两个末端上具有一个或多个或非杂交的核苷(突出端)和/或一个或多个内部非杂交核苷(错配)，前提是存在足够互补
性，以维持在生理学相关条件下的杂交。
[0162] B.某些化合物
[0163] 在某些实施方案中，本发明提供缀合反义化合物，所述缀合反义化合物包含反义寡核苷酸和缀合物。
[0164] a.某些反义寡核苷酸
[0165] 在某些实施方案中，本发明提供反义寡核苷酸。所述反义寡核苷酸包含连接核苷，每个核苷包含糖部分和核碱基。可根据化学特征(例如，修饰和修饰的模式)和核碱基序列(例如，反义寡核苷酸的序列、靶核酸的身份和序列)来考虑所述反义寡核苷酸的结构。
[0166] i.某些化学特征
[0167] 在某些实施方案中，反义寡核苷酸包含一个或多个修饰。在某些所述实施方案中，反义寡核苷酸包含一个或多个修饰核苷和/或修饰的核苷间键联。在某些实施方案中，修饰核苷包含修饰的糖部分和/或修饰的核碱基。
[0168] 1.某些糖部分
[0169] 在某些实施方案中，本公开的化合物包含一个或多个修饰核苷，所述修饰核苷包含修饰的糖部分。相对于仅包含包含有天然存在的糖部分的核苷的寡核苷酸，包含一个或
多个糖修饰的核苷的所述化合物可具有希望的性质，如增强的核酸酶稳定性或增大的与靶
核酸的结合亲合力。在某些实施方案中，修饰的糖部分为取代的糖部分。在某些实施方案
中，修饰的糖部分为糖替代物。所述糖替代物可包含对应于取代的糖部分的那些取代的一
个或多个取代。
[0170] 在某些实施方案中，修饰的糖部分为包含一个或多个非桥联糖取代基的取代的糖部分，包括但不限于在2’位和/或5’位上的取代基。适于2’-位的糖取代基的实例包括
但不限于：2’-F、2'-OCH3(“OMe”或“O-甲基”)和2'-O(CH2)2OCH3(“MOE”)。在某些实施方案中，2’位上的糖取代基选自烯丙基、氨基、叠氮基、硫代基、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、O-C1-C10取代的烷基；OCF3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)以及O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中每个Rm和Rn独立地为H或取代或未取代的C1-C10烷基。5’-位上的糖取代基的
实例包括但不限于：5’-甲基(R或S)；5'-乙烯基和5’-甲氧基。在某些实施方案中，取
代的糖包含多于一个非桥联糖取代基，例如，2'-F-5'-甲基糖部分(对于另外的5',2'-双
取代的糖部分和核苷，参见，例如，PCT国际申请WO 2008/101157)。
[0171] 包含2’-取代的糖部分的核苷称为2’-取代的核苷。在某些实施方案中，2’-取代的核苷包含选自以下的2'-取代基：卤代基、烯丙基、氨基、叠氮基、SH、CN、OCN、CF3、OCF3、O、S或N(Rm)-烷基；O、S或N(Rm)-烯基；O、S或N(Rm)-炔基；O-亚烷基-O-烷基、炔基、
烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)或O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中每个Rm和Rn独立地为H、氨基保护基或取代或未取代的C1-C10烷基。这些2'-取代基可被独立地选自以下的一个或多个取代基进一步取代：羟基、氨基、烷氧基、羧基、苯甲基、苯基、硝基(NO2)、巯基、硫代烷氧基(S-烷基)、卤素、烷基、芳基、烯基以及炔基。
[0172] 在某些实施方案中，2’-取代的核苷包含选自以下的2’-取代基：F、NH2、N3、OCF3、O-CH3、O(CH2)3NH2、CH2-CH＝CH2、O-CH2-CH＝CH2、OCH2CH2OCH3、O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2以及N-取代的乙酰胺(O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中每个Rm和Rn独立地为H、氨基保护基或取代或未取代的C1-C10烷基。
[0173] 在某些实施方案中，2’-取代的核苷包含糖部分，所述糖部分包含选自以下的2’-取代基：F、OCF3、O-CH3、OCH2CH2OCH3、O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(CH3)2、-O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2以及O-CH2-C(＝O)-N(H)CH3。
[0174] 在某些实施方案中，2’-取代的核苷包含糖部分，所述糖部分包含选自以下的2’-取代基：F、O-CH3和OCH2CH2OCH3。
[0175] 某些修饰的糖部分包含桥联糖取代基，所述桥联糖取代基形成第二个环，从而产生双环糖部分。在某些所述实施方案中，双环糖部分在4'呋喃糖环原子与2'呋喃糖环原子
之间包含桥联。所述4’至2’糖取代基的实例包括但不限于：-[C(Ra)(Rb)]n-、-[C(Ra)(Rb)]n-O-、-C(RaRb)-N(R)-O- 或 –C(RaRb)-O-N(R)-；4'-CH2-2'、4'-(CH2)2-2'、4'-(CH2)3-2'、
4'-(CH2)-O-2'(LNA)；4'-(CH2)-S-2'；4'-(CH2)2-O-2'(ENA)；4'-CH(CH3)-O-2'(cEt)
和4'-CH(CH2OCH3)-O-2'以及其类似物(参见，例如，2008年7月15日授权的美国专
利7,399,845)；4'-C(CH3)(CH3)-O-2'及其类似物(参见，例如，2009年1月8日公布
的WO2009/006478)；4'-CH2-N(OCH3)-2'及其类似物(参见，例如，2008年12月11日
公布的WO2008/150729)；4'-CH2-O-N(CH3)-2'(参见，例如，2004年9月2日公 布的
US2004/0171570)；4'-CH2-O-N(R)-2'以及4'-CH2-N(R)-O-2'-，其中每个R独立地为H、保
护基或C1-C12烷基；4'-CH2-N(R)-O-2'，其中R为H、C1-C12烷基或保护基(参见，2008年9
月23日授权的美国专利7,427,672)；4'-CH2-C(H)(CH3)-2'(参见，例如，Chattopadhyaya
等，J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；以及4'-CH2-C(＝CH2)-2'及其类似物(参见，2008
年12月8日公布的已公布的PCT国际申请WO2008/154401)。
[0176] 在某些实施方案中，所述4’至2’桥联独立地包含1至4个连接的基团，所述基团独立地选自以下：-[C(Ra)(Rb)]n-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-C(＝NRa)-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-O-、-Si(Ra)2-、-S(＝O)x-以及-N(Ra)-；
[0177] 其中：
[0178] x为0、1或2；
[0179] n为1、2、3或4；
[0180] 每个Ra和Rb独立地为H、保护基、羟基、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、C5-C7脂环基、取代的C5-C7脂环基、卤素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、CN、磺酰基(S(＝O)2-J1)或亚磺酰基(S(＝O)-J1)；并且
[0181] 每个J1和J2独立地为H、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、杂环基、取代的杂环基、C1-C12氨基烷基、取代的C1-C12氨基烷基或保护基。
[0182] 包含双环糖部分的核苷称为双环核苷或BNA。双环核苷包括但不限于如下所描绘的(A)α-L-亚甲基氧基(4’-CH2-O-2’)BNA、(B)β-D-亚甲基氧基(4’-CH2-O-2’)BNA(也称为锁核酸或LNA)、(C)亚乙基氧基(4’-(CH2)2-O-2’)BNA、(D)氨基氧基(4’-CH2-O-N(R)-2’)BNA、(E)氧氨基(4’-CH2-N(R)-O-2’)BNA、(F)甲基(亚甲基氧基)(4’-CH(CH3)-O-2’)
BNA(也称为约束乙基或cEt)、(G)亚甲基-硫代基(4’-CH2-S-2’)BNA、(H)亚甲基-氨
基(4’-CH2-N(R)-2’)BNA、(I)甲基碳环(4’-CH2-CH(CH3)-2’)BNA，以及(J)丙烯碳环
(4’-(CH2)3-2’)BNA。
[0183]
[0184] 其中Bx为核碱基部分并且R独立地为H、保护基或C1-C12烷基。
[0185] 另外的双环糖部分为本领域中已知的，例如：Singh等，Chem.Commun.,1998,4,455-456；Koshkin 等，Tetrahedron,1998,54,3607-3630；Wahlestedt
等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633-5638；Kumar 等，Bioorg.Med.Chem.
Lett.,1998,8,2219-2222；Singh 等，J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039；Srivastava
等，J.Am.Chem.Soc.,129(26)8362-8379(2007年 7月 4日 )；Elayadi 等，Curr.Opinion Invens.Drugs,2001,2,558-561；Braasch 等，Chem.Biol.,2001,8,1-7；Orum 等，Curr.
Opinion Mol.Ther.,2001,3,239-243；美国专利号7,053,207、6,268,490、6,770,748、
6,794,499、7,034,133、6,525,191、6,670,461 和 7,399,845；WO 2004/106356、WO
1994/14226、WO 2005/021570和WO 2007/134181；美国专利公布号US2004/0171570、
US2007/0287831和 US2008/0039618；美 国 专 利 序 列 号 12/129,154、60/989,574、
61/026,995、61/026,998、61/056,564、61/086,231、61/097,787和61/099,844；以及PCT国际申请号PCT/US2008/064591、PCT/US2008/066154和PCT/US2008/068922。
[0186] 在某些实施方案中，双环糖部分和掺入所述双环糖部分的核苷通过异构构型进一步定义。例如，包含4’-2’亚甲基-氧基桥联的核苷可呈α-L构型或呈β-D构型。先前，
已将α-L-亚甲基氧基(4’-CH2-O-2’)双环核苷掺入到显示反义活性的反义寡核苷酸中
(Frieden等，Nucleic Acids Research,2003,21,6365-6372)。
[0187] 在某些实施方案中，取代的糖部分包含一个或多个非桥联糖取代基和一个或多个桥联糖取代基(例如，5’-取代的糖和4’-2’桥联的糖)。(参见，11/22/07公布的PCT国
际申请WO 2007/134181，其中LNA被例如5'-甲基或5'-乙烯基取代)。
[0188] 在某些实施方案中，修饰的糖部分为糖替代物。在某些所述实施方案中，天然存在的糖的氧原子被例如硫、碳或氮原子取代。在某些所述实施方案中，所述修饰的糖部分
还包含如上所述的桥联取代基和/或非桥联取代基。例如，某些糖替代物包含4’-硫原子
和2'-位(参见，例如，2005年6月16日公布的已公布的美国专利申请US2005/0130923)
和/或5’位上的取代。通过另外举例的方式，具有4'-2'桥联的碳环双环核苷已有所描述
(参见，例如，Freier等，Nucleic Acids Research,1997,25(22),4429-4443和Albaek等，J.Org.Chem.,2006,71,7731-7740)。
[0189] 在某些实施方案中，糖替代物包含具有除了5个原子以外的环。例如，在某些实施方案中，糖替代物包含吗啉代。吗啉代化合物及其在低聚化合物中的用途已报道于许多专利和出版的文章中(参见例如：Braasch等，Biochemistry,2002,41,4503-4510；和美国专
利5,698,685；5,166,315；5,185,444和5,034,506)。如在此所使用，术语“吗啉代”意指具有以下结构的糖替代物：
[0190]
[0191] 在某些实施方案中，可例如通过添加或改变来自以上吗啉代结构的各种取代基来修饰吗啉代。所述糖替代物在本文中称为“修饰的吗啉代”。
[0192] 对于另一个实例，在某些实施方案中，糖替代物包含六元四氢吡喃。所述四氢吡喃可被进一步修饰或取代。包含所述修饰的四氢吡喃的核苷包括但不限于己糖醇核
酸(HNA)、anitol核酸(ANA)、甘露醇核酸(MNA)(参见Leumann,CJ.Bioorg.&Med.Chem.
(2002)10:841-854)、氟代HNA(F-HNA)以及具有式VI的那些化合物：
[0193]
[0194] 其中独立地对于式VI的所述至少一个四氢吡喃核苷类似物中的每一个：
[0195] Bx为核碱基部分；
[0196] T3和T4各自独立地为将四氢吡喃核苷类似物连接至反义化合物的核苷间连接基团或T3和T4中的一个为将四氢吡喃核苷类似物连接至反义化合物的核苷间连接基团并且
T3和T4中的另一个为H、羟基保护基、连接的缀合物基团或5'或3'-端基；
[0197] q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自独立地为H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；并且
[0198] R1和R2中的每一个独立地选自以下：氢、卤素、取代或未取代的烷氧基、NJ1J2、SJ1、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2以及CN，其中X为O、S或NJ1，并且每个J1、J2和J3独立地为H或C1-C6烷基。
[0199] 在某些实施方案中，提供了式VI的修饰的THP核苷，其中q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自为H。在某些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中的至少一个不是H。在某些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中的至少一个为甲基。在某些实施方案中，提供了式VI的THP核苷，其中R1和R2中的一个为F。在某些实施方案中，R1为氟代基并且R2为H，R1为甲氧基并且R2为H，并且R1为甲氧基乙氧基并且R2为H。
[0200] 许多其它双环和三环糖替代物环系统也为本领域中已知的，其可用来修饰核苷以掺入到反义化合物中(参见，例如，综述文章：Leumann,J.C,Bioorganic&Medicinal
Chemistry,2002,10,841-854)。
[0201] 还提供了修饰的组合，不限于如2'-F-5'-甲基取代的核苷(对于其它公开的5',2'-双取代核苷，参见8/21/08公布的PCT国际申请WO2008/101157)和用S替代核糖基
环氧原子以及在2'-位上的进一步取代(参见2005年6月16日公布的已公布的美国专利
申请US2005-0130923)或替代地双环核酸的5'-取代(参见11/22/07公布的PCT国际申
请WO 2007/134181，其中4'-CH2-O-2'双环核苷在5'位上被5'-甲基或5'-乙烯基进一步
取代)。碳环双环核苷的合成和制备连同其低聚和生物化学研究也已有所描述(参见，例
如，Srivastava等，J.Am.Chem.Soc.2007,129(26),8362-8379)。
[0202] 在某些实施方案中，本公开提供了包含修饰核苷的寡核苷酸。那些修饰核苷酸可包括修饰的糖、修饰的核碱基和/或修饰的键联。选择具体的修饰，使得所得到的寡核苷酸具有希望的特征。在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个RNA样核苷。在某些实施
方案中，寡核苷酸包含一个或多个DNA样核苷酸。
[0203] 2.某些核碱基修饰
[0204] 在某些实施方案中，本公开的核苷包含一个或多个未修饰核碱基。在某些实施方案中，本公开的核苷包含一个或多个修饰核碱基。
[0205] 在某些实施方案中，修饰核碱基选自以下：通用碱基、疏水碱基、混杂碱基、尺寸膨胀碱基以及如本文所定义的氟化碱基。5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶；5-丙炔基胞嘧啶；5-羟甲基胞嘧
啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧
啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其
它炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧
啶、8-卤代基、8-氨基、8-巯基、8-硫代烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、
5-卤代基具体地为5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤
和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱
氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤、通用碱基、疏水碱基、混杂碱
基、尺寸膨胀碱基以及如本文所定义的氟化碱基。另外的修饰核碱基包括三环嘧啶如吩噁
嗪胞嘧啶([5,4-b][1,4]苯并嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞嘧啶(1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]
苯并噻嗪-2(3H)-酮)；G-夹如取代的吩噁嗪胞嘧啶(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶
并[5,4-b][1,4]苯并嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞嘧啶(2H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-2-酮)、吡
啶并吲哚胞嘧啶(H-吡啶并[3',2':4,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)。修饰核碱基还可
包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其它杂环例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2-氨基吡啶和
2-吡啶酮替代的那些。另外的核碱基包括公开于美国专利号3,687,808中的那些、公开于
The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,Kroschwitz,J.I.编
著，John Wiley&Sons,1990,858-859中的那些；由Englisch等，Angewandte Chemie，国际版，1991,30,613公开的那些；以及由Sanghvi,Y.S.，第15章，Antisense Research and
Applications,Crooke,S.T.和Lebleu,B.编著，CRC Press,1993,273-288公开的那些。
[0206] 教导某些上述修饰核碱基以及其它修饰核碱基的制备的代表性美国专利包括但 不 限 于 U.S.3,687,808；4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；
5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；
5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,645,985；5,681,941；5,750,692；
5,763,588；5,830,653和6,005,096，某些所述美国专利与本申请共有，并且所述美国专利中的每一个均以引用的方式整体并入本文。
[0207] 3.某些核苷间键联
[0208] 在某些实施方案中，本公开提供了包含连接核苷的寡核苷酸。在所述实施方案中，核苷可使用任何核苷间键联连接在一起。通过磷原子的存在或不存在来定义两大类核
苷间连接基团。代表性含磷核苷间键联包括但不限于磷酸二酯(PO)、磷酸三酯、甲基膦酸
酯、氨基磷酸酯以及硫代磷酸酯(PS)。代表性的不含磷的核苷间连接基团包括但不限于亚
甲基甲基亚氨基(-CH2-N(CH3)-O-CH2-)、硫二酯(-O-C(O)-S-)、氨基甲硫羰酸酯(-O-C(O)
(NH)-S-)；硅氧烷(-O-Si(H)2-O-)；以及N,N'-二甲基肼(-CH2-N(CH3)-N(CH3)-)。与天然
磷酸二酯键联相比，修饰的键联可用来改变(通常为增加)寡核苷酸的核酸酶抗性。在某
些实施方案中，具有手性原子的核苷间键联可制备为外消旋混合物或制备为单独的对映异
构体。代表性手性键联包括但不限于烷基膦酸酯和硫代磷酸酯。制备含磷和不含磷核苷间
键联的方法是本领域技术人员熟知的。
[0209] 本文描述的寡核苷酸含有一个或多个不对称中心并且因此产生对映异构体、非对映异构体和可根据绝对立体化学定义为(R)或(S)、α或β如对于糖端基异构体或定义为
(D)或(L)如对于氨基酸等的其它立体异构构型。在本文提供的反义化合物中包括所有所
述可能的异构体以及其外消旋形式和光学纯形式。
[0210] 中性核苷间键联包括但不限于磷酸三酯、甲基膦酸酯、MMI(3'-CH2-N(CH3)-O-5')、酰 胺-3(3'-CH2-C(＝O)-N(H)-5')、酰 胺-4(3'-CH2-N(H)-C( ＝O)-5')、甲 乙 缩 醛(3'-O-CH2-O-5')以及硫代甲乙缩醛(3'-S-CH2-O-5')。另外的中性核苷间键联包括包含硅
氧烷(二烷基硅氧烷)、羧酸酯、羧酰胺、硫化物、磺酸酯以及酰胺的非离子键联(参见例如：
Carbohydrate Modifications in Antisense Research；Y.S.Sanghvi和P.D.Cook编著，
ACS座谈会系列580；第3和4章，40-65)。另外的中性核苷间键联包括包含混合的N、O、S
和CH2组成部分的非离子键联。
[0211] 4.某些基序
[0212] 在某些实施方案中，反义寡核苷酸包含一个或多个修饰核苷(例如，包含修饰的糖和/或修饰的核碱基的核苷)和/或一个或多个修饰的核苷间键联。寡核苷酸上的所述
修饰的模式在本文中称为基序。在某些实施方案中，糖、核碱基和键联基序彼此独立。
[0213] a.某些糖基序
[0214] 在某些实施方案中，寡核苷酸包含以限定的模式或糖修饰基序沿着寡核苷酸或其区域布置的一种或多种类型的修饰的糖部分和/或天然存在的糖部分。所述基序可包括本
文讨论的任何糖修饰和/或其它已知的糖修饰。
[0215] 在某些实施方案中，寡核苷酸包含具有缺口聚物糖基序的区域或由所述区域组成，所述缺口聚物糖基序包含两个外部区域或“翼”以及中心或内部区域或“缺口”。缺口聚物糖基序的三个区域(5’-翼、缺口和3’-翼)形成连续的核苷序列，其中每个翼的核苷
的至少一些糖部分不同于缺口的核苷的至少一些糖部分。确切来说，每个翼的核苷的至少
最接近缺口的糖部分(5’-翼的最3’核苷和3’-翼的最5’核苷)不同于邻近缺口核苷的
糖部分，从而限定了翼与缺口之间的边界。在某些实施方案中，缺口内的糖部分彼此相同。
在某些实施方案中，缺口包括一个或多个核苷，所述核苷具有不同于缺口的一个或多个其
它核苷的糖部分的糖部分。在某些实施方案中，两翼的糖基序彼此相同(对称的糖缺口聚
物)。在某些实施方案中，5'-翼的糖基序不同于3'-翼的糖基序(不对称的糖缺口聚物)。
[0216] i.某些5’-翼
[0217] 在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼由1至8个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼由1至7个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼
由1至6个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼由1至5个连接核苷组
成。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼由2至5个连接核苷组成。在某些实施方案中，
缺口聚物的5’-翼由3至5个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼由4
或5个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼由1至4个连接核苷组成。
在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼由1至3个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口
聚物的5’-翼由1或2个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼由2至4
个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼由2或3个连接核苷组成。在某
些实施方案中，缺口聚物的5’-翼由3或4个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物
的5’-翼由1个核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼由2个连接核苷组成。
在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼由3个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼由4个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼由5个连接核苷组
成。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼由6个连接核苷组成。
[0218] 在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少一个双环核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少两个双环核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包
含至少三个双环核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少四个双环核苷。在
某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少一个约束乙基核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少一个LNA核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼的每个核苷
均为双环核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼的每个核苷均为约束乙基核苷。在
某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼的每个核苷均为LNA核苷。
[0219] 在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少一个非双环修饰核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少一个2’-取代的核苷。在某些实施方案中，缺口聚
物的5’-翼包含至少一个2’-MOE核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少
一个2’-OMe核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼的每个核苷均为非双环修饰核
苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼的每个核苷均为2’-取代的核苷。在某些实施
方案中，缺口聚物的5’-翼的每个核苷均为2’-MOE核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的
5’-翼的每个核苷均为2’-OMe核苷。
[0220] 在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少一个2’-脱氧核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼的每个核苷均为2’-脱氧核苷。在某些实施方案中，缺口聚物
的5’-翼包含至少一个核糖核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼的每个核苷均为
核糖核苷。在某些实施方案中，5’-翼的核苷中的一个、多于一个、或每一个为RNA样核苷。
[0221] 在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少一个双环核苷和至少一个非双环修饰核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少一个双环核苷和至少一个
2’-取代的核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少一个双环核苷和至少一
个2’-MOE核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少一个双环核苷和至少一
个2’-OMe核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少一个双环核苷和至少一
个2’-脱氧核苷。
[0222] 在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少一个约束乙基核苷和至少一个非双环修饰核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少一个约束乙基核苷和至少
一个2’-取代的核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少一个约束乙基核苷
和至少一个2’-MOE核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少一个约束乙基
核苷和至少一个2’-OMe核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少一个约束
乙基核苷和至少一个2’-脱氧核苷。
[0223] ii.某些3’-翼
[0224] 在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼由1至8个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼由1至7个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼
由1至6个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼由1至5个连接核苷组
成。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼由2至5个连接核苷组成。在某些实施方案中，
缺口聚物的3’-翼由3至5个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼由4
或5个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼由1至4个连接核苷组成。
在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼由1至3个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口
聚物的3’-翼由1或2个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼由2至4
个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼由2或3个连接核苷组成。在某
些实施方案中，缺口聚物的3’-翼由3或4个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物
的3’-翼由1个核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼由2个连接核苷组成。
在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼由3个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼由4个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼由5个连接核苷组
成。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼由6个连接核苷组成。
[0225] 在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个双环核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个约束乙基核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个LNA核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼的每个核苷均为双环核苷。
在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼的每个核苷均为约束乙基核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼的每个核苷均为LNA核苷。
[0226] 在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个非双环修饰核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少两个非双环修饰核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少三个非双环修饰核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少
四个非双环修饰核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个2’-取代的核
苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个2’-MOE核苷。在某些实施方案
中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个2’-OMe核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼的每个核苷均为非双环修饰核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼的每个核苷均为
2’-取代的核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼的每个核苷均为2’-MOE核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼的每个核苷均为2’-OMe核苷。
[0227] 在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个2’-脱氧核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼的每个核苷均为2’-脱氧核苷。在某些实施方案中，缺口聚物
的3’-翼包含至少一个核糖核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼的每个核苷均为
核糖核苷。在某些实施方案中，5’-翼的核苷中的一个、多于一个、或每一个为RNA样核苷。
[0228] 在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个双环核苷和至少一个非双环修饰核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个双环核苷和至少一个
2’-取代的核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个双环核苷和至少一
个2’-MOE核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个双环核苷和至少一
个2’-OMe核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个双环核苷和至少一
个2’-脱氧核苷。
[0229] 在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个约束乙基核苷和至少一个非双环修饰核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个约束乙基核苷和至少
一个2’-取代的核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个约束乙基核苷
和至少一个2’-MOE核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个约束乙基
核苷和至少一个2’-OMe核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个约束
乙基核苷和至少一个2’-脱氧核苷。
[0230] 在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个LNA核苷和至少一个非双环修饰核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个LNA核苷和至少一个
2’-取代的核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个LNA核苷和至少一
个2’-MOE核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个LNA核苷和至少一
个2’-OMe核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个LNA核苷和至少一
个2’-脱氧核苷。
[0231] 在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个双环核苷、至少一个非双环修饰核苷以及至少一个2’-脱氧核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少
一个约束乙基核苷、至少一个非双环修饰核苷以及至少一个2’-脱氧核苷。在某些实施方
案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个LNA核苷、至少一个非双环修饰核苷以及至少一个
2’-脱氧核苷。
[0232] 在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个双环核苷、至少一个2’-取代的核苷以及至少一个2’-脱氧核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一
个约束乙基核苷、至少一个2’-取代的核苷以及至少一个2’-脱氧核苷。在某些实施方
案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个LNA核苷、至少一个2’-取代的核苷以及至少一个
2’-脱氧核苷。
[0233] 在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个双环核苷、至少一个2’-MOE核苷以及至少一个2’-脱氧核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个约束乙基核苷、至少一个2’-MOE核苷以及至少一个2’-脱氧核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个LNA核苷、至少一个2’-MOE核苷以及至少一个2’-脱氧核苷。
[0234] 在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个双环核苷、至少一个2’-OMe核苷以及至少一个2’-脱氧核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个约束乙基核苷、至少一个2’-OMe核苷以及至少一个2’-脱氧核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个LNA核苷、至少一个2’-OMe核苷以及至少一个2’-脱氧核苷。
[0235] iii.某些中心区(缺口)
[0236] 在某些实施方案中，缺口聚物的缺口由6至20个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口由6至15个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口由6
至12个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口由6至10个连接核苷组成。在
某些实施方案中，缺口聚物的缺口由6至9个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物
的缺口由6至8个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口由6或7个连接核
苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口由7至10个连接核苷组成。在某些实施方案
中，缺口聚物的缺口由7至9个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口由7或
8个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口由8至10个连接核苷组成。在某
些实施方案中，缺口聚物的缺口由8或9个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的
缺口由6个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口由7个连接核苷组成。在
某些实施方案中，缺口聚物的缺口由8个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口由9个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口由10个连接核苷组成。在某
些实施方案中，缺口聚物的缺口由11个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的缺
口由12个连接核苷组成。
[0237] 在某些实施方案中，缺口聚物的缺口的每个核苷均为2’-脱氧核苷。在某些实施方案中，缺口包含一个或多个修饰核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口的每个核苷均为2’-脱氧核苷或为“DNA样”的修饰核苷。在所述实施方案中，“DNA样”意指核苷具有与DNA类似的特征，使得包含缺口聚物和RNA分子的双链体能够激活RNA酶H。例如，在某些
条件下，2’-(ara)-F已显示支持RNA酶H激活，并且因此为DNA样的。在某些实施方案中，
缺口聚物的缺口的一个或多个核苷不为2’-脱氧核苷并且不为DNA样的。在某些所述实
施方案中，尽管如此，缺口聚物仍然支持RNA酶H激活(例如，凭借非DNA核苷的数目或位
置)。
[0238] 在某些实施方案中，缺口包含被一个或多个修饰核苷中断的未修饰的2’-脱氧核苷的链段(stretch)，从而产生三个子区(两个具有一个或多个2’-脱氧核苷的链段和一
个具有一个或多个中断的修饰核苷的链段)。在某些实施方案中，未修饰的2’-脱氧核苷
的链段不长于5、6或7个核苷。在某些实施方案中，通过使用短缺口区来实现所述短链段。
在某些实施方案中，通过中断较长的缺口区来实现短链段。
[0239] 在某些实施方案中，缺口包含一个或多个修饰核苷。在某些实施方案中，缺口包含选自以下的一个或多个修饰核苷：cEt、FHNA、LNA和2-硫代-胸苷。在某些实施方案中，缺口包含一个修饰核苷。在某些实施方案中，缺口包含选自以下的5’-取代的糖部分：5’-Me和5’-(R)-Me。在某些实施方案中，缺口包含两个修饰核苷。在某些实施方案中，缺口包含三个修饰核苷。在某些实施方案中，缺口包含四个修饰核苷。在某些实施方案中，缺口包含两个或更多个修饰核苷并且每个修饰核苷是相同的。在某些实施方案中，缺口包含两个或更多个修饰核苷并且每个修饰核苷是不同的。
[0240] 在某些实施方案中，缺口包含一个或多个修饰的键联。在某些实施方案中，缺口包含一个或多个甲基膦酸酯键联。在某些实施方案中，缺口包含两个或更多个修饰的键联。在某些实施方案中，缺口包含一个或多个修饰的键联和一个或多个修饰的核苷。在某些实施方案中，缺口包含一个修饰的键联和一个修饰的核苷。在某些实施方案中，缺口包含两个修饰的键联和两个或更多个修饰的核苷。
[0241] b.某些核苷间键联基序
[0242] 在某些实施方案中，寡核苷酸包含以限定的模式或修饰的核苷间键联基序沿着寡核苷酸或其区域布置的修饰的核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含具有交替的
核苷间键联基序的区域。在某些实施方案中，本公开的寡核苷酸包含具有统一修饰的核苷
间键联的区域。在某些所述实施方案中，寡核苷酸包含通过硫代磷酸酯核苷间键联统一连
接的区域。在某些实施方案中，寡核苷酸通过硫代磷酸酯核苷间键联统一连接。在某些实
施方案中，寡核苷酸的每个核苷间键联选自磷酸二酯和硫代磷酸酯。在某些实施方案中，寡核苷酸的每个核苷间键联选自磷酸二酯和硫代磷酸酯并且至少一个核苷间键联为硫代磷
酸酯。
[0243] 在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少6个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少7个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少8个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少9个硫代磷酸酯核
苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少10个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实
施方案中，寡核苷酸包含至少11个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸
包含至少12个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少13个硫代
磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少14个硫代磷酸酯核苷间键联。
[0244] 在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少6个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少7个连续的硫代磷酸
酯核苷间键联的嵌段。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少8个连续的硫
代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少9个连
续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少
10个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些实施方案中，寡核苷酸至少包含具有至
少一种12个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些所述实施方案中，至少一个所述
嵌段位于寡核苷酸的3’末端。在某些所述实施方案中，至少一个所述嵌段位于寡核苷酸的
3’末端的3个核苷内。在某些实施方案中，寡核苷酸包含少于15个硫代磷酸酯核苷间键
联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含少于14个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案
中，寡核苷酸包含少于13个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含少
于12个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含少于11个硫代磷酸酯
核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含少于10个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些
实施方案中，寡核苷酸包含少于9个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含少于8个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含少于7个硫代磷
酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含少于6个硫代磷酸酯核苷间键联。在
某些实施方案中，寡核苷酸包含少于5个硫代磷酸酯核苷间键联。
[0245] c.某些核碱基修饰基序
[0246] 在某些实施方案中，寡核苷酸包含对以限定的模式或核碱基修饰基序沿着寡核苷酸或其区域布置的核碱基的化学修饰。在某些所述实施方案中，核碱基修饰以有缺口的基
序布置。在某些实施方案中，核碱基修饰以交替基序布置。在某些实施方案中，每个核碱基均为修饰的。在某些实施方案中，没有一个核碱基为化学修饰的。
[0247] 在某些实施方案中，寡核苷酸包含修饰核碱基的嵌段。在某些所述实施方案中，嵌段处于寡核苷酸的3’-末端。在某些实施方案中，嵌段在寡核苷酸的3’-末端的3个核苷酸内。在某些所述实施方案中，嵌段处于寡核苷酸的5’-末端。在某些实施方案中，嵌段在寡核苷酸的5’-末端的3个核苷酸内。
[0248] 在某些实施方案中，核碱基修饰随寡核苷酸的具体位置上的天然碱基变化。例如，在某些实施方案中，寡核苷酸中的每个嘌呤或每个嘧啶均为修饰的。在某些实施方案中，每个腺嘌呤均为修饰的。在某些实施方案中，每个鸟嘌呤均为修饰的。在某些实施方案中，每个胸腺嘧啶均为修饰的。在某些实施方案中，每个胞嘧啶均为修饰的。在某些实施方案中，每个尿嘧啶均为修饰的。
[0249] 在某些实施方案中，寡核苷酸中的一些、所有或没有一个胞嘧啶部分为5-甲基胞嘧啶部分。在本文中，5-甲基胞嘧啶不为“修饰核碱基”。因此，除非另外指出，否则未修饰的核碱基包括具有5-甲基的胞嘧啶残基和缺乏5甲基的那些胞嘧啶残基。在某些实施方
案中，指定了所有或一些胞嘧啶核碱基的甲基化状态。
[0250] 在某些实施方案中，对核碱基的化学修饰包括将某些缀合物基团连接至核碱基。在某些实施方案中，寡核苷酸中的每个嘌呤或每个嘧啶可任选地被修饰以包含缀合物基
团。
[0251] d.某些总长度
[0252] 在某些实施方案中，本公开提供了具有各种长度范围中的任何一个的寡核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸由X至Y个连接核苷组成，其中X表示范围内的最小核苷数并
且Y表示范围内的最大核苷数。在某些所述实施方案中，X和Y各自独立地选自：8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、
36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50；前提是X≤Y。例如，在某些实施方案中，寡核苷酸可由8至9、8至10、8至11、8至12、8至13、8至14、8至15、8至16、8至
17、8至18、8至19、8至20、8至21、8至22、8至23、8至24、8至25、8至26、8至27、8至
28、8至29、8至30、9至10、9至11、9至12、9至13、9至14、9至15、9至16、9至17、9至
18、9至19、9至20、9至21、9至22、9至23、9至24、9至25、9至26、9至27、9至28、9至
29、9至30、10至11、10至12、10至13、10至14、10至15、10至16、10至17、10至18、10至
19、10至20、10至21、10至22、10至23、10至24、10至25、10至26、10至27、10至28、10
至29、10至30、11至12、11至13、11至14、11至15、11至16、11至17、11至18、11至19、
11至20、11至21、11至22、11至23、11至24、11至25、11至26、11至27、11至28、11至
29、11至30、12至13、12至14、12至15、12至16、12至17、12至18、12至19、12至20、12
至21、12至22、12至23、12至24、12至25、12至26、12至27、12至28、12至29、12至30、
13至14、13至15、13至16、13至17、13至18、13至19、13至20、13至21、13至22、13至
23、13至24、13至25、13至26、13至27、13至28、13至29、13至30、14至15、14至16、14
至17、14至18、14至19、14至20、14至21、14至22、14至23、14至24、14至25、14至26、
14至27、14至28、14至29、14至30、15至16、15至17、15至18、15至19、15至20、15至
21、15至22、15至23、15至24、15至25、15至26、15至27、15至28、15至29、15至30、16
至17、16至18、16至19、16至20、16至21、16至22、16至23、16至24、16至25、16至26、
16至27、16至28、16至29、16至30、17至18、17至19、17至20、17至21、17至22、17至
23、17至24、17至25、17至26、17至27、17至28、17至29、17至30、18至19、18至20、18
至21、18至22、18至23、18至24、18至25、18至26、18至27、18至28、18至29、18至30、
19至20、19至21、19至22、19至23、19至24、19至25、19至26、19至29、19至28、19至
29、19至30、20至21、20至22、20至23、20至24、20至25、20至26、20至27、20至28、20
至29、20至30、21至22、21至23、21至24、21至25、21至26、21至27、21至28、21至29、
21至30、22至23、22至24、22至25、22至26、22至27、22至28、22至29、22至30、23至
24、23至25、23至26、23至27、23至28、23至29、23至30、24至25、24至26、24至27、24
至28、24至29、24至30、25至26、25至27、25至28、25至29、25至30、26至27、26至28、
26至29、26至30、27至28、27至29、27至30、28至29、28至30或29至30个连接核苷组
成。在其中化合物的寡核苷酸的核苷数限制至一定范围或具体数字的实施方案中，化合物
仍然还可包含另外的其它取代基。例如，包含8-30个核苷的寡核苷酸不包括具有31个核
苷的寡核苷酸，但是，除非另外指出，否则这样的寡核苷酸还可包含例如一个或多个缀合物基团、端基或其它取代基。
[0253] 另外，在通过总长度范围和通过具有指定长度的区域来描述寡核苷酸时并且在区域的指定长度的总和小于总长度范围的上限时，寡核苷酸可具有超出指定区域的那些核苷
的另外的核苷，前提是核苷的总数不超过总长度范围的上限。
[0254] 5.某些反义寡核苷酸化学基序
[0255] 在某些实施方案中，反义寡核苷酸的化学结构特征通过其糖基序、核苷间键联基序、核碱基修饰基序和总长度来表征。在某些实施方案中，所述参数各自彼此独立。因此，具有缺口聚物糖基序的寡核苷酸的每个核苷间键联均可为修饰或未修饰的并且可或可不
遵循糖修饰的缺口聚物修饰模式。因此，糖-缺口聚物的翼区内的核苷间键联可为彼此相
同或不同的，并且可与缺口区的核苷间键联相同或不同。同样，所述糖-缺口聚物寡核苷酸可包含一个或多个独立于糖修饰的缺口聚物模式的修饰核碱基。本领域技术人员将了解，
可将所述基序组合以产生各种寡核苷酸。
[0256] 在某些实施方案中，核苷间键联和核苷修饰的选择彼此之间不是独立的。
[0257] i.某些序列和靶标
[0258] 在某些实施方案中，本发明提供了具有与靶核酸互补的序列的反义寡核苷酸。所述反义化合物能够与靶核酸杂交，产生至少一种反义活性。在某些实施方案中，反义化合物与一种或多种靶核酸特异性杂交。在某些实施方案中，特异性杂交的反义化合物具有核碱
基序列，所述核碱基序列包含与靶核酸具有足够互补性以允许杂交和产生反义活性并且与
任何非靶标具有不足够的互补性以便在希望特异性杂交的条件下(例如，在用于体内或治
疗用途的生理条件下，和在体外测定的情况下进行测定的条件下)避免或减少与非靶核酸
序列的非特异性杂交的区域。在某些实施方案中，寡核苷酸在靶标与非靶标之间为选择性
的，即使靶标和非靶标均包含靶序列。在所述实施方案中，选择性可由与另一种核酸分子相比一种核酸分子的靶区域的相对可接近性造成。
[0259] 在某些实施方案中，本公开提供了包含寡核苷酸的反义化合物，所述寡核苷酸在寡核苷酸的整个长度上与靶核酸完全互补。在某些实施方案中，寡核苷酸与靶核酸99％互
补。在某些实施方案中，寡核苷酸与靶核酸95％互补。在某些实施方案中，所述寡核苷酸与靶核酸90％互补。
[0260] 在某些实施方案中，所述寡核苷酸与靶核酸85％互补。在某些实施方案中，所述寡核苷酸与靶核酸80％互补。在某些实施方案中，反义化合物包含与靶核酸完全互补并且在寡核苷酸的整个长度上与靶核酸至少80％互补的区域。在某些所述实施方案中，具有完全
互补性的区域的长度为6至14个核碱基。
[0261] 在某些实施方案中，寡核苷酸包含杂交区和末端区。在某些所述实施方案中，杂交区由12-30个连接核苷组成并且与靶核酸完全互补。在某些实施方案中，相对于靶核酸，杂交区包括一个错配。在某些实施方案中，相对于靶核酸，杂交区包括两个错配。在某些实施方案中，相对于靶核酸，杂交区包括三个错配。在某些实施方案中，末端区由1-4个末端核苷组成。在某些实施方案中，末端核苷处于3’末端。在某些实施方案中，一个或多个末端核苷不与靶核酸互补。
[0262] 反义机制包括涉及寡核苷酸与靶核酸的杂交的任何机制，其中杂交产生生物作用。在某些实施方案中，所述杂交导致靶核酸降解或占位并伴有细胞机器的抑制或刺激，涉及例如靶核酸的翻译、转录或剪接。
[0263] 涉及靶RNA的降解的一种类型的反义机制为RNA酶H介导的反义。RNA酶H为裂解RNA:DNA双链体的RNA链的细胞核酸内切酶。本领域已知“DNA样”的单链反义化合物在
哺乳动物细胞中引发RNA酶H活性。因此，RNA酶H的激活导致RNA靶标的裂解，从而极大
地增强了基因表达的DNA样寡核苷酸介导的抑制的效率。
[0264] 在某些实施方案中，缀合物基团包含可裂解部分。在某些实施方案中，缀合物基团包含一个或多个可裂解键。在某些实施方案中，缀合物基团包含接头。在某些实施方案中，接头包含蛋白质结合部分。在某些实施方案中，缀合物基团包含细胞靶向部分(也称为细胞靶向基团)。在某些实施方案中，细胞靶向部分包含支链基团。在某些实施方案中，细胞靶向部分包含一个或多个系链。在某些实施方案中，细胞靶向部分包含碳水化合物或碳水
化合物聚簇。
[0265] ii.某些可裂解部分
[0266] 在某些实施方案中，可裂解部分为可裂解键。在某些实施方案中，可裂解部分包含可裂解键。在某些实施方案中，缀合物基团包含可裂解部分。在某些所述实施方案中，可裂解部分连接至反义寡核苷酸。在某些所述实施方案中，可裂解部分直接连接至细胞靶向部分。在某些所述实施方案中，可裂解部分连接至缀合物接头。在某些实施方案中，可裂解部分包含磷酸酯或磷酸二酯。在某些实施方案中，可裂解部分为可裂解核苷或核苷类似物。在某些实施方案中，核苷或核苷类似物包含选自以下的任选保护的杂环碱基：嘌呤、取代的嘌呤、嘧啶或取代的嘧啶。在某些实施方案中，可裂解部分为包含选自以下的任何保护的杂环碱基的核苷：尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、4-N-苯甲酰基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、4-N-苯甲酰基-5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤、6-N-苯甲酰基腺嘌呤、鸟嘌呤以及2-N-异丁酰基鸟嘌呤。在某些实施方案中，可裂解部分为2'-脱氧核苷，所述2'-脱氧核苷通过磷酸二酯键联连接至反
义寡核苷酸的3'位并且通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键联连接至接头。在某些实施方案中，
可裂解部分为2'-脱氧腺苷，所述2'-脱氧腺苷通过磷酸二酯键联连接至反义寡核苷酸的
3'位并且通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键联连接至接头。在某些实施方案中，可裂解部分为
2'-脱氧腺苷，所述2'-脱氧腺苷通过磷酸二酯键联连接至反义寡核苷酸的3'位并且通过
磷酸二酯键联连接至接头。
[0267] 在某些实施方案中，可裂解部分连接至反义寡核苷酸的3'位。在某些实施方案中，可裂解部分连接至反义寡核苷酸的5'位。在某些实施方案中，可裂解部分连接至反义
寡核苷酸的2'位。在某些实施方案中，可裂解部分通过磷酸二酯键联连接至反义寡核苷
酸。在某些实施方案中，可裂解部分通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键联连接至接头。在某些
实施方案中，可裂解部分通过磷酸二酯键联连接至接头。在某些实施方案中，缀合物基团不包括可裂解部分。
[0268] 在某些实施方案中，在将复合物施用至动物之后，仅在被靶细胞内化之后，可裂解部分才被裂解。在细胞内部，可裂解部分裂解，从而释放活性反义寡核苷酸。虽然不希望受理论的束缚，但是据信可裂解部分在细胞内被一种或多种核酸酶裂解。在某些实施方案中，一种或多种核酸酶裂解可裂解部分与接头之间的磷酸二酯键联。在某些实施方案中，可裂解部分具有选自以下的结构：
[0269]
[0270] 其中Bx、Bx1、Bx2和Bx3中的每一个独立地为杂环碱基部分。在某些实施方案中，可裂解部分具有选自以下的结构：
[0271]
[0272] iii.某些接头
[0273] 在某些实施方案中，缀合物基团包含接头。在某些所述实施方案中，接头共价结合至可裂解部分。在某些所述实施方案中，接头共价结合至反义寡核苷酸。在某些实施方案中，接头共价结合至细胞靶向部分。在某些实施方案中，接头还包含对固体载体的共价连
接。在某些实施方案中，接头还包含对蛋白质结合部分的共价连接。在某些实施方案中，接头还包含对固体载体的共价连接并且还包含对蛋白质结合部分的共价连接。在某些实施方
案中，接头包括多个用于连接束缚配体(tethered ligand)的位置。在某些实施方案中，接头包括多个用于连接束缚配体的位置并且不连接至支链基团。在某些实施方案中，接头还
包含一个或多个可裂解键。在某些实施方案中，缀合物基团不包括接头。
[0274] 在某些实施方案中，接头包括至少线性基团，所述线性基团包含选自以下的基团：烷基、酰胺、二硫化物、聚乙二醇、醚、硫醚(-S-)和羟氨基(-O-N(H)-)。在某些实施方案中，线性基团包含选自以下的基团：烷基、酰胺和醚基团。在某些实施方案中，线性基团包含选自烷基和醚基团的基团。在某些实施方案中，线性基团包含至少一个磷连接基团。在某些
实施方案中，线性基团包含至少一个磷酸二酯基团。在某些实施方案中，线性基团包括至少一个中性连接基团。在某些实施方案中，线性基团共价连接至细胞靶向部分和可裂解部分。
在某些实施方案中，线性基团共价连接至细胞靶向部分和反义寡核苷酸。在某些实施方案
中，线性基团共价连接至细胞靶向部分、可裂解部分和固体载体。在某些实施方案中，线性基团共价连接至细胞靶向部分、可裂解部分、固体载体和蛋白质结合部分。在某些实施方案中，线性基团包括一个或多个可裂解键。
[0275] 在某些实施方案中，接头包括共价连接至支架基团的线性基团。在某些实施方案中，支架包括支链脂肪族基团，所述支链脂肪族基团包含选自以下的基团：烷基、酰胺、二硫化物、聚乙二醇、醚、硫醚和羟氨基。在某些实施方案中，支架包括支链脂肪族基团，所述支链脂肪族基团包含选自以下的基团：烷基、酰胺和醚基团。在某些实施方案中，支架包括至少一个单环系统或多环系统。在某些实施方案中，支架包括至少两个单环系统或多环系统。
在某些实施方案中，线性基团共价连接至支架基团并且支架基团共价连接至可裂解部分和
接头。在某些实施方案中，线性基团共价连接至支架基团并且支架基团共价连接至可裂解
部分、接头和固体载体。在某些实施方案中，线性基团共价连接至支架基团并且支架基团共价连接至可裂解部分、接头和蛋白质结合部分。在某些实施方案中，线性基团共价连接至支架基团并且支架基团共价连接至可裂解部分、接头、蛋白质结合部分和固体载体。在某些实施方案中，支架基团包括一个或多个可裂解键。
[0276] 在某些实施方案中，接头包括蛋白质结合部分。在某些实施方案中，蛋白质结合部分为脂质，例如像包括但不限于：胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、
1,3-二-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯
甲基或吩噁嗪)、维生素(例如，叶酸、维生素A、维生素E、生物素、吡哆醛)、肽、碳水化合物(例如，单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖、多糖)、溶内体组分、类固醇(例如，熊果醇、龙舌兰皂苷配基、薯蓣皂苷配基)、萜烯(例如，三萜烯，例如萨洒皂草配基、无羁萜、表无羁萜醇衍生的石胆酸)或阳离子脂质。在某些实施方案中，蛋白质结合部分为C16至C22长链饱和或
不饱和的脂肪酸、胆固醇、胆酸、维生素E、金刚烷或1-五氟丙基。
[0277] 在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
[0278]
[0279] 其中每个n独立地为1至20；并且p为1至6。
[0280] 在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
[0281]
[0282] 其中每个n独立地为1至20。
[0283] 在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
[0284]
[0285] 其中n为1至20。
[0286] 在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
[0287]
[0288] 其中每个L独立地为磷连接基团或中性连接基团；并且
[0289] 每个n独立地为1至20。
[0290] 在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
[0291]
[0292]
[0293] 在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
[0294]
[0295] 在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
[0296]
[0297] 在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
[0298]
[0299] 其中n为1至20。
[0300] 在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
[0301] 在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
[0302]
[0303] 在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
[0304]
[0305] 在某些实施方案中，缀合物接头具有以下结构：
[0306]
[0307] 在某些实施方案中，缀合物接头具有以下结构：
[0308]
[0309] 在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
[0310]
[0311] 在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
[0312]
[0313] 其中每个n独立地为0、1、2、3、4、5、6或7。
[0314] iv.某些细胞靶向部分
[0315] 在某些实施方案中，缀合物基团包含细胞靶向部分。某些所述细胞靶向部分使反义化合物的细胞摄取增加。在某些实施方案中，细胞靶向部分包含支链基团、一个或多个系链和一个或多个配体。在某些实施方案中，细胞靶向部分包含支链基团、一个或多个系链、一个或多个配体以及一个或多个可裂解键。
[0316] 1.某些支链基团
[0317] 在某些实施方案中，缀合物基团包含靶向部分，所述靶向部分包含支链基团和至少两个束缚配体。在某些实施方案中，支链基团连接缀合物接头。在某些实施方案中，支链基团连接可裂解部分。在某些实施方案中，支链基团连接反义寡核苷酸。在某些实施方案
中，支链基团共价连接至接头和每个束缚配体。在某些实施方案中，支链基团包含支链脂肪族基团，所述支链脂肪族基团包含选自以下的基团：烷基、酰胺、二硫化物、聚乙二醇、醚、硫醚和羟氨基。在某些实施方案中，支链基团包含选自以下的基团：烷基、酰胺和醚基团。在某些实施方案中，支链基团包含选自烷基和醚基团的基团。在某些实施方案中，支链基团包含单环系统或多环系统。在某些实施方案中，支链基团包含一个或多个可裂解键。在某些
实施方案中，缀合物基团不包括支链基团。
[0318] 在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：
[0319]
[0320] 其中每个n独立地为1至20；
[0321] j为1至3；并且
[0322] m为2至6。
[0323] 在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：
[0324]
[0325] 其中每个n独立地为1至20；并且
[0326] m为2至6。
[0327] 在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：
[0328]
[0329] 在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：
[0330]
[0331] 其中每个A1独立地为O、S、C＝O或NH；并且
[0332] 每个n独立地为1至20。
[0333] 在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：
[0334]
[0335] 其中每个A1独立地为O、S、C＝O或NH；并且
[0336] 每个n独立地为1至20。
[0337] 在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：
[0338]
[0339] 其中A1为O、S、C＝O或NH；并且
[0340] 每个n独立地为1至20。
[0341] 在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：
[0342]
[0343] 在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：
[0344]
[0345] 在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：
[0346]
[0347] 2.某些系链
[0348] 在某些实施方案中，缀合物基团包含共价连接至支链基团的一个或多个系链。在某些实施方案中，缀合物基团包含共价连接至连接基团的一个或多个系链。在某些实施方
案中，每个系链为包含选自以下的一个或多个基团的线性脂肪族基团：处于任何组合的烷
基、醚、硫醚、二硫化物、酰胺和聚乙二醇基团。在某些实施方案中，每个系链为包含选自以下的一个或多个基团的线性脂肪族基团：处于任何组合的烷基、取代的烷基、醚、硫醚、二硫化物、酰胺、磷酸二酯和聚乙二醇基团。在某些实施方案中，每个系链为包含选自以下的一个或多个基团的线性脂肪族基团：处于任何组合的烷基、醚和酰胺基团。在某些实施方案
中，每个系链为包含选自以下的一个或多个基团的线性脂肪族基团：处于任何组合的烷基、取代的烷基、磷酸二酯、醚和酰胺基团。在某些实施方案中，每个系链为包含选自以下的一个或多个基团的线性脂肪族基团：处于任何组合的烷基和磷酸二酯。在某些实施方案中，每个系链包含至少一个磷连接基团或中性连接基团。
[0349] 在某些实施方案中，系链包括一个或多个可裂解键。在某些实施方案中，系链通过酰胺或醚基团连接至支链基团。在某些实施方案中，系链通过磷酸二酯基团连接至支链基团。在某些实施方案中，系链通过磷连接基团或中性连接基团连接至支链基团。在某些实
施方案中，系链通过醚基团连接至支链基团。在某些实施方案中，系链通过酰胺或醚基团连接至配体。在某些实施方案中，系链通过醚基团连接至配体。在某些实施方案中，系链通过酰胺或醚基团连接至配体。在某些实施方案中，系链通过醚基团连接至配体。
[0350] 在某些实施方案中，每个系链在配体与支链基团之间包含约8至约20个原子的链长。在某些实施方案中，每个系链基团在配体与支链基团之间包含约10至约18个原子的
链长。在某些实施方案中，每个系链基团包含约13个原子的链长。
[0351] 在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：
[0352]
[0353] 其中每个n独立地为1至20；并且
[0354] 每个p为1至约6。
[0355] 在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：
[0356]
[0357] 在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：
[0358]
[0359] 其中每个n独立地为1至20。
[0360] 在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：
[0361]
[0362] 其中L为磷连接基团或中性连接基团；
[0363] Z1为C(＝O)O-R2；
[0364] Z2为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；
[0365] R2为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；并且
[0366] 每个m1独立地为0至20，其中对于每个系链，至少一个m1大于0。
[0367] 在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：
[0368]
[0369] 在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：
[0370]
[0371] 其中Z2为H或CH3；并且
[0372] 每个m1独立地为0至20，其中对于每个系链，至少一个m1大于0。
[0373] 在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：
[0374] 其中每个n独立地为0、1、2、3、4、5、6或7。
[0375] 在某些实施方案中，系链包含磷连接基团。在某些实施方案中，系链不包含任何酰胺键。在某些实施方案中，系链包含磷连接基团并且不包含任何酰胺键。
[0376] 3.某些配体
[0377] 在某些实施方案中，本公开提供了配体，其中每个配体共价连接至系链。在某些实施方案中，每个配体经过选择以对靶细胞上的至少一种类型的受体具有亲合力。在某些实施方案中，选择对哺乳动物肝脏细胞表面上的至少一种类型的受体具有亲合力的配体。在
某些实施方案中，选择对肝去唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)具有亲合力的配体。在某些实施
方案中，每个配体为碳水化合物。在某些实施方案中，每个配体独立地选自半乳糖、N-乙酰基半乳糖胺、甘露糖、葡萄糖、葡糖胺以及岩藻糖。在某些实施方案中，每个配体为N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。在某些实施方案中，靶向部分包含2至6个配体。在某些实施方案
中，靶向部分包含3个配体。在某些实施方案中，靶向部分包含3个N-乙酰基半乳糖胺配
体。
[0378] 在某些实施方案中，配体为碳水化合物、碳水化合物衍生物、改性的碳水化合物、多价碳水化合物聚簇、多糖、改性的多糖或多糖衍生物。在某些实施方案中，配体为氨基糖或硫代糖。例如，氨基糖可选自任何数目的本领域中已知的化合物，例如葡糖胺、唾液
酸、α-D-半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、2-乙酰氨基-2-脱氧-D-吡喃半乳糖(GalNAc)、
2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖(β-胞壁酸)、2-脱氧-2-甲
基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰氨基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、
2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖和N-磺基-D-葡糖胺以及N-乙醇酰基-α-神经氨
酸。例如，硫代糖可选自由以下组成的组：5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰
基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖以及
3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯。
[0379] 在某些实施方案中，“GalNac”或“Gal-NAc”是指2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖，在文献中通常称为N-乙酰基半乳糖胺。在某些实施方案中，“N-乙酰基半乳糖胺”是指2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖。在某些实施方案中，“GalNac”或“Gal-NAc”是指2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖。在某些实施方案中，“GalNac”或“Gal-NAc”是指2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖，其包括β形式：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-β-D-吡
喃半乳糖和α形式：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖。在某些实施方案中，β形
式：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖和α形式：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡
喃半乳糖可互换使用。因此，在其中描绘一种形式的结构中，这些结构也意图包括另一种形式。例如，在针对α形式：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖示出结构时，该结构也
意图包括另一种形式。在某些实施方案中，在某些优选的实施方案中，β形式2-(乙酰氨
基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖为优选的实施方案。
[0380]
[0381] 2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖
[0382]
[0383] 2-(乙酰氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖
[0384]
[0385] 2-(乙酰氨基)-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖
[0386] 在某些实施方案中，一个或多个配体具有选自以下的结构：
[0387]
[0388] 其中每个R1选自OH和NHCOOH。
[0389] 在某些实施方案中，一个或多个配体具有选自以下的结构：
[0390]
[0391] 在某些实施方案中，一个或多个配体具有选自以下的结构：
[0392]
[0393] 在某些实施方案中，一个或多个配体具有选自以下的结构：
[0394]
[0395] i.某些缀合物
[0396] 在某些实施方案中，缀合物基团包含以上结构特征。在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
[0397]
[0398] 其中每个n独立地为1至20。
[0399] 在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
[0400]
[0401] 在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
[0402]
[0403] 其中每个n独立地为1至20；
[0404] Z为H或连接的固体载体；
[0405] Q为反义化合物；
[0406] X为O或S；并且
[0407] Bx为杂环碱基部分。
[0408] 在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
[0409]
[0410] 在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
[0411]
[0412] 在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
[0413]
[0414] 在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
[0415]
[0416] 在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
[0417]
[0418] 在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
[0419]
[0420] 在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
[0421]
[0422] 在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
[0423]
[0424] 在某些实施方案中，缀合物不包含吡咯烷。
[0425] 在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
[0426]
[0427] 在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
[0428]
[0429] 在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
[0430]
[0431] 在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
[0432]
[0433] 在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
[0434]
[0435] 在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
[0436]
[0437] 在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
[0438]
[0439] 在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
[0440]
[0441] 在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
[0442]
[0443] 在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
[0444]
[0445] 在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
[0446]
[0447] 在某些实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
[0448]
[0449] 其中X为具有六至十一个连续键合的原子的取代或未取代的系链。
[0450] 在某些实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
[0451]
[0452] 其中X为具有十个连续键合的原子的取代或未取代的系链。
[0453] 在某些实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
[0454]
[0455] 其中X为具有四至十一个连续键合的原子的取代或未取代的系链并且其中系链包含恰好一个酰胺键。
[0456] 在某些实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
[0457]
[0458] 其中Y和Z独立地选自C1-C12取代或未取代的烷基、烯基或炔基，或包含醚、酮、酰胺、酯、氨基甲酸酯、胺、哌啶、磷酸酯、磷酸二酯、硫代磷酸酯、三唑、吡咯烷、二硫化物或硫醚的基团。
[0459] 在某些所述实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
[0460]
[0461] 其中Y和Z独立地选自C1-C12取代或未取代的烷基，或包含恰好一个醚或恰好两个醚、酰胺、胺、哌啶、磷酸酯、硫酸二酯或硫代磷酸酯的基团。
[0462] 在某些所述实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
[0463]
[0464] 其中Y和Z独立地选自C1-C12取代或未取代的烷基。
[0465] 在某些所述实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
[0466]
[0467] 其中m和n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12。
[0468] 在某些所述实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
[0469]
[0470] 其中m为4、5、6、7或8，并且n为1、2、3或4。
[0471] 在某些实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
[0472]
[0473] 其中X为具有四至十三个连续键合的原子的取代或未取代的系链，并且其中X不包含醚基团。
[0474] 在某些实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
[0475]
[0476] 其中X为具有八个连续键合的原子的取代或未取代的系链，并且其中X不包含醚基团。
[0477] 在某些实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
[0478]
[0479] 其中X为具有四至十三个连续键合的原子的取代或未取代的系链，并且其中系链包含恰好一个酰胺键，并且其中X不包含醚基团。
[0480] 在某些实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
[0481]
[0482] 其中X为具有四至十三个连续键合的原子的取代或未取代的系链并且其中系链由酰胺键和取代或未取代的C2-C11烷基组成。
[0483] 在某些实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
[0484]
[0485] 其中Y选自C1-C12取代或未取代的烷基、烯基或炔基，或包含醚、酮、酰胺、酯、氨基甲酸酯、胺、哌啶、磷酸酯、磷酸二酯、硫代磷酸酯、三唑、吡咯烷、二硫化物或硫醚的基团。
[0486] 在某些所述实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
[0487]
[0488] 其中Y选自C1-C12取代或未取代的烷基，或包含醚、胺、哌啶、磷酸酯、磷酸二酯或硫代磷酸酯的基团。
[0489] 在某些所述实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
[0490]
[0491] 其中Y选自C1-C12取代或未取代的烷基。
[0492] 在某些所述实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
[0493]
[0494] 其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。
[0495] 在某些所述实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
[0496]
[0497] 其中n为4、5、6、7或8。
[0498] b.某些缀合反义化合物
[0499] 在某些实施方案中，缀合物在核苷的2’、3’或5’位上结合至反义寡核苷酸的核苷。在某些实施方案中，缀合反义化合物具有以下结构：
[0500]
[0501] 其中
[0502] A为反义寡核苷酸；
[0503] B为可裂解部分
[0504] C为缀合物接头
[0505] D为支链基团
[0506] 每个E为系链；
[0507] 每个F为配体；并且
[0508] q为1与5之间的整数。
[0509] 在某些实施方案中，缀合反义化合物具有以下结构：
[0510]
[0511] 其中
[0512] A为反义寡核苷酸；
[0513] C为缀合物接头
[0514] D为支链基团
[0515] 每个E为系链；
[0516] 每个F为配体；并且
[0517] q为1与5之间的整数。
[0518] 在某些所述实施方案中，缀合物接头包含至少一个可裂解键。
[0519] 在某些所述实施方案中，支链基团包含至少一个可裂解键。
[0520] 在某些实施方案中，每个系链包含至少一个可裂解键。
[0521] 在某些实施方案中，缀合物在核苷的2’、3’或5’位上结合至反义寡核苷酸的核苷。
[0522] 在某些实施方案中，缀合反义化合物具有以下结构：
[0523]
[0524] 其中
[0525] A为反义寡核苷酸；
[0526] B为可裂解部分
[0527] C为缀合物接头
[0528] 每个E为系链；
[0529] 每个F为配体；并且
[0530] q为1与5之间的整数。
[0531] 在某些实施方案中，缀合物在核苷的2’、3’或5’位上结合至反义寡核苷酸的核苷。在某些实施方案中，缀合反义化合物具有以下结构：
[0532]
[0533] 其中
[0534] A为反义寡核苷酸；
[0535] C为缀合物接头
[0536] 每个E为系链；
[0537] 每个F为配体；并且
[0538] q为1与5之间的整数。
[0539] 在某些实施方案中，缀合反义化合物具有以下结构：
[0540]
[0541] 其中
[0542] A为反义寡核苷酸；
[0543] B为可裂解部分
[0544] D为支链基团
[0545] 每个E为系链；
[0546] 每个F为配体；并且
[0547] q为1与5之间的整数。
[0548] 在某些实施方案中，缀合反义化合物具有以下结构：
[0549]
[0550] 其中
[0551] A为反义寡核苷酸；
[0552] D为支链基团
[0553] 每个E为系链；
[0554] 每个F为配体；并且
[0555] q为1与5之间的整数。
[0556] 在某些所述实施方案中，缀合物接头包含至少一个可裂解键。
[0557] 在某些实施方案中，每个系链包含至少一个可裂解键。
[0558] 在某些实施方案中，缀合反义化合物具有选自以下的结构：
[0559]
[0560] 在某些实施方案中，缀合反义化合物具有选自以下的结构：
[0561]
[0562] 在某些实施方案中，缀合反义化合物具有选自以下的结构：
[0563]
[0564] 教导某些上述缀合物、缀合反义化合物、系链、接头、支链基团、配体、可裂解部分以及其它修饰的制备的代表性美国专利、美国专利申请公布和国际专利申请公布包括但不限于US 5,994,517、US 6,300,319、US 6,660,720、US 6,906,182、US 7,262,177、
US 7,491,805、US 8,106,022、US 7,723,509、US 2006/0148740、US 2011/0123520、WO
2013/033230和WO 2012/037254，所述专利中的每一个均以引用的方式整体并入本文。
[0565] 教导某些上述缀合物、缀合反义化合物、系链、接头、支链基团、配体、可裂解部分以及其它修饰的代表性出版物包括但不限于BIESSEN等，"The Cholesterol
Derivative of a Triantennary Galactoside with High Affinity for the Hepatic
Asialoglycoprotein Receptor:a Potent Cholesterol Lowering Agent"J.Med.
Chem.(1995)38:1846-1852；BIESSEN 等，"Synthesis of Cluster Galactosides with
High Affinity for the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor"J.Med.Chem.
(1995)38:1538-1546；LEE 等，"New and more efficient multivalent glyco-ligands
for asialoglycoprotein receptor of mammalian hepatocytes"Bioorganic&Medicina
l Chemistry(2011)19:2494-2500；RENSEN等，"Determination of the Upper Size Limit for Uptake and Processing of Ligands by the Asialoglycoprotein Receptor on
Hepatocytes in Vitro and in Vivo"J.Biol.Chem.(2001)276(40):37577-37584；RENSEN
等，"Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor"J.Med.Chem.(2004)47:5798-5808；SLIEDREGT等，"Design and Synthesis of Novel Amphiphilic Dendritic Galactosides for Selective Targeting of Liposomes to the Hepatic
Asialoglycoprotein Receptor"J.Med.Chem.(1999)42:609-618 以 及 Valentijn 等，
“Solid-phase synthesis of lysine-based cluster galactosides with high affinity for the Asialoglycoprotein Receptor”Tetrahedron,1997,53(2),759-770，所述参考文献中的每一个均以引用的方式整体并入本文。
[0566] 在某些实施方案中，缀合反义化合物包含基于RNA酶H的寡核苷酸(如缺口聚物)或剪接调节寡核苷酸(如完全修饰的寡核苷酸)和包含至少一个、两个或
三个GalNAc基团的任何缀合物基团。在某些实施方案中，缀合反义化合物包含见
于任何以下参考文献中的任何缀合物基团：Lee,Carbohydr Res,1978,67,509-514；
Connolly 等，J Biol Chem,1982,257,939-945；Pavia 等，Int J Pep Protein
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WO2012/068187；WO2009/126933；WO2004/024757；WO2010/054406；WO2012/089352；
WO2012/089602；WO2013/166121；WO2013/165816；美 国 专 利 4,751,219；8,552,163；
6,908,903；7,262,177；5,994,517；6,300,319；8,106,022；7,491,805；7,491,805；
7,582,744；8,137,695；6,383,812；6,525,031；6,660,720；7,723,509；8,541,548；
8,344,125；8,313,772；8,349,308；8,450,467；8,501,930；8,158,601；7,262,177；
6,906,182；6,620,916；8,435,491；8,404,862；7,851,615；已公布的美国专利申请公布US2011/0097264；US2011/0097265；US2013/0004427；US2005/0164235；US2006/0148740；
US2008/0281044；US2010/0240730；US2003/0119724；US2006/0183886；US2008/0206869；
US2011/0269814；US2009/0286973；US2011/0207799；US2012/0136042；US2012/0165393；
US2008/0281041；US2009/0203135；US2012/0035115；US2012/0095075；US2012/0101148；
US2012/0128760；US2012/0157509；US2012/0230938；US2013/0109817；US2013/0121954；
US2013/0178512；US2013/0236968；US2011/0123520；US2003/0077829；US2008/0108801以及US2009/0203132；所述参考文献中的每一个均以引用的方式整体并入。
[0567] C.某些用途和特征
[0568] 在某些实施方案中，缀合反义化合物表现出有效的体内靶RNA减少。在某些实施方案中，未缀合反义化合物在肾中积累。在某些实施方案中，缀合反义化合物在肝脏中积
累。在某些实施方案中，缀合反义化合物为耐受良好的。所述性质使得缀合反义化合物特
别有用于抑制许多靶RNA，包括但不限于涉及代谢、心血管和其它疾病、病症或病状的那些。
因此，本文提供了通过使肝脏组织与靶向与所述疾病、病症或病状相关的RNA的缀合反义
化合物接触来治疗所述疾病、病症或病状的方法。因此，还提供了用于使用本发明的缀合反义化合物来改善各种代谢、心血管和其它疾病、病症或病状中的任何一种的方法。
[0569] 在某些实施方案中，缀合反义化合物在特定的组织浓度下比未缀合的对应物更有效。不希望受任何理论或机制的束缚，在某些实施方案中，缀合物可允许缀合反义化合物更有效地进入细胞或更有成效地进入细胞。例如，在某些实施方案中，缀合反义化合物与其未缀合的对应物相比可表现出更大的靶标减少，其中缀合反义化合物和其未缀合的对应物均
以相同的浓度存在于组织中。例如，在某些实施方案中，缀合反义化合物与其未缀合的对应物相比可表现出更大的靶标减少，其中缀合反义化合物和其未缀合的对应物均以相同的浓
度存在于肝脏中。
[0570] 先前已讨论了寡核苷酸的产生性和非产生性摄取(参见例如Geary,R.S.,E.Wancewicz等(2009)."Effect of Dose and Plasma Concentration on Liver Uptake
and Pharmacologic Activity of a2'-Methoxyethyl Modified Chimeric Antisense
Oligonucleotide Targeting PTEN."Biochem.Pharmacol.78(3):284-91；&Koller,E.,T.
M.Vincent 等 (2011)."Mechanisms of single-stranded phosphorothioate modified
antisense oligonucleotide accumulation in hepatocytes."Nucleic Acids
Res.39(11):4795-807)。本文描述的缀合物基团可改进产生性摄取。
[0571] 在某些实施方案中，本文描述的缀合物基团可通过增加缀合反义化合物对特定类型的细胞或组织的亲合力来进一步改进效力。在某些实施方案中，本文描述的缀合物基团
可通过增加一种或多种细胞表面受体对缀合反义化合物的识别来进一步改进效力。在某些
实施方案中，本文描述的缀合物基团可通过促进缀合反义化合物的内吞作用来进一步改进
效力。
[0572] 在某些实施方案中，可裂解部分可通过允许缀合物在缀合反义化合物进入细胞之后从反义寡核苷酸中裂解来进一步改进效力。因此，在某些实施方案中，可以低于对未缀合的反义寡核苷酸来说将为必要的剂量施用缀合反义化合物。
[0573] 先前已将硫代磷酸酯键联掺入到反义寡核苷酸中。所述硫代磷酸酯键联对核酸酶具有抗性并且因此改进了寡核苷酸的稳定性。此外，硫代磷酸酯键联还结合某些蛋白
质，这导致反义寡核苷酸在肝脏中的积累。具有较少硫代磷酸酯键联的寡核苷酸在肝脏
中积累较少并且在肾中积累较多(参见，例如Geary,R.,“Pharmacokinetic Properties
of2’-O-(2-Methoxyethyl)-Modified Oligonucleotide Analogs in Rats,”Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，第296卷，第3期，890-897；&Antisense a Drug Technology中的Pharmacological Properties of 2’-O-Methoxyethyl Modified Oligonucleotides，第10章，Crooke,S.T.编著，2008)。在某些实施方案中，具有较少硫代磷酸酯核苷间键联和较多磷酸二酯核苷间键联的寡核苷酸在肝脏中积累较少并且在肾中
积累较多。当治疗肝脏中的疾病时，出于以下若干原因这是不希望的：(1)较少药物到达希望作用的部位(肝脏)；(2)药物逸散到尿液中；以及(3)肾暴露于相对高浓度的药物，这可
导致肾中毒。因此，对于肝脏疾病，硫代磷酸酯键联提供重要益处。
[0574] 然而，在某些实施方案中，统一被硫代磷酸酯核苷间键联连接的寡核苷酸的施用诱发一种或多种促炎性反应。(参见例如：J Lab Clin Med.1996年9月；
128(3):329-38.“Amplification of antibody production by phosphorothioate
oligodeoxynucleotides”.Branda等；并且还参见例如：Antisense a Drug Technology中的Toxicologic Properties，第12章，第342-351页，Crooke,S.T.编著，2008)。在某些实施方案中，其中大多数核苷间键联包含硫代磷酸酯核苷间键联的寡核苷酸的施用诱发一种
或多种促炎性反应。
[0575] 在某些实施方案中，促炎性作用的程度可取决于若干变量(例如骨架修饰、脱靶效应、核碱基修饰和/或核苷修饰)，参见例如：Antisense a Drug Technology中的
Toxicologic Properties，第12章，第342-351页，Crooke,S.T.编著，2008)。在某些实施方案中，促炎性作用的程度可通过调节一个或多个变量来减轻。例如，给定寡核苷酸的促炎性作用的程度可通过用磷酸二酯核苷间键联替代任何数目的硫代磷酸酯核苷间键联并且
由此减少硫代磷酸酯核苷间键联的总数来减轻。
[0576] 在某些实施方案中，将希望减少硫代磷酸酯键联的数目，如果可以在不丧失稳定性并且不使分布从肝脏转移至肾的情况下实现的话。例如，在某些实施方案中，可通过用磷酸二酯键联替代硫代磷酸酯键联来减少硫代磷酸酯键联的数目。在这样一个实施方案中，
具有较少硫代磷酸酯键联和较多磷酸二酯键联的反义化合物可诱发较少的促炎性反应或
不诱导促炎性反应。虽然具有较少硫代磷酸酯键联和较多磷酸二酯键联的反义化合物可诱
发较少的促炎性反应，但是具有较少硫代磷酸酯键联和较多磷酸二酯键联的反义化合物可
以不在肝脏中积累并且与具有较多硫代磷酸酯键联的反义化合物相比在相同或类似的剂
量下可为功效较小的。在某些实施方案中，因此希望设计具有多个磷酸二酯键和多个硫代
磷酸酯键但还具有稳定性和对肝脏的良好分布的反义化合物。
[0577] 在某些实施方案中，缀合反义化合物比未缀合的对应物在肝脏中积累更多并且在肾中积累更少，即使在一些硫代磷酸酯键联被较少促炎性的磷酸二酯核苷间键联替代时也
是如此。在某些实施方案中，缀合反义化合物与其未缀合的对应物相比在肝脏中积累更多
并且没有同样多地排泄到尿液中，即使在一些硫代磷酸酯键联被较少促炎性的磷酸二酯核
苷间键联替代时也是如此。在某些实施方案中，缀合物的使用允许人们设计更有效并且耐
受性更好的反义药物。事实上，在某些实施方案中，缀合反义化合物具有比未缀合的对应
物更大的治疗指数。这允许缀合反义化合物在较高绝对剂量下施用，因为存在较小的促炎
性应答风险和较小的肾毒性风险。这种较高剂量允许人们较不频繁地给药，因为预期清除
(代谢)为类似的。此外，因为化合物更有效，如上所述，所以可允许浓度在下一次剂量之前变低而不失去治疗活性，从而允许给药之间的甚至更长的时间段。
[0578] 在某些实施方案中，包括一些硫代磷酸酯键联仍是希望的。例如，末端键联易受到核酸外切酶的破坏，所以在某些实施方案中，那些键联为硫代磷酸酯或其它修饰的键联。连接两个脱氧核苷的核苷间键联易受到核酸内切酶的破坏，所以在某些实施方案中，那些键联为硫代磷酸酯或其它修饰的键联。修饰核苷与脱氧核苷(其中脱氧核苷在键联脱氧核苷
的5’侧上)之间的核苷间键联易受到核酸内切酶的破坏，所以在某些实施方案中，那些键
联为硫代磷酸酯或其它修饰的键联。某些类型的两个修饰核苷之间和脱氧核苷与某种类型
的修饰核苷(其中修饰核苷处于键联的5’侧)之间的核苷间键联对核酸酶消化具有足够
的抗性，键联可为磷酸二酯。
[0579] 在某些实施方案中，缀合反义化合物的反义寡核苷酸包含少于16个硫代磷酸酯键联。在某些实施方案中，缀合反义化合物的反义寡核苷酸包含少于15个硫代磷酸酯键
联。在某些实施方案中，缀合反义化合物的反义寡核苷酸包含少于14个硫代磷酸酯键联。
在某些实施方案中，缀合反义化合物的反义寡核苷酸包含少于13个硫代磷酸酯键联。在某
些实施方案中，缀合反义化合物的反义寡核苷酸包含少于12个硫代磷酸酯键联。在某些实
施方案中，缀合反义化合物的反义寡核苷酸包含少于11个硫代磷酸酯键联。在某些实施方
案中，缀合反义化合物的反义寡核苷酸包含少于10个硫代磷酸酯键联。在某些实施方案
中，缀合反义化合物的反义寡核苷酸包含少于9个硫代磷酸酯键联。在某些实施方案中，缀合反义化合物的反义寡核苷酸包含少于8个硫代磷酸酯键联。
[0580] 在某些实施方案中，包含本文描述的一个或多个缀合物基团的反义化合物与缺乏所述一个或多个缀合物基团的母体反义化合物相比具有增加的活性和/或效力和/或耐受
性。因此，在某些实施方案中，所述缀合物基团连接至寡核苷酸为希望的。所述缀合物基团可连接在寡核苷酸的5’-末端和/或3’-末端。在某些情况下，5’-末端的连接在合成上
是希望的。通常，通过使用本领域中熟知的技术将3’末端核苷连接至固体载体并且从3’
至5’依次偶联核苷来合成寡核苷酸。因此，如果希望缀合物基团位于3’-末端处，那么人们可(1)将缀合物基团连接至3’-末端核苷并且将所述缀合的核苷连接至固体载体用于随
后寡核苷酸的制备或(2)在合成之后将缀合物基团连接至完全寡核苷酸的3’-末端核苷。
这些方法中没有一个是非常有效的并且因此均为昂贵的。具体来说，虽然在本文的实施例
中展示，但缀合核苷至固体载体的连接是低效的过程。在某些实施方案中，将缀合物基团连接至5’-末端核苷比连接在3’-末端处在合成上更容易。人们可将非缀合的3’末端核苷
连接至固体载体并且使用标准和表征良好的反应制备寡核苷酸。然后人们仅需要在最后的
偶联步骤连接具有缀合物基团的5’核苷。在某些实施方案中，这比将缀合核苷直接连接至固体载体(如通常进行来制备3’-缀合寡核苷酸)更有效。本文的实施例展示了5’-末端
处的连接。另外，某些缀合物基团具有合成优点。例如，包含磷连接基团的某些缀合物基团比包括先前报道的缀合物基团的其它缀合物基团在合成上更简单并且制备更有效(例如，
WO/2012/037254)。
[0581] 在某些实施方案中，向受试者施用缀合反义化合物。在所述实施方案中，包含本文描述的一个或多个缀合物基团的反义化合物与缺乏所述一个或多个缀合物基团的母体反义化合物相比具有增加的活性和/或效力和/或耐受性。不受机制的束缚，据信缀合物基
团有助于分布、递送和/或摄取到靶细胞或组织中。在某些实施方案中，一旦在靶细胞或组织内部，就希望缀合物基团的所有或部分裂解，以释放活性寡核苷酸。在某些实施方案中，整个缀合物基团从寡核苷酸中裂解是不必要的。例如，在实施例20中，向小鼠施用缀合寡
核苷酸并且检测到许多不同的化学物质，所述化学物质各自包含剩余在寡核苷酸上的缀合
物基团的不同部分(表10a)。此缀合反义化合物展示出良好的效力(表10)。因此，在某
些实施方案中，缀合物基团的多个部分裂解的所述代谢特征不干扰活性/效力。尽管如此，在某些实施方案中，希望前药(缀合寡核苷酸)产生单一活性化合物。在某些情况下，如果
发现活性化合物的多种形式，那么确定每一个的相对量和活性可为必要的。在其中需要监
管审查(例如，USFDA或对应机构)的某些实施方案中，希望具有单一(或主要为单一的)
活性物质。在某些所述实施方案中，希望所述单一活性物质为缺乏缀合物基团的任何部分
的反义寡核苷酸。在某些实施方案中，5’-末端处的缀合物基团更可能导致缀合物基团的
完全代谢。不受机制的束缚，负责5’末端(例如，5’核苷)处的代谢的内源性酶可比3’对应物更有活性/更有效。在某些实施方案中，特定缀合物基团更适于单一活性物质的代谢。
在某些实施方案中，某些缀合物基团更适于寡核苷酸的代谢。
[0582] D.反义
[0583] 在某些实施方案中，本发明的低聚化合物为反义化合物。在所述实施方案中，低聚化合物与靶核酸互补。在某些实施方案中，靶核酸为RNA。在某些实施方案中，靶核
酸为非编码RNA。在某些实施方案中，靶核酸编码蛋白质。在某些实施方案中，靶核酸
选自mRNA、前体mRNA、微小RNA、非编码RNA(包括小型非编码RNA)以及启动子指导的
RNA(promoter-directed RNA)。在某些实施方案中，低聚化合物至少部分地与多于一种靶
核酸互补。例如，本发明的低聚化合物可为微小RNA模拟物，其通常结合多个靶标。
[0584] 在某些实施方案中，反义化合物包含具有与靶核酸的核碱基序列至少70％互补的核碱基序列的部分。在某些实施方案中，反义化合物包含具有与靶核酸的核碱基序列至
少80％互补的核碱基序列的部分。在某些实施方案中，反义化合物包含具有与靶核酸的核
碱基序列至少90％互补的核碱基序列的部分。在某些实施方案中，反义化合物包含具有与
靶核酸的核碱基序列至少95％互补的核碱基序列的部分。在某些实施方案中，反义化合物
包含具有与靶核酸的核碱基序列至少98％互补的核碱基序列的部分。在某些实施方案中，
反义化合物包含具有与靶核酸的核碱基序列100％互补的核碱基序列的部分。在某些实施
方案中，反义化合物在反义化合物的整个长度上与靶核酸的核碱基序列至少70％、80％、
90％、95％、98％或100％互补。
[0585] 反义机制包括涉及低聚化合物与靶核酸的杂交的任何机制，其中杂交产生生物作用。在某些实施方案中，所述杂交导致靶核酸降解或占位并伴有细胞机器的抑制或刺激，涉及例如靶核酸或靶核苷酸可能以另外的方式与其相互作用的核酸的翻译、转录或聚腺苷酸
化。
[0586] 涉及靶RNA的降解的一种类型的反义机制为RNA酶H介导的反义。RNA酶H为裂解RNA:DNA双链体的RNA链的细胞核酸内切酶。本领域已知“DNA样”的单链反义化合物在
哺乳动物细胞中引发RNA酶H活性。因此，RNA酶H的激活导致RNA靶标的裂解，从而极大
地增强了基因表达的DNA样寡核苷酸介导的抑制的效率。
[0587] 反义机制还包括但不限于利用RISC途径的RNAi机制。所述RNAi机制包括但不限于siRNA、ssRNA和微小RNA机制。所述机制包括产生微小RNA模拟物和/或抗微小RNA。
[0588] 反义机制还包括但不限于杂交或模拟非编码RNA而不是微小RNA或mRNA的机制。所述非编码RNA包括但不限于启动子指导的RNA和影响一种或多种核酸的转录或翻译的短
和长RNA。
[0589] 在某些实施方案中，包含本文描述的缀合物的寡核苷酸为RNAi化合物。在某些实施方案中，包含本文描述的缀合物的低聚寡核苷酸为ssRNA化合物。在某些实施方案中，包含本文描述的缀合物的寡核苷酸与第二低聚化合物配对以形成siRNA。在某些所述实施方
案中，第二低聚化合物也包含缀合物。在某些实施方案中，第二低聚化合物为任何修饰或未修饰的核酸。在某些实施方案中，包含本文描述的缀合物的寡核苷酸为siRNA化合物中的
反义链。在某些实施方案中，包含本文描述的缀合物的寡核苷酸为siRNA化合物中的有义
链。在其中缀合低聚化合物为双链siRnA的实施方案中，缀合物可位于有义链、反义链或有义链和反义链两者上。
[0590] D.靶核酸、区域和区段
[0591] 在某些实施方案中，缀合反义化合物靶向任何核酸。在某些实施方案中，靶核酸编码临床相关的靶蛋白。在所述实施方案中，靶核酸的调节产生临床益处。某些靶核酸包括但不限于表1中所示的靶核酸。
[0592] 表1：某些靶核酸
[0593]
[0594] 靶向过程通常包括确定靶核酸内的至少一个靶区域、区段或位点用于发生反义相互作用，使得将产生希望的作用。
[0595] 在某些实施方案中，靶区域为核酸的结构限定区。例如，在某些所述实施方案中，靶区域可涵盖3’UTR、5’UTR、外显子、内含子、编码区、翻译起始区、翻译终止区，或其它限定的核酸区域或靶区段。
[0596] 在某些实施方案中，靶区段为缀合反义化合物靶向的靶区域的至少约8个核碱基部分。靶区段可包括从靶区段之一的5'-末端起包含至少8个连续核碱基的DNA或RNA序
列(其余核碱基为紧邻靶区段的5'-末端上游开始并且继续直到DNA或RNA包含约8至约
30个核碱基为止的相同DNA或RNA的连续链段)。靶区段还由从靶区段之一的3'-末端起
包含至少8个连续核碱基的DNA或RNA序列表示(其余核碱基为紧邻靶区段的3'-末端下
游开始并且继续直到DNA或RNA包含约8至约30个核碱基为止的相同DNA或RNA的连续
链段)。靶区段还可由从靶区段的序列的内部起包含至少8个连续核碱基的DNA或RNA序
列表示，并且可在任一或两个方向上延伸直到缀合反义化合物包含约8至约30个核碱基。
[0597] 在某些实施方案中，靶向表1中列出的核酸的反义化合物可如本文所述进行修饰。在某些实施方案中，反义化合物可具有修饰的糖部分、未修饰的糖部分或如本文所述的修饰和未修饰的糖部分的混合物。在某些实施方案中，反义化合物可具有修饰的核苷间键
联、未修饰的核苷间键联或如本文所述的修饰和未修饰的核苷间键联的混合物。在某些实
施方案中，反义化合物可具有修饰的核碱基、未修饰的核碱基或如本文所述的修饰和未修
饰的核碱基的混合物。在某些实施方案中，反义化合物可具有如本文所述的基序。
[0598] 在某些实施方案中，靶向表1中列出的核酸的反义化合物可如本文所述进行缀合。
[0599] 1.乙型肝炎(HBV)
[0600] 乙型肝炎为通过受污染的材料如血液和血液制品、受污染的针肠胃外传播、性传播以及由受感染的或为携带者的母亲垂直传播给其后代的病毒性疾病。据世界卫生组织估
计全世界已有大于20亿人感染，其中每年约4百万急性病例、每年1百万死亡以及3.5-4
亿慢性携带者(World Health Organization:Geographic Prevalence of Hepatitis
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hepbprev.htm)。
[0601] HBV病毒为仅感染人和非人灵长类动物的双链嗜肝病毒。病毒复制主要发生在肝脏中，并且在较小程度上，发生在肾、胰腺、骨髓和脾脏中(Hepatitis B virus biology.Microbiol Mol Biol Rev.64:2000；51-68.)。病毒和免疫标志物在血液中可检测并且特
征性抗原-抗体模式随时间推移而发展。第一可检测病毒标志物为HBsAg，接着为乙型肝
炎e抗原(HBeAg)和HBV DNA。在孵育时期期间滴度可能为高的，但HBV DNA和HBeAg水
平在疾病发作时开始下降并且在临床疾病顶峰时可能为不可检测的(Hepatitis B virus
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[0602] 目前由美国肝脏疾病研究协会(AASLD)和欧洲肝脏研究协会(EASL)推荐的用于慢性HBV感染的疗法包括干扰素α(INFα)、聚乙二醇化干扰素α-2a(Peg-IFN2a)、恩替卡
韦(entecavir)和替诺福韦(tenofovir)。核苷和核碱基疗法(恩替卡韦和替诺福韦)在减
少病毒载量上是成功的，但HBeAg血清转化和HBsAg消失的速率甚至比使用IFNα疗法所
获得的那些还要低。还使用了包括拉米夫定(lamivudine)(3TC)、替比夫定(telbivudine)
(LdT)和阿德福韦(adefovir)的其它类似疗法，但一般来说对于核苷/核碱基疗法，抗性的
出现限制了治疗功效。
[0603] 因此，本领域中存在发现和开发新的抗病毒疗法的需要。另外，存在对能够增加HBeAg和HBsAg血清转化速率的新的抗HBV疗法的需要。最近的临床研究发现了血清转化
与HBeAg减少(Fried等(2008)Hepatology 47:428)和HBsAg减少(Moucari等(2009)
Hepatology49:1151)之间的关系。抗原水平的减少可允许HBV感染的免疫学控制，因为据
认为高水平抗原诱导免疫耐受性。目前用于HBV的核苷疗法能够急剧减少HBV的血清水平，
但对HBeAg和HBsAg水平几乎没有影响。
[0604] 靶向HBV的反义化合物先前已公开于WO2011/047312、WO2012/145674和WO2012/145697中，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。计划临床研究以评估靶向
HBV的反义化合物在患者中的作用。然而，仍存在为患者提供另外的并且更有效的治疗选择的需要。
[0605] 靶向HBV核酸的某些缀合反义化合物
[0606] 在某些实施方案中，缀合反义化合物靶向具有 登录号U95551.1的序列的HBV核酸，所述序列作为SEQ ID NO:1并入本文。在某些所述实施方案中，靶向SEQ
ID NO:1的缀合反义化合物与SEQ ID NO:1至少90％、至少95％或100％互补。
[0607] 在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:1的缀合反义化合物包含SEQ ID NO:3的至少8个连续核碱基序列。在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:1的缀合反义化合物包含SEQ
ID NO:3的核碱基序列。
[0608] 在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:1的缀合反义化合物包含SEQ ID NO:4的至少8个连续核碱基序列。在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:1的缀合反义化合物包含SEQ
ID NO:4的核碱基序列。
[0609] 在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:1的缀合反义化合物包含SEQ ID NO:5的至少8个连续核碱基序列。在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:1的缀合反义化合物包含SEQ
ID NO:5的核碱基序列。
[0610] 在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:1的缀合反义化合物包含SEQ ID NO:6的至少8个连续核碱基序列。在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:1的缀合反义化合物包含SEQ
ID NO:6的核碱基序列。
[0611] 在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:1的缀合反义化合物包含SEQ ID NO:7的至少8个连续核碱基序列。在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:1的缀合反义化合物包含SEQ
ID NO:7的核碱基序列。
[0612] 在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:1的缀合反义化合物包含SEQ ID NO:8的至少8个连续核碱基序列。在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:1的缀合反义化合物包含SEQ
ID NO:8的核碱基序列。
[0613] 在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:1的缀合反义化合物包含SEQ ID NO:9的至少8个连续核碱基序列。在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:1的缀合反义化合物包含SEQ
ID NO:9的核碱基序列。
[0614] 在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:1的缀合反义化合物包含SEQ ID NO:10的至少8个连续核碱基序列。在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:1的缀合反义化合物包含SEQ
ID NO:10的核碱基序列。
[0615] 在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:1的缀合反义化合物包含SEQ ID NO:11的至少8个连续核碱基序列。在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:1的缀合反义化合物包含SEQ
ID NO:11的核碱基序列。
[0616] 表2：靶向HBV SEQ ID NO:1的反义化合物
[0617]
[0618] 在某些实施方案中，化合物包含ISIS 505358和缀合物基团或由ISIS 505358和缀合物基团组成。ISIS 505358是具有下式的修饰寡核苷酸：Ges mCes Aes Ges Aes Gds
Gds Tds Gds Ads Ads Gds mCds Gds Ads Aes Ges Tes Ges mCe，其中，
[0619] A＝腺嘌呤，
[0620] mC＝5’-甲基胞嘧啶
[0621] G＝鸟嘌呤，
[0622] T＝胸腺嘧啶，
[0623] e＝2’-O-甲氧基乙基修饰核苷，
[0624] d＝2’-脱氧核苷，并且
[0625] s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
[0626] 在某些实施方案中，化合物包含ISIS 509934和缀合物基团或由ISIS 509934和缀合物基团组成。ISIS 509934为具有下式的修饰寡核苷酸：mCes mCes Aes Aes Tes Tds Tds Ads Tds Gds mCds mCds Tds Ads mCds Aes Ges mCes mCes Te，其中，
[0627] A＝腺嘌呤，
[0628] mC＝5’-甲基胞嘧啶
[0629] G＝鸟嘌呤，
[0630] T＝胸腺嘧啶，
[0631] e＝2’-O-甲氧基乙基修饰核苷，
[0632] d＝2’-脱氧核苷，并且
[0633] s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
[0634] 在某些实施方案中，化合物包含ISIS 510100和缀合物基团或由ISIS 510100和缀合物基团组成。ISIS 510100为具有下式的修饰寡核苷酸：Ges Ges mCes Ads Tds Ads
Gds mCds Ads Gds mCds Ads Gds Ges Aes Tes Ge，其中，
[0635] A＝腺嘌呤，
[0636] mC＝5’-甲基胞嘧啶
[0637] G＝鸟嘌呤，
[0638] T＝胸腺嘧啶,
[0639] e＝2’-O-甲氧基乙基修饰核苷，
[0640] d＝2’-脱氧核苷，并且
[0641] s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
[0642] 在某些实施方案中，化合物包含ISIS 552023和缀合物基团或由ISIS 552023和缀合物基团组成。ISIS 552023为具有下式的修饰寡核苷酸：Aes Ges Ges Aes Ges Tes
Tds mCds mCds Gds mCds Ads Gds Tds Ads Tds Ges Ges Aes Te，其中，
[0643] A＝腺嘌呤，
[0644] mC＝5’-甲基胞嘧啶
[0645] G＝鸟嘌呤，
[0646] T＝胸腺嘧啶，
[0647] e＝2’-O-甲氧基乙基修饰核苷，
[0648] d＝2’-脱氧核苷，并且
[0649] s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
[0650] 在某些实施方案中，化合物包含ISIS 552024和缀合物基团或由ISIS 552024和缀合物基团组成。ISIS 552024为具有下式的修饰寡核苷酸：Ges Tes Ges Aes Aes Ges
mCds Gds Ads Ads Gds Tds Gds mCds Ads mCds Aes mCes Ges Ge，其中，
[0651] A＝腺嘌呤，
[0652] mC＝5’-甲基胞嘧啶
[0653] G＝鸟嘌呤，
[0654] T＝胸腺嘧啶，
[0655] e＝2’-O-甲氧基乙基修饰核苷，
[0656] d＝2’-脱氧核苷，并且
[0657] s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
[0658] 在某些实施方案中，化合物包含ISIS 552032和缀合物基团或由ISIS 552032和缀合物基团组成。ISIS 552032为具有下式的修饰寡核苷酸：Ges Tes Ges mCes Aes Ges
Ads Gds Gds Tds Gds Ads Ads Gds mCds Gds Aes Aes Ges Te，其中，
[0659] A＝腺嘌呤，
[0660] mC＝5’-甲基胞嘧啶
[0661] G＝鸟嘌呤，
[0662] T＝胸腺嘧啶，
[0663] e＝2’-O-甲氧基乙基修饰核苷，
[0664] d＝2’-脱氧核苷，并且
[0665] s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
[0666] 在某些实施方案中，化合物包含ISIS 552859和缀合物基团或由ISIS 552859和缀合物基团组成。ISIS 552859为具有下式的修饰寡核苷酸：Aes Gks Gks Tds Gds Ads
Ads Gds mCds Gds Ads Ads Gds Tks Gks mCe，其中，
[0667] A＝腺嘌呤，
[0668] mC＝5’-甲基胞嘧啶
[0669] G＝鸟嘌呤，
[0670] T＝胸腺嘧啶，
[0671] e＝2’-O-甲氧基乙基修饰核苷，
[0672] k＝cEt修饰核苷，
[0673] d＝2’-脱氧核苷，并且
[0674] s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
[0675] 在某些实施方案中，化合物包含ISIS 552925和缀合物基团或由ISIS 552925和缀合物基团组成。ISIS 552925为具有下式的修饰寡核苷酸：Tes mCks mCds Gds mCds Ads Gds Tds Ads Tds Gds Gds Aks Tes mCks Ge，其中，
[0676] A＝腺嘌呤，
[0677] mC＝5’-甲基胞嘧啶
[0678] G＝鸟嘌呤，
[0679] T＝胸腺嘧啶，
[0680] e＝2’-O-甲氧基乙基修饰核苷，
[0681] k＝cEt修饰核苷，
[0682] d＝2’-脱氧核苷，并且
[0683] s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
[0684] s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
[0685] 在某些实施方案中，化合物包含ISIS 577119和缀合物基团或由ISIS 577119和缀合物基团组成。ISIS 577119为具有下式的修饰寡核苷酸：Aks Ads Tks Tds Tks Ads
Tds Gds mCds mCds Tds Ads mCds Aes Ges mCes mCes Te，其中，
[0686] A＝腺嘌呤，
[0687] mC＝5’-甲基胞嘧啶
[0688] G＝鸟嘌呤，
[0689] T＝胸腺嘧啶，
[0690] e＝2’-O-甲氧基乙基修饰核苷，
[0691] k＝cEt修饰核苷，
[0692] d＝2’-脱氧核苷，并且
[0693] s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
[0694] 在某些实施方案中，具有以下化学结构的化合物包含具有5’-X的ISIS 505358或由具有5’-X的ISIS 505358组成，其中X为如本文所述的缀合物基团：
[0695]
[0696] 在某些实施方案中，化合物包含具有以下化学结构的ISIS 712408或由具有以下化学结构的ISIS 712408组成：
[0697]
[0698] 在某些实施方案中，化合物包含具有以下化学结构的ISIS 695324或由具有以下化学结构的ISIS 695324组成：
[0699]
[0700] 在某些实施方案中，化合物包含SEQ ID NO:3、5’-GalNAc和由以下化学结构表示的化学修饰或由SEQ ID NO:3、5’-GalNAc和由以下化学结构表示的化学修饰组成：
[0701]
[0702] 其中R1为–OCH2CH2OCH3(MOE)并且R2为H；或者R1和R2一起形成桥联，其中R12 1 2
为–O-并且R为–CH2-、-CH(CH3)-或-CH2CH2-，并且R和R 直接连接成使得所得桥联选
自：-O-CH2-、-O-CH(CH3)-和–O-CH2CH2-；
[0703] 并且对于同一环上的每一对R3和R4，独立地对于每个环：R3选自H4 3 4 3
和-OCH2CH2OCH3并 且R 为H；或 者R 和R 一起形成桥联，其中R 为 –O-并
4 3 4
且R为–CH2-、-CH(CH3)-或-CH2CH2-并且R和R 直接连接成使得所得桥联选
自：-O-CH2-、-O-CH(CH3)-和–O-CH2CH2-；
[0704] 并且R5选自H和–CH3；
[0705] 并且Z选自S-和O-。
[0706] 在某些实施方案中，化合物包含公开于以引用的方式整体并入本文的WO2012/145697中的反义寡核苷酸和本文所述的缀合物基团。在某些实施方案中，化合物包
含具有公开于WO 2012/145697中的SEQ ID NO 5-310、321-802、804-1272、1288-1350、
1364-1372、1375、1376和1379中的任一个的核碱基序列的反义寡核苷酸和本文所述的
缀合物基团。在某些实施方案中，化合物包含公开于以引用的方式整体并入本文的WO
2011/047312中的反义寡核苷酸和本文所述的缀合物基团。在某些实施方案中，化合物包
含具有公开于WO 2011/047312中的SEQ ID NO 14-22中的任一个的核碱基序列的反义寡
核苷酸和本文所述的缀合物基团。在某些实施方案中，化合物包含公开于以引用的方式整
体并入本文的WO 2012/145674中的反义寡核苷酸和本文所述的缀合物基团。在某些实施
方案中，化合物包含具有公开于WO 2012/145674中的SEQ ID NO 18-35中的任一个的核碱
基序列的反义寡核苷酸。在某些实施方案中，化合物包含公开于以引用的方式整体并入本
文的WO 2013/159109中的双链寡核苷酸和本文所述的缀合物基团。在某些实施方案中，化
合物包含其中一个链具有公开于WO 2013/159109中的SEQ ID NO 30-125中的任一个的核
碱基序列的双链寡核苷酸。以上提及的所有SEQ ID NO的核碱基序列以引用的方式并入本
文。
[0707] HBV治疗适应症
[0708] 在某些实施方案中，本发明提供了用于使用靶向HBV核酸的缀合反义化合物来调节受试者中HBV的表达的方法。在某些实施方案中，减少了HBV的表达。
[0709] 在某些实施方案中，本发明提供了用于使用药物组合物中靶向HBV核酸的缀合反义化合物来治疗受试者的方法。在某些实施方案中，受试者具有HBV相关的病状。在某些
实施方案中，HBV相关的病状包括但不限于：慢性HBV感染、炎症、纤维化、硬化、肝癌、血清性肝炎、黄疸、肝癌、肝脏炎症、肝纤维化、肝硬化、肝衰竭、弥漫性肝细胞炎症性疾病、噬血细胞综合征、血清性肝炎以及HBV病毒血症。在某些实施方案中，当与对于存在乙型肝炎
病毒、乙型肝炎病毒抗原的阳性测试或对于存在特异于乙型肝炎病毒抗原的抗体的阳性测
试结合时，HBV相关的病状可具有以下病状，所述病状可包括以下中的任何或所有症状：流感样疾病、虚弱、疼痛、头痛、发热、食欲不振、腹泻、黄疸、恶心和呕吐、身体肝脏区域上的疼痛、泥色或灰色粪便、浑身瘙痒以及深色尿。在某些实施方案中，受试者处于HBV相关病状的风险中。这包括具有发展HBV相关病状的一种或多种风险因素的受试者，所述一种或多
种风险因素包括性暴露于感染乙型肝炎病毒的个体、与具有终身乙型肝炎病毒感染的个体
生活在相同的房子中、暴露于感染乙型肝炎病毒的人血液、注射违禁药物、具有血友病的人以及参观乙型肝炎常见的地区。在某些实施方案中，受试者被鉴定为有治疗HBV相关病状
的需要。
[0710] 某些实施方案提供降低感染HBV的动物中HBV DNA和/或HBV抗原水平的方法，其包括向动物施用靶向HBV核酸的缀合反义化合物。在某些实施方案中，抗原为HBsAG或
HBeAG。在某些实施方案中，HBV抗原的量可得到足够减少从而产生血清转化。
[0711] 在某些实施方案中，本发明提供了用于使用靶向HBV核酸的缀合反义化合物制备药品的方法。
[0712] 在某些实施方案中，本发明提供了靶向HBV核酸的缀合反义化合物或其药学上可接受的盐，其用于疗法中。
[0713] 某些实施方案提供靶向HBV核酸的缀合反义化合物，其用于治疗HBV相关的病状。HBV相关的病状包括但不限于：慢性HBV感染、炎症、纤维化、硬化、肝癌、血清性肝炎、黄疸、肝癌、肝脏炎症、肝纤维化、肝硬化、肝衰竭、弥漫性肝细胞炎症性疾病、噬血细胞综合征、血清性肝炎以及HBV病毒血症。
[0714] 某些实施方案提供靶向HBV核酸的缀合反义化合物，其用于降低感染HBV的动物中HBV DNA和/或HBV抗原水平，其包括向动物施用靶向HBV核酸的缀合反义化合物。在
某些实施方案中，抗原为HBsAG或HBeAG。在某些实施方案中，HBV抗原的量可得到足够减
少从而产生血清转化。
[0715] 应理解，本文所述的任何化合物可用于前述方法和用途中。例如，在某些实施方案中，在前述方法和用途中靶向HBV核酸的缀合反义化合物可包括但不限于：靶向SEQ ID
NO:1的缀合反义化合物，其包含SEQ ID NO:3-11中的任一个的至少8个连续核碱基序列；
靶向SEQ ID NO:1的缀合反义化合物，其包含SEQ ID NO:3-11中的任一个的核碱基序列；
包含ISIS 505358、ISIS 509934、ISIS 510100、ISIS 552023、ISIS 552024、ISIS 552032、ISIS 552859、ISIS 552925或ISIS 577119和缀合物基团的化合物或由其组成的化合
物；包含公开于以引用的方式整体并入本文的WO 2012/145697中的反义寡核苷酸和本文
所述的缀合物基团的化合物；包含具有公开于WO 2012/145697中的SEQ ID NO 5-310、
321-802、804-1272、1288-1350、1364-1372、1375、1376和1379中的任一个的核碱基序列的反义寡核苷酸和本文所述的缀合物基团的化合物；包含具有公开于WO 2011/047312中的
SEQ ID NO 14-22中的任一个的核碱基序列的反义寡核苷酸和本文所述的缀合物基团的
化合物；包含具有公开于WO 2012/145674中的SEQ ID NO 18-35中的任一个的核碱基序
列的反义寡核苷酸的化合物；或包含其中一个链具有公开于WO 2013/159109中的SEQ ID
NO30-125中的任一个的核碱基序列的双链寡核苷酸的化合物。
[0716] 2.甲状腺素运载蛋白(TTR)
[0717] TTR(也称为前白蛋白、高甲状腺素血症(hyperthytoxinemia)、前白蛋白异常的(dysprealbuminemic)、甲状腺素；老年全身性淀粉样变性、淀粉样多神经病、淀粉样
变性I、PALB；甲状腺素运载蛋白异常的(dystransthyretinemic)、HST2651；TBPA；前
白蛋白异常的甲状腺机能正常的高甲状腺素血症(dysprealbuminemic euthyroidal
hyperthyroxinemia))为负责甲状腺素和视黄醇运输的血清/血浆和脑脊液蛋白(Sakaki
等，Mol Biol Med.1989,6:161-8)。在结构上，TTR为同四聚体；蛋白质的点突变和错折叠导致淀粉样纤维沉积并且与如老年全身性淀粉样变性(SSA)、家族性淀粉样多神经病(FAP)
和家族性淀粉样心肌病(FAC)的病症相关。
[0718] TTR主要通过肝脏和脑的脉络丛来合成并且在较小程度上通过人的视网膜来合成(Palha,Clin Chem Lab Med,2002,40,1292-1300)。在肝脏中合成的甲状腺素运载蛋白分泌到血液中，而源于脉络丛的甲状腺素运载蛋白的目的地为CSF。在脉络丛中，甲状腺素运载蛋白合成代表了约20％的总局部蛋白合成和多达25％的总CSF蛋白(Dickson等，J Biol
Chem,1986,261,3475-3478)。
[0719] 随着遗传和免疫组织化学诊断测试的可用，已在全世界许多国家发现了患有TTR淀粉样变性的患者。最近研究表明TTR淀粉样变性不像先前所认为的那样是罕见的地方
病，并且可影响多达25％的老年人口(Tanskanen等，Ann Med.2008；40(3):232-9)。
[0720] 在生物化学水平上，TTR被鉴定为FAP患者的淀粉样沉积物中的主要蛋白质组分(Costa等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1978,75:4499–4503)，并且后来发现在蛋白质的
位置30上用甲硫氨酸取代缬氨酸为引起疾病的最常见的分子缺陷(Saraiva等，J.Clin.
Invest.1984,74:104–119)。在FAP中，TTR聚集体和淀粉样纤维的广泛全身性细胞
外沉积发生在整个结缔组织上，具体来说在外周神经系统中(Sousa和Saraiva,Prog.
Neurobiol.2003,71:385–400)。TTR沉积之后，开始于小直径的无髓和有髓纤维的轴突退
化发生，并且最终导致神经节部位处的神经元丢失。
[0721] 靶向TTR的反义化合物先前已公开于US2005/0244869、WO2010/017509和WO2011/139917中，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。靶向TTR的反义寡核苷酸
ISIS-TTRRx目前处于2/3期临床试验以研究其在治疗患有家族性淀粉样多神经病的受试者
中的有效性。然而，仍存在为患者提供另外的并且更有效的治疗选择的需要。
[0722] 靶向TTR核酸的某些缀合反义化合物
[0723] 在某些实施方案中，缀合反义化合物靶向具有 登录号NM_000371.3的序列的TTR核酸，所述序列作为SEQ ID NO:2并入本文。在某些所述实施方
案中，靶向SEQ ID NO:2的缀合反义化合物与SEQ ID NO:2至少90％、至少95％或100％互
补。
[0724] 在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:2的缀合反义化合物包含SEQ ID NO:12-19中任一项的至少8个连续核碱基序列。在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:2的缀合反义
化合物包含SEQ ID NO:12-19中任一项的核碱基序列。
[0725] 在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:2的缀合反义化合物包含SEQ ID NO:12的至少8个连续核碱基序列。在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:2的缀合反义化合物包含SEQ
ID NO:12的核碱基序列。
[0726] 在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:2的缀合反义化合物包含SEQ ID NO:13的至少8个连续核碱基序列。在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:2的缀合反义化合物包含SEQ
ID NO:13的核碱基序列。
[0727] 在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:2的缀合反义化合物包含SEQ ID NO:14的至少8个连续核碱基序列。在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:2的缀合反义化合物包含SEQ
ID NO:14的核碱基序列。
[0728] 在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:2的缀合反义化合物包含SEQ ID NO:15的至少8个连续核碱基序列。在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:2的缀合反义化合物包含SEQ
ID NO:15的核碱基序列。
[0729] 在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:16的缀合反义化合物包含SEQ ID NO:78的至少8个连续核碱基序列。在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:16的缀合反义化合物包含
SEQ ID NO:78的核碱基序列。
[0730] 在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:2的缀合反义化合物包含SEQ ID NO:17的至少8个连续核碱基序列。在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:2的缀合反义化合物包含SEQ
ID NO:17的核碱基序列。
[0731] 在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:2的缀合反义化合物包含SEQ ID NO:18的至少8个连续核碱基序列。在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:2的缀合反义化合物包含SEQ
ID NO:18的核碱基序列。
[0732] 在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:2的缀合反义化合物包含SEQ ID NO:19的至少8个连续核碱基序列。在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:2的缀合反义化合物包含SEQ
ID NO:19的核碱基序列。
[0733] 表3：靶向TTR SEQ ID NO:2的反义化合物
[0734]
[0735]
[0736] 在某些实施方案中，化合物包含ISIS 420915和缀合物基团或由ISIS 420915和缀合物基团组成。ISIS 420915是具有下式的修饰寡核苷酸：Tes mCes Tes Tes Ges Gds
Tds Tds Ads mCds Ads Tds Gds Ads Ads Aes Tes mCes mCes mCe，其中
[0737] A＝腺嘌呤，
[0738] mC＝5’-甲基胞嘧啶
[0739] G＝鸟嘌呤，
[0740] T＝胸腺嘧啶，
[0741] e＝2’-O-甲氧基乙基修饰核苷，
[0742] d＝2’-脱氧核苷，并且
[0743] s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
[0744] 在某些实施方案中，化合物包含ISIS 304299和缀合物基团或由ISIS 304299和缀合物基团组成。ISIS 304299为具有下式的修饰寡核苷酸：mCes Tes Tes Ges Ges Tds
Tds Ads mCds Ads Tds Gds Ads Ads Ads Tes mCes mCes mCes Ae，其中，
[0745] A＝腺嘌呤，
[0746] mC＝5’-甲基胞嘧啶
[0747] G＝鸟嘌呤，
[0748] T＝胸腺嘧啶，
[0749] e＝2’-O-甲氧基乙基修饰核苷，
[0750] d＝2’-脱氧核苷，并且
[0751] s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
[0752] 在某些实施方案中，化合物包含ISIS 420921和缀合物基团或由ISIS 420921和缀合物基团组成。ISIS 420921为具有下式的修饰寡核苷酸：Ges Ges Aes Aes Tes Ads
mCds Tds mCds Tds Tds Gds Gds Tds Tds Aes mCes Aes Tes Ge，其中，
[0753] A＝腺嘌呤，
[0754] mC＝5’-甲基胞嘧啶
[0755] G＝鸟嘌呤，
[0756] T＝胸腺嘧啶,
[0757] e＝2’-O-甲氧基乙基修饰核苷，
[0758] d＝2’-脱氧核苷，并且
[0759] s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
[0760] 在某些实施方案中，化合物包含ISIS 420922和缀合物基团或由ISIS 420922和缀合物基团组成。ISIS 420922为具有下式的修饰寡核苷酸：Tes Ges Ges Aes Aes Tds
Ads mCds Tds mCds Tds Tds Gds Gds Tds Tes Aes mCes Aes Te，其中，
[0761] A＝腺嘌呤，
[0762] mC＝5’-甲基胞嘧啶
[0763] G＝鸟嘌呤，
[0764] T＝胸腺嘧啶，
[0765] e＝2’-O-甲氧基乙基修饰核苷，
[0766] d＝2’-脱氧核苷，并且
[0767] s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
[0768] 在某些实施方案中，化合物包含ISIS 420950和缀合物基团或由ISIS 420950和缀合物基团组成。ISIS 420950为具有下式的修饰寡核苷酸：Tes Tes Tes Tes Aes Tds
Tds Gds Tds mCds Tds mCds Tds Gds mCds mCes Tes Ges Ges Ae，其中，
[0769] A＝腺嘌呤，
[0770] mC＝5’-甲基胞嘧啶
[0771] G＝鸟嘌呤，
[0772] T＝胸腺嘧啶，
[0773] e＝2’-O-甲氧基乙基修饰核苷，
[0774] d＝2’-脱氧核苷，并且
[0775] s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
[0776] 在某些实施方案中，化合物包含ISIS 420955和缀合物基团或由ISIS 420955和缀合物基团组成。ISIS 420955为具有下式的修饰寡核苷酸：Ges Aes Aes Tes Ges Tds
Tds Tds Tds Ads Tds Tds Gds Tds mCds Tes mCes Tes Ges mCe，其中，
[0777] A＝腺嘌呤，
[0778] mC＝5’-甲基胞嘧啶
[0779] G＝鸟嘌呤，
[0780] T＝胸腺嘧啶，
[0781] e＝2’-O-甲氧基乙基修饰核苷，
[0782] d＝2’-脱氧核苷，并且
[0783] s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
[0784] 在某些实施方案中，化合物包含ISIS 420957和缀合物基团或由ISIS 420957和缀合物基团组成。ISIS 420957为具有下式的修饰寡核苷酸：Aes Ges Ges Aes Aes Tds
Gds Tds Tds Tds Tds Ads Tds Tds Gds Tes mCes Tes mCes Te，其中，
[0785] A＝腺嘌呤，
[0786] mC＝5’-甲基胞嘧啶
[0787] G＝鸟嘌呤，
[0788] T＝胸腺嘧啶，
[0789] e＝2’-O-甲氧基乙基修饰核苷，
[0790] d＝2’-脱氧核苷，并且
[0791] s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
[0792] 在某些实施方案中，化合物包含ISIS 420959和缀合物基团或由ISIS 420959和缀合物基团组成。ISIS 420959为具有下式的修饰寡核苷酸：Aes mCes Aes Ges Ges Ads
Ads Tds Gds Tds Tds Tds Tds Ads Tds Tes Ges Tes mCes Te，其中，
[0793] A＝腺嘌呤，
[0794] mC＝5’-甲基胞嘧啶
[0795] G＝鸟嘌呤，
[0796] T＝胸腺嘧啶，
[0797] e＝2’-O-甲氧基乙基修饰核苷，
[0798] d＝2’-脱氧核苷，并且
[0799] s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
[0800] 在某些实施方案中，具有以下化学结构的化合物包含具有5’-X的ISIS 420915或由具有5’-X的ISIS 420915组成，其中X为如本文所述的缀合物基团：
[0801]
[0802] 在某些实施方案中，化合物包含具有以下化学结构的ISIS 682877或由具有以下化学结构的ISIS 682877组成：
[0803]
[0804] 在某些实施方案中，化合物包含具有以下化学结构的ISIS 682884或由具有以下化学结构的ISIS 682884组成：
[0805]
[0806] 在某些实施方案中，化合物包含SEQ ID NO:12、5’-GalNAc和由以下化学结构表示的化学修饰或由SEQ ID NO:12、5’-GalNAc和由以下化学结构表示的化学修饰组成：
[0807]
[0808] 其中R1为–OCH2CH2OCH3(MOE)并且R2为H；或者R1和R2一起形成桥联，其中R12 1 2
为–O-并且R为–CH2-、-CH(CH3)-或-CH2CH2-，并且R和R 直接连接成使得所得桥联选
自：-O-CH2-、-O-CH(CH3)-和–O-CH2CH2-；
[0809] 并且对于同一环上的每一对R3和R4，独立地对于每个环：R3选自H4 3 4 3
和-OCH2CH2OCH3并 且R 为H；或 者R 和R 一起形成桥联，其中R 为 –O-并
4 3 4
且R为–CH2-、-CH(CH3)-或-CH2CH2-并且R和R 直接连接成使得所得桥联选
自：-O-CH2-、-O-CH(CH3)-和–O-CH2CH2-；
[0810] 并且R5选自H和–CH3；
[0811] 并且Z选自S-和O-。
[0812] 在某些实施方案中，化合物包含公开于以引用的方式整体并入本文的WO2011/139917或US 8,101,743中的反义寡核苷酸和缀合物基团。在某些实施方案中，化合
物包含具有公开于WO 2011/139917中的SEQ ID NO 8-160、170-177中的任一个的核碱基
序列的反义寡核苷酸和本文所述的缀合物基团。在某些实施方案中，化合物包含具有公开
于US 8,101,743中的SEQ ID NO 12-89中的任一个的核碱基序列的反义寡核苷酸和本文
所述的缀合物基团。在某些实施方案中，化合物包含具有与公开于US 8,101,743中的SEQ
ID NO 90-133中的任一个的优选靶区段互补的核碱基序列的反义寡核苷酸和本文所述的
缀合物基团。所有上述提到的SEQ ID NO的核碱基序列均以引用的方式并入本文。
[0813] TTR治疗适应症
[0814] 在某些实施方案中，本发明提供了用于使用靶向TTR核酸的缀合反义化合物来调节受试者中TTR的表达的方法。在某些实施方案中，减少了TTR的表达。
[0815] 在某些实施方案中，本发明提供了用于使用药物组合物中靶向TTR核酸的缀合反义化合物来治疗受试者的方法。在某些实施方案中，受试者具有甲状腺素运载蛋白相关的
疾病、病症或病状或其症状。在某些实施方案中，甲状腺素运载蛋白相关的疾病、病症或病状为甲状腺素运载蛋白淀粉样变性。如本文所使用的“甲状腺素运载蛋白相关的淀粉样变
性”或“甲状腺素运载蛋白淀粉样变性”或“甲状腺素运载蛋白淀粉样病”为与甲状腺素运载蛋白的功能异常或调节异常相关的任何病理或疾病，所述甲状腺素运载蛋白的功能异常
或调节异常导致形成含甲状腺素运载蛋白的淀粉样纤维。甲状腺素运载蛋白淀粉样变性包
括但不限于遗传性TTR淀粉样变性、软脑膜淀粉样变性、家族性淀粉样多神经病(FAP)、家
族性淀粉样心肌病、家族性眼软脑膜淀粉样变性、老年心脏淀粉样变性或老年全身性淀粉
样变性。
[0816] 在某些实施方案中，本发明提供了用于使用靶向TTR核酸的缀合反义化合物制备药品的方法。
[0817] 在某些实施方案中，本发明提供了靶向TTR核酸的缀合反义化合物或其药学上可接受的盐，其用于疗法中。
[0818] 某些实施方案提供了靶向TTR核酸的缀合反义化合物，其用于治疗甲状腺素运载蛋白相关的疾病、病症或病状或其症状。在某些实施方案中，甲状腺素运载蛋白相关的疾
病、病症或病状为甲状腺素运载蛋白淀粉样变性。
[0819] 应理解，本文所述的任何化合物可用于前述方法和用途中。例如，在某些实施方案中，在前述方法和用途中靶向TTR核酸的缀合反义化合物可包括但不限于：靶向SEQ ID
NO:2的缀合反义化合物，其包含SEQ ID NO:12-19中的任一个的至少8个连续核碱基序
列；靶向SEQ ID NO:2的缀合反义化合物，其包含SEQ ID NO:12-19中的任一个的核碱基
序列；包含ISIS 420915、ISIS 304299、ISIS 420921、ISIS 420922、ISIS 420950、ISIS
420955、ISIS 420957或ISIS 420959和缀合物基团的化合物或由其组成的化合物；包含公
开于以引用的方式整体并入本文的WO 2011/139917或US 8,101,743中的反义寡核苷酸和
本文所述的缀合物基团的化合物；包含具有公开于WO2011/139917中的SEQ ID NO 8-160、
170-177中的任一个的核碱基序列的反义寡核苷酸和本文所述的缀合物基团的化合物；包
含具有与公开于US 8,101,743中的SEQ ID NO 12-89中的任一个的核碱基序列的反义
寡核苷酸和本文所述的缀合物基团；或包含具有与公开于US 8,101,743中的SEQ ID NO
90-133中的任一个的优选靶区段互补的核碱基序列的反义寡核苷酸和本文所述的缀合物
基团的化合物。所有上述提到的SEQ ID NO的核碱基序列均以引用的方式并入本文。
[0820] E.某些药物组合物
[0821] 在某些实施方案中，本公开提供了包含一种或多种反义化合物的药物组合物。在某些实施方案中，所述药物组合物包含合适的药学上可接受的稀释剂或载体。在某些实施
方案中，药物组合物包含无菌盐水溶液和一种或多种反义化合物。在某些实施方案中，所述药物组合物由无菌盐水溶液和一种或多种反义化合物组成。在某些实施方案中，无菌盐水
为药用级盐水。在某些实施方案中，药物组合物包含一种或多种反义化合物和无菌水。在
某些实施方案中，药物组合物由一种或多种反义化合物和无菌水组成。在某些实施方案中，无菌盐水为药用级水。在某些实施方案中，药物组合物包含一种或多种反义化合物和磷酸
盐缓冲盐水(PBS)。在某些实施方案中，药物组合物由一种或多种反义化合物和无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)组成。在某些实施方案中，无菌盐水为药用级PBS。
[0822] 在某些实施方案中，反义化合物可与药学上可接受的活性物质和/或惰性物质混合用于制备药物组合物或制剂。组合物和用于配制药物组合物的方法取决于许多标准，包
括但不限于施用途径、疾病的程度或待施用的剂量。
[0823] 包含反义化合物的药物组合物涵盖任何药学上可接受的盐、酯或所述酯的盐。在某些实施方案中，包含反义化合物的药物组合物包含一种或多种寡核苷酸，当向动物(包
括人)施用时，所述一种或多种寡核苷酸能够(直接地或间接地)提供生物活性代谢物或
其残余物。因此，例如，本公开还涉及反义化合物的药学上可接受的盐、前药、所述前药的药学上可接受的盐以及其它生物等效物。合适的药学上可接受的盐包括但不限于钠盐和钾
盐。
[0824] 前药可包括在寡核苷酸的一个或两个末端处掺入另外的核苷(所述核苷被体内的内源性核酸酶裂解)以形成活性反义寡核苷酸。
[0825] 脂质部分已用于各种方法中的核酸疗法中。在某些所述方法中，将核酸引入到由阳离子脂质和中性脂质的混合物制成的预先形成的脂质体或脂质复合物中。在某些方法
中，在不存在中性脂质的情况下形成具有单阳离子脂质或聚阳离子脂质的DNA复合物。在
某些实施方案中，对脂质部分进行选择，以增加药剂至具体细胞或组织的分布。在某些实施方案中，对脂质部分进行选择，以增加药剂至脂肪组织的分布。在某些实施方案中，对脂质部分进行选择，以增加药剂至肌肉组织的分布。
[0826] 在某些实施方案中，本文提供的药物组合物包含一种或多种修饰寡核苷酸和一种或多种赋形剂。在某些所述实施方案中，赋形剂选自水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、淀粉酶、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素以及聚乙烯吡咯烷酮。
[0827] 在某些实施方案中，本文提供的药物组合物包含递送系统。递送系统的实例包括但不限于脂质体和乳剂。某些递送系统有用于制备某些药物组合物，所述药物组合物包括
包含疏水化合物的那些。在某些实施方案中，使用了某些有机溶剂如二甲亚砜。
[0828] 在某些实施方案中，本文提供的药物组合物包含设计来将本公开的一种或多种药剂递送至特定组织或细胞类型的一个或多个组织特异性递送分子。例如，在某些实施方案
中，药物组合物包括涂覆有组织特异性抗体的脂质体。
[0829] 在某些实施方案中，本文提供的药物组合物包含共溶剂系统。某些所述共溶剂系统包含例如苯甲醇、非极性表面活性剂、水可混溶的有机聚合物以及水相。在某些实施方案中，所述共溶剂系统用于疏水化合物。所述共溶剂系统的非限制性实例为VPD共溶剂系统，TM
其为包含3％w/v苯甲醇、8％w/v非极性表面活性剂聚山梨酯80 和65％w/v聚乙二醇
300的无水乙醇溶液。所述共溶剂系统的比例可在不显著改变其溶解度和毒性特征的情况
下明显改变。此外，共溶剂组分的身份可改变：例如，可使用其它表面活性剂替代聚山梨酯TM
80 ；可改变聚乙二醇的分数大小；其它生物相容的聚合物可替代聚乙二醇，例如聚乙烯吡咯烷酮；并且其它糖或多糖可取代右旋糖。
[0830] 在某些实施方案中，本文提供的药物组合物被制备用于经口施用。在某些实施方案中，药物组合物被制备用于经颊施用。
[0831] 在某些实施方案中，药物组合物被制备用于通过注射(例如，静脉内、皮下、肌肉内等)施用。在某些所述实施方案中，药物组合物包含载体并且配制在水溶液中，如水或生理上相容的缓冲液如汉克斯溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液。在某些实施方案中，包括其它成分(例如，帮助溶解或充当防腐剂的成分)。在某些实施方案中，使用适当的液体载体、悬浮剂等制备可注射悬浮液。某些注射用药物组合物以单位剂型呈现，例如在安瓿中或在多剂量容器中。某些注射用药物组合物为油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液，并且可含有配制剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。某些适用于注射用药物组合物的溶剂包括但不限于亲脂溶剂和脂肪油(如芝麻油)、合成脂肪酸酯(如油酸乙酯或甘油三酯)以及
脂质体。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或右旋糖酐。任选地，所述悬浮液还可含有合适的稳定剂或增加药剂溶解度的试剂，以允许制备高度浓缩的溶液。
[0832] 在某些实施方案中，制备药物组合物用于透粘膜施用。在某些所述实施方案中，在配制中使用适用于待渗透的屏障的渗透剂。所述渗透剂通常为本领域中已知的。
[0833] 在某些实施方案中，本文提供的药物组合物包含治疗有效量的寡核苷酸。在某些实施方案中，治疗有效量足以预防、减轻或改善疾病的症状或延长正在治疗的受试者的存
活。确定治疗有效量完全在本领域技术人员的能力范围内。
[0834] 在某些实施方案中，本文提供的一种或多种修饰寡核苷酸被配制成前药。在某些实施方案中，当体内施用时，前药化学转化为寡核苷酸的生物学、药学或治疗学上更具活性的形式。在某些实施方案中，前药为有用的，因为它们比对应的活性形式更容易施用。例如，在某些情况下，前药可比对应的活性形式生物利用度更高(例如，通过经口施用)。在某些
情况下，与对应的活性形式相比，前药可具有改进的溶解度。在某些实施方案中，前药比对应的活性形式水溶性更小。在某些情况下，所述前药具有优越的跨越细胞膜传输的能力，其中水溶性不利于迁移性。在某些实施方案中，前药为酯。在某些所述实施方案中，当施用时酯被代谢水解为羧酸。在某些情况下，含有羧酸的化合物为对应的活性形式。在某些实施
方案中，前药包含结合至酸基团的短肽(聚氨基酸)。在某些所述实施方案中，当施用时肽
裂解以形成对应的活性形式。
[0835] 在某些实施方案中，本公开提供了用于减少细胞中靶核酸的量或活性的组合物和方法。在某些实施方案中，细胞在动物中。在某些实施方案中，动物为哺乳动物。在某些实施方案中，动物为啮齿动物。在某些实施方案中，动物为灵长类动物。在某些实施方案中，动物为非人灵长类动物。在某些实施方案中，动物为人。
[0836] 在某些实施方案中，本公开提供了向动物施用包含本公开的寡核苷酸的药物组合物的方法。合适的施用途径包括但不限于经口、直肠、透粘膜、肠、肠内、局部、栓剂、通过吸入、鞘内、脑室内、腹膜内、鼻内、眼内、瘤内以及肠胃外(例如，静脉内、肌肉内、髓内和皮下)。在某些实施方案中，施用鞘内药物(pharmaceutical intrathecal)以实现局部暴露
而非全身暴露。例如，可将药物组合物直接注射在希望作用的区域中(例如，到肝脏中)。
[0837] 非限制性公开并且以引用的方式并入
[0838] 虽然已根据某些实施方案具体描述了本文所述的某些化合物、组合物和方法，但以下实施例仅用以说明本文所述的化合物并且不意图限制所述化合物。本申请中引用的每
个参考文献、GenBank登录号和类似物均以引用的方式整体并入本文。
[0839] 本文中的某些化合物、组合物和方法被描述为“恰好包含(comprising exactly)”或“恰好包含(comprises exactly)”具体数目的具体元件或特征。所述描述用来表明虽然化合物、组合物或方法可包含另外的其它元件，但具体元件或特征的数目为确定的数目。例如，“恰好包含一个GalNAc的缀合物”为含有一个并且仅含有一个GalNAc的缀合物，但是它可含有除了一个GalNAc以外的其它元件。
[0840] 虽然在要求时随附本文件的序列表将每个序列鉴定为“RNA”或“DNA”，但实际上，那些序列可用任何化学修饰组合来修饰。本领域技术人员将容易了解，在某些情况下，这种命名为“RNA”或“DNA”来描述修饰寡核苷酸是任意的。例如，包含含有2’-OH糖部分和胸腺嘧啶碱基的核苷的寡核苷酸可被描述为具有修饰的糖(对于DNA的天然2’-H为2’-OH)的DNA或具有修饰碱基(对于RNA的天然尿嘧啶为胸腺嘧啶(甲基化尿嘧啶))的RNA。
[0841] 因此，本文提供的核酸序列(包括但不限于序列表中的那些)意图涵盖含有任何组合的天然或修饰RNA和/或DNA的核酸，包括但不限于具有修饰核碱基的所述核酸。通
过进一步举例而非限制的方式，具有核碱基序列“ATCGATCG”的寡核苷酸涵盖具有所述核碱基序列(无论修饰的或未修饰的)的任何寡核苷酸，包括但不限于包含RNA碱基的所述化
合物，如具有序列“AUCGAUCG”的那些和具有一些DNA碱基和一些RNA碱基如“AUCGATCG”
me me
的那些以及具有其它修饰碱基如“AT CGAUCG”的寡核苷酸，其中 C指示在5-位上包含甲
基的胞嘧啶碱基。
实施例
[0842] 以下实施例说明了本公开的某些实施方案并且不是限制性的。此外，在提供具体实施方案时，发明人已预期了那些具体实施方案的一般应用。例如，具有具体基序的寡核苷酸的公开为具有相同或类似基序的另外的寡核苷酸提供了合理支持。并且，例如，在特别高亲合力的修饰出现在具体位置上时，相同位置上的其它高亲合力修饰也认为是合适的，除
非另外指出。
[0843] 实施例1：用于制备亚磷酰胺化合物1、1a和2的一般方法
[0844]
[0845] 根据描述于本文的说明书中的本领域熟知的工序制备化合物1、1a和2(参见Seth等，Bioorg.Med.Chem.,2011,21(4),1122-1125、J.Org.Chem.,2010,75(5),1569-1581,Nucleic Acids Symposium Series,2008,52(1),553-554)；并且还参见已公布的PCT国际申请
(WO 2011/115818、WO 2010/077578、WO2010/036698、WO2009/143369、WO 2009/006478和WO 2007/090071)和美国专利7,569,686)。
[0846] 实施例2：化合物7的制备
[0847]
[0848] 化合物3(2-乙酰氨基-1,3,4,6-四-O-乙酰基-2-脱氧-β-D吡喃半乳糖或半乳糖胺五乙酸酯)为商业上可获得的。根据公布的工序制备化合物5(Weber等，J.Med.
Chem.,1991,34,2692)。
[0849] 实施例3：化合物11的制备
[0850]
[0851] 化合物8和9为商业上可获得的。
[0852] 实施例4：化合物18的制备
[0853]
[0854] 根据实施例3中说明的工序制备化合物11。化合物14为商业上可获得的。使用由Rensen等，J.Med.Chem.,2004,47,5798-5808所报道的类似工序制备化合物17。
[0855] 实施例5：化合物23的制备
[0856]
[0857] 化合物19和21为商业上可获得的。
[0858] 实施例6：化合物24的制备
[0859]
[0860] 根据实施例4和5中说明的工序制备化合物18和23。
[0861] 实施例7：化合物25的制备
[0862]
[0863] 根据实施例6中说明的工序制备化合物24。
[0864] 实施例8：化合物26的制备
[0865]
[0866] 根据实施例6中说明的工序制备化合物24。
[0867] 实施例9：在3’末端包含GalNAc3-1的缀合ASO化合物29的一般制备
[0868]
[0869]
[0870] 其中受保护的GalNAc3-1具有以下结构：
[0871]
[0872] 缀合物基团GalNAc3-1的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-1a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。其中GalNAc3-1a具有下式：
[0873]
[0874] 根据实施例7中说明的工序制备固体载体结合的受保护的GalNAc3-1，即化合物25。使用自动化DNA/RNA合成中的标准工序制备在3’末端包含GalNAc3-1的低聚化合物
29(参见Dupouy等，Angew.Chem.Int.Ed.,2006,45,3623-3627)。根据实施例1中说明的
工序制备亚磷酰胺结构单元，即化合物1和1a。所述的亚磷酰胺意在为代表性的并且不意
图为限制性的，因为可使用其它亚磷酰胺结构单元来制备具有预先确定的序列和组成的低
聚化合物。可调节添加至固体载体的亚磷酰胺的顺序和量以制备如本文所述的有缺口的低
聚化合物。所述有缺口的低聚化合物可具有如任何给定靶标所指示的预先确定的组成和碱
基序列。
[0875] 实施例10：在5’末端包含GalNAc3-1的缀合ASO化合物34的一般制备
[0876]
[0877] UnylinkerTM 30为商业上可获得的。使用自动化DNA/RNA合成中的标准工序制备在5’末端包含GalNAc3-1聚簇的低聚化合物34(参见Dupouy等，Angew.Chem.Int.
Ed.,2006,45,3623-3627)。根据实施例1中说明的工序制备亚磷酰胺结构单元，即化合物
1和1a。所述的亚磷酰胺意在为代表性的并且不意图为限制性的，因为可使用其它亚磷酰
胺结构单元来制备具有预先确定的序列和组成的低聚化合物。可调节添加至固体载体的亚
磷酰胺的顺序和量以制备如本文所述的有缺口的低聚化合物。所述有缺口的低聚化合物可
具有如任何给定靶标所指示的预先确定的组成和碱基序列。
[0878] 实施例11：化合物39的制备
[0879]
[0880]
[0881] 根据实施例2、4和5中说明的工序制备化合物4、13和23。使用公布于以下的类似工序制备化合物35：Rouchaud等，Eur.J.Org.Chem.,2011,12,2346-2353。
[0882] 实施例12：化合物40的制备
[0883]
[0884] 根据实施例11中说明的工序制备化合物38。
[0885] 实施例13：化合物44的制备
[0886]
[0887]
[0888] 根据实施例5和11中说明的工序制备化合物23和36。使用公布于WO 2009082607中的类似工序制备化合物41。
[0889] 实施例14：化合物45的制备
[0890]
[0891] 根据实施例13中说明的工序制备化合物43。
[0892] 实施例15：化合物47的制备
[0893]
[0894] 化合物46为商业上可获得的。
[0895] 实施例16：化合物53的制备
[0896]
[0897] 化合物48和49为商业上可获得的。根据实施例4和15中说明的工序制备化合物17和47。
[0898] 实施例17：化合物54的制备
[0899]
[0900] 根据实施例16中说明的工序制备化合物53。
[0901] 实施例18：化合物55的制备
[0902]
[0903] 根据实施例16中说明的工序制备化合物53。
[0904] 实施例19：用于通过固相技术制备在3’位包含GalNAc3-1的缀合ASO的一般方法(ISIS 647535、647536和651900的制备)
[0905] 除非另外说明，否则用于合成低聚化合物的所有试剂和溶液均购自商业来源。使m
用标准亚磷酰胺结构单元和固体载体来掺入核苷残基，所述核苷残基包括例如T、A、G和 C残基。0.1M的亚磷酰胺在无水乙腈中的溶液用于β-D-2’-脱氧核糖核苷和2’-MOE。
[0906] 在ABI 394合成器(1-2μmol规模)上或在GE Healthcare Bioscienceoligopilot合成器(40-200μmol规模)上通过填充在柱中的负载GalNAc3-1的VIMAD固体
载体(110μmol/g，Guzaev等，2003)上的亚磷酰胺偶联方法来进行ASO合成。对于偶联步
骤，以超过固体载体上的负载量4倍的量递送亚磷酰胺并且持续10min进行亚磷酰胺缩合。
所有其它步骤均按照制造商供应的标准方案。使用6％二氯乙酸在甲苯中的溶液来从核苷
酸的5’-羟基上去除二甲氧基三苯甲基(DMT)。无水CH3CN中的4,5-二氰基咪唑(0.7M)
用作偶联步骤过程中的活化剂。通过用苍耳烷氢化物在1:1吡啶/CH3CN中的0.1M溶液硫
化3分钟的接触时间来引入硫代磷酸酯键联。使用20％叔丁基过氧化氢在含有6％水的
CH3CN中的溶液作为氧化剂来提供磷酸二酯核苷间键联，其中接触时间为12分钟。
[0907] 在装配希望的序列之后，使用三乙胺和乙腈的1:1(v/v)混合物将磷酸氰基乙酯保护基去保护，其中接触时间为45分钟。将固体载体结合的ASO悬浮在氨水
(28wt％-30wt％)中并且在55℃下加热6h。
[0908] 然后过滤未结合的ASO并且将氨煮沸掉。残余物通过高压液相色谱法在强阴离子交换柱上纯化(GE Healthcare Bioscience，Source30Q，30μm，2.54x8cm，A＝30％水性
CH3CN中的100mM乙酸铵，B＝A中的1.5M NaBr，在60min内为0％-40％的B，流速14mL
min-1，λ＝260nm)。残余物通过HPLC在反相柱上脱盐以得到基于固体载体上的初始负载
量为15％-30％的分离产率的希望的ASO。使用Agilent 1100MSD系统通过离子对HPLC偶
联的MS分析来表征ASO。
[0909] 使用本领域中熟知的标准寡核苷酸合成工序合成不包含缀合物的反义寡核苷酸。
[0910] 使用这些方法，制备了靶向ApoC III的三种单独的反义化合物。如以下表4中所概述，靶向ApoC III的三种反义化合物中的每一种均具有相同的核碱基序列；ISIS
304801为具有所有硫代磷酸酯键联的5-10-5MOE缺口聚物；ISIS 647535与ISIS 304801
相同，除了ISIS 647535具有缀合在其3’末端的GalNAc3-1；并且ISIS 647536与ISIS
647535相同，除了所述化合物的某些核苷间键联为磷酸二酯键联。如表4中进一步概述，
合成了靶向SRB-1的两种单独的反义化合物。ISIS 440762为具有所有硫代磷酸酯核苷间
键联的2-10-2cEt缺口聚物；ISIS 651900与ISIS 440762相同，除了ISIS 651900在其
3’-末端包括GalNAc3-1。
[0911] 表4
[0912] 靶向ApoC III和SRB-1的修饰ASO
[0913]
[0914] 下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“k”指示6’-(S)-CH3双环核苷(例如cEt)；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸
二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。上标“m”指示5-甲基胞嘧啶。
“GalNAc3-1”指示具有先前在实施例9中示出的结构的缀合物基团。应注意，GalNAc3-1包含将ASO连接至缀合物的剩余部分的可裂解腺苷，所述可裂解腺苷命名为“GalNAc3-1a”。这种命名法用于上表以显示整个核碱基序列，包括作为缀合物的一部分的腺苷。因此，在上表中，序列还可列为以“GalNAc3-1”结尾，其中省略“Ado”。在全部这些实施例中使用了这种惯例：使用下标“a”来指示缺乏可裂解核苷或可裂解部分的缀合物基团的部分。缺乏可裂解部分的缀合物基团的此部分在本文中是指“聚簇”或“缀合物聚簇”或“GalNAc3聚簇”。在某些情况下，通过单独提供其聚簇和其可裂解部分来方便地描述缀合物基团。
[0915] 实施例20：huApoC III转基因小鼠中的人ApoC III的剂量依赖性反义抑制
[0916] 在剂量依赖性研究中，针对其抑制人ApoC III转基因小鼠中的人ApoC III的能力，对各自靶向人ApoC III并且以上描述的ISIS 304801和ISIS 647535进行单独测试和
评价。
[0917] 处理
[0918] 将人ApoCIII转基因小鼠维持在12小时亮/暗循环中并且随意喂食Teklad实验室食物。在开始实验之前，使动物在研究设备中适应至少7天。在PBS中制备ASO并且通
过过滤通过0.2微米过滤器进行灭菌。将ASO溶解于0.9％PBS中用于注射。
[0919] 每 周 一 次 在 0.08μmol/kg、0.25μmol/kg、0.75μmol/kg、2.25μmol/kg 或6.75μmol/kg下用ISIS 304801或647535或使用PBS作为对照腹膜内注射人ApoC III转
基因小鼠，持续两周。每个处理组由4只动物组成。在施用最后剂量之后的四十八小时，从每只小鼠中抽血并且将小鼠处死并收集组织。
[0920] ApoC III mRNA分析
[0921] 使用实时PCR和 RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案来测定小鼠肝脏中的ApoC III mRNA水平。在归一化为PBS处理
的对照之前，测定相对于总RNA的ApoC III mRNA水平(使用Ribogreen)。以下结果以归
一化为PBS处理的对照的每个处理组的ApoC III mRNA水平的平均百分比呈现并且表示为
“％PBS”。每个ASO的半数最大有效剂量(ED50)也呈现于以下表5中。
[0922] 如所说明的，相对于PBS对照，这两种反义化合物使ApoC III RNA减少。此外，缀合至GalNAc3-1的反义化合物(ISIS 647535)大致上比缺乏GalNAc3-1缀合物的反义化合物(ISIS 304801)更有效。
[0923] 表5
[0924] ASO处理对人ApoC III转基因小鼠中ApoC III mRNA水平的影响
[0925]
[0926] ApoC III蛋白分析(浊度测定)
[0927] 使用在2013年3月29日印刷之前在线公布的Graham等，Circulation Research所报道的工序确定血浆ApoC III蛋白分析。
[0928] 在不稀释的情况下使用Olympus临床分析器和商业上可获得的浊度ApoC III测定(Kamiya,Cat#KAI-006,Kamiya Biomedical,Seattle,WA)来分析从小鼠中分离的大约
100μl血浆。如供应商所述执行测定方案。
[0929] 如以下表6中所示，相对于PBS对照，这两种反义化合物使ApoC III蛋白减少。此外，缀合至GalNAc3-1的反义化合物(ISIS 647535)大致上比缺乏GalNAc3-1缀合物的反义
化合物(ISIS 304801)更有效。
[0930] 表6
[0931] ASO处理对人ApoC III转基因小鼠中ApoC III血浆蛋白水平的影响
[0932]
[0933] 通过Bligh和Dyer(Bligh,E.G.和Dyer,W.J.Can.J.Biochem.Physiol.37:911-917,1959)(Bligh,E 和 Dyer,W,Can J Biochem Physiol,37,911-917,1959)(Bligh,E 和
Dyer,W,Can J Biochem Physiol,37,911-917,1959)的方法提取血浆甘油三酯和胆固醇并
且通过使用Beckmann Coulter临床分析器和商业上可获得的试剂来测量。
[0934] 相对于PBS注射的小鼠测量甘油三酯水平并且表示为“％PBS”。结果呈现于表7中。如所说明的，这两种反义化合物使甘油三酯水平降低。此外，缀合至GalNAc3-1的反义化合物(ISIS 647535)大致上比缺乏GalNAc3-1缀合物的反义化合物(ISIS 304801)更有
效。
[0935] 表7
[0936] ASO处理对转基因小鼠中甘油三酯水平的影响
[0937]
[0938] 通过HPLC分析血浆样品来测定总胆固醇和不同级分的胆固醇(HDL和LDL)的量。结果呈现于表8和9中。如所说明的，这两种反义化合物使总胆固醇水平降低；均使LDL降
低；并且均使HDL升高。此外，缀合至GalNAc3-1的反义化合物(ISIS 647535)大致上比缺
乏GalNAc3-1缀合物的反义化合物(ISIS 304801)更有效。HDL水平增加和LDL水平降低
为反义抑制ApoC III的心血管有益作用。
[0939] 表8
[0940] ASO处理对转基因小鼠中总胆固醇水平的影响
[0941]
[0942] 表9
[0943] ASO处理对转基因小鼠中HDL和LDL胆固醇水平的影响
[0944]
[0945] 药物代谢动力学分析(PK)
[0946] 还评价了ASO的PK。使用标准方案切碎并且提取肝脏和肾样品。在MSD1上利用IP-HPLC-MS分析样品。测量全长ISIS 304801和647535的组织水平(μg/g)并且结果提
供于表10中。如所说明的，对于两种反义化合物，总全长反义化合物的肝脏浓度类似。因
此，即使GalNAc3-1-缀合的反义化合物在肝脏中更具活性(如通过以上RNA和蛋白质数据
所展示)，但它在肝脏中不以大致上更高的浓度存在。事实上，所计算的EC50(提供于表10
中)证实了所观察到的缀合化合物的效力增加不能完全归因于积累增加。此结果表明缀合
物不仅仅通过肝脏积累的机制，还可能通过改进细胞对反义化合物的产生性摄取来改进效
力。
[0947] 结果还显示GalNAc3-1缀合反义化合物在肾中的浓度低于缺乏GalNAc缀合物的反义化合物的浓度。这具有若干有益的治疗意义。对于不想要在肾中的活性的治疗适应症
(indication)，对肾的暴露具有肾毒性的风险而没有相应的益处。此外，肾中的高浓度通常导致化合物流失至尿液，从而导致更快的清除。因此，对于非肾靶标，肾积累为不希望的。这些数据表明GalNAc3-1缀合使肾积累减少。
[0948] 表10
[0949] 转基因小鼠中ASO处理的PK分析
[0950]
[0951] 还鉴定了ISIS 647535的代谢物并且通过高分辨率质谱分析证实了其质量。以下示出所观察到的代谢物的裂解位点和结构。使用标准工序计算全长ASO的相对％并且
结果呈现于表10a中。ISIS 647535的主要代谢物为缺乏整个缀合物的全长ASO(即ISIS
304801)，其由在以下示出的裂解位点A处裂解产生。此外，还观察到由其它裂解位点产生
的另外代谢物。这些结果表明在GalNAc3-1糖与ASO之间引入其它可裂解键如酯、肽、二硫
化物、氨基磷酸酯或酰基腙也可以是有用的，所述可裂解键可被细胞内部的酶裂解或所述
可裂解键可在细胞液的还原性环境中裂解或所述可裂解键对内体和溶酶体内部的酸性pH
不稳定。
[0952] 表10a
[0953] 所观察到的ISIS 647535的全长代谢物
[0954]
[0955]
[0956]
[0957] 实施例21：单一施用研究中人ApoC III转基因小鼠中的人ApoC III的反义抑制
[0958] 在单一施用研究中，针对其抑制人ApoC III转基因小鼠中的人ApoC III的能力，对各自靶向人ApoC III并且描述于表4中的ISIS 304801、647535和647536进行进一步
评价。
[0959] 处理
[0960] 将人ApoCIII转基因小鼠维持在12小时亮/暗循环中并且随意喂食Teklad实验室食物。在开始实验之前，使动物在研究设备中适应至少7天。在PBS中制备ASO并且通
过过滤通过0.2微米过滤器进行灭菌。将ASO溶解于0.9％PBS中用于注射。
[0961] 在以下示出的剂量下，用ISIS 304801、647535或647536(以上所述)或用PBS处理的对照腹膜内注射人ApoC III转基因小鼠一次。处理组由3只动物组成并且对照组由4
只动物组成。在处理之前以及在最后一次剂量之后，从每只小鼠中抽血并且分析血浆样品。
在最后施用之后72小时将小鼠处死。
[0962] 收集样品并且分析以测定肝脏中的ApoC III mRNA和蛋白质水平；血浆甘油三酯；以及胆固醇，包括如上所述(实施例20)评估的HDL和LDL级分。来自那些分析的数据呈
现于以下表11-15中。使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水
平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。ALT和AST水平显示反义化
合物在所有施用的剂量下为耐受良好的。
[0963] 这些结果显示了与缺乏GalNAc3-1缀合物的反义化合物(ISIS 304801)相比，在3’末端包含GalNAc3-1缀合物的反义化合物(ISIS 647535和647536)的效力的改进。此
外，包含GalNAc3-1缀合物和一些磷酸二酯键联的ISIS 647536与ISIS 647535一样有效，
所述ISIS 647535包含相同的缀合物并且ASO内的所有核苷间键联为硫代磷酸酯。
[0964] 表11
[0965] ASO处理对人ApoC III转基因小鼠中ApoC III mRNA水平的影响
[0966]
[0967]
[0968] 表12
[0969] ASO处理对人ApoC III转基因小鼠中ApoC III血浆蛋白水平的影响
[0970]
[0971] 表13
[0972] ASO处理对转基因小鼠中甘油三酯水平的影响
[0973]
[0974]
[0975] 表14
[0976] ASO处理对转基因小鼠中总胆固醇水平的影响
[0977]
[0978] 表15
[0979] ASO处理对转基因小鼠中HDL和LDL胆固醇水平的影响
[0980]
[0981]
[0982] 这些结果证实GalNAc3-1缀合物改进了反义化合物的效力。结果还显示了其中反义寡核苷酸具有混合的键联的GalNAc3-1缀合反义化合物(具有六个磷酸二酯键联的ISIS
647536)和相同反义化合物的全部硫代磷酸酯型式(ISIS 647535)的相等效力。
[0983] 硫代磷酸酯键联为反义化合物提供若干性质。例如，它们抗核酸酶消化并且它们结合导致化合物在肝脏中积累而不是在肾/尿液中积累的蛋白质。这些为希望的性质，特
别是当治疗肝脏中的适应症时。然而，硫代磷酸酯键联还与炎症性应答相关。因此，减少
化合物中硫代磷酸酯键联的数目预期会减小炎症的风险，但是也降低化合物在肝脏中的浓
度，增加在肾和尿液中的浓度，减小在核酸酶存在下的稳定性并且降低总体效力。本结果显示其中某些硫代磷酸酯键联已被磷酸二酯键联替代的GalNAc3-1缀合反义化合物与具有全
部硫代磷酸酯键联的对应物在对抗肝脏中的靶标方面一样有效。所述化合物预期为促炎性
较少的(参见实施例24，其描述了显示PS的减少导致炎症性作用减小的实验)。
[0984] 实施例22：靶向SRB-1的GalNAc3-1缀合的修饰ASO在体内的作用
[0985] 在剂量依赖性研究中，针对其抑制Balb/c小鼠中的SRB-1的能力，对各自靶向SRB-1并且描述于表4中的ISIS 440762和651900进行评价。
[0986] 处理
[0987] 在以下示出的剂量下，用ISIS 440762、651900或用PBS处理的对照皮下注射六周龄雄性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次。每个处理组由4只动物
组成。在最后施用之后48小时将小鼠处死以使用实时PCR和 RNA定量
试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定肝脏SRB-1mRNA水平。在归
一化为PBS处理的对照之前，测定相对于总RNA的SRB-1mRNA水平(使用Ribogreen)。以
下结果以归一化为PBS处理的对照的每个处理组的SRB-1mRNA水平的平均百分比呈现并且
表示为“％PBS”。
[0988] 如表16中所说明的，这两种反义化合物使SRB-1mRNA水平降低。此外，包含GalNAc3-1缀合物的反义化合物(ISIS 651900)比缺乏GalNAc3-1缀合物的反义化合物
(ISIS 440762)大致上更有效。这些结果展示使用与不同靶标互补并且具有不同化学修饰
核苷的反义寡核苷酸观察到GalNAc3-1缀合物的效力益处，在这种情况下，修饰核苷包含约束乙基糖部分(双环糖部分)。
[0989] 表16
[0990] ASO处理对Balb/c小鼠中SRB-1mRNA水平的影响
[0991]
[0992] 实施例23：人外周血单核细胞(hPBMC)测定方案
[0993] 使用BD Vautainer CPT管法进行hPBMC测定。从在美国健康工作诊所(Faraday&El Camino Real,Carlsbad)具有知情同意书的志愿供体中获得全血样品并且收
集在4-15个BD Vacutainer CPT 8ml管中(VWR Cat.#BD362753)。使用PBMC测定数据表
记录每个供体的CPT管中的大约起始总全血体积。
[0994] 通过将管轻轻倒置8-10次在离心之前立即重新混合血液样品。将CPT管在具有制动的1500-1800RCF(2700RPM Beckman Allegra6R)下、在水平(摆动)转子中在室温
(18-25℃)下离心30min。从血沉棕黄层界面(在Ficoll与聚合物凝胶层之间)取回细
胞；转移至无菌50ml圆锥管并且汇集至5个CPT管/50ml圆锥管/供体。然后用PBS(无
++ ++
Ca 、Mg ；GIBCO)洗涤细胞两次。将管加满至50ml并且通过倒置若干次来混合。然后将样
品在室温下在330x g下(在Beckman Allegra 6R中的1215RPM)离心15分钟并且在不干
扰沉淀物的情况下尽可能多的抽吸上清液。通过轻轻旋转管使细胞沉淀物脱落并且将细胞
重新悬浮在RPMI+10％FBS+青霉素/链霉素(大约1ml/10ml起始全血体积)中。将60μl
样品用移液管移入到具有600μl VersaLyse试剂(Beckman Coulter Cat#A09777)的样品
小瓶(Beckman Coulter)中并且轻轻涡旋10-15秒。使样品在室温下孵育10min并且在计
数之前再次混合。使用PBMC细胞类型(1:11的稀释因子与其它参数一起存储)在Vicell
XR细胞活力分析器(Beckman Coulter)上计数细胞悬浮液。记录活细胞/ml和活力。在
7
RPMI+10％FBS+青霉素/链霉素中将细胞悬浮液稀释至1x10活PBMC/ml。
[0995] 将细胞以5x105涂布在50μl/孔的96孔组织培养平板(Falcon Microtest)中。根据实验模板(总共100μl/孔)添加50μl/孔的稀释在RPMI+10％FBS+青霉素/链霉
素中的2x浓度寡核苷酸/对照。将平板放置在振荡器上并且允许混合大约1min。在37℃、
5％CO2下孵育24小时之后，将平板在400x g下离心10分钟，之后去除上清液用于MSD细
胞因子测定(即人IL-6、IL-10、IL-8和MCP-1)。
[0996] 实施例24：在hPBMC测定中评价GalNAc3-1缀合ASO的促炎性作用
[0997] 使用实施例23中描述的方案，在hPBMC测定中评价列于表17中的反义寡核苷酸(ASO)的促炎性作用。ISIS 353512为已知为测定中的IL-6释放的高响应者的内标物。从新
鲜志愿供体中分离hPBMC并且用0μM、0.0128μM、0.064μM、0.32μM、1.6μM、8μM、40μM和200μM浓度下的ASO处理。在24小时处理之后，测量细胞因子水平。
[0998] IL-6的水平用作原始读出。使用标准工序计算EC50和Emax。结果表达为来自两个供体的Emax/EC50的平均比率并且表示为“Emax/EC50”。较低的比率表明促炎性反应相对减小并且较高的比率表明促炎性反应相对增加。
[0999] 对于测试化合物，促炎性最小的化合物为PS/PO连接的ASO(ISIS 616468)。GalNAc3-1缀合ASO(ISIS 647535)比其未缀合的对应物ISIS 304801的促炎性稍小。这
些结果表明掺入一些PO键联使促炎性反应减小并且添加GalNAc3-1缀合物并不使化合
物更具有促炎性并且可能减小促炎性反应。因此，人们将预期包含混合的PS/PO键联和
GalNAc3-1缀合物的反义化合物将相对于具有或不具有GalNAc3-1缀合物的全部PS连接的
反义化合物产生较低的促炎性反应。这些结果表明GalNAc3-1缀合反义化合物(尤其是具
有减小的PS含量的那些)为促炎性较小的。
[1000] 总之，这些结果表明GalNAc3-1缀合化合物(尤其是具有减小的PS含量的缀合化合物)可在比缺乏GalNAc3-1缀合物的对应全部PS反义化合物更高的剂量下施用。因为不
预期这些化合物的半衰期是大致上不同的，所以所述较高施用将导致较不频繁的给药。事
实上，所述施用可为甚至更不频繁的，因为GalNAc3-1缀合化合物为更有效的(参见实施例
20-22)并且一旦化合物的浓度下降到低于希望的水平，重新给药是必要的，其中所述希望
的水平基于效力。
[1001] 表17
[1002] 修饰ASO
[1003]
[1004] 下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“k”指示6’-(S)-CH3双环核苷(例如cEt)；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸
二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。上标“m”指示5-甲基胞嘧啶。
“Ado’-GalNAc3-1a”指示所指的具有连接至反义寡核苷酸的3’-末端的在实施例9中示出的结构GalNAc3-1的缀合物。
[1005] 表18
[1006] 靶向ApoC III的ASO在hPBMC测定中的促炎性作用
[1007]
[1008] 实施例25：靶向人ApoC III的GalNAc3-1缀合的修饰ASO在体外的作用
[1009] 在体外测试以上所述的ISIS 304801和647535。用0.03μM、0.08μM、0.24μM、0.74μM、2.22μM、6.67μM和20μM浓度的修饰寡核苷酸处理密度为25,000个细胞/孔的
来自转基因小鼠的原代肝细胞。在大约16小时的处理期后，从细胞中分离RNA并且通过定
量实时PCR测量mRNA水平并且如通过RIBOGREEN所测量，根据总RNA含量调节hApoC III
mRNA水平。
[1010] 使用标准方法计算IC50并且结果呈现于表19中。如所说明的，与对照ISIS 304801相比，在用ISIS 647535处理的细胞中观察到可比的效力。
[1011] 表19
[1012] 靶向原代肝细胞中的人ApoC III的修饰ASO
[1013]
[1014] 在本实验中，在体外没有观察到在体内所观察到的GalNAc3-1缀合的极大效力益处。随后体外的在原代肝细胞中的自由摄取实验确实显示了包含各种GalNAc缀合物的寡
核苷酸相对于缺乏GalNAc缀合物的寡核苷酸的效力增加。(参见实施例60、82和92)
[1015] 实施例26：PO/PS键联对ApoC III ASO活性的影响
[1016] 每周一次以25mg/kg的ISIS 304801或ISIS 616468(上述两者)或用PBS处理的对照腹膜内注射人ApoC III转基因小鼠，持续两周。处理组由3只动物组成并且对照组
由4只动物组成。在处理之前以及在最后一次剂量之后，从每只小鼠中抽血并且分析血浆
样品。在最后施用之后72小时将小鼠处死。
[1017] 如上所述收集样品并且分析以测定肝脏中的ApoC III蛋白水平(实施例20)。来自那些分析的数据呈现于以下表20中。
[1018] 这些结果表明相对于全部PS(ISIS 304801)，在翼中具有PO/PS的反义化合物(ISIS 616468)效力减小。
[1019] 表20
[1020] ASO处理对人ApoC III转基因小鼠中ApoC III蛋白水平的影响
[1021]
[1022] 实施例27：化合物56
[1023]
[1024] 化合物56可从Glen Research商业上获得或可根据由Shchepinov等，NucleicAcids Research,1997,25(22),4447-4454所报道的已公布工序制备。
[1025] 实施例28：化合物60的制备
[1026]
[1027] 根据实施例2中说明的工序制备化合物4。化合物57为商业上可获得的。通过结构分析来证实化合物60。
[1028] 化合物57意在为代表性的并且不意图为限制性的，因为可使用其它单保护的取代或未取代的烷基二醇包括但不限于在本文的说明书中呈现的那些来制备具有预先确定
的组成的亚磷酰胺。
[1029] 实施例29：化合物63的制备
[1030]
[1031] 使用类似于由Tober等，Eur.J.Org.Chem.,2013,3,566-577；和Jiang等，Tetrahedron,2007,63(19),3982-3988所报道的那些的工序制备化合物61和62。
[1032] 或者，使用类似于由Kim等，Synlett,2003,12,1838-1840；和Kim等，已公布的PCT国际申请WO 2004063208的科学和专利文献中所报道的那些的工序制备化合物63。实
施例30：化合物63b的制备
[1033]
[1034] 使 用 类 似 于 由 Hanessian 等，Canadian Journal ofChemistry,1996,74(9),1731-1737所报道的那些的工序制备化合物63a。
[1035] 实施例31：化合物63d的制备
[1036]
[1037] 使用类似于由Chen等，Chinese Chemical Letters,1998,9(5),451-453所报道的那些的工序制备化合物63c。
[1038] 实施例32：化合物67的制备
[1039]
[1040] 根据实施例2中说明的工序制备化合物64。使用类似于由Or等，已公布的PCT国际申请WO 2009003009所报道的那些的工序制备化合物65。用于化合物65的保护基意在
为代表性的并且不意图为限制性的，因为可使用其它保护基包括但不限于在本文的说明书
中呈现的那些。
[1041] 实施例33：化合物70的制备
[1042]
[1043] 根据实施例2中说明的工序制备化合物64。化合物68为商业上可获得的。用于化合物68的保护基意在为代表性的并且不意图为限制性的，因为可使用其它保护基包括
但不限于在本文的说明书中呈现的那些。
[1044] 实施例34：化合物75a的制备
[1045]
[1046] 根据由Shchepinov等，Nucleic Acids Research,1997,25(22),4447-4454所报道的公布的工序制备化合物75。
[1047] 实施例35：化合物79的制备
[1048]
[1049] 根据由Shchepinov等，Nucleic Acids Research,1997,25(22),4447-4454所报道的公布的工序制备化合物76。
[1050] 实施例36：化合物79a的制备
[1051]
[1052] 根据实施例35中说明的工序制备化合物77。
[1053] 实施例37：用于通过固体载体制备在5’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc3-2缀合物的缀合低聚化合物82的一般方法(方法I)
[1054]
[1055]
[1056] 其中GalNAc3-2具有以下结构：
[1057]
[1058] 缀合物基团GalNAc3-2的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-2a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。其中GalNAc3-2a具有下式：
[1059]
[1060] 使用用于自动化DNA/RNA合成的标准工序制备VIMAD结合的低聚化合物79b(参见Dupouy等，Angew.Chem.Int.Ed.,2006,45,3623-3627)。分别根据实施例27和28中说
明的工序制备亚磷酰胺化合物56和60。所说明的亚磷酰胺意在为代表性的并且不意图为
限制性的，因为可使用其它亚磷酰胺结构单元包括但不限于在本文的说明书中呈现的那些
来制备在5’末端具有磷酸二酯连接的缀合物基团的低聚化合物。可调节添加至固体载体的亚磷酰胺的顺序和量来制备具有任何预先确定的序列和组成的如本文所述的低聚化合物。
[1061] 实施例38：用于制备在5’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc3-2缀合物的低聚化合物82的替代方法(方法II)
[1062]
[1063] 使用用于自动化DNA/RNA合成的标准工序制备VIMAD结合的低聚化合物79b(参见Dupouy等，Angew.Chem.Int.Ed.,2006,45,3623-3627)。根据实施例35中说明的工序制
备GalNAc3-2聚簇亚磷酰胺，即化合物79。此替代方法允许在合成的最后一步将磷酸二酯
连接的GalNAc3-2缀合物一步装至低聚化合物。所说明的亚磷酰胺意在为代表性的并且不
意图为限制性的，因为可使用其它亚磷酰胺结构单元包括但不限于在本文的说明书中呈现
的那些来制备在5’末端具有磷酸二酯缀合物的低聚化合物。可调节添加至固体载体的亚
磷酰胺的顺序和量来制备具有任何预先确定的序列和组成的如本文所述的低聚化合物。
[1064] 实施例39：用于通过固体载体制备在5’末端包含GalNAc3-3缀合物的低聚化合物83h(针对5'末端连接修饰的GalNAc3-1)的一般方法
[1065]
[1066]
[1067] 根据实施例4中说明的工序制备化合物18。化合物83a和83b为商业上可获得的。使用标准寡核苷酸合成工序制备包含磷酸二酯连接的己胺的低聚化合物83e。用氨水
处理受保护的低聚化合物提供5'-GalNAc3-3缀合的低聚化合物(83h)。
[1068] 其中GalNAc3-3具有以下结构：
[1069]
[1070] 缀合物基团GalNAc3-3的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-3a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。其中GalNAc3-3a有下式：
[1071]
[1072] 实施例40：用于通过固体载体制备在3’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc3-4缀合物的低聚化合物89的一般方法
[1073]
[1074]
[1075] 其中GalNAc3-4具有以下结构：
[1076]
[1077] 其中CM为可裂解部分。在某些实施方案中，可裂解部分为：
[1078]
[1079] 缀合物基团GalNAc3-4的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-4a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。其中GalNAc3-4a具有下式：
[1080]
[1081] 受保护的Unylinker官能团化的固体载体化合物30为商业上可获得的。使用类似于文献中所报道的那些的工序制备化合物84(参见Shchepinov
等，Nucleic Acids Research,1997,25(22),4447-4454 ；Shchepinov 等，
Nucleic Acids Research,1999,27,3035-3041；以 及 Hornet 等，Nucleic Acids
Research,1997,25,4842-4849)。
[1082] 根据实施例28和36中说明的工序制备亚磷酰胺结构单元，即化合物60和79a。所说明的亚磷酰胺意在为代表性的并且不意图为限制性的，因为可使用其它亚磷酰胺结构
单元来制备具有预先确定的序列和组成的在3’末端具有磷酸二酯连接的缀合物的低聚化
合物。可调节添加至固体载体的亚磷酰胺的顺序和量来制备具有任何预先确定的序列和组
成的如本文所述的低聚化合物。
[1083] 实施例41：用于通过固相技术制备在5’位上包含磷酸二酯连接的GalNAc3-2(参见实施例37，Bx为腺嘌呤)缀合物的ASO的一般方法(ISIS 661134的制备)
[1084] 除非另外说明，否则用于合成低聚化合物的所有试剂和溶液均购自商业来源。使m
用标准亚磷酰胺结构单元和固体载体来掺入核苷残基，所述核苷残基包括例如T、A、G和 C残基。使用亚磷酰胺化合物56和60来合成5’末端处的磷酸二酯连接的GalNAc3-2缀合
物。0.1M的亚磷酰胺在无水乙腈中的溶液用于β-D-2’-脱氧核糖核苷和2’-MOE。
[1085] 在ABI 394合成器(1-2μmol规模)上或在GE Healthcare Bioscienceoligopilot合成器(40-200μmol规模)上通过填充在柱中的VIMAD固体载体(110μmol/
g，Guzaev等，2003)上的亚磷酰胺偶联方法来进行ASO合成。对于偶联步骤，以超过固体载体的初始负载量4倍的量递送亚磷酰胺并且持续10min进行亚磷酰胺偶联。所有其它步骤
按照制造商供应的标准方案。使用6％二氯乙酸在甲苯中的溶液来从核苷酸的5’-羟基上
去除二甲氧基三苯甲基(DMT)。无水CH3CN中的4,5-二氰基咪唑(0.7M)用作偶联步骤过
程中的活化剂。通过用苍耳烷氢化物在1:1吡啶/CH3CN中的0.1M溶液硫化3分钟的接触
时间来引入硫代磷酸酯键联。使用20％叔丁基过氧化氢在含有6％水的CH3CN中的溶液作
为氧化剂来提供磷酸二酯核苷间键联，其中接触时间为12分钟。
[1086] 在装配希望的序列之后，使用20％甲苯中的二乙胺(v/v)将磷酸氰基乙酯保护基去保护，其中接触时间为45分钟。将固体载体结合的ASO悬浮在氨水(28wt％-30wt％)
中并且在55℃下加热6h。
[1087] 然后过滤未结合的ASO并且将氨煮沸掉。残余物通过高压液相色谱法在强阴离子交换柱上纯化(GE Healthcare Bioscience，Source30Q，30μm，2.54x8cm，A＝30％水性
CH3CN中的100mM乙酸铵，B＝A中的1.5M NaBr，在60min内为0％-40％的B，流速14mL
min-1，λ＝260nm)。残余物通过HPLC在反相柱上脱盐以得到基于固体载体上的初始负载
量为15％-30％的分离产率的希望的ASO。使用Agilent 1100MSD系统通过离子对HPLC偶
联的MS分析来表征ASO。
[1088] 表21
[1089] 靶向SRB-1的在5’位上包含磷酸二酯连接的GalNAc3-2缀合物的ASO
[1090]
[1091] 下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“k”指示6’-(S)-CH3双环核苷(例如cEt)；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸
二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。上标“m”指示5-甲基胞嘧啶。
GalNAc3-2a的结构在实施例37中示出。
[1092] 实施例42：用于通过固相技术制备在5’位上包含GalNAc3-3缀合物的ASO的一般方法(ISIS 661166的制备)
[1093] 使用如实施例39和41中所说明的类似工序进行ISIS 661166的合成。
[1094] ISIS 661166为5-10-5MOE缺口聚物，其中5’位包含GalNAc3-3缀合物。使用Agilent 1100 MSD系统通过离子对HPLC偶联的MS分析来表征ASO。
[1095] 表21a
[1096] 靶向Malat-1的通过己基氨基磷酸二酯键联在5’位上包含GalNAc3-3缀合物的ASO
[1097]
[1098] 下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。上标“m”指示5-甲基胞嘧啶。“5’-GalNAc3-3a”的结构在实施例39中示出。
[1099] 实施例43：靶向SRB-1的5’末端处的磷酸二酯连接的GalNAc3-2(参见实施例37和41，Bx为腺嘌呤)的体内剂量依赖性研究
[1100] 在剂量依赖性研究中，测试在5’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc3-2缀合物的ISIS 661134(参见实施例41)对小鼠中SRB-1的反义抑制。未缀合的ISIS 440762和
651900(3’末端处的GalNAc3-1缀合物，参见实施例9)包括在研究中用于比较并且先前描
述于表4中。
[1101] 处理
[1102] 在以下示出的剂量下，用ISIS 440762、651900、661134或用PBS处理的对照皮下注射六周龄雄性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次。每个处理组由4
只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死，以使用实时PCR和 RNA
定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定肝脏SRB-1mRNA水平。在
归一化为PBS处理的对照之前，测定相对于总RNA的SRB-1mRNA水平(使用Ribogreen)。
以下结果以归一化为PBS处理的对照的每个处理组的SRB-1mRNA水平的平均百分比呈现并
且表示为“％PBS”。使用如先前所述的类似方法测量ED50并且在以下呈现。
[1103] 如表22中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1mRNA水平。事实上，在5’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc3-2缀合物的反义寡核苷酸(ISIS 661134)
或包含连接在3’末端的GalNAc3-1缀合物的反义寡核苷酸(ISIS 651900)与未缀合的反
义寡核苷酸(ISIS 440762)相比显示出效力的大致改进。此外，在5’末端包含磷酸二酯连
接的GalNAc3-2缀合物的ISIS 661134与在3’末端包含GalNAc3-1缀合物的ISIS 651900
相比效力相等。
[1104] 表22
[1105] 靶向SRB-1的含有GalNAc3-1或GalNAc3-2的ASO
[1106]
[1107] 先前在实施例9和37中描述了3’GalNAc3-1和5’GalNAc3-2的结构。
[1108] 药物代谢动力学分析(PK)
[1109] 如实施例20中所说明，以相同方式检验和评价来自高剂量组(7mg/kg)的ASO的PK。使用标准方案切碎并且提取肝脏样品。鉴定了661134(5’GalNAc3-2)和ISIS
651900(3’GalNAc3-1)的全长代谢物并且通过高分辨率质谱分析证实了其质量。结果显示
针对在5’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc3-2缀合物的ASO(ISIS 661134)所检测到的主
要代谢物为ISIS 440762(数据未示出)。在可检测水平下没有观察到另外的代谢物。不像
其对应物，针对在3’末端具有GalNAc3-1缀合物的ASO(ISIS 651900)观察到类似于先前
在表10a中报道的那些的另外的代谢物。这些结果表明具有磷酸二酯连接的GalNAc3-1或
GalNAc3-2缀合物可在不损害其效力的情况下改进ASO的PK特征。
[1110] 实施例44：PO/PS键联对靶向SRB-1的在3’末端包含GalNAc3-1缀合物(参见实施例9)的ASO的反义抑制的影响
[1111] 在单一施用研究中，针对其抑制小鼠中SRB-1的能力，对各自靶向SRB-1的在3’末端包含GalNAc3-1缀合物的ISIS 655861和655862进行测试。在研究中包括母体未缀
合化合物ISIS 353382用于比较。
[1112] ASO为5-10-5MOE缺口聚物，其中缺口区包含十个2’-脱氧核糖核苷并且每个翼区包含五个2’-MOE修饰核苷。使用如先前在实施例19中所说明的类似方法制备ASO并且
在以下表23中描述。
[1113] 表23
[1114] 靶向SRB-1的在3’末端包含GalNAc3-1缀合物的修饰ASO
[1115]
[1116] 下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。上标“m”指示5-甲基胞嘧啶。“GalNAc3-1”的结构在实施例9中示出。
[1117] 处理
[1118] 在以下示出的剂量下，用ISIS 353382、655861、655862或用PBS处理的对照皮下注射六周龄雄性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次。每个处理组由
4只动物组成。在处理之前以及在最后一次剂量之后，从每只小鼠中抽血并且分析血浆样
品。在最后施用之后72小时将小鼠处死，以使用实时PCR和 RNA定量试
剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定肝脏SRB-1mRNA水平。在归一
化为PBS处理的对照之前，测定相对于总RNA的SRB-1mRNA水平(使用Ribogreen)。以下
结果以归一化为PBS处理的对照的每个处理组的SRB-1mRNA水平的平均百分比呈现并且表
示为“％PBS”。使用如先前所述的类似方法测量ED50并且在以下报道。
[1119] 如表24中所说明，与PBS处理的对照相比，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1mRNA水平。事实上，在3’末端包含GalNAc3-1缀合物的反义寡核苷酸(ISIS
655861和655862)与未缀合反义寡核苷酸(ISIS 353382)相比显示出效力的大致改进。此
外，相对于全部PS(ISIS 655861)，具有混合的PS/PO键联的ISIS 655862显示出效力的改
进。
[1120] 表24
[1121] PO/PS键联对靶向SRB-1的在3’末端包含GalNAc3-1缀合物的ASO的反义抑制的影响
[1122]
[1123]
[1124] 使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了器官重量。结果展示相比于PBS
对照，在用ASO处理的小鼠中没有观察到转氨酶水平(表25)或器官重量(数据未示出)上
升。此外，与全部PS(ISIS 655861)相比，具有混合的PS/PO键联的ASO(ISIS 655862)显
示出类似的转氨酶水平。
[1125] 表25
[1126] PO/PS键联对靶向SRB-1的在3’末端包含GalNAc3-1缀合物的ASO的转氨酶水平的影响
[1127]
[1128] 实施例45：PFP酯化合物110a的制备
[1129]
[1130]
[1131] 单独用化合物103a或103b(38毫摩尔)和TMSOTf(0.5当量)以及二氯甲烷(200mL)中的分子筛处理化合物4(9.5g，28.8毫摩尔)，并且在室温下搅拌16小时。这时
使有机层过滤通过硅藻土，然后用碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层分离并且通过硫酸钠干燥，过滤并且在减压下缩减。通过硅胶色谱法(2％-->10％甲醇/二氯甲烷)纯化
所得到的油状物，得到>80％产率的化合物104a和104b。LCMS和质子NMR与结构一致。
[1132] 将化合物104a和104b处理至与对于化合物100a-d(实施例47)相同的条件，得到>90％产率的化合物105a和105b。LCMS和质子NMR与结构一致。
[1133] 在与对于化合物901a-d相同的条件下单独用化合物90处理化合物105a和105b，得到化合物106a(80％)和106b(20％)。LCMS和质子NMR与结构一致。
[1134] 将化合物106a和106b处理至与对于化合物96a-d(实施例47)相同的条件，得到107a(60％)和107b(20％)。LCMS和质子NMR与结构一致。
[1135] 将化合物107a和107b处理至与对于化合物97a-d(实施例47)相同的条件，得到40％-60％产率的化合物108a和108b。LCMS和质子NMR与结构一致。
[1136] 将化合物108a(60％)和108b(40％)处理至与对于化合物100a-d(实施例47)相同的条件，得到>80％产率的化合物109a和109b。LCMS和质子NMR与结构一致。
[1137] 将化合物109a处理至与对于化合物101a-d(实施例47)相同的条件，得到30％-60％产率的化合物110a。LCMS和质子NMR与结构一致。或者，可以类似方式用化合
物109b起始制备化合物110b。
[1138] 实施例46：用于与PFP酯(寡核苷酸111)缀合的一般工序；ISIS666881(GalNAc3-10)的制备
[1139] 使用标准固相寡核苷酸工序合成并纯化5’-己基氨基修饰的寡核苷酸。将5’-己基氨基修饰的寡核苷酸溶解于pH 8.5的0.1M四硼酸钠(200μL)中，并且添加3当量的溶
解于DMSO(50μL)中的所选的PFP酯化GalNAc3聚簇。如果在添加至ASO溶液时PFP酯沉
淀，那么添加DMSO直到所有PFP酯溶解。在室温下混合约16h之后反应完全。用水将所得
到的溶液稀释至12mL，然后在具有3000Da的质量截留的旋转过滤器中在3000rpm下离心沉
降。将此过程重复两次以去除小分子杂质。然后将溶液冻干至干燥并且重新溶解于浓氨水
中，并且在室温下混合2.5h，接着在真空中浓缩以去除大部分氨。通过RP-HPLC将缀合寡核苷酸纯化和脱盐并且将其冻干以提供GalNAc3缀合的寡核苷酸。
[1140]
[1141] 将寡核苷酸111与GalNAc3-10缀合。缀合物基团GalNAc3-10的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-10a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-，如用以下GalNAc3-10合成的寡核苷酸(ISIS
666881)中所示。GalNAc3-10(GalNAc3-10a-CM-)的结构在以下示出：
[1142]
[1143] 根据此一般工序制备ISIS 666881。使用标准固相寡核苷酸工序合成并且纯化5’-己基氨基修饰的寡核苷酸ISIS 660254。将ISIS 660254(40mg，5.2μmol)溶解于pH
8.5的0.1M四硼酸钠(200μL)中，并且添加3当量溶解于DMSO(50μL)中的PFP酯(化合
物110a)。在添加至ASO溶液时PFP酯沉淀，则需要另外的DMSO(600μL)来完全溶解PFP
酯。在室温下混合16h之后反应完全。用水将溶液稀释至12mL总体积，并且在具有3000Da
的质量截留的旋转过滤器中在3000rpm下离心沉降。将此过程重复两次以去除小分子杂
质。将溶液冻干至干燥并且重新溶解于浓氨水中，同时在室温下混合2.5h，接着在真空中浓缩以去除大部分氨。通过RP-HPLC将缀合的寡核苷酸纯化和脱盐并且将其冻干，得到90重
量％产率的ISIS 666881(42mg，4.7μmol)。
[1144] GalNAc3-10缀合的寡核苷酸
[1145]
[1146] 大写字母指示每个核苷的核碱基并且mC指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；
“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
[1147] 实施例47：包含GalNAc3-8的寡核苷酸102的制备
[1148]
[1149]
[1150]
[1151] 将三元酸90(4g，14.43mmol)溶解于DMF(120mL)和N,N-二异丙基乙胺(12.35mL，72毫摩尔)中。在氩气下逐滴添加三氟乙酸五氟苯基酯(8.9mL，52毫摩尔)，并且使反应物
在室温下搅拌30分钟。连同N,N-二异丙基乙胺(12.35mL，72毫摩尔)一起添加Boc-二
胺91a或91b(68.87mmol)，并且使反应物在室温下搅拌16小时。这时在减压下使DMF缩
减>75％，然后将混合物溶解于二氯甲烷中。将有机层用碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后
将有机层分离并且通过硫酸钠干燥，过滤并且在减压下缩减至油状物。通过硅胶色谱法
(2％-->10％甲醇/二氯甲烷)纯化所得到的油状物，得到大约80％产率的化合物92a和
92b。LCMS和质子NMR与结构一致。
[1152] 在室温下用20mL二氯甲烷和20mL三氟乙酸将化合物92a或92b(6.7毫摩尔)处理16小时。蒸发所得到的溶液，然后溶解于甲醇中，并且用DOWEX-OH树脂处理30分钟。过
滤所得到的溶液并且在减压下缩减至油状物，得到85％-90％产率的化合物93a和93b。
[1153] 将化合物7或64(9.6毫摩尔)在DMF(20mL)中用HBTU(3.7g，9.6毫摩尔)和N,N-二异丙基乙胺(5mL)处理15分钟。向其中添加化合物93a或93b(3毫摩尔)，并且使
其在室温下搅拌16小时。这时在减压下使DMF减少>75％，然后将混合物溶解于二氯甲烷
中。将有机层用碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层分离并且通过硫酸钠干燥，过滤并且在减压下缩减至油状物。通过硅胶色谱法(5％-->20％甲醇/二氯甲烷)纯化所得到的
油状物，得到20％-40％产率的化合物96a-d。LCMS和质子NMR与结构一致。
[1154] 在乙醇(75mL)中通过雷尼镍单独地将化合物96a-d(0.75毫摩尔)氢化3小时。这时通过过滤通过硅藻土来去除催化剂并且在减压下去除乙醇，得到80％-90％产率的化
合物97a-d。LCMS和质子NMR与结构一致。
[1155] 将化合物23(0.32g，0.53毫摩尔)在DMF(30mL)中用HBTU(0.2g，0.53毫摩尔)和N,N-二异丙基乙胺(0.19mL，1.14毫摩尔)处理15分钟。单独地向其中添加化合物
97a-d(0.38毫摩尔)，并且使其在室温下搅拌16小时。这时在减压下使DMF减少>75％，然
后将混合物溶解于二氯甲烷中。将有机层用碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层分离
并且通过硫酸钠干燥，过滤并且在减压下缩减至油状物。通过硅胶色谱法(2％-->20％甲
醇/二氯甲烷)纯化所得到的油状物，得到30％-40％产率的化合物98a-d。LCMS和质子
NMR与结构一致。
[1156] 将化合物99(0.17g，0.76毫摩尔)在DMF(50mL)中用HBTU(0.29g，0.76毫摩尔)和N,N-二异丙基乙胺(0.35mL，2.0毫摩尔)处理15分钟。单独地向其中添加化合物
97a-d(0.51毫摩尔)，并且使其在室温下搅拌16小时。这时在减压下使DMF减少>75％，然
后将混合物溶解于二氯甲烷中。将有机层用碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层分离
并且通过硫酸钠干燥，过滤并且在减压下缩减至油状物。通过硅胶色谱法(5％-->20％甲
醇/二氯甲烷)纯化所得到的油状物，得到40％-60％产率的化合物100a-d。LCMS和质子
NMR与结构一致。
[1157] 单独地在甲醇/乙酸乙酯(1:1，50mL)中通过10％Pd(OH)2/C将化合物100a-d(0.16毫摩尔)氢化3小时。这时通过过滤通过硅藻土来去除催化剂并且在减压下
去除有机物，得到80％-90％产率的化合物101a-d。LCMS和质子NMR与结构一致。
[1158] 单独地将化合物101a-d(0.15毫摩尔)溶解于DMF(15mL)和吡啶(0.016mL，0.2毫摩尔)中。在氩气下逐滴添加三氟乙酸五氟苯基酯(0.034mL，0.2毫摩尔)，并且使反应
物在室温下搅拌30分钟。这时在减压下使DMF减少>75％，然后将混合物溶解于二氯甲烷
中。将有机层用碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层分离并且通过硫酸钠干燥，过滤并且在减压下缩减至油状物。通过硅胶色谱法(2％-->5％甲醇/二氯甲烷)纯化所得到的
油状物，得到大约80％产率的化合物102a-d。LCMS和质子NMR与结构一致。
[1159]
[1160] 使用实施例46中说明的一般工序制备包含GalNAc3-8缀合物基团的低聚化合物102。缀合物基团GalNAc3-8的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-8a)可与任何可裂解部分组合
以提供各种缀合物基团。在优选的实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)
(OH)-。
[1161] GalNAc3-8(GalNAc3-8a-CM-)的结构在以下示出：
[1162] 实施例48：包含GalNAc3-7的寡核苷酸119的制备
[1163]
[1164]
[1165] 根据文献中描述的工序合成化合物112(J.Med.Chem.2004,47,5798-5808)。
[1166] 将化合物112(5g，8.6mmol)溶解于1:1甲醇/乙酸乙酯(22mL/22mL)中。添加碳上氢氧化钯(0.5g)。将反应混合物在氢气下在室温下搅拌12h。将反应混合物过滤通过硅
藻土垫并且用1:1甲醇/乙酸乙酯洗涤该垫。合并滤液和洗涤物并且浓缩至干燥，得到化
合物105a(定量的)。通过LCMS证实结构。
[1167] 将化合物113(1.25g，2.7mmol)、HBTU(3.2g，8.4mmol)和DIEA(2.8mL，16.2mmol)溶解于无水DMF(17mL)中并且将反应混合物在室温下搅拌5min。向其中添加化合物105a(3.77g，8.4mmol)在无水DMF(20mL)中的溶液。将反应物在室温下搅拌6h。在减压
下去除溶剂以得到油状物。将残余物溶解于CH2Cl2(100mL)中并且用饱和NaHCO3水溶液
(100mL)和盐水(100mL)洗涤。将有机相分离、干燥(Na2SO4)、过滤并且蒸发。通过硅胶柱
色谱法纯化残余物并且用10％至20％的二氯甲烷中的MeOH洗脱，得到化合物114(1.45g，
1
30％)。通过LCMS和 H NMR分析来证实结构。
[1168] 将化合物114(1.43g，0.8mmol)溶解于1:1甲醇/乙酸乙酯(4mL/4mL)中。添加钯碳(湿润，0.14g)。用氢气冲洗反应混合物并且在氢气下在室温下搅拌12h。将反应混合
物过滤通过硅藻土垫。用甲醇/乙酸乙酯(1:1)洗涤硅藻土垫。将滤液和洗涤物合并在一
1
起并且在减压下蒸发，得到化合物115(定量的)。通过LCMS和 H NMR分析来证实结构。
[1169] 将 化 合 物 83a(0.17g，0.75mmol)、HBTU(0.31g，0.83mmol) 和 DIEA(0.26mL，1.5mmol)溶解于无水DMF(5mL)中并且将反应混合物在室温下搅拌5min。向其中添加化合
物115(1.22g，0.75mmol)在无水DMF中的溶液并且将反应物在室温下搅拌6h。在减压下去
除溶剂并且将残余物溶解于CH2Cl2中。将有机层用饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤并且通
过无水Na2SO4干燥并且过滤。将有机层浓缩至干燥，并且通过硅胶柱色谱法纯化所获得的
残余物并且用3％至15％的二氯甲烷中的MeOH洗脱，得到化合物116(0.84g，61％)。通过
1
LCMS和 H NMR分析来证实结构。
[1170]
[1171] 将化合物116(0.74g，0.4mmol)溶解于1:1甲醇/乙酸乙酯(5mL/5mL)中。添加钯碳(湿润，0.074g)。用氢气冲洗反应混合物并且在氢气下在室温下搅拌12h。将反应混
合物过滤通过硅藻土垫。用甲醇/乙酸乙酯(1:1)洗涤硅藻土垫。将滤液和洗涤物合并在
1
一起并且在减压下蒸发，得到化合物117(0.73g，98％)。通过LCMS和 H NMR分析来证实
结构。
[1172] 将化合物117(0.63g，0.36mmol)溶解于无水DMF(3mL)中。向此溶液中添加N,N-二异丙基乙胺(70μL，0.4mmol)和三氟乙酸五氟苯基酯(72μL，0.42mmol)。将反应
混合物在室温下搅拌12h并且倾入到饱和NaHCO3水溶液中。将混合物用二氯甲烷萃取，用
盐水洗涤并且通过无水Na2SO4干燥。将二氯甲烷溶液浓缩至干燥并且用硅胶柱色谱法纯化
并且用5％至10％的二氯甲烷中的MeOH洗脱，得到化合物118(0.51g，79％)。通过LCMS
1 1 19
以及 H与 H和 F NMR证实结构。
[1173]
[1174] 使用实施例46中说明的一般工序制备包含GalNAc3-7缀合物基团的低聚化合物119。缀合物基团GalNAc3-7的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-7a)可与任何可裂解部分组合以
提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。
[1175] GalNAc3-7(GalNAc3-7a-CM-)的结构在以下示出：
[1176]
[1177] 实施例49：包含GalNAc3-5的寡核苷酸132的制备
[1178]
[1179] 将化合物120(14.01g，40mmol)和HBTU(14.06g，37mmol)溶解于无水DMF(80mL)中。添加三乙胺(11.2mL，80.35mmol)并且搅拌5min。在冰浴中冷却反应混合物并且添加化合物121(10g，mmol)在无水DMF(20mL)中的溶液。添加另外的三乙胺(4.5mL，32.28mmol)
并且将反应混合物在氩气气氛下搅拌18h。通过TLC(乙酸乙酯:己烷；1:1；Rf＝0.47)监
测反应。在减压下去除溶剂。将残余物吸收于EtOAc(300mL)中并且用1M NaHSO4(3x150mL)、饱和NaHCO3水溶液(3x150mL)和盐水(2x100mL)洗涤。用Na2SO4干燥有机层。通过过滤
去除干燥剂并且通过旋转蒸发浓缩有机层。通过硅胶柱色谱法纯化粗混合物并且通过使用
1
35％–50％的己烷中的EtOAc洗脱，得到化合物122(15.50g，78.13％)。通过LCMS和 H
+
NMR分析来证实结构。质量m/z 589.3[M+H]。
[1180] 将LiOH(92.15mmol)在水(20mL)和THF(10mL)中的溶液添加至溶解于甲醇(15mL)中的化合物122(7.75g，13.16mmol)的冷却溶液中。将反应混合物在室温下搅拌
45min并且通过TLC(EtOAc:己烷；1:1)监测。在减压下将反应混合物浓缩至一半体积。在
冰浴中冷却剩余的溶液并且通过添加浓HCl来中和。将反应混合物稀释，用EtOAc(120mL)
萃取并且用盐水洗涤(100mL)。当静置过夜时形成乳液并且澄清。将有机层分离、干燥
(Na2SO4)、过滤并且蒸发，得到化合物123(8.42g)。残余的盐可能为质量过量的原因。LCMS与结构一致。产物无需任何进一步纯化即使用。计算的分子量：574.36；实测的分子量：
+
575.3[M+H]。
[1181]
[1182] 根据文献中描述的工序合成化合物126(J.Am.Chem.Soc.2011,133,958-963)。
[1183]
[1184]
[1185] 将化合物123(7.419g，12.91mmol)、HOBt(3.49g，25.82mmol)和化合物126(6.33g，16.14mmol)溶解于DMF(40mL)中，并且在冰浴中冷却所得到的反应混合物。在氩气气氛下，向其中添加N,N-二异丙基乙胺(4.42mL，25.82mmol)、PyBop(8.7g，16.7mmol)，接着添加Bop偶联试剂(1.17g，2.66mmol)。去除冰浴并且使溶液升温至室温。在1h后反应完
成，如通过TLC(DCM:MeOH:AA；89:10:1)所测定的。在减压下浓缩反应混合物。将残余物溶解于EtOAc(200mL)中并且用1M NaHSO4(3x100mL)、饱和NaHCO3水溶液(3x100mL)和盐水
(2x100mL)洗涤。将有机相分离、干燥(Na2SO4)、过滤并且浓缩。通过硅胶柱色谱法用50％己烷/EtOAC至100％EtOAc梯度纯化残余物，得到呈白色泡沫的化合物127(9.4g)。LCMS
和1H NMR与结构一致。质量m/z 778.4[M+H]+。
[1186] 将三氟乙酸(12mL)添加至化合物127(1.57g，2.02mmol)在二氯甲烷(12mL)中的溶液中，并且在室温下搅拌1h。在减压下使反应混合物与甲苯(30mL)共蒸发至干燥。
使所获得的残余物与乙腈(30mL)和甲苯(40mL)共蒸发两次，得到呈三氟乙酸盐的化合物
128(1.67g)并且无需进一步纯化即用于下一步。LCMS和1H NMR与结构一致。质量m/z
478.2[M+H]+。
[1187] 将化合物7(0.43g，0.963mmol)、HATU(0.35g，0.91mmol)和HOAt(0.035g，0.26mmol)合并在一起并且在圆底烧瓶中在减压下通过P2O5干燥4h，然后溶解于无水DMF(1mL)中并且搅拌5min。向其中添加化合物128(0.20g，0.26mmol)在无水DMF(0.2mL)和N,N-二
异丙基乙胺(0.2mL)中的溶液。在氩气气氛下在室温下搅拌反应混合物。在30min之后反
应完全，如通过LCMS和TLC(7％MeOH/DCM)所测定的。在减压下浓缩反应混合物。将残余
物溶解于DCM(30mL)中并且用1M NaHSO4(3x20mL)、饱和NaHCO3水溶液(3x 20mL)和盐水
(3x20mL)洗涤。将有机相分离、通过Na2SO4干燥、过滤并且浓缩。通过硅胶柱色谱法使用
1
5％-15％的二氯甲烷中的MeOH来纯化残余物，得到化合物129(96.6mg)。LC MS和 H NMR
+
与结构一致。质量m/z 883.4[M+2H]。
[1188] 在20mL闪烁瓶中将化合物129(0.09g，0.051mmol)溶解于甲醇(5mL)中。向其中添加少量的10％Pd/C(0.015mg)并且用H2气体冲洗反应容器。将反应混合物在H2气氛下
在室温下搅拌18h。将反应混合物过滤通过硅藻土垫并且用甲醇洗涤硅藻土垫。将滤液洗
1
涤物汇集在一起并且在减压下浓缩，得到化合物130(0.08g)。LCMS和 H NMR与结构一致。
+
产物无需进一步纯化即使用。质量m/z 838.3[M+2H]。
[1189] 向10mL刻度的圆底烧瓶中添加化合物130(75.8mg，0.046mmol)、0.37M吡啶/DMF(200μL)和搅拌棒。在搅拌的情况下向此溶液中逐滴添加0.7M三氟乙酸五氟苯基酯/
DMF(100μL)。在1h后反应完成，如通过LC MS所测定的。在减压下去除溶剂并且将残余
物溶解于CHCl3(大约10mL)中。将有机层用NaHSO4(1M，10mL)、饱和NaHCO3水溶液(10mL)
和盐水(10mL)各分配三次。将有机相分离并且通过Na2SO4干燥、过滤并且蒸发，得到化合
+
物131(77.7mg)。LCMS与结构一致。无需进一步纯化即使用。质量m/z 921.3[M+2H]。
[1190]
[1191] 使用实施例46中说明的一般工序制备包含GalNAc3-5缀合物基团的低聚化合物132。缀合物基团GalNAc3-5的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-5a)可与任何可裂解部分组合以
提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。
[1192] GalNAc3-5(GalNAc3-5a-CM-)的结构在以下示出：
[1193]
[1194] 实施例50：包含GalNAc4-11的寡核苷酸144的制备
[1195]
[1196]
[1197] 化合物134的合成。向Merrifield烧瓶中添加用乙腈、二甲基甲酰胺、二氯甲烷和乙腈洗涤的氨甲基VIMAD树脂(2.5g，450μmol/g)。树脂在乙腈(4mL)中溶胀。通过添
加20(1.0mmol，0.747g)、TBTU(1.0mmol,0.321g)、乙腈(5mL)和DIEA(3.0mmol，0.5mL)将化合物133在100mL圆底烧瓶中预先活化。使此溶液搅拌5min，然后在振荡的情况下添加至
Merrifield烧瓶。使悬浮液振荡3h。排出反应混合物并且用乙腈、DMF和DCM洗涤树脂。
通过测量DCM中的DMT阳离子在500nm(消光系数＝76000)处的吸光度来定量新树脂负载
量并且测定为238μmol/g。通过悬浮于乙酸酐溶液中持续十分钟，进行三次，来将树脂加
帽。
[1198] 使用反复基于Fmoc(iterative Fmoc-based)的固相肽合成方法来合成固体载体结合的化合物141。取出少量固体载体并且悬浮于氨水(28wt％-30wt％)中持续6h。通
+
过LC-MS分析裂解的化合物并且所观察到的质量与结构一致。质量m/z 1063.8[M+2H]。
[1199] 使用固相肽合成方法来合成固体载体结合的化合物142。
[1200]
[1201] 在DNA合成器上使用标准固相合成来合成固体载体结合的化合物143。
[1202] 将固体载体结合的化合物143悬浮于氨水(28wt％-30wt％)中并且在55℃下加热16h。冷却溶液并且过滤固体载体。浓缩滤液，将残余物溶解于水中并且通过HPLC在强
阴离子交换柱上纯化。将含有全长化合物144的级分汇集在一起并且脱盐。通过LC-MS分
析所得到的GalNAc4-11缀合的低聚化合物并且所观察到的质量与结构一致。
[1203] 缀合物基团GalNAc4-11的GalNAc4聚簇部分(GalNAc4-11a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)
(OH)-。
[1204] GalNAc4-11(GalNAc4-11a-CM)的结构在以下示出：
[1205]
[1206] 实施例51：包含GalNAc3-6的寡核苷酸155的制备
[1207]
[1208] 如文献中所描述来合成化合物146(Analytical Biochemistry 1995,229,54-60)。
[1209]
[1210] 将化合物4(15g，45.55mmol)和化合物35b(14.3克，57mmol)溶解于CH2Cl2(200ml)中。添加活化的分子筛( 2g，粉末状)，并且使反应物在氮气气氛下搅拌30分钟。
添加TMS-OTf(4.1ml，22.77mmol)并且使反应物在室温下搅拌过夜。当完成时，通过倾入到饱和NaHCO3水溶液(500ml)和碎冰(大约150g)的溶液中来猝灭反应。将有机层分离、用
盐水洗涤、通过MgSO4干燥、过滤并且在减压下浓缩至橙色油状物。通过硅胶柱色谱法纯化粗材料并且用2％-10％的CH2Cl2中的MeOH洗脱，得到化合物112(16.53g，63％)。LCMS和
1H NMR与预期的化合物一致。
[1211] 将化合物112(4.27g，7.35mmol)溶解于1:1MeOH/EtOAc(40ml)中。通过使氩气流鼓泡穿过溶液15分钟来吹扫反应混合物。添加Pearlman氏催化剂(碳上氢氧化钯，
400mg)，并且使氢气鼓泡穿过溶液30分钟。在完成时(TLC 10％的CH2Cl2中的MeOH和
LCMS)，通过过滤通过硅藻土垫来去除催化剂。通过旋转蒸发来浓缩滤液，并且在高真空下简单干燥以得到化合物105a(3.28g)。LCMS和1H NMR与希望的产物一致。
[1212] 将化合物147(2.31g，11mmol)溶解于无水DMF(100mL)中。添加N,N-二异丙基乙胺(DIEA，3.9mL，22mmol)，接着添加HBTU(4g，10.5mmol)。使反应混合物在氮气下搅拌大约
15分钟。向其中添加化合物105a(3.3g，7.4mmol)在干燥DMF中的溶液并且在氮气气氛下
搅拌2h。将反应物用EtOAc稀释并且用饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤。将有机相分离、干
燥(MgSO4)、过滤并且浓缩至橙色浆状物。通过柱色谱法2％-5％的CH2Cl2中的MeOH来纯
化粗材料，得到化合物148(3.44g，73％)。LCMS和1H NMR与预期的产物一致。
[1213] 将化合物148(3.3g，5.2mmol)溶解于1:1MeOH/EtOAc(75ml)中。通过使氩气流鼓泡穿过溶液15分钟来吹扫反应混合物。添加Pearlman氏催化剂(碳上氢氧化钯)(350mg)。
使氢气鼓泡穿过溶液30分钟。在完成时(TLC 10％的DCM中的MeOH和LCMS)，通过过滤通
过硅藻土垫来去除催化剂。通过旋转蒸发浓缩滤液并且将其在高真空下简单干燥，得到化
合物149(2.6g)。LCMS与希望的产物一致。将残余物溶解于干燥DMF(10ml)中，其立即用
于下一步。
[1214]
[1215] 将化合物146(0.68g，1.73mmol)溶解于干燥DMF(20ml)中。向其中添加DIEA(450μL，2.6mmol，1.5当量)和HBTU(1.96g，0.5.2mmol)。使反应混合物在氮气下在室温下搅拌15分钟。添加化合物149(2.6g)在无水DMF(10mL)中的溶液。通过添加DIEA(如
果必要的话)将反应物的pH调节至pH＝9-10。使反应物在氮气下在室温下搅拌2h。在
完成时，将反应物用EtOAc(100mL)稀释，并且用饱和NaHCO3水溶液洗涤、接着用盐水洗
涤。将有机相分离、通过MgSO4干燥、过滤并且浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化残余物并且用
1
2％-10％的CH2Cl2中的MeOH洗脱，得到化合物150(0.62g，20％)。LCMS和 H NMR与希望
的产物一致。
[1216] 将化合物150(0.62g)溶解于1:1MeOH/EtOAc(5L)中。通过使氩气流鼓泡穿过溶液15分钟来吹扫反应混合物。添加Pearlman氏催化剂(碳上氢氧化钯)(60mg)。使氢气
鼓泡穿过溶液30分钟。在完成时(TLC 10％的DCM中的MeOH和LCMS)，通过过滤(注射器
针头式特氟龙过滤器，0.45μm)来去除催化剂。通过旋转蒸发来浓缩滤液并且将其在高真
空下简单干燥，得到化合物151(0.57g)。LCMS与希望的产物一致。将产物溶解于4mL干燥
DMF中并且立即用于下一步。
[1217]
[1218] 将化合物83a(0.11g，0.33mmol)溶解于无水DMF(5mL)中并且添加N,N-二异丙基乙胺(75μL，1mmol)和PFP-TFA(90μL，0.76mmol)。当接触时反应混合物变为洋红色，并
且在接下来的30分钟里逐渐变为橙色。通过TLC和LCMS监测反应的进展。当完成时(形
成PFP酯)，添加化合物151(0.57g，0.33mmol)在DMF中的溶液。通过添加N,N-二异丙基
乙胺(如果必要的话)将反应物的pH调节至pH＝9-10。将反应混合物在氮气下搅拌大约
30min。当完成时，在减压下去除大部分溶剂。用CH2Cl2稀释残余物并且用饱和NaHCO3水
溶液洗涤，接着用盐水洗涤。将有机相分离、通过MgSO4干燥、过滤并且浓缩至橙色浆状物。
通过硅胶柱色谱法(2％-10％的CH2Cl2中的MeOH)纯化残余物，得到化合物152(0.35g，
1
55％)。LCMS和 H NMR与希望的产物一致。
[1219] 将化合物152(0.35g，0.182mmol)溶解于1:1MeOH/EtOAc(10mL)中。通过使氩气流鼓泡穿过溶液15分钟来吹扫反应混合物。添加Pearlman氏催化剂(碳上氢氧化钯)
(35mg)。使氢气鼓泡穿过溶液30分钟。在完成时(TLC 10％的DCM中的MeOH和LCMS)，通
过过滤(注射器针头式特氟龙过滤器，0.45μm)来去除催化剂。通过旋转蒸发来浓缩滤液
并且将其在高真空下简单干燥，得到化合物153(0.33g，定量的)。LCMS与希望的产物一致。
[1220] 在氮气下搅拌的情况下，将化合物153(0.33g，0.18mmol)溶解于无水DMF(5mL)中。向其中添加N,N-二异丙基乙胺(65μL，0.37mmol)和PFP-TFA(35μL，0.28mmol)。将
反应混合物在氮气下搅拌大约30min。在接触时反应混合物变为洋红色，并且逐渐变为橙
色。通过添加更多的N,-二异丙基乙胺将反应混合物的pH维持在pH＝9-10。通过TLC和
LCMS监测反应的进展。当完成时，在减压下去除大部分溶剂。用CH2Cl2(50mL)稀释残余物，并且用饱和NaHCO3水溶液洗涤，接着用盐水洗涤。将有机层通过MgSO4干燥、过滤并且浓缩至橙色浆状物。通过柱色谱法纯化残余物并且用2％-10％的CH2Cl2中的MeOH洗脱，得到
1
化合物154(0.29g，79％)。LCMS和 H NMR与希望的产物一致。
[1221]
[1222] 使用实施例46中说明的一般工序制备包含GalNAc3-6缀合物基团的低聚化合物155。缀合物基团GalNAc3-6的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-6a)可与任何可裂解部分组合以
提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。
[1223] GalNAc3-6(GalNAc3-6a-CM-)的结构在以下示出：
[1224]
[1225] 实施例52：包含GalNAc3-9的寡核苷酸160的制备
[1226]
[1227] 根据文献中描述的工序合成化合物156(J.Med.Chem.2004,47,5798-5808)。
[1228] 将化合物156(18.60g，29.28mmol)溶解于甲醇(200mL)中。添加钯碳(6.15g，10wt％，负载量(干基)，基质碳粉，湿润)。将反应混合物在氢气下在室温下搅拌18h。将
反应混合物过滤通过硅藻土垫并且用甲醇彻底洗涤硅藻土垫。洗涤合并的滤液并且浓缩至
干燥。通过硅胶柱色谱法纯化残余物并且用5％-10％的二氯甲烷中的甲醇洗脱，得到化合
-
物157(14.26g，89％)。质量m/z 544.1[M-H]。
[1229] 将化合物157(5g，9.17mmol)溶解于无水DMF(30mL)中。添加HBTU(3.65g，9.61mmol)和N,N-二异丙基乙胺(13.73mL，78.81mmol)并且将反应混合物在室温下搅拌5
分钟。向其中添加化合物47(2.96g，7.04mmol)的溶液。将反应物在室温下搅拌8h。将反
应混合物倾入到饱和NaHCO3水溶液中。用乙酸乙酯萃取混合物，并且将有机层用盐水洗涤
并干燥(Na2SO4)、过滤和蒸发。通过硅胶柱色谱法纯化所获得的残余物并且用50％的己烷
1
中的乙酸乙酯洗脱，得到化合物158(8.25g，73.3％)。通过MS和 H NMR分析来证实结构。
[1230] 在减压下通过P2O5干燥化合物158(7.2g，7.61mmol)。将干燥的化合物溶解于无水DMF(50mL)中。向其中添加1H-四唑(0.43g，6.09mmol)和N-甲基咪唑(0.3mL，3.81mmol)以及2-氰乙基-N,N,N’,N’-四异丙基二氨基磷酸酯(3.65mL，11.50mmol)。将反应混合物
在氩气气氛下搅拌4h。用乙酸乙酯(200mL)稀释反应混合物。用饱和NaHCO3和盐水洗涤
反应混合物。将有机相分离、干燥(Na2SO4)、过滤并且蒸发。通过硅胶柱色谱法纯化残余物并且用50％-90％的己烷中的乙酸乙酯洗脱，得到化合物159(7.82g，80.5％)。通过LCMS
31
和 P NMR分析来证实结构。
[1231]
[1232] 使用标准寡核苷酸合成工序制备包含GalNAc3-9缀合物基团的低聚化合物160。将化合物159的三个单元偶联至固体载体，接着偶联核苷酸亚磷酰胺。用氨水处理受保护的
低聚化合物得到化合物160。缀合物基团GalNAc3-9的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-9a)可
与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝
O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-9(GalNAc3-9a-CM)的结构在以下示出：
[1233]
[1234] 实施例53：用于制备化合物18(GalNAc3-1a和GalNAc3-3a)的替代工序
[1235]
[1236] 使内酯161与二氨基丙烷(3-5当量)或单-Boc保护的二氨基丙烷(1当量)反应，以提供醇162a或162b。当未受保护的丙二胺用于上述反应时，通过在高真空下蒸发来
去除过量的二胺并且使用CbzCl保护162a中的游离氨基，以在通过柱色谱法纯化之后提供
呈白色固体的162b。在TMSOTf的存在下，使醇162b与化合物4进一步反应，以提供163a，
所述163a通过使用催化氢化去除Cbz基团而转化为163b。通过使三元酸113(参见实施
例48)与DMF(0.1M至0.5M)中的PFPTFA(3.5当量)和吡啶(3.5当量)反应来制备五氟
苯基(PFP)酯164。使三酯164与胺163b(3-4当量)和DIPEA(3-4当量)直接反应，以提
供化合物18。以上方法极大地促进中间体的纯化并且使副产物的形成最小化，所述副产物
使用实施例4中描述的工序形成。
[1237] 实施例54：用于制备化合物18(GalNAc3-1a和GalNAc3-3a)的替代工序
[1238]
[1239] 使用实施例53中概述的工序由酸113制备三PFP酯164并且使其与单-Boc保护的二胺反应，以提供基本上定量产率的165。用盐酸或三氟乙酸去除Boc基团以提供三胺，
所述三胺在合适的碱如DIPEA的存在下与PFP活化的酸166反应，以提供化合物18。
[1240] 通过用DMF中的PFPTFA(1-1.2当量)和吡啶(1-1.2当量)处理来由对应的酸制备PFP保护的Gal-NAc酸166。继而通过使用乙腈和水中的TEMPO(0.2当量)和BAIB的
氧化来由对应的醇制备前体酸。使用先前在实施例47中描述的条件，通过与1,6-己二醇
(或1,5-戊二醇或对于其它n值的其它二元醇)(2-4当量)和TMSOTf反应来由糖中间体
4制备前体醇。
[1241] 实施例55：靶向SRB-1的包含3'-缀合物基团或5'-缀合物基团的寡核苷酸(比较GalNAc3-1、3、8和9)的体内剂量依赖性研究
[1242] 在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。包括未缀合的ISIS 353382作为标准物。各种GalNAc3缀合物基团中的每一个均通过磷酸二
酯连接的2'-脱氧腺苷核苷(可裂解部分)连接在相应寡核苷酸的3'或5'末端处。
[1243] 表26
[1244] 靶向SRB-1的修饰ASO
[1245]m
[1246] 大写字母指示每个核苷的核碱基并且 C指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；
“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
[1247] GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出。GalNAc3-9的结构先前在实施例52中示出。GalNAc3-3的结构先前在实施例39中示出。GalNAc3-8的结构先前在实施例47中示
出。
[1248] 处理
[1249] 在以下示出的剂量下用ISIS 353382、655861、664078、661161、665001或用盐水皮下注射六周龄雄性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次。每
个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死，以使用实时PCR和
RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定
肝脏SRB-1mRNA水平。以下结果以归一化为盐水对照的每个处理组的SRB-1mRNA水平的平
均百分比呈现。
[1250] 如表27中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1mRNA水平。事实上，在3’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc3-1和GalNAc3-9缀合物的反义寡核苷酸
(ISIS 655861和ISIS 664078)和包含连接在5’末端的GalNAc3-3和GalNAc3-8缀合物的
反义寡核苷酸(ISIS 661161和ISIS 665001)与未缀合的反义寡核苷酸(ISIS 353382)相
比显示出效力的大致改进。此外，在3'末端包含GalNAc3-9缀合物的ISIS 664078与在3’
末端包含GalNAc3-1缀合物的ISIS 655861相比基本上效力相等。分别包含GalNAc3-3或
GalNAc3-9的5'缀合的反义寡核苷酸ISIS 661161和ISIS 665001与3'缀合的反义寡核
苷酸(ISIS 655861和ISIS 664078)相比具有增加的效力。
[1251] 表27
[1252] 靶向SRB-1的含有GalNAc3-1、3、8或9的ASO
[1253]
[1254]
[1255] 使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素和BUN。评价了体重
变化，其中与盐水组相比没有显著变化。ALT、AST、总胆红素和BUN值在下表中示出。
[1256] 表28
[1257]
[1258]
[1259] 实施例56：靶向SRB-1的包含3'-缀合物基团或5'-缀合物基团的寡核苷酸(比较GalNAc3-1、2、3、5、6、7和10)的体内剂量依赖性研究
[1260] 在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。包括未缀合的ISIS 353382作为标准物。各种GalNAc3缀合物基团中的每一个均通过磷酸二
酯连接的2'-脱氧腺苷核苷(可裂解部分)连接在相应寡核苷酸的5'末端处，具有连接在
3’末端处的GalNAc3缀合物基团的ISIS 655861除外。
[1261] 表29
[1262] 靶向SRB-1的修饰ASO
[1263]
[1264]
[1265] 大写字母指示每个核苷的核碱基并且mC指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；
“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
[1266] GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出。GalNAc3-2a的结构先前在实施例37中示出。GalNAc3-3a的结构先前在实施例39中示出。GalNAc3-5a的结构先前在实施例49中
示出。GalNAc3-6a的结构先前在实施例51中示出。GalNAc3-7a的结构先前在实施例48中
示出。GalNAc3-10a的结构先前在实施例46中示出。
[1267] 处理
[1268] 在以下示出的剂量下用ISIS 353382、655861、664507、661161、666224、666961、666981、666881或用盐水皮下注射六周龄雄性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory,Bar
Harbor,ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死以使用
实时PCR和 RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准
方案测定肝脏SRB-1mRNA水平。以下结果以归一化为盐水对照的每个处理组的SRB-1mRNA
水平的平均百分比呈现。
[1269] 如表30中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1mRNA水平。事实上，缀合反义寡核苷酸与未缀合反义寡核苷酸(ISIS 353382)相比显示出效力的大致
改进。5'缀合的反义寡核苷酸与3'缀合的反义寡核苷酸相比显示出效力稍微增加。
[1270] 表30
[1271]
[1272]
[1273] 使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素和BUN。评价了体重
变化，其中与盐水组相比没有显著变化。ALT、AST、总胆红素和BUN值在以下表31中示出。
[1274] 表31
[1275]
[1276]
[1277] 实施例57：靶向ApoC III的包含3'-缀合物基团的寡核苷酸的体内作用持续时间研究
[1278] 用以下指示的剂量注射小鼠一次并且经过42天的过程监测ApoC-III和血浆甘油三酯(血浆TG)水平。在每个组中使用3只表达人APOC-III的转基因小鼠进行研究。
[1279] 表32
[1280] 靶向ApoC III的修饰ASO
[1281]
[1282]m
[1283] 大写字母指示每个核苷的核碱基并且 C指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；
“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
[1284] GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出。
[1285] 表33
[1286] ApoC III mRNA(第1天时的％盐水)和血浆TG水平(第1天时的％盐水)
[1287]
[1288] 如上表中可看出，与未缀合寡核苷酸相比，作用持续时间随着3'-缀合物基团的添加而增加。与缀合的全部PS寡核苷酸647535相比，对于缀合的混合PO/PS寡核苷酸
647536存在作用持续时间的进一步增加。
[1289] 实施例58：靶向SRB-1的包含3'-缀合物基团的寡核苷酸(比较GalNAc3-1和GalNAc4-11)的体内剂量依赖性研究
[1290] 在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。包括未缀合的ISIS 440762作为未缀合标准物。缀合物基团中的每一个均通过磷酸二酯连接
的2'-脱氧腺苷核苷可裂解部分连接在相应寡核苷酸的3'末端处。
[1291] GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出。GalNAc3-11a的结构先前在实施例50中示出。
[1292] 处理
[1293] 在以下示出的剂量下用ISIS 440762、651900、663748或用盐水皮下注射六周龄雄性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次。每个处理组由4只动物组
成。在最后施用之后72小时将小鼠处死，以使用实时PCR和 RNA定量试
剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定肝脏SRB-1mRNA水平。以下结
果以归一化为盐水对照的每个处理组的SRB-1mRNA水平的平均百分比呈现。
[1294] 如表34中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1mRNA水平。在3’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc3-1和GalNAc4-11缀合物的反义寡核苷酸(ISIS
651900和ISIS 663748)与未缀合的反义寡核苷酸(ISIS 440762)相比显示出效力的大致
改进。两种缀合寡核苷酸GalNAc3-1和GalNAc4-11效力相等。
[1295] 表34
[1296] 靶向SRB-1的修饰ASO
[1297]
[1298]m
[1299] 大写字母指示每个核苷的核碱基并且 C指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“k”指示6’-(S)-CH3双环核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；
“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
[1300] 使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素和BUN。评价了体重
变化，其中与盐水组相比没有显著变化。ALT、AST、总胆红素和BUN值在以下表35中示出。
[1301] 表35
[1302]
[1303] 实施例59：靶向FXI的GalNAc3-1缀合的ASO的体内作用
[1304] 在多剂量研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的FXI的反义抑制。包括ISIS404071作为未缀合标准物。缀合物基团中的每一个均通过磷酸二酯连接的2'-脱氧腺苷核
苷可裂解部分连接在相应寡核苷酸的3'末端处。
[1305] 表36
[1306] 靶向FXI的修饰ASO
[1307]m
[1308] 大写字母指示每个核苷的核碱基并且 C指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；
“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
[1309] GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出。
[1310] 处理
[1311] 在以下示出的剂量下用ISIS 404071、656172、656173或用PBS处理的对照皮下注射六周龄雄性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)，一周两次，持续3
周。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死以使用实时PCR和
RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定
肝脏FXImRNA水平。还使用ELISA测量了血浆FXI蛋白水平。在归一化为PBS处理的对照
之前，确定相对于总RNA的FXI mRNA水平(使用 )。以下结果以每个处
理组的FXI mRNA水平的平均百分比呈现。将数据归一化为PBS处理的对照并且表示为“％
PBS”。使用如先前所述的类似方法测量ED50并且在以下呈现。
[1312] 表37
[1313] 因子XI mRNA(％盐水)
[1314]
[1315] 如表37中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低FXI mRNA水平。包含3'-GalNAc3-1缀合物基团的寡核苷酸与未缀合的反义寡核苷酸(ISIS 404071)相
比显示出效力的大致改进。在两种缀合寡核苷酸之间，通过用PO取代一些PS键联(ISIS
656173)来进一步提供效力改进。
[1316] 如表37a中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低FXI蛋白水平。包含3'-GalNAc3-1缀合物基团的寡核苷酸与未缀合的反义寡核苷酸(ISIS 404071)相
比显示出效力的大致改进。在两种缀合寡核苷酸之间，通过用PO取代一些PS键联(ISIS
656173)来进一步提供效力改进。
[1317] 表37a
[1318] 因子XI蛋白(％盐水)
[1319]
[1320]
[1321] 使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素、总白蛋白、CRE和BUN。
评价了体重变化，其中与盐水组相比没有显著变化。ALT、AST、总胆红素和BUN值在下表中示出。
[1322] 表38
[1323]
[1324] 实施例60：靶向SRB-1的缀合ASO的体外作用
[1325] 在多剂量研究中测试以下列出的寡核苷酸对原代小鼠肝细胞中的SRB-1的反义抑制。包括ISIS 353382作为未缀合标准物。缀合物基团中的每一个均通过磷酸二酯连接
的2'-脱氧腺苷核苷可裂解部分连接在相应寡核苷酸的3'或5'末端处。
[1326] 表39
[1327] 靶向SRB-1的修饰ASO
[1328]
[1329] 大写字母指示每个核苷的核碱基并且mC指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；
“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
[1330] GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出。GalNAc3-3a的结构先前在实施例39中示出。GalNAc3-8a的结构先前在实施例47中示出。GalNAc3-9a的结构先前在实施例52中
示出。GalNAc3-6a的结构先前在实施例51中示出。GalNAc3-2a的结构先前在实施例37中
示出。GalNAc3-10a的结构先前在实施例46中示出。GalNAc3-5a的结构先前在实施例49
中示出。GalNAc3-7a的结构先前在实施例48中示出。
[1331] 处理
[1332] 在体外在小鼠原代肝细胞中测试以上列出的寡核苷酸，所述小鼠原代肝细胞以25,000个细胞/孔的密度涂布并且用0.03nM、0.08nM、0.24nM、0.74nM、2.22nM、6.67nM或
20nM修饰寡核苷酸处理。在大约16小时的处理期之后，从细胞中分离RNA并且通过定量实
时PCR测量mRNA水平并且如通过 所测量，根据总RNA含量调节SRB-1mRNA
水平。
[1333] 使用标准方法计算IC50并且结果呈现于表40中。结果显示，在其中没有使用试剂或电穿孔技术来人工促进寡核苷酸进入到细胞中的自由摄取条件下，包含GalNAc缀合物
的寡核苷酸比不包含GalNAc缀合物的母体寡核苷酸(ISIS 353382)在肝细胞中显著更有
效。
[1334] 表40
[1335]
[1336]a
[1337] 多次运行的平均值。
[1338] 实施例61：包含GalNAc3-12的低聚化合物175的制备
[1339]
[1340]
[1341]
[1342]
[1343] 化合物169为商业上可获得的。通过向化合物171添加苯甲基(全氟苯基)戊二酸酯来制备化合物172。通过向DMF中的5-(苯甲氧基)-5-氧戊酸添加PFP-TFA和DIEA
来制备苯甲基(全氟苯基)戊二酸酯。使用实施例46中说明的一般工序由化合物174制
备包含GalNAc3-12缀合物基团的低聚化合物175。缀合物基团GalNAc3-12的GalNAc3聚簇
部分(GalNAc3-12a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某一实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-12(GalNAc3-12a-CM-)的结构在以
下示出：
[1344]
[1345] 实施例62：包含GalNAc3-13的低聚化合物180的制备
[1346]
[1347]
[1348] 使用实施例2中示出的一般工序制备化合物176。使用实施例49中说明的一般工序由化合物177制备包含GalNAc3-13缀合物基团的低聚化合物180。缀合物基团
GalNAc3-13的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-13a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合
物基团。在某一实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-13(
GalNAc3-13a-CM-)的结构在以下示出：
[1349]
[1350] 实施例63：包含GalNAc3-14的低聚化合物188的制备
[1351]
[1352] 化合物181和185为商业上可获得的。使用实施例46中说明的一般工序由化合物187制备包含GalNAc3-14缀合物基团的低聚化合物188。缀合物基团GalNAc3-14的GalNAc3
聚簇部分(GalNAc3-14a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方
案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-14(GalNAc3-14a-CM-)的结
构在以下示出：
[1353]
[1354] 实施例64：包含GalNAc3-15的低聚化合物197的制备
[1355]
[1356]
[1357] 化合物189为商业上可获得的。使用实施例31中示出的一般工序制备化合物195。使用标准寡核苷酸合成工序由化合物194和195制备包含GalNAc3-15缀合物基团的低聚化
合物197。缀合物基团GalNAc3-15的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-15a)可与任何可裂解部
分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝
O)(OH)-。GalNAc3-15(GalNAc3-15a-CM-)的结构在以下示出：
[1358]
[1359] 实施例65：靶向SRB-1的包含5’-缀合物基团的寡核苷酸(比较GalNAc3-3、12、13、14和15)的体内剂量依赖性研究
[1360] 在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。包括未缀合的ISIS 353382作为标准物。GalNAc3缀合物基团中的每一个均通过磷酸二酯连
接的2'-脱氧腺苷核苷(可裂解部分)连接在相应寡核苷酸的5'末端处。
[1361] 表41
[1362] 靶向SRB-1的修饰ASO
[1363]
[1364] 大写字母指示每个核苷的核碱基并且mC指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；
“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
[1365] GalNAc3-3a的结构先前在实施例39中示出。GalNAc3-12a的结构先前在实施例61中示出。GalNAc3-13a的结构先前在实施例62中示出。GalNAc3-14a的结构先前在实施例
63中示出。GalNAc3-15a的结构先前在实施例64中示出。
[1366] 处理
[1367] 在以下示出的剂量下用ISIS 353382、661161、671144、670061、671261、671262或用盐水皮下注射六至八周龄C57bl6小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次或两次。给药两次的小鼠在第一次剂量之后三天接受第二次剂量。每个处理组由4只动物组
成。在最后施用之后72小时将小鼠处死，以使用实时PCR和 RNA定量试
剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定肝脏SRB-1mRNA水平。以下结
果以归一化为盐水对照的每个处理组的SRB-1mRNA水平的平均百分比呈现。
[1368] 如表42中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1mRNA水平。在接受单一剂量的动物与接受两次剂量的动物之间没有观察到靶敲除的显著差异(参见
ISIS 353382剂量30mg/kg和2x 15mg/kg；以及ISIS 661161剂量5mg/kg和2x 2.5mg/
kg)。包含磷酸二酯连接的GalNAc3-3、12、13、14和15缀合物的反义寡核苷酸与未缀合的
反义寡核苷酸(ISIS 335382)相比显示出效力的大致改进。
[1369] 表42
[1370] SRB-1mRNA(％盐水)
[1371]
[1372]
[1373] 使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素和BUN。评价了体重
变化，其中与盐水组相比没有显著差异(数据未示出)。ALT、AST、总胆红素和BUN值在以
下表43中示出。
[1374] 表43
[1375]
[1376]
[1377] 实施例66：各种可裂解部分对通过包含5’-GalNAc3聚簇的靶向SRB-1的寡核苷酸进行的体内反义抑制的影响
[1378] 在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。GalNAc3缀合物基团中的每一个均通过磷酸二酯连接的核苷(可裂解部分(CM))连接在相
应寡核苷酸的5'末端处。
[1379] 表44
[1380] 靶向SRB-1的修饰ASO
[1381]
[1382] 大写字母指示每个核苷的核碱基并且mC指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；
“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
[1383] GalNAc3-3a的结构先前在实施例39中示出。GalNAc3-13a的结构先前在实施例62中示出。
[1384] 处理
[1385] 在以下示出的剂量下用ISIS 661161、670699、670700、670701、671165或用盐水皮下注射六至八周龄C57bl6小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次。每
个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死，以使用实时PCR和
RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定
肝脏SRB-1mRNA水平。以下结果以归一化为盐水对照的每个处理组的SRB-1mRNA水平的平
均百分比呈现。
[1386] 如表45中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1mRNA水平。包含各种可裂解部分的反义寡核苷酸均显示出类似的效力。
[1387] 表45
[1388] SRB-1mRNA(％盐水)
[1389]
[1390] 使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素和BUN。评价了体重
变化，其中与盐水组相比没有显著差异(数据未示出)。ALT、AST、总胆红素和BUN值在以
下表46中示出。
[1391] 表46
[1392]
[1393] 实施例67：包含GalNAc3-16的低聚化合物199的制备
[1394]
[1395] 使用实施例7和9中说明的一般工序制备包含GalNAc3-16缀合物基团的低聚化合物199。缀合物基团GalNAc3-16的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-16a)可与任何可裂解部
分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝
O)(OH)-。GalNAc3-16(GalNAc3-16a-CM-)的结构在以下示出：
[1396]
[1397] 实施例68：包含GalNAc3-17的低聚化合物200的制备
[1398]
[1399] 使用实施例46中说明的一般工序制备包含GalNAc3-17缀合物基团的低聚化合物200。缀合物基团GalNAc3-17的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-17a)可与任何可裂解部分组
合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)
(OH)-。GalNAc3-17(GalNAc3-17a-CM-)的结构在以下示出：
[1400]
[1401] 实施例69：包含GalNAc3-18的低聚化合物201的制备
[1402]
[1403] 使用实施例46中说明的一般工序制备包含GalNAc3-18缀合物基团的低聚化合物201。缀合物基团GalNAc3-18的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-18a)可与任何可裂解部分组
合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)
(OH)-。GalNAc3-18(GalNAc3-18a-CM-)的结构在以下示出：
[1404]
[1405] 实施例70：包含GalNAc3-19的低聚化合物204的制备
[1406]
[1407] 使用实施例52中说明的一般工序由化合物64制备包含GalNAc3-19缀合物基团的低聚化合物204。缀合物基团GalNAc3-19的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-19a)可与任
何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)
(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-19(GalNAc3-19a-CM-)的结构在以下示出：
[1408]
[1409] 实施例71：包含GalNAc3-20的低聚化合物210的制备
[1410]
[1411] 通过将PFP-TFA和DIEA添加至乙腈中的6-(2,2,2-三氟乙酰氨基)己酸来制备化合物205，所述乙腈中的6-(2,2,2-三氟乙酰氨基)己酸通过将三氟甲磺酸酐添加至
6-氨基己酸来制备。将反应混合物加热至80℃，然后降低至室温。使用实施例52中说明
的一般工序由化合物208制备包含GalNAc3-20缀合物基团的低聚化合物210。缀合物基团
GalNAc3-20的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-20a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合
物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-20(
GalNAc3-20a-CM-)的结构在以下示出：
[1412]
[1413] 实施例72：包含GalNAc3-21的低聚化合物215的制备
[1414]
[1415] 化合物211为商业上可获得的。使用实施例52中说明的一般工序由化合物213制备包含GalNAc3-21缀合物基团的低聚化合物215。缀合物基团GalNAc3-21的GalNAc3聚
簇部分(GalNAc3-21a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案
中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-21(GalNAc3-21a-CM-)的结构
在以下示出：
[1416]
[1417] 实施例73：包含GalNAc3-22的低聚化合物221的制备
[1418]
[1419] 使用二异丙基铵四唑由化合物219制备化合物220。使用实施例52中说明的一般工序由化合物220制备包含GalNAc3-21缀合物基团的低聚化合物221。缀合物基团
GalNAc3-22的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-22a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合
物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-22(
GalNAc3-22a-CM-)的结构在以下示出：
[1420]
[1421] 实施例74：各种可裂解部分对通过包含5’-GalNAc3缀合物的靶向SRB-1的寡核苷酸进行的体内反义抑制的影响
[1422] 在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。GalNAc3缀合物基团中的每一个均连接在相应寡核苷酸的5'末端处。
[1423] 表47
[1424] 靶向SRB-1的修饰ASO
[1425]
[1426] 在所有表格中，大写字母指示每个核苷的核碱基并且mC指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
[1427] GalNAc3-3a的结构先前在实施例39中示出。GalNAc3-17a的结构先前在实施例68中示出，并且GalNAc3-18a的结构在实施例69中示出。
[1428] 处理
[1429] 在以下示出的剂量下用列于表47中的寡核苷酸或用盐水皮下注射六至八周龄C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次。每个处理组由4只动物组成。
在最后施用之后72小时将小鼠处死以使用实时PCR和 RNA定量试剂
(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定SRB-1mRNA水平。以下结果以归一
化为盐水对照的每个处理组的SRB-1mRNA水平的平均百分比呈现。
[1430] 如表48中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1mRNA水平。包含GalNAc缀合物的反义寡核苷酸显示出类似的效力并且比缺乏GalNAc缀合物的母体寡
核苷酸显著更有效。
[1431] 表48
[1432] SRB-1mRNA(％盐水)
[1433]
[1434] 使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素和BUN。评价了体重
变化，其中与盐水组相比没有显著变化(数据未示出)。ALT、AST、总胆红素和BUN值在以
下表49中示出。
[1435] 表49
[1436]
[1437]
[1438] 实施例75：包含5’-缀合物基团的寡核苷酸的药物代谢动力学分析
[1439] 使用根据实施例65、66和74中描述的处理工序所获得的肝脏样品来评价以上表41、44和47中的ASO的PK。使用标准方案切碎并提取肝脏样品并且与内标物一起通过
IP-HPLC-MS进行分析。通过对适当的UV峰进行积分来测量所有代谢物的组合的组织水平
(μg/g)，并且使用适当的萃取离子色谱图(EIC)测量缺少缀合物的全长ASO(“母体”，在这种情况下为Isis No.353382)的组织水平。
[1440] 表50
[1441] 肝脏中的PK分析
[1442]
[1443]
[1444] 以上表50中的结果显示，在寡核苷酸施用之后72小时，尤其当考虑到具有与不具有GalNAc3缀合物基团的寡核苷酸之间的给药差异时，包含GalNAc3缀合物基团的寡核苷酸
的肝脏组织水平比不包含GalNAc3缀合物基团的母体寡核苷酸(ISIS 353382)更高。此外，
至72小时，40％-98％的包含GalNAc3缀合物基团的每个寡核苷酸代谢为母体化合物，表明
GalNAc3缀合物基团从寡核苷酸上裂解。
[1445] 实施例76：包含GalNAc3-23的低聚化合物230的制备
[1446]
[1447]
[1448] 化合物222为商业上可获得的。将44.48ml(0.33mol)的化合物222用吡啶(500mL)中的甲苯磺酰氯(25.39g，0.13mol)处理16小时。然后将反应物蒸发至油状物，溶
解于EtOAc中并且用水、饱和NaHCO3、盐水洗涤，并且通过Na2SO4干燥。将乙酸乙酯浓缩至干燥并且通过柱色谱法纯化，用EtOAc/己烷(1:1)洗脱，接着用10％的CH2Cl2中的甲醇洗脱，得到呈无色油状物的化合物223。LCMS和NMR与结构一致。在室温下将10g(32.86mmol)的
1-甲苯磺酰基三甘醇(化合物223)用DMSO(100mL)中的叠氮化钠(10.68g，164.28mmol)处
理17小时。然后将反应混合物倾倒在水上，并且用EtOAc萃取。将有机层用水洗涤三次并且通过Na2SO4干燥。将有机层浓缩至干燥，得到5.3g的化合物224(92％)。LCMS和NMR与结构
一致。在惰性气氛下用4A分子筛(5g)和二氯甲烷(100mL)中的TMSOTf(1.65ml，9.11mmol)
处理1-叠氮基三甘醇(化合物224，5.53g，23.69mmol)和化合物4(6g，18.22mmol)。在14
小时之后，过滤反应物以去除分子筛，并且将有机层用饱和NaHCO3、水、盐水洗涤，并且通过Na2SO4干燥。将有机层浓缩至干燥并且通过柱色谱法纯化，用2％至4％梯度的二氯甲烷中
的甲醇洗脱，得到化合物225。LCMS和NMR与结构一致。通过Pearlman氏催化剂在EtOAc/
甲醇(4:1，250mL)中氢化化合物225(11.9g，23.59mmol)。在8小时之后，通过过滤去除催
化剂并且去除溶剂至干燥，得到化合物226。LCMS和NMR与结构一致。
[1449] 为了生成化合物227，用五氟三氟乙酸酯(9.05ml，52.65mmol)逐滴处理硝基甲烷三丙酸(4.17g，15.04mmol)和Hunig氏碱(10.3ml，60.17mmol)在DMF(100mL)中的溶液。
在30分钟之后，将反应物倾倒在冰水上并且用EtOAc萃取。将有机层用水、盐水洗涤，并
且通过Na2SO4干燥。将有机层浓缩至干燥并且然后从庚烷中重结晶，得到呈白色固体的化
合物227。LCMS和NMR与结构一致。将化合物227(1.5g，1.93mmol)和化合物226(3.7g，
7.74mmol)在室温下在乙腈(15mL)中搅拌2小时。然后将反应物蒸发至干燥并且通过柱色
谱法纯化，用2％至10％梯度的二氯甲烷中的甲醇洗脱，得到化合物228。LCMS和NMR与结
构一致。在氢气气氛中，用乙醇(100mL)中的雷尼镍(约2g湿润)处理化合物228(1.7g，
1.02mmol)。在12小时之后，通过过滤去除催化剂并且将有机层蒸发至固体，所述固体直接用于下一步。LCMS和NMR与结构一致。用DMF(5mL)中的苯甲基戊二酸(0.18g，0.8mmol)、
HBTU(0.3g，0.8mmol)和DIEA(273.7μl，1.6mmol)处理此固体(0.87g，0.53mmol)。在16小时之后，在减压下在65℃下去除DMF至油状物，并且将油状物溶解于二氯甲烷。将有机层用饱和NaHCO3、盐水洗涤，并且通过Na2SO4干燥。在有机层蒸发之后，通过柱色谱法纯化化合物并且用2％至20％梯度的二氯甲烷中的甲醇洗脱，得到偶联的产物。LCMS和NMR与结构
一致。将苯甲酯在氢气气氛下用Pearlman氏催化剂去保护，持续1小时。然后通过过滤去
除催化剂并且去除溶剂至干燥，得到酸。LCMS和NMR与结构一致。将酸(486mg，0.27mmol)
溶解于干燥DMF(3mL)中。添加吡啶(53.61μl，0.66mmol)并且用氩气吹扫反应物。将五氟
三氟乙酸酯(46.39μl，0.4mmol)缓慢添加至反应混合物中。反应物的颜色从浅黄色变为
酒红色，并且放出轻烟，所述轻烟用氩气流吹走。使反应物在室温下搅拌一小时(通过LCMS证实反应完全)。在减压下(旋转蒸发)在70℃下去除溶剂。将残余物用DCM稀释并且用
1N NaHSO4、盐水、饱和碳酸氢钠洗涤并再次用盐水洗涤。将有机物通过Na2SO4干燥、过滤并且浓缩至干燥，得到225mg的呈易碎黄色泡沫的化合物229。LCMS和NMR与结构一致。
[1450] 使用实施例46中说明的一般工序由化合物229制备包含GalNAc3-23缀合物基团的低聚化合物230。GalNAc3-23缀合物基团的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-23a)可与任何可
裂解部分组合以提供各种缀合物基团。GalNAc3-23(GalNAc3-23a-CM)的结构在以下示出：
[1451]
[1452] 实施例77：通过包含GalNAc3缀合物的靶向SRB-1的寡核苷酸进行的体内反义抑制
[1453] 在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。
[1454] 表51
[1455] 靶向SRB-1的修饰ASO
[1456]
[1457] GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出，GalNAc3-3a在实施例39中示出，GalNAc3-9a在实施例52中示出，GalNAc3-10a在实施例46中示出，GalNAc3-19a在实施例70
中示出，GalNAc3-20a在实施例71中示出，并且GalNAc3-23a在实施例76中示出。
[1458] 处理
[1459] 在以下示出的剂量下用列于表51中的寡核苷酸或用盐水各自皮下注射六至八周龄C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次。每个处理组由4只动物组
成。在最后施用之后72小时将小鼠处死以使用实时PCR和 RNA定量试
剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定SRB-1mRNA水平。以下结果以
归一化为盐水对照的每个处理组的SRB-1mRNA水平的平均百分比呈现。
[1460] 如表52中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1mRNA水平。
[1461] 表52
[1462] SRB-1mRNA(％盐水)
[1463]
[1464] 使用标准方案，还测量了血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素和BUN。评价了体重变化，其中与盐水组
相比没有显著变化(数据未示出)。ALT、AST、总胆红素和BUN值在以下表53中示出。
[1465] 表53
[1466]
[1467] 实施例78：通过包含GalNAc3缀合物的靶向血管紧张素原的寡核苷酸进行的体内反义抑制
[1468] 在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对血压正常的斯普拉道来大鼠中的血管紧张素原(AGT)的反义抑制。
[1469] 表54
[1470] 靶向AGT的修饰ASO
[1471]
[1472] GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出。
[1473] 处理
[1474] 在以下示出的剂量(总共三次剂量)下，每周一次用列于表54中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射六周龄雄性斯普拉道来大鼠。每个处理组由4只动物组成。在最后剂
量之后72小时将大鼠处死。使用实时PCR和 RNA定量试剂(Molecular
Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测量AGT肝脏mRNA水平。用1:20,000稀释的血浆
使用总血管紧张素原ELISA(目录号JP27412,IBL International,Toronto,ON)来测量AGT
血浆蛋白水平。以下结果以归一化为PBS对照的每个处理组的肝脏中AGT mRNA水平或血
浆中AGT蛋白水平的平均百分比呈现。
[1475] 如表55中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低AGT肝脏mRNA和血浆蛋白水平，并且包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比缺乏GalNAc缀合物的母体寡核苷酸
显著更有效。
[1476] 表55
[1477] AGT肝脏mRNA和血浆蛋白水平
[1478]
[1479]
[1480] 使用标准方案，在处死时还测量了血浆中的肝脏转氨酶水平(即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST))和体重。结果在以下表56中示出。
[1481] 表56
[1482] 肝脏转氨酶水平和大鼠体重
[1483]
[1484] 实施例79：包含GalNAc3缀合物的靶向APOC-III的寡核苷酸的体内作用持续时间
[1485] 在单一剂量研究中测试列于以下表57中的寡核苷酸在小鼠中的作用持续时间。
[1486] 表57
[1487] 靶向APOC-III的修饰ASO
[1488]
[1489]
[1490] GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出，GalNAc3-3a在实施例39中示出，GalNAc3-7a在实施例48中示出，GalNAc3-10a在实施例46中示出，并且GalNAc3-13a在实施
例62中示出。
[1491] 处理
[1492] 用列于表57中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射表达人APOC-III的六至八周龄转基因小鼠一次。每个处理组由3只动物组成。在给药之前抽血以确定基线并且在剂量之
后72小时、1周、2周、3周、4周、5周和6周时抽血。如实施例20中所描述来测量血浆甘油
三酯和APOC-III蛋白水平。以下结果以归一化为基线水平的每个处理组的血浆甘油三酯
和APOC-III水平的平均百分比呈现，表明包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸表现出比不
具有缀合物基团的母体寡核苷酸(ISIS 304801)更长的作用持续时间，即使母体剂量为包
含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸剂量的三倍也是如此。
[1493] 表58
[1494] 转基因小鼠中的血浆甘油三酯和APOC-III蛋白水平
[1495]
[1496]
[1497] 实施例80：通过包含GalNAc3缀合物的靶向α-1抗胰蛋白酶(A1AT)的寡核苷酸进行的体内反义抑制
[1498] 在研究中测试列于以下表59中的寡核苷酸对小鼠中的A1AT的剂量依赖性抑制。
[1499] 表59
[1500] 靶向A1AT的修饰ASO
[1501]
[1502] GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出，GalNAc3-3a在实施例39中示出，GalNAc3-7a在实施例48中示出，GalNAc3-10a在实施例46中示出，并且GalNAc3-13a在实施
例62中示出。
[1503] 处理
[1504] 在以下示出的剂量(总共三次剂量)下，每周一次用列于表59中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射六周龄雄性C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory,Bar
Harbor,ME)。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死。使
用实时PCR和 RNA定量 试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)
根据标准方案测定A1AT肝脏mRNA水平。使用小鼠α1-抗胰蛋白酶ELISA(目录号
41-A1AMS-E01,Alpco,Salem,NH)测定A1AT血浆蛋白水平。以下结果以归一化为PBS对照
的每个处理组的A1AT肝脏mRNA和血浆蛋白水平的平均百分比呈现。
[1505] 如表60中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低A1AT肝脏mRNA和A1AT血浆蛋白水平。包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比母体(ISIS 476366)显著更有效。
[1506] 表60
[1507] A1AT肝脏mRNA和血浆蛋白水平
[1508]
[1509]
[1510] 使用标准方案在处死时测量血浆中的肝脏转氨酶和BUN水平。还测量了体重和器官重量。结果在以下表61中示出。体重以相对于基线的％示出。器官重量以相对于PBS
对照组的体重的％示出。
[1511] 表61
[1512]
[1513] 实施例81：包含GalNAc3聚簇的靶向A1AT的寡核苷酸的体内作用持续时间
[1514] 在单一剂量研究中测试列于表59中的寡核苷酸在小鼠中的作用持续时间。
[1515] 处理
[1516] 用列于表59中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射六周龄雄性C57BL/6小鼠一次。每个处理组由4只动物组成。在给药前一天抽血以确定基线并且在剂量之后5天、12天、
19天和25天时抽血。通过ELISA测量血浆A1AT蛋白水平(参见实施例80)。以下结果以
归一化为基线水平的每个处理组的血浆A1AT蛋白水平的平均百分比呈现。结果显示，包
含GalNAc缀合物的寡核苷酸更有效并且比缺乏GalNAc缀合物的母体(ISIS 476366)具有
更长的作用持续时间。此外，包含5’-GalNAc缀合物的寡核苷酸(ISIS 678381、678382、
678383和678384)通常比包含3’-GalNAc缀合物的寡核苷酸(ISIS 656326)甚至更有效
并且作用持续时间甚至更长。
[1517] 表62
[1518] 小鼠中的血浆A1AT蛋白水平
[1519]
[1520]
[1521] 实施例82：通过包含GalNAc3缀合物的靶向SRB-1的寡核苷酸进行的体外反义抑制
[1522] 在处理之前2小时，以15,000个细胞/孔将小鼠原代肝脏肝细胞接种于96孔平板中。以2nM、10nM、50nM或250nM在Williams E培养基中添加列于表63中的寡核苷酸，
并且将细胞在37℃下在5％CO2中孵育过夜。在寡核苷酸添加之后16小时使细胞裂解，并
且使用RNease 3000BioRobot(Qiagen)纯化总RNA。使用实时PCR和 RNA
定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定SRB-1mRNA水平。使用
Prism 4软件(GraphPad)确定IC50值。结果显示，包含各种不同GalNAc缀合物基团和各
种不同可裂解部分的寡核苷酸在体外自由摄取实验中比缺乏GalNAc缀合物基团的母体寡
核苷酸(ISIS 353382和666841)显著更有效。
[1523] 表63
[1524] SRB-1表达的体外抑制
[1525]
[1526]
[1527] GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出，GalNAc3-3a在实施例39中示出，GalNAc3-5a在实施例49中示出，GalNAc3-6a在实施例51中示出，GalNAc3-7a在实施例48中
示出，GalNAc3-8a在实施例47中示出，GalNAc3-9a在实施例52中示出，GalNAc3-10a在实施例
46中示出，GalNAc3-12a在实施例61中示出，GalNAc3-13a在实施例62中示出，GalNAc3-14a在实施例63中示出，GalNAc3-15a在实施例64中示出，GalNAc3-17a在实施例68中示出，
GalNAc3-18a在实施例69中示出，GalNAc3-19a在实施例70中示出，GalNAc3-20a在实施例
71中示出，并且GalNAc3-23a在实施例76中示出。
[1528] 实施例83：通过包含GalNAc3聚簇的靶向因子XI的寡核苷酸进行的体内反义抑制
[1529] 在研究中测试列于以下表64中的寡核苷酸对小鼠中的因子XI的剂量依赖性抑制。
[1530] 表64
[1531] 靶向因子XI的修饰寡核苷酸
[1532]
[1533] GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出，GalNAc3-3a在实施例39中示出，GalNAc3-7a在实施例48中示出，GalNAc3-10a在实施例46中示出，并且GalNAc3-13a在实施
例62中示出。
[1534] 处理
[1535] 在以下示出的剂量(总共三次剂量)下，每周一次用以下列出的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射六至八周龄小鼠。每个处理组由4只动物组成。在最后剂量之后72小时将小
鼠处死。根据标准方案使用实时PCR测量因子XI肝脏mRNA水平并且归一化为亲环蛋白。
还测量了肝脏转氨酶、BUN和胆红素。以下结果以归一化为PBS对照的每个处理组的平均
百分比呈现。
[1536] 如表65中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低因子XI肝脏mRNA。结果显示包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比缺乏GalNAc缀合物的母体(ISIS 404071)更有
效。此外，包含5’-GalNAc缀合物的寡核苷酸(ISIS 663086、678347、678348和678349)甚至比包含3’-GalNAc缀合物的寡核苷酸(ISIS 656173)更有效。
[1537] 表65
[1538] 因子XI肝脏mRNA、肝脏转氨酶、BUN和胆红素水平
[1539]
[1540] 实施例84：包含GalNAc3缀合物的靶向因子XI的寡核苷酸的体内作用持续时间
[1541] 在单一剂量研究中测试列于表64中的寡核苷酸在小鼠中的作用持续时间。
[1542] 处理
[1543] 用列于表64中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射六至八周龄小鼠一次。每个处理组由4只动物组成。在给药前一天通过尾部放血抽血以确定基线并且在剂量之后3天、10
天和17天时抽血。使用来自R&D Systems,Minneapolis,MN的因子XI捕获和生物素化的检
测抗体(分别为目录号AF2460和BAF2460)和OptEIA Reagent Set B(目录号550534,BD
Biosciences,San Jose,CA)通过ELISA测量血浆因子XI蛋白水平。以下结果以归一化为
基线水平的每个处理组的血浆因子XI蛋白水平的平均百分比呈现。结果显示包含GalNAc
缀合物的寡核苷酸比缺乏GalNAc缀合物的母体(ISIS 404071)更有效且作用持续时间更
长。此外，包含5’-GalNAc缀合物的寡核苷酸(ISIS 663086、678347、678348和678349)甚至比包含3’-GalNAc缀合物的寡核苷酸(ISIS 656173)更有效并且作用持续时间甚至更
长。
[1544] 表66
[1545] 小鼠中的血浆因子XI蛋白水平
[1546]
[1547] 实施例85：通过包含GalNAc3缀合物的靶向SRB-1的寡核苷酸进行的体内反义抑制
[1548] 在剂量依赖性研究中测试列于表63中的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。
[1549] 处理
[1550] 在以下示出的剂量(总共三次剂量)下，每周一次用列于表63中的寡核苷酸或用盐水各自皮下注射六至八周龄C57BL/6小鼠。每个处理组由4只动物组成。在最后施
用之后48小时将小鼠处死以使用实时PCR和 RNA定量试剂(Molecular
Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定SRB-1mRNA水平。以下结果以归一化为盐水对
照的每个处理组的肝脏SRB-1mRNA水平的平均百分比呈现。
[1551] 如表67和68说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1mRNA水平。
[1552] 表67
[1553] 肝脏中的SRB-1mRNA
[1554]
[1555]
[1556] 表68
[1557] 肝脏中的SRB-1mRNA
[1558]
[1559] 还使用标准方案测量了肝脏转氨酶水平、总胆红素、BUN和体重。每个处理组的平均值在以下表69中示出。
[1560] 表69
[1561]
[1562]
[1563] 实施例86：通过包含GalNAc3聚簇的靶向TTR的寡核苷酸进行的体内反义抑制
[1564] 在剂量依赖性研究中测试列于以下表70中的寡核苷酸对表达人TTR基因的转基因小鼠中的人甲状腺素运载蛋白(TTR)的反义抑制。
[1565] 处理
[1566] 每周一次用列于下表中的寡核苷酸和剂量或用PBS各自皮下注射八周龄TTR转基因小鼠，持续三周，总共三次剂量。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死。在整个实验的各个时间点进行尾部放血，测量血浆TTR蛋白、ALT和AST水平并且报道于表72-74在将动物处死之后，测量血浆ALT、AST和人TTR水平以及体重、器官重量和
肝脏人TTR mRNA水平。使用临床分析器(AU480,Beckman Coulter,CA)测量TTR蛋白水平。
根据标准方案使用实时PCR和 RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.
Eugene,OR)来测定肝脏人TTR mRNA水平。呈现于表71-74结果为每个处理组的平均值。
mRNA水平为相对于PBS组的平均值的平均值。血浆蛋白水平为相对于基线处的PBS组的平
均值的平均值。体重为每个单独处理组的直到处死时从基线的重量变化的平均百分比。将
示出的器官重量归一化为动物的体重，然后相对于PBS组的平均归一化器官重量呈现每个
处理组的平均归一化器官重量。
[1567] 在表71-74中，“BL”指示基线，即刚好在第一次剂量之前取得的测量结果。如表71和72中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低TTR表达水平。包含GalNAc
缀合物的寡核苷酸比缺乏GalNAc缀合物的母体(ISIS 420915)更有效。此外，包含GalNAc
缀合物和混合的PS/PO核苷间键联的寡核苷酸甚至比包含GalNAc缀合物和全部PS键联的
寡核苷酸更有效。
[1568] 表70
[1569] 靶向人TTR的寡核苷酸
[1570]
[1571]
[1572] 表72的图例可见于实施例74。GalNAc3-1的结构在实施例9中示出。GalNAc3-3a的结构在实施例39中示出。GalNAc3-7a的结构在实施例48中示出。GalNAc3-10a的结构在
实施例46中示出。GalNAc3-13a的结构在实施例62中示出。GalNAc3-19a的结构在实施例
70中示出。
[1573] 表71
[1574] 人TTR的体内反义抑制
[1575]
[1576] 表72
[1577] 人TTR的体内反义抑制
[1578]
[1579]
[1580] 表73
[1581] 转氨酶水平、体重变化和相对器官重量
[1582]
[1583] 表74
[1584] 转氨酶水平、体重变化和相对器官重量
[1585]
[1586]
[1587] 实施例87：单一剂量的包含GalNAc3聚簇的靶向TTR的寡核苷酸的体内作用持续时间
[1588] 在单一剂量研究中测试ISIS号420915和660261(参见表70)在小鼠中的作用持续时间。在单一剂量研究中还测试ISIS号420915、682883和682885(参见表70)在小鼠
中的作用持续时间。
[1589] 处理
[1590] 用100mg/kg ISIS No.420915或13.5mg/kg ISIS No.660261各自皮下注射表达人TTR的八周龄雄性转基因小鼠一次。每个处理组由4只动物组成。在给药之前进行尾部
放血以确定基线并且在剂量之后第3天、第7天、第10天、第17天、第24天和第39天时进
行尾部放血。如实施例86中所描述来测量血浆TTR蛋白水平。以下结果以归一化为基线
水平的每个处理组的血浆TTR水平的平均百分比呈现。
[1591] 表75
[1592] 血浆TTR蛋白水平
[1593]
[1594] 处理
[1595] 用100mg/kg ISIS No.420915、10.0mg/kg ISIS No.682883或10.0mg/kg 682885各自皮下注射表达人TTR的雌性转基因小鼠一次。每个处理组由4只动物组成。在给药之
前进行尾部放血以确定基线并且在剂量之后第3天、第7天、第10天、第17天、第24天和
第39天时进行尾部放血。如实施例86中所描述来测量血浆TTR蛋白水平。以下结果以归
一化为基线水平的每个处理组的血浆TTR水平的平均百分比呈现。
[1596] 表76
[1597] 血浆TTR蛋白水平
[1598]
[1599] 表75和76中的结果显示包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比缺乏缀合物的母体寡核苷酸(ISIS 420915)更有效并且作用持续时间更长。
[1600] 实施例88：通过包含GalNAc3缀合物的靶向SMN的寡核苷酸进行的体内剪接调节
[1601] 测试列于表77中的寡核苷酸对小鼠中的人存活运动神经元(SMN)的剪接调节。
[1602] 表77
[1603] 靶向SMN的修饰ASO
[1604]
[1605] GalNAc3-7a的结构先前在实施例 48中示出。“X”指示通过GeneTools(Philomath,OR)产生的5’伯胺，并且GalNAc3-7b指示缺乏如下所示的接头
的-NH-C6-O部分的GalNAc3-7a的结构：
[1606]
[1607] ISIS号703421和703422为吗啉代寡核苷酸，其中两个寡核苷酸中的每个核苷酸为吗啉代核苷酸。
[1608] 处理
[1609] 用列于表78中的寡核苷酸或用盐水皮下注射表达人SMN的六周龄转基因小鼠一次。每个处理组由2只雄性和2只雌性组成。在剂量之后3天将小鼠处死，以根据标准方
案使用实时PCR测定具有和不具有外显子7的肝脏人SMN mRNA水平。使用Ribogreen试
剂测量总RNA。将SMN mRNA水平归一化为总mRNA，并且进一步归一化为盐水处理组的平均
值。包括外显子7的SMN mRNA与缺失外显子7的SMN mRNA的所得平均比率在表78中示
出。结果显示，调节剪接并包含GalNAc缀合物的完全修饰的寡核苷酸比缺乏GalNAc缀合物
的母体寡核苷酸在改变肝脏中的剪接上显著更有效。此外，对于多种修饰化学包括2’-MOE和吗啉代修饰的寡核苷酸，将维持这个趋势。
[1610] 表78
[1611] 靶向人SMN的寡核苷酸的体内作用
[1612]
[1613] 实施例89：通过包含GalNAc3缀合物的靶向载脂蛋白A(Apo(a))的寡核苷酸进行的体内反义抑制
[1614] 在研究中测试列于以下表79中的寡核苷酸对转基因小鼠中的Apo(a)的剂量依赖性抑制。
[1615] 表79
[1616] 靶向Apo(a)的修饰ASO
[1617]
[1618]
[1619] GalNAc3-7a的结构在实施例48中示出。
[1620] 处理
[1621] 在以下示出的剂量(总共六次剂量)下，每周一次用列于表79中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射八周龄雌性C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)。每个
处理组由3-4只动物组成。在第一次剂量前一天进行尾部放血并且每周在每次剂量之后进
行尾部放血以测定血浆Apo(a)蛋白水平。在最后施用之后两天将小鼠处死。使用实时PCR
和 RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测
定Apo(a)肝脏mRNA水平。使用ELISA测定Apo(a)血浆蛋白水平，并且测定肝脏转氨酶水
平。表80中的mRNA和血浆蛋白结果以相对于PBS处理组的处理组平均百分比呈现。将血
浆蛋白水平进一步归一化为PBS组的基线(BL)值。平均绝对转氨酶水平和体重(相对于
基线平均值的％)报道于表81中。
[1622] 如表80中所说明，用寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低Apo(a)肝脏mRNA和血浆蛋白水平。此外，包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比缺乏GalNAc缀合物的母体寡核苷酸
显著更有效并且作用持续时间更长。如表81中所说明，转氨酶水平和体重不受寡核苷酸的
影响，表明寡核苷酸为耐受良好的。
[1623] 表80
[1624] Apo(a)肝脏mRNA和血浆蛋白水平
[1625]
[1626]
[1627] 表81
[1628]
[1629] 实施例90：通过包含GalNAc3聚簇的靶向TTR的寡核苷酸进行的体内反义抑制
[1630] 在剂量依赖性研究中测试列于以下表82中的寡核苷酸对表达人TTR基因的转基因小鼠中的人甲状腺素运载蛋白(TTR)的反义抑制。
[1631] 处理
[1632] 每周一次用列于表83中的寡核苷酸和剂量或用PBS各自皮下注射TTR转基因小鼠，持续三周，总共三次剂量。每个处理组由4只动物组成。在第一次剂量之前，进行尾部放血以测定基线(BL)处的血浆TTR蛋白水平。在最后施用之后72小时将小鼠处死。使
用临床分析器(AU480,Beckman Coulter,CA)测量TTR蛋白水平。根据标准方案使用实时
PCR和 RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)来测定肝脏人
TTR mRNA水平。呈现于表83中的结果为每个处理组的平均值。mRNA水平为相对于PBS组
的平均值的平均值。血浆蛋白水平为相对于基线处的PBS组的平均值的平均值。“BL”指
示基线，即刚好在第一次剂量之前取得的测量结果。如表83中所说明，用反义寡核苷酸处
理以剂量依赖性方式降低TTR表达水平。包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比缺乏GalNAc缀
合物的母体(ISIS 420915)更有效，并且包含磷酸二酯或脱氧腺苷可裂解部分的寡核苷酸
与缺乏缀合物的母体相比显示出效力的显著改进(参见ISIS号682883和666943相对于
420915并且参见实施例86和87)。
[1633] 表82
[1634] 靶向人TTR的寡核苷酸
[1635]
[1636] 表82的图例可见于实施例74。GalNAc3-3a的结构在实施例39中示出。GalNAc3-7a的结构在实施例48中示出。GalNAc3-10a的结构在实施例46中示出。GalNAc3-13a的结构
在实施例62中示出。
[1637] 表83
[1638] 人TTR的体内反义抑制
[1639]
[1640] 实施例91：通过包含GalNAc3缀合物的靶向因子VII的寡核苷酸在非人灵长类动物中进行的体内反义抑制
[1641] 在非终止的剂量递增研究(non-terminal,dose escalation study)中测试列于以下表84中的寡核苷酸对猴子中的因子VII的反义抑制。
[1642] 处理
[1643] 用递增剂量的列于表84中的寡核苷酸或用PBS在第0天、第15天和第29天时各自皮下注射非首次用于实验的猴子。每个处理组由4只雄性和1只雌性组成。在第一次剂
量之前并且在此后的各个时间点进行抽血以测定血浆因子VII蛋白水平。通过ELISA测量
因子VII蛋白水平。呈现于表85中的结果为相对于基线(BL)处的PBS组的平均值(刚好
在第一次剂量之前取得的测量结果)的每个处理组的平均值。如表85中所说明，用反义寡
核苷酸处理以剂量依赖性方式降低因子VII表达水平，并且包含GalNAc缀合物的寡核苷酸
与缺乏GalNAc缀合物的寡核苷酸相比在猴子中显著更有效。
[1644] 表84
[1645] 靶向因子VII的寡核苷酸
[1646]
[1647] 表84的图例可见于实施例74。GalNAc3-10a的结构在实施例46中示出。
[1648] 表85
[1649] 因子VII血浆蛋白水平
[1650]
[1651] 实施例92：通过包含GalNAc3缀合物的靶向Apo-CIII的反义寡核苷酸在原代肝细胞中进行的反义抑制
[1652] 以15,000个细胞/孔将小鼠原代肝细胞接种于96孔平板中，并且以0.46nM、1.37nM、4.12nM或12.35nM、37.04nM、111.11nM或333.33nM或1.00μM添加靶向小鼠
ApoC-III的列于表86中的寡核苷酸。在用寡核苷酸孵育24小时之后，使细胞裂解并且使用
RNeasy(Qiagen)纯化总RNA。使用实时PCR和 RNA定量试剂(Molecular
Probes,Inc.)根据标准方案测定ApoC-III mRNA水平。使用Prism 4软件(GraphPad)确
定IC50值。结果显示无论可裂解部分是否为磷酸二酯或磷酸二酯连接的脱氧腺苷，包含
GalNAc缀合物的寡核苷酸均比缺乏缀合物的母体寡核苷酸显著更有效。
[1653] 表86
[1654] 小鼠原代肝细胞中小鼠APOC-III表达的抑制
[1655]
[1656]
[1657] GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出，GalNAc3-3a在实施例39中示出，GalNAc3-7a在实施例48中示出，GalNAc3-10a在实施例46中示出，GalNAc3-13a在实施例62
中示出，并且GalNAc3-19a在实施例70中示出。
[1658] 实施例93：通过包含混合翼和5’-GalNAc3缀合物的靶向SRB-1的寡核苷酸进行的体内反义抑制
[1659] 在剂量依赖性研究中测试列于表87中的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。
[1660] 表87
[1661] 靶向SRB-1的修饰ASO
[1662]
[1663] GalNAc3-3a的结构先前在实施例39中示出，并且GalNAc3-7a的结构先前在实施例48中示出。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“k”指示6’-(S)-CH3双环核苷(cEt)；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)。上标“m”指示5-甲基胞嘧啶。
[1664] 处理
[1665] 在以下示出的剂量下用列于表87中的寡核苷酸或用盐水皮下注射六至八周龄C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次。每个处理组由4只动物组成。
在最后施用之后72小时将小鼠处死。使用实时PCR测量肝脏SRB-1mRNA水平。根据标准
方案将SRB-1mRNA水平归一化为亲环蛋白mRNA水平。结果以相对于盐水对照组的每个处
理组的SRB-1mRNA水平的平均百分比呈现。如表88中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量
依赖性方式降低SRB-1mRNA水平，并且包含GalNAc缀合物并具有为全部cEt或混合糖修饰
的翼的缺口聚物寡核苷酸比缺乏缀合物并包含全部cEt修饰的翼的母体寡核苷酸显著更
有效。
[1666] 还测量了体重、肝脏转氨酶、总胆红素和BUN，并且每个处理组的平均值在表88中示出。体重以相对于刚好在寡核苷酸剂量之前测量的基线体重的体重平均百分比(％BL)示出。
[1667] 表88
[1668] SRB-1mRNA、ALT、AST、BUN和总胆红素水平以及体重
[1669]
[1670]
[1671] 实施例94：通过包含2’-糖修饰和5’-GalNAc3缀合物的靶向SRB-1的寡核苷酸进行的体内反义抑制
[1672] 在剂量依赖性研究中测试列于表89中的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。
[1673] 表89
[1674] 靶向SRB-1的修饰ASO
[1675]
[1676] 下标“m”指示2’-O-甲基修饰的核苷。对于完整的表格图例参见实施例74。GalNAc3-3a的结构先前在实施例39中示出，并且GalNAc3-7a的结构先前在实施例48中示
出。
[1677] 处理
[1678] 使用实施例93中描述的方案完成研究。结果在以下表90中示出并且显示包含GalNAc缀合物的2’-MOE和2’-OMe修饰的寡核苷酸比缺乏缀合物的相应母体寡核苷酸显
著更有效。体重、肝脏转氨酶、总胆红素和BUN测量的结果表明化合物均为耐受良好的。
[1679] 表90
[1680] SRB-1mRNA
[1681]
[1682] 实施例95：通过包含双环核苷和5’-GalNAc3缀合物的靶向SRB-1的寡核苷酸进行的体内反义抑制
[1683] 在剂量依赖性研究中测试列于表91中的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。
[1684] 表91
[1685] 靶向SRB-1的修饰ASO
[1686]
[1687] 下标“g”指示氟-HNA核苷，下标“l”指示包含2’-O-CH2-4’桥联的锁核苷。对于其它缩写参见实施例74表格图例。GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出，GalNAc3-3a的结构先前在实施例39中示出，并且GalNAc3-7a的结构先前在实施例48中示出。
[1688] 处理
[1689] 使用实施例93中描述的方案完成研究。结果在以下表92中示出并且显示包含GalNAc缀合物和各种双环核苷修饰的寡核苷酸比缺乏缀合物并包含双环核苷修饰的母体
寡核苷酸显著更有效。此外，包含GalNAc缀合物和氟-HNA修饰的寡核苷酸比缺乏缀合物
并包含氟-HNA修饰的母体显著更有效。体重、肝脏转氨酶、总胆红素和BUN测量的结果表
明化合物均为耐受良好的。
[1690] 表92
[1691] SRB-1mRNA、ALT、AST、BUN和总胆红素水平以及体重
[1692]
[1693] 实施例96：包含GalNAc3缀合物基团的反义寡核苷酸的血浆蛋白结合
[1694] 在超滤测定中测试靶向ApoC-III的列于表57中的寡核苷酸和靶向Apo(a)的列于表93中的寡核苷酸以便评估血浆蛋白结合。
[1695] 表93
[1696] 靶向Apo(a)的修饰寡核苷酸
[1697]
[1698] 对于表格图例参见实施例74。GalNAc3-7a的结构先前在实施例48中示出。
[1699] 将Ultrafree-MC 超 滤 单 元(30,000NMWL，低 结 合 再 生 的 纤 维 素 膜，Millipore,Bedford,MA)用300μL的0.5％Tween 80预调节并且在2000g下离心10分钟，
然后用300L的对照寡核苷酸在H2O中的300μg/mL溶液预调节并且在2000g下离心16分
钟。为了评估待用于研究中的来自表57和93个测试寡核苷酸对过滤器的非特异性结合，
将300μL的pH 7.4的寡核苷酸在H2O中的250ng/mL溶液放置于预调节的过滤器中并且
在2000g下离心16分钟。通过ELISA测定分析未过滤和过滤的样品以测定寡核苷酸浓度。
对于每个样品，使用三次重复以获得平均浓度。相对于未过滤样品的过滤样品的平均浓度
用来确定在不存在血浆的情况下通过过滤器回收的寡核苷酸的百分比(％回收)。
[1700] 收集于K3-EDTA中的来自正常的无药物人志愿者、食蟹猴和CD-1小鼠的冷冻全血浆样品购自Bioreclamation LLC(Westbury,NY)。在两种浓度(5μg/mL和150μg/mL)下将
测试寡核苷酸添加至1.2mL血浆等分试样中。将每个掺加的血浆样品的等分试样(300μL)
放置于预调节的过滤器单元中并且在37℃下孵育30分钟，接着立即在2000g下离心16分
钟。通过ELISA分析过滤和未过滤的掺加的血浆样品的等分试样，以测定每个样品中的寡
核苷酸浓度。每个浓度使用三次重复，以确定每个样品中结合和未结合的寡核苷酸的平均
百分数。使用相对于未过滤样品的浓度的过滤样品的平均浓度来确定血浆中未结合至血浆
蛋白的寡核苷酸的百分比(％未结合)。通过将每个寡核苷酸的％未结合除以％回收来校
正非特异性结合的最终未结合寡核苷酸值。通过从100中扣除最终％未结合值来确定最
终％结合寡核苷酸值。对于在每种血浆中测试的两种浓度的寡核苷酸(5μg/mL和150μg/
mL)，结果在表94中示出。结果显示GalNAc缀合物基团对血浆蛋白结合不具有显著影响。
此外，具有全部PS核苷间键联的寡核苷酸和具有混合PO/PS键联的寡核苷酸均结合血浆蛋
白，并且具有全部PS键联的那些寡核苷酸比具有混合PO/PS键联的那些寡核苷酸结合血浆
蛋白的程度略微更大。
[1701] 表94
[1702] 结合至血浆蛋白的修饰寡核苷酸的百分比
[1703]
[1704] 实施例97：包含GalNAc3缀合物基团的靶向TTR的修饰寡核苷酸
[1705] 将包含GalNAc缀合物的示于表95中的寡核苷酸设计成靶向TTR。
[1706] 表95
[1707] 靶向TTR的修饰寡核苷酸
[1708]
[1709] 表95的图例可见于实施例74。GalNAc3-1的结构在实施例9中示出。GalNAc3-3a的结构在实施例39中示出。GalNAc3-7a的结构在实施例48中示出。GalNAc3-10a的结构在
实施例46中示出。GalNAc3-13a的结构在实施例62中示出。GalNAc3-19a的结构在实施例
70中示出。
[1710] 实施例98：在hPMBC测定中评价包含GalNAc缀合物的寡核苷酸的促炎性作用
[1711] 在如实施例23和24中所描述的hPMBC测定中测试列于表96中的寡核苷酸的促炎性作用。(对于寡核苷酸的描述参见表17、70、82和95。)ISIS 353512为用作阳性对照的
高响应者，并且其它寡核苷酸描述于表70、82和95中。使用来自一位志愿者供体的血液获
得示于表96中的结果。结果显示，与具有全部PS键联的相同寡核苷酸相比，包含混合PO/
PS核苷间键联的寡核苷酸产生显著较低的促炎性反应。此外，GalNAc缀合物基团在此测定
中不具有显著作用。
[1712] 表96
[1713]ISIS No. Emax/EC50 GalNAc3聚簇 键联 CM
353512 3630 不适用 PS 不适用
420915 802 不适用 PS 不适用
682881 1311 GalNAc3-10 PS Ad
682888 0.26 GalNAc3-10 PO/PS Ad
684057 1.03 GalNAc3-19 PO/PS Ad
[1714] 实施例99：包含GalNAc缀合物的寡核苷酸对去唾液酸糖蛋白受体的结合亲和力
[1715] 在竞争性受体结合测定中测试列于表97中的寡核苷酸对去唾液酸糖蛋白受体的结合亲和力(对于寡核苷酸的描述，参见表63)。将竞争配体α1-酸糖蛋白(AGP)在50mM
乙酸钠缓冲液(pH 5)中用1U神经氨酸酶-琼脂糖在37℃下孵育16小时，并且通过唾液
酸测定或尺寸排阻色谱法(SEC)来证实>90％的去唾液酸化。根据Atsma等的工序使用一
氯化碘来碘化AGP(参见J Lipid Res.1991年1月；32(1):173-81)。在此方法中，将去唾
125
液酸化的α1-酸糖蛋白(de-AGP)添加至0.25M NaOH中的10mM氯化碘、Na I和1M甘氨
酸中。在室温下孵育10分钟之后，通过利用3KDMWCO自旋柱将混合物浓缩两次来从游离的
125 125
I中分离出 I-标记的de-AGP。在配备有Agilent SEC-3柱(7.8x300mm)和β-RAM计
125
数器的HPLC系统上测试蛋白质的标记效率和纯度。如下进行利用 I-标记的de-AGP和
6
含有ASO的各种GalNAc-聚簇的竞争实验。将人HepG2细胞(10个细胞/毫升)涂布在6
孔平板上处于2ml适当的生长培养基中。使用了用10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺
和10mM HEPES补充的MEM培养基。将细胞分别在5％和10％CO2下在37℃下孵育16-20
小时。在实验之前用不具有FBS的培养基洗涤细胞。将细胞在37℃下用1ml含有适当生长
-8 125
培养基的竞争混合物孵育30min，所述培养基具有2％FBS、10 M I-标记的de-AGP和浓
-11 -5 -2
度在10 M至10 M范围内的含有GalNAc-聚簇的ASO。在10 M GalNAc糖的存在下确定非
125
特异性结合。将细胞用不具有FBS的培养基洗涤两次，以去除未结合的 I-标记的de-AGP
和竞争者GalNAc ASO。使用含有1％β-巯基乙醇的Qiagen的RLT缓冲液使细胞裂解。在
简短的10min冻/融循环之后将裂解液转移至圆底测定管中并且在γ-计数器上测定。在
125
将 I蛋白计数除以最低GalNAc-ASO浓度计数的值之前扣除非特异性结合。使用非线性
回归算法根据单一位点竞争结合方程式拟合抑制曲线以计算结合亲和力(KD’s)。
[1716] 从在五个不同日子进行的实验中获得表97中的结果。用上标“a”标志的寡核苷酸的结果为在两个不同日子进行的实验的平均值。结果显示，在5’-末端包含GalNAc缀合
物基团的寡核苷酸以比在3’-末端包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸大1.5倍至16倍的
亲和力结合人HepG2细胞上的去唾液酸糖蛋白受体。
[1717] 表97
[1718] 去唾液酸糖蛋白受体结合测定结果
[1719]
[1720] 实施例100：靶向Apo(a)的包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸的体内反义抑制
[1721] 在单一剂量研究中测试列于以下表98a中的寡核苷酸在小鼠中的作用持续时间。
[1722] 表98a
[1723] 靶向APO(a)的修饰ASO
[1724]
[1725] GalNAc3-7a的结构在实施例48中示出。
[1726] 处理
[1727] 每周一次用列于表98b中的寡核苷酸和剂量或用PBS各自皮下注射表达人Apo(a)的雌性转基因小鼠，总共6次剂量。每个处理组由3只动物组成。在给药前一天抽血以测
定血浆中Apo(a)蛋白的基线水平并且在第一次剂量之后72小时、1周和2周时抽血。在第
一次剂量之后3周、4周、5周和6周时将发生另外的抽血。使用ELISA测量血浆Apo(a)蛋
白水平。表98b中的结果以归一化为基线水平的每个处理组的血浆Apo(a)蛋白水平的平
均百分比(％BL)呈现。结果显示包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸表现出Apo(a)表达
的有效减少。对于包含全部PS核苷间键联的寡核苷酸和包含混合PO和PS键联的寡核苷
酸观察到这种有效作用。
[1728] 表98b
[1729] Apo(a)血浆蛋白水平
[1730]
[1731] 实施例101：通过包含经由稳定部分连接的GalNAc聚簇的寡核苷酸进行的反义抑制
[1732] 测试列于表99中的寡核苷酸对小鼠APOC-III表达的体内抑制。用列于表99中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射C57Bl/6小鼠一次。每个处理组由4只动物组成。用ISIS
440670处理的每只小鼠接受2mg/kg、6mg/kg、20mg/kg或60mg/kg的剂量。用ISIS 680772
或696847处理的每只小鼠接受0.6mg/kg、2mg/kg、6mg/kg或20mg/kg。ISIS 696847的
GalNAc缀合物基团经由稳定部分连接，所述稳定部分为硫代磷酸酯键联而不是能够易于裂
解的含磷酸二酯的键联。在剂量之后72小时将动物处死。使用实时PCR测量肝脏APOC-III
mRNA水平。根据标准方案将APOC-III mRNA水平归一化为亲环蛋白mRNA水平。结果以相
对于盐水对照组的每个处理组的APOC-III mRNA水平的平均百分比呈现于表99中。结果
显示包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸比缺乏缀合物基团的寡核苷酸显著更有效。此外，
包含经由可裂解部分连接至寡核苷酸的GalNAc缀合物基团的寡核苷酸(ISIS 680772)甚
至比包含经由稳定部分连接至寡核苷酸的GalNAc缀合物基团的寡核苷酸(ISIS 696847)
更有效。
[1733] 表99
[1734] 靶向小鼠APOC-III的修饰寡核苷酸
[1735]
[1736] GalNAc3-7a的结构在实施例48中示出。
[1737] 实施例102：包含GalNAc缀合物的反义寡核苷酸在肝脏中的分布
[1738] 评价了不包含GalNAc缀合物的ISIS 353382(参见表23)和包含GalNAc缀合物的ISIS 655861(参见表23)的肝脏分布。以列于表100中的剂量用ISIS 353382或655861
皮下注射雄性balb/c小鼠一次。每个处理组由3只动物组成，除了ISIS 655861的18mg/
kg组，所述组由2只动物组成。在剂量之后48小时将动物处死以确定寡核苷酸的肝脏分
布。为了测量每个细胞的反义寡核苷酸分子的数量，将钌(II)三-联吡啶标签(MSD TAG，
Meso Scale Discovery)缀合至用来检测反义寡核苷酸的寡核苷酸探针。呈现于表100中的
结果为以百万个寡核苷酸分子/细胞单位计的每个处理组的寡核苷酸的平均浓度。结果显
示，在等效剂量下，包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比不包含GalNAc缀合物的寡核苷酸以更
高的浓度存在于总肝脏和肝细胞中。此外，包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比不包含GalNAc
缀合物的寡核苷酸以更低的浓度存在于非实质肝脏细胞中。虽然ISIS 655861在肝细胞和
非实质肝脏细胞中的浓度为每个细胞类似的，但是肝脏大约为80体积％肝细胞。因此，存
在于肝脏中的大多数ISIS 655861寡核苷酸见于肝细胞中，而存在于肝脏中的大多数ISIS
353382寡核苷酸见于非实质肝脏细胞中。
[1739] 表100
[1740]
[1741] 实施例103：包含GalNAc3缀合物的靶向APOC-III的寡核苷酸的体内作用持续时间
[1742] 在单一剂量研究中测试列于以下表101中的寡核苷酸在小鼠中的作用持续时间。
[1743] 表101
[1744] 靶向APOC-III的修饰ASO
[1745]
[1746]
[1747] GalNAc3-3a的结构在实施例39中示出，并且GalNAc3-19a在实施例70中示出。
[1748] 处理
[1749] 用列于表101中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射表达人APOC-III的雌性转基因小鼠一次。每个处理组由3只动物组成。在给药之前抽血以确定基线并且在剂量之后3
天、7天、14天、21天、28天、35天和42天时抽血。如实施例20中所描述来测量血浆甘油三酯和APOC-III蛋白水平。表102中的结果以归一化为基线水平的每个处理组的血浆甘油
三酯和APOC-III水平的平均百分比呈现。实施例79的表58中的结果与以下表102中的
结果的比较显示，包含磷酸二酯和硫代磷酸酯核苷间键联的混合物的寡核苷酸表现出比仅
包含硫代磷酸酯核苷间键联的相当(equivalent)寡核苷酸增加的作用持续时间。
[1750] 表102
[1751] 转基因小鼠中的血浆甘油三酯和APOC-III蛋白水平
[1752]
[1753]
[1754] 实施例104：包含5’-GalNAc2缀合物的寡核苷酸的合成
[1755]
[1756] 化合物120为商业上可获得的，并且化合物126的合成描述于实施例49中。将化合 物120(1g，2.89mmol)、HBTU(0.39g，2.89mmol) 和HOBt(1.64g，4.33mmol)溶 解 于DMF(10mL中，并且添加N,N-二异丙基乙胺(1.75mL，10.1mmol)。在约5min之后，将氨基己
酸苄基酯(1.36g，3.46mmol)添加至反应物中。在3h之后，将反应混合物倾入100mL的1M
NaHSO4中并且用2x50mL乙酸乙酯萃取。合并有机层并且用3x40mL饱和NaHCO3和2x盐水
洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并且浓缩。通过硅胶柱色谱法(DCM:EA:Hex，1:1:1)纯化产物，得到化合物231。LCMS和NMR与结构一致。将化合物231(1.34g，2.438mmol)溶解于二氯
甲烷(10mL)中并且添加三氟乙酸(10mL)。在室温下搅拌2h之后，将反应混合物在减压下
浓缩并且与甲苯共蒸发(3x10mL)。在减压下干燥残余物，得到呈三氟乙酸盐的化合物232。
化合物166的合成描述于实施例54中。将化合物166(3.39g，5.40mmol)溶解于DMF(3mL)
中。将化合物232(1.3g，2.25mmol)的溶液溶解于DMF(3mL)中并且添加N,N-二异丙基乙
胺(1.55mL)。将反应物在室温下搅拌30分钟，然后倾入水(80mL)并且用EtOAc(2x100mL)
萃取水层。将有机相分离并且用饱和NaHCO3水溶液(3x80mL)、1M NaHSO4(3x80mL)和盐水
(2x80mL)洗涤，然后干燥(Na2SO4)、过滤并且浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化残余物，得到化合物233。LCMS和NMR与结构一致。将化合物233(0.59g，0.48mmol)溶解于甲醇(2.2mL)
和乙酸乙酯(2.2mL)中。添加钯碳(10wt％Pd/C，湿润，0.07g)，并且将反应混合物在氢气
气氛下搅拌3h。将反应混合物过滤通过硅藻土垫并且浓缩以得到羧酸。将羧酸(1.32g，
1.15mmol，不含聚簇的酸)溶解于DMF(3.2mL)中。向其中添加N,N-二异丙基乙胺(0.3mL，
1.73mmol)和PFPTFA(0.30mL，1.73mmol)。在室温下搅拌30min之后，将反应混合物倾入
水(40mL)中并且用EtOAc(2x50mL)萃取。如上所述完成标准的后处理，得到化合物234。
LCMS和NMR与结构一致。使用实施例46中描述的一般工序制备寡核苷酸235。缀合物基
团GalNAc2-24的GalNAc2聚簇部分(GalNAc2-24a)可与寡核苷酸上存在的任何可裂解部分
组合以提供各种缀合物基团。GalNAc2-24(GalNAc2-24a-CM)的结构在以下示出：
[1757]
[1758] 实施例105：包含GalNAc1-25缀合物的寡核苷酸的合成
[1759]
[1760] 化合物166的合成描述于实施例54中。使用实施例46中描述的一般工序制备寡核苷酸236。
[1761] 或者，使用以下示出的方案合成寡核苷酸236，并且使用实施例10中描述的工序使用化合物238来形成寡核苷酸236。
[1762]
[1763] 缀合物基团GalNAc1-25的GalNAc1聚簇部分(GalNAc1-25a)可与寡核苷酸上存在的任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。GalNAc1-25(GalNAc1-25a-CM)的结构在以
下示出：
[1764]
[1765] 实施例106：通过包含5’-GalNAc2或5’-GalNAc3缀合物的靶向SRB-1的寡核苷酸进行的体内反义抑制
[1766] 在剂量依赖性研究中测试列于表103和104中的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。
[1767] 处理
[1768] 用2mg/kg、7mg/kg或20mg/kg的ISIS No.440762，或用0.2mg/kg、0.6mg/kg、2mg/kg、6mg/kg或20mg/kg的ISIS No.686221、686222或708561，或用盐水皮下注射六周龄雄性C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死。使用实时PCR测量肝脏SRB-1mRNA水平。根据标准方
案将SRB-1mRNA水平归一化为亲环蛋白mRNA水平。反义寡核苷酸以剂量依赖性方式降低
SRB-1mRNA水平，并且ED50结果呈现于表103和104中。虽然先前研究显示三价GalNAc-缀
合的寡核苷酸比二价GalNAc-缀合的寡核苷酸显著更有效，但是所述二价GalNAc-缀
合的寡核苷酸继而比一价GalNAc缀合的寡核苷酸显著更有效(参见，例如，Khorev等，
Bioorg.&Med.Chem.，第16卷，5216-5231(2008))，用包含一价、二价和三价GalNAc聚簇的反义寡核苷酸处理以与表103和104中所示类似的效力降低SRB-1mRNA水平。
[1769] 表103
[1770] 靶向SRB-1的修饰寡核苷酸
[1771]
[1772] 对于表格图例，参见实施例93。GalNAc3-13a的结构在实施例62中示出，并且GalNAc2-24a的结构在实施例104中示出。
[1773] 表104
[1774] 靶向SRB-1的修饰寡核苷酸
[1775]
[1776] 对于表格图例，参见实施例93。GalNAc1-25a的结构在实施例105中示出。
[1777] 使用实施例75中描述的工序，还评价了表103和104中的寡核苷酸在肝脏中的浓度。如通过UV以μg寡核苷酸/克肝脏组织的单位所测量，示于以下表104a和104b中的
结果为每个处理组的平均总反义寡核苷酸组织水平。结果显示，包含GalNAc缀合物基团
的寡核苷酸以显著高于相同剂量的缺乏GalNAc缀合物基团的寡核苷酸的水平在肝脏中积
累。此外，在其相应缀合物基团中包含一个、两个或三个GalNAc配体的反义寡核苷酸均以
类似水平在肝脏中积累。由以上引用的Khorev等参考文献来看此结果为令人惊奇的并且
与示于以上表103和104中的活性数据一致。
[1778] 表104a
[1779] 包含GalNAc2或GalNAc3缀合物基团的寡核苷酸的肝脏浓度
[1780]
[1781] 表104b
[1782] 包含GalNAc1缀合物基团的寡核苷酸的肝脏浓度
[1783]
[1784] 实施例107：包含GalNAc1-26或GalNAc1-27缀合物的寡核苷酸的合成
[1785]
[1786] 通过使用DMF中的HBTU和DIEA将化合物47(参见实施例15)偶联至酸64(参见实施例32)来合成寡核苷酸239。将所得到的含酰胺化合物亚磷酸酯化，然后使用实施
例10中描述的工序添加至寡核苷酸的5’-末端。缀合物基团GalNAc1-26的GalNAc1聚簇
部分(GalNAc1-26a)可与寡核苷酸上存在的任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。
GalNAc1-26(GalNAc1-26a-CM)的结构在以下示出：
[1787]
[1788] 为了将GalNAc1缀合物基团添加至寡核苷酸的3’-末端，使用实施例7中描述的工序将由化合物47和64反应所形成的酰胺添加至固体载体上。然后使用实施例9中描述
的工序完成寡核苷酸合成以便形成寡核苷酸240。
[1789]
[1790] 缀合物基团GalNAc1-27的GalNAc1聚簇部分(GalNAc1-27a)可与寡核苷酸上存在的任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。GalNAc1-27(GalNAc1-27a-CM)的结构在以
下示出：
[1791]
[1792] 实施例108：通过靶向Apo(a)的包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸进行的体内反义抑制
[1793] 在单一剂量研究中在小鼠中测试列于以下表105中的寡核苷酸。
[1794] 表105
[1795] 靶向APO(a)的修饰ASO
[1796]
[1797]
[1798] GalNAc3-7a的结构在实施例48中示出。
[1799] 处理
[1800] 用列于表106中的寡核苷酸和剂量或用PBS各自皮下注射表达人Apo(a)的雄性转基因小鼠一次。每个处理组由4只动物组成。在给药前一天抽血以确定血浆中Apo(a)蛋
白的基线水平并且在第一次剂量之后1周时抽血。另外的抽血将每周发生，持续大约8周。
使用ELISA测量血浆Apo(a)蛋白水平。表106中的结果以归一化为基线水平的每个处理组
的血浆Apo(a)蛋白水平的平均百分比(％BL)呈现。结果显示反义寡核苷酸减少Apo(a)
蛋白表达。此外，包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸表现出甚至比不包含缀合物基团的寡
核苷酸更有效的Apo(a)表达减少。
[1801] 表106
[1802] Apo(a)血浆蛋白水平
[1803]
[1804] 实施例109：包含GalNAc1-28或GalNAc1-29缀合物的寡核苷酸的合成
[1805]
[1806] 使用类似于实施例71中描述的那些的工序形成亚磷酰胺中间体，接着使用实施例10中描述的工序合成寡核苷酸来合成寡核苷酸241。缀合物基团GalNAc1-28的GalNAc1
聚簇部分(GalNAc1-28a)可与寡核苷酸上存在的任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基
团。GalNAc1-28(GalNAc1-28a-CM)的结构在以下示出：
[1807]
[1808] 为了将GalNAc1缀合物基团添加至寡核苷酸的3’-末端，使用类似于实施例71中描述的那些的工序形成羟基中间体，然后使用实施例7中描述的工序将所述羟基中间体添
加至固体载体。然后使用实施例9中描述的工序完成寡核苷酸合成以便形成寡核苷酸242。
[1809]
[1810] 缀合物基团GalNAc1-29的GalNAc1聚簇部分(GalNAc1-29a)可与寡核苷酸上存在的任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。GalNAc1-29(GalNAc1-29a-CM)的结构在以
下示出：
[1811]
[1812] 实施例110：包含GalNAc1-30缀合物的寡核苷酸的合成
[1813]
[1814] 如上所示，合成包含GalNAc1-30缀合物基团的寡核苷酸246，其中Y选自O、S、取代或未取代的C1-C10烷基、氨基、取代的氨基、叠氮基、烯基或炔基。缀合物基团GalNAc1-30的GalNAc1聚簇部分(GalNAc1-30a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在
某些实施方案中，Y为可裂解部分的一部分。在某些实施方案中，Y为稳定部分的一部分，并且可裂解部分存在于寡核苷酸上。GalNAc1-30a的结构在以下示出：
[1815]
[1816] 实施例111：包含GalNAc2-31或GalNAc2-32缀合物的寡核苷酸的合成
[1817]
[1818] 如上所示，合成包含GalNAc2-31缀合物基团的寡核苷酸250，其中Y选自O、S、取代或未取代的C1-C10烷基、氨基、取代的氨基、叠氮基、烯基或炔基。缀合物基团GalNAc2-31的GalNAc2聚簇部分(GalNAc2-31a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在
某些实施方案中，直接与寡核苷酸的5’-末端相邻的含Y基团为可裂解部分的一部分。在
某些实施方案中，直接与寡核苷酸的5’-末端相邻的含Y基团为稳定部分的一部分，并且可裂解部分存在于寡核苷酸上。GalNAc2-31a的结构在以下示出：
[1819]
[1820] 以下示出包含GalNAc2-32缀合物的寡核苷酸的合成。
[1821]
[1822] 如上所示，合成包含GalNAc2-32缀合物基团的寡核苷酸252，其中Y选自O、S、取代或未取代的C1-C10烷基、氨基、取代的氨基、叠氮基、烯基或炔基。缀合物基团GalNAc2-32的GalNAc2聚簇部分(GalNAc2-32a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在
某些实施方案中，直接与寡核苷酸的5’-末端相邻的含Y基团为可裂解部分的一部分。在
某些实施方案中，直接与寡核苷酸的5’-末端相邻的含Y基团为稳定部分的一部分，并且可裂解部分存在于寡核苷酸上。GalNAc2-32a的结构在以下示出：
[1823]
[1824] 实施例112：包含GalNAc1缀合物的修饰寡核苷酸
[1825] 用GalNAc1缀合物基团合成靶向SRB-1的表107中的寡核苷酸，以便进一步测试包含含有一个GalNAc配体的缀合物基团的寡核苷酸的效力。
[1826] 表107
[1827]
[1828]
[1829] 实施例113：包含靶向乙型肝炎病毒(HBV)的GalNAc缀合物基团的修饰寡核苷酸
[1830] 以下表108中所列出的寡核苷酸被设计成靶向HBV。在某些实施方案中，可裂解部分为磷酸二酯键联。
[1831] 表108
[1832]
[1833]
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