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含有作为活性成分的ENA活性矿物源A活化水的用于防止肝损伤或改善肝功能的药物组合物

阅读：186发布：2021-02-22

IPRDB可以提供含有作为活性成分的ENA活性矿物源A活化水的用于防止肝损伤或改善肝功能的药物组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明披露了一种具有抗氧化、抗衰老和提高肝功能活性的组合物，其含有ENA活性矿物源A活化水。更具体地，本发明披露了一种含有作为活性成分的由墨鱼骨和红藻粉制备的碱性ENA活性矿物源A活化水的保健食品或健康补充品，由于对血清中维生素C减少的抑制活性，而防止衰老，或由于对肝细胞的损伤、细胞凋亡或坏死的抑制活性，而防止肝损伤或改善肝功能。该组合物抑制体内血清维生素C的减少，从而抑制衰老并防止肝细胞的损伤、细胞凋亡或坏死，并且从根本上保护肝细胞以抑制由肝脏中的衰老引起的肝细胞的损伤、细胞凋亡或坏死并改善肝功能。，下面是含有作为活性成分的ENA活性矿物源A活化水的用于防止肝损伤或改善肝功能的药物组合物专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种药物组合物，其包含作为活性成分的碱性水溶液，由于对血清中维生素C减少的抑制活性，而防止衰老，或由于对肝细胞的损伤、细胞凋亡或坏死的抑制活性，而防止肝损伤或改善肝功能，其中所述碱性水溶液按照以下步骤制备：

将选自墨鱼骨(金乌贼)、紫菜(海苔)、琼脂(石花菜)、海藓(真江蓠)、海索面、蜈蚣藻、线性杉藻、海水藻、和红藻淀粉中的一种或多种碾压粉末化；

以1,000℃至2,000℃加热煅烧粉末物质；

使所述物质冷却并微粉化，然后将微粉物质加入到80℃至100℃的水中；

利用扬水泵以10rpm或更高的落差破碎所得到的混合物以制备离子溶液；以及过滤所述离子溶液以获得碱性水溶液。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述ENA活性矿物源A活化水以基于所述药物组合物总重量0.001至15重量百分比的量存在。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，该药物组合物由于对血清中维生素C减少的抑制活性，而防止衰老，或由于对肝细胞的损伤、细胞凋亡或坏死的抑制活性，而防止肝损伤或改善肝功能，其中，所述药物组合物被配制成胶囊、片剂、咀嚼片、粉剂、干糖浆、颗粒剂、软胶囊、丸剂、饮料或舌下片剂。

4.一种保健食品或健康补充品，其包含作为活性成分的碱性水溶液，由于对血清中维生素C减少的抑制活性，而防止衰老，或由于对肝细胞的损伤、细胞凋亡或坏死的抑制活性，而防止肝损伤或改善肝功能，其中所述碱性水溶液是按照以下步骤制备的：

将选自墨鱼骨(金乌贼)、紫菜(海苔)、琼脂(石花菜)、海藓(真江蓠)、海索面、蜈蚣藻、线性杉藻、海水藻、和红藻淀粉中的一种或多种碾压粉末化；

在于1,000℃至2,000℃加热下煅烧粉末物质；

使所述物质冷却并微粉化，然后将所述微粉物质加入到80℃至100℃的水中；

利用扬水泵以10rpm或更高的落差破碎所得到的混合物以制备离子溶液；以及过滤所述离子溶液以获得碱性水溶液。

5.根据权利要求4所述的保健食品或健康补充品，其中，所述保健食品或所述健康补充品被配制成饮料、焦糖、巧克力、减肥棒或零食。

说明书全文

含有作为活性成分的ENA活性矿物源A活化水的用于防止

肝损伤或改善肝功能的药物组合物

技术领域

[0001] 本发明涉及一种抗氧化、抗衰老并且具有肝功能改善活性的含有ENA活性矿物源A(ENA actimineral resource A)活化水的组合物。更具体地，本发明涉及含有作为活性成分ENA活性矿物源A活化水的药物组合物、保健食品或保健补充物，由于其对血清中维生素C的减少具有抑制活性从而能够防止衰老，或由于其对肝细胞的损伤、细胞凋亡、或坏死具有抑制活性从而能够防止肝损伤或改善肝功能。

背景技术

[0002] 正在经历快速发展的人类处于各种各样的外部压力之中。压力是不可避免的并且对人体的一般的衰老过程产生影响。衰老不是疾病，而是一种不可避免的自然生理现象。人类对于长寿的内在需要导致对抑制衰老进行了大量研究。而且，说人们正在承受越来越大的压力一点也不为过。随着最近追求健康的趋势，人们越来越关注生命质量的改善，大量的研究集中于具有抗衰老活性的抗氧化物质。

[0003] 衰老标记蛋白(SMP 30)是一种质量为34kDa的衰老标记蛋白，其首次发现于大鼠肝脏中，并且有报道称其随着衰老的发生迅速减少数量。这种减少行为被已知是与由于衰老在雄性大鼠体内的雄性激素产生减少有关(Fujita T.，Biochem Biophys Res Commun.1999 Jan 8；254(1)：1-4，Mori T et al.，Pathology International 2004；54；167-1737)。

[0004] 人们发现SMP 30能够防止细胞的细胞凋亡和坏死，并由此抑制物理性衰老。SMP30的主要机制如下。SMP 30作为与维生素C的合成有关的葡萄糖酸内酯酶并从而在体内维生素C的生物合成中起重要作用。SMP 30维持胞内和胞外钙离子的体内稳态，其是一种信号分子，能够在细胞的细胞凋亡和坏死中起到重要作用。另外，SMP 30本身起到抗氧化蛋白的作用，其破坏对身体造成伤害的活性氧和自由基从而防止物理性衰老以及细胞的细胞凋亡和坏死。因此，已知与具有正常SMP 30蛋白的动物相比，SMP 30蛋白缺乏会导致维生素C缺乏并加速动物的衰老。

[0005] 越来越庞大的老年人群导致与长寿相关的产业迅速发展，包括健康补充品、激素制剂、抗氧化药物、以及老年人的生活和功能辅助手段。约90％的各种现代疾病都被发现由活性氧引起。在这种情况下，由于各种活动(例如皮肤护理和抑制绝经后机能紊乱并抗衰老)而进行胎盘素注射目前引起了很多关注，并且发现胎盘素表现出除去活性氧的活性并且因此能够有助于90％的现代疾病的治疗。因此，已知胎盘素几乎能够治疗由自发性神经控制活性、内分泌控制活性和免疫复苏活性引起的所有疾病。然而，对胎盘素的各种成分的作用还没有进行研究，而且与药物不同，食品的成分和作用不标注在食品上，这是因为这种标注不是法律上强制规定的。不存在理论支持实际上表现出抗衰老效果的抗衰老激素和这些激素的应用因此不被推荐的断言。

[0006] 韩国专利第10-0463825号披露了一种用于制备ENA活性矿物源A活化水的方法以及利用其防止和减轻骨质疏松症的组合物。作为一种天然物质，ENA活性矿物源A对于物理性衰老的防止或抑制活性目前为止还是未知的，其能够抑制肝细胞损伤并抑制血清维生素C的减少，从而抑制哺乳动物的衰老。

发明内容

[0007] 因此，基于上述问题提出了本发明，本发明的一个目的是提供一种含有ENA活性矿物源A活化水作为活性成分的药物组合物和保健食品或健康补充品，其中该作为活性成分的ENA活性矿物源A活化水由于对血清维生素C减少具有抑制活性而防止衰老，或由于对肝细胞的损伤、细胞凋亡或坏死具有抑制活性而防止肝脏损伤或改善肝功能。

[0008] 根据本发明，上述和其他目的能够通过提供一种含有ENA活性矿物源A活化水作为有效成分的药物组合物和保健食品或健康补充品来实现，该作为活性成分的ENA活性矿物源A活化水由于对血清维生素C减少具有抑制活性而防止衰老，或由于对肝细胞的损伤、细胞凋亡或坏死具有抑制活性而防止肝脏损伤或改善肝功能。

[0009] ENA活性矿物源A活化水抑制体内血清维生素C的减少，从而抑制衰老和防止肝细胞的损伤、细胞凋亡或坏死。

[0010] ENA活性矿物源A活化水抑制肝细胞的损伤、细胞凋亡或坏死，从而防止肝损伤或改善肝功能。

具体实施方式

[0011] 以下，将具体描述本发明。

[0012] 根据本发明，提供了一种碱性水溶液，提供通过纯化天然可食用藻类制备的作为主要成分的天然矿物质，该天然可食用藻类，即：紫菜(海苔)、琼脂(石花菜)、海藓(真江蓠(Gracilaria verrucosa))、海索面(Nemalion vermiculare)、蜈蚣藻(Grateloupia filicina)、线形杉藻(Gigartina tenella)、海水藻(或三叉仙菜，Ceramium kondoi)、红藻淀粉、和墨鱼骨(金乌贼(Sepia esculenta))。通过韩国专利第463,825号披露的方法获得的物质被称为“ENA活性矿物源A活化水”，并且其是参照以下的方法制备的。

[0013] 如在此所使用的，术语“天然可食用的藻类”是指100％可食用的蔬菜红藻，其含有藻红蛋白以及叶绿素并且因此呈红色或紫罗兰色。这种藻类通常具有多细胞线形或叶子形状，其通常在海洋中被发现并且包括紫菜、琼脂(石花菜)、布海苔(鹿角海萝(Gloiopeltis tenax))等。另外，墨鱼骨是通过干燥由墨鱼的中心收集得到的白骨而制备的。

[0014] 利用红藻或可食用的墨鱼制备矿物质是这样进行的：彻底清洗红藻或可食用墨鱼，对它们进行充分干燥，接着以1,000℃至2000℃煅烧一小时。在通过煅烧细菌和杂质完全烧尽并由此被除去后，只剩下矿物质、无机物质。将矿物质完全冷却至环境温度，然后利用研磨器将其微粉化。

[0015] 然后，将该含有经煅烧的墨鱼骨和红藻的微粉矿物质溶解于水中。优选地，通过在80℃至100℃利用扬水泵以10rpm或更高的落差破碎该矿物质溶液一小时或更长的时间来制备离子溶液。沉淀并过滤这样获得的离子溶液。更具体地，将该离子溶液静置15至35小时以使矿物质淤渣自然沉淀，而仅所得的清澈上层清液通过过滤器进行过滤，从而制得碱性矿物质活化水。

[0016] 证实了ENA活性矿物源A活化水对存活率和体重变化、动物骨骼变化和物理转化的差异的影响。更具体地，例如，持续18周以0％、5％和10％的不同浓度向给予了维生素C的18周龄的SMP 30敲除小鼠，以及向未给予维生素C的26周龄和46周龄的SMP 30敲除小鼠给予ENA活性矿物源A活化水，通过肉眼观察到的变化以及测试周期上的体重以及存活率的变化被监测，在测试周期之后对所有的受试动物进行尸体剖检。

[0017] 结果是，对于给予了维生素C的组，能够观察到在给予了ENA活性矿物源A活化水、测试矿物质的组与未服务ENA活性矿物源A活化水的组之间没有体重差异和存活率差异(参见图1)。

[0018] 另一方面，对于未服用维生素C的组之间在体重和存活率变化上的差异，给予ENA活性矿物源A活化水的组相应于ENA活性矿物源A活化水的水平表现出体重显著快速下降低于平均体重，并且存活率为0％。也就是说，在相应于不同浓度的ENA活性矿物源A活化水的组之间存在明显差异(参见图2至图4)。

[0019] 另外，作为通过X-射线辐照证实自然发生的衰老现象对动物骨骼变化和物理转化的影响的测试结果，所有给予维生素C的组未患上坏血病性成骨病症，而所有未给予维生素C的组患有坏血病性成骨病症(参见图5)。

[0020] 证实了不论ENA活性矿物源A活化水是否能够抑制体内血清的维生素C的下降，进而抑制衰老和肝细胞的损伤、细胞凋亡或坏死。

[0021] 首先，仅在给予了维生素C的组中观察到作为证实ENA活性矿物源A活化水对血清维生素C的影响的实验结果，而仅在未给予维生素C的组中未观察到维生素C。更具体地，对于给予了维生素C的组，给予了ENA活性矿物源A活化水的组，与仅给予赋形剂的对照组相比统计学上表现出显著更高的血清中总维生素C水平。另外，能够从示出减少的维生素C与氧化的维生素C之比的图表中看出，与赋形剂对照组相比，给予了ENA活性矿物源A活化水的组表现出减少的维生素C与氧化的维生素C之比根据活化水的浓度增加。这种行为表明，ENA活性矿物源A活化水由于其具有抗衰老功能而抑制活体中的维生素C氧化，从而防止衰老(参见图6和图7)。

[0022] 同时，ENA活性矿物源A活化水抑制肝细胞的损伤、细胞凋亡或坏死并由此防止肝损伤或改善肝功能。更具体地，例如，在各种几周龄的雄性SMP-30敲除小鼠衰老模型中，对于给予维生素C的组和未给予维生素C的组，观察到在衰老进行的18周的试验期间相应地给予ENA活性矿物源A活化水的肝脏中的组的病理学变化。通过观察肝细胞的细胞凋亡和损坏以及利用获自小鼠肝脏的肝组织片段观察抗活化蛋白的表达来研究这样的病理学变化。结果，对于所有给予了维生素C的组而言，未观察到病理学异常，并且未观察到它们之间的差异。另外，能够确认在正常肝细胞的细胞质中几乎没有观察到TUNEL-阳性细胞和糖原。然而，在所有未给予维生素C的组中，多度增生的肝脏星形细胞和肝细胞表现出高于正常水平的空泡形成并且观察到TUNEL-阳性细胞。此外，给予了ENA活性矿物源A活化水的组在肝细胞的细胞质中表现出明显增加的糖原水平。这种结果表明，ENA活性矿物源A活化水抑制了由于衰老引起的肝细胞的细胞凋亡和损坏并保持正常肝功能，从而保持肝脏细胞质中的正常糖原水平并由此表现出优异的浓度依赖性肝细胞保护效应(参见图8至图13)。

[0023] ENA活性矿物源A活化水抑制过氧化物歧化酶(一种衰老指示剂)。更具体地，作为证实这种指示剂对代表性抗衰老蛋白、Cu、Zn-SOD的影响的测试结果，Cu、Zn-SOD的表达随着小鼠年龄的增长而增加。对于46周龄组，以5％的浓度给予ENA活性矿物源A活化水的组与赋形剂对照组相比，表现出肝脏中的Cu、Zn-SOD的表达减少，并且该减少的表达取决于活化水的浓度(参见图15)。

[0024] 基于药物组合物的总重量，作为活性成分的ENA活性矿物源A活化水以0.001至15重量百分比的量存在，并且优选地，以0.01至10重量百分比的量存在。

[0025] 药物组合物的每日剂量可根据个体差异(例如年龄和损伤的严重程度、或配方、或体型)来适当地控制。对于成人，该药物组合物以0.01 to 1000mg的有效量每日给予两次，并且其可被制成胶囊、片剂、咀嚼片、粉剂、干糖浆、颗粒剂、软胶囊、丸剂、饮料或舌下片剂。

[0026] 该药物组合物可进一步含有防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化促进剂、药用佐剂(如盐或缓冲剂以控制渗透压)以及其他治疗有效性物质。该药物组合物可通过常规方法配制为各种口服或肠胃外给药。

[0027] 用于口服给药的制剂的示例包括片剂、丸剂、硬胶囊和软胶囊、液体、混悬剂、乳剂、糖浆和颗粒剂等。除了活性成分之外，这些配方还可以含有稀释剂，如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和甘氨酸，以及润滑剂，例如二氧化硅、滑石粉、硬脂酸盐、硬脂酸镁、硬脂酸钙和聚乙二醇。如果需要，片剂可以含有粘结剂(如硅酸镁铝(magnesium aluminum silicate)、淀粉糊剂、明胶、黄蓍树胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷酮)，以及药物添加剂，包括分解剂(如淀粉、琼脂、藻酸盐或藻酸钠，吸附剂，着色剂，风味剂或甜味剂)。片剂可通过常规方法制备，例如混合、造粒或包衣。另外，优选的肠胃外配方是用于注射的配方，即，等渗水溶液或混悬液。

[0028] 然而，应该理解，活性成分的实际剂型可以由各种因素来确定，例如症状的严重程度、所选择的给药途径、以及受治疗者的年龄、性别、体重和健康状况。

[0029] 本领域技术人员将容易地确定和指定药物组合物的有益于皮肤的适当剂量。根据本发明的剂量的每日剂量可以根据不同因素而变化，例如受治疗者的疾病进展、疾病发作时间、年龄、健康状况和并发症。按体重比组成的组合物可以以每天一次或两次(以单独的剂量)的1至500mg/kg，优选30至200mg/kg的剂量给予。该剂量不用于限制本发明的范围。

[0030] 根据本发明，提供了一种含有ENA活性矿物源A活化水和营养学可接受的添加剂的保健功能性食品。该保健功能性食品是含有作为有效成分的ENA活性矿物源A活化水的片剂、胶囊剂、丸剂或液体。该保健食品组合物含有基于组合物的总重量0.001至10重量百分比。该保健食品可利用常规的成分被配制成饮料、焦糖、巧克力和减肥棒、或零食，其中常规成分例如葡萄糖、柠檬酸、液态低聚糖、玉米糖浆、大豆卵磷脂、黄油、氢化植物油、脱脂乳、糖、人造黄油、食用盐、淀粉、小麦粉、淀粉糖浆、麦芽糖、碳酸氢钠和糖酯。

[0031] 如前文所述，ENA活性矿物源A活化水抑制与衰老相关的现象，例如体重减轻、死亡率、临床症状、肝细胞的细胞凋亡和损伤以及使血清中维生素C减少，从而其是一种有效抑制或防止哺乳动物体内衰老的天然物质。

[0032] ENA活性矿物源A活化水是一种能够根本上保护肝细胞并因此抑制肝细胞的损伤、细胞凋亡或坏死，并且能够防止肝损伤或改善肝功能而不会伤害其他器官的天然物质。

[0033] 尽管为了示例性的目的披露了本发明的优选实施方式，但本领域技术人员将理解，在不背离由所附权利要求限定的本发明的范围和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改、增加和替换。

附图说明

[0034] 通过以下结合附图进行的详细描述，能够更加清楚地理解本发明的上述和其他目的、特征以及其他优点，其中：

[0035] 图1是比较在给予根据本发明的ENA活性矿物源A活化水之后在完整测试期间动物组之间各周平均体重变化值的图表；

[0036] 图2是示出了在给予根据本发明的ENA活性矿物源A活化水之后，18周内各组18周龄小鼠的平均存活率的图表；

[0037] 图3是示出了在给予根据本发明的ENA活性矿物源A活化水之后，18周内各组26周龄小鼠的平均存活率的图表；

[0038] 图4是示出了在给予根据本发明的ENA活性矿物源A活化水之后，18周内各组48周龄小鼠的平均存活率的图表；

[0039] 图5是示出了ENA活性矿物源A活化水对SMP 30毁坏小鼠的成骨性病症的影响的X-射线图像；

[0040] 图6是示出了在给予根据本发明的ENA活性矿物源A活化水之后，在第18周进行尸体剖检的小鼠体内的总维生素C比率的图表；

[0041] 图7是示出了在给予根据本发明的ENA活性矿物源A活化水之后，在第18周进行尸体剖检的小鼠体内的减少维生素C/氧化维生素C之比；

[0042] 图8示出了在给予本发明的ENA活性矿物源A活化水并进行尸体剖检之后，相对于ENA活性矿物源A活化水的HE-阳性细胞的病理学分析结果；

[0043] 图9示出了ENA活性矿物源A活化水对HE-阳性细胞数目的影响的比较结果；

[0044] 图10示出了在给予本发明的ENA活性矿物源A活化水并进行尸体剖检之后，相对于ENA活性矿物源A活化水的PAS-阳性细胞的病理学分析结果；

[0045] 图11示出了ENA活性矿物源A活化水对PAS-阳性细胞数目的影响的比较结果；

[0046] 图12示出了在给予根据本发明的ENA活性矿物源A活化水并进行尸体剖检之后，ENA活性矿物源A活化水对染色的TUNEL-阳性细胞数目的影响的比较结果；

[0047] 图13示出了ENA活性矿物源A活化水对TUNEL-阳性细胞数目的影响的比较结果；

[0048] 图14示出了证实在给予根据本发明的ENA活性矿物源A活化水之后，ENA活性矿物源A活化水对肝脏中SMP 30表达的影响的病理学分析结果；以及

[0049] 图15示出了利用免疫印迹法证实的ENA活性矿物源A活化水对Cu、Zn-SOD表达的影响的比较结果。

[0050] 实施例

[0051] [制备例1]ENA活性矿物源A活化水的制备

[0052] 彻底清洗墨鱼骨和红藻，干燥并且然后进行粉碎以获得粉状的墨鱼骨和红藻。将这些粉状物质于1100℃加热煅烧一小时。使经煅烧的墨鱼骨和红藻完全冷却至环境温度，然后利用研磨器进行微粉化。本文中所使用的红藻是等量的紫菜(甘紫菜)、琼脂(石花菜)、海藓(真江蓠)、海索面、蜈蚣藻、线性杉藻、海水藻和红藻淀粉的混合物。

[0053] 边搅拌边将1.5kg经煅烧的墨鱼骨微粉和4kg经煅烧的红藻微粉溶解于500L水中。得到的溶液于90℃利用扬水泵以10rpm或更高的落差破碎该矿物质溶液两小时来制备离子溶液。由此获得的离子溶液静置15至35小时以使矿物质淤渣自然沉淀，而仅对所得的清澈上层清液通过过滤器进行过滤，从而制得碱性矿物质活化水。

[0054] 由此获得的矿物质活化水被称为“ENA活性矿物源A活化水”并且下表1中示出了矿物成分的测定结果：

[0055] 表1

[0056] ENA活性矿物源A活化水的成分测定

[0057]

[0058]

[0059] 如上表1中所示，根据本发明的离子溶液是碱性的(pH为12.85)并且含有高水平的钙和大量的各种金属离子。

[0060] [实施例]

[0061] (1)测试对象

[0062] 1)物种和种系

[0063] 特异性致病生物体-缺陷型(SPF)雄性18周龄、26周龄、46周龄敲除C57BL/6小鼠。

[0064] 2)对象来源

[0065] 在此所使用的小鼠是由获自东京都老年病学研究所(Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology)(35-2 Sakae-cho，Itabashi-ku，东京，173-0015，日本)的小鼠经受基因分析和杂交产生的。

[0066] 3)对象的选择理由

[0067] 在此所使用的SMP 30-敲除小鼠经受比正常小鼠更快的衰老并由此使得其作为可用于衰老测试动物模型的有用对象并且可用于测试结果分析。

[0068] 4)隔离和驯养

[0069] 通过杂交繁育10只雄性和20只雌性获自位于庆北国立大学(Kyungpook National University)兽医学学院实验动物医学系中的东京都老年病学研究所的SMP30KO C57BL/6小鼠来制备SMP30敲除小鼠。只通过利用PCR进行的尾部DNA基因型分析从杂交繁育出生的F1小鼠中选择SMP30敲除小鼠。

[0070] 5)动物的基因型分析

[0071] 通过利用PCR的尾部DNA基因型分析来进行动物的基因型分析。根据文献中披露的组合方法从小鼠的尾部提取基因组DNA。小鼠尾部经历活组织检查并于-80℃冷冻至少15分钟。然后，向每个样品中加入300mL裂解缓冲液(60mM Tris-HCl pH 8.0；500mMEDTA；
10％SDS；0.2mg/ml核糖核酸酶A；1mg/ml蛋白酶K)。通过使混合物发生反应而进行样品裂解，同时在CO2恒温箱中以56℃震荡5小时。裂解后，在环境温度下以13000rpm的转速对每一样品进行离心，以除去组织残余物。然后，分离上层清液并向其中加入500μL异丙醇以使基因组DNA沉淀。用乙醇清洗所得的溶液。将样品离心10分钟。在除去上层清液后，将沉淀下来的片状物在环境温度下干燥。将该片状物溶解于50μL的5mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)中并使其于65℃静置5分钟。利用分光计(Backman，Fullerton，USA)对基因组DNA进行定量分析，稀释至250ng/ul的水平并向该经稀释的DNA中加入1μL的PCR混合物。
利用引物TA4(5’-CAAGTAACTCTAGGTATGGAC-3’)、TS3(5’-CTAGCCATGGTGGATGAAGAT-3’)和NEO(5’-TCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATT-3’)来进行敲除确认。

[0072] (2)繁育环境

[0073] 1)环境

[0074] 在庆北国立大学兽医学学院实验动物医学系的自动恒温恒湿调节器中驯养和饲喂本文中所使用的小鼠，其中温度为22±3℃，相对湿度为50±10％，光照周期为12小时(在早8点开灯并在晚8点熄灯)。在整个测试期间不能接受影响测试结果的繁育条件的变化。

[0075] 2)繁育箱、繁育箱的密度和鉴别

[0076] 在测试期间，在每个聚碳酸酯繁育箱(240W×390L×175Hmm)中放进5只小鼠。通过尾部标记和利用永久性标记对每个繁育箱进行标记的ID卡来进行对象的鉴别。

[0077] 3)饲料和水

[0078] a)提供饲料的方法

[0079] 通过辐照(13.2kGy)对作为饲料的测试动物的固体饲料(PMINutrition thInternational，505North 4 Street Richmond，In 47374，USA)实施灭菌，然后随意提供。

[0080] b)提供水的方法利用含有自来水的水瓶向小鼠随意提供水。

[0081] c)实验组的构成和给药

[0082] 将试验分成实验计划A和实验计划B。实验计划A利用18周龄雄性SMP 30敲除C57BL/6小鼠并将其分成三个组(对于每个组，n＝3)：对照组、实验组1和实验组2。实验计划B利用26周龄和46周龄雄性SMP30敲除C57BL/6小鼠并如实验计划A中一样将其分成三组：对照组、实验组1和实验组2。将26周龄小鼠分成三组(对于每个组，n＝4)并将46周龄小鼠分成三个组(对于每个组，n＝6)。本文中使用的ENA活性矿物源A活化水是一种由制备例1获得的粗制活化水在自来水中的稀释溶液(约5％和10％)。在18周的测试周期期间内，将该稀释的溶液随意饲喂小鼠。在第18周时，所有的动物接受尸体解剖并收集其血液和器官样品用于病理学检查。

[0083]

[0084]

[0085]

[0086] *ENA：ENA活性矿物源A活化水

[0087] *在测试期间，可随意提供饮用水

[0088] (4)观察的项目和测试检查

[0089] 1)样品对体重变化的影响

[0090] 在12周的测试周期期间每周对雄性SMP 30-敲除小鼠衰老模型进行称重并观察体重的变化。以下表1中示出了由此获得的结果。

[0091] 2)样品对与衰老有关的临床症状的影响

[0092] 为了观察天然产生的与衰老有关的临床症状，在12周的测试周期期间评估样品对雄性SMP30敲除小鼠衰老模型中的动物骨骼变化和物理性转化的影响。

[0093] 3)样品对存活率的影响

[0094] 在18周的整个测试周期通过X-射线观察雄性SMP 30-敲除小鼠衰老模型组之间的改变和差异。以下表1中示出了由此获得的结果。

[0095] 表2

[0096] ENA活性矿物源A活化水对与抗衰老活动有关的存活率的影响

[0097]

[0098]

[0099] 4)样品对血清维生素C的影响

[0100] 为了证实在18周的测试周期期间样品对雄性SMP 30-敲除小鼠衰老模型中的血清维生素C的影响，用450μL的3％偏磷酸处理通过离心(3,000g，15分钟)从血液样品中分离的100μL血清并将得到的混合物以10,000g和4℃离心10分钟，将90μL的上层清液与16.4μL的0.1％二硫苏糖醇(DTT)混合，将所得的混合物于冰浴器中静置30分钟，并向其中加入957.6μL的3％偏磷酸。将所得的混合物以1,000g和4℃离心10分钟，利用Shodex-5SIL-4E柱(4.6250mm；Showa Denko，东京)通过高性能液体色谱(HPLC)测量血液中的维生素C水平。

[0101] 5)样品对由肝脏衰老引起的病理学变化的影响

[0102] 为了证实在18周的测试周期的衰老期间样品对雄性SMP 30-损坏小鼠衰老模型的肝脏中的病理学变化的影响，进行苏木精-伊红染色，高碘酸染色，TUNEL测试染色和免疫组织化学分析。用光学分光镜来观察染色并计算对每一种染色表现出阳性反应的细胞从而观察组间细胞的细胞凋亡和损伤以及抗氧化蛋白表达的差异。利用双屏进行所有的病理学监测。以下表3中示出了如此获得的结果。

[0103] 表3

[0104] 不同年龄(周)和小鼠组中的肝脏损害和损伤

[0105]

[0106]*

[0107] ENA：ENA活性矿物源A活化水

[0108] 6)样品对肝脏中抗氧化蛋白表达的影响

[0109] 为了证实样品在18周的测试期间之后在雄性SMP 30-敲除小鼠衰老模型中对代表性抗氧化蛋白、超氧化物歧化酶(Cu，Zn-SOD)表达的影响，将于-70℃冷冻的肝脏组织在含有0.1mM正钒酸钠(Na3Vo4)和蛋白酶抑制剂混合片剂(Roche，Mannheim，德国)的RIPA缓冲液中均质化。将所得的肝样品以4℃和4000rpm离心10分钟以除去脂质。将所得的上层清液以4℃和14,000rpm再次离心20分钟以获得上层清液。通过蛋白质定量测定(Bradford法)来测量该上层清液中的蛋白质水平。使该蛋白质样品(80μg/孔)经历10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。将电泳凝胶中的蛋白质电传递通过用于特定蛋白质检测(免疫印记法)的PVDF膜(Schleicher & Schuell，Dassel，德国)。然后，在阻断溶液(其中将3％牛血清白蛋白(Bovine serum albumin)溶解于三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水中)中阻断该蛋白质样品一小时，然后与Cu，Zn-SOD(1∶100，Stressgen，Victoria，加拿大)和β-微管蛋白(1∶1000，Sigma，Missouri，USA)反应。用含有0.5％ Twin 200的TBS缓冲溶液对所得的样品进行彻底冲洗，然后与对应于一抗的二抗的稀释溶液(以1∶1000至
1∶2000的比率)在环境温下反应一小时。再次用TBS缓冲溶液彻底清洗样品，与Super Signal West Dura持久性化学发光底物(PIERCE，IL，USA)反应以观察特定反应，然后暴露于医用X-射线胶片(Kodak，东京，日本)。

[0110] (5)统计方法

[0111] 利用成对(而不是非成对)T-检验对如此获得的数据进行统计分析，以评价两组之间的平均差异。T-检验是一种统计假设检验，其中两组之间的平均差异是利用组的方差来标准化的并对所得的值进行统计分析。T-检验分为两种情况，即，一种情况是各组具有相同的方差而另一种情况是各组具有不同的方差。这种分析是利用统计学程序GraphPad inStat(版本3.05，GraphPad Software Inc.)来进行的。检验的显著性水平为5％和1％。

[0112] [药物组合物配方1]片剂

[0113] 利用流化床干燥器将80mg的ENA活性矿物源A活化水、200mg的低聚乳糖、60mg的乳糖和140mg的麦芽糖酶的混合物造粒，向颗粒中加入6mg的糖酯并利用压片机将得到的混合物压片。药片成分的总重量为600mg。

[0114] [保健食品组合物配方2]饮料

[0115] 将300mL蒸馏水加入到80mg的ENA活性矿物源A活化水、10mg的葡萄糖、0.6g的柠檬酸和25g的液态低聚糖的混合物中，并将得到的混合物以每瓶200mL的量灌装，然后于130℃灭菌4至5秒来制备饮料。

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