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一种淡水蛭弧菌微生物制剂及快速评价其货架期的方法

阅读：1111发布：2020-08-04

IPRDB可以提供一种淡水蛭弧菌微生物制剂及快速评价其货架期的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了一种淡水蛭弧菌微生物制剂及快速评价其货架期的方法。其中，制备得到的淡水蛭弧菌微生物制剂显著提高了蛭弧菌的成活率，为蛭弧菌的活力差的问题提供了新的解决思路和方法，使得蛭弧菌易培养、长久保存而广泛应用于水产动物的养殖成为可能。本发明公开的快速评价淡水蛭弧菌微生物制剂货架期的方法可有效快速评价淡水蛭弧菌的活力保持，操作简单、数据准确；无需进行传统的分析检测，可利用存在的数据预测微生物的活性。，下面是一种淡水蛭弧菌微生物制剂及快速评价其货架期的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种淡水蛭弧菌微生物制剂的制备方法，其特征在于包含如下步骤：(1)制备蛭弧菌游泳体；

(2)在步骤(1)得到的蛭弧菌游泳体加入保护剂，得到货架期延长的淡水蛭弧菌微生物制剂；

所述蛭弧菌为淡水蛭弧菌BDS01，于2009年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 209169；

所述保护剂为终浓度5％W/V的谷氨酸钠、终浓度5％W/V的蔗糖、终浓度5％W/V的内消旋肌醇、终浓度5％W/V的棉子糖、终浓度5％W/V的葡萄糖、终浓度15％W/V的甘油或终浓度

5％W/V的谷氨酸钠+终浓度15％W/V的甘油；

所述的蛭弧菌游泳体的终浓度为1010PFU/mL；

所述的蛭弧菌游泳体的制备方法，包含如下步骤：

㈠宿主菌悬浮液的制备

将宿主菌接种于营养肉汤培养基中，摇床培养，然后将培养液离心弃上清，得到的沉淀用2～3mL营养肉汤液体培养基悬浮；得到宿主菌悬浮液，4℃保存备用；

㈡蛭弧菌游泳体的制备

将步骤㈠制备的宿主菌悬浮液接种到100mL的营养肉汤液体培养基中，摇床培养，然后将宿主菌培养液离心弃上清；将沉淀加入到100mL的DNB液体培养基中，再加入蛭弧菌的噬菌斑，摇床培养，然后将蛭弧菌培养液离心，取上清液，再将上清液离心，保留沉淀，加入DNB液体培养基重新悬浮蛭弧菌沉淀物，得到蛭弧菌游泳体。

2.根据权利要求1所述的一种淡水蛭弧菌微生物制剂的制备方法，其特征在于：步骤㈠中所述的宿主菌为嗜水气单胞菌；所述的摇床培养条件为200rpm、28℃培养

18h；所述的离心条件为4℃、6000rpm离心20min；

步骤㈡中所述的宿主菌摇床培养的条件为200rpm、28℃摇床培养18h；所述的宿主菌培养液的离心条件为4℃、5000rpm离心15min；

步骤㈡中所述的蛭弧菌摇床培养条件为250rpm、28℃培养36h；所述的蛭弧菌培养液离心条件为4℃、6000rpm离心20min；所述的上清液离心的条件为4℃、16000rpm离心20min。

3.一种淡水蛭弧菌微生物制剂，其特征在于采用权利要求1～2任一项所述方法制备得到。

说明书全文

一种淡水蛭弧菌微生物制剂及快速评价其货架期的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种微生物制剂，具体涉及一种淡水蛭弧菌微生物制剂及快速评价其货架期的方法。

背景技术

[0002] 蛭弧菌(Bdellovibrio-and-like organisms,BALOs)是一类寄生于其他细菌并依靠裂解宿主菌使自身得以生长繁殖的细菌，它具有寄生和裂解细菌的生理特性，尤其是对许多病原弧菌有良好的裂解作用。在控制细菌及在水产养殖中具有广阔的应用前景。蛭弧菌在水产养殖中用于控制病原菌，是近几年来的研究热点，蛭弧菌对大多数致病菌有较强的裂解能力，能改善水质，安全环保，有可能取代抗生素，成为控制病害的新手段。而蛭弧菌大多存在不易保存的问题而使蛭弧菌的应用得到限制。因此，使蛭弧菌的活性和稳定性得到保障，对扩大蛭弧菌的使用范围和推广具有十分重要的意义。

[0003] 蛭弧菌的生活史由两个阶段组成：自由生活、能运动，不进行增殖的游泳体阶段和在特定宿主细菌的周质空间内进行生长繁殖的蛭质体阶段。在游泳体阶段，蛭弧菌识别并与宿主发生不可逆的结合，然后侵入宿主。蛭弧菌侵入宿主菌后，在其周质空间中利用宿主细胞成分为营养进行丝状生长，通过复分裂进行增殖，最后裂解宿主细胞并释放成熟子代个体。

[0004] 蛭弧菌游泳体是指侵入宿主细菌前的生长形式。蛭弧菌游泳体侵入宿主细菌的过程非常快，一般在几秒钟内就能完成。蛭弧菌游泳体相对于蛭质体而言，存在着制备繁琐、不易保存的弱点，但用蛭弧菌游泳体做活性检测具有起效快的优点。

[0005] 温度是影响蛭弧菌及其制剂稳定性的重要因素之一。在保存时，蛭弧菌普遍存在稳定性差的问题。即蛭弧菌活性易受到外界环境的影响，经储存后活菌含量已远远降低，达不到原有的要求。因此保持并延长高浓度蛭弧菌及其制剂的活力，将蛭弧菌作为“活性抗生素”应用于水产养殖业、食品行业及扩大其应用范围具有十分重大的意义。

发明内容

[0006] 本发明的首要目的在于克服现有蛭弧菌活力保持不够长而导致蛭弧菌的广泛应用受限的缺点与不足，提供一种淡水蛭弧菌微生物制剂。

[0007] 本发明的再一目的在于提供上述淡水蛭弧菌微生物制剂的制备方法。

[0008] 本发明的另一目的在于提供一种快速评价上述淡水蛭弧菌微生物制剂货架期的方法。

[0009] 本发明的目的通过以下技术方案实现：

[0010] 一种淡水蛭弧菌微生物制剂的制备方法，包含如下步骤：

[0011] （1）制备蛭弧菌游泳体；

[0012] （2）在步骤（1）得到的蛭弧菌游泳体加入保护剂，得到货架期延长的淡水蛭弧菌微生物制剂。

[0013] 所述蛭弧菌优选为淡水蛭弧菌（Bdellovibrio sp.）BDS01；

[0014] 所述的蛭弧菌游泳体的终浓度为1010PFU(plaque forming unit)/mL；

[0015] 所述的淡水蛭弧菌（Bdellovibrio sp.）BDS01（该菌株已在中国专利申请号为“200910042274.6”、名称为“一种防治乳腺炎的蛭弧菌菌株及其应用”中公开）于2009年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M209169；对所述的蛭弧菌进行负染后于电子显微镜下观察形态可知：BDS01呈单细胞，弧形，大小为0.9×0.25μm，端生鞭毛，鞭毛长度为4μm；所述蛭弧菌BDS01用双层平板培养的方法于28℃培养四天可形成直径1～2mm的透明圆形噬菌斑；

[0016] 所述保护剂为谷氨酸钠、蔗糖、内消旋肌醇、棉子糖、葡萄糖和甘油中的一种或至少两种；

[0017] 优选的，所述保护剂为终浓度1%～10%W/V（质量/体积）的谷氨酸钠、终浓度1%～10%W/V的蔗糖、终浓度1%～10%W/V的内消旋肌醇、终浓度1%～10%W/V的棉子糖、终浓度1%～
10%W/V的葡萄糖、终浓度5%～30%W/V的甘油、终浓度1%～10%W/V的蔗糖+终浓度1%～10%W/V的谷氨酸钠、终浓度1%～10%W/V的谷氨酸钠+终浓度1%～10%W/V的内消旋肌醇、终浓度1%～
10%W/V的谷氨酸钠+终浓度1%～10%W/V的棉子糖、终浓度1%～10%W/V的谷氨酸钠+终浓度1%～10%W/V的葡萄糖或终浓度1%～10%W/V的谷氨酸钠+终浓度5%～30%W/V的甘油；

[0018] 进一步优选的，所述保护剂为终浓度5%W/V的谷氨酸钠、终浓度5%W/V的蔗糖、终浓度5%W/V的内消旋肌醇、终浓度5%W/V的棉子糖、终浓度5%W/V的葡萄糖、终浓度15%W/V的甘油或终浓度5%W/V的谷氨酸钠+终浓度15%W/V的甘油；

[0019] 所述的蛭弧菌游泳体优选通过中国专利申请号为“200710031166.X”、名称为“高密度蛭弧菌游泳体的发酵培养技术”中公开的高密度蛭弧菌游泳体的发酵方法进行制备，具体步骤如下：

[0020] ㈠宿主菌悬浮液的制备

[0021] 将宿主菌接种于营养肉汤培养基中，摇床培养，然后将培养液离心弃上清，得到的沉淀用2～3mL营养肉汤液体培养基悬浮；得到宿主菌悬浮液，4℃保存备用；

[0022] ㈡蛭弧菌游泳体的制备

[0023] 将步骤㈠制备的宿主菌悬浮液接种到100mL的营养肉汤液体培养基中，摇床培养，然后将宿主菌培养液离心弃上清；将沉淀加入到100mL的DNB液体培养基中，再加入蛭弧菌的噬菌斑，摇床培养，然后将蛭弧菌培养液离心，取上清液，再将上清液离心，保留沉淀，加入DNB液体培养基重新悬浮蛭弧菌沉淀物，得到蛭弧菌游泳体；

[0024] 步骤㈠中所述的宿主菌为嗜水气单胞菌；所述的摇床培养条件优选为200rpm、28℃培养18h；所述的离心条件优选为4℃、6000rpm离心20min；

[0025] 步骤㈡中所述的宿主菌摇床培养的条件为200rpm、28℃摇床培养18h；所述的宿主菌培养液的离心条件为4℃、5000rpm离心15min；

[0026] 步骤㈡中所述的蛭弧菌摇床培养条件优选为250rpm、28℃培养36h；所述的蛭弧菌培养液离心条件优选为4℃、6000rpm离心20min；所述的上清液离心的条件为4℃、16000rpm离心20min；

[0027] 一种淡水蛭弧菌微生物制剂，通过上述制备方法得到；

[0028] 一种快速评价淡水蛭弧菌微生物制剂货架期的方法，包含如下步骤：

[0029] ①将上述淡水蛭弧菌微生物制剂进行经典恒温加速实验：检测淡水蛭弧菌微生物制剂的初始活菌数C0；将上述淡水蛭弧菌微生物制剂在不同检测温度下保存并于不同的时间间隔t取样检测，获得蛭弧菌微生物制剂的活菌数C；计算出蛭弧菌微生物制剂在各检测温度下保存不同时间后的相对活性Cr=C/C0；

[0030] ②运用阿伦尼乌斯方程计算出淡水蛭弧菌微生物制剂的货架期：以lgCr对时间间隔t进行回归分析，得出各检测温度下淡水蛭弧菌微生物制剂的失活速度常数k；将lgk对1/T×103进行回归分析，得到阿伦尼乌斯方程（Arrhenius方程）；最后，根据所得的阿伦尼乌斯方程（Arrhenius方程）计算出降低2个数量级浓度的淡水蛭弧菌微生物制剂的货架期；

[0031] ③通过货架期来确定保护剂的效果：当货架期越长，活力越大，保护剂效果越好；当货架期越小，活力越小，保护剂效果越差；

[0032] 步骤①中所述的检测温度为25℃、37℃、45℃、55℃和65℃；所述的检测温度对应的取样间隔时间分别为12h、8h、4h、40min和20min；

[0033] 步骤②中所述的T为步骤①中检测温度的绝对温度；

[0034] 经典恒温法的理论依据为阿伦尼乌斯方程（Arrhenius方程）的指数定律k=e-E/RT,其对数形式为：logk=-E/2.303RT+logA。其中k为反应速率常数，R为摩尔气体常数，A是一个与反应物分子相互碰撞有关的常数。

[0035] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

[0036] （1）本发明所述的保护剂简单易得，成本低。

[0037] （2）本发明的淡水蛭弧菌微生物制剂显著提高了蛭弧菌的成活率。所有受试的保护剂对受试的蛭弧菌都有延长活力的作用，与对照组相比，加入保护剂的处理组的活力都延长了。

[0038] （3）本发明所述的微生物制剂能保持活力，使得适用范围得以推广，使得本发明所述的微生物制剂有望取代抗生素而避免滥用抗生素所带来的副作用。高浓度蛭弧菌便于储存及运输，克服了现有的制剂活性不高的缺点。

[0039] （4）本发明公开了一种快速评价淡水蛭弧菌微生物制剂货架期的方法，该方法可有效快速评价淡水蛭弧菌的活力延长，操作简单、数据准确；无需进行传统的分析检测，可利用存在的数据预测微生物的活性。

具体实施方式

[0040] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0041] 实施例中所使用的培养基和菌株：

[0042] DNB(diluted nutrient broth)培养基为一种蛭弧菌的培养基，组成成分为：营养肉汤0.8g，酪氨酸酸水解物0.5g，酵母提取物0.1g，蒸馏水1000mL，pH7.2～7.6，分装后再121℃0.1MPa条件下处理20min后保存备用。

[0043] 嗜水气单胞菌购于广东省微生物所菌种保藏中心，编号GIM1.172。

[0044] 使用的蛭弧菌菌株为BDS01，于2009年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M209169；将所述蛭弧菌BDS01进行负染后于电子显微镜下观察形态可知：BDS01呈单细胞，弧形，大小为0.9×0.25μm,端生鞭毛，鞭毛长度为4μm；所述蛭弧菌BDS01用双层平板培养的方法于28℃培养4d可形成直径1～2mm的透明圆形噬菌斑。

[0045] 实施例1

[0046] 一、淡水蛭弧菌微生物制剂的制备

[0047] （1）宿主菌悬浮液的制备

[0048] 嗜水气单胞菌购于广东省微生物所菌种保藏中心，编号GIM1.172。从保存的划有嗜水气单胞菌的营养琼脂培养基平板上挑取一环菌体，接种于无菌的营养肉汤培养基（营养肉汤18g，蒸馏水1000mL，pH7.2）中，200rpm、28℃摇床培养18h，然后将培养液于4℃、6000rpm离心20min，弃上清，沉淀用2～3mL营养肉汤液体培养基悬浮；得到嗜水气单胞菌悬浮液，4℃冰箱保存备用。

[0049] （2）蛭弧菌BDS01游泳体的制备

[0050] 蛭弧菌游泳体通过中国专利申请号“200710031166.X”的国家发明专利申请公开的高密度蛭弧菌游泳体的发酵方法进行发酵：在1个装有100mL营养肉汤（NB）液体培养基（营养肉汤18g，蒸馏水1000mL，pH7.2）的锥形瓶中接种由步骤（1）制备的嗜水气单胞菌悬浮液，200rpm、28℃摇床培养18h，然后将嗜水气单胞菌培养液于4℃、5000rpm离心15min，弃上清；将沉淀加入到装有100mL DNB液体培养基（营养肉汤0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母提取物0.1g，溶于1000mL蒸馏水，pH7.2～7.6，121℃0.1MPa条件下处理20min。）的锥形瓶中，再加入从平板上挑取的蛭弧菌BDS01的噬菌斑。在恒温摇床上250rpm、28℃培养36h，培养液于4℃6000rpm离心20min，取上清液，再将上清液于4℃16000rpm离心20min，保留沉淀，加入灭菌的DNB液体培养基（营养肉汤0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母提取物0.1g，溶于1000mL蒸馏水，pH7.2～7.6）重新悬浮蛭弧菌沉淀物，得到蛭弧菌BDS01游泳体；

[0051] （3）蛭弧菌BDS01微生物制剂的制备

[0052] 将制备得到的蛭弧菌游泳体与不同种类或浓度的保护剂混合，得到货架期延长的淡水蛭弧菌BDS01微生物制剂，其中，蛭弧菌游泳体的终浓度为1010PFU/mL；表1为蛭弧菌微生物制剂中添加保护剂的种类及其终浓度。

[0053] 表1淡水蛭弧菌BDS01微生物制剂中添加保护剂的种类以及终浓度（W/V）[0054]

[0055] 二、快速评价淡水蛭弧菌微生物制剂货架期的方法，包含如下步骤：

[0056] ①将步骤一得到的淡水蛭弧菌BDS01微生物制剂进行经典恒温加速实验，在不同的温度下保存并于不同的时间间隔取样检测其存活率：将加入不同浓度不同保护剂的淡水蛭弧菌BDS01微生物制剂分别于25℃、37℃、45℃、55℃、65℃下隔12h、8h、4h、40min、20min的时间间隔取样，测其活菌数C，初始淡水蛭弧菌BDS01微生物制剂的活菌数为C0，求出淡水蛭弧菌BDS01微生物制剂在各温度下保存不同时间后的相对活性Cr=C/C0；

[0057] ②运用阿伦尼乌斯方程计算出上述淡水蛭弧菌BDS01微生物制剂的货架期：以lgCr对时间t进行回归分析，得出各检测温度下淡水蛭弧菌BDS01微生物制剂的失活速度常数k，将lgk对1/T×103(T为检测温度的绝对温度)进行回归分析，得到Arrhenius方程。然后用此方程计算预测淡水蛭弧菌BDS01微生物制剂降低2个数量级浓度后的货架期（单位：天）。其中，添加保护剂的淡水蛭弧菌BDS01微生物制剂为处理组，不加保护剂的淡水蛭弧菌BDS01微生物制剂为对照组。不同的温度下取样检测间隔时间按照表2进行。

[0058] 表2不同的温度下取样检测间隔时间及取样次数

[0059]

[0060] 试验结果如下：

[0061] （1）表3、表4和表5分别为对照组（第1组）和各处理组（第2～7组：含低浓度保护剂）的失活速率常数、Arrhenius方程以及根据Arrhenius方程计算预测淡水蛭弧菌BDS01微生物制剂降低2个数量级浓度后的货架期，以货架期表示活力，其中，对照组不添加保护剂；第2～7组添加保护剂的种类和浓度分别为：终浓度1%W/V的内消旋肌醇、终浓度1%W/V的棉子糖、终浓度5%W/V的甘油、终浓度1%W/V的蔗糖、终浓度1%W/V的谷氨酸钠和终浓度1%W/V的葡萄糖。

[0062] 表3对照组和各处理组（含低浓度保护剂）的失活速率常数

[0063]

[0064] 表4对照组和各处理组（含低浓度保护剂）的Arrhenius方程

[0065]

[0066]

[0067] 表5对照组和各处理组（含低浓度保护剂）降低2个数量级浓度后的货架期（单位：天）

[0068]

[0069] 表6、表7和表8分别为对照组（第1组）和各处理组（第2～7组：含高浓度保护剂）的失活速率常数、Arrhenius方程以及根据Arrhenius方程计算预测淡水蛭弧菌BDS01微生物制剂降低2个数量级浓度后的货架期，以货架期表示活力，其中，对照组不添加保护剂；第2～7组添加保护剂的种类和浓度分别为：终浓度10%W/V的蔗糖、终浓度10%W/V的谷氨酸钠、终浓度10%W/V的内消旋肌醇、终浓度10%W/V的棉子糖、终浓度30%W/V的甘油和终浓度10%W/V的葡萄糖。

[0070] 表6对照组和各处理组（含高浓度保护剂）的失活速率常数

[0071]

[0072] 表7高浓度下对照组和各处理组（含高浓度保护剂）的Arrhenius方程[0073]

[0074]

[0075] 表8对照组和各处理组（含高浓度保护剂）降低2个数量级浓度后的货架期（单位：天）

[0076]

[0077] （3）表9、表10和表11为对照组（第1组）和各处理组（第2～7组：含中间浓度保护剂）的失活速率常数、Arrhenius方程以及根据Arrhenius方程计算预测淡水蛭弧菌BDS01微生物制剂降低2个数量级浓度后的货架期，以货架期表示活力，其中，对照组不添加保护剂；第2～7组添加保护剂的种类和浓度分别为：终浓度15%W/V的甘油、终浓度5%W/V的棉子糖、终浓度5%W/V的内消旋肌醇、终浓度5%W/V的蔗糖、终浓度5%W/V的谷氨酸钠和终浓度5%W/V的葡萄糖。通过表5、表8和表11可看出，货架期较好的两个组为含中间浓度保护剂的第2组和第5组，货架期分别为77.89天和75.57天。

[0078] 表9对照组和各个处理组（含中间浓度保护剂）的失活速率常数

[0079]

[0080] 表10对照组和各处理组（含中间浓度保护剂）的Arrhenius方程

[0081]

[0082]

[0083] 表11对照组和各处理组（含中间浓度保护剂）降低2个数量级浓度后的货架期（单位：天）

[0084]

[0085] （3）表12为以上6组保护剂的最佳保护效果浓度：

[0086] 表12实施例1不同保护剂的最佳保藏效果终浓度（W/V）

[0087]

[0088] 由实施例1的结果得出低浓度的保护剂效果不明显/不佳，随着保护剂的浓度升高，保护效果提升，不同保护剂保护效果最佳的浓度如表12所示；但超过一定的范围后高浓度的保护剂保护效果不再提升，故保护剂的浓度范围在中间的活力保持效果最佳。

[0089] 实施例2

[0090] 一、淡水蛭弧菌微生物制剂的制备

[0091] （1）宿主菌悬浮液的制备

[0092] 嗜水气单胞菌购于广东省微生物所菌种保藏中心，编号GIM1.172。从保存的划有嗜水气单胞菌的营养琼脂培养基平板上挑取一环菌体，接种于无菌的营养肉汤培养基（营养肉汤18g，蒸馏水1000mL，pH7.2）中，200rpm、28℃摇床培养18h，然后将培养液于4℃、6000rpm离心20min，弃上清，沉淀用2～3mL营养肉汤液体培养基悬浮；得到嗜水气单胞菌悬浮液，4℃冰箱保存备用。

[0093] （2）蛭弧菌BDS01游泳体的制备

[0094] 蛭弧菌游泳体通过中国专利申请号“200710031166.X”的国家发明专利申请公开的高密度蛭弧菌游泳体的发酵方法进行发酵：在1个装有100mL营养肉汤（NB）液体培养基（营养肉汤18g，蒸馏水1000mL，pH7.2）的锥形瓶中接种由步骤（1）制备的嗜水气单胞菌悬浮液，200rpm、28℃摇床培养18h，然后将嗜水气单胞菌培养液于4℃、5000rpm离心15min，弃上清；将沉淀加入到装有100mL DNB（dilute nutrient broth）液体培养基（营养肉汤0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母提取物0.1g，溶于1000mL蒸馏水，pH7.2～7.6，121℃0.1MPa条件下处理20min。）的锥形瓶中，再加入从平板上挑取的蛭弧菌BDS01的噬菌斑。在恒温摇床上250rpm、28℃培养36h，培养液于4℃6000rpm离心20min，取上清液，再将上清液于4℃
16000rpm离心20min，保留沉淀，加入灭菌的DNB液体培养基（营养肉汤0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母提取物0.1g，溶于1000mL蒸馏水，pH7.2～7.6）重新悬浮蛭弧菌沉淀物，得到蛭弧菌BDS01游泳体；

[0095] （3）蛭弧菌BDS01微生物制剂的制备

[0096] 将制备得到的蛭弧菌游泳体与不同种类或浓度的保护剂混合，得到货架期延长的淡水蛭弧菌BDS01微生物制剂，其中，蛭弧菌游泳体的终浓度为1010PFU/mL；添加保护剂的种类以及终浓度分别为终浓度5%W/V的谷氨酸钠+终浓度5%W/V的葡萄糖、终浓度5%W/V的谷氨酸钠+终浓度5%W/V的蔗糖、终浓度5%W/V的谷氨酸钠+终浓度5%W/V的棉子糖、终浓度5%W/V的谷氨酸钠+终浓度5%W/V的内消旋肌醇、终浓度5%W/V的谷氨酸钠+终浓度15%W/V的甘油。

[0097] 二、快速评价淡水蛭弧菌微生物制剂货架期的方法

[0098] 将步骤一得到的5种淡水蛭弧菌BDS01微生物制剂作为处理组进行经典恒温加速实验，在不同的温度下保存并于不同的时间间隔取样检测其存活率：试验步骤与实施例1相同。其中，将实施例1得到的保护效果较好的一组蛭弧菌微生物制剂（含终浓度15%W/V的甘油）做为对照组（第1组）。表13为对照组和各处理组淡水蛭弧菌微生物制剂中所含的保护剂种类及其浓度。

[0099] 表13实施例2对照组和各处理组保护剂种类以及终浓度

[0100]

[0101] 其中，表14为对照组和各处理组（第2～6组）蛭弧菌的失活速度常数，表15、16为对照组和各处理组（第2～6组）蛭弧菌的Arrhenius方程以及根据Arrhenius方程计算预测淡水蛭弧菌BDS01微生物制剂降低2个数量级浓度后的货架期（单位：天）；

[0102] 表14实施例2对照组和各处理组的失活速度常数

[0103]

[0104] 表15实施例2对照组和各处理组的Arrhenius方程

[0105]

[0106] 表16实施例2对照组和各个处理组降低2个数量级浓度后的货架期（单位：天）[0107]

[0108] 计算得到预测的货架期结果如表16所示，其中第6组计算得到的预测货架期比其他组预测货架期长，比最少的第1组长32.30天，即活力最大的试验组比最小的试验组货架期长一个月。

[0109] 比较添加保护剂的淡水蛭弧菌BDS01微生物制剂的预测货架期，加甘油保护剂的试验组的活力要优于加其他保护剂的实验组。而处理组的活力均优于对照组。由此可见，加入保护剂可延长蛭弧菌的活力，以实现蛭弧菌的广泛应用。

[0110] 实施例3

[0111] 恒温储存验证试验

[0112] 将实施例2中计算得到的较好的组（第6组）放置于25℃和4℃的培养箱中进行验证试验。每个温度下的菌液做3个平行后取平均值，25℃的每隔12h检测一次活菌的浓度，4℃的每10天检测一次。

[0113] 1、25℃下的验证性试验结果

[0114] 经过120h的放置后，25℃的BDS01的数量级仍然在低于开始时的2个数量级范围内。

[0115] 2、4℃下的验证性试验结果

[0116] 第11次检测后，在低于初始浓度的2个数量级范围内仍然能检测到有活性的BDS01菌液。

[0117] 恒温储存验证试验结果表明，在实施例2预测的货架期内仍能检测到活菌数，即本验证性试验结果说明了实施例2中的保护剂以及评价保持活力长短的方法可行。

[0118] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，

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一种淡水蛭弧菌微生物制剂及快速评价其货架期的方法

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