大肠杆菌(Escherichia coli)是多样性极高的有机体。除了是正常的肠道菌群之外，E.coli的菌株还可引起膀胱感染，脑膜炎和腹泻。肠出血性(Enterohemorrhagic)E.coli包括至少5种E.coli，其能引起从类似霍乱的腹泻到极端大肠炎的多种症状。每种肠出血性E.coli都具有一套包括粘合素，侵袭素和/或毒素的特异性毒力因子，其负责引起特异性的腹泻。
致肠病性(Enteropathogenic)E.coli(EPEC)是世界范围内婴儿腹泻的最主要原因。EPEC疾病的特征是严重程度不同的水样腹泻，以及呕吐和通常伴随脱水的发烧。除了在发达国家的日间看护和托儿所中孤立的爆发之外，EPEC在发展中国家对婴幼儿(＜6个月)也是一种主要的地方病健康威胁。在世界范围内，EPEC是婴幼儿中最主要的细菌介导性腹泻的原因，据估计EPEC每天可使数十万儿童致死。
肠出血性E.coli(EHEC)，也称为产志贺氏毒素的E.coli(STEC)或产细胞毒素的E.coli(VTEC)，能引起比EPEC(肠性大肠炎)更严重的腹泻，且约占10％的病例，该疾病还可演变成常见的致死性肾脏疾病，溶血性尿毒症综合征(HUS)。EHEC O157：H7是加拿大和美国最常见的血清型，并且与食物和水中毒有关(3)。其他血清型的EHEC也在亚洲、欧洲和南美洲引起了一些更为严重的问题，而北美洲的严重情况略差。EHEC寄居于牛并引起A/E损伤，但在成年动物中并不引起疾病，相反却将有机体扩散至环境中。由于相对稀少的EHEC就足以感染人类，所以这会引起严重的健康问题。
与诸如肠毒素性(enterotoxigenic)E.coli的其他E.coli腹泻不同，由EHEC和EPEC引起的腹泻并不是由毒素介导的。相反，EPEC和EHEC结合于肠表面(EPEC结合于小肠，EHEC结合于大肠)并引起了特征性的组织损伤，成为附着和消失(A/E)损伤(8)。A/E损伤的特点在于在细菌附着位置上肠刷状缘表面的溶解和上皮微绒毛的丧失(消失)。一旦发生结合，细菌就位于类似杯状的突出物或基架上。在上皮细胞中支撑这一基架的是几种细胞骨架成分，包括肌动蛋白和与肌动蛋白相连的细胞骨架蛋白。A/E损伤的形成和在附着细菌下方的富含肌动蛋白的基架是A/E病原体的组织病理学标志(1，2)。该病理学可在体外培养的细胞中重现，且基架形成也可通过荧光肌动蛋白染色分析得以观察(2，11)。A/E损伤的形成可能是破坏所述刷状缘和微绒毛，流体分泌以及腹泻的原因。
EPEC和EHEC属于A/E病原体家族，其包括若干种在兔子(REPEC)，猪(PEPEC)和小鼠(Citrobacter rodentium(肠粘膜肥厚症菌))中引起疾病的EPEC样动物病原体。这些病原体包括致病岛(PAI)，其编码特异性的分泌系统并分泌对疾病至关重要的毒力因子。一般认为形成A/E损伤的基因在单染色体致病岛中是成簇分布的，称为肠上皮细胞消失座位(LEE)，其包括III型分泌系统(TTSS)，分泌的效应蛋白及其同源的伴侣蛋白(4-8)。
所述LEE包括41个基因，使其成为更复杂的PAI。所述LEE TTSS的主要功能是将效应物传递入宿主细胞中，在那里其破坏宿主细胞功能并介导疾病(9，10，34)。现已鉴定了5种LEE编码的效应物(Tir，EspG，EspF，Map和EspH)(35-40)。(针对易位紧密粘附素(intimin)受体的)Tir被易位入宿主细胞中，在那里其与宿主细胞骨架蛋白和信号蛋白结合，并在细菌附着位点启动了肌动蛋白聚合(31，44)，导致了在附着细菌下方形成了肌动蛋白基架结构，其通过细菌外膜蛋白紧密粘附素与Tir的细胞外环直接作用。CesT作为Tir稳定和分泌的伴侣蛋白发挥作用(18，19)。
还对A/E病原体中的四种其他LEE编码的TTSS易位效应物进行了表征：EspH增强了肌动蛋白基架的延伸(40)；EspF在分解肠上皮细胞的紧密联合中具有作用(38)；EspG与志贺杆菌微管结合效应物VirA相关(36，55)；Map位于线粒体(37)，还具有肌动蛋白动力学的作用(48)。(针对LEE编码的调节子的)Ler是目前已鉴定的仅有的LEE编码的调节子。
发明概述
本发明部分根据的是对A/E病原体的几种新普通分泌蛋白的鉴定。
在一方面，本发明提供了包括多肽或其片段或变异体，或包括这种多肽的细胞培养上清液的组合物，其中基本上纯的所述多肽包括与SEQID NO：22-43、59或73-84，或其片段或变异体的任意一种或多种序列基本上相同的氨基酸序列。本发明还提供了包括核酸分子的组合物，其中所述核酸分子包括与SEQ ID NO：1-21或60-72的任意一种或多种序列基本上相同的核酸序列；以及包括核酸分子的组合物，其中所述核酸分子编码与SEQ ID NO：22-43，或其片段的任意一种或多种序列基本上相同的多肽序列。所述组合物还包括生理可接受的载体，或还包括佐剂。所述组合物还包括多肽或核酸分子，例如EspA，EspB，EspD，EspP，Tir，志贺氏毒素1，志贺氏毒素2或紧密粘附素。所述多肽或核酸分子可能是基本上纯的。
在其他方面，本发明还提供了细菌或其制备方法，其中所述细菌在诸如nleA，nleB，nleC，nleD，nleE，nleF，nleG或nleH或其同源物的基因上有突变，或在其基因组上在与SEQ ID NO：1-21或60-72基本上相同的核酸序列上有突变。在一些实施方案中，所述细菌可以是A/E病原体，例如肠出血性E.coli(EHEC；例如EHEC O157：H7或EHECO 157：NM)，致肠病性E.coli(EPEC；例如EPEC O 127：H6)或Citrobacterrodentium(肠粘膜肥厚症菌)。在某些实施方案中，所述突变可以减弱毒力，或者所述突变可发生在所述A/E病原体的基因组核酸序列中，所述核酸序列与选自SEQ ID NO：1-21或60-72的序列基本上相同。所述细菌可与佐剂一起作为组合物提供。在某些实施方案中，所述细菌可以是活的。在某些实施方案中，所述细菌可以是死的。给药方式可以是口服或经肠道外给药。
在其他方面，本发明还提供了在样本中测定A/E病原体存在的方法，所述方法是通过，提供样本；以及测定以下物质的存在：包括与选自SEQID NO：1-21或60-72或其片段或变异体中的任意一种或多种序列基本上相同的核酸序列的核酸序列；编码与选自SEQ ID NO：22-43、59或73-84，或其片段或变异体的序列基本上相同的多肽序列的核酸序列，或者包括与选自SEQ ID NO：22-43、59或73-84，或其片段或变异体的序列基本上相同的氨基酸序列的多肽，其中所述核酸分子或多肽的存在说明在所述样本中(例如蛋、粪便、血液或肠)存在有A/E病原体。所述测定包括用与选自SEQ ID NO：1-21或60-72的序列基本上相同的探针或引物，或编码与SEQ ID NO：22-43、59或73-84，或其部分基本上相同的多肽的核酸序列接触所述核酸序列，或者所述方法包括用抗体接触所述氨基酸序列，所述抗体特异性地结合于选自SEQ ID NO：22-43、59或73-84，或其片段或变异体的序列。
在其他方面，本发明还通过鉴定动物感染了A/E病原体或具有A/E病原体感染的风险；以及向所述动物给药有效量的组合物，提供了在动物(例如，人，反刍动物，例如绵羊(羊属)，山羊，牛(牛属)，等等；获任一其他动物，例如，猪，兔，家禽(例如，鸭，鸡，火鸡)等等)体内引起针对A/E病原体或其成分的免疫反应的方法，或降低A/E病原体集群或扩散的方法，所述组合物包括与SEQ ID NO：22-43、59或73-84中任意一种或多种序列基本上相同的氨基酸序列的多肽；编码与选自SEQ ID NO：22-43、59或73-84的序列基本上相同的多肽序列的核酸序列；包括与SEQ ID NO：1-21或60-72的任意一种或多种序列基本上相同的核酸序列的核酸分子；或包括这些多肽的细胞培养上清液，由此在所述动物体内引起免疫反应，或降低所述A/E病原体在所述动物中的集群或扩散。
在其他方面，本发明还提供了减弱A/E病原体毒力的方法，所述方法包括在所述A/E病原体中突变诸如nleA，nleB，nleC，nleD，nleE，nleF，nleG或nleH或其同源物中的基因，或在所述A/E病原体基因组中突变一种或多种核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自SEQ IDNO：1-21或60-72，由此减弱毒力。
在其他方面，本发明还提供了筛选减弱A/E病原体毒力的化合物的方法，所述方法包括提供一个系统(例如，细胞，如EHEC、EPEC或C.rodentium细胞，动物模型，或体外系统)，该系统包括：包括与SEQ ID NO：22-43、59或73-84、或其片段或变异体基本上相同的一种或多种氨基酸序列的多肽；编码与选自SEQ ID NO：22-43、59或73-84，或其片段或变异体基本上相同的一种或多种序列的核酸序列；或包括与SEQ ID NO：1-21或60-72或其片段或变异体基本上相同的任意一种或多种序列的核酸分子；提供测试化合物；及测定所述测试化合物是否调节所述多肽或核酸分子的表达、分泌或生物活性，其中所述多肽或核酸分子的改变，例如表达、分泌或生物活性的降低说明该化合物减弱了A/E病原体的毒力。
在其他方面，本发明还提供了产生A/E病原体毒力因子的方法，该方法包括提供重组细胞，所述重组细胞包含包括与SEQ IDNO：22-43、59或73-84或其片段或变异体的任一氨基酸序列基本上相同的多肽；编码与选自SEQ ID NO：22-43、59或73-84或其片段或变异体的任一氨基酸序列基本上相同的多肽序列的核酸序列；或包括与SEQ IDNO：1-21或60-72或其片段或变异体中任一序列基本上相同的核酸序列的核酸分子；在允许所述多肽表达和/或分泌的条件下培养所述重组细胞，且任选地，分离所述多肽。在一些实施方案中，所述多肽可从所述细胞中分泌出来。
在其他方面，本发明还通过鉴定动物感染了A/E病原体或具有感染A/E病原体的风险；及向所述动物给药有效量的减弱A/E病原体毒力的化合物，其中所述化合物抑制包括与SEQ ID NO：22-43、59或73-84或其片段或变异体中任一序列基本上相同的氨基酸序列的多肽的表达和分泌，提供了治疗或预防由A/E病原体引起的感染的方法。在一些实施方案中，所述化合物可以是与SEQ ID NO：1-21或60-72或其片段或变异体中任一序列基本上相同的核苷酸序列互补的反义核酸分子，或者是siRNA。
在其他方面，本发明还提供了包括与SEQ ID NO：22-43、59或73-84的序列基本上相同的氨基酸序列的重组多肽，或包括与SEQ ID NO：1-21或60-72的序列基本上相同的核酸序列的分离的核酸分子；和/或包括这些核酸序列的载体；和或包括这些载体的宿主细胞(例如，A/E病原体，例如肠出血性E.coli(EHEC)，致肠病性E.coli(EPEC)或Citrobacterrodentium。所述载体可以能够整合入A/E病原体的基因组也可以不能整合入A/E病原体的基因组。
在其他方面，本发明还提供了基于本发明的所述组合物、细菌、多肽或核酸分子在制备引起针对A/E病原体或其成分产生免疫反应、或降低在动物中A/E病原体的扩散或集群的药物中的用途。
在其他方面，本发明还提供了包括在样本中测定A/E病原体的试剂以及教导在样本中测定A/E病原体的包装说明书的试剂盒。所述试剂包括与选自SEQ ID NO：1-21或60-72或其片段或变异体的任意一种或多种基本上相同的核酸序列，或编码与SEQ ID NO：22-43、59或73-84，或其片段或变异体的任意一种或多种基本上相同的多肽的核酸序列基本上相同的探针或引物探针或引物，或特异性地结合于选自SEQ IDNO：22-43、59或73-84，或其片段或变异体的任意一种或多种序列的抗体。
“A/E病原体”是一种病原体，例如致病性的E.coli细菌，其可以结合于动物的肠表面，例如牛、绵羊、山羊、猪、兔、狗、猫等等的动物，或例如鸡、鸭、火鸡等等的禽类，并引起特征性的组织损伤，称作附着和消失(A/E)损伤(8)。一般地，A/E致病性感染可导致腹泻，肠性大肠炎，肾脏疾病(例如溶血性尿毒症综合征)。然而，A/E病原体感染并不一定会表现出疾病的症状；感染了A/E病原体的宿主动物可以是该病原体的携带者，并保持健康且未罹患疾病。因此，感染了A/E病原体或具有感染A/E病原体风险的哺乳动物，包括农业动物，例如家禽，如鸡，火鸡，鸭，或反刍动物，如牛，绵羊，山羊等等，或其他农业动物，如猪的动物，以及人类都并未表现出疾病的症状，作为感染了A/E病原体的结果，他们易患有严重的肠疾病。
示例性的A/E病原体包括且不限于肠出血性E.coli(EHEC)(也称为产志贺氏毒素的E.coli(STEC)或产细胞毒素的E.coli(VTEC))，例如EHEC血清型O157(例如，EHEC O157：H7，其基因组序列在登录号为AE005594、AE005595、AP002566、AE005174、NC 002695或NC_002655)，或0158，05，08，018，026，045，048，052，055，075，076，078，084，91，0103，0104，0111，0113，0114，0116，0118，0119，0121，0125，028，0145，0146，0163，0165；致肠病性E.coli(EPEC)；以及感染小鼠(例如，Citrobacter rodentium)；兔(例如，RDEC-1株，例如O15：H-)；猪；绵羊；狗和其他动物的致病性E.coli。许多A/E病原体菌株是可商业获得的，例如，通过美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，Manassus，VA，美国。还可以从被感染的个体中分离A/E病原体，例如，通过在补充有头孢克肟和亚碲酸盐或免疫磁性富集物的山梨醇MacConkey琼脂上直接涂布，然后在相同的培养基上进行涂布(72，107，108)得以分离。
“蛋白”，“肽”或“多肽”是二种或更多种氨基酸的任意链，包括自然发生或非自然发生的氨基酸或氨基酸类似物，无论翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)的情况。本发明的“氨基酸序列”，“多肽”，“肽”或“蛋白”可包括具有异常连接、交联和末端帽子，非肽键或其他修饰基团的多肽或蛋白。这些修饰基团也在本发明范围之内。术语“修饰基团”是指包括直接附着于所述肽结构(例如，通过共价轭合)的结构，以及那些间接附着于所述肽结构(例如，通过稳定的非共价连接或通过共价偶联于其他的氨基酸残基或其模拟物、类似物或衍生物，其可以位于所述核心肽结构的侧翼)的结构。例如，所述修饰基团可以偶联于肽结构的氨基末端或羧基末端，或偶联于所述核心结构域侧翼的肽或肽模拟结构。或者，所述修饰基团可以轭合于肽结构的至少一个氨基酸残基的侧链，或偶联于所述核心结构域侧翼的肽或肽模拟区域(例如，通过赖氨酰残基的ε氨基，通过天冬氨酸残基或谷氨酸残基的羧基，通过酪氨酰残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基的羟基，或在氨基酸侧链上的其他适合的反应基团)。共价偶联于所述肽结构的修饰基团可通过本领域中公知的方式和方法结合于连接性化学结构，包括，例如酰胺，烷氨基，氨基甲酸盐或尿素键。
术语“核酸”或“核酸分子”包括了RNA(正链和负链)和DNA，包括cDNA，基因组DNA和合成的(例如化和合成的)DNA。所述核酸可以是双链的或单链的。当以单链存在时，所述核酸可以是有义链或反义链。核酸分子可以是两种或更多种共价结合核苷酸的任意链，包括自然产生或非自然产生的核苷酸，或核苷酸类似物或衍生物。“RNA”是指两种或更多种共价结合、自然发生或被修饰的核糖核苷酸的序列。该术语中修饰RNA的一个例子是磷硫酰RNA。“DNA”是指两种或更多种共价结合、自然发生或被修饰的脱氧核苷酸的序列。“cDNA”是指通过依赖于RNA的DNA聚合酶(反转录酶)的反应从RNA模板产生的互补或拷贝DNA。因此，“cDNA克隆”是指在克隆载体中携带的，互补于感兴趣的RNA分子的双链DNA序列。“互补”是指两种核酸，例如DNA或RNA，含有能够形成沃森-克里克碱基对的足够数量的核酸，从而在所述两种核酸之间形成双链区域。因此，在一条DNA或RNA链中的腺嘌呤与相互补DNA链中的胸腺嘧啶或相互补RNA链中的尿嘧啶配对。应该理解，核酸分子中的每一个核苷酸并不必须与相互补链的核苷酸形成匹配的沃森-克里克碱基对才能形成双链。如果一个核酸分子可与另一个核酸分子在较严谨的条件下杂交，那么该核酸分子是与另一个核酸分子“互补”的。
在此使用的“细胞培养上清液”一般是指从培养的细菌或其他有机体(例如，酵母)或细胞(例如，昆虫细胞)中得到的上清液，所述培养物能够向所述细胞培养基中分泌出含有与SEQ ID NO：22-43、59或73-84或其片段或变异体中任一序列基本上相同的氨基酸序列的一种或多种多肽。在一些实施方案中，所述细胞培养上清液是基本上纯的，即，基本上没有细菌细胞或这些细胞的裂解物。在一些实施方案中，所述细胞培养上清液可以含有EspA，EspB，EspD，Tir，紧密粘附素(intimin)，志贺氏毒素1或2，EspP多肽或其片段或集合物。
所述细菌可以是A/E病原体，例如，EHEC，EPEC或Citrobacterrodentium，其在一些实施方案中可以被修饰或突变成主要表达或分泌此述的蛋白，所述细菌也可以是其他的细菌，例如，非致病细菌，例如诸如HB101的非致病E.coli，或者非A/E病原体，可通过例如重组或其他技术对其进行修饰或突变，从而将此述的一种或多种蛋白，例如，含有与SEQ ID NO：22-43、59或73-84或其片段或变异体中、或其免疫原性的部分的任一序列基本上相同的氨基酸的多肽分泌到所述细胞培养基中。在一些实施方案中，所述细菌不是EHEC和EPEC。在一些所述细菌是A/E病原体的实施方案中，其可以含有进一步的修饰，所述修饰会削弱其表达或分泌多肽(例如，EspA，EspB，EspD，Tir，紧密粘附素，志贺氏毒素1或2，或EspP)的能力，所述多肽是在没有所述修饰时的正常分泌的。在一些实施方案中，可对其他的有机体(例如，酵母)或细胞(例如，昆虫细胞)进行修饰或突变，例如，通过重组或其他技术，从而向所述细胞培养基中分泌一种或多种此述的蛋白，例如，含有与SEQID NO：22-43，或其免疫原性部分的任一序列基本上相同的氨基酸序列的多肽。
当某种化合物从其天然伴随成分中分离出来的时候，该化合物是“基本上纯的”或“分离的”。通常地，当其至少为样本中所述总材料的10％、20％、30％、40％、50％或60％，或更通常地至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％重量比时，该化合物是基本上纯的。因此，例如，通过化学合成或重组技术生产的多肽通常基本上不含有其天然结合的成分。如果通过物理技术，例如离心，沉淀，柱层析，凝胶电泳，HPLC等等将某种多肽与其天然结合的成分分离，则该多肽一般是基本上纯的。
当某种核酸分子没有与所述编码序列紧邻(即共价连接)时，该核酸分子通常是基本上纯的或“分离的”，而所述编码序列通常在所述有机体的自然发生基因组中是相邻的，从所述有机体中得到了本发明的DNA。因此，“分离的”基因或核酸分子是指并不位于通常在所述基因或核酸分子(例如在基因组序列中)侧翼，但和/或已完全或部分地从其他转录序列(作为cDNA或RNA文库)中纯化出来的基因或核酸分子。例如，本发明的分离的核酸可以是根据自然发生的复杂细胞环境中基本上分离出来的。在某些情况下，所述分离的材料可以形成部分的组合物(例如，含有其他物质的粗提取物)，缓冲体系或试剂混合物。在其他情况中，所述材料可以被纯化成完全均一的状态，正如通过PAGE或诸如HPLC的柱层析测定的那样。该术语因此包括，例如，整合入载体的重组核酸，例如自我复制的质粒或病毒；或进入原核生物或真核生物的基因组DNA的核酸，或以独立于其他序列的分离的分子存在的核酸(例如，通过PCR或限制性内切酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)。其还包括了编码其他多肽序列的部分杂交基因的重组核酸。优选地，分离的核酸包括所有存在的大分子类型中的至少50％、80％或90％(摩尔比)。因此，分离的基因或核酸分子可以包括通过化学合成或重组方式得到的基因或核酸分子。包含于载体中的重组DNA也包括在此述的“分离”定义之内。同样，分离的核酸分子还包括了异源宿主细胞中的重组DNA分子，以及溶液中部分或完全纯化的DNA分子。本发明DNA分子的体内和体外RNA转录本也包括在“分离的”核酸分子之内。这样的分离的核酸分子在制备所编码的多肽中非常有用，可作为分离同源序列的探针(例如，从其他哺乳动物种类中)，作为基因定位的探针(例如，通过与染色体的原位杂交)，或作为测定所述基因在系统中表达的探针(例如，人类组织，例如外周血)，例如Northern杂交分析。
可以通过例如从天然来源进行提取；通过表达编码多肽化合物的重组核酸分子；或通过化学合成可得到基本上纯的化合物。可以采用任意适合的方法进行纯度的分析，例如柱层析，凝胶电泳，HPLC等等。基本上纯的细胞，例如，细菌细胞的制剂，其中污染的细胞并不具有所希望的突变基因型，或并未表达或分泌足量所希望的多肽，在所述制剂细胞中其组成低于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的总数量。
本发明中的各种基因和核酸序列可以是重组序列。术语“重组子”是指重组的东西，因此当参照核酸构建体进行制备时，该术语是指由结合到一起或由分子生物学方法制备的核酸序列构成的分子。当参照蛋白或多肽进行制备时，术语“重组子”是指由分子生物学技术构建的采用重组核酸构建体进行表达的蛋白或多肽分子。当参照遗传组合物进行制备时，术语“重组子”是指具有新的在父代基因组中未出现的等位基因组合的配子和后裔。重组核酸构建体可包括连接于或被操作变为连接于天然并不连接或天然在不同位点的核酸序列的核苷酸序列。参照作为“重组子”的核酸构建体可由此说明可使用遗传工程，即通过人工干预对所述核酸分子进行操作。
可通过转化示例性地将重组核酸构建体引入宿主细胞中。这样的重组核酸构建体可包括来自所述相同宿主细胞类型或来自不同宿主细胞类型的序列，其可被分离出来并重新导入所述宿主类型的细胞。作为所述宿主细胞原始转化的结果，或作为随后的重组和/或修复事件的结果，重组核酸构建体序列可整合入宿主细胞基因组。
对核酸或蛋白而言，本文所使用的“异源”一词是指通过人工干预进行操作，使其不处于其天然发现的位置上。例如，可将来自一个物种的核酸序列引入其他物种的基因组中，或者将来自一个基因座位的核酸序列移动至相同物种的其他基因座位或染色体外座位。异源蛋白包括，例如，表达来自异源编码序列的蛋白，或表达来自天然不能表达所述蛋白的细胞中的重组基因的蛋白。
“基本上相同的”序列是与参考序列相比仅有一个或多个保守性替换区别的氨基酸或核苷酸序列，正如在本文中所讨论的那样，或在所述序列位点的一个或多个非保守型替换，缺失或插入并不会破坏所述氨基酸或核酸分子的生物学功能。这样的序列可以是从10％-90％的任一整数，或更一般地在所述氨基酸或核苷酸水平与用于比较的序列有至少10％、20％、30％、40％、50％、55％或60％，或至少65％、75％、80％、85％、90％或95％，或多至96％、97％、98％或99％的一致，例如，排列程序(96)或FASTA。对多肽而言，所述比较序列的长度可以是至少2、5、10或15个氨基酸，或至少20、25或30个氨基酸。在其他实施方案中，所述比较序列的长度可以是至少35、40或50个氨基酸，或超过60、80或100个氨基酸。对核酸分子而言，所述比较序列的长度可以是至少5、10、15、20或25个核苷酸，或是至少30、40或50个核苷酸。在其他实施方案中，所述比较序列的长度可以是至少60、70、80或90个核苷酸，或超过100、200或500个核苷酸。可采用公共可获得的序列分析软件(例如，GeneticsComputer Group的序列分析软件包，威斯康星大学生物工程中心，1710大学大道，麦迪逊，Wis.53705，或者是来自于国立医学图书馆的BLAST软件，或如本文所述的软件)方便地测定序列一致性。可用软件的示例包括Pile-up和PrettyBox。通过指定对各种替换，缺失，取代和其他修饰的同源性程度进行比对，这些软件可对类似的序列进行匹配。
可选择地，或除此之外，如果两个核酸序列在较高的严谨条件下能杂交的话，则这两个核酸序列也是“基本上相同的”。在一些实施方案中，较高的严谨条件是，例如，能允许与使用至少500个核苷酸长度的DNA探针，在含有0.5M NaHPO4，pH 7.2，7％SDS，1mM EDTA和1％BSA(组分V)的缓冲液，在65℃，或在含有48％甲酰胺，4.8x SSC，0.2M Tris-C1，pH 7.6，1x Denhardt’s溶液，10％硫酸葡聚糖和0.1％SDS的缓冲液，在42℃条件下的杂交相当的杂交条件(这些是对Northern或Southern杂交的常见的较高的严谨条件)。杂交实施的时间可以是约20-30分钟，或约2-6小时，或约10-15小时，或超过24小时或更长。高严谨性的杂交也依赖于由分子生物学家实施的多种常规技术的成功，例如高保真性的PCR，DNA测序、单链构象多态分析以及原位杂交。与Northern或Southern杂交不同，这些技术通常是采用相对较短的探针进行的(例如，通常为约16个核苷酸或更长的序列进行PCR或测定，以及约40个核苷酸或更长的序列进行原位杂交)。用于这些技术中的所述高严谨条件是分子生物学领域所属技术人员公知的(61)。
基本上相同的序列可以是，例如，与SEQ ID NO：22-43、59或73-84，或其片段或变异体的任一序列基本上相同的氨基酸序列，或与SEQ IDNO：1-21或60-72或其片段或变异体的任一序列基本上相同的核酸序列。在一些实施方案中，基本上相同的序列可以是，例如，与SEQ ID NO：1-21或60-72或其片段或变异体的任一序列互补或杂交的核苷酸序列。在一些实施方案中，基本相同的序列可以源自A/E病原体。
“探针”或“引物”是能与含有互补序列的(所述靶)的另一种DNA或RNA分子碱基配对的，具有确定序列的单链DNA或RNA分子。所得杂交分子的稳定性依赖于所发生的碱基配对的程度，并受到诸如所述探针和靶分子之间互补程度，以及所述杂交条件严谨程度的参数影响。杂交严谨性的程度受到了诸如温度、盐浓度和诸如甲酰胺的有机分子的浓度的参数的影响，并可通过本领域所属技术人员公知的方法来确定。针对此述的核酸序列或其部分的特异性探针或引物可以在至少8个核苷酸至超过500个核苷酸的整数长度进行变化，包括其中的任一的数值，依赖于杂交的目的以及进行的条件，可以使用所述探针或引物。例如，探针或引物可以是至少8、10、15、20或25个核苷酸长度，或者至少30、40、50或60个核苷酸长度，或可超过100、200、500或1000个核苷酸长度。针对与此述核酸分子的特异性探针或引物可以是从10％-90％的任一整数，或更一般地有至少10％、20％、30％、40％、50％、55％或60％，或至少65％、75％、80％、85％、90％或95％，或多至96％、97％、98％或99％地与使用例如排列程序(96)的此述的核酸序列相同。
通过本领域所属技术人员公知的方法，探针或引物可以是具有可检测性标记的，或者是放射性的或者是非放射性的。探针或引物可用于涉及核酸杂交的方法，例如核酸测序，通过聚合酶链反应的核酸扩增，单链构象多态性(SSCP)分析，限制性片段多态性(RFLP)分析，Southern杂交，Northern杂交，原位杂交，电泳迁移率变动分析(EMSA)，和其他本领域所属技术人员公知的方法。探针或引物可来自于基因组DNA或cDNA，例如，通过扩增，或来自克隆的DNA片段，或者是通过化学合成的。
“突变”包括当与所述父系菌株相比较时，在DNA序列，即有机体的基因组中的任意改变。所述改变可能是自发产生的，或是通过将所述有机体暴露于突变性的刺激引起的，例如突变性的化学物质，能量，辐射，重组技术，交配或其他用来改变DNA的技术。突变可以包括在此述的任一核苷酸序列中的改变，或者可包括在此述的编码任一所述多肽的核酸序列中的改变。
当与其父系菌株相比时，如果作为突变的结果，所述突变细胞的毒力水平降低了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，那么该突变可以是“减弱毒力”的。当与所述父系菌株比较时，可以通过测定在所述突变株中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的多肽表达的降低，例如，包括与SEQ IDNO：22-43、59或73-84，或其片段或变异体的任一序列基本上相同的氨基酸序列的多肽表达的降低，来测定毒力的降低。可以通过此述的方法或本领域公知的方法测定A/E病原体的毒力。可以通过测定在所述多肽的生物学活性至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的改变，例如，包括与SEQ ID NO：22-43、59或73-84，或其片段或变异体的任一序列基本上相同的氨基酸序列的多肽生物学活性，来测定毒力的降低。
“Modulating(调节)”或“Modulates(调节)”是指通过增加或降低完成的改变。当与对照或参考样本或化合物进行比较时，所述增加或降低可以是在介于10％至90％之间任一整数的改变，或介于30％至60％之间的任一整数，或也可能超过100％。
“检测化合物”是任一的自然发生或人造来源的化合物。检测化合物可以包括，但不限于，肽、多肽、合成的有机分子，自然发生的有机分子和核酸分子。检测化合物可以与公知的诸如本文所述的任一多肽或核酸分子的化合物“竞争”，例如，对毒力的干扰，或对由公知化合物诱导的任一生物学反应的干扰。
一般地，当与参考化合物相比较时，检测化合物可表现出介于10％至200％，或超过500％的任一数值的调节。例如，检测化合物可表现出至少从10％至200％的任意正整数或负整数的调节，或至少从30％至150％的任意正整数或负整数的调节，或至少从60％至100％的任意正整数或负整数的调节，或任意超过100％的正整数或负整数的调节。相对于公知的化合物，负调节剂的化合物一般可以降低调节，而与公知的化合物相比，正调节剂的化合物一般可以升高调节。
“载体”是来自于例如质粒、噬菌体或哺乳动物或昆虫病毒，或人工染色体的DNA分子，可向其中插入核酸分子，例如，与SEQ ID NO：1-21或60-72或其片段或变异体的任一序列基本上相同的核酸序列。载体可以含有一种或多种唯一的限制行位点，或可以在限定的宿主或载体有机体中自主复制，因此所克隆的序列是可再生的。载体可以是DNA表达载体，即，能够指导重组多肽合成的任意自主成分，因此可以用来表达多肽，例如，包括在宿主细胞中的与SEQ ID NO：22-43、59或73-84，或其片段或变异体的任一序列基本上相同的氨基酸序列的多肽。DNA表达载体包括细菌质粒和噬菌体、和哺乳动物和昆虫质粒和病毒。载体能够整合入宿主细胞的基因组中，因此经由所述载体引入所述宿主细胞基因组的任一修饰都变成了所述宿主细胞的部分基因组。载体也可以不整合入所述宿主细胞的基因组，因此保持其自主复制单位，例如质粒。
当抗体识别并与抗原，例如，包括与SEQ ID NO：22-43、59或73-84，或其片段或变异体的任一序列基本上相同的氨基酸序列的多肽结合时，所述抗体“特异性地结合”于抗原，但基本上不识别和结合样本中的其他分子。这样的抗体具有例如针对所述抗原的亲和性，其至少10，100，1000或10000倍高于所述抗体与样本中其他参考分子的亲和性。
“样本”可以是任意从个体中分离的器官，组织，细胞或细胞提取物，例如从被A/E病原体感染的动物中分离的样本，或给药了本发明的一种或多种多肽或核酸分子，或其免疫原性片段的动物。例如，样本可包括，但不限于，从患者(人或动物)、检测个体或实验动物获得的组织(例如，来自活组织检查或尸检)、细胞、血液、血清、乳汁、尿液、粪便、唾液、排泄物、蛋、哺乳动物细胞培养物或培养基，或任意其他标本，或其提取物。样本还可包括，但不限于，通过正常或转化的细胞在细胞培养中产生的产物(例如，通过重组DNA或单克隆抗体技术)。“样本”还可以是在实验条件下构建的细胞或细胞系，而不是直接从个体直接分离得到的。样本还可以是无细胞的，人造来源的或合成的。
可对所述样本进行分析，适用本领域公知的方法和/或此述的方法测定来自A/E病原体的基因、基因组、多肽、核酸分子的存在，或测定来自A/E病原体的突变，或测定来自A/E病原体的基因或多肽的表达水平，或测定来自A/E病原体的基因或多肽的生物学功能。例如，诸如测序、单链构象多态(SSCP)分析，或对来自样本的PCR产物的限制性片段长度多态性(RFLP)分析都可用来测定基因中的突变；ELISA或Western杂交可用来测定多肽或抗体的亲和性水平；Northern杂交可用来测定mRNA水平，或可用PCR来测定核酸分子的水平。
“免疫反应”包括但不限于，在给药了所述组合物或疫苗之后，一种或多种动物中的以下反应：抗体的诱导，特异性针对所述组合物或疫苗的B细胞，T细胞(包括辅助性T细胞，抑制性T细胞，细胞毒性T细胞，γδT细胞)的诱导。因此针对组合物或疫苗的免疫反应一般包括在宿主动物中由细胞和/或抗体介导的对所述感兴趣的组合物或疫苗的反应的发展。一般地，所述免疫反应会导致对A/E病原体产生的感染的预防和降低；导致对A/E病原体产生的对肠的集群的抵抗；或导致对A/E病原体产生的扩散的降低。
多肽或核酸分子的“免疫原性片段”是指能够引起免疫反应的氨基酸或核苷酸序列。因此，免疫原性片段可包括而不限于，此述任意所述序列的任意部分或与该序列基本上相同的序列，其包括一种或多种抗原决定簇(被特异性免疫系统细胞，例如T细胞或B细胞识别的位点)。例如，免疫原性片段可包括但不限于，例如来自此述的一种多种序列的介于6和60个之间任一数值，或超过60个氨基酸长度的多肽，例如介于10和20个之间任一数值氨基酸长度的多肽，或介于20和40个氨基酸长度的多肽。可采用本领域所属技术人员公知的标准方法，例如抗原决定簇定位技术或采用例如来自Oxford Molecular Group的Omiga 1.0程序进抗原性或行水疗法作图对这些片段进行鉴定(参见，例如，美国专利第4,708,871号)(76，77，81，92，73)。
附图的简要描述
图1A-F所示为来自C.rodentium，EPEC和EHEC(SEQ ID NOs：1-3和22-24)的NleA的核苷酸和氨基酸序列。
图2A-J所示为来自C.rodentium，EPEC和EHEC(SEQ ID NOs：4-7和25-29和60)的NleB的核苷酸和氨基酸序列。
图3A-F所示为来自C.rodentium，EPEC和EHEC(SEQ ID NOs：8-10和30-32)的NleC的核苷酸和氨基酸序列。
图4A-F所示为来自C.rodentium，EPEC和EHEC(SEQ ID NOs：11-13和33-35)的NleD的核苷酸和氨基酸序列。
图5A-H所示为来自C.rodentium，EPEC和EHEC(SEQ ID NOs：14-17和36-39)的NleE的核苷酸和氨基酸序列。
图6A-H所示为来自C.rodentium，EPEC和EHEC(SEQ ID NOs：18-21和40-43)的NleF的核苷酸和氨基酸序列。
图7所示为C.rodentium Orf11/GrlA(SEQ ID NO：56)与阳性转录调节因子，CaiF(SEQ ID NO：57)，以及与未表征的沙门氏菌蛋白(SEQ IDNO：58)的推断的氨基酸序列的氨基酸序列比对。下划线部分是预测的DNA结合蛋白的螺旋-回转-螺旋基序。*所示为一致的氨基酸残基，而保守性的改变用+表示。
图8所示为通过来自C.rodentium(pCRorf11)，EHEC(pEHorf11)或EPEC(pRPorf11)的orf11表现出的C.rodentium Δorf11的互补，以及由C.rodentium ler或orf11表现出的C.rodentium Δler-Δorf11的双突变的互补。
图9所示为在EHEC O157：H7基因组中含有6个新鉴定的效应物基因的O岛的相对位置的示意图。同样表示出了志贺氏毒素基因(stx)，LEE和inv-spa TTSS的位置。需要注意的是许多与原噬菌体相关的基因(CP-933和BP-933)。
图10A-B所示为对EHEC分泌蛋白的蛋白组学分析。A.来自野生型EHEC(wt)和III型分泌突变体(escN-)总分泌蛋白的1维SDS-PAGE凝胶电泳。分子量标记的迁移情况如所述凝胶的左侧所示(以kDa为单位)。B.来自野生型EHEC的总分泌蛋白的2维凝胶电泳。分子量标记的迁移情况如所述凝胶的左侧所示(以kDa为单位)，大约的pI值如凝胶的顶部所示。对采用质谱分析的蛋白点(参见表I)进行了圈画和编号。
图11A-C所示为NleA的基因组组织，分布和保守情况。A.在EHEC基因组中围绕nleA的代表性区域示意图。箭头所指为每个ORF的转录方向。对ORF的注释来自于对(3)的修饰。将NleA以粗体突出显示。B.对来自EPEC，EHEC，REPEC，Citrobacter rodentium(Citro.)和非致病性E.coli菌株HB101的基因组DNA进行的Southern杂交分析。将每个基因组DNA样本用BamHI(泳道1，4，7，10，13)，EcoRI(泳道2，5，8，11，14)和PstI(泳道3，6，9，12，15)进行消化。C.对来自EHEC，紧密粘附素阳性的原噬菌体，非O 157EHEC菌株(O84：H4)，EPEC和Citrobacter rodentium的NleA的多重蛋白序列比对。一致的序列由点(.)代表，与特异性序列相比缺乏的氨基酸由虚线(-)代表。在所述EHEC序列中，将推测的作为跨膜结构域的两个疏水性部分突出显示。
图12所示为野生型(wt)EHEC和表达pNleA-HA的III型分泌突变体(escN-)的分泌蛋白(左泳道)，细菌沉淀(右泳道)以及未转化对照的Western杂交分析。用抗HA(A.)，抗DnaK(B.)，抗Tir(C.)作为探针进行杂交。
图13A-B所示为在ΔnleA EHEC中的III型分泌和易位。A.来自野生型EHEC(wt)和所述ΔnleA突变体的总分泌蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳。分子量标记的迁移情况如所述凝胶的左侧所示(以kDa为单位)。B.用抗NleA抗血清对野生型EHEC(wt)和所述ΔnleA突变体的分泌蛋白的Western杂交分析。分子量标记的迁移情况如所述凝胶的左侧所示(以kDa为单位)。
图14A-B所示为感染的宿主细胞组分的Western杂交分析。A.用野生型(wt)或表达HA-标记NleA的escN-EHEC感染HeLa细胞，并通过差速离心得到亚细胞组分。用于分析的组分有：细菌，未破碎的细胞核细胞骨架(低速沉淀)，宿主细胞胞液(宿主胞液)，以及宿主细胞膜(宿主细胞膜)。使用抗HA，抗DnaK，抗钙联接蛋白(Calnexin)和抗微管蛋白(tubulin)抗体对所述组分进行Western杂交分析。B.将用表达HA-标记NleA的野生型EHEC感染细胞的膜成分提取出来。然后在冰上在高盐(1M NaCl)，高pH(pH 11.4)，中性pH和等渗盐(对照)中，或在中性pH和含有1％的triton x100(Triton X100)的等渗盐中对膜成分进行提取，并且离心从而得到可溶(S)和不可溶(P)的膜组分。将这些成分用于采用抗HA(顶图)，抗钙联接蛋白(中图)和抗钙网织蛋白(calreticulin)(底图)抗体的Western杂交分析。
图15A-D所示为小鼠中Citrobacter rodentium的毒力研究。A.以抗NleA抗血清为探针，对来自野生型C.rodentium(wt)和所述ΔnleA突变体的总细菌提取物进行的Western杂交分析。分子量标记的迁移情况如所述凝胶的左侧所示(以kDa为单位)。B.用野生型C.rodentium(黑色方块)，ΔnleA C.rodentium(空心圆)感染的C3H/HeJ小鼠，以及之前用ΔnleA突变体感染过且随后用用野生型C.rodentium(垂直小棒)刺激过的小鼠的存活作图。在感染阶段每天对小鼠进行监测，一旦有任何小鼠变显出濒死症状立即处死。所示为在每一组中在每一天存活小鼠与起始小鼠数量的百分比。C.来自被感染的NIH swiss小鼠的结肠C.rodentium的滴度。感染了野生型C.rodentium(黑色圈)或ΔnleA菌株(空心圆)的小鼠在感染后10天被处死。将结肠组织和粪便块匀浆并涂布于MacConkey琼脂上从而测定在处死时所述小鼠结肠中的总C.rodentium负荷。实验中的每一只小鼠由一个点代表。在图中每一组的平均值由水平的横杠表示。D.测定被感染的NIH swiss小鼠的大肠和脾脏重量。感染了野生型C.rodentium(黑色方块和三角)或ΔnleA菌株(空心圆和三角)的小鼠在感染后10天被处死。分离出结肠(方块)和脾脏(三角形)并称重。实验中的每一只小鼠由一个点代表。在图中每一组的平均值由水平的横杠表示。
图16A-B所示为来自EHEC(SEQ ID NOs：61和73)的NleG同源物的核苷酸和氨基酸序列。
图17A-B所示为来自EHEC(SEQ ID NOs：62和74)的NleH1的核苷酸和氨基酸序列。
图18A-B所示为来自EHEC(SEQ ID NOs：63和75)的NleH2的核苷酸和氨基酸序列。
图19A-B所示为来自EHEC(SEQ ID NOs：64和76)的Z2076的核苷酸和氨基酸序列。
图20A-B所示为来自EHEC(SEQ ID NOs：65和77)的Z2149的核苷酸和氨基酸序列。
图21A-B所示为来自EHEC(SEQ ID NOs：66和78)的Z2150的核苷酸和氨基酸序列。
图22A-B所示为来自EHEC(SEQ ID NOs：67和79)的Z2151的核苷酸和氨基酸序列。
图23A-B所示为来自EHEC(SEQ ID NOs：68和80)的Z2337的核苷酸和氨基酸序列。
图24A-B所示为来自EHEC(SEQ ID NOs：69和81)的Z2338的核苷酸和氨基酸序列。
图25A-B所示为来自EHEC(SEQ ID NOs：70和82)的Z2339的核苷酸和氨基酸序列。
图26A-B所示为来自EHEC(SEQ ID NOs：71和83)的Z2560的核苷酸和氨基酸序列。
图27A-B所示为来自EHEC(SEQ ID NOs：72和84)的Z2976的核苷酸和氨基酸序列。
发明详述
采用可用来显著提高分泌的阳性LEE调节剂(LEE活化物的全能调节剂(Global Regulator)，或GrlA)，我们鉴定了几种针对A/E病原体的新的常见分泌蛋白(表2)，并使得我们可采用基于蛋白组学的方法对通过所述LEE编码的TTSS分泌的蛋白进行功能性的筛选。这些新的蛋白，称为Nle(非LEE编码的效应物)A-H，存在于含有LEE的病原体中，而并不存在于非致病性的E.coli菌株和非LEE的病原体中，其是由存在于A/E病原体中的3PAI在LEE外部编码的，并与所述LEE公进化(3，8)。对这些蛋白的鉴定，在一些情况下，使得赋予了之前功能未知的ORF的功能。示例性的蛋白，NleA(p54)，是包括C.rodentium，EPEC和EHEC的A/E病原体中的III型效应物，并在行使毒力中具有重要作用。与LEE不同，NleA是在所述EHEC基因组内在噬菌体相关致病岛中编码的。所述LEE编码的TTSS指导了将NleA易位入宿主细胞中，在那里其定位于高尔基体上。nleA存在于含有LEE的病原体中，而不存在于非致病性的E.coli菌株和非LEE的病原体中。
在本发明的一些实施方案中，这些多肽和编码这些多肽或其部分的核酸分子可用作针对A/E病原性感染的有效疫苗、治疗方法、诊断学或药物筛选工具，或用作反应试剂。
多肽和检测化合物
本发明所述的化合物包括但不限于，此述的多肽和核酸分子，例如SEQ ID NO：1-56、59-84，及其片段、类似物或变异体。本发明所述的化合物还包括orf11/grlA、nleA、nleB、nleB2、nleC、nleD、nleE、nleF、nleG、nleH(nleH1和/或nleH2)基因或其同源物的产物。本发明所述的化合物还包括此述的多肽和核酸序列，例如，如编号Z0985(NleB2)、Z0986(NleC)、Z0990(NleD)、Z6020(NleF)、Z6024(NleA)、Z4328(NleB)、Z4329(NleE)、Z6025(NleG类似物)、Z6021(NleH1)、Z0989(NleH2)、Z2076、Z2149、Z2150、Z2151、Z2337、Z2338、Z2339、Z2560、Z2976或L0043(Orf11/GrlA)(登录号AF071034)的所述的EHEC基因组序列(例如AE005174)及其片段、类似物和变异体。
可通过例如在此述多肽的任意位置上，用其他保守的氨基酸残基，即具有相似的物理、生物学或化学性质的残基来替换，缺失或插入，并筛选例如对弱化毒力有用的化合物。在本发明的一些实施方案中，本发明的所述化合物包括特异性结合本发明所述多肽，例如，SEQ IDNO：22-43、59或73-84的抗体。
在本领域中，众所周知可以在多肽的结构中进行某些修饰和改变而基本上不改变该多肽的生物学功能，从而得到生物学等同的多肽。在本发明的一个方面，本发明的多肽也可以扩展为生物学等同的多肽，或通过保守性氨基酸替换区别于本发明的所述多肽序列的部分序列，或通过不影响生物学功能，例如毒力的非保守性替换得以区别的“变异体”。正如本发明所使用的，术语“保守的氨基酸替换”是指在所述多肽的给定位置上一种氨基酸对另一种氨基酸的替换，其中可以在基本上不丧失相关功能的条件下进行所述替换。在进行这样的变化时，可以在侧链取代相对相似性，例如，其大小，电荷，疏水性，亲水性等等的基础上进行类似的氨基酸残基替换，并且可通过常规的测定分析这些替换对其功能的作用。
在此使用的术语“氨基酸”是指那些在天然发生的蛋白中发现的L-氨基酸，D-氨基酸以及被修饰的这些氨基酸。因此，本发明的氨基酸可包括，例如：2-氨基脂肪酸；3-氨基脂肪酸；β-丙氨酸；β-氨基丙酸；2-氨基丁酸；4-氨基丁酸；哌啶酸；6-氨基己酸；2-氨基庚酸；2-氨基异丁酸；3-氨基异丁酸；2-氨基庚二酸；2，4-二氨基丁酸；锁链素；2，2’-二氨基庚二酸；2，3-二氨基丙酸；N-乙基甘氨酸；N-乙基天冬酰胺；羟基赖氨酸；别-羟基赖氨酸；3-羟脯氨酸；4-羟脯氨酸；异锁链素；别-异亮氨酸；N-甲基甘氨酸；肌氨酸；N-甲基异亮氨酸；6-N-甲基赖氨酸；N-甲基缬氨酸；戊氨酸；正亮氨酸和鸟氨酸。
在一些实施方案中，当氨基酸残基被替换成具有类似亲水值(例如，在±2.0值的范围内，或±2.0，或±1.0，或±0.5)的其他氨基酸时，其中水疗系数为约-1.6的氨基酸，例如Tyr(-1.3)或Pro(-1.6)的下列氨基酸被指定为氨基酸残基(如美国专利第4,554,101号详细公开的内容，在此将其引入作为参考)，如：Arg(+3.0)；Lys(+3.0)；Asp(+3.0)；Glu(+3.0)；Ser(+0.3)；Asn(+0.2)；Gln(+0.2)；Gly(0)；Pro(-0.5)；Thr(-0.4)；Ala(-0.5)；His(-0.5)；Cys(-1.0)；Met(-1.3)；Val(-1.5)；Leu(-1.8)；Ile(-1.8)；Tyr(-2.3)；Phe(-2.5)；及Trp(-3.4)，可进行保守的氨基酸替换。
在其他实施方案中，当氨基酸残基被替换成具有类似水疗系数(例如，在±2.0值的范围内，或±2.0，或±1.0，或±0.5)的其他氨基酸时，可进行保守的氨基酸替换。在这样的实施方案中，在其疏水性和电荷特征的基础上可对每一种氨基酸残基指定水疗系数，如下：Ile(+4.5)；Val (+4.2)；Leu(+3.8)；Phe(+2.8)；Cys(+2.5)；Met(+1.9)；Ala(+1.8)；Gly(-0.4)；Thr(-0.7)；Ser(-0.8)；Trp(-0.9)；Tyr(-1.3)；Pro(-1.6)；His(-3.2)；Glu(-3.5)；(-3.5)；Asp(-3.5)；Asn(-3.5)；Lys(-3.9)和Arg(-4.5)。
在其他实施方案中，可使用公共可获得的相似性矩阵(60，70，102，103，94，104，86)进行保守性氨基酸替换。PAM矩阵是基于来源于进化模型的计数，而Blosum矩阵采用的是来自比对之内高度保守模块的计数。在PAM或Blosum矩阵中大于零的类似分数可以用来制备保守性的氨基酸替换。
在其他实施方案中，当用所述相同族中的其他氨基酸替换氨基酸，可进行保守性氨基酸替换，其中所述氨基酸被分成非极性，酸性，碱性和中性的族，如下：非极性的：Ala，Val，Leu，Ile，Phe，Trp，Pro，Met；酸性的：Asp，Glu；碱性的：Lys，Arg，His；中性的：Gly，Ser，Thr，Cys，Asn，Gln，Tyr。
保守性的氨基酸改变包括用对应的D-氨基酸、用保守性的D-氨基酸、或用自然发生的、非遗传编码形式的氨基酸替换L-氨基酸，以及L-氨基酸的保守性替换。自然发生非遗传编码的氨基酸包括β-丙氨酸，3-氨基丙酸，2，3-二氨基丙酸，α-氨基异丁酸，4-氨基丁酸，N-甲基甘氨酸(肌氨酸)，羟基脯氨酸，鸟氨酸，瓜氨酸，t-丁基丙氨酸，t-丁基甘氨酸，N-甲基异亮氨酸，苯基甘氨酸，环己基丙氨酸，正亮氨酸，戊氨酸，2-萘基丙氨酸，吡啶基丙氨酸，3-苯并噻吩基丙氨酸，4-氯苯基丙氨酸，2-氟苯基丙氨酸，3-氟苯基丙氨酸，4-氟苯基丙氨酸，青霉胺，1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-羧酸，β-2-噻吩基丙氨酸，甲硫氨酸亚砜，高精氨酸，N-乙酰赖氨酸，2-氨基丁酸，2-氨基丁酸，2，4-二氨基丁酸，p-氨基苯丙氨酸，N-甲基缬氨酸，高半胱氨酸，高丝氨酸，磺基丙氨酸，ε-氨基己酸，δ-氨基戊酸或2，3-二氨基丁酸。
在其他实施方案中，保守性氨基酸改变包括基于亲水性或疏水性，大小或体积，或电荷的考虑的改变。主要根据所述氨基酸侧链的性质，一般而言可将氨基酸分为疏水性的或亲水性的。基于标准化的Eisenberg等人的一致性疏水等级(71)，疏水性氨基酸表现出的疏水性大于零，而亲水性氨基酸表现出的亲水性小于零。遗传编码的疏水性氨基酸包括Gly，Ala，Phe，Val，Leu，Ile，Pro，Met和Trp，而遗传编码的亲水性氨基酸包括Thr，His，Glu，Gln，Asp，Arg，Ser和Lys。非遗传编码的疏水性氨基酸包括t-丁基丙氨酸，而非遗传编码的亲水性氨基酸包括瓜氨酸和高半胱氨酸。
根据其侧链的特征，可将疏水性或亲水性氨基酸进一步分组。例如，芳香族氨基酸是具有侧链的疏水性氨基酸，该侧链含有至少一个芳环或杂芳环，其含有一种或多种诸如-OH，-SH，-CN，-F，-Cl，-Br，-I，-NO2，-NO，-NH2，-NHR，-NRR，-C(O)R，-C(O)OH，-C(O)OR，-C(O)NH2，-C(O)NHR，-C(O)NRR等等的取代基，其中R是独立的(C1-C6)烷基，取代的(C1-C6)烷基，(C1-C6)烯基，取代的(C1-C6)烯基，(C1-C6)炔基，取代的(C1-C6)炔基，(C5-C20)芳基，取代的(C5-C20)芳基，(C6-C26)烷芳基，取代的(C6-C26)烷芳基，5-20元杂芳基，取代的5-20元杂芳基，6-26元烷基杂芳基或取代的6-26元烷基杂芳基。遗传编码的芳香族氨基酸包括Phe，Tyr和Trp，而非遗传编码的芳香族氨基酸包括苯丙氨酸，2-萘基丙氨酸，β-2-噻吩基丙氨酸，1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-羧酸，4-氯苯丙氨酸，2-氟苯丙氨酸，3-氟苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。
非极性氨基酸是在生理pH时侧链没有电荷的疏水性氨基酸，且在其所成的键中，两个原子共用的电子对于每个原子的距离相同(即所述侧链没有极性)。遗传编码的非极性氨基酸包括Gly，Leu，Val，Ile，Ala和Met，而非遗传编码的非极性氨基酸包括环己基丙氨酸。非极性氨基酸还可被进一步分成脂肪族氨基酸，其是含有脂肪族烃侧链的疏水性氨基酸。遗传编码的脂肪族氨基酸包括Ala，Leu，Val和Ile，而非遗传编码的脂肪族氨基酸包括正亮氨酸。
极性氨基酸是在生理pH时侧链没有电荷的亲水性氨基酸，但在其所成的键中，两个原子共用的电子对离其中的一个原子更近。遗传编码的极性氨基酸包括Ser，Thr，Asn和Gln，而非遗传编码的极性氨基酸包括N-乙酰赖氨酸和甲硫氨酸亚砜。
酸性氨基酸是侧链pKa值低于7的亲水性氨基酸。酸性氨基酸通常由于丢失一个氢离子在生理pH时具有负电荷的侧链。遗传编码的酸性氨基酸包括Asp和Glu。碱性氨基酸是侧链pKa值大于7的疏水性氨基酸。碱性氨基酸通常由于与水和氢离子相连在生理pH时具有正电荷的侧链。遗传编码的碱性氨基酸包括Arg，Lys和His，而非遗传编码的碱性氨基酸包括鸟氨酸，2，3-二氨基丙酸，2，4-二氨基丁酸和高精氨酸。
本领域所属技术人员应当理解，以上分类并不是绝对的，而且可以多种方式对氨基酸进行分类。此外，可基于公知的状态和或特征性的化学、物理，或基于特异性分析的生物学性质，或与之前已鉴定氨基酸的比较来对氨基酸进行分类。氨基酸还可包括具有类似于氨基酸侧链的双官能部分。
保守性改变还可包括通过例如氨基酸的官能侧链反应，对非衍生残基进行化学衍生部分的取代。因此，这些取代基可包括这样的化合物，其游离的氨基被衍生成盐酸胺，p-甲苯磺酰基，卞氧羰基，t-丁氧羰基，氯乙酰基或甲酰基。类似地，游离的羧基可被衍生形成盐，甲基或乙基酯或其他类型的酯或肼，且侧链可被衍生形成游离羟基的O-酰基或O-烷基衍生物，或组氨酸咪唑氮的N-亚氨苯甲基组氨酸。多肽类似物还可包括被化学改变的，例如甲基化，通过诸如乙胺，乙醇胺或乙二胺的烷基胺对C-末端氨基酸的酰胺化，或对氨基酸侧链的乙酰化或甲基化(例如对赖氨酸ε氨基的乙酰化)的氨基酸。多肽类似物还可包括用取代的酰胺(例如，通式为-C(O)-NR的基团，其中R是(C1-C6)烷基，(C1-C6)烯基，(C1-C6)炔基，取代的(C1-C6)烷基，取代的(C1-C6)烯基或取代的(C1-C6)炔基)对酰胺键进行替换或酰胺键的同电子排列体(例如，-CH2NH-，-CH2S，-CH2CH2-，-CH＝CH-(顺式和反式)，-C(O)CH2-，-CH(OH)CH2-或-CH2SO-)。
所述化合物可以是共价连接的，例如通过聚合或轭合形成共聚物或杂聚物。间隔物和连接物通常由小型的中性分子构成，例如可使用在生理条件下不带电荷的氨基酸。可采用多种方法完成连接。例如可在所述多肽末端加上半胱氨酸残基，通过控制的氧化将若干多肽共价连接。或者，可采用异双官能团试剂，例如二硫化物/酰胺形成试剂或硫醚/酰胺形成试剂。所述化合物还可被连接于另一个化合物，该化合物具有例如，调节免疫原性反应的功能。可通过例如具有环部分对所述化合物进行限制。
可通过标准化学方法，例如通过使用液相或固相合成方法自动合成多肽或多肽类似物。自动化多肽合成仪是可商业获得的，其采用的是本领域公知的技术。还可以使用重组DNA技术，使用诸如在Sambrook等人(110)或Ausubel等人(111)的描述中的标准方法制备多肽和多肽类似物。一般而言，可根据本领域公知的方法，从天然产物或合成(半合成)提取物或化学文库的大文库中对候选化合物进行鉴定。在药物发现和开发领域所属的技术人员应该理解，检测提取物或检测化合物的准确来源并不是本发明方法的关键问题。因此，采用本发明所述的示例性方法，可以筛选到任意数量的化学提取物或化合物。这些提取物或化合物的例子包括，但不限于，基于植物、真菌、原核生物或动物的提取物，发酵培养液和合成化合物，以及对业已存在化合物的修饰。还有多种方法可用来产生任意数量化合物，包括但不限于，基于多糖、脂、多肽和核酸的化合物的随机性或指导性(例如半合成或全合成)合成。合成化合物文库是可商业获得的。另外，以细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库也可从多种来源获得，包括Biotics(苏塞克斯，英国)，Xenova(斯劳，英国)，Harbor Branch海洋学研究所(Ft.Pierce，佛罗里达州，美国)和ParmaMar，马萨诸塞州，美国。此外，如果需要的话，根据本领域公知的方法，例如，通过标准提取和分离方法，可生产例如A/E病原体多肽的天然和合成文库。而且，如果需要的话，可使用标准的化学，物理或生物化学方法轻而易举地对任何文库或化合物进行修饰。
当发现某种粗提取物能够调控毒力时，有必要对所述阳性前导提取物进行分离，从而提取出导致所观察效果的化合组分。因此，提取、分离和纯化方法的目的在于在含有毒力调节性质的所述粗提取物范围内对其化学实体进行仔细地表征和鉴定。用于对混合物中化合物的活性进行测定的，与在此描述相同分析方法也可用来纯化所述活性组分和测定其衍生物。对这些异源提取物进行分离和纯化的方法是本领域所公知的。如果需要的话，可根据本领域公知的方法对表现出作为治疗有效制剂的化合物进行化学修饰。随后可采用针对A/E致病性感染的Citrobater或牛模型，或针对A/E致病性感染的任意其他动物模型对鉴定为具有治疗性、预防性、诊断性或其他价值的化合物进行分析。
疫苗
“疫苗”是含有能够引起所希望的免疫反应的物质的组合物。疫苗可以选择、活化或扩展免疫系统的记忆性的B和T细胞，使其能够例如，清除感染性制剂，例如A/E病原体或其成分。在一些实施方案中，疫苗包括适合的载体，例如佐剂，其是以非特异性方法作用来提高针对特异性抗原或一组抗原的免疫反应的制剂，能够在需要产生预期免疫反应的任意给定的疫苗剂量中降低抗原的量或能够降低剂量的频率。所需要的免疫反应包括全部或部分的针对由A/E病原体引起的扩散(存在于已感染动物，例如哺乳动物的粪便)或集群(存在于已感染动物，例如哺乳动物的肠道)的防护。例如，当与非免疫动物相比较时，所希望的免疫反应可包括在免疫动物中10-100％间，例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％针对由A/E病原体引起的扩散或集群的防护。
如本发明所述的疫苗可包括此述的多肽和核酸分子，或其免疫原性片段，并可采用本领域公知或此述的任意给药形式进行给药。在本发明的一些实施方案中，所述疫苗包括活的A/E病原体，灭活的A/E病原体，或其组分。活的A/E病原体，其可以口服疫苗的形式给药，其可含有能够影响所述A/E病原体毒力，但不因性免疫反应诱导的不可恢复的遗传改变。活疫苗能够在所接种的动物，例如哺乳动物中的肠中集群。
在一些实施方案中，可将此述的多肽和核酸分子，或其免疫原性的片段或此述突变的细菌(例如，弱化的细菌)给药家禽，例如，鸡、鸭、火鸡等等，从而在所述家禽中引起免疫反应，例如产生抗体。从这些家禽获得的蛋或其制品，表现出了针对此述多肽和核酸分子或其免疫原性的片段产生免疫反应，可将其给药于动物，例如，人、牛、山羊、绵羊等等从而在所述动物中引起针对此述多肽和核酸分子或其免疫原性片段的免疫反应。在家禽中产生抗体和给药这些抗体的方法在Cook，申请日为1998年5月12目的美国专利第5,750,113号；Ivarie等人，申请日为2004年5月4日美国专利第6,730,822号和本文的参考文献113-117中有详细描述。
可以通过本领域公知的技术，通过添加重组或纯化的抗原，例如EspA、EspB、EspD、EspP、Tir、志贺氏毒素1或2、和/或紧密粘附素对本发明的疫苗进行进一步补充。例如，已有关于重组子制备和诸如EspA、Tir、EspB和紧密粘附素的EHEC O157：H7蛋白的使用的报道(PCT申请公开WO 97/40063；PCT申请公开WO 99/24576；51)
细胞培养
可根据本领域公知的任意方法或此述的方法进行A/E病原体的培养。例如，可首先将行A/E病原体培养于Luria-Bertani(LB)培养基中约8-48小时，或约12-24小时，然后以约1∶5-1∶100，例如1∶67、或约1∶5-1∶25、或约1∶10，稀释入M-9基本培养基中，其中添加了20-100mM NaHCO2或NaHCO3，或约30-50mM，或约44mM NaHCO2或NaHCO3；4-20mMMgSO4，或约5-10mM；或约0.8mM-8mM MgSO4，0.1-5％葡萄糖，或约0.2-1％，或约0.4％葡萄糖和0.05-0.5％酪蛋白氨基酸，或约0.07-0.2％，或约0.1％酪蛋白氨基酸。培养一般保持在约37℃，任意的2-10％CO2，或任意的约5％CO2，且生长至在600nm的光密度为0.7-0.8。采用任意适当的方法，例如微过滤或离心去除全部细胞，并使用透析，超滤等等方法将所述上清液浓缩，例如10-1000倍或更高，例如100。采用本领域公知的方法可容易地测定总蛋白。
可使用在此所述或本领域公知的，包括野生型或突变A/E病原体的任意A/E病原体，例如EHEC的培养物，生产细胞培养上清液。一般而言，所述A/E病原体是在适于III性抗原分泌条件下，在适当的培养基中进行培养的(美国专利第6,136,554号和第6,165,743号)(51，74)。
其他基因的分离和鉴定
根据此述的核苷酸和氨基酸序列，例如，SEQ ID NO：1-56或59-84，可以使用标准方法对其他基因进行分离和鉴定。任意的A/E病原体都可作为这些基因的来源。
在一些实施方案中，可使用此述的核酸序列来设计探针或引物，包括根据该序列的任意一条DNA链简并的寡核苷酸探针或引物。然后可使用标准的扩增或杂交技术，使用所述探针或引物对基因组或cDNA文库进行筛选获得来自其他A/E病原体的基因。
在一些实施方案中，可使用此述的氨基酸序列产生抗体或其他制剂，其可用于从与这些抗体结合的A/E病原体中筛选多肽。
在一些实施方案中，可通过用抗原决定簇序列(例如，FLAG或2HA)标记本发明的(例如，那些与SEQ ID NO：22-43、59或73-84基本上相同的)多肽，并通过用含有编码本发明多肽的核酸序列的适当载体进行转染，或通过内源性细菌III型传递，将其导入宿主细胞，然后通过对所结合伴侣进行免疫沉淀和鉴定，对所述结合伴侣进行鉴定。可以用表达FLAG或2HA融合蛋白的菌株感染HeLa细胞，然后裂解，并用抗FLAG或抗2HA抗体进行免疫沉淀。可通过质谱对结合伴侣进行鉴定。如果不能产生足量的本发明所述多肽，这样的方法就不能传递足量的标记蛋白从而鉴定其伴侣。作为互补方法的一部分，可将本发明的每种多肽克隆至融合于例如2HA、GFP和/或FLAG的哺乳动物转染载体中。转染之后，可将HeLa细胞裂解并将所述标记的多肽免疫沉淀。可通过SDS PAGE然后进行质谱对所述结合伴侣进行鉴定。
在一些实施方案中，可对本发明的多肽进行标记，过量产生，并用于亲和柱，从而鉴定和/或确认所鉴定的靶化合物。FLAG，HA和/或His标记的蛋白可被用于这些亲和柱，从而从细胞提取物中提取宿主细胞因子，并可通过标准结合分析，饱和曲线和其它此述或本领域公知的方法对任意采样进行确证。
在一些实施方案中，可采用细菌双杂交系统来研究蛋白-蛋白互作。可将此述的核酸序列或与其基本上相同的序列克隆至所述双杂交系统的pBT饵质粒，并将商业可获得的5×106独立克隆的鼠脾文库用作所述饵的靶文库。可通过回收所述质粒进一步表征潜在的命中目标，并再次转化以降低来自克隆饵变异体和文库靶克隆的假阳性，所述克隆饵变异体和文库靶克隆能激活独立于所述克隆饵的报道基因。如本文所述，可采用此述的方法对可再生的命中目标进行深入研究。
在一些实施方案中，将表达GrlA的A/E病原体菌株，例如，表达克隆的GrlA的EHEC O157菌株用于A/E III型分泌蛋白质组的蛋白组学分析，例如可使用对上清液的2D凝胶分析。此外，可将全部的A/E病原体(例如EHEC阵列)用来确定哪些基因是由GrlA调节的。可采用此述或本领域公知的方法对毒力进行分析。
一旦鉴定了编码序列，就可以使用标准的克隆方法将其分离出来，并插入了任意适合的载体或复制子中，进行例如，多肽的生产。这样的载体和复制子包括但不限于，噬菌体X(E.coli)、pBR322(E.coli)、pACYC177(E.coli)、pKT230(革兰氏阴性菌)、pGV1 106(革兰氏阴性菌)、pLAFR1(革兰氏阴性菌)、pME290(非E.coli革兰氏阴性菌)、pHV14(E.coli和枯草芽孢杆菌)、pBD9(芽孢杆菌)、pIJ61(链霉菌)、pUC6(链霉菌)、Yip5(酵母)、YCp19(酵母)或牛乳头瘤病毒(哺乳动物细胞)。
一般地，可在用适当载体转化或转染的任意适合的宿主细胞中生产本发明的所述多肽(69)。转化或转染的方法以及表达载体的选择都依赖于所选定的宿主系统。可采用多种表达系统，所采用的精确的宿主细胞对本发明并不重要。例如，可在原核宿主(例如，E.coli)或真核宿主(例如，啤酒酵母，昆虫细胞，例如，Sf21细胞，或哺乳动物细胞，例如，NIH3T3，HeLa或COS细胞)中生产本发明所述的多肽。这样的细胞可来自多种途径(例如，美国典型培养物保藏中心，Manassus，美国)。适合多肽生产的细菌表达系统包括E.coli pET表达系统(Novagen，Inc.，麦迪逊，维斯康星州)，以及pGEX表达系统(Pharmacia)。
分析
可采用此述或本领域公知的多种技术对包括多肽，核酸分子和小分子的候选化合物进行筛选和测定。能够降低本发明所述任一多肽或核酸分子的表达水平的化合物可作为有效的、例如A/E致病性感染的治疗剂。
可以通过标准Northern杂交分析，使用基于本发明的任意适合的核酸片段作为杂交探针，测定基因表达进行筛选分析，其中将存在所述候选化合物时的基因表达水平与不存在所述候选化合物时的基因表达水平进行比较。可选择地，或另外地，可以使用例如免疫沉淀或Western杂交的方法在所述多肽表达或分泌的水平上测定候选化合物的效果。
还可以进行如下的其他分析：
III型分泌的确认以及易位入宿主细胞
为了测定哪一种候选化合物需要TTSS分泌，可将每一种基因或其部分融合于FLAG在其C末端，并从WT和TTSS突变体，例如，此述或本领域公知的WT EHEC和同源的escNIII型突变体收集上清液。其他测定分泌的方法包括测定在所述突变菌株上清液中分泌产物的损失，或对于所述蛋白所产生的抗体，以及对WT和III型上清液采用Western分析。为了确定没有任何感兴趣的蛋白是TTSS成分，需要对生长在III型诱导条件下的每种候选化合物上清液进行III型分泌的测定。LEE TTSS分泌两组蛋白：集中于细菌细胞表面的易位子(EspA、B和D)，以及被直接易位入宿主细胞的效应物。可以对候选化合物进行检测从而测定其是效应物或易位子。例如，在EHEC中FLAG标记的推测的效应物或其他A/E病原体可被用来感染培养的HeLa上皮细胞，或在用抗-FLAG抗体染色之后通过免疫荧光显微镜进行测定。这样的可视效果通常都能证明细菌传递到了所述宿主细胞，并通常说明哪一个细胞器是所述效应物的靶位(例如，Tir到膜，NleA到高尔基体)。针对多种细胞分隔的抗体可被用来确认所述定位。为了与所述可视效果互补，可使用公知的分离方法(30)将感染的HeLa细胞分成细胞溶质，不可溶和膜组分，并使用抗-FLAG抗体进行Western分析从而测定所述效应物靶相于那种细胞组分。作为对照，可使用在TTSS缺陷性菌株中表达的具有标记的效应物感染细胞。如果靶向于所述膜组分，则可使用高盐或碱性pH处理来测定是否其是完全的膜蛋白。如果所述候选化合物以低水平表达，那么通过免疫荧光测定易位是相当困难的，而对于腺苷酸环化酶可进行遗传融合，该酶需要哺乳动物细胞质辅因子(钙调蛋白)得以具有活性(87)。
支架形成和摄取的效果
假设肌动蛋白凝聚和基架形成是A/E病原体的主要标志，那么可以在例如培养的HeLa上皮细胞中针对蛋白凝聚和基架形成来筛选候选化合物。
EPEC和EHEC侵入是另一种容易测定的细胞培养表现型，且可给出培养的上皮细胞的互作和改变宿主细胞骨架的指示(III型突变体不侵入，缺乏Tir和紧密粘附素的菌株也不侵入)。可以使用庆大霉素保护分析，在wt和III型突变体A/E病原体之中，例如在HeLa细胞中的WT和TTSS突变体EHEC中，对各种候选化合物的侵入水平进行比较。
此外，正如EPEC和EHEC在培养的巨噬细胞中通过以III型依赖性的方式抑制宿主PI-3激酶活性来抑制巨噬作用，可以测定所述候选化合物对所培养的巨噬细胞的吞噬作用的阻断的能力(Celli，J.，M.Olivier和B.B.Finlay.2001通过对PI-3激酶依赖性途径的抑制肠出血性大肠杆菌对抗吞噬作用的介导。Embo J 20：1245-58)。如果没有任何一种候选化合物能够抑制吞噬作用，则进行PI-3激酶抑制的后续分析。
对极化上皮单层细胞的作用
连接完整性在腹泻中具有重要的作用。除了基架形成，A/E病原体还能引起其他对于极化上皮细胞的LEE III型作用，包括微绒毛(微绒毛效应)的丧失和跨单层电阻、紧密连接尺寸的丧失。使用极化的人肠单层Caco-2细胞，可将高分辨率的扫描电子显微镜应用于感染了WT A/E病原体(例如，WT EHEC)，TTSS突变体A/E病原体，例如EHEC escN，以及每种所述候选化合物。可利用标准技术对单层细胞进行多次感染、洗涤和处理用于SEM(66)，并在感染了极化的Caco-2细胞之后，筛查电阻的损失。
对先天免疫和炎症的影响
在病原体中快速出现的主题是抑制先天免疫和炎症反应的能力。已经对诸如EHEC和EPEC的A/E病原体的这些影响进行了报道，且这些分析可被用来检测在WT和TTSS突变体A/E病原体菌株中的候选化合物。例如，EHEC引起了对NF-κβ的抑制，导致了诸如HeLa细胞中的I1-8、I1-6和I1-1α几种细胞因子的抑制(80)，该方法需要LEE TTSS。可以在，例如HeLa细胞感染之后，使用诸如RT-PCR(实时PCR)，也商业可获得的ELISA分析的标准方法，对候选化合物对这些因子的抑制进行分析。
基于定位信息的功能性研究
除了表型分析，根据其对宿主细胞的定位也可对候选化合物进行分析。例如，如果某种候选化合物定位于高尔基体，则可对其进行分析从而测定是否其会影响高尔基体的功能，包括在表达所述候选化合物的酵母中进行生化研究测定糖基化和功能性高尔基体分析。如果所述候选化合物定位于线粒体，则可进行对调亡和其他线粒体功能的分析。如果所述候选化合物靶定于内质网，则可设计蛋白合成和分泌的分析。如果发生了细胞核的靶向，则可实施转录研究。
毒力的作用
竞争性指数(CI)可用来广泛地测定小型毒力因子的作用，以及是否两种毒力因子归属于相同的毒力“途径”(63)。简言之，可将两种具有不同抗生素抗性标记的菌株共感染动物，在适当的孵育时间之后，将所述细菌收获并测定两种菌株的比例。数值为1说明毒力相等。如果鉴定的化合物对毒力有影响，则可测定其与WT相比的CI。CI也可用来测定所述候选化合物归属与哪条毒力途径。例如，除了将每一种毒力因子的突变体与WT进行比较，还可以通过对这两种毒力因子的突变体进行比较测定CI。当对一种突变体以及双突变体进行比较时，CI值为1说明他们归属于相同的一般性毒力途径，而任意其他不是1的情况都说明它们处于不同的毒力“途径”。
显微镜研究
可使用包括透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM)的显微镜技术来对A/E病原体疾病进行表征，从而对来自REPEC感染兔子远端回肠派伊尔(氏)淋巴集结中的淋巴滤泡(小结)进行测定，进而确认A/E损伤的形成(63)，使用共聚焦显微技术来表明进入感染小鼠的鼠绒毛的传递和所述疾病过程的组织学分析。
这些技术可用来在适当的动物模型分析候选化合物，例如，用携带有所述候选序列上有突变的各种Citrobacter菌株感染的小鼠。对每一种候选化合物而言，都可在(或缺乏)该系统中，在所述疾病发展之后进行综合研究。此外，还可以测定这些突变体在肠表面的集群水平。可以在对肠组织进行收获之后，用抗生素标记的菌株感染动物。可将组织匀浆，并通过平板计数在选择性平板上定量所述细菌。
A/E病原体致病性感染，例如，Citrobacter感染的主要特征是广泛性的炎症。可以进行共聚焦显微分析来跟踪在候选化合物中各种突变体的炎症细胞事件。通过用抗体或凝集素对组织进行标记，然后采用共聚焦显微技术，与父系菌株相比，可对由所述突变体导致的聚集于感染位点的炎症细胞进行定义。对应于若干先天反应因子的抗体是可获得的并用来对感染过程中的突变体表型进行分析，测定先天反应因子以及诸如巨噬细胞，中性粒细胞，iNOS产生细胞，树突状细胞等等的细胞。
组织学研究
可以对染色的组织进行组织学研究。例如，可对用REPEC和在候选化合物中有缺失的菌株感染的兔的苏木精和曙红染色的回肠切片进行研究，从而对炎症和组织损伤进行比较，并对A/E病原体感染进行表征(58)。还可以用缺乏候选化合物的Citrobacter菌株在小鼠中进行类似的染色。可以进一步定义与Citrobacter及其同源突变体相关炎症的几种其它组织学染色也是可获得的，包括吉姆萨(Giemsa)和甲苯胺蓝(Toluidine BlueO)(适用于普通形态学)，过碘酸-希夫氏染色反应(Periodic Acid-Schiff)(对糖进行染色，允许对肠粘液层和杯状细胞进行检测)，革兰氏染色，氯醋酸酯酶(炎症细胞染色)和半胱天冬酶(caspase)分析(适用于调亡)。免疫组织化学允许旨在针对细菌和哺乳细胞抗原的抗体的应用。
抗体
使用标准技术制备方法(45)或本领域公知的方法，可将本发明的化合物用来制备针对本发明多肽的抗体。
例如，可将本发明多肽的编码序列纯化至免疫兔子的必须程度。为了降低抗血清的低亲和性或特异性的潜在问题，可对每种蛋白生成2或3种多肽构建体，并将每种构建体注射到至少2只兔子中。可通过一系列，优选为包括至少三次加强注射的注射来产生抗血清。可采用弗氏完全佐剂进行初次免疫，然后采用弗氏不完全佐剂进行后续免疫。可采用Western杂交和使用所述纯化蛋白的免疫沉淀分析对抗体滴度进行监测。可使用CNBr-葡聚糖偶联蛋白对免疫血清进行亲和纯化。可使用不相关的蛋白板测定抗血清的特异性。可选择地，或除此之外，可以产生对应于本发明多肽相对唯一的免疫原性区域的多肽，并通过引入的C-末端赖氨酸与钥孔戚血蓝素(KLH)偶联。对这些多肽中每一种的抗血清都可通过轭合于BSA的多肽进行亲和纯化，使用多肽轭合物在ELISA和Western杂交并通过Western杂交和免疫沉淀测定特异性。
可选择地，可根据标准杂交瘤方法制备与本发明任一多肽特异性结合的单克隆抗体(91，90，89，78)。一旦产生出来，可通过Western杂交或免疫沉淀对单克隆抗体的特异性识别进行测定。可认为那些与本发明所述多肽特异性结合的抗体是有用的；这样的抗体可用作，例如，免疫分析。也可以使用上述的本发明所述多肽和噬菌体显示文库制备其他的单克隆抗体(112)。
在一些实施方案中，可使用表现为具有免疫原性的多肽片段，制备抗体，该免疫原性是通过诸如具有较高频率的带电荷的残基作为标准。例如，通过使用含有来自于一个种类的抗原结合区域和来自其他种类Fc部分的嵌合抗体，或通过使用来自适合类型杂交瘤制备的抗体，可对抗体进行定制来降低不利的宿主免疫反应。
在一些实施方案中，可使用针对此述任一多肽的抗体来治疗或预防由A/E病原体引起的感染。
动物模型
可在多种A/E病原体感染的动物模型中对化合物进行快速的筛选。
Citrobacter鼠感染模型是天然发生的疾病模型，而成年牛EHEC扩散模型则是天然非疾病携带模型(牛并未生病，而EHEC也不是正常菌群的一部分)。对Citrobacter模型而言，可根据以上描述对小鼠中的毒力突变体进行筛选。可使用敲除(KO)/突变体小鼠来研究感染中候选序列的作用。已经开发了几种包括定义iNOS(20)、T和B细胞(106)、Tlr-4的功能并建立了一些列具有宿主易感性(54)以及Nck的KO小鼠品系。
对于牛的模型，可在一岁内的牛中筛选EHEC突变体(参见，例如，PCT申请国际公开第WO 02/053181号)。简言之，通过口-胃插管法，可将108CFU的突变体或WT O157传递入牛体内。接种后14天，可通过选择性涂板监测粪便扩散，通过多重PCR，扩散水平，以及在EHEC集中的肛门区域的组织学和显微镜分析证明聚集情况(97)。其他的模型还有牛肠环模型，其中向肠环注射EHEC，并在各个时间进行组织学和显微镜学检查，并通过涂布定量所吸附的细菌。
可以按下方式制备RDEC-1感染的天然兔感染模型：通过离心收集过夜细菌培养物，并重悬于1毫升磷酸缓冲盐水中。将新西兰白兔(重量为1.0-1.6kg)禁食过夜，然后使用口胃管将5毫升2.5％无菌的碳酸钠和1毫升RDEC-1或候选序列突变菌株(2：-5×1010)接种入胃中。在之后一天以相同剂量的细菌对每只兔子进行接种。每只兔子每天都称重，通过直肠擦拭并从粪球中收集细菌的排泄物扩散。将直肠擦拭棉签在含有萘啶酸的MacConkey平板的表面上旋转半圈。从每只兔子收集5团粪便或相同数量的液体粪便，将其重悬于3毫升磷酸缓冲盐水中，并将0.1毫升的每种粪便悬液涂布于含有萘啶酸的MacConkey平板上。将抗萘啶酸克隆的生长计分如下：0，没有生长；1，较大间隔的克隆；2，间隔较近的克隆；3，汇合生长的克隆。通过静脉注射氯胺酮或过量给药苯巴比妥钠处死动物后立即将组织剪切下来。对在肠系统中细菌聚集数量的分析如下：将肠部分(10厘米)，除了盲肠，在其近段和远端双重结扎，并在所述双重结扎部分之间切断，然后用10毫升并冷却的磷酸缓冲盐水进行冲洗。向来自所述盲肠的1克粘性成分中加入9毫升磷酸缓冲盐水。将所得的磷酸缓冲盐水悬液稀释，并涂布于含有萘啶酸的MacConkey平板上。使用9mm直径的木塞打孔器对组织样本进行剪切，用磷酸缓冲盐水洗涤三次，加入2毫升冰预冷的磷酸缓冲盐水，用匀浆器匀浆，然后将系列稀释的样本涂布于MacConkey平板。可以通过下式计算出每平方厘米上附着的细菌数：
CFU/cm2＝细菌数/平板x稀释因子x 2ml/-0.452。
治疗和诊断
本发明所述的多肽和核酸分子可用作治疗剂，例如，制备疫苗或治疗组合物、或弱化毒力的A/E病原体构建体。可通过例如在基于本发明所述核酸序列的基础上设计引物，和使用基于sacB序列的等位基因交换的在本文中所述的技术，构建这样的A/E病原体构建体(29)。所述多肽和核酸分子可以单独使用或相互或与其它适合的分子，例如EspA、EspB、EspD、EspP、Tir、志贺氏毒素1、志贺氏毒素2或紧密粘附素组合使用。
在一些实施方案中，可将本发明所述的核酸分子用于反义技术中。参考于核酸在此使用的“反义”一词，是指互补于核酸分子编码链，例如，诸如nleA、nleB、nleC、nleD、nleE或nleF基因的基因，或互补于与SEQ ID NO：1-21或60-72或其片段或变异体的任一序列基本上相同的核酸序列的核酸序列。在一些实施方案中，反义核酸分子是当与其互补基因都在细胞中表达时，能够降低其互补基因编码多肽水平的核酸分子。在一些实施方案中，与在仅表达所述基因而不是所述互补反义核酸分子的细胞中的多肽水平相比，所述多肽水平下降了至少10％-至少25％中的任一整数，或至少25％-至少50％中的任一整数，或至少50％-至少75％中的任一整数，或至少75％-至少100％中的任一整数。
在一些实施方案中，可采用RNA干涉(RNAi)技术，一种转录后基因沉默类型的技术，对基因或编码或非编码感兴趣区域的表达进行抑制或阻碍。RNAi可用来创建功能性的“敲除”，即，降低基因或编码或非编码感兴趣区域的表达能够被诱导的系统，从而得到所述编码产物的总体水平的降低。因此，可对感兴趣的核酸或其片段或变异体进行RNAi靶向操作，从而降低其编码产物的表达水平和活性。这样的系统可用来对所述产物进行功能性研究，并治疗由A/E病原体引起的感染。RNAi在例如美国专利申请第20020173478号(Gewirtz；公开于2002年11月21号)和第20020132788号(Lewis等人；公开于2002年11月7号)中已被公开(79，67)。进行RNAi的试剂和试剂盒是可以从，例如，Ambion Inc(奥斯定，德克萨斯州，美国)和New England Biolab Inc.(贝弗利，马萨诸塞州，美国)商业获得的。
在一些系统中，最初的RNAi试剂被认为是对应于靶核酸的dsRNA分子。随后认为所述dsRNA分子可被切割成21-23核苷酸长度(19-21bp的双链，每个具有2个核苷酸的3’突出端)的短的干涉RNA(siRNA)。影响这一最先剪切步骤的酶被称为“剪切酶(Dicer)”，并被分为dsRNA特异性核酸酶中的III类RNA酶。可选择地，可通过直接导入细胞，或通过向所述细胞导入这样的siRNA或类siRNA分子的适合前体(例如，载体，等等)使得RNAi产生作用。siRNA可随后与其他细胞内组分结合从而形成RNA-诱导的沉默复合体(RISC)。由此形成的所述RISC可随后通过其siRNA组分和靶转录本之间同源程度的碱基配对互作靶定感兴趣的转录本，导致从所述siRNA的3’末端对所述靶转录本进行约12个核苷酸的剪切。因此，所述靶mRNA被剪切，且其编码的蛋白产物的水平也被降低。
可通过向细胞中引入适合的体外合成的siRNA或类siRNA分子来使得RNAi起作用。可使用例如化学合成的RNA来进行RNAi(64)，其中可采用公知的方法化学合成适当的RNA分子。或者，可使用适当的表达载体在体外或体内转录这些RNA。可使用例如T7RNA聚合酶对有义和反义链(由同一载体或分开的载体上的序列编码的)进行体外转录，其中所述载体可包括可操作的连接于T7启动子的适当编码序列。在所述实施方案中，体外转录的RNA可被体外处理(例如，使用E.coli III型RNA酶)成适于进行RNAi的长度。可将有义和反义转录物合并形成导入感兴趣的靶细胞的RNA双链。也可以使用表达能被处理成类siRNA分子的小发夹RNA(shRNA)的其他载体。多种基于载体的方法是本领域公知的(65，93，95，98，99，105，109)。将这些载体通过体外或体内(例如，基因治疗)引入细胞的多种方法也是本领域公知的。
因此，在某个实施方案中，包括与SEQ ID NO：22-43的任一序列基本上相同的氨基酸序列的表达，可通过向细胞中引入或在细胞中产生对应于编码所述多肽或其片段，或对应于其同源核酸的siRNA或类siRNA分子得到抑制。在多个实施方案中，这样的方法使得需要直接给药，或使用上述的基于载体的方法将siRNA或类siRNA分子导入细胞。在一个实施方案中，所述siRNA或类siRNA分子的大小小于约30个核苷酸。在其他实施方案中，所述siRNA或类siRNA分子的大小约为21-23个核苷酸。在一个实施方案中，siRNA或类siRNA分子包括19-21bp的双连部分，每条链还含有2个核苷酸的3’突出端。在实施方案中，所述siRNA或类siRNA分子基本上与编码所述多肽或其片段或变异体(或变异的片段)的核酸相同。这样的变异体能够编码具有由SEQ ID NO：22-43编码的多肽活性的蛋白。在实施方案中，所述siRNA或类siRNA分子的有义链基本上与SEQ ID NO：1-21或其片段(RNA用U替换了DNA序列上的T)相同。
在一些实施方案中，所产生的针对本发明所述多肽的抗体可用来治疗由A/E病原体引起的感染。
在一些实施方案中，本发明所述的多肽和核酸分子可用来测定样本中A/E病原体的存在。所述核酸分子可用来设计例如，能够与样本中A/E病原体的DNA杂交，或可用来使用例如聚合酶链反应技术在样本中对A/E病原体的DNA进行扩增的探针或引物。所述多肽可用来，例如，产生与由A/E病原体表达的多肽特异性结合的抗体。这样的探针或引物或抗体可进行可检测的标记。“可检测的标记”是指对分子，例如寡核苷酸探针或引物，基因或其片段，或cDNA分子的存在进行标记和鉴定的任意方法。可检测的标记分子的方法在本领域内是公知的，包括但不限于，放射性标记(例如，使用诸如32p或35S的同位素)和非放射性标记，例如酶标记(例如，使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶)，化学发光标记，荧光标记(例如，使用荧光素)，生物发光标记，或对附着于所述探针的配体的抗体检测。这一定义还包括可通过用间接方法标记的，例如，结合于第一部分(例如生物素)，其又结合于可进行观察或分析的第二部分(例如荧光素标记的抗生蛋白链菌素)的可检测的分子。标记还包括地高辛，荧光素酶和水母素。
制药和兽药组合物，剂量和给药
所述化合物包括此述的多肽和核酸分子以及使用本发明方法鉴定的化合物。在存在脂质体、佐剂或任一药物可接受载体，以适于对哺乳动物，例如人、牛、绵羊等等给药的适当形式条件下，可单独提供本发明所述的化合物或与其他化合物(例如，核酸分子、小分子、多肽、肽或肽类似物)组合提供。如果需要的话，可用基于本发明的化合物与多种传统和现存的治疗剂联合治疗A/E病原体感染。
可使用常规的制药方法提供适合的制剂或组合物从而对A/E病原体感染的患者给药所述化合物。可以采用任意适合的、例如非肠道的、静脉的、皮下的、肌肉的、颅内的、眶内的、眼的、心室内的、囊内的、脊柱内、脑池内、腹膜内的、鼻内的、气雾剂或口服给药方法。配方可以是液体溶液或悬液；片剂或胶囊；粉末，滴鼻剂或气雾剂形式。
制备所述制剂的方法是本领域公知的(57)。适于非肠道给药的配方可含有，例如，赋型剂，灭菌水，或盐水，诸如聚乙二醇的聚亚烷基二醇，植物来源的油，或氢化的萘。也可以采用生物匹配的、生物可降解的交酯聚合物、交酯/乙交酯聚合物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物来控制所述化合物的释放。其他潜在的用于调节性化合物非肠道传递的系统包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入的灌注系统以及脂质体。适于吸入的配方可包括赋型剂，例如乳糖，或可以是含有例如聚氧乙烯-9-月桂酸酯、甘胆酸盐和脱氧胆酸盐的水溶液，或可以是以滴鼻剂形式给药的油状溶液或作为凝胶。对治疗性或预防性组合物而言，可以足以中止或延缓A/E病原体感染的量对个体给药所述化合物。
基于本发明化合物的“有效量”包括治疗有效量或预防有效量。“治疗有效量”是指在剂量上的有效量，并且在必需的时间阶段内，达到所需要的治疗结果，例如A/E病原体的聚集或扩散的降低。根据诸如患者疾病状态、年龄、性别和体重的因素以及所述化合物在患者体内引起所需要反应的能力不同，所述化合物的治疗有效量也会发生变化。可对剂量方案进行调节从而提供最适的治疗反应。治疗有效量也可以是所述治疗有效效果超过了所述化合物的任意毒性或有害效果的量。“预防有效量”是指在剂量上的有效量，并且在必需的时间阶段内，达到所需要的预防结果，例如预防由A/E病原体引起的聚集。通常，可在患病之前或疾病的早期对患者使用预防剂量，所以预防有效量可能低于治疗有效量。化合物的优选治疗或预防有效量范围可以是从0.1nM-0.1M、0.1nM-0.05M、0.05nM-15μM或0.01nM-10μM中的任意整数。
需要注意的是所述剂量可随拟被缓解的病症的严重程度不同而变化。对任意特异的患者而言，可根据个体的需要对特异性的剂量配置，和给药或监督所述组合物给药的人的职业判断进行调节。在此设定的剂量范围仅仅是示例性的，而并没有对通过医疗人员选定的剂量范围进行限制。根据诸如所述个体的疾病状态、年龄、性别和重量的因素，在所述组合物中的活性化合物的量可以改变。可对剂量方式进行调节从而提供最适的治疗效果。例如，可给药单粒大丸药，可随时间给药分开的若干剂量，或可根据所述治疗情况的紧急事件对所述剂量进行成比例的降低或升高。以剂量单位形式配置非肠道组合物对方便给药和均一剂型相当有益的。
在疫苗制剂的情况下，可单独或与其他化合物，以及与一种或多种诱导免疫反应的免疫佐剂来提供本发明的有效量化合物。基于本发明的佐剂包括乳化剂、胞壁酰二肽、阿夫立定、诸如氢氧化铝的水性佐剂、基于几丁质的佐剂、皂角苷、油、Amphigen、LPS、细菌细胞壁提取物、细菌DNA、细菌复合物、合成的寡核苷酸及其组合(100)。所述佐剂可包括草分支杆菌(M.phlei)细胞壁提取物(MCWE)(美国专利第4,744,984号)，草分支杆菌DNA(M-DNA)，或分支杆菌细胞壁复合物(MCC)。乳化剂包括天然或合成的乳化剂。合成的乳化剂包括阴离子试剂(例如，月桂酸和油酸的钾盐、钠盐和铵盐、脂肪酸的钙盐、镁盐和铝盐、即金属皂、以及诸如硫酸月桂酸钠的有机磺酸盐)，阳离子试剂(例如，溴化十六烷基三甲铵)，和非离子试剂(例如，诸如单硬脂酸甘油酯的甘油酯，聚乙二醇酯和醚，以及诸如脱水山梨聚醇单棕榈酸酯的脱水山梨醇脂肪酸酯，及其聚氧乙烯衍生物，例如聚氧乙烯脱水山梨聚醇单棕榈酸酯)。天然乳化剂包括阿拉伯树胶，明胶卵磷脂和胆固醇。其他适合的佐剂包括油，例如单种油或混合油，水包油乳剂(例如，EMULSIGENTM，EMULSIGENPLUSTM，或VSA3)，或非水包油乳剂(例如，油性乳剂，油包水乳剂或水包油包水乳剂)。所述油可以是矿物油，植物油或动物油。适合的动物油包括例如，鱼肝油，大比目鱼油，鲱油，橘刺鲷(orange roughy)鱼油或鲨鱼肝油，所有这些油都是可商业获得的。适合的植物油包括但不限于，菜籽油，杏仁油，棉籽油，玉米油，橄榄油，花生油，红花油，芝麻油或大豆油。可选择地，多种脂肪族含氮碱可用作所述疫苗制剂的佐剂。例如，公知的免疫佐剂包括胺，季铵化合物，胍，苄脒和硫脲阳离子(75)。特异性地佐剂化合物包括溴化二甲基双十八烷铵(DDA)(美国专利第5,951,988号)(88，59，85，68，84，82，83)和N，N-双十八烷基-N，N-二(2-羟乙基)丙烷二胺(“阿夫立定”)(美国专利第4,310,550号，美国专利第5,151,267号)(62)。基于本发明的佐剂还可包括例如矿物油和溴化二甲基双十八烷铵。
可使包括但不限于混合、超声波和微流化的标准方法来制备疫苗组合物。所述佐剂可包括疫苗的约10-50％(体积/体积)，或约20％-40％(体积/体积)或约20％-30％或35(体积/体积)，或这些范围中的任意值。所述化合物还可连接于载体分子，例如牛血清白蛋白或钥孔戚血蓝素从而提高免疫原性。
一般地，可在不引起基本毒性的条件下使用本发明的化合物。可使用标准方法，例如，通过检测细胞培养物或实验动物并测定所述治疗系数，即LD50(所述种群的50％致死剂量)和LD100(所述种群的100％致死剂量)之间的比例，测定本发明所述化合物的毒性。然而，在某些情况下，例如严重的疾病状态下，有必要给药基本过量的所述组合物。
下述实施例仅对本发明的实施方案进行示例性说明，而不应该理解为对本发明范围的限制。
实施例1
突变体的产生
所使用的细菌菌株如下：EHEC O157:H7菌株86//24(32)，EHECEDL933(野生型E.coli O127:H7分离物；3)；EHEC escN-(47)，野生型EPEC E2348/69(野生型E.coli O127:H6分离物；50)，C.rodentium DBS100(ATCC 51459；53)，REPEC 0103：K-：H285/150(52)，E.coli HB101。
所使用的质粒如下：
  质粒   描述和相关表现型   参考文献   pRE118   用于等位基因交换的基于sacB的自杀性载体，Kanr   4   pKD46   质粒表达λ红色重组酶，AMPr   5   pACYC184   克隆载体，CMrTetr   NEB   pCR2.1-TOPO   PCR克隆载体，AmprKanr   Invitrogen   pTOPO-2HA   基于pCR2.1-TOPO，针对C-末端2HA标记的Plac-  驱动的表达盒，AmprKanr   pCRespG-2HA/  BlgII   基于pACYC184，针对C-末端2HA标记的  Citrobacter espG启动子驱动的表达盒，Cmr   pCR1er   pCR2.1-TOPO中的C.rodentium ler   pCRorf11   pCR2.1-TOPO中的C.rodentium orf11/grla   pEGorf11   pCR2.1-TOPO中的EHEC orf11/grlA   pRPorf11   pCR2.1-TOPO中的EPEC orf11/grlA
  质粒   描述和相关表现型   参考文献   pKK232-8   含有无启动子cat基因的pBR322衍生物   Pharmacia   pLEE1-CAT   带有C.rodentium LEE1(Ler)-cat转录融合来自核  苷酸-162至+216的pKK232-8衍生物   pLEE5-CAT   带有C.rodentium LEE5(Tir)-cat转录融合来自核苷  酸-262至+201的pKK232-8衍生物

对PCR或反向PCR而言，可使用校对阅读的ELONGASE扩增系统(GIBCO BRL/Life Technologies)来常规地降低PCR错误率。使用来自Invitrogen的pCR2，1-TOPO或pCRII-TOPO的TOPO TA克隆试剂盒对PCR产物进行克隆。使用Taq Dye-terminator方法和自动373A DNA测序仪(Applied Biosystems)测定DNA序列。对常规克隆，转化和感染而言，细菌都生长于37℃的Luria-Bertani(LB)琼脂或添加了适当抗生素的培养基中。可以下列浓度使用多种抗生素，氨苄青霉素100μg/ml，羧苄青霉素100μg/ml，卡那霉素50μg/ml，和氯霉素30μg/ml。在Dullbecco′s modifiedEagle′s培养基(DMEM)中的培养物可用于诱导LEE基因表达和III型蛋白分泌。
可采用基于sacB基因的等位基因交换(14)和λ红色重组酶系统(17)，来产生突变体。一般而言，可将每个基因的75％或更多内部成分缺失来确保所述基因功能的破坏。通过λ红色重组酶方法可对ler基因进行突变，而通过基于sacB基因的等位基因交换对ler，orf11/grlA和cesT基因进行了突变。可使用基于sacB基因的等位基因交换产生了ler/orf11双突变体。在其他地方也描述了tir和escD突变体的产生(20，56)。所述突变体是在阅读框内缺失的突变体，同时在所缺失的位点上引入了限制酶(NheI，BamHI或SalI)位点，如下：
  LEE突变  体名称   蛋白长度(aa)   密码子缺失  (从#到#)   在所述缺失位  点引入的特征   应用的缺失方法   Δler   129   23-97或9-122   NheI或aphT盒   sacB或Lambda  红   Δorf11/grlA   135   23-115   NheI   sacB   ΔescT   156   25-147   NheI   sacB
可通过多重PCR反应对这些突变体进行确证。可通过对各个基因提供质粒对Δtir，Δler和Δorf11突变体进行互补测验。所有这些突变体都可以互补，从却确认了通过等位基因交换方法生成的突变并未影响到下游基因的功能，而且因此是无极性的。
为了制备EHEC-pNleA-HA，使用校正阅读的ELONGASE扩增系统(Invitreogen)和以下引物Z6024F：5′AGATCTGAAGGAGATATTATGAACATTCAACCGACCATAC(SEQ ID NO：44)；Z6024R：5′CTCGAGGACTCTTGTTTCTTCGATTATATCAAAG(SEQ ID NO：45)对nleA的编码部分进行扩增。使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitreogen)对PCR产物进行克隆，并使用Taq Dye-terminator方法和自动373A DNA测序仪(Applied Biosystems)对DNA序列进行确认。然后将所述产物亚克隆入pCRespG-2HA/BglII，该质粒是工程化后用于驱动C.rodentium EspG启动子的蛋白表达，并向所述表达的蛋白的C-末端加上两个流感血凝素(HA)的源自pACYC的质粒。然后通过电穿孔向野生型EHEC和EHECescN-中导入所述质粒构建体。
通过基于sacB基因的等位基因交换(29)构建了在抗萘啶酸的EHEC菌株中nleA的缺失突变体。使用EHEC染色体DNA作为模板，对nleA侧翼的两个DNA片段进行了PCR扩增。
使用引物NT10 5′CCGGTACCTCTAACCATTGACGCACTCG(SEQID NO：46)和引物NT11 5′AACCTGCAGAACTAGGTATCTCTAATGCC(SEQ ID NO：47)对片段A进行PCR扩增从而产生了1.3kb的产物。
使用引物NT12 5′AACCTGCAGCTGACTATCCTCGTATATGG(SEQID NO：48)和引物NT13 5′CCGAGCTCAGGTAATGAGACTGTCAGC(SEQ ID NO：49)对片段B进行PCR扩增从而产生了1.3kb的产物。
然后用PstI对片段A和B消化1小时，然后将所述酶在65℃加热失活20分钟。在室温将约50ng的每种消化片段与T4DNA连接酶连接1小时。将所述连接反应物稀释成1/10，并将1μl加入到使用引物NT10和NT13的PCR中。将所得的2.3kb PCR产物随后用SacI和KpnI消化，连接于pRE112的对应位点(14)，并转化入DH5αλpir从而生产pNT225。将pNT225转化入作为与野生型EHEC轭合的供体菌株的轭合SM10λpir菌株。在LB琼脂上，可对抗萘啶酸和氯霉素的接合后体(exoconjugation)。然后将所述接合后体涂布于含有5％(重量/体积)蔗糖而没有NaCl的LB    琼脂上。将所得的克隆随后进行氯霉素敏感性的筛选，然后通过PCR来鉴定所述分离物具有nleA缺失和质粒序列的缺失。然后分离到nleA缺失突变体，并将其用于后续工作。使用PCR构建的C.rodentium nleA突变体可在pRE118(14)中构建含有nleA内部缺失的自杀性载体。
使用了以下引物：del1F 5′GGTACCACCACACAGAATAATC(SEQID NO：50)；del1R：5′CGCTAGCCTATATACTGCTGTTGGTT(SEQ IDNO：51)；del2F：5′GCTAGCTGACAGGCAACTCTTGGACTGG(SEQ IDNO：52)；del2R：5′GAGCTCAACATAATTTGATGGATTATGAT(SEQ IDNO：53)。通过电穿孔将所得质粒导入C.rodentium从而构建了具有抗生素抗性的局部二倍体菌株。如上所述，可对通过第二次重组事件缺失的质粒序列进行筛选。可使用在所述缺失区域侧翼的引物，通过PCR对抗生素敏感、抗蔗糖克隆的适当重组事件进行确证。可采用多克隆抗-NleA抗血清，通过Western杂交对全细胞裂解液中NleA的缺乏进行确证。
对总蛋白/蛋白质组和分泌蛋白/蛋白质组的分析
如前所述制备了分泌蛋白(51)。
在37℃，在4ml Luria broth(LB)的烧瓶中将C.rodentium菌株过夜生长。将所述培养物以1∶50接种到在组织培养箱中预孵育(5％CO2)过夜的4ml Dulbecco′s modified Eagle′s培养基(DMEM)中，在相同的培养箱中静置生长6小时从而诱导LEE基因表达。将所述培养物在13,000rpm，离心10分钟，重复两次，从而去除细菌，并用10％三氯乙酸(TCA)沉淀上清液，从而将分泌入所述培养基中的蛋白浓缩。用2X SDS-PAGE缓冲液溶解所述细菌沉淀，并将其指定为总细菌蛋白。还可将从所述上清液中沉淀出的分泌蛋白溶解于2X SDS-PAGE缓冲液，并且用1μl饱和的Tris中和残留的TCA。将用来重悬所述细菌沉淀和分泌蛋白的缓冲液体积标准化至所述培养物的OD600，从而确保所述样本的上样是相等的。在12％或17％SDS-PAGE，和用0.1％考马斯亮蓝G250染色对所分泌的蛋白进行分析。对Western杂交分析而言，可使用10％SDS-PAGE对所述总蛋白或分泌蛋白进行分离，并转移至硝酸纤维素膜上(Bio-Rad)。所使用的抗体是针对所述His标记的Citrobacter Tir的大鼠多克隆抗体，以及针对EPEC EspB的小鼠单克隆抗体。按标准的ECL Western杂交实验指南(Amersham Life Science)进行实验。
在LB培养基中对野生型EHEC和EHEC CVD451进行过夜培养。然后将培养物以1∶100稀释入添加了44mM NaHCO3、8mM MgSO4、0.4％葡萄糖和0.1％酪蛋白氨基酸的M-9基本培养基中，并在37℃在5％CO2中静置生长至OD600为0.6-0.8。
通过在8000g离心30分钟收集分泌蛋白，由此从所述沉淀中分离出所述上清液。将上清液通过0.45μm的滤器进行过滤，并通过BCA分析测定蛋白浓度(Sigma)。可通过用1/9体积的100％冷的TCA在冰上沉淀45-120分钟，然后在17600g离心30分钟制备用于电泳的蛋白。将所述沉淀在冷的100％丙酮中润洗，并溶解于1X laemmli缓冲液(针对1维SDS-PAGE凝胶)或针对2D凝胶的2D样本缓冲液(8M尿素，2M硫脲，4％CHAPS，20mM Tris，0.002％溴酚兰)。对2D凝胶而言，在上样之前将DTT加至6mg/ml，将IPG缓冲液(pH3-10：Amersham Biosciences)加至0.5％。将18cm的Immobiline干条(pH3-10：Amersham)在样本中在20℃过夜再水化。然后在15℃在65,000Vh对样本进行聚集。聚集之后，将所述条在EB+10mg/ml DTT中平衡15分钟，然后在EB+25mg/ml碘乙酰胺中平衡15分钟(EB是50mM Tris，6M尿素，30％甘油，2％SDS，pH8.8)。使用0.5％琼脂糖，在SDS-PAGE电泳缓冲液+0.002％溴酚兰中，将平衡的条封入大块SDS-PAGE凝胶(12％或14％丙烯酰胺)的顶部，并将所述凝胶电泳至所述染料前端跑出所述凝胶。
按照制造商的指导(BioRad)，用Sypro Ruby对凝胶染色，在UV看片灯上进行观察，或通过MS/配备有Nanoflow液相层析系统(LCPacking-Dionex)的LCQ Deca离子捕获质谱(Thermo Finnigan)的MS进行观察。对在UV看片灯上对凝胶进行观察，可对感兴趣的点进行手工剪切。根据说明书(23)，在Investigator ProGest Robot(Genomic Solution，安阿伯，密歇根州)上进行蛋白的凝胶内消化。用配备有FAMOS自动采样器(LC Packings-Dionex，圣弗朗西斯科，加利福尼亚州)的Nanoflow液相层析系统，和LCQ Deca离子捕获质谱(Thermo Finnigan，圣何塞，加利福尼亚州)(24)组成的LC-MS系统对高蛋白丰度的样本进行分析。
使用反相PicoFrit柱PFC7515-PP 18-5(New Objective，Woburn，马萨诸塞州，美国)进行多肽分离，并将所述柱流出物直接喷射到质谱仪中。使用200nL/分钟的流速，每个样本的总收集时间都为45分钟。
用API QSTAR Pulsar混合MS/配有Nanospray离子源(Proxeon，Odense，丹麦)的MS质谱仪(Applied Biosystems/MDS SCIEX，Concord，加拿大)(12)对低蛋白丰度的样本进行分析。在分析之前，在ZipTips(Millipore，Billerica，马萨诸塞州)上对样本进行纯化和浓缩。APIQSTAR Pulsar还可用于从头开始的多肽测序。
使用Mascot(Matrixscience)或Sonar(Proteometrics Canada Ltd)搜索引擎将所得谱在NCBI(Nethesda，马里兰州)数据库中进行搜索。
cat转录融合的构建和CAT分析
将带有所述启动子和所有Citrobacter ler(LEE1)和tir(LEE5)上游调控元件的PCR片段用Bam HI和Hind III消化，并克隆至含有无启动子cat基因的质粒pKK232-8。通过所述克隆片段跨越的位置如上所述。可根据以上描述对不同Citrobacter菌株中的这些融合蛋白指导的CAT活性进行测定(21，22)。如上所述，在不同时间点从生长于DMEM中的细菌培养物中收集样本。
序列分析和生物信息学工具
通过BLASTN，TBLASTN和BLASTP进行的DNA和蛋白序列分析与同源性搜索是使用来自NCBI网站(http://www.ncbi.nih.org/)获得的程序完成的。所使用的数据库包括NCBI网站，桑格基因组中心(http://www.sanger.ac.uk/Projects/Microbes)和SwissPort(http://www.expasy.org/sprot/)。可通过IslandPath程序(http://www.pathogenomics.sfu.ca/islandpath/)产生的数据获得LEE PAI的位置和EHEC基因组中原噬菌体的位置(13)。
Southern杂交分析
使用DNeasy组织试剂盒(Qiagen)制备用于Southern杂交分析的基因组DNA样本。通过用SalI和BglII酶消化得到500bp的片段，并使用BrightStar Psoralen-生物素非同位素标记试剂盒(Ambion)对其进行标记及制备了探针。
用25单位BamHI，EcoRI和PstI对5微克每个基因组DNA样本完全消化。用1％琼脂糖凝胶将所述样本分离，并通过被动地、轻微的碱性向下洗脱将其过夜转移至BrightStar-Plus尼龙膜上(Ambion)。通过暴露于UV光2分钟，然后在80℃烘烤30分钟，对所述DNA交联于所述膜。
通过在10ml ULTRAhyb超敏感杂交缓冲液中(Ambion)在42℃洗涤30分钟对所述膜进行预杂交。然后向缓冲液中的预杂交膜中加入10微升制备好的探针，将所述探针与所述膜在42℃杂交过夜。将所述膜在室温在低严谨洗涤缓冲液中(Ambion)洗涤2次，每次5分钟，然后在高严谨洗涤缓冲液中(Ambion)洗涤2次，每次15分钟。使用BrightStar BioDetect非同位素检测试剂盒(Ambion)，然后曝光于Kodak胶片对杂交探针进行测定。
抗-NleA抗血清的产生
使用以下引物：5′TTCCATATGAACATTCAACCGACC(SEQ IDNO：54)和5′GGAATTCAATAATAGCTGCCATCC(SEQ ID NO：55)将nleA的编码部分从EHEC基因组DNA中扩增出来，并克隆至his标记的表达载体(pET28a，Novagen)上。将该质粒导入BL21(λDE3)，生长至光密度(A600)为0.8，并用0.5mM IPTG在20℃诱导16小时。按照制造商的指导(Qiagen)，将His标记的蛋白在Ni-NTA柱子中进行纯化。将含有NleA的组分合并，并加入凝血酶(500∶1)，将所述蛋白在20mM tris pH8.2和50mM NaCl中透析过夜。次日，将所述蛋白上样于monoQ FPLC柱，并使用50-500mM线性梯度的NaCl对其进行发展。将含有NleA的组分合并。这一步骤完成之后所述蛋白的纯度＞90％。使用氟氏完全佐剂(Sigma)，将纯化的蛋白用来免疫两只雄性Sprague Dawley大鼠，300μg蛋白/只，按照制造商指南(BioRad)使用活化的免疫亲和支持Affi-Gel 15对所产生的抗血清进行亲和纯化。对免疫荧光试验而言，可通过用由HeLa细胞和由EHEC.NleA制备的丙酮粉末进行吸收进一步纯化所述抗血清，如参考文献45所示。可通过对来自野生型EHEC和EHEC.NleA的细胞提取物进行Western杂交确定抗血清的特异性。
免疫杂交分析
将用于Western杂交分析的样本通过SDS-PAGE(9％-12％丙烯酰胺)进行分离。将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，并用含5％无脂奶粉(NFDM)的pH 7.2、含有0.1％Tween20的TBS(TBST)，在4℃对免疫杂交封闭过夜，然后用溶于1％NFDM TBST的第一抗体在室温(RT)孵育1小时。将所述膜在TBST中洗涤6次，然后与1∶5000稀释的辣根过氧化酶轭合的山羊抗小鼠(H+L)抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.)在RT孵育1小时。使用化学发光检测试剂盒(Amersham)，然后通过曝光于Kodak胶片(Perkin Elmer)可看到抗原-抗体复合物。使用了以下的第一抗体：抗-HA.11(Covance)，抗-DnaK(Stressgen)，抗-EHEC Tir，抗-NleA(本研究)，抗-钙联接蛋白(Stressgen)，抗-钙网织蛋白(Affinity Bioregeants)，抗-微管蛋白(Sigma)。
免疫荧光
将HeLa细胞生长于24孔组织培养版中的玻璃盖玻片上，并用1μl(EHEC)OD约为0.4的静置过夜培养物感染6小时。在感染后6小时，用含有Ca2+和Mg2+的PBS洗涤3次细胞，并在室温用含有2.5％多聚甲醛的PBS固定15分钟。用含有0.1％皂角苷的PBS对细胞进行通透处理，用含有5％山羊血清或5％BSA的PBS+0.1％皂角苷进行封闭，并在室温与以下稀释于封闭液中的第一抗体孵育1小时：抗-EHEC Tir，1∶1000；抗-E.coli O157(Difco)，1∶200；亲和纯化的大鼠多克隆抗-NleA(本研究)，1∶100；抗-甘露糖苷酶II(由Marilyn Farquhar博士惠赠，UCSD)，1∶1000。在PBS/皂角苷中洗涤3次之后，将细胞与第二抗体(Alexa-488或-568-轭合的抗小鼠、兔子、大鼠(Molecular Probes)1∶400)在室温孵育30分钟，用PBS/皂角苷中洗涤3次，用PBS洗1次，使用mowiol+DABCO将其加载在玻璃载玻片上。为了能够看到聚合的肌动蛋白，Alexa-488轭合的鬼笔环肽(Molecular Probes)中包括了以1∶100稀释的第二抗体。当需要时，将细胞与5μg/ml布雷菲德菌素A(Borhringer Mannheim)在固定前孵育30分钟。使用Zeiss Axioskop显微镜对图像进行检测，使用Empix DVC 1300数码相机进行拍摄，使用Northern Eclipase图像软件进行分析，或在BioRad Radiance Plus共聚焦显微镜上用Lasersharp软件进行检测。
感染宿主细胞的组分分离
对每个样本而言，使用1∶10的初始MOI，用野生型EHEC-pNleA-HA或EHECescN-pNleA-HA感染两个汇合的100mm培养皿HeLa细胞。在感染后6小时，用冰预冷的PBS将所述细胞洗涤三次，并使用之前所述的方法进行生物化学组分分离(30，49)。简言之，用300μL添加了COPLETE蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的匀浆缓冲液(3mM咪唑，250mM蔗糖，0.5mM EDTA，pH7.4)重悬所述细胞，并机械性地通过22-G针头进行破坏。在4℃以低速(3000g)对所述匀浆离心15分钟沉淀未破损的细胞、细菌、细胞核和细胞骨架成分(低速沉淀)。将上清液在4℃在TLS55转头在TL100离心机(Beckman)中高速超速离心(41,000g)20分钟，从而将宿主细胞膜(沉淀)和胞质(上清液)分离。将所述沉淀重悬于300μL 1Xlaemmli缓冲液，使用5X储存液将所述上清制备成1X laemmli缓冲液。将等体积的所有组分通过SDS-PAGE(9％丙烯酰胺)分离，并转移至硝酸纤维素膜进行Western杂交。
对与NleA结合的膜的提取研究而言，使用上述的分离条件将两个100mm培养皿的感染的HeLa细胞进行各个提取条件的组分分离。将高速沉淀(宿主膜组分)重悬于300μL以下提取缓冲液中：(i)10mM Tris，5mM MgCl2，pH 7.4；(ii)10mM Tris，5mM MgCl2，1M NaCl，pH 7.4；(iii)0.2M NaHCO3，5mM MgCl2，pH 11.4；(iv)10mM Tris，5mM MgCl2，1％Triton X-100pH7.4。在冰上，通过将所述样本每5分钟吸上落下一次进行30分钟，并将所述样本在100,000g重新离心30分钟。将所述沉淀(不溶性组成)重悬于300μL laemmli缓冲液，将上清液(可溶性组分)在冰上用10％三氯乙酸沉淀30分钟，用100％丙酮洗涤，并重悬于300μL laemmli缓冲液。将等体积的样本通过SDS-PAGE(9％丙烯酰胺)分离，并转移至硝酸纤维素膜进行Western杂交。
小鼠中C.rodentium的感染分析
按照由英属哥伦比亚大学动物福利委员会和加拿大实验动物使用委员会提出的指导准则，将5周龄的C3H/HeJ小鼠(Jackson Laboratory)和远交的NIH Swiss小鼠(Harlan Sprague-Dawley)饲养于英属哥伦比亚大学的动物房内。将过夜生长于200rpm摇床上的100μL的LB培养基中的野生型C.rodentium和nleA缺失突变体通过口胃管感染小鼠。通过连续稀释和涂布滴定接种量，对每一组的计算量为4×108cfu/小鼠。对用C.rodentium感染的高易感性C3H/HeJ小鼠而言，在感染后的每天都要测定所述感染小鼠的存活情况。一旦任一小鼠表现出濒死状况，就将其立刻处死。使用NIH Swiss小鼠进行细菌毒力分析，将动物在感染后10天处死。为了对结肠增生进行评价，收集起始自肛外缘的头4cm的远端结肠，并在去除了所有粪便之后进行称重。为了对细菌集群进行分析，使用Polytron组织匀浆器在PBS中将结肠组织和粪便进行匀浆，并在涂布于MacConkey琼脂(Difco Laboratories)之间进行连续稀释。将结肠组织和粪便合并来确定在处死时所述小鼠结肠中的总细菌负载。MacConkey琼脂对革兰氏阴性细菌是具有选择性的，在其上，C.rodentium形成了具有区别性的且与典型E.coli不同的可鉴定形态学的菌落(26)。为了进行组织学分析，将所感染小鼠的最后0.5cm结肠固定于10％的中性缓冲的福尔马林中，进行处理，切成3μm切片，并用苏木精和曙红染色。组织学分析是在英属哥伦比亚大学的病理学与实验医学系的形态学服务实验室中完成的。
实施例2
对LEE基因表达调控的分析
为了研究是LEE中的哪个基因对C.rodentium中的LEE表达进行调控，我们对表达EspB和Tir的LEE突变体进行了分析，所述突变体是分别由LEE4和LEE5(Tir)操纵子编码的。使用抗-Tir和抗-EspB血清，对生长于DMEM中的细菌的总细胞裂解物进行了Western杂交分析。我们的结果证实了Ler在LEE表达中的关键作用，因为在Δler中不产生Tir和EspB。正如所期望的那样，Δtir和ΔespB也并不产生Tir和EspB。在ΔcesT中未观察到Tir，这与CesT作为Tir稳定性和分泌的分子伴侣的作用一致(18，19)。令人惊奇的是，其他LEE编码的蛋白，Orf11，也是Tir和EspB表达所必需的。Tir和EspB在Δorf11中的表达通过仅带有Citrobacter orf11的质粒互补(图8)。orf11基因在A/E病原体中是高度保守的，且EHEC和EPCE orf11都与Citrobacter Δorf11互补(图8)，说明Orf11与A/E病原体中LEE基因表达的正调控是功能相当的。
序列分析说明Orf11/GrlA与CaiF具有23％一致性，CaiF是肠杆菌科的cai和fix操纵子的转录激活子，并与由位于std伞毛操纵子下游的基因编码的未表征沙门氏菌产物的推测的氨基酸序列具有37％一致性(16)(图7)。这一沙门氏菌同源物在图中用SGH(Salmonella GrlAHomologue)表示。所有这三种蛋白都含有DNA结合蛋白的特征性的预测的螺旋-转角-螺旋基序。
为了研究Orf11和Ler在调节LEE基因表达中的层次，我们构建了C.rodentium的ler和orf11双突变体。尽管可通过反式表达Ler部分的恢复ΔlerΔorf11中Tir和EspB的表达，而类似地表达Orf11则没有这样的效果(图8)，说明Orf11在调控级联中在Ler上游起作用。通过说明Citrobacter ler启动子类似于EPECler，且其表达在Δorf11中有所降低，引物扩增分析确证了这样的调控层次。
在生长于DMEM培养基中6小时的Citrobacter WT，Δler和Δorf11菌株中，通过监测在LEE1(Ler)(pLEE1-CAT)或LEE5(Tir)(pLEE5-CAT)操纵子以及cat报告基因之间调控区域的转录融合的活性对Orf11在ler表达中的调控作用进行了进一步的证明。在Δorf11中LEE1-cat融合的活性有所降低，而在Δler和Δorf11中，LEE5-cat融合的活性则急剧降低。这些结果说明Orf11是Ler表达的新的阳性调节基因，其随后协助了其他LEE操纵子的表达。因为Orf11在所述调控级联中在Ler的上游发挥作用，所以将其命名为GrlA(对LEE-激活子的全部调节剂而言)。
实施例3
LEE编码的TTSS分泌的效应物的鉴定
A.E病原体向组织培养基或基本培养基中分泌了若干种蛋白，但所分泌的蛋白主要是易位子EspA、EspB和EspD。通过TCA对生长于DMEM中的细菌上清液进行沉淀，对分泌的蛋白进行了浓缩，并采用12％SDS-PAGE，然后用考马斯亮蓝染色进行分析。与WT菌株相比，含有orf11.grlA质粒的C.rodentium分泌了至少300％的EspA、EspB和EspD。
为了对由Citrobacter LEE编码的效应物进行定义，我们用双血凝素(2HA)抗原决定簇在羧基末端对不涉及TTS和宿主细胞附着的多种LEE-编码的蛋白进行了标记，并分析了其在WT和C.rodentium中的分泌情况。在C.rodentium中，只有Tir、EspG、EspF、EspH和Map是LEE-编码的TTSS分泌的，说明LEE仅编码5种效应物。可通过考马斯染色在具有Tir分泌大幅提高的突变体中方便地测定出之前未识别的54kDa蛋白(p54)，说明其代表了在LEE之外编码的的新的推测的效应物。
为了鉴定p54和测定是否在C.rodentium的LEE之外还有其他编码的效应物，我们利用GrlA能提高LEE基因表达和/或III型分泌的能力，将grlA质粒引入分泌效应物而不是易位子的突变体中。GrlA的过量表达极大地增强(超过400％)了Tir在这些突变体中的分泌，同时未分泌出易位子。观察到了至少6种其他的分泌蛋白，说明LEE-编码的TTSS可分泌若干其他非LEE-编码的蛋白。
为了鉴定这些蛋白，通过2-D凝胶对所述分泌蛋白进行分析。因为一些LEE-编码的效应物(EspF，EspH和Map)具有预测的碱性pI值，且EspF具有11.00的极高pI值，所以这些分泌蛋白被首先聚集于具有酸性(pH 3-10)和碱性(pH 6-11)梯度的Immobiline干条上，然后分别用12％和14％的SDS-PAGE解析。用Sypro Ruby对凝胶进行染色，将所选定的蛋白点手工剪切，并通过质谱和从头多肽测序进行分析。
这样的分析确证了LEE-编码的Tir、EspF、EspG、EspH和Map都是III型分泌的(表2)。
表2在C.rodentium中由LEE-编码的TTSS分泌的效应物和推测的效应物
 编号   建议  名称   估计的  MW   估计  的pI   基因位  置   在EHEC和其他病原体中的同源物  5   Tir   68   5.0   LEE   Tir，在所有A/E病原体中保守。  10   EspG   44   7.3   LEE   EspG，在所有A/E病原体中保守。  C1&C2   Map   23   9.0   LEE   Map，在所有A/E病原体中保守。  C3   EspF   31   11.0   LEE   EspF，在所有A/E病原体中保守。  C5&C6   EspH   21   8.7   LEE   EspH，在所有A/E病原体中保守。  7   NleA   54   5.8   非LEE   EHEC Z6024在靠近原噬菌体CP-933P  的O-岛71中  12   NleB   39   5.9   非LEE   EHEC Z4328在O-岛122、REPEC LEE-  结合的RorfE和S.typhimurium STMF1  中。还同源于O-岛36的Z0985。  13   NleC   40   4.6   非LEE   EHEC Z0986在靠近原噬菌体  CP-933K的O-岛36中。   14   NleD   28   7.1   非LEE   EHEC Z0990在与Z0985和Z0986在相  同的O-岛36中。还与P.syringae pv.  番茄效应物HopPtoH具有相似性。   17   NleE   27   6.3   非LEE   EHEC Z4329在与Z4328相同的O-岛  122，REPEC LEE-相连的RorfD，和  S.flexneri ORF122。   19   NleF   24   4.7   非LEE   EHEC Z6020，在与Z6024在相同的  O-岛71中。与鼠疫耶氏菌(Yersinia  pestis)和幽门螺旋杆菌(Helicobacter  pylori)的推测蛋白具有一定的相似性。
 编号   建议  名称   估计的  MW   估计  的pI   基因位  置   在EHEC和其他病原体中的同源物   20   NleG   26   5.8   非LEE   鉴定的多肽序列为：  QQENAPSS(I/L)QTR。在数据库中未  发现同源物。

除了所述五种LEE-编码的效应物，我们还鉴定了7种非LEE-编码的类似效应物的分泌蛋白。这些由LEE以外编码的分析蛋白因此被指定为NleA(p54)、NleB、NleC、NleD、NleE、NleF和NleG(QQENAPSS(I/L)QTR；SEQ ID NO：59)(对非LEE编码的效应物而言)，从而将其与LEE编码的分泌蛋白/效应物(Esp)区别开来(表2)。在这7种鉴定的蛋白中，只有NleG是C.rodentium唯一的，其他6种蛋白在EHEC O157中都具有高度的保守同源物(表2)。所述EHEC的同源物是由基因组中集簇在3个不同区域的基因编码的，每个区域编码至少与C.rodentium分泌蛋白同源的两种蛋白(表2)。编码NleA和NleF同源物的基因Z6024和Z6020位于与原噬菌体CP-933P相连的EHEC的O-岛71。类似地，编码NleB和NleE同源物的基因Z4328和Z4329位于O-岛122，而编码NleC和NleD同源物(Z0986和Z0990)的基因则位于O-岛36(表2，图9)。此外，Z4328(O-岛122)与Z0985具有极高的同源性，Z0985是O-岛36中与Z0986相邻的基因。
所有6种新EHEC效应物基因的同源物在EPEC中都有出现并具有类似的组织方式，EPEC的基因组已被测序(http://www.sanger.ac.uk/Projects/Microbes/)。除了Z6024，其表现出与EPEC基因的89％核苷酸一致性，其他5种EHEC基因都表现出与其在EPEC中同源物至少95％的一致性。而且，这些效应物中的一些在其他致病性细菌中也是高度保守的。NleD/Z0990具有与P.syringae pv.番茄的III型效应物HopPtoH具有相似性(41，42)。NleE/Z4329与兔子EPEC(REPEC)的RorfD和S.flexneri的Orf212具有显著的同源性(8，33)，而NleB/Z4328则与REPEC的RorfE和两种推测的S.typhimurium蛋白具有显著的同源性。Z4328和Z4329基因在EHEC中位置相连，类似于REPEC中rorfD和rorfE的基因排列(8)。然而，在REPEC中rorfD和rorfE紧邻于LEE，而其在EHEC中的对应物则存在于远离LEE的区域(O-岛122)。携带有Z4328和Z4329的EHEC O-岛122还包含编码两种细胞毒素和PagC同源物的基因，一种S.enterica中重要的PhoP/PhoQ调控的毒力因子(3，43)。编码这些新效应物的EHEC中的3个O-岛具有二核苷酸倾向和较低的GC％含量，即PAI的标志(9)。此外，它们或者与原噬菌体相连，或者通过移动插入序列侧翼于原噬菌体，且并不出现与非致病性E.coli的基因组中(3)，说明了这些基因的水平转移。综上，这说明了这些岛和新鉴定的Citrobacter以及EHEC效应物在毒力中的重要性。还说明由于它们之间各有差异，相关的病原体保持了惊人的保守性PAI组合，尽管PAI的位置在细菌染色体中是变化的。
实施例4
NleA的鉴定
尽管III型分泌一般认为是接触依赖性的(46)，但确定的体外培养条件也可在液体培养生长的过程中诱导EHEC将III型效应物分泌至细胞外培养基中(28，51)。从野生型EHEC(wt)中制备了培养物上清液，并在III型分泌诱导条件下产生了III型分泌突变体(escN-)。通过SDS-PAGE对所述分泌蛋白的分析得到了与来自野生型和escN-样本的分泌蛋白类似的一种丰富的高分子量蛋白，而只有野生型样本存在的其它几种丰富的蛋白(图10A)。将所分泌的蛋白通过2维凝胶电泳分离，将足量的分离蛋白点从所述凝胶上剪切下来并通过质谱进行分析(图10B，表I)。
表I
  点编号   ID   e值  多肽的#   预测的  mw(kDa)   实验的  mw(kDa)   预测的pI   实验的pI   1   EspP   5.60E-4  4   105   95   5.9   6.5   2a   Tir   2.50E-39  14   58   68   5   5   2b   Tir   2.10E-29  10   58   65   5   4.8   3   NleA   7.70E-11  6   48   50   5   5   4a   EspB   8.60E-53  19   33   38   5.1   5.2   4b   EspB   2.00E-06  2   33   38   5.1   5.1   5   EspA   1.30E-37  16   21   18   4.8   5
在野生型和escN-培养物上清液中出现的#1号点被鉴定为EspP，其是由不依赖于III型分泌的自动运输机制分泌出的EHEC的质粒编码蛋白(25)。四种主要的点(#2，3，4，5)是野生型上清液唯一存在的。其中的三个点被鉴定为公知的LEE中编码的III型分泌蛋白：Tir(#2号点)、EspB(#4号点)和EspA(#5号点)(图10B，表I)。经过鉴定，#3号点是由EHEC基因组内LEE之外的开放阅读框编码的预测分子量为48kDa的蛋白(图10C)。我们将该蛋白称为NleA，即非LEE编码的效应物A。
实施例5
含有nleA座位的表征
nleA基因是在O-岛内编码的，O-岛是非致病性E.coli菌株K-12基因组中不存在的EHEC基因组部分(3)。在E.coli K-12骨架中保守的最后一个基因(YciE)和编码噬菌体结构蛋白的基因之间的区域中包含有几个推测性的转座酶片段和一个推测性的位点特异性重组酶片段(图11A)。使用Ispandpath，其为鉴定PAI而设计的程序对该区域进行分析(13)，说明在该区域内的所有ORF都具有二核苷酸倾向和与EHEC基因组平均值不同的GC含量。该区域内有10个ORF的GC含量比所述EHEC基因组的平均值低至少一个标准差，而6个ORF中的2个则具有比所述EHEC基因组的平均值高至少一个标准差的GC含量。综上，这些结果说明nleA基因归属于含有PAI的水平转移基因。该区域内的几个其他ORF都具有说明其在发挥毒力作用中的特征，包括推测性的分子伴侣(Z2565)和两种与其他病原体的III型分泌蛋白类似的蛋白(Z6021，Z6020)。
为了对nleA基因的本质和分布进行深入研究，制备了nleA探针并对来自其他A/E病原体和非致病性E.coli菌株的基因组DNA板进行了Southern杂交。如图11B所示，nleA基因存在于所有检测的A/E病原体中，但不存在于非致病性E.coli中。对进程中的EPEC基因组序列的分析表明，nleA存在于所述EPEC基因组中噬菌体插入位点的近端。nleA还存在于紧密粘附素阳性原噬菌体、非O157EHEC菌株、O84:H4内，而不存在于非致病性的E.coli菌株和不含有LEE的尿道致病E.coli中。nleA也不存在于其他含有TTSS的病原体中，例如沙门氏菌属和志贺氏菌属中。因此，nleA是A/E病原体特异性获得的或保留的。对来自C.rodentium，EPEC，EHEC和O84:H4的nleA基因序列的多重序列比对说明了在这四种A/E病原体中较高程度的序列保守性(图11C)。
实施例6
NleA是通过LEE编码的III型分泌系统分泌的
迄今为止描述的LEE编码的TTSS的EHEC和EPEC效应物都是在靠近编码分泌元件本身的基因近端、在LEE之内编码的。为了测定NleA的分泌是否依赖于LEE编码的TTSS的，在野生型EHEC和缺乏III型分泌的escN-菌株的质粒中表达了抗原决定簇标记的NleA(47)。如图12A所示，尽管在野生型和escN-EHEC中HA-标记的NleA的表达水平类似，但只有NleA-HA-转化的野生型细菌的蛋白分泌到了细胞外培养基中。可使用非分泌的细菌蛋白，DnaK，作为在分泌蛋白样本中缺乏非分泌蛋白的对照(图12B)。未转化的和NleA-HA-转化的野生型菌株中分泌Tir，但escN-菌株不分泌(图12C)，证实了所期望的TTSS表型。在野生型EHEC和几种EPEC的III型分泌突变体中也观察到了抗原决定簇标记的NleA表达的类似结果，说明NleA也可通过EPEC TTSS分泌。
实施例7
NleA被易位入宿主细胞中
当EHEC生长于III型分泌诱导条件下时，有两种蛋白分泌到了细胞外培养基中。为了测定NleA是否是易位体或易位效应物，我们通过产生缺失突变菌株研究了在缺乏NleA条件下的III型分泌和易位。分析了来自野生型和ΔnleA突变体EHEC菌株的分泌蛋白谱。野生型样本中含有ΔnleA分泌蛋白中没有的约50kDa的丰富的蛋白(图13A)。用针对NleA的抗血清进行Western杂交证明了野生型分泌蛋白样本中存在有50kDa的NleA，而不存在于ΔnleA样本(图13B)。然而，无论存在或不存在NleA，野生型和ΔnleA菌株的分泌蛋白谱都是一致的(图13A)。因此，并不需要NleA来分析其他III型分泌效应物。为了测定是否需要NleA来完成其他III型效应物进入宿主细胞的易位，使用野生型EHEC和EHEC ΔnleA感染了HeLa细胞，并通过对感染细胞进行免疫荧光染色监测Tir的易位和功能。通过将感染的细胞进行抗-EHEC和抗-Tir抗体的免疫荧光，并用毒伞素使纤维状肌动蛋白成为可见，对野生型EHEC和ΔnleA突变体的基架形成进行了测定。所述结果说明EHEC ΔnleA附着于HeLa细胞的水平与野生型EHEC相当。免疫荧光染色说明Tir易位进入了宿主细胞，并集中在感染的野生型和ΔnleA EHEC菌株的细菌下。为了确证功能性的Tir易位，用荧光毒伞素对感染的细胞进行染色，从而使得在附着细菌之下涉及基架形成中的聚合的肌动蛋白成为可见。在感染了野生型或ΔnleAEHEC的细胞中出现的肌动蛋白基架，说明了可在缺乏NleA的情况下实施其他III型效应物的易位和功能。这些结果也说明不需要NleA来完成基架形成。
由于NleA并未表现出在其他效应物的分泌和易位中具有作用，我们需要研究是否NleA会自我易位。用野生型EHEC或表达HA-标记的NleA的escN-EHEC感染HeLa细胞6小时，将其用于亚细胞组分分离，并用抗-HA抗体进行Western杂交分析。如图14A所示，NleA易位进入宿主细胞，在那里其与宿主细胞膜组分相结合。在使用表达HA-标记的NleA的III型分泌突变体感染细胞的过程中未观察到NleA的易位，说明NleA易位与宿主膜结合是TTSS依赖的。使用与每种组分的特异性蛋白结合的抗体对所述组分进行的Western杂交确证了不存在所述组分的交叉污染。钙联接蛋白，一种宿主细胞整合的膜蛋白，并不存在于宿主细胞质组分中；微管蛋白，一种宿主细胞细胞质蛋白，也不存在于宿主膜组分中。DnaK，一种非分泌的细菌蛋白，仅存在于低速沉淀中，说明没有宿主细胞膜和胞质组分的细菌污染。由于EHEC附着的III型依赖性，NleA和DnaK都不存在于III型突变体感染细胞的低速沉淀中。为了对因EHEC附着的III型依赖性而产生的III型突变体感染样本中的NleA人工缺乏进行控制，我们还用野生型或III型突变体EPEC进行了类似实验来表达和传递NleA-HA，因为EPEC对HeLa细胞的附着是不依赖于III型分泌的。NleA存在于用野生型感染，而不存在于用III型突变体EPEC菌株的细胞感染的膜组分中。NleA和DnaK存在于野生型和III型突变体EPEC感染细胞的低速沉淀中。
为了研究NleA与宿主细胞膜结合的本质，在冰上，在若干条件下可对含有HA-标记的NleA的感染的宿主细胞膜组分进行提取，并离心从而获得可溶性和不溶性的膜组分(图14B)。将这些组分使用抗-HA抗体的Western杂交分析来测定HA-标记的NleA。用高盐(1M NaCl)或碱性pH(0.2M Na2CO3，pH 11.4)处理分别去除通过静电或亲水相互作用的与外周膜结合的蛋白。NleA与宿主细胞膜的结合可以抵抗这些处理的破坏(图14B，顶部嵌图)，钙联接蛋白，一种整合膜蛋白也如此(图14B，中部嵌图)。相反，可在高盐和碱性处理中从所述膜组分中提取出大部分的钙网织蛋白，其是一种外周膜蛋白(图14B，底部嵌图)。用溶解诸如钙联接蛋白的整合膜蛋白的非离子去污剂Triton X-100对膜组分进行处理(图14B，中图)，几乎完全的溶解了NleA，导致了所述HA-标记的NleA蛋白从不溶组分迁移到了可溶组分(图14B，顶部嵌图)。这些结果说明NleA易位进入宿主细胞，在那里其可作为整合的膜蛋白。实际上，通过若干跨膜结构域预测程序对所述NleA蛋白序列的分析在该序列中预测出了一个或两个推断性的跨膜结构域(图11C)。
实施例8
NleA定位于宿主的高尔基体
随后测定了宿主细胞内NleA的亚细胞定位。用野生型EHEC或EHEC ΔnleA感染HeLa细胞，并用针对于NleA和甘露糖苷酶II的抗体进行免疫荧光。在固定前，可用布雷菲德菌素A对某些样本处理30分钟。采用NleA和甘露糖苷酶II染色的双色覆盖法。用编码GFP-NleA融合蛋白的表达构建体转染HeLa细胞，并使用针对甘露糖苷酶II的抗体进行免疫荧光。
使用抗-NleA抗体，对野生型EHEC感染的HeLa细胞进行免疫荧光染色，得到了在用EHEC ΔnleA感染的细胞或未感染细胞中都没有的核周染色图谱。这样的图谱并不类似于用适于晚期内涵体、溶酶体、内质网、线粒体或细胞核的标记得到的染色。然而，当用抗-NleA和针对高尔基体，包括甘露糖苷酶II的标记的抗体对细胞进行共染色时，得到了非常类似的染色图谱，其中所述两种蛋白的共定位相当广泛。为了确证NleA定位于高尔基体，在固定前，将感染的细胞与破坏高尔基体结构的真菌代谢物布雷菲德菌素A孵育(27)，并进行免疫荧光。正如对高尔基体定位的蛋白所期望的那样，布雷菲德菌素A处理导致了甘露糖苷酶II和NleA染色的扩散。观察到了NleA与几种其它高尔基体标记的共定位，而在使用HA和FLAG抗原决定簇标记的抗-标记抗体，对测定抗原决定簇标记的NleA染色进行的实验中也观察到了高尔基体的定位。为了测定NleA定位于高尔基体是否还需要其它的细菌因子还是NleA的固有性质，用编码GFP-NleA融合蛋白的表达构建体对细胞进行了转染。转染的NleAGFP同样定位于高尔基体，其在那里与甘露糖苷酶II的染色重叠。
因此，我们的结果说明NleA定位于高尔基体。所观察到的转化的GFP-NleA融合蛋白定位于高尔基体说明，NleA蛋白含有高尔基体靶位信息，而不需要其它细菌因子来达到这一目的地。细菌传递的NleA也是高尔基体定位的。
实施例9
NleA是毒力必需的
在A/E病原体中NleA的高度序列保守性(图11C)说明NleA在感染中具有类似作用。C.rodentium是小鼠的天然病原体(53)，并本用作研究A/E发病机理的模型系统。在易感菌株中，C.rodentium感染是致命的，并通常在感染的6-10天导致感染小鼠的死亡(54)。更具有抗性的小鼠品系并不会由于C.rodentium感染而死亡，但会变成寄居的并发展成肠炎症和结肠增生(54)。
为了测定NleA在毒力中的作用，我们构建了nleA-缺失的C.rodentium菌株，并通过用NleA抗血清对总细菌提取物进行Western杂交证明了不存在NleA(图16A)。通过口胃管用等量的野生型或ΔnleA细菌感染小鼠。在C.rodentium-易感性C3H-HeJ小鼠中，NleA是毒力必需的。所有感染了野生型C.rodentium的C3H-HeJ小鼠(n＝9)在感染的6-10天后全部死亡，而所有ΔnleA-感染的小鼠(n＝13)则表现出一些较轻的疾病症状，例如软便，但依然在增重，且在整个感染过程中都比较活跃，并具有无限定的成活率(图16B)。而且，所述ΔnleA-感染的小鼠能够抵抗随后用野生型C.rodentium进行的刺激(n＝5，图16B)。因此，尽管ΔnleA菌株在易感小鼠中是非致病性的，但其也足以与宿主相互作用从而刺激保护性免疫。
与C3H-HeJ小鼠相反，C.rodentium感染对远交的NIH Swiss小鼠并不是致命的。在这些小鼠中，在大肠的C.rodentium寄居导致了肠炎症，结肠增生和轻微的腹泻症状。用野生型C.rodentium或ΔnleA菌株感染NIH Swiss小鼠，并在感染后10天处死。在第10天，用ΔnleA菌株感染的小鼠，平均比用C.rodentium感染的小鼠在结肠中的滴度低20倍(图16C)。
通过用野生型C.rodentium或ΔnleA菌株感染，并在感染后10天处死动物，对感染的NIH Swiss小鼠的结肠进行了组织学分析。将所感染小鼠的最后0.5cm结肠固定于10％的中性缓冲的福尔马林中，进行处理，切成3μm切片，并用苏木精和曙红染色。使用5X和63X物镜对所有小鼠的组织切片进行观察和照相。其结果说明，在来自感染小鼠肛外缘的的活组织切片检查组织学分析中，在野生型感染的组织中可见无数的细菌，而在ΔnleA感染的样本中细菌数要稀少的多。所有感染了野生型C.rodentium的动物都表现出结肠增生的病理信号，而所有ΔnleA感染的小鼠都没有增生的信号。所述野生型感染的样本表现出了严重的炎症和增生，其程度达到了肠腔不再明显，且外肌肉层可见扩张，从而容纳体积增大的上皮细胞。相反，ΔnleA感染的样本却表现出相对正常的组织学。在两组小鼠中，还观察到了在处死时的结肠重量的不同，以及肠炎症和增生的相对程度的不同(图16D)。正如脾重量所反映出的，野生型感染的小鼠具有比ΔnleA感染的小鼠增大的脾(图16D)。
因此，我们证明了NleA在小鼠疾病模型中对毒力的重要影响。在易感小鼠中，在C.rodentium中功能性NleA的存在可在10天之内导致致命感染。感染了缺乏NleA菌株的小鼠几乎没有症状并在感染后具有无限定的存活。在更有抗性的小鼠品系中，C.rodentium感染是不致命的，NleA是结肠增生的发展所必需的，且在感染第10天时，在宿主肠道中出现了较少的nleA突变体细菌。这些研究说明了NleA在C.rodentium的毒力中具有明显的作用。我们来自HeLa细胞EHEC感染的结果证明，在体外，NleA并不影响细菌对宿主细胞的附着或者是其他效应物的易位，这说明NleA可在抵抗宿主清除的水平上具有作用，而不是提高细菌的附着。此外，ΔnleA感染的小鼠对随后用野生型C.rodentium刺激的抵抗也证明，nle突变体菌株寄居于宿主和与宿主的相互作用足以刺激宿主的免疫。这与C.rodentium的III型突变体相反，其并不寄居于宿主，也并会为随后的刺激提供保护。因此，ΔnleA突变体菌株可用作弱化的疫苗菌株。
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其他实施方案
尽管在此已公开了本发明的多种实施方案，但本领域所属技术人员仍可根据常用一般知识在本发明范围内进行多种改变和修改。这些修改包括用基本上相同的方法为达到本发明相同结果的本发明任意方面的公知等价替换。正如在此使用的登录号，涉及多种数据库的登录号，包括GenBank、欧洲分子生物学实验室(EMBL)、日本的DNA数据库(DDBJ)、或核苷酸序列的基因组序列数据中心(GSDB)，还包括蛋白信息资源(PIR)、SWISSPROT、蛋白研究基金会(PRF)、蛋白数据库(PDB)(来自解析结构的序列)，以及针对多肽序列，来自于GenBank、EMBL、DDBJ或RefSeq核苷酸序列编码区注释的翻译物。所使用的数字范围包括了定义该范围的数字。在本说明书中，“包括”一词是开放性的术语，基本相当于短语“包括但不限于”，“包含”一词也具有对应的词义。在此引用的参考文献也并不应该理解为本发明的现有技术。所有在此引用的出版物就如每一种单独出版物都被特异性和单独地指明被作为参考在此引入一样，且就如本文全部给出那样。本发明包括了所有实施方案及其如前所描述的变化，以及对实施例和附图的参考。
本申请是申请日为2004年10月29日，申请号为200480039568.9，发明题目为“细菌毒力因子及其用途”的中国专利申请的分案申请。